CN113264990A

CN113264990A - 抑制新型冠状病毒（sars-cov-2）的多肽和其应用

Info

Publication number: CN113264990A
Application number: CN202010091991.4A
Authority: CN
Inventors: 江一舟; 凌荣崧; 黄文杰; 黄博轩; 戴雅蓉
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN113264990B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体的说是一种抑制新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)的多肽和其应用。一种新冠病毒中的功能肽，新冠病毒中七肽重复2(HR2)序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。以及抑制所述新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的多肽，其为与新冠病毒中七肽重复2(HR2)氨基酸序列功能相同的序列。本发明公开新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)的七肽重复2(HR2)的氨基酸序列，同时给出其抑制序列，抑制序列能够结合新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的S蛋白的HR1区域，进而防止SARS‑CoV‑2与靶细胞融合，进而为防治新型冠状病毒SARS‑CoV‑2提供了一种全新的方法。

Description

抑制新型冠状病毒(SARS-COV-2)的多肽和其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体的说是一种抑制新型冠状病毒 (SARS-COV-2)的多肽和其应用。

背景技术

2019年新型冠状病毒(SARS-COV-2)是一种新发现的正链RNA包膜病毒。2020年2月11日，新病毒被世界卫生组织命名。感染该病毒的人出现不同程度的症状，从发烧或轻微咳嗽，肺炎，更严重的甚至死亡。目前来看，该病毒致死率约为2％到4％，但这是一个非常早期的百分比，随着更多信息的获得可能会改变。1月30日，世界卫生组织(WHO)宣布新的冠状病毒爆发为国际关注的突发公共卫生事件。

SARS-COV-2进入宿主细胞的详细途径还不清楚。然而SARS-COV-2 的基因序列类似于严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)，推测其与细胞结合的功能主要是与S蛋白有关。在S蛋白中含有S1 与S2亚基，S1亚基含有用于结合的细胞受体，氨肽酶N(APN)的受体结合结构域(RBD)；S2亚基，其由融合肽(FP)的，七肽重复1 (HR1)，七肽重复2(HR2)，跨膜结构域(TM)和细胞质结构域融合 (CP)，是负责介导病毒融合和进入。最近的体外细胞学研究证实，血管紧张素转换酶Ⅱ(ACE2)是SARS-COV-2细胞受体，而ACE2是SARS冠状病毒的受体；所以，途径应该是类似于普通的冠状病毒。对于普通的冠状病毒在病毒感染，靶细胞蛋白酶通过裂解它们变成 S1和S2亚单位激活蛋白S。在此之后的S2肽的Fusion Peptide(FP) 将被插入到靶细胞膜，HR1和HR2结构域将在同一时间被暴露。然后，HR1和HR2结构域将形成的六螺旋束。六螺旋束形成发夹结构将使细胞和病毒的脂质双层成接近度，从而引起膜融合，进而引起感染。

在膜融合过程中在S蛋白具有三个主要的状态，其中包括一个融合前天然状态，预发夹中间状态，以及稳定的融合后发夹状态。如果能让蛋白停留在预发夹中间状态，那么其就可以停止膜融合过程阻止感染。

虽然目前也有使用阻断多肽(blocking peptide)阻止细胞融合的例子，但是抑制病毒的blocking peptide具有较高的特异性，也就是说针对不同的病毒，需要设计不同的peptide，同时即使遵循已有方式进行设计，效果也不一定会很好，并且倘若不选取出主要的功能区段，会导致多肽过长，成本上升，效果降低。我们创新性地对多肽序列关键区域进行识别、裁剪、修饰，得到了效果更优的多肽序列。并且前尚未有针对SARS-COV-2的peptide。

发明内容

本发明目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种抑制新型冠状病毒(SARS-COV-2)的多肽和其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种新冠病毒中的功能肽，新冠病毒中七肽重复2(HR2)序列具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

一种抑制所述新型冠状病毒SARS-CoV-2的多肽，抑制肽为与新冠病毒中七肽重复2(HR2)氨基酸序列功能相同的序列。

所述肽具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。

所述肽具有SEQ ID NO:3序列所示的氨基酸序列经修饰、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得的序列。

