JP2022511995A - Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピートタンパク質に対して指向化されたペプチド免疫原コンストラクト - Google Patents

Abstract

本開示は、ジペプチドリピート（ＤＰＲ）ペプチド免疫原コンストラクト、コンストラクトを含む組成物、コンストラクトによって誘導される抗体、ならびにコンストラクト及びその組成物の調製方法及び使用方法を対象とする。開示のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトは、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するＤＰＲタンパク質に由来するＢ細胞エピトープ（ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、及びポリＰＡリピートを含む）が異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して直接的に連結されたもの、または任意選択の異種スペーサーを介して連結されたものを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、それぞれのジペプチド配列の約１０～約２５回リピートを含む。開示のペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＰＲ配列に対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示のペプチド免疫原コンストラクトは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態に罹患している患者のための免疫療法剤として使用され得る。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１８年１０月１日出願の米国仮出願第６２／７３９，７９４号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質の一部に基づくペプチド免疫原コンストラクト、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の予防及び治療のためのその製剤に関する。

ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のイントロン内でＧＧＧＧＣＣというヘキサヌクレオチド配列が伸長していることは、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の両方と関連する（Ranum, et al.によるＷＯ２０１４／１５９２４７）。３つの代替リーディングフレームでのセンス転写物、すなわち伸長したヘキサヌクレオチドリピートが、通常とは異なる非ＡＴＧ翻訳を受け、その結果、３つの異なるポリペプチドが産生、生成、及び凝集することが示されており、これら３つの異なるポリペプチドはそれぞれ、２つのアミノ酸のリピート単位から構成されるもの（ジペプチドリピート（ＤＰＲ））であり、すなわちポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ；ＧＡ）、ポリ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ；ＧＰ）、及びポリ（Ｇｌｙ－Ａｒｇ；ＧＲ）である（MontrasioによるＷＯ２０１６／０５０８２２Ａ２）。さらに、対応するアンチセンス転写物が翻訳されることで、ポリ（Ｐｒｏ－Ａｒｇ；ＰＲ）、ポリ（Ｐｒｏ－Ａｌａ；ＰＡ）、及びポリ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ；ＧＰ）が生成する。こうしたＣ９ＯＲＦ７２－ジペプチドリピート（ＤＰＲ）伸長は、ＦＴＤ患者の最大で３０％、ＡＬＳ患者の最大で５０％、及びＦＴＤ－ＡＬＳ患者の８０％に当てはまり、米国及び欧州のコーカサス人種集団において最も高頻度で変異が見られることが示されている。

ＡＬＳは、病因が多様な衰弱性疾患であり、この疾患には１００，０００人に２人が罹患する（Ranum, et al.によるＷＯ２０１４／１５９２４７、PetrucelliによるＵＳ９，４４８，２３２）。ＡＬＳは、上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンが変性する障害であると伝統的に考えられており、脱力、筋萎縮、筋痙縮、発話困難（構音障害）、嚥下困難（嚥下障害）、及び呼吸困難（difficulty breathing）（呼吸困難（dyspnea））が急速に進行することによって特徴付けられる。症状の順序及び速度は人によって異なるものの、最終的にほとんどの対象が歩行できなくなるか、自分自身で起床できなくなるか、または自身の手及び腕を使えなくなり、ＡＬＳ対象のほとんどが、症状の発症から通常は３～５年以内に呼吸不全によって最終的に死に至ることになる。ＡＬＳは、最大で患者の５０％において前頭側頭機能（認知及び行動など）が損なわれる多系統障害であることが広く認知されてきている。現在利用可能な唯一のＡＬＳ治療薬はＲｉｌｕｚｏｌｅ（ＲＩＬＵＴＥＫ（登録商標））であるが、この治療薬は、進行を遅延させ、ある程度の延命をもたらすものにすぎない。

