CN112584858A - 抗原性ospa多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及抗原性OspA多肽及其在引发针对OspA的抗体中的用途。还公开了包含OspA多肽和铁蛋白蛋白的抗原性多肽。

Description

抗原性OSPA多肽
本申请要求2018年4月3日提交的美国临时专利申请号62/652,210的优先权权益，所述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文中。
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2019年3月18日创建的所述ASCII副本被命名为2019-03-18_01121-0033-00PCT_SL.txt并且大小为370,862字节。
即使在疫苗学领域取得了许多成功，仍需要新的突破来保护人类免受许多威胁生命的传染性疾病的影响。当前许多已获许可的疫苗都依赖十年前的技术来产生活的减毒病原体或灭活的杀死病原体，所述病原体具有固有的安全性问题，并且在许多情况下，仅刺激短暂的弱免疫应答，从而需要给予多个剂量。虽然遗传学和生物化学工程学的进步使得开发针对具有挑战性的疾病靶标的治疗剂成为可能，但在疫苗学领域的这些应用尚未完全实现。重组蛋白技术现在允许设计最佳抗原。另外，纳米颗粒已越来越多地展示出用于最佳抗原呈递和靶向药物递送的潜力。已经显示具有多个附接抗原的纳米颗粒具有增加的结合亲合力，所述增加的结合亲合力凭借其分子货物的多价展示和由于其纳米尺寸而更有效地跨过生物屏障的能力而提供。与流感病毒血凝素(HA)蛋白融合的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori(H.pylori))铁蛋白纳米颗粒可以改善抗原稳定性并增加在小鼠流感模型中的免疫原性(参见Kanekiyo等人,Nature 499:102-106(2013))。此融合蛋白自组装成八面体对称性纳米颗粒并呈递8个三聚体HA刺突，从而在与佐剂一起使用时在各种临床前模型中产生稳健的免疫应答。
莱姆疏螺旋体病是一种由疏螺旋体属(Borrelia)中的一些菌种引起的人畜共患疾病，并通过感染的硬蜱属物种(Ixodes spp.)蜱虫的叮咬传播给人和犬科动物。莱姆病是全球性的公共卫生问题，跨欧洲、北美洲和亚洲的温带气候中报告了病例。疏螺旋体属的外表面蛋白A(OspA)是引发免疫应答的主要抗原。在世界范围内的疏螺旋体属中发现了至少七种不同的OspA血清型(血清型1-7)。在世界范围内存在不同的疏螺旋体属基因种，因此对一种基因种的免疫力可能不会赋予对也会引起莱姆疏螺旋体病的其他细菌的免疫力。此外，藏匿疏螺旋体属的蜱虫的局部性范围意指与一个地理区域中的患者的莱姆病相关的OspA血清型可能与另一地理区域中的患者的莱姆病不相关。
在此，提出了一组涉及OspA多肽的新多肽、纳米颗粒、组合物、方法和用途。开发了修饰的OspA多肽以在降低刺激自身免疫反应的风险的情况下提供保护免受疏螺旋体属感染。此外，开发了包含OspA多肽和铁蛋白的自佐剂化抗原性多肽，其中免疫刺激部分(如佐剂)直接化学附接至抗原性多肽。将免疫刺激部分直接缀合至抗原性多肽允许在单一大分子实体中靶向共递送免疫刺激部分和OspA多肽，这可以大大降低全身性毒性的可能性，所述全身性毒性是在包含作为单独分子的抗原和免疫刺激分子(如佐剂)的传统的疫苗的情况下所担忧的。免疫刺激部分与OspA多肽在大分子实体中的共递送以及它们的多价呈递也可以减少引发保护所需的总剂量，从而减少生产负担和成本。
发明内容
本公开文本的目的是提供可以提供以上讨论的一个或多个优点，或者至少为公众提供有用选择的组合物、试剂盒、方法和用途。因此，本文公开了以下实施方案。
实施方案1是一种抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含疏螺旋体属的OspA血清型1多肽，其中所述多肽不包含SEQ ID NO:77的序列。
实施方案2是根据实施方案1所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽缺乏跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。
实施方案3是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽是非脂化的。
实施方案4是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中相对于SEQID NO:77的序列存在至少一种氨基酸取代，其中所述取代降低与SEQ ID NO:78的同一性，或是非保守性的并且不导致与SEQ ID NO:78的更高同一性。
实施方案5是根据实施方案4所述的抗原性OspA多肽，其中所述取代降低与SEQ IDNO:78的同一性。
实施方案6是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中SEQ IDNO:77的一个或多个氨基酸被非血清型1OspA的一个或多个相应氨基酸置换。
实施方案7是根据实施方案6所述的抗原性OspA多肽，其中所述非血清型1OspA是血清型2、3、4、5、6或7OspA。
实施方案8是根据实施方案6所述的抗原性OspA多肽，其中SEQ ID NO:77的每个氨基酸被血清型2、3、4、5、6或7OspA的相应氨基酸置换。
实施方案9是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽进一步包含用以减少或消除糖基化的修饰。
实施方案10是根据实施方案9所述的抗原性OspA多肽，其中所述修饰包括对至少一个天冬酰胺的取代。
实施方案11是根据实施方案10所述的抗原性OspA多肽，其中所述至少一个天冬酰胺包括OspA血清型1的N71、N190、N202和N251中的任何一个、两个、三个或更多个。
实施方案12是根据实施方案11所述的抗原性OspA多肽，其中所述至少一个天冬酰胺包括OspA血清型1的N71、N190、N202和N251。
实施方案13是根据实施方案10-12中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述一个或多个天冬酰胺被谷氨酰胺取代。
实施方案14是根据实施方案10-13中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽缺乏N-糖基化位点。
实施方案15是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述OspA来自博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、梅奥疏螺旋体(Borrelia mayonii)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)或巴伐利亚疏螺旋体(Borrelia bavariensis)。
实施方案16是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:1、3、4或53中任一个的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施方案17是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含SEQ ID NO:1-10或12-76中任一个的序列。
实施方案18是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含OspA胞外结构域。
实施方案19是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:94-102中任一个的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
实施方案20是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽进一步包含铁蛋白蛋白。
实施方案21是根据实施方案20所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
实施方案22是一种抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含OspA多肽和铁蛋白，其中所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
实施方案23是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的E12C、S26C、S72C、A75C、K79C、S100C和S111C突变中的一种或多种或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的一种或多种相应突变。
实施方案24是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的E12C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案25是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的S26C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案26是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的S72C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案27是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的A75C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案28是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的K79C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案29是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的S100C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案30是根据实施方案20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的S111C突变，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的相应突变。
实施方案31是根据实施方案20-30中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含经由表面暴露的氨基酸连接至所述铁蛋白的一个或多个免疫刺激部分，任选地其中所述表面暴露的氨基酸是由突变产生的半胱氨酸。
实施方案31a是根据实施方案31所述的抗原性OspA多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR2的激动剂，任选地其中所述激动剂是PAM2CSK4、FSL-1或PAM3CSK4。
实施方案31b是根据实施方案31所述的抗原性OspA多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR7/8的激动剂，任选地其中所述激动剂是单链RNA、咪唑并喹啉、核苷类似物、3M-012或SM7/8a。
实施方案31c是根据实施方案31所述的抗原性OspA多肽，其中所述免疫刺激部分是TLR9的激动剂，任选地其中所述激动剂是CpH寡脱氧核苷酸(ODN)、包含一个或多个含有5'嘌呤(Pu)-嘧啶(Py)-C-G-Py-Pu 3'的6聚体CpG基序的ODN、包含序列SEQ ID NO:210的ODN、或ISS-1018。
实施方案31d是根据实施方案31c所述的铁蛋白蛋白，其中所述TLR9的激动剂包含含有硫代磷酸酯连接的主链。
实施方案31e是根据实施方案31所述的抗原性OspA多肽，其中所述免疫刺激部分是STING的激动剂，任选地其中所述激动剂是环状二核苷酸(CDN)、cdA、cdG、cAMP-cGMP和2'-5',3'-5'cGAMP或DMXAA。
实施方案32是根据实施方案20-31e中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，任选地其中所述天冬酰胺是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置19处，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似位置处。
实施方案33是根据实施方案20-32中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变，任选地其中所述内部半胱氨酸是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处，或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置处。
实施方案34是根据实施方案20-33中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述抗原性OspA多肽包含在所述OspA多肽与所述铁蛋白之间的肽接头。
实施方案35是根据实施方案34所述的抗原性OspA多肽，其中所述肽接头在所述铁蛋白的N末端。
实施方案35a是根据实施方案34所述的抗原性OspA多肽，其中所述肽接头在所述铁蛋白的C末端。
实施方案36是根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含与SEQ ID NO:201-207或211-215中的任一个具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36a是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:201中的任一个具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36b是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:202中的任一个具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36c是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:203中的任一个具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36d是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:215具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36e是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:204具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36f是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:205具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36g是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:206具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36h是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:207具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36i是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:211具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36j是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:212具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36k是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:213具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案36l是根据实施方案36所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:214具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
实施方案37是一种铁蛋白颗粒，所述铁蛋白颗粒包含根据实施方案20-36l中任一项所述的抗原性OspA多肽。
实施方案38是根据实施方案1-19中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽进一步包含2,4-二氧四氢喋啶合酶蛋白。
实施方案39是一种2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒，所述2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒包含根据实施方案38所述的抗原性OspA多肽。
实施方案40是一种组合物，所述组合物包含根据前述实施方案中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒或2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
实施方案41是根据实施方案40所述的组合物，所述组合物进一步包含佐剂，任选地其中所述佐剂是AF03。
实施方案42是根据实施方案40或41所述的组合物，所述组合物包含第一抗原性OspA多肽和第二抗原性OspA多肽，其中所述第一抗原性OspA多肽和所述第二抗原性OspA多肽包含不同血清型的OspA多肽。
实施方案43是根据实施方案42所述的组合物，所述组合物包含选自以下项的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种抗原性OspA多肽：含有OspA血清型1多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型2多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型3多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型4多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型5多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型6多肽的抗原性OspA多肽；和含有OspA血清型7多肽的抗原性OspA多肽。
实施方案44是根据实施方案43所述的组合物，所述组合物包含含有OspA血清型1多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型2多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型3多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型4多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型5多肽的抗原性OspA多肽；和含有OspA血清型7多肽的抗原性OspA多肽。
实施方案45是根据实施方案1-44中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒或组合物，用于在引发对疏螺旋体属的免疫应答或保护受试者免于莱姆病的方法中使用。
实施方案46是一种引发对疏螺旋体属的免疫应答或保护受试者免于莱姆病的方法，所述方法包括向受试者给予根据实施方案1-44中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒或组合物中的任何一种或多种。
实施方案47是根据实施方案45-46中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是人。
实施方案47a是根据实施方案45-46中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是哺乳动物，任选地其中所述哺乳动物是灵长类动物或驯养哺乳动物，进一步任选地其中所述灵长类动物是非人灵长类动物、猴子、猕猴、恒河猴或食蟹猴或猿，或者所述驯养哺乳动物是犬、兔、猫、马、绵羊、牛、山羊、骆驼或驴。
实施方案48是一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案1-44所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒和组合物中的任何一种或多种，所述试剂盒任选地具有针对莱姆病对受试者进行免疫的使用说明书。
实施方案49是一种核酸，所述核酸编码根据实施方案1-36l中任一项所述的抗原性OspA多肽，任选地其中所述核酸是RNA。
其他目的和优点将部分阐述于随后的描述中，并且部分将从所述描述中明显看出，或者可以通过实践获知。所述目的和优点将借助所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
应了解，上文的一般说明与下文的详细说明均仅是示例性和解释性的，并且对权利要求无限制性。
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图展示了若干实施方案，并且附图连同本说明一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A至图1D示出了OspA-铁蛋白纳米颗粒的示例性设计。图1A.OspA与铁蛋白在基因上融合形成融合蛋白。OspA和铁蛋白序列由甘氨酸-丝氨酸接头(-GS-)隔开。图1B.描绘了OspA的胞外结构域的结构。其中OspA附接至铁蛋白的C末端用星号指示。图1C.由幽门螺杆菌铁蛋白的24个单体构成的示例性铁蛋白纳米颗粒。图1D.示例性OspA-铁蛋白融合蛋白纳米颗粒。描绘了铁蛋白(浅灰色)、甘氨酸-丝氨酸接头(GS)的位置和OspA(深灰色和黑色)(n：亚基数)。
图2A至图2D示出了示例性OspA-铁蛋白的表达和纯化。图2A.在Superose 6柱上纯化的示例性OspA-铁蛋白纳米颗粒的尺寸排阻色谱(SEC)图。图2B.来自Expi293细胞的纯化的示例性OspA-铁蛋白的SDS-PAGE凝胶。图2C.示例性OspA-铁蛋白纳米颗粒的动态光散射(DLS)图。半径为13nm，Pd％(归一化多分散性的量度)为7.4，并且质量为100％。图2D.由在67,000x放大倍率下对318个颗粒的透射电子显微照片的类别平均化构建而成的示例性OspA-铁蛋白的复合图像。铁蛋白纳米颗粒在透射电子显微镜上显现为具有空心中心的强圆形密度。每个纳米颗粒都被许多对应于OspA的短形状包围，所述短形状显现为圆形或微椭圆形。
图3A至图3B示出了在大肠杆菌中替代性血清型OspA纳米颗粒的产生。图3A.通过尺寸排阻色谱纯化的OspA-铁蛋白血清型1-5和7的SDS-PAGE生化分析。图3B.OspA-铁蛋白血清型1-5和7的透射电子显微镜(98,000x)。
图4示出了示例性血清型1OspA-铁蛋白纳米颗粒与
Figure BDA0002795913570000101
莱姆(Lyme)(博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的纯化的外表面蛋白A(OspA)的液体悬浮液)的免疫原性和持续时间的比较。在第0周和第4周，用1μg OspA-铁蛋白+Ribi佐剂(Sigmaadjuvant system目录号S6322-1vl)或
Figure BDA0002795913570000102
莱姆(Lyme)肌内免疫C3H小鼠(n＝5)。在每种组合物的情况下，通过在第2次免疫后2周(第6周)和在第2次免疫后21周(第25周)经由ELISA测量终点效价来评估抗体应答。
图5A至图5C呈现了关于示例性OspA-铁蛋白的信息，其中OspA多肽在OspA血清型1的与人白细胞功能相关抗原-1(hLFA-1)的序列片段具有同源性的表位处被修饰。图5A.示出了LFA-1同源位点(SEQ ID NO:83的氨基酸165-173)在OspA胞外结构域内的位置的结构。图5B.示出了SEQ ID NO:83(博氏疏螺旋体血清型1OspA)的OspA氨基酸165-173与hLFA-1和其他疏螺旋体物种和血清型中的相应序列的关系的系统树图。图5C.将SEQ ID NO:83的氨基酸165-173处的九个氨基酸的区段(九肽)(标记为“OspA”)与来自血清型2和血清型3OspA的相应九肽(分别为“S2”(SEQ ID NO:79)和“S3”(SEQ ID NO:80))、合理设计的取代九肽(“RD2”；SEQ ID NO:81)和来自hLFA-1的相应九肽(SEQ ID NO:78)进行比较。图5C按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 77、79-81和78。图5D.在第0周和第4周用1μg剂量的OspA血清型1-铁蛋白纳米颗粒与AddaVaxTM佐剂(基于角鲨烯的水包油纳米乳剂；可从InvivoGen获得，目录号vac-adx-10)肌内(IM)免疫C3H小鼠(n＝5)。OspA序列包括野生型hLFA-1同源位点(即，SEQ ID NO:83的氨基酸165-173；“血清型1”)或如下的取代序列：SEQ ID NO:81(“RD”)；SEQID NO:80(“血清型3置换物”)；SEQ ID NO:79(“血清型2置换物”)。经由在所指示构建体的第2次免疫后2周通过ELISA测量的终点效价来评估抗体应答。
图6A至图6B呈现了关于与示例性免疫刺激部分TLR 7/8激动剂(3M-012)缀合的示例性OspA-铁蛋白纳米颗粒的信息。图6A.使用2步式点击化学策略将3M-012附接至铁蛋白。首先将DBCO-PEG4-马来酰亚胺接头附接至铁蛋白上的表面暴露的半胱氨酸。除去过量的接头后，添加叠氮化物-3M-012。图6B.在第0周和第4周用1μg所指示组合物肌内免疫C3H小鼠(n＝5)，并且在2周后进行分析。“缀合物”指示OspA-铁蛋白-3M-012缀合的纳米颗粒。“掺合物(Admix)”指示与29ng或20μg 3M-012或明矾一起给予的相同OspA-铁蛋白的非缀合混合物。OspA-铁蛋白和3M-012的29ng“掺和”混合物表示缀合的纳米颗粒上3M-012的摩尔当量。
图7A至图7C呈现了关于与示例性免疫刺激部分ISS-1018CpG(SEQ ID NO:210)缀合的示例性OspA-铁蛋白纳米颗粒的信息。图7A.使用2步式点击化学策略将CPG附接至铁蛋白。首先将DBCO-PEG4-马来酰亚胺接头附接至铁蛋白上的表面暴露的半胱氨酸。除去过量的接头后，添加叠氮化物-CpG。图7A公开了SEQ ID NO:228。图7B.通过SDS-PAGE凝胶对CpG-缀合进行的生化分析揭示出在与CpG缀合后分子量的移位，其中92％的OspA-铁蛋白与CpG缀合。图7C.在第0周和第4周用1μg所指示组合物肌内免疫C3H小鼠(n＝5)，并且在2周后进行分析。“缀合物”指示OspA-铁蛋白-CPG缀合的纳米颗粒。“掺合物”指示与339ng或50μgCpG或明矾一起给予的相同OspA-铁蛋白的非缀合混合物。OspA-铁蛋白和CPG的339ng“掺和”混合物表示缀合的纳米颗粒上CpG的摩尔当量。
图8A至图8F比较了在给予以下项之后对血清型1(图8A)、血清型2(图8B)、血清型3(图8C)、血清型4(图8D)、血清型5(图8E)和血清型7(图8F)的抗体应答：伴有明矾佐剂的单价血清型匹配的OspA-铁蛋白(1μg/剂量)(“单价的”)或伴有明矾佐剂的包含血清型1OspA-铁蛋白、血清型2OspA-铁蛋白、血清型3OspA-铁蛋白、血清型4OspA-铁蛋白、血清型5OspA-铁蛋白和血清型7OspA-铁蛋白中的每一种(各自为1μg/剂量)的六价组合物(“六价的”)。在第0周和第4周肌内免疫C3H小鼠(n＝5)，并且2周后经由通过ELISA测量的终点效价来评估抗体应答。将ELISA板用指定的OspA血清型包被。