其中，修饰可在序列的N、C端或任意位置进行功能性修饰，获得具有与SEQ ID NO:3序列氨基酸相同功能的肽。

一种抑制肽的应用，所述肽在制备抗新冠病毒或其潜在的同源病毒感染的药物中的应用。

一种重组蛋白，含至少一条所述抑制肽。

一种表达载体，含所述的重组蛋白。

一种重组细胞，含所述表达载体。

一种药物组合物，以至少一条所述抑制肽、所述的重组蛋白、所述表达载体、所述重组细胞中的一种或几种的组合作为活性成分，与药学上可接受待载体混合。

一种药物组合物的应用所述药物组合物在作为抗新冠病毒或其潜在的同源病毒感染的药物、功能性食品、保健品或消毒制剂中的应用。其中，药物的给药形式可为静脉注射、肌肉注射，肺部灌流，喷雾剂，雾化吸入剂，滴眼液，透皮给药，口服给药等方式；同时，功能性食品、保健品可为如用益生菌表达多肽或多肽类食品；另外，消毒制剂可按照现有技术与可接受的载体制成相应剂型。

本发明所具有的优点：

本发明公开新型冠状病毒(SARS-COV-2)的七肽重复2(HR2) 的氨基酸序列，同时给出其抑制序列，抑制序列能够结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的HR1区域，进而防止SARS-CoV-2与靶细胞融合，进而为防治新型冠状病毒SARS-CoV-2提供了一种全新的方法。

本发明的药物来源于病毒的HR2区域，创新性地通过裁剪，替换等的过程，获得了一条能与病毒HR1区域结合更紧密的多肽序列。并且通过计算得知病毒的HR2跟HR1结合能约为31.94kJ/mo，修饰后抑制多肽序列与HR1结合能约为35.61kJ/mol。由上可见，本发明修饰过的阻抗多肽较病毒的HR2区域与HR1的结合能更大，可以竞争性地结合病毒的HR1区域，进而防止膜融合，防止病毒侵染细胞。

理论上，本发明抑制多肽能够抑制早期病毒侵染细胞，可以制成鼻腔喷雾剂或者雾化吸入剂让此肽在鼻腔和呼吸道中保持一定浓度，防止透过口罩的病毒感染人体。并且依据此抑制多肽序列进一步的修饰，也会具有相应的效果。

本发明抑制多肽的生产也并不繁琐，目前基因工程表达多肽已有成熟的发酵技术，相信不久后，经过假病毒动物试验后，含有此多肽的制剂会投入市场，为国家抗击新型冠状病毒出一份力。

附图说明

图1为本发明实施例提的新型冠状病毒(SARS-COV-2)侵染靶细胞以及抗病毒肽作用机理的模式图；其中，S蛋白与抑制肽的作用机理，S蛋白位于病毒膜上，由S1和S2亚基组成。S1亚基具有受体结合域(RBD)，S2亚基参与了病毒的融合和进入。当SARS-COV-2与细胞膜接触时，S1亚基上的RBD与受体ACE结合。然后APN将S蛋白裂解成S1亚基和S2亚基，并插入目标细胞膜。HR1和HR2结合形成融合核，使病毒膜与细胞膜融合；抑制肽可以更紧密地与HR1结合，阻止HR1和HR2形成融合核，从而防止病毒与细胞融合。

图2为本发明实施例获得HR1/HR2融合核的整体结构图。

图3为本发明实施例获得HR1/HR2融合核三聚体的结构图，其中，左侧是三聚体的俯视图，右侧是其侧视图。

图4为本发明实施例获得介导SARS-COV-2融合核形成的氨基酸相互作用图。

图5A为本发明实施例获得拉力与时间对应的HR2解离曲线。

图5B为本发明实施例获得拉力与时间对应的抑制肽解离曲线。

图6A为本发明实施例获得HR2的结合能图。

图6B为本发明实施例获得抑制肽的结合能图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，本发明应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。但任何实施例或组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围有所附权利要求书限定，结合说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修饰和改变也包含在本发明的范围内。

虽然本发明所述新冠病毒SARS-COV-2的HR2序列与SARS具有相似同源性，但HR1在序列上并不完全相同，只有73％的相似性，所以传统的结合SARS的HR1序列的药物对新冠病毒SARS-COV-2的效果并不好。本发明所构建获得抑制肽较病毒的HR2区域与HR1的结合能更大，其可以竞争性地结合病毒的HR1区域阻止融合核的形成，进而防止膜融合，不能膜融合的病毒基因组不能进入靶细胞，防止病毒侵染细胞。

实施例1

HR区的查找：

从NCBI数据库上下载SARS-COV-2的S蛋白的蛋白质序列 (GenBank：QHQ82464.1)将其分别与SARS和MERS的HR1、HR2序列通过ClustalW软件进行多序列比对(空位罚分设置为10，延伸罚分设置为0.2)。SARS和MERS的HR1、HR2序列会比对到SARS-COV-2上，比对到的SARS-COV-2序列即为其HR区。