ＦＴＤは、脳の前頭葉及び側頭葉の萎縮または収縮と関連する臨床的、病理学的、及び遺伝的に不均一な障害の一群に属する。ＦＴＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に多く見られる若年性認知症原因である。認知症状は可変性であり、こうした認知症状には、前頭皮質及び側頭皮質の変性に起因する認知症、行動及び性格の変化、言語機能障害、及び／または精神病が含まれる。ＦＴＤは、その症状に基づいて、（ｉ）行動異常型前頭側頭型認知症（ｂｖＦＴＤ）（性格、行動、及び判断の変化を伴う）、（ｉｉ）原発性進行性失語（ＰＰＡ）（コミュニケーション能力、すなわち話す、読む、書く、及び他人が言うことを理解する言語使用能力の変化を伴う）、ならびに（ｉｉｉ）大脳皮質基底核症候群（ＣＢＳ）及び進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）（動作、思考、及び言語能力の制御に影響を与える）という３つの群に分類され得る。ＦＴＤ患者は、享受可能な適切な治療が存在しないため、症状の発症から５～１０年後に死亡する。一方で、ＦＴＤ患者の５０％が家族歴陽性であることが示されており、ＡＬＳと比較して、ＦＴＤは、根底をなす病因を共有する疾患連続体となっているように思われる。

ＡＬＳ及び／またはＦＴＤの新たな診断方法及び治療方法があれば、ＡＬＳ対象及びＦＴＤ対象が受ける恩恵は大きいものであろう。Ｃ９ｏｒｆ７２におけるＲＮＡ伸長をもたらす遺伝子変異は、ＡＬＳ及びＦＴＤの両方が存在することによって特徴付けられる常染色体優性型の遺伝性神経変性を引き起こす。現在、ＡＬＳ／ＦＴＤについては、このＣ９ｏｒｆ７２型が、こうした疾患の最も一般的な遺伝型として認知されている。

本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原コンストラクト、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の予防及び治療のためのその製剤を対象とする。本開示は、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトの調製方法及び使用方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体も対象とする。

ある特定の実施形態では、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
｛（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＤＰＲ）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ｝_ｙ－Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＤＰＲ）は、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
それぞれのｍは、０～約４であり、
それぞれのｎは、０～約１０であり、
ｙは、１～約５である。

以下には、開示のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトのさまざまな構成要素について記載される。
参考文献：
１．RANUM, L., et al. “Di-amino acid repeat-containing proteins associated with ALS”, WO2014/159247, October 2, 2014
２．PETRUCELLI, L., et al. “Methods and materials for detecting C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive frontotemporal lobar degeneration or C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive amyotrophic lateral sclerosis”, US Patent No. 9,448,232, September 20, 2016
３．MONTRASIO, F., et al. “Human-derived anti-dipeptide repeats (DPRs) antibody”, WO2016/050822, April 7, 2016
４．FREIBAUM, B.D., et al., “The role of dipeptide repeats in C9ORF72-related ALS-FTD”, Frontiers in Molecular Neuroscience, 10 (35): 1-35 (2017)