图9A至图9G示出了在给予缀合的和非缀合的六价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物后，在小鼠中观察到的小鼠中对血清型1(图9A)、血清型2(图9B)、血清型3(图9C)、血清型4(图9D)、血清型5(图9E)、血清型6(图9F)和血清型7(图9G)的抗体应答。六价组合物包含血清型1OspA-铁蛋白、血清型2OspA-铁蛋白、血清型3OspA-铁蛋白、血清型4OspA-铁蛋白、血清型5OspA-铁蛋白和血清型7OspA-铁蛋白中的每一种，如对于图8A至F所述的，不同之处在于“六价-CPG”和“六价-3M-012”指示将纳米颗粒与CPG和3M-012化学缀合(参见图7A和6A和随附描述)。2周后经由通过ELISA测量的终点效价来评估抗体应答。将ELISA板用指定的OspA血清型包被。
图10A至图10G示出了对于六价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物，恒河猴(n＝3/组)中的分别对血清型1-7的抗体应答，所述六价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物如图9A-G所述，不同之处在于剂量共为60μg(每种血清型10μg)并且含有非缀合的AF03佐剂。在第0周和第6周肌内对猴进行免疫。免疫后2周经由通过ELISA测量的终点效价来分析抗体应答。
Figure BDA0002795913570000121
莱姆以10μg剂量用作比较参考。对于所有实验，将ELISA板用每个图片中指示的OspA血清型包被。
图10H至图10N示出了对于六价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物，恒河猴(n＝3/组)中的分别对血清型1-7的抗体应答，所述六价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物如对于图10A-G所述，不同之处在于未使用AF03佐剂，而将纳米颗粒与3M-012或CpG缀合(参见图6A和图7A和随附描述)。剂量共使用60μg(每种血清型10μg)。在第0周和第6周肌内对猴进行免疫。免疫后2周经由通过ELISA测量的终点效价来分析抗体应答。对于所有实验，将ELISA板用每个图片中指示的OspA血清型包被。
图11示出了3M-012缀合的OspA-铁蛋白组合物的蜱虫攻击测试的结果。在第0周和第4周用1μg剂量的所指示组合物对小鼠进行免疫。单价组合物含有1μg与3M-012缀合的OspA-铁蛋白血清型1。“六价-3M-012”组合物如对于图9A-G所述的。对照颗粒缺少OspA多肽。在第二次免疫后两周，用感染博氏疏螺旋体N40菌株(血清型1)的5-6只蜱虫攻击小鼠5天，并且两周后将所述小鼠处死。将来自心脏、踝部和耳部的组织样品在BSK培养基中与针对博氏疏螺旋体的抗生素一起培养6周。通过PCR测试阴性样品中博氏疏螺旋体的存在。阳性样品是通过培养或PCR呈阳性的。
图12示出了通过质谱确认OspA-铁蛋白纳米颗粒与TLR 7/8激动剂3M-012的缀合。顶部图片示出了未缀合的，并且底部图片示出了缀合的构建体。数据显示出586.69道尔顿的质量移位，这与3M-012的添加一致。
图13示出了在如图所示的稀释系列上，通过ELISA测量的小鼠中与糖基化对应物(RD)相比对非糖基化突变体OspA-铁蛋白(NG-RD)的抗体应答。RD＝SEQ ID NO:52。NG-RD＝SEQ ID NO:53。在第0周和第4周以1μg剂量对小鼠进行疫苗接种。
图14示出了在如图所示的稀释系列上，通过ELISA测量的小鼠中与
Figure BDA0002795913570000131
莱姆和阴性(免疫前)对照相比对OspA-铁蛋白(SEQ ID NO:52)、OspA-铁蛋白糖基化突变体N>Q(SEQ ID NO:53)和糖基化突变体S/T>A(SEQ ID NO:63)的抗体应答。
图15A至图15E示出了对包含不同接头(GS，Gly-Ser接头；GS1，Gly-Gly-Gly-Ser接头(SEQ ID NO:226)；GS2，SEQ ID NO:91接头；GS5，SEQ ID NO:92接头；构建体序列分别为SEQ ID NO:53和60-62)的OspA构建体的纯化和表征。图15A.对纯化的包含如所指示接头的OspA构建体的考马斯染色。图15A按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:226和91-92。图15B.包含GS1的OspA-铁蛋白纳米颗粒(SEQ ID NO:60)的动态光散射(DLS)。图15C.包含GS2的OspA-铁蛋白纳米颗粒(SEQ ID NO:61)的DLS。图15D.包含GS5的OspA-铁蛋白纳米颗粒(SEQID NO:62)的电子显微照片(EM)。图15E.包含GS5的OspA-铁蛋白纳米颗粒(SEQ ID NO:62)的DLS。
图16示出了在如图所示的稀释系列上，通过ELISA测量的小鼠中与
Figure BDA0002795913570000132
莱姆和阴性(免疫前)对照相比对以下OspA-铁蛋白构建体的抗体应答，所述OspA-铁蛋白构建体包含不同的接头(接头1X GGGS(SEQ ID NO:226)构建体，SEQ IDNO:60；接头2x GGGS(SEQ ID NO:91)构建体，SEQ ID NO:61；接头5X GGGS(SEQ ID NO:92)构建体，SEQ ID NO:62)。
图17A至图17C示出了对2,4-二氧四氢喋啶合酶(lumazine synthase)OspA血清型4构建体(SEQ ID NO:18)的表征。图17A.DLS数据。图17B.尺寸排阻色谱(SEC)迹线的所指示级分22-64的考马斯凝胶。图17C.EM数据。
图18示出了小鼠中对伴有或不伴有明矾的OspA血清型4-铁蛋白构建体(SEQ IDNO:4)和OspA血清型4-2,4-二氧四氢喋啶合酶构建体(SEQ ID NO:18)的抗体应答。
图19A至图19C示出了对OspA血清型1-2,4-二氧四氢喋啶合酶构建体(SEQ ID NO:12)的表征。图19A.EM数据。图19B.SEC迹线的所指示级分20-40的考马斯凝胶。图19C.DLS数据。
图20A至图20C示出了对OspA血清型2-2,4-二氧四氢喋啶合酶构建体(SEQ ID NO:16)的表征。图20A.EM数据。图20B.SEC迹线的所指示级分27-56的考马斯凝胶。图20C.DLS数据。
图21A至图21B示出了对OspA血清型3-2,4-二氧四氢喋啶合酶构建体(SEQ ID NO:17)的表征。图21A.SEC迹线的所指示级分23-39的考马斯凝胶。图21B.DLS数据。
图22A至图22C示出了对OspA血清型5-2,4-二氧四氢喋啶合酶构建体(SEQ ID NO:19)的表征。图22A.EM数据。图22B.SEC迹线的所指示级分22-38的考马斯凝胶。图22C.DLS数据。
图23A至图23C示出了对OspA血清型7-2,4-二氧四氢喋啶合酶构建体(SEQ ID NO:21)的表征。图23A.EM数据。图23B.SEC迹线的所指示级分20-38的考马斯凝胶。图23C.DLS数据。
图24A至图24G示出了对于用明矾或AF03佐剂化的含有1ug对应于OspA血清型1-7的每种OspA-铁蛋白纳米颗粒的七价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物(共7ug)或对于
Figure BDA0002795913570000141
莱姆，C3H小鼠(n＝5/组)中分别对血清型1-7的抗体应答。对于所有实验，将ELISA板用每个图片中指示为“S X”的OspA血清型包被，其中X是血清型编号。
图25示出了恒河猴中终点抗体效价的时间历程。在第0周和第6周用伴有AF03佐剂的六价OspA-铁蛋白疫苗(在单独的纳米颗粒中含有血清型1、2、3、4、5和7的OspA)或
Figure BDA0002795913570000142
肌内对猴进行免疫。将ELISA板用OspA血清型1包被。
具体实施方式
本文提供了用于针对莱姆病的疫苗接种的新型抗原。莱姆病是由属于广义(s.l)博氏疏螺旋体复合体(本文称为“疏螺旋体属”)的细菌引起的。本文所述的抗原包括可以单独使用或与非缀合的佐剂一起使用以针对莱姆病对受试者进行疫苗接种的抗原性多肽、融合蛋白、纳米颗粒和组合物。融合蛋白可以包含与铁蛋白融合的抗原性多肽。铁蛋白可以是野生型的或可以包含一个或多个突变，例如，用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变，使得免疫刺激部分可以直接缀合至工程化的表面暴露的半胱氨酸。由这种突变产生的半胱氨酸可以消除或减少对单独给予的佐剂的需要，并且还潜在地减少引发对抗原的免疫应答所需的佐剂/免疫刺激部分的量。还提供了编码本文所述抗原性多肽的核酸。
A.定义
如本文所用，“佐剂”是指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可以包括而不限于其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；其中抗原溶液乳化在矿物油中或水中的油包水或水包油乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)。有时包括杀死的分枝杆菌(例如，弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG基序)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还可以包括生物分子，如Toll样受体(TLR)激动剂和共刺激分子。佐剂可以作为单独分子在组合物中给予或与修饰的铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽共价结合(缀合)。
如本文所用，“抗原”是指引发免疫应答的因子；和/或当暴露或给予至生物体时由T细胞受体结合的因子(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体(例如，由B细胞产生)结合的因子。在一些实施方案中，抗原在生物体中引发体液应答(例如，包括产生抗原特异性抗体)。可替代地或另外，在一些实施方案中，抗原在生物体中引发细胞应答(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。特定抗原可以在靶标生物体(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或若干成员中引发免疫应答，但不能在靶标生物体物种的所有成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在靶标生物体物种的至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的成员中引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原结合抗体和/或T细胞受体，并且在生物体中可能诱导或可能不诱导特定生理应答。在一些实施方案中，例如，抗原可以在体外结合抗体和/或T细胞受体，无论在体内是否发生这种相互作用。在一些实施方案中，抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的那些)反应。抗原包括如本文所述的抗原性铁蛋白蛋白，其包含铁蛋白(例如，包含一个或多个突变)和非铁蛋白多肽。
如本文所用，“铁蛋白”或“铁蛋白蛋白”是指与幽门螺杆菌铁蛋白(SEQ ID NO:208或209)或本文所讨论的另一种铁蛋白(如激烈火球菌(P.furiosus)铁蛋白、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)铁蛋白或人铁蛋白)具有可检测的序列同一性的蛋白质，其用于例如在细胞内或组织中存储铁或在血流中携带铁。在下文详细讨论了此类示例性铁蛋白，包括以两条多肽链(称为重链和轻链)出现的那些(例如，粉纹夜蛾和人铁蛋白)。在一些实施方案中，铁蛋白包含与本文例如在表1(序列表)中公开的铁蛋白序列具有至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的序列。铁蛋白可以是全长天然存在的序列的片段。如本文所用，“野生型铁蛋白”是指其序列由天然存在的序列组成的铁蛋白。铁蛋白还包括其氨基酸序列与野生型铁蛋白有一个或多个差异的全长铁蛋白或铁蛋白片段。
如本文所用，“铁蛋白单体”是指未与其他铁蛋白分子组装的单一铁蛋白分子(或，在适用时，单一铁蛋白重链或轻链)。“铁蛋白多聚体”包含多个缔合的铁蛋白单体。“铁蛋白蛋白”包括单体铁蛋白和多聚体铁蛋白。
如本文所用，“铁蛋白颗粒”是指已经自组装成球状形式的铁蛋白。铁蛋白颗粒有时被称为“铁蛋白纳米颗粒”或简称为“纳米颗粒”。在一些实施方案中，铁蛋白颗粒包含24个铁蛋白单体(或，在适用时，总共24个重链和轻链)。
如本文所用，“杂合铁蛋白”是指包含幽门螺杆菌铁蛋白与牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的铁蛋白。用作牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的示例性序列呈现为SEQ ID NO:217。在杂合铁蛋白中，可以将牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区与幽门螺杆菌铁蛋白融合，由此使得使免疫刺激部分附接位点均匀分布在铁蛋白颗粒表面。如本文所用，“牛蛙接头”是包含序列SEQ ID NO:217的接头。杂合铁蛋白有时也称为“bfpFerr”或“bfp铁蛋白”。可以在没有牛蛙序列的情况下，例如像在没有接头或在具有替代性接头的情况下提供包含牛蛙序列的任何构建体。示例性牛蛙接头序列提供于表1中。在表1示出牛蛙接头的情况下，可以在没有接头或具有替代性接头的情况下制造相同的构建体。
如本文所用，“糖基化”是指将糖单元添加至蛋白质。
如本文所用，“免疫应答”是指免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞)对刺激物(如抗原或疫苗)的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御应答的身体的任何细胞，例如包括分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性和/或适应性免疫应答。如本文所用，“保护性免疫应答”是指保护受试者免受感染(例如，预防感染或预防与感染相关的疾病的发生)的免疫应答。测量免疫应答的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如通过测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。“抗体应答”是其中产生抗体的免疫应答。
如本文所用，“免疫刺激部分”是指共价附接至铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽并可以激活免疫系统的组分(单独或当附接至铁蛋白或抗原性铁蛋白多肽时)的部分。示例性免疫刺激部分包括toll样受体(TLR)例如TLR 4、7、8或9的激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分是佐剂。
如本文所用，术语“试剂盒”是指一组经包装的相关组分，如一种或多种化合物或组合物和一种或多种相关材料，如溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。
如本文所用，“N-聚糖”是指在蛋白质的N(天冬酰胺)残基的酰胺氮处附接至蛋白质的糖链。这样，通过N-糖基化过程形成N-聚糖。此聚糖可以是多糖。
如本文所用，“OspA胞外结构域”是指博氏疏螺旋体OspA的大约氨基酸残基27-273(UniProt登录号P0CL66)或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物的相应位置。OspA胞外结构域的另外例子包括SEQ ID NO:83-89中任一个的位置27-X，其中X是相关序列的C末端位置，任选地其中C末端Lys被省略。在一些实施方案中，胞外结构域在其N-末端进一步包含相应的全长野生型序列的第26残基或第25和第26残基；在SEQ ID NO:83-89中，第25和26残基是Asp和Glu。OspA胞外结构域的再另外的例子包括SEQ ID NO:94-102中的任一个，任选地其中N末端1、2或3个残基(Met-Asp-Glu)被省略，进一步任选地其中C末端Lys被省略。
如本文所用，“OspA跨膜结构域”是指博氏疏螺旋体OspA的大约氨基酸残基2-24(UniProt登录号P0CL66)或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物的相应位置。
如本文所用，“自佐剂化”是指组合物或多肽包含铁蛋白和直接缀合至铁蛋白的免疫刺激部分，使得铁蛋白和免疫刺激部分在同一分子实体中。可以将包含非铁蛋白多肽的抗原性铁蛋白多肽与免疫刺激部分缀合以产生自佐剂化多肽。
“抗原性OspA多肽”在本文中用于指包含全部或部分OspA的多肽，所述OspA的长度足以使所述多肽具有关于OspA的抗原性。全长OspA包含下文定义的跨膜结构域和胞外结构域。抗原性可以是作为进一步包含异源序列(如铁蛋白或2,4-二氧四氢喋啶合酶蛋白)的构建体的一部分的OspA序列的特征。即，如果OspA是进一步包含异源序列的构建体的一部分，则所述构建体可以充当产生抗OspA抗体的抗原就足够了，而不管不伴有异源序列的OspA序列是否可以如此。
“抗原性铁蛋白多肽”和“抗原性铁蛋白蛋白”在本文中可互换用于指包含铁蛋白和非铁蛋白多肽(如OspA)的多肽，所述非铁蛋白多肽的长度足以使所述分子具有关于非铁蛋白多肽的抗原性。抗原性铁蛋白多肽可以进一步包含免疫刺激部分。抗原性可以是作为较大构建体的一部分的非铁蛋白序列的特征。即，所述构建体可以充当针对非铁蛋白多肽的抗原就足够了，而不管不伴有铁蛋白(如果适用，和免疫刺激部分)的非铁蛋白多肽是否可以如此。在一些实施方案中，非铁蛋白多肽是OspA多肽，在这种情况下，抗原性铁蛋白多肽也是“抗原性OspA多肽”。然而，要清楚的是，“抗原性OspA多肽”不需要包含铁蛋白。“抗原性多肽”在本文中用于指为抗原性铁蛋白多肽和抗原性OspA多肽中的任一者或两者的多肽。本公开文本描述了分别与给定核酸序列或氨基酸序列(参考序列)具有一定同一性程度的核酸序列和氨基酸序列。
两个核酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”指示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“相同％”、“同一性％”或类似术语旨在具体是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯粹统计学的，并且两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过以下方式进行：在最佳比对之后，关于区段或“比较窗口”比较所述序列，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动地进行或借助于Smith和Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法、借助于Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索算法、或借助于使用所述算法的计算机程序(在Wisconsin序列分析包(Genetics Computer Group,575Science Drive,威斯康星州麦迪逊)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLASTN和TFASTA)进行。
百分比同一性通过以下方式获得：确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用此数目除以比较的位置的数目(例如，参考序列中的位置的数目)，并且然后将此结果乘以100。
在一些实施方案中，同一性程度是针对区域给出的，所述区域是参考序列的整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中为连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列的整个长度给出同一性程度。
分别与给定核酸序列或氨基酸序列具有特定同一性程度的核酸序列或氨基酸序列可具有所述给定序列的至少一种功能特性，例如并且在一些情况下，在功能上等同于所述给定序列。一个重要的特性包括充当细胞因子的能力，特别是当给予受试者时。在一些实施方案中，与给定核酸序列或氨基酸序列具有一定同一性程度的核酸序列和氨基酸序列在功能上等同于所述给定序列。
如本文所用，“受试者”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“受试者”是指人。在一些实施方案中，“受试者”是指非人动物。在一些实施方案中，受试者包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在某些实施方案中，非人受试者是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/猪)。在一些实施方案中，受试者可以是转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。在本发明的某些实施方案中，受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，术语“个体”或“患者”被使用并且旨在与“受试者”可互换。
如本文所用，“表面暴露的”氨基酸是指蛋白质(例如，铁蛋白)中具有侧链的氨基酸残基，当所述蛋白质在多聚化后(如果适用)处于其天然的三维构象时，所述侧链可以被溶剂分子接触。因此，例如，在形成24聚体的铁蛋白的情况下，当铁蛋白组装为24聚体，例如组装为铁蛋白多聚体或铁蛋白颗粒时，表面暴露的氨基酸残基是其侧链可以被溶剂接触的氨基酸残基。
如本文所用，术语“疫苗接种(vaccination或vaccinate)”是指给予旨在例如对致病因子产生免疫应答的组合物。疫苗接种可以在暴露于致病因子和/或发生一种或多种症状之前、期间和/或之后给予，并且在一些实施方案中，在暴露于所述因子之前、期间和/或之后不久给予。在一些实施方案中，疫苗接种包括间隔适当时间的疫苗接种组合物的多次给予。
B.OspA多肽
提供了OspA多肽，OspA多肽在单独给予、与作为单独分子的佐剂一起给予和/或作为可以自佐剂化的纳米颗粒(例如，铁蛋白颗粒或2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒)的一部分给予时可以是抗原性的。在一些实施方案中，OspA多肽包含疏螺旋体属的修饰的外表面蛋白A(OspA)。OspA以多种血清型存在，所述多种血清型如通过其与针对OspA的不同表位的单克隆抗体的反应性所定义(参见Wilske等人,J Clin Microbio 31(2):340-350(1993))。这些血清型与疏螺旋体属细菌的不同基因种相关联。在一些实施方案中，OspA是血清型1-7中的任一种。在一些实施方案中，OspA来自博氏疏螺旋体、梅奥疏螺旋体(Borrelia mayonii)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)或巴伐利亚疏螺旋体(Borrelia bavariensis)。在一些实施方案中，OspA是博氏疏螺旋体OspA。在一些实施方案中，疏螺旋体属可以由硬蜱属(Ixodes)的蜱虫携带。在一些实施方案中，疏螺旋体属是博氏疏螺旋体、梅奥疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体或巴伐利亚疏螺旋体。
在一些实施方案中，OspA多肽是OspA血清型1多肽，如OspA血清型1胞外结构域。文献报道，OspA血清型1的在SEQ ID NO:83的氨基酸165-173处的表位与人白细胞功能相关抗原1(hLFA-1)的序列片段(即SEQ ID NO:78)具有同源性(参见Gross,D.M.等人,Science281(5377):第703-6页(1998))。SEQ ID NO:83的氨基酸165-173在SEQ ID NO:77中示出为分离的九肽，并且称为hLFA-1同源位点。SEQ ID NO:83是示例性野生型血清型1OspA序列，所述序列在本文中用作讨论OspA中的氨基酸位置的参考序列。此同源位点可能在莱姆关节炎(包括抗生素抗性莱姆关节炎)的发生中起作用。本文描述了抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含疏螺旋体属的修饰的OspA血清型1多肽，其中修饰的OspA不包含SEQ IDNO:77的序列。当用于引发抗体时，此类多肽可以具有改善的安全性，例如降低的触发自身免疫应答的风险。在一些实施方案中，OspA血清型1多肽具有降低与hLFA-1的同一性的一种或多种修饰。涵盖了降低与SEQ ID NO:78的同源性、降低与SEQ ID NO:78的同一性或相对于SEQ ID NO:78引入一个或多个非保守取代的任何修饰。在一些实施方案中，提供了抗原性多肽，所述抗原性多肽包含疏螺旋体属的OspA血清型1多肽，其中多肽不包含SEQ ID NO:77的序列。在一些实施方案中，抗原性多肽包含OspA血清型1的胞外结构域，其中胞外结构域不包含SEQ ID NO:77的序列。在一些实施方案中，抗原性OspA血清型1多肽包含与SEQ IDNO:94-102中任一个的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
“降低同源性”涵盖降低序列同一性和/或降低序列相似性，其中认为在下表中列为保守取代的一组氨基酸中的每个成员与所列的原始残基以及与该组的其他成员相似；例如，表格的第一行指示丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸彼此相似，并且第八行指示丙氨酸和甘氨酸彼此相似。相似性不具有传递性，因此例如，异亮氨酸和甘氨酸不被认为相似。在一些实施方案中，修饰的OspA包括与野生型OspA血清型1相比具有降低的与hLFA-1的同源性的OspA血清型1蛋白。在一些实施方案中，修饰的OspA包括含有对SEQ ID NO:77的任何一个或多个氨基酸的修饰的OspA血清型1。在一些实施方案中，对SEQ ID NO:77的修饰是非保守氨基酸取代。非保守取代是与下表中所示的保守取代不同的取代。
表3：保守氨基酸取代
Figure BDA0002795913570000211
Figure BDA0002795913570000221
在一些实施方案中，SEQ ID NO:77的一个或多个氨基酸被非血清型1OspA(如血清型2、3、4、5、6或7OspA)的一个或多个相应氨基酸置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:77的每个氨基酸被血清型2、3、4、5、6或7OspA的一个或多个相应氨基酸置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:77的氨基酸被血清型2(S2，SEQ ID NO:79)或血清型3(S3，SEQ ID NO:80)的相应氨基酸置换。
在一些实施方案中，修饰的OspA包含SEQ ID NO:81。在一些实施方案中，修饰的OspA包含SEQ ID NO:82。SEQ ID NO:81和82旨在置换SEQ ID NO:77并由此降低了与SEQ IDNO:78的同源性。
在一些实施方案中，多肽是全长OspA(例如，包括跨膜结构域和胞外结构域，其可以包含或可以不包含如本文所述的用以降低与hLFA-1的同源性的修饰)。
在一些实施方案中，多肽缺乏跨膜结构域。在一些实施方案中，多肽缺乏跨膜结构域的一部分，例如野生型OspA序列的N末端2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸。在一些实施方案中，多肽缺乏下述区段，所述区段包含OspA血清型1的氨基酸17或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物的相应位置。在一些实施方案中，多肽至少缺乏OspA(如OspA血清型1)的氨基酸1-17，或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物中的对应氨基酸。在一些实施方案中，多肽至少缺乏OspA(如OspA血清型1)的N末端18、19、20、21、22、23或24个氨基酸，或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物中的对应氨基酸。在一些实施方案中，多肽缺乏OspA(如OspA血清型1)的氨基酸1-25，或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物中的对应氨基酸。在一些实施方案中，多肽缺乏OspA血清型1的氨基酸1-26，或如通过成对或结构比对鉴定的其同源物中的对应氨基酸。为了避免疑问，缺乏跨膜结构域并不要求多肽缺乏N端甲硫氨酸；例如，认为其中第一残基是甲硫氨酸并且第二残基对应于野生型OspA的残基26，之后是对应于第27、第28等野生型OspA残基的残基的多肽缺乏跨膜结构域。在一些实施方案中，包含OspA的多肽缺乏脂化位点，如野生型OspA血清型1的跨膜结构域内所包含的脂化位点。在一些实施方案中，多肽缺乏OspA血清型1的半胱氨酸17。在一些实施方案中，多肽不包含对应于野生型OspA(例如，SEQ ID NO:83-89中的任一种)的位置1-25中的任一个的半胱氨酸。在一些实施方案中，多肽缺乏或具有在OspA血清型1的半胱氨酸17处的取代。在一些实施方案中，多肽缺乏野生型OspA跨膜结构域的至少一部分，由此使得其缺乏脂化位点。在一些实施方案中，多肽缺乏与OspA血清型1的氨基酸1-17对齐的氨基酸。
