CN111217919B - 一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 - Google Patents

一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白双区域亚单位纳米疫苗。本发明以病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)和融合肽(Fusion peptide,FP)共同作为双抗原，并与火球菌多聚物蛋白(PF_Ferritin)连接组成融和蛋白RBD‑FP‑PF_Ferritin，实现抗原多聚化；再利用真核细胞表达系统表达，可通过PF_Ferritin自组装作用形成二十四聚体纳米抗原。该方案可克服RBD单体免疫原性不足的缺点，所得疫苗能显著的提高宿主针对病毒的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。而且本发明疫苗制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。

Description

一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白双区域亚单位 纳米疫苗
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒(暂定名称SARS-CoV-2，又名2019-nCoV)S蛋白双区域亚单位纳米疫苗。
背景技术
目前，人类仍缺乏有效的抗SARS-CoV-2的疫苗，在这种严峻的形势下，尽快开发安全、有效的针对SARS-CoV-2的疫苗用以保护易感人群，对于我国的人民健康与国家安全具有重要意义。
对于疫苗的研发，就必须先要了解病毒的结构。冠状病毒是一类具有包膜的单正链RNA病毒，能够在人和其他哺乳动物以及鸟类中广泛存在，并导致呼吸、消化、肝脏和神经系统等类型的疾病。在本次疫情发生以前，目前已知有6种冠状病毒可以引发人类疾病。其中，四种229E，OC43，NL63和HKU1基本上只会导致免疫缺陷的人引起普通感冒症状，而另外两种就是我们熟知的SARS-CoV和MERS-CoV，会引发严重的传染性疾病。冠状病毒5'端的单链阳性RNA基因组的长度介于26.2和31.7kb之间，是所有RNA病毒中最长的。其基因组有六到十个开放的读码框(ORF)。第一个ORF包含基因组的三分之二，并编码复制酶蛋白质，而最后三分之一含有固定顺序的结构蛋白基因：(HE)-S-E-M-N。在这些基因之间存在着编码辅助蛋白的多个ORF。基因组被包装成螺旋状的核衣壳，核衣壳被宿主来源的脂质双层所包围。这个病毒膜至少含有三种病毒蛋白，即刺突蛋白(S)和膜蛋白(M)以及包膜蛋白(E)。
其中，M和E蛋白主要参与病毒的组装，而S蛋白介导了病毒与宿主细胞膜上的受体结合并与宿主细胞膜相融合。因此，S蛋白在病毒的组织嗜性、细胞融合和毒力等方面起重要作用，是冠状病毒的主要中和抗原。MERS-CoV、SARS-CoV S蛋白的受体结合区(ReceptorBinding Domain,RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。MERS-CoV通过RBD与宿主细胞的受体(CD26，又名DPP4)结合而侵入细胞，SARS-CoV通过其RBD与宿主细胞受体ACE2结合而进入细胞，其作为疫苗的核心能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，进而提高疫苗的免疫原性和中和效率。然而在前期的研究中，来源于MERS-CoV以及SARS-CoV的RBD单体疫苗接种动物模型后仅能引发较低的假病毒中和抗体水平。
因此，目前针对新型冠状病毒SARS-CoV-2开展高免疫原性和中和效率的疫苗的研发工作迫在眉睫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有新型冠状病毒治疗药物以及疫苗的不足，为尽快开发安全、有效的针对SARS-CoV-2的疫苗用以保护易感人群。本发明以病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)及融合肽(Fusion peptide,FP)共同作为双抗原片段，并基于火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin)实现抗原多聚化，构建开发了一种RBD-FP抗原多聚体复合物。具体是以病毒的受体结合域(Receptorbinding domain,RBD)及融合肽(Fusion peptide,FP)共同作为双抗原片段，并与火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin(PF))组成融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin，实现抗原多聚化，同时加上信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F细胞)表达可自组装的RBD-FP-PF_Ferritin蛋白，可通过Ferritin(PF)自行组装将RBD-FP-PF_Ferritin单聚体组装成球状二十四聚体纳米颗粒，将其展示在纳米颗粒表面，克服了RBD单体免疫原性不足的缺点，能够有效地引起更强的免疫反应，产生中和SARS-CoV-2假病毒入侵靶细胞的抗体。本发明的疫苗能显著的提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平；而且本发明疫苗制备方法简单、蛋白含有His标签易于纯化，NIH登记的临床试验中已证明了细菌来源的Ferritin制作纳米疫苗载体的安全性，疫苗可较快的应用于临床试验。
本发明的目的是提供一种基于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合区与细菌多聚物构建的二十四聚体化的亚单位的新型冠状病毒抗原。
本发明另一目的是提供所述新型冠状病毒抗原在制备新型冠状病毒疫苗及抗新型冠状病毒药物中的应用。
本发明再一目的是提供所述新型冠状病毒抗原的制备方法。