HR1序列如SEQ ID NO:1中氨基酸所示：

YRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVE

HR2序列如SEQ ID NO:2中氨基酸所示：

ELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGK YEQYIKWPWY

实施例2

1)HR1/HR2融合核的建模：

利用上述获得的HR区，将HR1置于复合体的N端，将HR2置于复合体的C端，HR1和HR2以一段长度为22个氨基酸的连接序列，按照常规技术连接起来，即得到HR1/HR2融合核；其中，连接序列为 LVPRGSGGSGGSGGLEVLFQGP(参见图2)。

由图2可见HR1/HR2融合核的整体结构，分子中的两个helix结构对应着HR1和HR2结构域。HR1结构域的范围为Q920到Q965，HR2 结构域的范围为I1163到L1202。Q965与I1169之间的片段为连接肽。可以观察到HR2在HR1/HR2三聚体中主要与两个HR1片段通过氢键与疏水作用连接(图3B)。

获得HR1/HR2复合体后，利用复合体的蛋白质序列建模：使用 SWISS-MODEL网站查找融合核的结构模板，由x光衍射，且同源程度最高(95％以上)，选择1wnc.1.B作为融合核的结构模板，通过该结构模板进行同源建模，建模完成后，下载PDB文件。所有的蛋白质结构图像均由PyMOL生成(https://pymol.org/2/)(参见图3)。

由图3可见所得蛋白质结构，带有疏水性质的残基都聚集在三聚体的中间部位，这使得三聚体中央形成一个强疏水作用。该HR1/HR2 融合核三聚体大致位置位于S蛋白中心，被S1亚基以β折叠的结构包裹着。

2)HR2抑制肽的获得

根据HR2与HR1结合的相互作用图像，三聚体中从HR1三聚体上看，带有疏水性质的残基都聚集在三聚体的中间部位，这使得三聚体中央形成一个强疏水作用。同时HR2在HR1/HR2三聚体中主要与两个HR1片段通过氢键与疏水作用连接，具体为HR2通过A1174、V1177、N1178、N1194、E1195、S1196和L1197与HR1结合形成氢键，且E1182 与HR1之间通过正负电荷之间的强烈静电相互作用形成盐桥，进而将两个残基束缚到一起。氢键与盐桥作用将HR2与HR1紧密地连接起来。且相互作用的残基均位于α螺旋的两端(图4)，选取该段序列作为抑制肽，其序列为：

HR2抑制肽序列如SEQ ID NO:3中氨基酸所示：

VNIQKEIDRLNEVAKNLNESL

由上述图4可见，图中(A)为中心螺旋的形成，其三个HR1多肽被标注为1到3.疏水性残基被标注为棍状结构。右侧显示了HR1单链的静电表面，这些残基在静电表面上被红圈圈出；图中(B)HR2 结合到HR1侧槽中.中间的图显示侧槽是由HR2结合到HR1二聚体上形成的，同时图中还标注HR2和HR1二聚体的相互作用。侧槽的静电表面如图左侧所示。可以与HR1相互作用的残基在右侧被标注为棍状结构。

根据上述抑制肽的序列对其进行修饰，所述修饰为经修饰、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸，主要的目的是让替换的氨基酸与HR1 形成氢键与盐桥作用；例如，按照现有的方式对SEQ ID NO:3的部分氨基酸进行增加后加入了一个谷氨酰胺。修饰后的序列可为：

①SVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLQ

②SVVNIQKEIDRLNEVAKNLQESL

③SVVNIQKEIDRLNEVAKNLTESL

④KVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESL

⑤SVVNIQKEIDRLNEVKKNLNESL

序列①末尾加入了一个谷氨酰胺，可以与HR1上的谷氨酰胺形成一个氢键，加大与HR1的结合力。其余序列原理也均根据可否与HR1 上的残基形成氢键，而进行修饰。

实施例4

对上述获得抑制肽以及修饰后的抑制肽通过分子对接与分子动力学模拟测试其与蛋白质结合能力：

1)实验方法：

使用PyMOL将结构中的HR1与连接肽删除，分理出单独的HR2片段。将HR2从融合核上分离出来之后，利用GRAMM-X网站 (http://vakser.compbio.ku.edu/resources/gramm/grammx/)将 HR2或上述实施例获得抑制肽或经修饰的肽对接到融合核上。然后使用GROMACS软件进行分子模拟。将伞状取样窗口设置为0.4，取模拟结果的170到330帧进行伞状取样。通过结果中的pullf.xvg文件使用wham命令计算出其能量(使用WeightedHistogram Analysis Method(WHAM)计算Potential of Mean Force(PMF))。分析过程具体如下：