在一些实施方案中，多肽不包含棕榈酰基基团。在一些实施方案中，多肽不包含二酰基甘油基团。在一些实施方案中，多肽是非脂化的。在一些实施方案中，多肽缺乏脂化位点。在一些实施方案中，此脂化位点包含在跨膜结构域内。在一些实施方案中，去除的脂化位点是OspA血清型1的半胱氨酸17。在一些实施方案中，多肽缺乏或具有在OspA血清型1的半胱氨酸17处的取代。
在一些实施方案中，OspA脂化位点和/或跨膜结构域或其部分的去除，和/或棕榈酰基和/或二酰基甘油基团的缺乏使得蛋白质纯化更容易，例如，通过改善蛋白质的溶解性和/或使蛋白质更适于通过如离子交换和其他形式的色谱的技术进行纯化。
在一些实施方案中，多肽包含哺乳动物前导序列(也称为信号序列)。在一些实施方案中，哺乳动物前导序列当在哺乳动物细胞中表达时导致多肽的分泌。
在一些实施方案中，多肽缺乏糖基化位点。本文详细描述了去除糖基化位点的修饰。根据本公开文本的OspA多肽可以包含任何这种修饰，这种修饰可以与本文所述的任何其他修饰(包括对hLFA-1同源位点的修饰和/或部分或全部跨膜结构域的缺失)组合。在一些实施方案中，多肽不包含SEQ ID NO:77(例如，具有降低的与hLFA-1a的同源性)，并且具有修饰以减少糖基化和/或缺乏跨膜结构域。
1.糖基化的修饰
N-连接的糖基化是聚糖与蛋白质的天冬酰胺(Asn；N)残基的酰胺氮的附接。附接过程产生糖基化的蛋白质。糖基化可以发生在蛋白质翻译后可被糖基化酶接近并识别的蛋白质中的任何天冬酰胺残基处，并且最常见于为NXS/TX位点(其中在天冬酰胺之后的第二个氨基酸残基是丝氨酸或苏氨酸)的一部分的可接近天冬酰胺处。非人糖基化模式可能在用于引发抗体时使多肽产生不期望的反应原性。另外，正常未被糖基化的多肽的糖基化可改变其免疫原性。例如，糖基化可以掩盖蛋白质内重要的免疫原性表位。因此，为了减少或消除糖基化，可以对天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基进行修饰，例如通过取代为另一个氨基酸。
在一些实施方案中，对包含OspA的多肽进行修饰以减少或消除糖基化。在一些实施方案中，去除OspA中的一个或多个N-糖基化位点。在一些实施方案中，N-糖基化位点的去除降低了OspA的糖基化。在一些实施方案中，相对于野生型OspA(如野生型血清型1OspA)，多肽具有降低的糖基化。在一些实施方案中，N-糖基化位点的去除消除了OspA的糖基化。
在一些实施方案中，将OspA中的一个或多个天冬酰胺置换为非天冬酰胺氨基酸。在一些实施方案中，将OspA中的每个天冬酰胺置换为非天冬酰胺氨基酸。蛋白质中发现的任何天然或非天然氨基酸(例如谷氨酰胺)都可以用于置换天冬酰胺。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰修饰了NXS/TX糖基化位点(其中在N之后的第二个残基是S或T)。在一些实施方案中，NXS/TX位点中的第一个X不是脯氨酸和/或NXS/TX位点中的第二个X不是脯氨酸。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰是N至Q取代。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰是S/T至A取代。
下面详细讨论了可以修饰以减少或消除糖基化的位置。位置编号是指提供为SEQID NO:83-89的全长OspA序列中的位置。应理解的是，应当针对部分和修饰的OspA序列适当地调节位置编号(例如，如果N末端缺失导致净缩短了25个氨基酸残基，则位置编号应当减少25)。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型1(SEQ IDNO:83)的N20、N71、N190、N202和N251中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型1的N71、N190、N202和N251中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型1的N20Q、N71Q、N190Q、N202Q或N251Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到相应的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型2-7的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型1的N20、N71、N190、N202和N251对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型1的位置22、73、192、204和253处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型1的位置22、73、192、204和253处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型2(SEQ IDNO:84)的N20、N71、N141、N164、N202和N205中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型2的N20、N71、N141、N164、N202和N205中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型2的N20Q、N71Q、N141Q、N164Q、N202Q或N205Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型1或3-7的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型2的N20、N71、N141、N164、N202和N205对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型2的位置22、73、143、166、204和207处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型2的位置22、73、143、166、204和207处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型3(SEQ IDNO:85)的N20、N71、N95、N141、N191和N203中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型3的N20、N20、N71、N95、N141、N191和N203中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型3的N20Q、N71Q、N95Q、N141Q、N191Q或N203Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型1-2或4-7的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型3的N20、N20、N71、N95、N141、N191和N203对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型3的位置22、73、97、143、193和205处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型3的位置22、73、97、143、193和205处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型4(SEQ IDNO:86)的N20、N71、N141、N202、N205和N219中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型4的N20、N71、N141、N202、N205和N219中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型4的N20Q、N71Q、N141Q、N202Q、N205Q或N219Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型1-3或5-7的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型4的N20、N71、N141、N202、N205和N219对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型4的位置22、73、143、204、207和221处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型4的位置22、73、143、204、207和221处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型5的N20、N71和N141中的任何一个或多个的取代。(某些血清型(包括血清型5-7)比某些其他OspA序列(如血清型1)含有更少的糖基化位点)。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型5(SEQID NO:87)的N20、N71和N141中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型5的N20Q、N71Q或N141Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型1-4或6-7的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型5的N20、N71和N141对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型5的位置22、73和143处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型5的位置22、73和143处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型6(SEQ IDNO:88)的N20、N71和N141中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型6的N20、N71和N141中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型6的N20Q、N71Q或N141Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型1-5或7的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型6的N20、N71和N141对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型6的位置22、73和143处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型6的位置22、73和143处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对OspA血清型7(SEQ IDNO:89)的N20、N71、N141和N191中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括在OspA血清型7的N20、N71、N141和N191中的每一个处的修饰。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括OspA血清型7的N20Q、N71Q、N141Q或N191Q中的一个或多个。通过成对比对，可以在不同血清型的OspA中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，在血清型1-6的OspA中被置换的天冬酰胺残基是与OspA血清型7的N20、N71、N141和N191对齐的氨基酸残基。在一些实施方案中，用以减少或消除糖基化的修饰包括对在OspA血清型7的位置22、73、143和193处的Ser或Thr残基中的任何一个或多个的取代。在一些实施方案中，修饰包括用丙氨酸取代OspA血清型7的位置22、73、143和193处的Ser或Thr残基中的一个或多个。
C.包含OspA多肽和铁蛋白或2,4-二氧四氢喋啶合酶的抗原性OspA
在一些实施方案中，提供了抗原性多肽，所述抗原性多肽包含OspA多肽和铁蛋白或2,4-二氧四氢喋啶合酶。应当理解，本文公开的此类抗原性OspA多肽具有关于OspA组分的抗原性，例如，它们可以被给予至哺乳动物(如人)，以引发抗OspA抗体的产生。抗原性多肽的铁蛋白组分可以是任何物种的野生型铁蛋白，或任何物种的包含一个或多个突变的铁蛋白，二者均如本文所述。在一些实施方案中，抗原性多肽包含SEQ ID NO:1-76中任一个的氨基酸。在一些实施方案中，抗原性多肽包含与SEQ ID NO:1-76中任一个的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。抗原性多肽的2,4-二氧四氢喋啶合酶组分可以是任何物种的2,4-二氧四氢喋啶合酶。
在一些实施方案中，抗原性多肽包含哺乳动物前导序列(也称为信号序列)。在一些实施方案中，哺乳动物前导序列当在哺乳动物细胞中表达时导致抗原性多肽的分泌。
1.OspA多肽组分
抗原性OspA多肽可以包含本文所述的任何经修饰的OspA多肽。
例如，在一些实施方案中，抗原性OspA多肽的OspA组分包含OspA的胞外结构域。在一些实施方案中，OspA的胞外结构域来自血清型1、2、3、4、5、6或7中的任一种。示例性野生型OspA序列提供为SEQ ID NO:83-89。可以去除其N末端的25个氨基酸，例如以去除脂化位点。在实施例中还提供了示例性OspA序列的登录号。在一些实施方案中，胞外结构域来自博氏疏螺旋体、梅奥疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体或巴伐利亚疏螺旋体。在一些实施方案中，胞外结构域是博氏疏螺旋体的。
在一些实施方案中，胞外结构域是野生型胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域是修饰的胞外结构域，例如经修饰以减少糖基化的胞外结构域。在上一章节中提供了对糖基化的介绍性讨论，并且为简洁起见，此处不再重复。抗原性OspA多肽的OspA组分可以包含本文所述的用于减少或消除糖基化的任何修饰，包括但不限于去除胞外结构域中的一个或多个N-糖基化位点，所述去除例如通过氨基酸取代进行，如本文详细讨论的。
在一些实施方案中，OspA胞外结构域作为抗原性多肽中较大OspA序列的一部分存在，所述较大OspA序列例如包含跨膜结构域的一部分或全部。在一些实施方案中，OspA胞外结构域以抗原性多肽内的全长OspA序列存在。在一些实施方案中，全长OspA序列是野生型全长OspA序列。在一些实施方案中，抗原性多肽不包含跨膜结构域。
上文讨论的任何修饰都可以组合在抗原性多肽中。在一些实施方案中，抗原性多肽包含至少一种减少糖基化的修饰和至少一种本文描述的另外修饰。
在一些实施方案中，抗原性多肽的OspA胞外结构域是在上文章节B中所述的经修饰的OspA胞外结构域中的任一种。
本文所述的任何OspA胞外结构域(或包含OspA胞外结构域的序列，如全长OspA)可以与下文所述的任何铁蛋白组合在抗原性多肽中。
2.铁蛋白组分
在一些实施方案中，涵盖了包含本文所述的抗原性OspA多肽和铁蛋白的融合蛋白。抗原性多肽中的铁蛋白可以是野生型或包含一个或多个突变(参见以下章节)。在一些实施方案中，铁蛋白是细菌、昆虫、真菌、鸟类或哺乳动物的。在一些实施方案中，铁蛋白是人的。在一些实施方案中，铁蛋白是细菌的。在一些实施方案中，铁蛋白是粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)铁蛋白(PDB：1Z6O_X，SEQ ID NO:211和212)。
在一些实施方案中，铁蛋白是轻链和/或重链铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是人重链铁蛋白(FTH1，GENE ID No:2495)或人轻链铁蛋白(FTL，GENE ID No:2512)。在一些实施方案中，铁蛋白是在本文中被称为“铁蛋白颗粒”或“铁蛋白纳米颗粒”的多聚体蛋白，其包含重链铁蛋白和轻链铁蛋白的24个总亚基。
在一些实施方案中，抗原性OspA多肽包含轻链铁蛋白和OspA多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽包含重链铁蛋白和OspA多肽。在一些实施方案中，可以将包含轻链铁蛋白和OspA多肽的抗原性多肽与未与非铁蛋白多肽连接的重链铁蛋白组装。在一些实施方案中，可以将包含重链铁蛋白和OspA多肽的抗原性多肽与未与非铁蛋白多肽连接的轻链铁蛋白组装。未与非铁蛋白多肽连接的铁蛋白可以称为“裸铁蛋白”。
在一些实施方案中，可以将包含重链铁蛋白和OspA多肽的抗原性多肽与包含轻链铁蛋白和OspA多肽的抗原性多肽组装，以允许在单一铁蛋白颗粒上表达2种相同或不同的抗原。在一些实施方案中，2种不同的抗原由单一感染原编码。在一些实施方案中，2种不同的抗原由2种不同的感染原(例如，不同血清型或物种的疏螺旋体属)编码。
在一些实施方案中，可以将包含重链铁蛋白和OspA多肽的抗原性多肽与包含轻链铁蛋白和OspA多肽的抗原性多肽组装，以产生二价组合物。在一些实施方案中，铁蛋白是幽门螺杆菌铁蛋白(对于在其N末端包含来自牛蛙铁蛋白的8氨基酸延伸区的示例性野生型幽门螺杆菌铁蛋白序列，参见SEQ ID NO:90)。在一些实施方案中，幽门螺杆菌铁蛋白(或其他细菌铁蛋白)与人铁蛋白之间较低的序列同源性在用作用于构建抗原性多肽的平台时可降低自身免疫的潜力(参见Kanekiyo等人,Cell 162,1090–1100(2015))。
在一些实施方案中，铁蛋白是任选地具有本文所述的一个或多个突变的激烈火球菌铁蛋白(NCBI seq WP_011011871.1)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含与野生型铁蛋白具有大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、或大于99％同一性的序列。
在一些实施方案中，铁蛋白是昆虫铁蛋白。在一些实施方案中，铁蛋白是任选地具有本文所述的一个或多个突变的粉纹夜蛾铁蛋白(PDB：1Z6O_X，SEQ ID NO:211和212)。
a)铁蛋白突变
在一些实施方案中，本文公开了包含一个或多个突变的铁蛋白。在一些实施方案中，一个或多个突变包括野生型铁蛋白的氨基酸序列的改变和/或例如在N或C末端的插入。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白相比，(在一些实施方案中，除了任何N末端插入)，铁蛋白中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个不同的氨基酸被突变。一个或多个突变可以改变铁蛋白的功能特性，例如，如下文详细讨论的。通常，突变简单地是指相对于相应的野生型铁蛋白的序列差异(如取代、添加或缺失的一个或多个氨基酸残基)。
(1)用于缀合的半胱氨酸
在一些实施方案中，铁蛋白被突变以提供用于缀合免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽的化学处理。这可以通过用半胱氨酸置换表面暴露的非半胱氨酸氨基酸的突变来实现。为了避免疑问，如“用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸”的语言必定意味着野生型或突变前序列中的表面暴露的氨基酸不是半胱氨酸。提供用于缀合免疫刺激部分或非铁蛋白多肽的化学处理的另一种方法是包括在铁蛋白的N或C末端的氨基酸区段(如接头)，其中所述氨基酸区段包含半胱氨酸。在一些实施方案中，此半胱氨酸(无论是置换表面暴露的氨基酸还是在N或C末端接头中)是不成对的，这意指它没有合适的伴侣半胱氨酸来形成二硫键。在一些实施方案中，此半胱氨酸不改变铁蛋白的二级结构。在一些实施方案中，此半胱氨酸不改变铁蛋白的三级结构。
在一些实施方案中，此半胱氨酸可以用于将药剂(如免疫刺激部分)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，此半胱氨酸提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白上的此半胱氨酸缀合的药剂暴露在组装的铁蛋白颗粒的表面上。在一些实施方案中，在组装铁蛋白颗粒的同时，此半胱氨酸可以在给予后与受试者的分子和细胞相互作用。
在一些实施方案中，此半胱氨酸的存在允许缀合一个或多个免疫刺激部分，例如佐剂。在一些实施方案中，在不存在此半胱氨酸的情况下不会发生免疫刺激部分的缀合。
在一些实施方案中，被半胱氨酸置换的非半胱氨酸氨基酸选自幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S72、A75、K79、S100和S111。因此，在一些实施方案中，被置换为半胱氨酸的表面暴露的氨基酸是对应于幽门螺杆菌铁蛋白的E12、S26、S72、A75、K79、S100或S111的氨基酸残基。通过成对或结构比对可以在非幽门螺杆菌铁蛋白中找到类似的氨基酸。在一些实施方案中，被半胱氨酸置换的非半胱氨酸氨基酸可以选自对应于人轻链铁蛋白的S3、S19、S33、I82、A86、A102和A120的氨基酸。在一些实施方案中，基于以下理解来选择要被半胱氨酸置换的表面暴露的氨基酸：如果天然氨基酸被半胱氨酸置换，它将在组装的铁蛋白多聚体或颗粒中是反应性的和/或此半胱氨酸不会破坏铁蛋白多聚体或颗粒的稳定性和/或此半胱氨酸不会导致铁蛋白表达水平降低。
在一些实施方案中，铁蛋白包含E12C突变。在一些实施方案中，E12C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，E12C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的E12C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个E12C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S26C突变。在一些实施方案中，S26C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S26C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S26C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S26C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S72C突变。在一些实施方案中，S72C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S72C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S72C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S72C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含A75C突变。在一些实施方案中，A75C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，A75C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的A75C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个A75C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含K79C突变。在一些实施方案中，K79C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，K79C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的K79C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个K79C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S100C突变。在一些实施方案中，S100C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S100C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S100C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S100C残基(每个单体中一个)。
在一些实施方案中，铁蛋白包含S111C突变。在一些实施方案中，S111C残基可以用于将药剂(例如，免疫刺激部分和/或非铁蛋白多肽)与铁蛋白缀合。在一些实施方案中，S111C残基提供了反应性的游离硫醇基团。在一些实施方案中，与铁蛋白单体上的S111C残基缀合的药剂在组装的铁蛋白多聚体或颗粒的表面上表达。在一些实施方案中，铁蛋白多聚体或颗粒的表面上存在二十四个S111C残基(每个单体中一个)。
(2)内部半胱氨酸的去除
在一些实施方案中，铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变。去除天然内部半胱氨酸残基可以确保每个铁蛋白单体只有一个未配对的半胱氨酸，并且避免了不希望的反应(如二硫化物形成)，并且可以导致更稳定且高效的结果(例如，佐剂呈递)。在一些实施方案中，幽门螺杆菌铁蛋白的C31被非半胱氨酸氨基酸置换。在一些实施方案中，用丝氨酸(C31S)置换幽门螺杆菌铁蛋白的C31，但是可以使用任何非半胱氨酸残基，例如丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺。通过成对或结构比对可以在非幽门螺杆菌铁蛋白中找到类似的氨基酸。因此，在一些实施方案中，被置换为非半胱氨酸的内部半胱氨酸是与幽门螺杆菌铁蛋白的C31对齐的氨基酸残基。显示C31S突变的示例性铁蛋白序列在SEQ IDNO:201-207中示出。在一些实施方案中，当铁蛋白中存在多于一个内部半胱氨酸时，两个或更多个(例如，每个)内部半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸置换，所述非半胱氨酸氨基酸如丝氨酸或选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺的氨基酸。
(3)糖基化
人相容性糖基化可有助于重组药物产品的安全性和功效。监管批准可能取决于证明适当的糖基化是关键的质量属性(参见Zhang等人,Drug Discovery Today 21(5):740-765(2016))。N-聚糖可以由天冬酰胺侧链的糖基化产生，并且在人与其他生物体(如细菌和酵母)之间的结构可能不同。因此，可能期望减少或消除根据本公开文本的铁蛋白中的非人糖基化和/或N-聚糖形成。在一些实施方案中，控制铁蛋白的糖基化改善了组合物的功效和/或安全性，尤其是当用于人疫苗接种时。
在一些实施方案中，铁蛋白被突变以抑制N-聚糖的形成。在一些实施方案中，与其相应的野生型铁蛋白相比，突变的铁蛋白具有降低的糖基化。
在一些实施方案中，铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变。在一些实施方案中，表面暴露的天冬酰胺是幽门螺杆菌铁蛋白的N19或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置。在一些实施方案中，使这种天冬酰胺(例如幽门螺杆菌铁蛋白的N19)突变降低了铁蛋白的糖基化。在一些实施方案中，突变是用谷氨酰胺置换了天冬酰胺。在一些实施方案中，铁蛋白是包含N19Q突变的幽门螺杆菌铁蛋白。SEQ ID NO:201-207是包含N19Q突变的示例性铁蛋白序列。
暴露于细菌或酵母中产生的糖基化蛋白的哺乳动物可能会对糖基化蛋白产生免疫应答，因为细菌或酵母中给定蛋白的糖基化模式可能与哺乳动物中相同蛋白的糖基化模式不同。因此，一些糖基化的治疗性蛋白质可能不适合在细菌或酵母中生产。
在一些实施方案中，通过氨基酸突变进行的铁蛋白糖基化减少有利于蛋白质在细菌或酵母中的产生。在一些实施方案中，减少的铁蛋白糖基化降低了在给予在细菌或酵母中表达的突变铁蛋白后在哺乳动物中产生不利影响的可能性。在一些实施方案中，因为糖基化减少，所以在细菌或酵母中产生的突变铁蛋白在人受试者中的反应原性降低。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白相比，用具有减少的糖基化的突变铁蛋白治疗后，人受试者中超敏反应的发生率较低。