本发明再一目的是提供编码表达所述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列、载体或转基因细胞系。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供一种提高抗原免疫原性的方法，所述方法是将病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)和融合肽(Fusion peptide,FP)共同作为双抗原，并进一步与火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin(PF))融合组成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin后作为抗原。
铁蛋白(Ferritin)作为一种可自组装的球形蛋白，其表面每相邻两个亚单位的氨基端间距约为4.5-7.5nm，适合在外表面负载抗原。利用PF_Ferritin这样一种来源于火球菌的铁蛋白能够自发形成多聚化的特性，且表面负载抗原后能诱发很强的体液免疫反应及细胞免疫反应，是非常理想的载体，可以增加单次免疫所能够承载的抗原的数量，大大提高了中和抗体滴度，解决RBD单体疫苗引发较弱免疫的缺点。
本发明提高抗原免疫原性的方案以病毒的受体结合域(Receptor bindingdomain,RBD)及融合肽(Fusion peptide,FP)共同作为双抗原片段，并基于火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin)实现抗原多聚化，能够克服RBD单体免疫原性不足的缺点，能够有效地引起更强的免疫反应，能显著的提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平。
在以往抗原研究中，尤其是SARS的研究，仅仅关注某一个区段的免疫原性，比如RBD区域，但目前相关疫苗的研发均宣告失败，因此我们考虑采用双区段进行抗原免疫。选择RBD和FP的原因在于：①RBD是和受体结合的区域；②FP是和受体细胞膜融合的区域。“结合”和“融合”构成了病毒侵入细胞的最关键最早期的两个步骤。将两个区域构建融合蛋白进行免疫在以往单区段疫苗研究中是不曾报道的。另外我们还对抗原片段进行PF_Ferritin的多聚化，利用PF_Ferritin(来源于火球菌的铁蛋白)能够自发形成多聚化的特性，将双抗原聚集在一起形成纳米颗粒，进一步增加单次免疫承载抗原的数量，因此可以更加充分而稳定的和人体内免疫细胞进行接触而刺激产生抗体。本发明的这种“双抗原+多聚体”的策略，可从质量(RBD+FP双抗原)和数量(多聚化)上达到更加有效、快速、稳定地刺激机体产生有效免疫反应的效果。
优选地，本发明上述抗原优选适用于冠状病毒抗原，所述病毒的受体结合域RBD和融合肽FP为冠状病毒的受体结合域RBD和融合肽FP。
优选包括新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原，所述冠状病毒的受体结合域RBD和融合肽FP为新型冠状病毒SARS-CoV-2的受体结合域RBD和融合肽FP。
更具体优选是指新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原为新型冠状病毒SARS-CoV-2的表面刺突蛋白(S蛋白)中和抗原，所述冠状病毒的受体结合域RBD和融合肽FP为新型冠状病毒SARS-CoV-2的受体结合域RBD和融合肽FP。
具体地，新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；FP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2可以直接连接得到融合蛋白RBD-FP。
或SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白RBD-FP。作为一种可选择的优选方案，所述Linker可以为GGSGGSGGSGGSGGG。当所述Linker为GGSGGSGGSGGSGGG时，新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD与FP的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
另外，所述Ferritin(PF)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4可以直接连接得到新的融和蛋白。
或SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin。作为一种可选择的优选方案，所述Linker可以为GSG。当所述Linker为GSG时，所得融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步优选地，作为一种可选择的实施方案，本发明所述提高抗原免疫原性的方法是将病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)和融合肽FP，与火球菌多聚物蛋白(Helicobacter pylori_Ferritin,Ferritin(PF))组成融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin后，再加上信号肽及纯化标签，通过真核表达系统表达出抗原。
优选地，所述信号肽为分泌型信号肽(Signal peptide,SP)。优选地，所述纯化标签为His标签(His-tag)。所述信号肽及纯化标签是加在RBD的氨基酸N端。
加上信号肽及纯化标签后，新型冠状病毒SARS-CoV-2的SP、His-tag、RBD与FP融合的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述Ferritin(PF)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
所述SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:4可以直接相连。
或SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:4以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin。作为一种可选择的优选方案，所述Linker可以为GSG。
当所述Linker为GSG时，所得融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列如SEQID NO:7所示(如图2所示)。
即本发明提供了一种含有信号肽及纯化标签的免疫原性提高的SARS-CoV-2抗原，所述抗原是利用火球菌铁蛋白自行组装为二十四聚体化的蛋白蛋白RBD-FP-PF_Ferritin(如图1所示)。