1.使用GROMACS软件对通过分子对接的抑制肽-HR1复合体进行分子动力学模拟：使用GROMOS96 53a6对复合体进行模拟，向体系中加入0.1mol的氯化钠作为电荷平衡的离子。在分子动力学模拟过程中，将抑制肽与HR1作为两个整体，固定HR1，将一个力作用到抑制肽上，模拟其被该力拉开的过程。在这个过程中，抑制肽被逐渐拉离 HR1，通过分析图5中拉动的过程可以得知HR2和抑制肽均在400ps 左右被拉离HR1。

由图5A和5B可见，图5A中，第一个箭头表示最大作用力点，第三个箭头表示HR2的解离作用点，第二个箭头是多肽解离的中间阶段，HR2的拉力表明，其完全解离时间约为400ps。

图5B中，第一个箭头表示最大作用力点，第三个箭头表示抑制肽的解离作用点，第二个箭头是多肽解离的中间阶段；当抑制肽被力拉动时，它会与HR1形成氢键，可见其结合能会比HR2大。

2.通过对这个过程进行分析，抑制肽在170帧到330帧之间被拉开了大约0.4nm的距离。取该段模拟结果进行伞状取样，算得在这个过程中的能量(参见Lemkul JA,BevanDR.Assessing the Stability of Alzheimer’s Amyloid Protofibrils UsingMolecular Dynamics. J Phys Chem B.2010；114(4):1652-1660.doi:10.1021/jp9110794)。该能量即为其结合能

2)实验结论：

通过上述测试方式获得HR2跟HR1结合能约为31.94kJ/mo，抑制肽序列与HR1结合能约为37.61kJ/mol(图6)。

由上述可见，抑制肽较病毒的HR2区域与HR1的结合能更大，其可以竞争性地结合病毒的HR1区域阻止融合核的形成，进而防止膜融合，防止病毒侵染细胞。

理论上，此多肽能够抑制早期病毒侵染细胞，可以制成鼻腔喷雾剂让此肽在鼻腔中保持一定浓度，防止透过口罩的病毒感染人体。并且此多肽序列会继续修改，未来会存在结合能更大的多肽序列，换言之抑制病毒能力更大的多肽序列。

与此将上述抑制肽经进一步的修饰，其修饰后的肽也具有相同的构象效果。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 抑制新型冠状病毒（SARS-COV-2）的多肽和其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 85

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn

1 5 10 15

Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln

20 25 30

Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

35 40 45

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser

50 55 60

Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg

65 70 75 80

Leu Asp Lys Val Glu

85

<210> 2

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu

1 5 10 15

Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu

20 25 30

Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile

35 40 45

Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp

50 55 60

Tyr

65

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn

1 5 10 15

Leu Asn Glu Ser Leu

20

Claims

1.一种新冠病毒中的功能肽，其特征在于：新冠病毒中七肽重复2(HR2)序列具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种抑制权利要求1所述新型冠状病毒SARS-CoV-2的多肽，其特征在于：抑制肽为与新冠病毒中七肽重复2(HR2)氨基酸序列功能相同的序列。

3.按权利要求2所述的多肽，其特征在于：所述肽具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。

4.按权利要求3所述的肽，其特征在于：所述肽具有SEQ ID NO:3序列所示的氨基酸序列经修饰、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸获得的序列。

5.一种权利要求2所述的肽的应用，其特征在于：所述肽在制备抗新冠病毒感染的药物中的应用。

6.一种重组蛋白，其特征在于：含至少一条权利要求2-4任意一项权利要求所述的肽。

7.一种表达载体，其特征在于：含权利要求5所述的重组蛋白。

8.一种重组细胞，其特征在于：含权利要求7所述表达载体。

9.一种药物组合物，其特征在于：以至少一条权利要求2-4所述的肽、权利要求6所述的重组蛋白、权利要求7所述表达载体、权利要求8所述重组细胞中的一种或几种的组合作为活性成分，与药学上可接受待载体混合。

10.一种权利要求9所述药物组合物的应用，其特征在于：所述药物组合物在作为抗新冠病毒感染的药物、功能性食品、保健品或消毒制剂中的应用。