在一些实施方案中，与包含野生型铁蛋白的组合物或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物在受试者中的降解较慢。在一些实施方案中，与包含野生型铁蛋白的组合物或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物在受试者中具有降低的清除率。在一些实施方案中，与野生型铁蛋白或包含具有野生型糖基化的相应铁蛋白的组合物相比，包含具有减少的糖基化的突变铁蛋白的组合物具有更长的血清半衰期。
(4)突变的组合
在一些实施方案中，铁蛋白包含本文所述的多于一种类型的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含一种或多种独立地选自以下项的突变：减少糖基化的突变、去除内部半胱氨酸的突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含减少糖基化的突变、去除内部半胱氨酸的突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。
在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和产生表面暴露的半胱氨酸的突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和E12C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S72C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和A75C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和K79C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S100C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含N19Q突变、C31S突变和S111C突变。在一些实施方案中，铁蛋白包含对应于前述突变组中的任一种的突变，其中相应的突变在通过铁蛋白氨基酸序列与幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:208或209)的成对比对确定的位置处将N改变为Q、将C改变为S，并且将非半胱氨酸表面暴露的氨基酸改变为半胱氨酸。
包含多于一种类型的突变的示例性铁蛋白提供于SEQ ID NO:201-207中。
3.结构比对
如本文所讨论，可以通过成对或结构比对来鉴定对应于关于给定多肽(例如，幽门螺杆菌铁蛋白)描述的那些的突变位置。结构比对与大型蛋白质家族(如铁蛋白)有关，在大型蛋白质家族中，尽管有相当大的序列变异，但蛋白质共享相似的结构并且家族的许多成员已在结构上进行了表征；并且还可以用于鉴定本文所述的其他多肽(如螺旋体属多肽(例如，OspA))的不同形式中的相应位置。蛋白质数据库(PDB)包括许多铁蛋白的3D结构，包括下文用其登录号列出的那些。
2jd6、2jd7–PfFR-激烈火球菌。2jd8–PfFR+Zn。3a68–来自基因SferH4的soFR–大豆。3a9q-来自基因SferH4的soFR(突变体)。3egm、3bvf、3bvi、3bvk、3bvl–HpFR–幽门螺杆菌。5c6f–HpFR(突变体)+Fe。1z4a、1vlg–FR–海栖热袍菌(Thermotoga maritime)。1s3q、1sq3、3kx9–FR–闪烁古生球菌(Archaeoglubus fulgidus)。1krq–FR–空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)。1eum-EcFR–大肠杆菌。4reu–EcFR+Fe。4xgs–EcFR(突变体)+Fe2O2。4ztt–EcFR(突变体)+Fe2O+Fe2+Fe+O2。1qgh–LiFR-英诺克李斯特菌(Listeriainnocua)。3qz3-VcFR–霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。3vnx–FR–孔石莼(Ulva pertusa)。4ism、4isp、4itt、4itw、4iwj、4iwk、4ixk、3e6s–PnmFR–多列拟菱形藻(Pseudo-nitschiamultiseries)。4zkh、4zkw、4zkx、4zl5、4zl6、4zlw、4zmc–PnmFR(突变体)+Fe。1z6o–FR–粉纹夜蛾。4cmy–FR+Fe–花柱绿杆菌(Chlorobaculum tepidum)。铁蛋白轻链(FTL)。1lb3、1h96–mFTL–小鼠。1rcc、1rcd、1rci–bFTL+酒石酸盐+Mg。1rce、1rcg-bFTL+酒石酸盐+Mn。3noz、3np0、3np2、3o7r–hoFTL(突变体)-马。3o7s、3u90-hoFTL。4v1w–hoFTL–低温EM。3rav、3rd0–hoFTL+巴比妥酸盐。铁蛋白轻+重链：5gn8–hFTH+Ca。
结构比对涉及通过以下方式来鉴定两个(或更多个)多肽序列中的相应残基：(i)使用第二序列的已知结构对第一序列的结构建模或(ii)比较两者均已知的第一序列和第二序列的结构，并且鉴定第一序列中与第二序列中的目的残基最相似定位的残基。在一些算法中，基于叠加结构中的α-碳距离最小化(例如，哪组成对α碳为比对提供最小的均方根偏差)鉴定出相应的残基。当鉴定非幽门螺杆菌铁蛋白中的对应于关于幽门螺杆菌铁蛋白描述的位置的位置时，幽门螺杆菌铁蛋白可以是“第二”序列。在目的幽门螺杆菌铁蛋白没有已知的可用结构，但相比于幽门螺杆菌铁蛋白与另一种具有已知结构的非幽门螺杆菌铁蛋白紧密相关的情况下，可能最有效的是使用紧密相关的非幽门螺杆菌铁蛋白的已知结构来对目的非幽门螺杆菌铁蛋白建模，然后将该模型与幽门螺杆菌铁蛋白结构进行比较，以鉴定目的铁蛋白中的期望的相应残基。关于结构建模和比对有大量文献，代表性的披露文本包括US 6859736；US 8738343；以及Aslam等人,Electronic Journal of Biotechnology20(2016)9–13中引用的内容。对于基于已知的一种或多种相关结构对结构建模的讨论，参见例如Bordoli等人,Nature Protocols 4(2009)1–13及其中引用的参考文献。
4.2,4-二氧四氢喋啶合酶
在一些实施方案中，抗原性多肽包含2,4-二氧四氢喋啶合酶蛋白(参见Ra等人,Clin Exp Vaccine Res 3:227-234(2014))。在一些实施方案中，此蛋白质是2,4-二氧四氢喋啶合酶血清型1、2、3、4、5、6或7。示例性2,4-二氧四氢喋啶合酶序列提供为SEQ ID NO:216和219。在一些实施方案中，2,4-二氧四氢喋啶合酶包含与SEQ ID NO:216或219具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。2,4-二氧四氢喋啶合酶可以形成更高级的结构，例如60个亚基的2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒。示例性2,4-二氧四氢喋啶合酶是风产液菌(Aquifex aeolicus)2,4-二氧四氢喋啶合酶和大肠杆菌2,4-二氧四氢喋啶合酶。2,4-二氧四氢喋啶合酶可以位于OspA(例如，包含OspA胞外结构域的序列，如全长OspA)的C末端，并且可以通过如本文所讨论的接头与OspA分开。包含2,4-二氧四氢喋啶合酶蛋白的示例性抗原性多肽是SEQ ID NO:12-21。在一些实施方案中，抗原性多肽包含与SEQ ID NO:12-21中的任一个具有80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
5.接头
在一些实施方案中，将铁蛋白或2,4-二氧四氢喋啶合酶经由接头连接(例如融合)至OspA(例如，包含OspA胞外结构域的序列，如全长OspA)。
在一些实施方案中，接头将非铁蛋白多肽(例如，OspA)的氨基酸序列与铁蛋白的氨基酸序列分开。可以使用任何接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，其可以有利于抗原性铁蛋白多肽作为融合蛋白的表达(例如，从单一开放阅读框)。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在一些实施方案中，甘氨酸-丝氨酸接头是GS、GGGS(SEQ ID NO:226)、2XGGGS(SEQ ID NO:91)(即，GGGSGGGS(SEQ ID NO:91))或5XGGGS(SEQ ID NO:92)。接头可以在铁蛋白的N或C末端。
在一些实施方案中，接头的长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约2-4、2-6、2-8、2-10、2-12或2-14个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少15个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少25个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少30个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少35个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为至少40个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度小于或等于60个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度小于或等于50个氨基酸。在一些实施方案中，接头的长度为约16、28、40、46或47个氨基酸。在一些实施方案中，接头是柔性的。在一些实施方案中，接头包含半胱氨酸，例如以用作用于缀合免疫刺激部分(例如，佐剂)的位点；包含半胱氨酸的示例性接头提供为SEQ ID NO:225。在一些实施方案中，接头包含与SEQID NO:225具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的序列，并且进一步包含对应于SEQ ID NO:225中的半胱氨酸的半胱氨酸。在一些实施方案中，接头包含至少25个氨基酸(例如，25至60个氨基酸)，其中半胱氨酸位于在自N末端的第8个氨基酸到自C末端的第8个氨基酸范围内的位置处，或位于接头的中心残基或键的10个氨基酸之内。
在一些实施方案中，接头包含甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)氨基酸。在一些实施方案中，接头包含以下项或由以下项组成：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)和/或丙氨酸(A)氨基酸以及任选的如上所讨论的半胱氨酸。在一些实施方案中，接头包含与SEQ ID NO:222具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头是GGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:220)、GGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(SEQ ID NO:221)、GGSGSASSGASASGSSNGSGSGSGSNSSASSGASSGGASGGSGGSG(SEQ ID NO:222)或GS。在一些实施方案中，接头是FR1(SEQ ID NO:223)或FR2(SEQ ID NO:224)。
在一些实施方案中，铁蛋白包括具有牛蛙铁蛋白的氨基末端延伸区的幽门螺杆菌铁蛋白(其将被称为杂合铁蛋白)。在一些实施方案中，此杂合铁蛋白形成具有均匀分布在表面上的非铁蛋白多肽附接位点的多聚体(参见Kanekiyo 2015)。在一些实施方案中，具有杂合铁蛋白的N末端融合蛋白允许非铁蛋白多肽在铁蛋白纳米颗粒表面上的呈递。在一些实施方案中，非铁蛋白多肽是病毒或细菌多肽。在一些实施方案中，铁蛋白在对应于SEQ IDNO:208(杂合铁蛋白，其包含此谷氨酸)的位置13或在SEQ ID NO:209(野生型幽门螺杆菌铁蛋白，其中位置6是异亮氨酸)中的位置6的位置处包含谷氨酸。与牛蛙接头结合时，此谷氨酸被认为可以保留人和牛蛙铁蛋白中发现的保守盐桥(人轻链和牛蛙低级亚基铁蛋白中的6R和14E)。参见Kanekiyo等人,Cell 162,1090–1100(2015))。
在一些实施方案中，抗原性OspA多肽经由半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头连接至铁蛋白。在一些实施方案中，此接头用于经由点击化学将部分(例如，免疫刺激性部分或非铁蛋白多肽)直接缀合至铁蛋白。包含半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头的示例性序列是SEQ IDNO:218。上文讨论了适合于涉及半胱氨酸-凝血酶-组氨酸接头的缀合反应的点击化学。
在一些实施方案中，将包含半胱氨酸作为免疫刺激部分(如佐剂)的缀合位点的接头用于包含缺乏不成对的表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白分子的构建体中，或用于包含含有不成对的表面暴露的半胱氨酸的铁蛋白分子的构建体中。
在一些实施方案中，构建体不包含接头。在一些实施方案中，构建体包含一个接头。在一些实施方案中，构建体包含两个或多于两个的接头。
6.免疫刺激部分；佐剂；缀合的多肽
在一些实施方案中，将非铁蛋白多肽(例如，OspA多肽)和/或免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸或接头。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸是半胱氨酸，例如，由上文讨论的突变产生的半胱氨酸。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸是赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。使用戊二醛(用于将赖氨酸与带氨基的接头或部分缀合)或碳二亚胺(例如用于将天冬氨酸或谷氨酸与带氨基的接头或部分或将赖氨酸与带羧基的接头或部分缀合的1-环己基-3-(2-吗啉-4-基-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺(EDC；EDAC))的缀合程序例如描述于可从万维网springer.com获得的Holtzhauer,M.,Basic Methods for the Biochemical Lab,Springer 2006,ISBN 978-3-540-32785-1的第四章中。
在一些实施方案中，将免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，将多于一个免疫刺激部分(如佐剂)附接至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，将二十四个免疫刺激部分附接至铁蛋白多聚体或颗粒(例如，幽门螺杆菌铁蛋白颗粒中每个单体有一个部分)。在具有多个附接至铁蛋白纳米颗粒的免疫刺激部分的实施方案中，所有的免疫刺激部分是相同的。在具有多个附接至铁蛋白纳米颗粒的免疫刺激部分的实施方案中，所有的免疫刺激部分是不相同的。
a)免疫刺激部分的类型；佐剂
可以附接至表面暴露的氨基酸(例如半胱氨酸)的任何免疫刺激部分都可以用于根据本公开文本的铁蛋白(或接头)中。在一些实施方案中，免疫刺激部分是B细胞激动剂。
在一些实施方案中，免疫刺激部分不是疏水性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分是亲水性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分是极性的。在一些实施方案中，免疫刺激部分能够进行氢键结合或离子键结合，例如包含氢键供体、氢键受体、阳离子部分或阴离子部分。如果部分在生理上相关的pH(如pH 6、7、7.4或8)下在水性溶液中将被离子化，则可以认为所述部分是阳离子或阴离子的。
在一些实施方案中，免疫刺激部分是佐剂。在一些实施方案中，佐剂包括病原体相关分子模式(PAMP)。在一些实施方案中，佐剂是Toll样受体(TLR)激动剂，或干扰素基因刺激物(STING)激动剂。在一些实施方案中，佐剂激活B和/或T细胞中的TLR信号传导。在一些实施方案中，佐剂调节适应性免疫应答。
(1)TLR2激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR2信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR2信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR2激动剂是PAM2CSK4、FSL-1或PAM3CSK4。
(2)TLR7/8激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8激动剂(即，TLR7和TLR8中至少一者的激动剂)。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR7和/或TLR8信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR7和/或TLR8信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是单链的(ssRNA)。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是咪唑并喹啉。在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是核苷类似物。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是咪唑并喹啉胺Toll样受体(TLR)激动剂，如3M-012(3M Pharmaceuticals)。游离3M-012的结构是：
Figure BDA0002795913570000411
应当理解的是，可以通过以下方式将免疫刺激部分(如3M-012)或本文所讨论的任何部分缀合至铁蛋白：用与本文所述的铁蛋白例如在表面暴露的半胱氨酸的硫处的键或与附接至这个硫的接头的键取代所述部分的适当的外围原子(例如氢)。因此，当缀合至铁蛋白时，免疫刺激部分的结构将与游离分子的结构略有不同。
在一些实施方案中，TLR7和/或TLR8激动剂是SM7/8a。游离SM7/8a的结构是：
Figure BDA0002795913570000412
参见，例如Lynn等人,Nat Biotechnol.2015年11月；33(11):1201-10.doi:10.1038/nbt.3371。
(3)TLR9激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激TLR9信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是TLR9信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，TLR9激动剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施方案中，TLR9激动剂是未甲基化的CpG ODN。在一些实施方案中，CpG ODN包含部分或完整的硫代磷酸酯(PS)主链，而不是普通DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)主链。
在一些实施方案中，CpG ODN是B类ODN，其包含一个或多个含有5'嘌呤(Pu)-嘧啶(Py)-C-G-Py-Pu 3'的6聚体CpG基序；具有完全硫代磷酸化(即PS改性)的主链；并且长度为18-28个核苷酸。在一些实施方案中，CpG ODN包含SEQ ID NO:210的序列，任选地包含在主链中的硫代磷酸酯连接。
在一些实施方案中，TLR9激动剂包含免疫刺激序列(ISS)。在一些实施方案中，TLR9激动剂是ISS-1018(Dynavax)(SEQ ID NO:210)。
(4)STING激动剂
在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING(干扰素基因蛋白的刺激物，也称为内质网IFN刺激物)激动剂。在一些实施方案中，免疫刺激部分刺激STING信号传导。在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING的合成小分子配体。在一些实施方案中，免疫刺激部分是STING信号传导的合成小分子激动剂。
在一些实施方案中，STING激动剂是环状二核苷酸(CDN)。参见，例如Danilchanka等人,Cell 154:962-970(2013)。示例性CDN包括cdA、cdG、cAMP-cGMP和2'-5',3'-5'cGAMP(对于结构，参见Danilchanka等人)。STING激动剂还包括合成激动剂，如DMXAA
Figure BDA0002795913570000421
b)缀合的非铁蛋白多肽
在一些实施方案中，抗原性OspA多肽缀合至铁蛋白的表面暴露的氨基酸。在一些实施方案中，抗原性OspA多肽单独地具有抗原性，而在一些实施方案中，抗原性OspA多肽由于其与铁蛋白的缔合而具有抗原性。
7.缀合
在一些实施方案中，使用表面暴露的半胱氨酸来将免疫刺激部分(如佐剂)或抗原性OspA多肽缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，使用表面暴露的半胱氨酸来将接头缀合至铁蛋白，可以随后将所述接头缀合至免疫刺激部分(如佐剂)或抗原性OspA多肽。在一些实施方案中，表面暴露的半胱氨酸产生用于缀合反应以附接佐剂、接头或抗原性OspA多肽的化学处理。
在一些实施方案中，产生了生物缀合物，其中在还原铁蛋白的不成对的表面暴露的半胱氨酸后将免疫刺激部分(如佐剂)或抗原性OspA多肽连接至铁蛋白。不成对的表面暴露的半胱氨酸是缺乏适当位置的伴侣半胱氨酸来形成二硫键的半胱氨酸。在一些实施方案中，不成对半胱氨酸包含游离硫醇侧链。
a)缀合化学的类型
可以使用任何类型的化学，例如经由表面暴露的氨基酸(如半胱氨酸)或另一种氨基酸(如Lys、Glu或Asp)的反应，来将免疫刺激部分(如佐剂)或抗原性OspA多肽缀合至铁蛋白。
在一些实施方案中，使用点击化学进行缀合。如本文所用，“点击化学”是指彼此快速且选择性地反应(即，“点击”)的一对官能团之间的反应。在一些实施方案中，点击化学可以在温和的水性条件下进行。在一些实施方案中，点击化学反应利用铁蛋白表面上的半胱氨酸(如由表面暴露的氨基酸突变产生的半胱氨酸)来使用可与所述半胱氨酸反应的官能团进行点击化学。
满足点击化学标准的多种反应在本领域中是已知的，并且本领域技术人员可以使用许多公布的方法中的任何一种(参见，例如Hein等人,Pharm Res 25(10):2216-2230(2008))。可以使用众多种可商购的点击化学试剂，如来自Sigma Aldrich、JenaBioscience或Lumiprobe的那些。在一些实施方案中，如以下实施例中所述那样使用点击化学进行缀合。
在一些实施方案中，点击化学反应在铁蛋白还原之后发生。
在一些实施方案中，点击化学可以是1步式点击反应。在一些实施方案中，点击化学可以是2步式点击反应。
在一些实施方案中，一个或多个反应包括无金属点击化学。在一些实施方案中，一个或多个反应包括硫醇-马来酰亚胺和/或二硫化物交换。
无金属点击化学
可以将无金属点击化学用于缀合反应以避免蛋白质的潜在氧化。无金属点击化学已被用于形成抗体缀合物(参见van Geel等人,Bioconjugate Chem.2015,26,2233-2242)。
在一些实施方案中，在反应中使用无金属点击化学以将佐剂附接至铁蛋白。在一些实施方案中，在反应中使用无铜缀合以将佐剂附接至铁蛋白。在一些实施方案中，无金属点击化学使用双环[6.1.0]壬炔(BCN)。在一些实施方案中，无金属点击化学使用二苯并氮杂环辛炔(DBCO)。在一些实施方案中，BCN或DBCO与叠氮化物基团反应。
DBCO在不存在催化剂的情况下经由应变促进的点击反应对叠氮化物基团具有高特异性，从而产生高产率的稳定三唑。在一些实施方案中，DBCO在不存在铜催化剂的情况下与叠氮化物反应。
在一些实施方案中，在1步式点击反应中使用无金属点击化学。在一些实施方案中，在2步式点击反应中使用无金属点击化学。
硫醇-马来酰亚胺和二硫化物交换
本文所述的铁蛋白可以包含含有硫醇(也称为巯基)的半胱氨酸，其可用于与巯基反应性化学基团反应(或其可通过还原而变为可用的)。因此，半胱氨酸允许化学选择性修饰以将免疫刺激部分(如佐剂)添加至铁蛋白。在碱性条件下，半胱氨酸将被去质子化以产生硫醇盐亲核体，所述硫醇盐亲核体可以与软亲电体(如马来酰亚胺和碘乙酰胺)反应。半胱氨酸与马来酰亚胺或碘乙酰胺的反应产生碳-硫键。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团与铁蛋白的表面暴露的半胱氨酸或铁蛋白接头中的半胱氨酸反应。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物或TNB-硫醇。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团通过烷基化(即形成硫醚键)与半胱氨酸的巯基缀合。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团通过二硫化物交换(即形成二硫键)与半胱氨酸的巯基缀合。
在一些实施方案中，将免疫刺激部分(如佐剂)缀合至铁蛋白的反应是硫醇-马来酰亚胺反应。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是马来酰亚胺。在一些实施方案中，马来酰亚胺与半胱氨酸的反应导致形成稳定的硫酯连接，例如不可逆的硫酯连接。在一些实施方案中，马来酰亚胺不与铁蛋白中的酪氨酸、组氨酸或甲硫氨酸反应。在一些实施方案中，未反应的马来酰亚胺在反应结束时通过添加例如过量的游离硫醇来淬灭。
在一些实施方案中，使免疫刺激部分(如佐剂)与铁蛋白缀合的反应是硫醇-二硫化物交换，也称为二硫化物互换。在一些实施方案中，反应涉及形成包含一部分原始二硫化物的混合二硫化物。在一些实施方案中，原始二硫化物是通过表面暴露的氨基酸的突变或N末端接头的添加而在铁蛋白中引入的半胱氨酸。
在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是吡啶基二硫醇。在一些实施方案中，巯基反应性化学基团是TNB-硫醇基团。
b)接头
在一些实施方案中，免疫刺激部分(如佐剂)或抗原性OspA多肽经由与表面暴露的氨基酸(如半胱氨酸)共价结合的接头附接至铁蛋白。在一些实施方案中，接头包含聚乙二醇，例如PEG接头。在一些实施方案中，聚乙二醇(例如PEG)接头增加了与免疫刺激部分(如佐剂)连接的铁蛋白的水溶性和连接效率。PEG接头的长度在2至18个PEG之间，例如PEG4、PEG5、PEG6、PEG7、PEG8、PEG9、PEG10、PEG11、PEG12、PEG13、PEG14、PEG15、PEG16、PEG17和PEG18。
在一些实施方案中，接头包含马来酰亚胺。在一些实施方案中，接头包含免疫刺激部分(ISM)-接头-马来酰亚胺的组分。在一些实施方案中，通过马来酰亚胺与铁蛋白的半胱氨酸的反应，以1步式点击化学反应将ISM-接头-马来酰亚胺缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，佐剂-接头-马来酰亚胺的ISM是SM7/8a。在一些实施方案中，ISM-接头-马来酰亚胺的接头是PEG4。在一些实施方案中，ISM-接头-马来酰亚胺是SM7/8a-PEG4-马来酰亚胺。
在一些实施方案中，用下述接头使用2步式点击化学方案，所述接头在一端包含巯基反应性化学基团，并且在另一端包含胺反应性基团。在这种2步式点击化学方案中，巯基反应性化学基团与铁蛋白的半胱氨酸反应，而胺反应性基团与附接至ISM的试剂反应。以这种方式，ISM经由一组2种点击化学试剂缀合至铁蛋白。
在2步式点击化学方案的一些实施方案中，巯基反应性化学基团是马来酰亚胺。在2步式点击化学方案的一些实施方案中，马来酰亚胺与通过表面暴露的氨基酸的突变或N末端接头的添加而引入铁蛋白中的半胱氨酸反应。
在2步式点击化学方案的一些实施方案中，胺反应性基团是DBCO。在2步式点击化学方案的一些实施方案中，DBCO与附接至ISM的叠氮化物基团反应。
在一些实施方案中，使用马来酰亚胺-接头-DBCO。在一些实施方案中，在铁蛋白还原后，将马来酰亚胺-接头-DBCO缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，通过在第一步中马来酰亚胺与铁蛋白的半胱氨酸的反应，将马来酰亚胺-接头-试剂缀合至铁蛋白。在一些实施方案中，DBCO用于与附接至叠氮化物的ISM连接。在一些实施方案中，偶联至叠氮化物的ISM是ISS-1018。在一些实施方案中，偶联至叠氮化物的佐剂是3M-012或CpG。