所述火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin(PF))为一种细菌复合物铁蛋白，所述细菌复合物铁蛋白形成存在于细菌的球状蛋白，其主要作用于控制多核三氧化二铁形成的速率和位置，通过水合铁离子和质子运输到矿化核和从矿化核运输。铁蛋白的球状形式是由单体亚基蛋白(Ferritin)构成的，其为具有分子量约17-20kD的多肽。一个这样的单体铁蛋白亚基的序列的如SEQ ID NO:4表示。这些单体铁蛋白亚基蛋白自组装为包含24个单体铁蛋白亚基蛋白的球状铁蛋白蛋白质。
该融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin可通过Ferritin(PF)自行组装作用将RBD-FP-PF_Ferritin单聚体组装成球状二十四聚体纳米颗粒，将RBD-FP双区域抗原展示在纳米颗粒表面，能够有效地引起受体更强的免疫反应，产生中和SARS-CoV-2假病毒入侵靶细胞的抗体。本发明的二十四聚体化的RBD-FP-PF_Ferritin可克服RBD单体免疫原性不足的缺点，显著提高了中和抗体滴度。
本发明还提供一种免疫原性提高的冠状病毒抗原，具体是由上述方法构建得到的一个新的可自行组装并二十四聚体化的融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin。
所述新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(一个新的融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示(通过SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以铰链区GGSGGSGGSGGSGGG相连得到SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3再与SEQ ID NO:4以铰链区GSG相连构成)；或再加上信号肽及纯化标签后形成的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(通过SEQ IDNO:6与SEQ ID NO:4以铰链区GSG相连构成)。
即作为本发明可选择的一种优选实施方案，新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(一个新的融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin)包含本文公开的信号肽及纯化标签、SARS-CoV-2的RBD蛋白与FP蛋白与自组装亚基蛋白Ferritin依次连接，其中所述RBD-FP-PF_Ferritin蛋白能够自组装为纳米颗粒，其在表面上展示RBD-FP蛋白的免疫原性部分。经进一步动物模型安全性与有效性研究后，RBD-FP-PF_Ferritin疫苗具备保护SARS-CoV易感人群的潜力。
因此，所述冠状病毒抗原在制备抗冠状病毒药物方面的应用，具体包括制备抗新型冠状病毒SARS-CoV-2药物的应用，也在本发明的保护范围之内。
作为一种可选择的实施方式，可以利用RBD-FP-PF_Ferritin蛋白与SAS佐剂合用制备抗SARS-CoV-2冠状病毒疫苗。
另外作为可选择的实施方式，所述应用还包括用于制备试剂盒；所述试剂盒中含有所述蛋白抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达试剂盒/转基因细胞系/重组菌。
另外本发明还提供一种表达上述抗原(融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
最后本发明还提供上述抗原的一种可选择的制备方法，具体是在SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:6与SEQ IDNO:4直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:5所示氨基酸对应的核苷酸序列、或SEQ ID NO:7所示氨基酸对应的核苷酸序列的3’端加上翻译终止密码子，克隆进真核表达载体(如图3所示，pcDNA3.1-Intron-WPRE)，经酶切以及测序正确后(如图4所示)，瞬时转染真核表达系统(如293F细胞)进行纳米抗原的表达(图5所示)，表达后收集细胞上清，纯化，即得到新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(多聚化RBD-FP蛋白)。
作为可选择的实施方案，所述真核表达系统包括但不限于HEK293T细胞、293F细胞、CHO细胞、sf9等可用于表达真核蛋白的细胞株、细胞系。相应蛋白导入真核表达系统的方案包括但不限于各种转染、感染、转座方案等。
作为可选择的实施方案，所述纯化方法是将表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片，并通10K超滤管(Millipore)进行初步的提纯，随即通过HisTrap HP镍柱(GE)、Lectin柱(GE)进行目的蛋白的捕获，最后通过使用Siperose6 Increase10/300GL柱子(GE)进行分子筛层析进行纯化，获取高纯度的目的蛋白(如图6-7所示)。
作为可选择的实施方案，超滤洗脱的缓冲液是：pH 7.4的PBS缓冲液。
作为可选择的实施方案，镍柱洗脱的缓冲液是：pH 7.4的PBS，含有500mMImidazole。
作为可选择的实施方案，Lectin柱(GE)的填料为：Concanavalin A(Con A)，Wheatgerm agglutinin(WGA)，柱洗脱的洗脱机是：methyl-α-D-mannopyranoside，GlcNAc。
作为可选择的实施方案，所述分子筛层析的缓冲液是：pH 7.4的PBS缓冲液。
本发明所得纳米疫苗是经纯化的二十四聚体RBD-FP-PF_Ferritin蛋白；所述二十四聚体的RBD-FP-PF_Ferritin蛋白在非还原条件下(不加DTT)的情况下大小约为50Kd。