在一些实施方案中，将具有反应性基团的接头添加至ISM。在一些实施方案中，接头是PEG4-叠氮化物接头或PEG4-马来酰亚胺接头。
在一些实施方案中，PEG4-叠氮化物接头缀合至3M-012。缀合至PEG4-叠氮化物接头的3M-012的示例性结构为：
Figure BDA0002795913570000461
在一些实施方案中，PEG4-叠氮化物接头缀合至SM7/8a。缀合至PEG4-叠氮化物接头的SM7/8a的示例性结构为：
Figure BDA0002795913570000462
在一些实施方案中，PEG4-马来酰亚胺接头缀合至SM7/8a。缀合至PEG4-马来酰亚胺接头的SM7/8a的示例性结构为：
Figure BDA0002795913570000471
在一些实施方案中，叠氮化物基团缀合至ISS-1018。缀合至NHS酯-叠氮化物接头的ISS-1018的示例性结构为：
Figure BDA0002795913570000472
D.示例性组合物、试剂盒、核酸、用途和方法
在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含本文所述的抗原性多肽中的任何一种或多种和药学上可接受的媒介物、佐剂或赋形剂。
在一些实施方案中，将本文所述的抗原性多肽或组合物给予至受试者(如人)，以针对由疏螺旋体属引起的感染(例如莱姆病)免疫。在一些实施方案中，将本文所述的抗原性多肽给予至受试者(如人)，以产生针对将来的疏螺旋体属感染的保护性免疫应答。在一些实施方案中，给予包含如本文所述的经修饰的OspA血清型1多肽的多肽。在一些实施方案中，给予包含如本文所述的OspA和铁蛋白的抗原性多肽。
在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了住院的发生率。在一些实施方案中，保护性免疫应答降低了急性或慢性莱姆病(包括关节发炎、神经系统症状、认知缺陷或心律不齐)的发生率。
在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型1多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型2多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型3多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型4多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型5多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型6多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型7多肽。在一些实施方案中，组合物仅包含一种OspA多肽。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型1、2、3、4、5、6和7中的一种或多种。
在一些实施方案中，组合物包含多于一种的OspA多肽，例如，来自多于一种的OspA血清型。在一些实施方案中，这种组合物实现了针对多种类型的疏螺旋体属(例如，血清型1-7中的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种)的疫苗接种。由于OspA的血清型与疏螺旋体属的基因种有关(参见Wilske 1993)，用这种包含多种血清型的OspA的组合物进行疫苗接种可以产生对可引起莱姆病的一系列细菌的免疫力。
在一些实施方案中，包含多种血清型的OspA的组合物产生针对表达不同OspA血清型的疏螺旋体属的免疫力。例如，如实施例中所讨论的，已经观察到包含血清型1-5和7的OspA多肽的组合物可以引发识别OspA血清型6的抗体。在一些实施方案中，这种组合物产生针对疏螺旋体属的多种基因种的免疫力。
在一些实施方案中，组合物包含两种不同的OspA血清型。在一些实施方案中，多价组合物包含三种不同的OspA血清型。在一些实施方案中，多价组合物包含四种不同的OspA血清型。在一些实施方案中，多价组合物包含五种不同的OspA血清型。在一些实施方案中，多价组合物包含六种不同的OspA血清型。在一些实施方案中，多价组合物包含七种不同的OspA血清型。
在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型1，和OspA血清型2-7中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型2，和OspA血清型1和3-7中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型3，和OspA血清型1-2和4-7中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型4，和OspA血清型1-3和5-7中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型5，和OspA血清型1-4和6-7中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型6，和OspA血清型1-5和7中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含OspA血清型7，和OspA血清型1-6中的任何一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含血清型1-5和7中的至少2、3、4、5或6种OspA多肽。
在一些实施方案中，提供了本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种，用于在针对由疏螺旋体属引起的感染(例如莱姆病)免疫中使用。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种，用于在产生针对将来的疏螺旋体感染的保护性免疫应答中使用。在一些实施方案中，本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种用于在哺乳动物，如灵长类动物(例如，非人灵长类动物，如猴子(例如，猕猴，如恒河猴或食蟹猴)或猿)、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)或驯养的哺乳动物(例如，犬、兔、猫、马、绵羊、牛、山羊、骆驼或驴)中使用。
1.佐剂
可以将佐剂与本文所述的抗原性多肽一起给予至受试者，其中这种给予与在不伴有佐剂的情况下的OspA的给予相比，在受试者中产生更高效价的针对OspA的抗体。佐剂可以促进对OspA的更早、更强效或更持久的免疫应答。
在一些实施方案中，组合物包含一种佐剂。在一些实施方案中，组合物包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，组合物不包含佐剂。
在一些实施方案中，佐剂包含铝。在一些实施方案中，佐剂是磷酸铝。在一些实施方案中，佐剂是明矾(Alyhydrogel’85 2％；Brenntag–目录号21645-51-2)。
在一些实施方案中，佐剂是有机佐剂。在一些实施方案中，佐剂是油基佐剂。在一些实施方案中，佐剂是水包油纳米乳剂。
在一些实施方案中，佐剂包含角鲨烯。在一些实施方案中，包含角鲨烯的佐剂是Ribi(Sigma adjuvant system目录号S6322-1vl)、AddaVaxTM(基于角鲨烯的水包油纳米乳剂)、MF59、AS03或AF03(参见US9703095)。在一些实施方案中，包含角鲨烯的佐剂是纳米乳剂。
在一些实施方案中，佐剂包含聚丙烯酸聚合物(PAA)。在一些实施方案中，包含PAA的佐剂是SPA09(参见WO 2017218819)。
在一些实施方案中，佐剂包含非可代谢油。在一些实施方案中，佐剂是不完全弗氏佐剂(IFA)。
在一些实施方案中，佐剂包含非可代谢油和杀死的结核分枝杆菌。在一些实施方案中，佐剂是完全弗氏佐剂(CFA)。
在一些实施方案中，佐剂是脂多糖。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰A(MPL或MPLA)。
2.受试者
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者是成人(大于或等于18岁)。在一些实施方案中，受试者是儿童或青少年(小于18岁)。在一些实施方案中，受试者是老年人(大于60岁)。在一些实施方案中，受试者是非老年人(大于或等于18岁且小于或等于60岁)。
在一些实施方案中，向受试者给予多于一次的组合物给予。在一些实施方案中，加强免疫给予改善了免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的抗原性多肽或组合物中的任何一种或多种用于在哺乳动物，如灵长类动物(例如，非人灵长类动物，如猴子(例如，猕猴，如恒河猴或食蟹猴)或猿)、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)或驯养的哺乳动物(例如，犬、兔、猫、马、绵羊、牛、山羊、骆驼或驴)中使用。
在一些实施方案中，将组合物适当地配制用于预期的给予途径。合适的给予途径的例子包括肌内、经皮、皮下、鼻内、口服或透皮。
在一些实施方案中，向受试者给予多于一次的组合物给予。在一些实施方案中，加强免疫给予改善了免疫应答。
3.药物组合物
在各种实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗原性铁蛋白多肽和/或相关实体。在一些实施方案中，药物组合物是能够引发免疫应答(如针对螺旋体属的保护性免疫应答)的免疫原性组合物(例如，疫苗)。
例如，在一些实施方案中，药物组合物可以包含以下项中的一种或多种：(1)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和(ii)抗原性OspA多肽；(2)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和连接至所述半胱氨酸的免疫刺激部分；和(ii)抗原性OspA多肽；(3)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含(i)表面暴露的半胱氨酸，(ii)在铁蛋白蛋白的N末端的肽接头，和(iii)在肽接头的N末端的抗原性OspA多肽；(4)抗原性铁蛋白蛋白，所述抗原性铁蛋白蛋白包含：(i)用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变和连接至所述半胱氨酸的免疫刺激部分，(ii)用非半胱氨酸氨基酸置换在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处的内部半胱氨酸的突变，或用非半胱氨酸氨基酸置换如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中与位置31类似的位置处的内部半胱氨酸的突变，(iii)用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，和(iv)抗原性OspA多肽；或(5)包含前述铁蛋白蛋白中的任一种的铁蛋白颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含与本文所述的抗原性多肽相关的抗体或其他药剂。在一个实施方案中，药物组合物包含与本文所述的抗原性多肽结合和/或竞争的抗体。可替代地，抗体可以识别包含本文所述的抗原性多肽的非铁蛋白多肽组分的病毒颗粒或细菌。
在一些实施方案中，将如本文所述的药物组合物单独给予或与一种或多种增强免疫应答的药剂(例如，以上所述的佐剂)组合给予。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含如上所述的佐剂。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所用，术语“载体”是指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在示例性实施方案中，载体可以包括无菌液体，例如像水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的油，例如像花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，载体是或包括一种或多种固体组分。药学上可接受的载体还可包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。如本文所用，赋形剂是可以包含在药物组合物中例如以提供或有助于所希望的稠度或稳定作用的任何非治疗剂。合适的药物赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在各种实施方案中，药物组合物是无菌的。
在一些实施方案中，药物组合物含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物可以包含多种添加剂(如稳定剂、缓冲液或防腐剂)中的任何一种。此外，可以包含辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
在各种实施方案中，可以将药物组合物配制成适合任何所期望的给予方式。例如，药物组合物可以采取以下形式：溶液、悬浮液、乳剂、滴剂、片剂、丸剂、球剂、胶囊、含有液体的胶囊、明胶胶囊、粉末、缓释配制品、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉、冷冻悬浮液、干燥粉或任何其他适合使用的形式。在药剂的配制和生产中的一般考虑可以见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿,1995(通过引用并入本文)中。
可以经由任何给予途径来给予药物组合物。给予途径包括例如口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、透皮、经直肠、通过气管内滴注、支气管滴注、吸入、或局部方式。给予可为局部或全身的。在一些实施方案中，给予是口服进行的。在另一个实施方案中，给予是通过肠胃外注射。在一些情况下，给予导致本文所述的抗原性铁蛋白多肽释放到血流中。给予方式可以由从业者决定。
在一些实施方案中，药物组合物适合于肠胃外给予(例如静脉内、肌内、腹膜内和皮下)。可以将此类组合物配制成例如溶液、悬浮液、分散体、乳剂等。它们也可以以无菌固体组合物(例如冻干的组合物)的形式生产，所述无菌固体组合物可以在临使用前溶解或悬浮于无菌可注射介质中。例如，肠胃外给予可以通过注射来实现。在此类实施方案中，注射剂以常规形式制备，即作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式、或作为乳剂。在一些实施方案中，注射溶液和悬浮液由无菌粉末、冻干粉末或颗粒制备。
在另一个实施方案中，将药物组合物配制成用于通过吸入递送(例如，用于直接递送至肺和呼吸系统)。例如，组合物可以采取鼻喷雾剂或任何其他已知的气雾剂配制品的形式。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂包含多个颗粒。在一些实施方案中，此类制剂可以具有约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12或约13微米的平均粒度。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂被配制为干粉。在一些实施方案中，用于吸入或气雾剂递送的制剂例如通过包含润湿剂而被配制为湿粉。在一些实施方案中，润湿剂选自水、盐水或其他处于生理pH的液体。
在一些实施方案中，将根据本发明的药物组合物以滴剂的形式给予至鼻腔或颊腔。在一些实施方案中，剂量可以包含多滴(例如1-100、1-50、1-20、1-10、1-5滴等)。
可以将本发明的药物组合物以适合于实现所期望结果的任何剂量给予。在一些实施方案中，所期望的结果是诱导针对病原体的持久的适应性免疫应答，所述病原体如存在于组合物中的抗原性铁蛋白多肽中的非铁蛋白多肽的来源。在一些实施方案中，所期望的结果是降低一种或多种感染症状的强度、严重程度、频率和/或延迟一种或多种感染症状的发作。在一些实施方案中，所期望的结果是抑制或预防感染。所需的剂量将根据以下而在受试者之间有所不同：受试者的物种、年龄、体重和一般状况，被预防或治疗的感染的严重程度，所使用的特定组合物及其给予方式。
在一些实施方案中，将根据本发明的药物组合物以单一剂量或多个剂量给予。在一些实施方案中，将药物组合物在不同日期以多个剂量给予(例如初免-加强免疫疫苗接种策略)。在一些实施方案中，将药物组合物作为加强免疫方案的一部分给予。
在各种实施方案中，将药物组合物与一种或多种另外的治疗剂共同给予。如果治疗剂的给予的时间安排使得另外的治疗剂和药物组合物中的一种或多种活性成分的药理活性在时间上重叠，从而发挥组合的治疗作用，则共同给予不需要同时给予治疗剂。通常，每种药剂将以针对所述药剂确定的剂量和时间表来给予。
4.核酸/RNA
还提供了核酸，所述核酸编码本文所述的抗原性OspA多肽。在一些实施方案中，核酸是mRNA。出于本公开文本的目的，任何能够经历翻译而产生多肽的核酸被认为是mRNA。
5.试剂盒
本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的一种或多种抗原性多肽、核酸、抗原性铁蛋白颗粒、抗原性2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒、组合物或药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂中的一种或多种。
***
此描述和示例性实施方案不应被视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有指示，否则在说明书和权利要求中使用的所有表达数量、百分比或比例的数字和其他数值应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰至已无法将其如此修饰的程度。“约”指示实质上不影响所述主题的特性的变化程度，例如在10％、5％、2％或1％之内。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据试图获得的所需特性而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求范围的等价范围的原则的应用，每个数值参数均应当至少考虑报告的有效数字的数量和通过应用普通四舍五入技术来解读。
注意，如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包括复数个指示物，除非明确地并且清楚地限于一个/种指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的详述不排除可以取代或添加到所列项目的其他类似项目。除非上下文另有指示，否则术语“或”以包括性含义使用，即等同于“和/或”。
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实施例
提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，并且不应解释为以任何方式限制本公开文本的范围。
1.OspA-铁蛋白抗原性多肽的制备
产生了包含OspA和铁蛋白的抗原性多肽。
由Genescript从以下序列合成OspA：博氏疏螺旋体株系B31(血清型1)NBCI序列IDWP_010890378.1、阿氏疏螺旋体株系PKO(血清型2)NCBI序列：WP_011703777.1、伽氏疏螺旋体株系PBr(血清型3)GenBank：CAA56549.1、巴伐利亚疏螺旋体(血清型4)NCBI序列WP_011187157.1、伽氏疏螺旋体(血清型5)GenBank CAA59727.1、伽氏疏螺旋体(血清型6)GenBank：CAA45010.1和伽氏疏螺旋体(血清型7)GenBank CAA56547.1。由Genescript合成了具有插入的N末端牛蛙铁蛋白序列的幽门螺杆菌铁蛋白，其中牛蛙铁蛋白序列与先前研究的相似(参见Kanekiyo,M.等人,Cell162(5):1090-100(2015))。将pet21a载体用于在大肠杆菌中表达带有His标签的OspA和OspA-铁蛋白纳米颗粒。将类似于先前使用的哺乳动物表达载体用于在Expi293细胞中表达(参见Xu,L.等人,Science 358(6359):85-90(2017))。
OspA-铁蛋白纳米颗粒是通过将OspA的胞外结构域在基因上融合至铁蛋白的氨基末端以产生抗原性多肽而产生的(图1A)。OspA是具有延伸的β-折叠结构的31-kDa脂蛋白，所述β-折叠结构由仅具有一个羧基末端α-螺旋的21个连续的反平行β链组成(图1B)(参见Kitahara,R.等人,Biophys J102(4):916-26(2012))。OspA的羧基末端还具有异常大的空腔(约200A)，所述空腔代表了对于使用甘氨酸-丝氨酸序列与铁蛋白的连接具有相容性的位点(图1B)。铁蛋白的24个亚基自发组装成空心球形纳米颗粒(图1C)。本研究中使用的铁蛋白含有融合至幽门螺杆菌铁蛋白以产生与人铁蛋白最小相关的嵌合体的牛蛙铁蛋白氨基末端序列(参见Kanekiyo 2015)。氨基末端牛蛙铁蛋白序列从纳米颗粒核心呈放射状突出(参见Trikha,J.等人J Mol Biol248(5):949-67(1995))，从而有利于OspA在纳米颗粒表面上均匀地呈递。
对铁蛋白结构进行了三个另外的改变以改善其功能性：N19Q、C31S和S111C。N19Q取代去除了潜在的氨基末端糖基化位点。S111C取代在铁蛋白上引入了表面暴露的半胱氨酸，所述表面暴露的半胱氨酸可用于例如通过点击化学来缀合佐剂。最后，将半胱氨酸31修饰为丝氨酸，使得仅一个半胱氨酸将通过缀合被修饰。OspA在纳米颗粒表面上的展示提供了一种24聚体抗原性纳米颗粒(图1D)。
对于从大肠杆菌中的纯化，我们使用了BL21 Star(DE3)(Invitrogen目录号C601003)。我们在16℃下用100μM IPTG诱导蛋白质过夜。在Tris缓冲液(pH 8)、50mM NaCl中使用超声处理来裂解细胞沉淀物。通过从流穿液中收集OspA-铁蛋白，在阴离子交换柱(HiTrap Q HP，GE)上纯化过滤器灭菌的上清液。然后通过重复6次的1％Triton X114提取去除内毒素。然后使用Amicon 100MW截止过滤器(Millipore目录号UFC910096)浓缩水相，然后将纳米颗粒在120ml Superose 6制备型SEC柱上在4℃下进一步纯化。对于从哺乳动物细胞培养物中的纯化，按照制造商的说明书，使用FectoPRO转染试剂(Polyplus，目录号116-100)用质粒DNA转染Expi293细胞。培养转染的细胞，并且在第5天收集并过滤上清液。使用无内毒素的试剂和玻璃器皿来遵循无内毒素的方案。将Q琼脂糖快速流动珠(GE，目录号17-0510-01)用50mM Tris(pH 7)、50mM NaCl制备，并且将其通过重力流施加至过滤器灭菌的上清液。收集流穿液并且使用Amicon 100MW截止过滤器将其浓缩至4ml。然后在室温下在120ml Superose 6制备型SEC柱上进一步纯化纳米颗粒。
对于带有His6标签(SEQ ID NO:227)的OspA的纯化，将血清型1、4、5和7OspA从大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen目录号C600003)中纯化，并且将血清型2和3从Expi293细胞中纯化。这些构建体缺乏跨膜结构域，包含C末端His6-标签(SEQ ID NO:227)，并且否则为野生型。对于大肠杆菌纯化，将蛋白质在500μM IPTG下诱导5小时，并且将细胞沉淀并在-20℃下冷冻。将沉淀物重悬于在具有完全蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，目录号11697498001)的TBS缓冲液中的1％Triton中，并且超声处理以裂解细胞。将上清液过滤灭菌。对于哺乳动物细胞培养，在转染后第5天收集上清液并将其过滤除菌。将上清液在附接到AKTA Pure FPLC的GE HiTrap HP 5ml柱(目录号17-5248-02)上运行。将柱洗涤并对其加载，并且再次用在TBS中的20mM咪唑洗涤。将最终蛋白质用在TBS中的250mM咪唑洗脱。
在转化的人肾上皮细胞系Expi293中由融合至铁蛋白的博氏疏螺旋体株系B31表达OspA血清型1(图2A至图2D；SEQ ID NO:52)。通过尺寸排阻柱色谱(SEC)和SDS-PAGE(分别为图2A和图2B)确认了纳米颗粒的形成和蛋白质的纯度。SEC分析揭示了预期保留时间的单一对称峰(图2A)。
还进行了动态光散射(DLS)分析。将纯化的纳米颗粒以约0.4μg/ml的浓度加载至具有透明底部的黑色384孔板(Corning，目录号3540)中。用DynaPro板读取器II(Wyatt)在25℃的控制温度下读取样品。DLS显示颗粒大小为13nm并具有纯且无聚集体的低多分散性(7.4％)(图2C)。消除含有脂化位点的OspA跨膜结构域(aa 1-25)提高了纯化的容易性。OspA序列含有四个潜在的氨基连接的糖基化位点，并且从哺乳动物细胞中纯化的OspA-铁蛋白迁移在更高的分子量处，这与聚糖的添加一致(图2B)。
对OspA-铁蛋白纳米颗粒进行了透射电子显微镜负染色成像和2D类别平均化分析(图2D)。将OspA-铁蛋白纳米颗粒样品在1xTBS中稀释300倍，并且在由400目铜网格上的硝化纤维素支撑的连续碳层上成像。通过以下方式来制备网格：将3μl样品悬浮液施加至清洁的网格上，用滤纸吸干掉，并立即用甲酸铀酰染色。使用配备有FEI Eagle 4k x 4K CCD相机的FEI Tecnai T12电子显微镜进行电子显微镜检查。以67,000(0.16nm/像素)的放大倍率获取高放大倍率图像。图像是在-1.9μm至-0.8μm的标称弱焦点和约
Figure BDA0002795913570000781
的电子剂量下获取的。使用自动拾取方案选择67,000x高放大倍率图像中的单独颗粒(参见Lander,G.C.等人,J Struct Biol,166(1):95-102(2009))。基于XMIPP处理软件包使用了无参考比对策略(参见Sorzano,C.O.等人,J Struct Biol 148(2):p.194-204(2004))。此包中的算法将选择的颗粒进行比对，并将其分选为自相似的组或类。
铁蛋白纳米颗粒显现为在中间具有空心中心的强圆形密度(图2D)。每个纳米颗粒都被多个短而均匀的OspA刺突包围，所述刺突的形状显现为微椭圆形。颗粒的总直径在约
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的范围内，具有
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直径的铁蛋白核心。刺突从颗粒表面在大小、形状和取向上均匀地延伸，长度多达
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OspA刺突的宽度为约
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并且在铁蛋白的甘氨酸-丝氨酸接头处渐缩至最小密度。
当LYMErixTM疫苗在2002年停用时，引起了人们的关注，即疫苗含有与来自人白细胞功能相关抗原-1(hLFA-1，参见Gross,D.M.等人,Science 281(5377):第703-6页(1998))的九肽区段(SEQ ID NO:78)具有同源性的表位(SEQ ID NO:83的氨基酸165-173)(图5A)。SEQ ID NO:83的氨基酸165-173称为hLFA-1同源位点。OspA血清型1是唯一含有此序列同源性的血清型(图5B)。为避免与此序列有关的任何潜在问题，将hLFA-1同源位点置换为相应的OspA血清型2(SEQ ID NO:79)或血清型3(SEQ ID NO:80)九肽序列，或引入降低与hLFA-1的相似性并旨在防止与hLFA-1结合的抗体的产生的点取代(RD2，SEQ ID NO:81)(图5C)。对于点取代，取代了表面暴露的氨基酸以降低与hLFA-1的相似性，同时避免或最小化β-折叠结构的去稳定化。
在小鼠中测试了具有修饰的hLFA-1同源位点的hLFA-1纳米颗粒的免疫原性，以相对于未经这种修饰的OspA-铁蛋白纳米颗粒比较免疫应答(图5D)。由具有修饰的hLFA-1同源性位点的纳米颗粒引发的抗体效价是稳健的，并且与具有未修饰的hLFA-1同源性位点的纳米颗粒没有显著差异。
2.对OspA-铁蛋白纳米颗粒的免疫原性的表征
为了评估OspA-铁蛋白纳米颗粒的免疫原性，用在Ribi佐剂的存在下的血清型1OspA-铁蛋白纳米颗粒或
Figure BDA0002795913570000791
莱姆(博氏疏螺旋体的纯化的外表面蛋白A(OspA)的液体悬浮液)(一种其中OspA是全长、脂化、重组且为血清型1的犬类疫苗)免疫C3H小鼠两次(图4)。在第0周和第4周对C3H/HeN小鼠进行肌内疫苗接种。对第2剂量后2周对血清进行ELISA。将Ribi(Sigma adjuvant system目录号#S6322-1vl)重悬于1ml PBS中并且涡旋1分钟，然后在免疫之前以等体积添加至抗原。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定对重组OspA的抗体应答。简而言之，将96孔板用在PBS中稀释的1μg/ml OspA-His包被，并且在4℃下孵育过夜。去除OspA-His并用溶解于PBST中的5％脱脂乳封闭板。去除封闭试剂后，将原始血清样品在PBST中连续稀释后进行添加。将原始样品以等体积添加至封闭溶液，以实现最终50％封闭溶液浓度。孵育1小时后，将板用PBST洗涤，并在室温下与山羊抗小鼠IgG，即HRP连接的二抗(在封闭溶液中的1:5,000稀释液)一起孵育1小时。抽吸并洗涤二抗，并将板与Sure Blue TMB过氧化物酶底物(KPL，马里兰州盖瑟斯堡)一起孵育，之后与等体积的终止溶液(0.5N硫酸)一起孵育。在450nm下测量吸光度。
在第六周，用OspA-铁蛋白的免疫诱导了比
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莱姆高4.4倍的终点效价(p<0.001)。在第25周的抗体效价也显著高于
Figure BDA0002795913570000793
莱姆(p<0.005)(图4)。
3.糖基化突变体；功效的评价
为了评价此OspA-铁蛋白的保护性功效，使用了攻击模型，其中将免疫或对照小鼠通过携带博氏疏螺旋体的蜱虫进行感染(参见Rosa,P.A.等人Nat Rev Microbiol 3(2):第129-43页(2005))。
用与AddaVaxTM 1:1混合的1μg OspA-铁蛋白纳米颗粒或1μg铁蛋白纳米颗粒对C3H/HeN小鼠进行肌内疫苗接种。在第0周和第4周对小鼠进行疫苗接种。使用具有对hLFA-1同源性位点的合理设计修饰和去除所有潜在N-糖基化位点的修饰的血清型1OspA-铁蛋白纳米颗粒(SEQ ID NO:53)对小鼠进行免疫，因为天然细菌表达的OspA在这些位置处没有糖基化。所述序列含有以下N>Q取代以防止糖基化：N71Q、N190Q、N202Q和N251Q。其免疫原性与糖基化纳米颗粒相似(图13)。
也测试了当将糖基化位点丝氨酸/苏氨酸突变为丙氨酸时的OspA-铁蛋白的糖基化突变体(SEQ ID NO:63)。与具有野生型糖基化位点的OspA-铁蛋白(SEQ ID NO:52)相比，此构建体和以上讨论的N＞Q构建体二者均给出了强的免疫应答，并且优于
Figure BDA0002795913570000801
莱姆对照(图14)。
在评价OspA-铁蛋白纳米颗粒在蜱虫攻击模型中的保护性功效的进一步实验中，肩突硬蜱(Ixodes scapularis)蜱幼虫从俄克拉荷马州立大学(Oklahoma StateUniversity)(俄克拉荷马州斯蒂尔沃特)的国家蜱虫研究和教育中心获得。通过将未感染的幼虫在博氏疏螺旋体株系N40感染的SCID小鼠上喂养至饱食，来产生博氏疏螺旋体感染的若虫。收集饱血的幼虫，并且使其在室温和高相对湿度下在4-6周内蜕变为若虫。通过培养每批中回收的蜱虫的一部分来确定所喂养幼虫中的博氏疏螺旋体感染的流行性。
在第0周和第4周，用1μg剂量的伴有AddaVaxTM佐剂的OspA-铁蛋白(SEQ ID NO:53)或对照铁蛋白对小鼠免疫两次，并用
Figure BDA0002795913570000802
莱姆来平行免疫比较组。通过将5至6只博氏疏螺旋体感染的若虫蜱喂养至饱食，在第6周(即，第二次疫苗接种剂量后2周)对小鼠进行攻击。收集喂养的若虫，并通过在BSK培养基中培养来测定博氏疏螺旋体感染。攻击后两周，处死小鼠并通过耳部、踝部和心脏培养物测定博氏疏螺旋体感染。通过暗视野显微镜观察培养物来确定博氏疏螺旋体的存在。如果通过暗视野显微镜发现一种或多种器官培养物为阳性，则将小鼠定义为感染了博氏疏螺旋体。也通过特定于博氏疏螺旋体的PCR来测试阴性培养物。
两周后处死小鼠。将来自心脏、踝部和耳部的组织样品在BSK培养基中与针对博氏疏螺旋体的抗生素一起培养6周。通过PCR测试阴性样品中博氏疏螺旋体的存在。所有阴性培养物均为PCR阴性。以未感染小鼠的百分比计算保护。
与阴性对照铁蛋白(其中5只动物中有4只被感染)形成对比，包含OspA-铁蛋白和AddaVaxTM佐剂的组合物未显示出感染(0/4)(表2；p<0.01)。
表2：OspA-铁蛋白纳米颗粒的保护性功效
Figure BDA0002795913570000811
4.对与免疫刺激部分缀合的OspA-铁蛋白的功效的评价
通过在铁蛋白纳米颗粒的表面上工程化半胱氨酸(S111C)来产生自佐剂化构建体，所述半胱氨酸允许通过点击化学直接缀合免疫刺激部分，如TLR激动剂(图6A)或CpG(SEQ ID NO:210；ISS-1018，图7A)。直接缀合的程序如下：用50mM Tris(pH 8.5)中的10mMTCEP(Amresco K831-10G)还原哺乳动物产生的物质1小时以去除半胱氨酰化(cysteinylation)。然后将蛋白质透析到100mM Tris(pH 8)、50mM NaCl中以去除TCEP。不需要对大肠杆菌产生的物质进行还原。将DBCO-PEG4-马来酰亚胺接头(Sigma-Aldrich目录号760676-5mg)以5mg/ml重悬于DMSO中。将2.5mg接头添加至10ml体积中的3mg蛋白(最终DMSO浓度为5％)。将接头与还原的蛋白质在室温下孵育30分钟。使用Ambicon 100MW截止过滤浓缩器通过缓冲液交换(Millipore目录号UFC910096)来去除过量的接头。将叠氮化物-PEG4-3M-012(自行合成)和叠氮化物-CPG(由IDT定制合成的ISS-1018)用于最终点击化学步骤。将0.5mg佐剂添加至0.5mg蛋白质中以进行最终的缀合步骤，并且在37℃下孵育6小时，然后在4℃下孵育过夜。使用Ambicon 100MW截止过滤浓缩器通过缓冲液交换来去除过量的佐剂。通过针对3M-012的质谱和针对CPG的SDS-PAGE分析确认了缀合效率。
使用了TLR 7/8激动剂3M-012，先前已经显示其在直接缀合至HIV Gag蛋白时增加抗体应答(参见Wille-Reece,U.等人,Proc Natl Acad Sci U S A 102(42):第15190-4页(2005))。使用两步式点击化学方法将3M-012附接至SEQ ID NO:53的纳米颗粒。首先，将DBCO-PEG4-马来酰亚胺接头连接至半胱氨酸，然后通过无铜的叠氮化物-炔烃环加成来添加具有PEG4-叠氮化物接头的修饰的3M-012(图6A)。通过质谱确认了>99％的缀合效率，其质量移位为587道尔顿(图12)。除了叠氮化物-3M-012，还成功添加了叠氮化物-CPG(图7A)，可以通过凝胶移位来确认其缀合(图7B)。
观察到铁蛋白的几乎完全缀合，这表明大多数纳米颗粒携带24个激动剂分子。然后评估缀合的OspA铁蛋白纳米颗粒在小鼠中的免疫原性。在第0周和第4周对C3H/HeN小鼠进行肌内疫苗接种。对第2剂量后2周对血清进行ELISA。在免疫前，将明矾(Alyhydrogel’852％；Brenntag–目录号21645-51-2)以等体积添加至抗原。将Ribi(Sigma adjuvant system目录号#S6322-1vl)重悬于1ml PBS中并且涡旋1分钟，然后在免疫之前以等体积添加至抗原。
用3M-012缀合的颗粒免疫的小鼠产生了比未缀合材料高4.5倍的OspA抗体应答(图6B，p<0.05)。与摩尔当量量的3M-012(29ng)混合的颗粒相比并且相比于与高1,000倍的剂量(20μg)的3M-012或标准明矾(Alyhydrogel'85 2％；Brenntag–目录号21645-51-2)佐剂混合的颗粒，由3M-012缀合的颗粒引发的抗体应答更高。
对于CPG缀合的OspA-铁蛋白纳米颗粒(SEQ ID NO:53)观察到了类似的抗体产生增强，与未缀合的颗粒相比，免疫应答增加6.3倍，并且相对于与纳米颗粒混合的等量的未缀合CPG，增加了4.7倍(图7C)。
因此，缀合至OspA-铁蛋白纳米颗粒的佐剂的靶向递送使得佐剂的量大大减少，同时刺激了有效且特异性的抗体应答。
5.对包含不同血清型的OspA-铁蛋白纳米颗粒的免疫原性的评价
虽然血清型1OspA株系博氏疏螺旋体在美国引起疾病，而阿氏疏螺旋体(血清型2)、伽氏疏螺旋体(血清型3、5、6、7)和巴伐利亚疏螺旋体(血清型4型)在欧洲、亚洲和其他地方引起疾病。为了产生广泛的交叉保护性组合物，设计针对血清型1、2、3、4、5和7的OspA-铁蛋白纳米颗粒。(SEQ ID NO:1、5、6、7、8和10)。使用阴离子交换和尺寸排阻色谱从大肠杆菌中表达并纯化这些颗粒(图3A)。所有OspA-铁蛋白抗原性多肽均具有47kDa的预期分子量，并且DLS分析和透射电子显微镜也确认了所有六种OspA纳米颗粒的形成(图3B)。
通过以等摩尔比例组合OspA-铁蛋白的血清型1-5和7中的每一种来产生六组分组合物。
将伴有明矾的六组分组合物(即六价)的免疫原性在小鼠中与伴有相同佐剂的单血清型颗粒(即单价)进行比较(图8A至图8F)。将单价组合物以1μg剂量给予，并且将六价组合物以每种血清型1μg(共6μg剂量)给予。在免疫前，将明矾(Alyhydrogel’85 2％；Brenntag–目录号21645-51-2)以等体积添加至抗原。六组分组合物诱导针对OspA血清型1-5和7的所有六种的稳健抗体应答。此外，对单一血清型对照的应答与混合物相似，这表明六种血清型组合之间没有干扰。相对于单组分组合物，在六价组合物的情况下看到改善的针对血清型4的免疫应答(参见图8D，血清型4)。
在确定六价组合物是免疫原性的，并且在一些情况下优于单价组合物后，制备六种OspA-铁蛋白纳米颗粒中的每一种的3M-012和CpG缀合物。通过将六种与3M-012缀合的OspA-铁蛋白纳米颗粒组合，以及单独地将与CpG缀合的六种OspA-铁蛋白纳米颗粒组合，产生两种六组分缀合组合物。对于全球范围内发现的所有七种OspA血清型，相比于未缀合的六价组合物，CpG缀合的和3M-012缀合的六价组合物在小鼠中显示出抗体应答的显著增加(图9A至图9G)，这表明六价配制品也赋予针对血清型6的保护，即使组合物中没有OspA血清型6多肽。
当在非人灵长类动物(NHP[恒河猴])中进行测试时，伴有AF03佐剂的六价纳米颗粒组合物(未缀合的)产生的针对所有七种循环疏螺旋体属血清型的Ab效价为
Figure BDA0002795913570000832
莱姆对照的11至200倍(图10A至图10G)。与小鼠相似，六价组合物在佐剂的存在下引发高效价Ab应答。在NHP中，3M-012和CpG缀合的组合物诱导与
Figure BDA0002795913570000831
莱姆对照类似的应答(分别将图10A-G与图10H-N进行比较)。六价疫苗在NHP中的抗体效价是稳健的，直至加强免疫剂量后的19周，并且保留了相比于
Figure BDA0002795913570000833
莱姆对照的优势(图25)。
还将缀合组合物在蜱虫攻击模型中进行测试。在第0周和第4周以1μg剂量的抗原对小鼠进行疫苗接种。单价组合物含有1μg与3M-012缀合的OspA-铁蛋白血清型1。六价组合物包含1μg的来自血清型1、2、3、4、5和7的OspA，每种OspA与3M-012缀合。在第二次免疫后两周，用感染博氏疏螺旋体N40菌株(血清型1)的5-6只蜱虫攻击小鼠5天，并且两周后将所述小鼠处死。将来自心脏、踝部和耳部的组织样品在BSK培养基中与针对博氏疏螺旋体的抗生素一起培养6周。通过PCR测试阴性样品中博氏疏螺旋体的存在。阳性样品是对于培养或PCR呈阳性的(图11)。
另外，我们在小鼠中测试含有所有七种血清型的七价疫苗。在第0周和第4周用以下项肌内对小鼠进行免疫：用明矾或AF03佐剂化的含有1ug对应于OspA血清型1-7的每种OspA-铁蛋白纳米颗粒的七价OspA-铁蛋白纳米颗粒组合物(共7ug)，或
Figure BDA0002795913570000841
莱姆(1μg剂量)。免疫后2周经由通过ELISA测量的终点效价来分析抗体应答。与
Figure BDA0002795913570000842
相比，展示出稳健的免疫应答(图24A-G)。
因此，OspA-铁蛋白纳米颗粒引发对七种主要血清型的高效价抗体应答。此外，七组分莱姆疫苗候选物提供了控制莱姆病的全球蔓延的潜力。
6.对具有不同柔性接头的OspA-铁蛋白构建体的表征
测试了若干种不同的接头，以提供在OspA与铁蛋白之间的柔性。构建体在一至五个-GGGS(SEQ ID NO:226)-序列内变化。纯化各种接头构建体并形成均匀大小的纳米颗粒。
包含GS1(GGGS(SEQ ID NO:226))、GS2(SEQ ID NO:91)或GS5(SEQ ID NO:92)接头的OspA-接头-铁蛋白构建体全部可以表达(图15A)，并且显示出一致的DLS(图15B、图15C和图15E)和EM(图15D)概况。
此外，不同的-GGGS(SEQ ID NO:226)-接头构建体(接头1x GGGS(SEQ ID NO:226)[SEQ ID NO:60]，接头2x GGGS(SEQ ID NO:91)[SEQ ID NO:61]，和接头5x GGGS(SEQ IDNO:92)[SEQ ID NO:62])均在C3H小鼠中显示出强的免疫应答(图16)。
7.对2,4-二氧四氢喋啶合酶OspA纳米颗粒的表征
研究了另一种纳米颗粒，来自风产液菌的2,4-二氧四氢喋啶合酶来用于OspA的抗原性展示。通过阴离子交换和尺寸排阻色谱容易地从大肠杆菌细胞中纯化出包含不同血清型的OspA-2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒。产生并表征了包含以下项的构建体：OspA血清型1(SEQ ID NO:12，图19A至图19C)；OspA血清型2(SEQ ID NO:16，图20A至图20C)；OspA血清型3(SEQ ID NO:17，图21A至图21B)；OspA血清型4(SEQ ID NO:18，图17A至图17C)；OspA血清型5(SEQ ID NO:19，图22A至图22C)；和OspA血清型7(SEQ ID NO:21，图23A至图23C)。OspA-2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒根据EM，形成的是15.8nm颗粒，并且根据DLS，大小是均匀的。
在小鼠中测试了OspA血清型4 2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒(SEQ ID NO:18)的免疫原性(图18)。伴有和不伴有明矾的OspA 2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒产生了强的免疫应答，所述免疫应答显现至少与相似的OspA血清型4铁蛋白纳米颗粒(SEQ ID NO:7)的免疫应答一样稳健。
因此，包含2,4-二氧四氢喋啶合酶和OspA多肽的抗原性多肽也可以用于引发抗OspA抗体应答。
序列表
<110> 赛诺菲
<120> 抗原性OSPA多肽
<130> 01121-0033-00PCT
<140>
<141>
<150> 62/652,210
<151> 2018-04-03
<160> 228
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 1
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65 70 75 80
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多肽"
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65 70 75 80
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Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
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<221> 来源
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Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Phe Ala Leu
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多肽"
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多肽"
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多肽"
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Glu Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Arg Asn Val Ile Lys Ala Cys Glu
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<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 51
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<220>
<221> 来源
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多肽"
<400> 52
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<221> 来源
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多肽"
<400> 54
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<400> 55
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<221> 来源
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多肽"
<400> 56
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<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 75
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Leu Ala Met Asp
20 25 30
Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu
35 40 45
Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr
50 55 60
Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser
65 70 75 80
Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Ala Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr
85 90 95
Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp
100 105 110
Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Lys Phe Asn Asp Lys Gly Lys Leu Ser Glu Lys Val Val
130 135 140
Thr Arg Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Gln Asn Asp
145 150 155 160
Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Gly
165 170 175
Thr Leu Thr Ala Asp Gly Glu Thr Lys Leu Thr Val Glu Ala Gly Thr
180 185 190
Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Glu Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu
195 200 205
Leu Lys Asp Thr Glu Thr Thr Pro Ala Asp Lys Lys Ser Gly Thr Trp
210 215 220
Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr
225 230 235 240
Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr
245 250 255
Asn Thr Ala Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp
260 265 270
Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Gly Ser Glu Ser Gln Val Arg
275 280 285
Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn
290 295 300
Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala
325 330 335
Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu
340 345 350
Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys
355 360 365
Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln
370 375 380
His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Cys
385 390 395 400
Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln
405 410 415
His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu
420 425 430
Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys
435 440 445
Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
450 455
<210> 76
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 76
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Leu Ala Met Asp
20 25 30
Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu
35 40 45
Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr
50 55 60
Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Ala Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr
85 90 95
Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp
100 105 110
Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Lys Phe Asn Asp Lys Gly Lys Leu Ser Glu Lys Val Val
130 135 140
Thr Arg Ala Gln Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Gln Asn Asp
145 150 155 160
Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Gly
165 170 175
Thr Leu Thr Ala Asp Gly Glu Thr Lys Leu Thr Val Glu Ala Gly Thr
180 185 190
Val Thr Leu Ser Lys Gln Ile Ser Glu Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu
195 200 205
Leu Lys Asp Thr Glu Thr Thr Pro Ala Asp Lys Lys Ser Gly Thr Trp
210 215 220
Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr
225 230 235 240
Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr
245 250 255
Asn Thr Ala Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp
260 265 270
Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys Gly Ser Glu Ser Gln Val Arg
275 280 285
Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn
290 295 300
Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala
325 330 335
Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu
340 345 350
Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys
355 360 365
Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln
370 375 380
His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Cys
385 390 395 400
Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln
405 410 415
His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu
420 425 430
Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys
435 440 445
Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
450 455
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 77
Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 78
Tyr Val Ile Glu Gly Thr Ser Lys Gln
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 79
Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 80
Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Thr Asp
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 81
Tyr Thr Leu Glu Gly Gln Leu Ser Asp
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 82
Tyr Asp Leu Lys Gly Glu Leu Ser Ser
1 5
<210> 83
<211> 273
<212> PRT
<213> 博氏疏螺旋体（Borreliella burgdorferi）
<400> 83
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys
65 70 75 80
Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln
85 90 95
Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys
100 105 110
Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Glu Lys Thr
165 170 175
Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser
180 185 190
Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala
195 200 205
Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu
225 230 235 240
Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu
245 250 255
Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu
260 265 270
Lys
<210> 84
<211> 273
<212> PRT
<213> 阿氏疏螺旋体（Borreliella afzelii）
<400> 84
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Ala Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Val Asp Lys Ile Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Asp Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Thr Lys
65 70 75 80
Asp Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Lys
85 90 95
Thr Thr Phe Glu Leu Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Arg
100 105 110
Lys Val Ser Ser Lys Asp Lys Thr Ser Thr Asp Glu Met Phe Asn Glu
115 120 125
Lys Gly Glu Leu Ser Ala Lys Thr Met Thr Arg Glu Asn Gly Thr Lys
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Glu Met Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Val
165 170 175
Thr Leu Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Glu Ile Ala
180 185 190
Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Asn Thr Thr Gln
195 200 205
Ala Thr Lys Lys Thr Gly Ala Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln
225 230 235 240
Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu
245 250 255
Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu
260 265 270
Lys
<210> 85
<211> 274
<212> PRT
<213> 伽氏疏螺旋体（Borreliella garinii）
<400> 85
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Glu Lys
65 70 75 80
Ala Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ser Gln Asp Leu Asn Gln
85 90 95
Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Arg
100 105 110
Lys Val Asn Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Asp
115 120 125
Lys Gly Lys Leu Ser Glu Lys Val Val Thr Arg Ala Asn Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Asn Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Gly Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Thr Asp Gly Gly Glu
165 170 175
Thr Lys Leu Thr Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile
180 185 190
Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Glu Thr Thr
195 200 205
Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr Ser Thr Leu
210 215 220
Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Pro Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys
225 230 235 240
Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu
245 250 255
Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Lys Ala Ala
260 265 270
Leu Lys
<210> 86
<211> 273
<212> PRT
<213> 巴伐利亚疏螺旋体（Borreliella bavariensis）
<400> 86
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys
65 70 75 80
Ser Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ser Glu Asp Leu Ser Lys
85 90 95
Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys
100 105 110
Lys Val Asn Ser Lys Asp Lys Ser Ser Ile Glu Glu Lys Phe Asn Ala
115 120 125
Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Ile Leu Arg Ala Asn Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Asp Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Lys Thr
165 170 175
Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Lys His Ile Pro
180 185 190
Asn Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu Leu Asn Asp Ser Asn Ser Thr Gln
195 200 205
Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe Thr Lys Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu
245 250 255
Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu
260 265 270
Lys
<210> 87
<211> 274
<212> PRT
<213> 伽氏疏螺旋体（Borreliella garinii）
<400> 87
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys
65 70 75 80
Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys
85 90 95
Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys
100 105 110
Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys
165 170 175
Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Lys Asn Ile
180 185 190
Leu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr
195 200 205
Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu
210 215 220
Thr Ile Ser Val Asn Ser Gln Lys Thr Lys Asn Leu Val Phe Thr Lys
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu
245 250 255
Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Glu Lys Leu Lys Asp Ala
260 265 270
Leu Lys
<210> 88
<211> 274
<212> PRT
<213> 博氏疏螺旋体（Borreliella burgdorferi）
<400> 88
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys
65 70 75 80
Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Ser Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln
85 90 95
Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys
100 105 110
Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Gly
115 120 125
Lys Gly Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys
165 170 175
Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Lys Asn Ile
180 185 190
Leu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Ala Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr
195 200 205
Arg Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu
210 215 220
Thr Ile Ser Val Asn Ser Gln Lys Thr Lys Asn Leu Val Phe Thr Lys
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Arg Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu
245 250 255
Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys Glu Leu Lys Asn Ala
260 265 270
Leu Lys
<210> 89
<211> 214
<212> PRT
<213> 伽氏疏螺旋体（Borreliella garinii）
<400> 89
Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala
1 5 10 15
Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val
20 25 30
Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys
35 40 45
Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys
50 55 60
Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys
65 70 75 80
Ala Ala Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln
85 90 95
Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys
100 105 110
Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Asp
115 120 125
Lys Gly Lys Leu Ser Glu Lys Val Val Thr Arg Ala Asn Gly Thr Arg
130 135 140
Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Gln Asn Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu
145 150 155 160
Val Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala Asp Gly Glu
165 170 175
Thr Lys Leu Thr Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asn Thr Ala
180 185 190
Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Glu Ala
195 200 205
Leu Lys Ala Ala Leu Lys
210
<210> 90
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 90
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Cys Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 91
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 92
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 93
<211> 154
<212> PRT
<213> 风产液菌（Aquifex aeolicus）
<400> 93
Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly Leu Arg Phe Gly
1 5 10 15
Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp Arg Leu Val Glu
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Cys Ile Val Arg His Gly Gly Arg Glu Glu Asp Ile
35 40 45
Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp Glu Ile Pro Val Ala Ala Gly
50 55 60
Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile Ala Ile Gly Val
65 70 75 80
Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile Ala Ser Glu Val
85 90 95
Ser Lys Gly Leu Ala Asn Leu Ser Leu Glu Leu Arg Lys Pro Ile Thr
100 105 110
Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala Ile Glu Arg Ala
115 120 125
Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala Leu Ser Ala Ile
130 135 140
Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg
145 150
<210> 94
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 94
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Tyr Thr Leu
130 135 140
Glu Gly Gln Leu Ser Asp Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 95
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 95
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Tyr Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Glu Leu Ser Ser Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 96
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 96
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Phe Thr Leu
130 135 140
Glu Gly Lys Val Ala Asn Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 97
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 97
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Phe Ala Leu
130 135 140
Glu Gly Thr Leu Thr Asp Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 98
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 98
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Gln
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Tyr Thr Leu
130 135 140
Glu Gly Gln Leu Ser Asp Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Gln Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Gln Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Gln Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 99
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 99
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Gln
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Phe Thr Leu
130 135 140
Glu Gly Lys Val Ala Asn Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Gln Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Gln Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Gln Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 100
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 100
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Gln
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Phe Ala Leu
130 135 140
Glu Gly Thr Leu Thr Asp Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Gln Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Gln Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Gln Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 101
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 101
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Gln
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Tyr Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Glu Leu Ser Ser Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Gln Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Gln Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Gln Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
<210> 102
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<220>
<221> 变体
<222> (48)..(48)
<223> /置换="Gln"
<220>
<221> 修饰残基
<222> (142)..(150)
<223> 任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (167)..(167)
<223> /置换="Gln"
<220>
<221> 变体
<222> (179)..(179)
<223> /置换="Gln"
<220>
<221> 变体
<222> (228)..(228)
<223> /置换="Gln"
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(250)
<223> /注释="序列中给出的变体残基相对于对于变体位置的注解中的那些没有偏好"
<400> 102
Met Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys
1 5 10 15
Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile
20 25 30
Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn
35 40 45
Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys
100 105 110
Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys
115 120 125
Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Xaa Xaa Xaa
130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val
165 170 175
Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys
195 200 205
Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu Lys
245 250
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<400> 103
000
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<400> 104
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<400> 106
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<210> 199
<400> 199
000
<210> 200
<400> 200
000
<210> 201
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 201
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Cys
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 202
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 202
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Cys Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 203
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 203
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Cys Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 204
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 204
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Cys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 205
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 205
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Cys Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 206
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 206
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Cys Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 207
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 207