最后，编码表达本发明上述抗原的核苷酸序列，以及含有该核苷酸序列、编码表达所述抗原的载体或转基因细胞系，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明将病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)及融合肽(Fusionpeptide,FP)共同作为双抗原片段，并与火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin(PF))组成融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin，实现抗原多聚化，同时加上信号肽及纯化标签，通过质粒转染真核细胞表达系统(如293F细胞)表达可自组装的RBD-FP-PF_Ferritin蛋白，RBD-FP可通过PF_Ferritin自组装作用形成二十四聚体纳米抗原。该方案可克服RBD-FP单体免疫原性不足的缺点，所得疫苗能显著的提高宿主针对SARS-CoV-2的中和抗体的水平。本发明通过RBD-FP-PF_Ferritin纳米抗原免疫Balb/c小鼠的实验已证实免疫10天后产生的中和抗体具有可强力阻挡SARS-CoV-2假病毒入侵靶细胞的能力。
而且本发明疫苗制备方法简单、蛋白含有His标签易于纯化，NIH登记的临床试验中已证明了Ferritin抗原作为纳米疫苗载体的安全性，疫苗可较快的应用于临床试验。
附图说明
图1为RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白自行组装纳米颗粒示意图。
图2为RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白结构示意图。
图3为表达RBD-FP-PF_Ferritin的质粒结构示意图。
图4为RBD-FP-PF_Ferritin融合酶切验证。
图5为RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白转染293F细胞免疫荧光图。
图6为RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白纯化分子筛图。
图7为RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白纯化SDS-PAGE图(约50KD)。
图8为RBD-FP-PF_Ferritin纳米疫苗小鼠免疫策略。
图9为小鼠血清中和抗体效价检测策略。
图10为小鼠免疫RBD-FP-PF_Ferritin纳米疫苗产生阻挡SARS-CoV-2入侵靶细胞的中和抗体。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1构建新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原(融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin)
融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin自行组装纳米颗粒示意图以及结构示意图分别如图1和图2所示。
具体地，融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的构建制备方法如下：
1、表达RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白的载体的制备
将RBD-FP-PF_Ferritin核苷酸序列3’端加上翻译终止密码子后克隆到添加Intron以及WPRE增强表达的表达载体(pcDNA3.1-Intron-WPRE)的Xho I和Xba I酶切位点之间，构建表达载体pcDNA3.1-Intron-WPRE-RBD-FP-Ferritin(PF)-IRE S-GFP(如图3所示)。
重组质粒转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和PCR鉴定出阳性克隆。提取去内毒素的质粒，经酶切以及测序验证后用于纳米抗原蛋白的表达(如图4所示)。将质粒通过脂质体转染的方案转染HEK293F细胞，转染3天后经离心收获细胞上清(RBD-FP-PF_Ferritin蛋白转染293F细胞免疫荧光图如图5所示)，进行目的蛋白RBD-FP-PF_Ferritin纯化。
2、RBD-FP-PF_Ferritin纳米抗原纯化
将表达RBD-FP-PF_Ferritin的细胞上清通过0.22μm的滤膜过滤，除去细胞碎片。经10K超滤管超滤后，将过滤后的细胞上清液与Histrap-excel于4℃结合30分钟，使用HisTrap excel镍柱进行粗纯。
之后，首先使用PBS(pH 7.4)缓冲液和低浓度咪唑缓冲液(PBS，50mM Imidazole，pH 7.4)分别进行洗涤50ml，去除流穿的杂蛋白。其后，通过含高咪唑缓冲液(PBS，500mMImidazole，pH 7.4)进行目的蛋白洗脱。随后，目的蛋白使用Con A与WGA以1：1比例填料的Lectin Agarose柱(GE)进行目的蛋白的富集。
收集合并RBD-FP-PF_Ferritin二十四聚体的洗脱峰，最后通过使用Siperose6Increase10/300GL柱子(GE)进行分子筛层析进行纯化，获得纯度大于99％的二十四聚体RBD-FP-PF_Ferritin蛋白(如图6-7所示)，分子筛层析的缓冲液是：PBS，pH 7.4。目的蛋白浓缩后，分装成小份，用液氮迅速冷冻后于-80℃保存。
实施例2小鼠免疫实验
将实施例1得到的RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白按照表1用生理盐水稀释至100μg/ml，并与等体积佐剂SAS进行分组乳化。然后对6-8周龄的Balb/C小鼠进行分组免疫。免疫策略如图8所示，即通过腹腔注射的方式，每只小鼠分别在第0天，第3周(21天)，第14周(108天)接受3次疫苗免疫，每次200μl的接种体积(10μg)。第10、31、108天，对小鼠进行眼眶取血。小鼠血清在静置一段时间待血清析出后，通过4℃，2800rpm离心15分钟获得，立刻用于SARS-CoV-2假病毒中和检测实验。
表1
抗原/对照 抗原含量 佐剂 动物数量(只)
RBD-FP-PF_Ferritin 10μg SAS 4
PBS 0 SAS 4
实施例3假病毒中和试验
1、假病毒的制备：
根据NCBI公布序列，合成SARS-CoV-2的Spike蛋白，并将其插入pcDNA3.1表达载体。将SARS-CoV-2Spike蛋白的表达载体与pHIV-luciferase和psPAX2质粒共同转染293T细胞，转染5小时后，PBS洗涤细胞2次，换为无血清DMEM培养基继续培养。48小时后收取上清，离心去除细胞碎片。后用小体积无血清DMEM溶解获得HIV-luc/SARS-CoV-2-S假病毒。