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Cys Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Ser Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 208
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 208
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu
1 5 10 15
Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser
20 25 30
Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe
35 40 45
Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile
50 55 60
Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser
65 70 75 80
Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala
85 90 95
Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp
115 120 125
Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu
130 135 140
Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165 170
<210> 209
<211> 166
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）
<400> 209
Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu
1 5 10 15
Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr
20 25 30
His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu
35 40 45
Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn
50 55 60
Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu
65 70 75 80
Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile
85 90 95
Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp
100 105 110
His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu
115 120 125
Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly
130 135 140
Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile
145 150 155 160
Ala Lys Ser Arg Lys Ser
165
<210> 210
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
寡核苷酸"
<400> 210
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 211
<211> 191
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）
<400> 211
Thr Gln Cys Asn Val Asn Pro Val Gln Ile Pro Lys Asp Trp Ile Thr
1 5 10 15
Met His Arg Ser Cys Arg Asn Ser Met Arg Gln Gln Ile Gln Met Glu
20 25 30
Val Gly Ala Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Met Gly Ala His Phe Ser Lys
35 40 45
Asp Val Val Asn Arg Pro Gly Phe Ala Gln Leu Phe Phe Asp Ala Ala
50 55 60
Ser Glu Glu Arg Glu His Ala Met Lys Leu Ile Glu Tyr Leu Leu Met
65 70 75 80
Arg Gly Glu Leu Thr Asn Asp Val Ser Ser Leu Leu Gln Val Arg Pro
85 90 95
Pro Thr Arg Ser Ser Trp Lys Gly Gly Val Glu Ala Leu Glu His Ala
100 105 110
Leu Ser Met Glu Ser Asp Val Thr Lys Ser Ile Arg Asn Val Ile Lys
115 120 125
Ala Cys Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asn Asp Tyr His Leu Val Asp Tyr
130 135 140
Leu Thr Gly Asp Phe Leu Glu Glu Gln Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Leu
145 150 155 160
Ala Gly Lys Ala Ser Thr Leu Lys Lys Leu Met Asp Arg His Glu Ala
165 170 175
Leu Gly Glu Phe Ile Phe Asp Lys Lys Leu Leu Gly Ile Asp Val
180 185 190
<210> 212
<211> 212
<212> PRT
<213> 粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）
<400> 212
Ala Asp Thr Cys Tyr Asn Asp Val Ala Leu Asp Cys Gly Ile Thr Ser
1 5 10 15
Asn Ser Leu Ala Leu Pro Arg Cys Asn Ala Val Tyr Gly Glu Tyr Gly
20 25 30
Ser His Gly Asn Val Ala Thr Glu Leu Gln Ala Tyr Ala Lys Leu His
35 40 45
Leu Glu Arg Ser Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ala Ala Tyr Phe Asn Asn
50 55 60
Tyr Gln Thr Asn Arg Ala Gly Phe Ser Lys Leu Phe Lys Lys Leu Ser
65 70 75 80
Asp Glu Ala Trp Ser Lys Thr Ile Asp Ile Ile Lys His Val Thr Lys
85 90 95
Arg Gly Asp Lys Met Asn Phe Asp Gln His Ser Thr Met Lys Thr Glu
100 105 110
Arg Lys Asn Tyr Thr Ala Glu Asn His Glu Leu Glu Ala Leu Ala Lys
115 120 125
Ala Leu Asp Thr Gln Lys Glu Leu Ala Glu Arg Ala Phe Tyr Ile His
130 135 140
Arg Glu Ala Thr Arg Asn Ser Gln His Leu His Asp Pro Glu Ile Ala
145 150 155 160
Gln Tyr Leu Glu Glu Glu Phe Ile Glu Asp His Ala Glu Lys Ile Arg
165 170 175
Thr Leu Ala Gly His Thr Ser Asp Leu Lys Lys Phe Ile Thr Ala Asn
180 185 190
Asn Gly His Asp Leu Ser Leu Ala Leu Tyr Val Phe Asp Glu Tyr Leu
195 200 205
Gln Lys Thr Val
210
<210> 213
<211> 174
<212> PRT
<213> 激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）
<400> 213
Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu
35 40 45
Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg
50 55 60
Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp
65 70 75 80
Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe
85 90 95
Ile Ser Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys
100 105 110
Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val
115 120 125
Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala
130 135 140
Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala
145 150 155 160
Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu
165 170
<210> 214
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 214
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Gln
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Gln Glu Ser
180
<210> 215
<211> 204
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 215
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Pro Gln Gly Val Leu Ala Ser Ser
20 25 30
Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser
35 40 45
Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly
50 55 60
Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe
65 70 75 80
Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu
85 90 95
Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys
100 105 110
Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala
115 120 125
Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His
130 135 140
Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu
145 150 155 160
Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp
165 170 175
His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly
180 185 190
Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
195 200
<210> 216
<211> 154
<212> PRT
<213> 风产液菌（Aquifex aeolicus）
<400> 216
Met Gln Ile Tyr Glu Gly Lys Leu Thr Ala Glu Gly Leu Arg Phe Gly
1 5 10 15
Ile Val Ala Ser Arg Phe Asn His Ala Leu Val Asp Arg Leu Val Glu
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Cys Ile Val Arg His Gly Gly Arg Glu Glu Asp Ile
35 40 45
Thr Leu Val Arg Val Pro Gly Ser Trp Glu Ile Pro Val Ala Ala Gly
50 55 60
Glu Leu Ala Arg Lys Glu Asp Ile Asp Ala Val Ile Ala Ile Gly Val
65 70 75 80
Leu Ile Arg Gly Ala Thr Pro His Phe Asp Tyr Ile Ala Ser Glu Val
85 90 95
Ser Lys Gly Leu Ala Asn Leu Ser Leu Glu Leu Arg Lys Pro Ile Thr
100 105 110
Phe Gly Val Ile Thr Ala Asp Thr Leu Glu Gln Ala Ile Glu Arg Ala
115 120 125
Gly Thr Lys His Gly Asn Lys Gly Trp Glu Ala Ala Leu Ser Ala Ile
130 135 140
Glu Met Ala Asn Leu Phe Lys Ser Leu Arg
145 150
<210> 217
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注释="未知的描述：
牛蛙接头序列"
<400> 217
Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe
1 5
<210> 218
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 218
Cys Leu Val Pro Arg Gly Ser Leu Glu His His His His His His
1 5 10 15
<210> 219
<211> 156
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 219
Met Asn Ile Ile Glu Ala Asn Val Ala Thr Pro Asp Ala Arg Val Ala
1 5 10 15
Ile Thr Ile Ala Arg Phe Asn Asn Phe Ile Asn Asp Ser Leu Leu Glu
20 25 30
Gly Ala Ile Asp Ala Leu Lys Arg Ile Gly Gln Val Lys Asp Glu Asn
35 40 45
Ile Thr Val Val Trp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Leu Pro Leu Ala Ala
50 55 60
Gly Ala Leu Ala Lys Thr Gly Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Gly
65 70 75 80
Thr Val Ile Arg Gly Gly Thr Ala His Phe Glu Tyr Val Ala Gly Gly
85 90 95
Ala Ser Asn Gly Leu Ala His Val Ala Gln Asp Ser Glu Ile Pro Val
100 105 110
Ala Phe Gly Val Leu Thr Thr Glu Ser Ile Glu Gln Ala Ile Glu Arg
115 120 125
Ala Gly Thr Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Glu Ala Ala Leu Thr Ala
130 135 140
Leu Glu Met Ile Asn Val Leu Lys Ala Ile Lys Ala
145 150 155
<210> 220
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 221
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 221
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 222
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 222
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asn Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 223
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 223
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25
<210> 224
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 224
Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
20 25 30
<210> 225
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
多肽"
<400> 225
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ala Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
35 40 45
<210> 226
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
肽"
<400> 226
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 227
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
6xHis标签"
<400> 227
His His His His His His
1 5
<210> 228
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述： 合成
寡核苷酸"
<400> 228
tgactgtgaa cgttcgagat g 21

Claims (38)

1.一种抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含疏螺旋体属的OspA血清型1多肽，其中所述多肽不包含SEQ ID NO:77的序列。
2.根据权利要求1所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽缺乏跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽是非脂化的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中相对于SEQ ID NO:77的序列存在至少一种氨基酸取代，其中所述取代降低与SEQ ID NO:78的同一性，或是非保守性的并且不导致与SEQ ID NO:78的更高同一性。
5.根据权利要求4所述的抗原性OspA多肽，其中所述取代降低与SEQ ID NO:78的同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中SEQ ID NO:77的一个或多个氨基酸被非血清型1OspA的一个或多个相应氨基酸置换。
7.根据权利要求6所述的抗原性OspA多肽，其中所述非血清型1OspA是血清型2、3、4、5、6或7OspA。
8.根据权利要求6所述的抗原性OspA多肽，其中SEQ ID NO:77的每个氨基酸被血清型2、3、4、5、6或7OspA的相应氨基酸置换。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽进一步包含用以减少或消除糖基化的修饰。
10.根据权利要求9所述的抗原性OspA多肽，其中所述修饰包括对至少一个天冬酰胺的取代。
11.根据权利要求10所述的抗原性OspA多肽，其中所述至少一个天冬酰胺包括OspA血清型1的N71、N190、N202和N251中的任何一个、两个、三个或更多个。
12.根据权利要求11所述的抗原性OspA多肽，其中所述至少一个天冬酰胺包括OspA血清型1的N71、N190、N202和N251。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述一个或多个天冬酰胺被谷氨酰胺取代。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述多肽缺乏N-糖基化位点。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述OspA来自博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、梅奥疏螺旋体(Borrelia mayonii)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)或巴伐利亚疏螺旋体(Borreliabavariensis)。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:1、3、4或53中任一个的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含SEQID NO:1-10或12-76中任一个的序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含OspA胞外结构域。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含与SEQ ID NO:94-102中任一个的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性的序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽进一步包含铁蛋白蛋白。
21.根据权利要求20所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
22.一种抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含OspA多肽和铁蛋白，其中所述铁蛋白包含用半胱氨酸置换表面暴露的氨基酸的突变。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含幽门螺杆菌铁蛋白的E12C、S26C、S72C、A75C、K79C、S100C和S111C突变中的一种或多种或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的一种或多种相应突变。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽包含经由表面暴露的氨基酸连接至所述铁蛋白的一个或多个免疫刺激部分，任选地其中所述表面暴露的氨基酸是由突变产生的半胱氨酸。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含用非天冬酰胺氨基酸置换表面暴露的天冬酰胺的突变，任选地其中所述天冬酰胺是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置19处，或如通过成对或结构比对确定的非幽门螺杆菌铁蛋白中的类似位置处。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的抗原性OspA多肽，其中所述铁蛋白包含用非半胱氨酸氨基酸置换内部半胱氨酸的突变，任选地其中所述内部半胱氨酸是在幽门螺杆菌铁蛋白的位置31处，或如通过成对或结构比对确定的对应于幽门螺杆菌铁蛋白的位置31的位置处。
27.一种铁蛋白颗粒，所述铁蛋白颗粒包含根据权利要求20-26中任一项所述的抗原性OspA多肽。
28.根据权利要求1-19中任一项所述的抗原性OspA多肽，所述抗原性OspA多肽进一步包含2,4-二氧四氢喋啶合酶蛋白。
29.一种2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒，所述2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒包含根据权利要求28所述的抗原性OspA多肽。
30.一种组合物，所述组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒或2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
31.根据权利要求30所述的组合物，所述组合物进一步包含佐剂，任选地其中所述佐剂是AF03。
32.根据权利要求30或31所述的组合物，所述组合物包含第一抗原性OspA多肽和第二抗原性OspA多肽，其中所述第一抗原性OspA多肽和所述第二抗原性OspA多肽包含不同血清型的OspA多肽。
33.根据权利要求32所述的组合物，所述组合物包含选自以下项的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种抗原性OspA多肽：含有OspA血清型1多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型2多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型3多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型4多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型5多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型6多肽的抗原性OspA多肽；和含有OspA血清型7多肽的抗原性OspA多肽。
34.根据权利要求33所述的组合物，所述组合物包含含有OspA血清型1多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型2多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型3多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型4多肽的抗原性OspA多肽；含有OspA血清型5多肽的抗原性OspA多肽；和含有OspA血清型7多肽的抗原性OspA多肽。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒或组合物，用于在引发对疏螺旋体属的免疫应答或保护受试者免于莱姆病的方法中使用。
36.一种引发对疏螺旋体属的免疫应答或保护受试者免于莱姆病的方法，所述方法包括向受试者给予根据权利要求1-34中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒或组合物中的任何一种或多种。
37.根据权利要求35-36中任一项所述的抗原性OspA多肽、铁蛋白颗粒、2,4-二氧四氢喋啶合酶颗粒、组合物或方法，其中所述受试者是人。
38.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-26中任一项所述的抗原性OspA多肽，任选地其中所述核酸是mRNA。
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