该假病毒可以有效模拟野生型SARS-CoV-2入侵细胞的过程。当其感染生产细胞或靶细胞后，SARS-CoV-2假病毒所携带的荧光素酶报告基因的表达能够准确反映病毒感染结果，使得实验系统的结果能够被精准快捷地读取，可以作为优秀的抗体中和效价监测系统(如图9所示)。
2、假病毒TCID 50测定
将上一步收取的病毒液按5倍比稀释，加入到96孔板中的HEK293T细胞中。感染4小时后，弃掉病毒液，PBS洗涤细胞2次，换为含10％血清的DMEM完全培养基。48小时后，弃掉培养基，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，震荡裂解30分钟。-80℃冻融一次后，每孔取30μl利用GloMax 96(Promega)检测荧光素酶活性值。通过Reed-Muech法计算TCID 50。
3、中和试验
将纯化的抗体2倍倍比稀释，与TCID 50终浓度假病毒混合，37℃共孵育1小时。将混合液加入到已密度为70％左右的HEK293T细胞中的96孔板中。48小时后，弃掉培养液，PBS洗涤细胞2次，加入细胞裂解液，检测荧光素酶活性值。
4、结果分析
结果如图10。将RBD-FP-PF_Ferritin纳米抗原免疫Balb/c小鼠后10天血清即检测到对SARS-CoV-2假病毒的中和活性，t检验显示实验组与对照组组间存在差异显著性。在显著性水平为0.05的情况下，双尾概率水平小于0.05。
结果表明，本发明RBD-FP-PF_Ferritin融合蛋白与SAS佐剂合用，经一次免疫后10天即可激发小鼠体液免疫，小于平行对照组所激发的中和抗体效价，且差异显著。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种基于火球菌铁蛋白的新型冠状病毒S蛋白双区域亚单位纳米疫苗
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 194
<212> PRT
<213> RBD的氨基酸序列
<400> 1
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> FP的氨基酸序列
<400> 2
Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser
1 5 10 15
Gln Ile Leu
<210> 3
<211> 228
<212> PRT
<213> RBD-FP的氨基酸序列
<400> 3
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe
210 215 220
Ser Gln Ile Leu
225
<210> 4
<211> 174
<212> PRT
<213> Ferritin(PF)的氨基酸序列
<400> 4
Gly Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu
35 40 45
Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Lys
50 55 60
Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp
65 70 75 80
Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe
85 90 95
Ile Ser Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys
100 105 110
Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val
115 120 125
Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala
130 135 140
Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala
145 150 155 160
Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu
165 170
<210> 5
<211> 405
<212> PRT
<213> 融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列，不含SP-His-tag
<400> 5
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe
210 215 220
Ser Gln Ile Leu Gly Ser Gly Gly Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala
225 230 235 240
Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe
245 250 255
Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn
260 265 270
Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe
275 280 285
Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Lys Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile
290 295 300
Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe Ile Ser Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala
325 330 335
Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu
340 345 350
Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile
355 360 365
Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met
370 375 380
Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu
385 390 395 400
Met Gln Gly Gly Glu
405
<210> 6
<211> 263
<212> PRT
<213> SP-His-tag-RBD-FP的氨基酸序列
<400> 6
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Glu His His His
20 25 30
His His His Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
35 40 45
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
50 55 60
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
65 70 75 80
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
85 90 95
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
100 105 110
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
115 120 125
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
130 135 140
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
165 170 175
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
180 185 190
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
195 200 205
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
210 215 220
Ala Pro Ala Thr Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly
245 250 255
Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu
260
<210> 7
<211> 440
<212> PRT
<213> 融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列，含SP-His-tag
<400> 7
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Glu His His His
20 25 30
His His His Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
35 40 45
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
50 55 60
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
65 70 75 80
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
85 90 95
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
100 105 110
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
115 120 125
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
130 135 140
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
165 170 175
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
180 185 190
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
195 200 205
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
210 215 220
Ala Pro Ala Thr Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly
245 250 255
Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Gly Ser Gly Gly Leu Ser Glu Arg Met
260 265 270
Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr
275 280 285
Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu Asp Leu Gly Leu Glu Gly
290 295 300
Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu Glu Glu Ile Gly His Ala
305 310 315 320
Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Lys Asn Gly Arg Val Glu Leu
325 330 335
Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp Glu Ser Pro Leu Lys Ala
340 345 350
Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe Ile Ser Lys Ser Ile Tyr
355 360 365
Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys Asp Tyr Ser Thr Arg Ala
370 375 380
Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val Glu Glu Glu Ala Ser Val
385 390 395 400
Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala Lys Asp Ser Pro Gln Ile
405 410 415
Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala Arg Ala Pro Lys Leu Pro
420 425 430
Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu
435 440

Claims (22)

1.一种提高冠状病毒抗原免疫原性的方法，其特征在于，所述方法将病毒的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)和融合肽(Fusion peptide,FP)共同作为双抗原，并与火球菌多聚物蛋白(Pyrococcus furiosus_Ferritin,Ferritin(PF))融合组成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin后作为抗原；
其中，受体结合域RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
融合肽FP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
火球菌多聚物蛋白Ferritin(PF)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述冠状病毒抗原为新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原，所述冠状病毒的受体结合域RBD和融合肽FP为新型冠状病毒SARS-CoV-2的受体结合域RBD和融合肽FP。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原为新型冠状病毒SARS-CoV-2的表面刺突蛋白(S蛋白)抗原。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，新型冠状病毒SARS-CoV-2的RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，FP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2可以直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白RBD-FP。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，当所述Linker为GGSGGSGGSGGSGGG时，所得融和蛋白RBD-FP的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述Ferritin(PF)的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示；SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4可以直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时，所得融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
8.根据权利要求1-7任一所述方法，其特征在于，融和蛋白再加上信号肽及纯化标签后，利用真核表达系统表达出抗原。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述信号肽为分泌型信号肽(Signalpeptide,SP)。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述纯化标签为His标签 (His-tag)。
11.根据权利要求8所述方法，其特征在于，新型冠状病毒SARS-CoV-2的SP、His-tag、RBD与FP融合的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
12.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:6所示序列可以直接连接，或两者以铰链区Linker相连构成一个新的融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin。
13.根据权利要求12所述方法，其特征在于，当所述Linker为GSG时，所得融和蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
14.一种免疫原性提高的冠状病毒抗原，其特征在于，依据权利要求1-13任一所述方法构建得到的新的融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin。
15.根据权利要求14所述冠状病毒抗原，其特征在于，融合蛋白RBD-FP-PF_Ferritin的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示。
16.权利要求14或15所述冠状病毒抗原在制备抗冠状病毒药物方面的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述冠状病毒抗原与SAS佐剂合用。
18.根据权利要求16或17所述的应用，其特征在于，所述应用是用于制备试剂盒；所述试剂盒中含有所述抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。
19.一种表达权利要求9或10所述抗原的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
20.一种冠状病毒疫苗，其特征在于，以权利要求9或10所述冠状病毒抗原为抗原制备而成。
21.权利要求14或15所述抗原的制备方法，其特征在于，在SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:4直接串联或铰链串联所示氨基酸对应的核苷酸序列、SEQ ID NO:5所示氨基酸对应的核苷酸序列、或SEQ ID NO:7所示氨基酸对应的核苷酸序列的3’端加上翻译终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染真核表达系统进行表达，表达后收集细胞上清，纯化，即得到冠状病毒抗原。
22.编码表达权利要求14或15所述抗原的核苷酸序列，或包含该序列的载体或转基因细胞系。
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