（グリシン－アルギニン；ＧＲ）_ｎ（配列番号２２６）、（グリシン－プロリン；ＧＰ）_ｎ（配列番号２２７）、及び（グリシン－アラニン；ＧＡ）_ｎ（配列番号２２８）というジペプチドのリピートを生成させると想定される伸長Ｃ９ＯＲＦ７２領域のＧＧＧＧＣＣリピート（配列番号２２５）から生成するセンスＲＮＡ転写物の３つの代替フレームの翻訳産物と、（グリシン－プロリン；ＧＰ）_ｎ（配列番号２３０）、（プロリン－アルギニン；ＰＲ）_ｎ（配列番号２３１）、及び（プロリン－アラニン；ＰＡ）_ｎ（配列番号２３２）というジペプチドのリピートを生成させると想定されるアンチセンスＲＮＡ ＧＧＣＣＣＣリピート（配列番号２２９）の３つの代替フレームの翻訳産物と、を示す模式図である。 個々のＤＰＲ種のいくつかの構造的特徴及び機能的特徴、ならびにそれらの特徴がそれらＤＰＲ種の相互作用及び毒性に与える影響をまとめた表である。 図３Ａ～３Ｉは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。具体的には、ポリＧＡコンストラクト（配列番号６８、６９、７０、及び８８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価を図３Ａ～３Ｄにそれぞれ示す。 図３Ａ～３Ｉは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。具体的には、ポリＧＰコンストラクト（配列番号９８及び９９）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価を図３Ｅ～３Ｆにそれぞれ示す。ポリＧＲコンストラクト（配列番号１３０及び１４８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価を図３Ｇ～３Ｈにそれぞれ示す。 図３Ａ～３Ｉは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。具体的には、ポリＧＲコンストラクト（配列番号１６１）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価を図３Ｉに示す。 図４Ａ～４Ｄは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。具体的には、図４Ａに示すように、ポリＧＡコンストラクト（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、及び配列番号８８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、高い力価が得られたことを示す一方で、（ＧＡ）_５または（ＧＡ）_１０及び（ＧＡ）_１５（配列番号１及び配列番号２）（免疫原性を増強するためのＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドに連結されていないポリＧＡ配列を含むもの）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、免疫原性が得られなかったことを示している。 図４Ａ～４Ｄは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。図４Ｂに示すように、ポリＧＰコンストラクト（配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１１０）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、高い力価が得られたことを示す一方で、（ＧＰ）_１０及び（ＧＰ）_１５（配列番号４及び配列番号５）（免疫原性を増強するためのＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドに連結されていないポリＧＰ配列を含むもの）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、免疫原性が得られなかったことを示している。 図４Ａ～４Ｄは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。図４Ｃに示すように、ポリＧＲコンストラクト（配列番号１３０及び配列番号１４８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、高い力価が得られたことを示す一方で、（ＧＲ）_１０、（ＧＲ）_１５、及び（ＧＲ）_２５（配列番号７、配列番号８、及び配列番号９）（免疫原性を増強するためのＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドに連結されていないポリＧＲ配列を含むもの）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、免疫原性が得られなかったことを示している。 図４Ａ～４Ｄは、本明細書に開示のペプチド免疫原コンストラクトを用いてモルモットの免疫化を行った後に得られた抗体力価を示すグラフである。図４Ｄに示すように、ポリＰＲコンストラクト（配列番号１６１及び配列番号１７３）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、高い力価が得られたことを示す一方で、（ＰＲ）_１０（配列番号１０）（免疫原性を増強するためのＵＢＩＴｈ（登録商標）ペプチドに連結されていないポリＰＲ配列を含むもの）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、バックグラウンドを若干上回る免疫原性が得られたこと示している。

本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原コンストラクト、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の予防及び治療のためのその製剤を対象とする。本開示は、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトの調製方法及び使用方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体も対象とする。

開示のペプチド免疫原コンストラクトは、Ｂ細胞エピトープ及びヘルパーＴ細胞エピトープを含み、約２０個以上のアミノ酸を有する。

ペプチド免疫原コンストラクトは、ポリＧＡリピート配列、ポリＧＰリピート配列、ポリＧＲリピート配列、ポリＰＲリピート配列、及びポリＰＡリピート配列を含む、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質の一部に由来するＢ細胞エピトープを含む。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して、任意選択の異種スペーサーを介して連結され得る。開示のペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＰＲに対して指向化された高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示のペプチド免疫原コンストラクトは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態に罹患している患者のための免疫療法剤として使用され得る。

ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、ポリＧＡリピート配列（配列番号１～３）、ポリＧＰリピート配列（配列番号４～５）、ポリＧＲリピート配列（配列番号７～９）、ポリＰＲリピート配列（配列番号１０～１２）、及びポリＰＡリピート配列（配列番号１３～１５）（表１に示される）を含む、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質に由来するアミノ酸配列を有する。

本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープアミノ酸配列（例えば、配列番号１６～６７）（表２に示される）を含む。ある特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体（ジフテリア毒素（配列番号５５）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号６６）、コレラ毒素（配列番号４８）など）に由来する。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、単一配列（例えば、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号４３～４６）または組み合わせ配列（例えば、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３９、及び配列番号４２）のいずれかの形態である、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１～５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１～３）に由来する理想化された人工Ｔｈエピトープである。本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、炎症性Ｔ細胞応答を活性化することなく、コンストラクトのＢ細胞エピトープ領域に対して指向化された抗体産生を誘発する能力を有する。

いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＰＲに由来するＢ細胞エピトープが、任意選択の異種スペーサーを介して異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに連結されたものを含む。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＰＲに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１５）を有するＢ細胞抗原部位が、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（例えば、配列番号１６～６７）に対して任意選択の異種スペーサーを介して連結されたものを含む。いくつかの実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に連結する能力を有する分子または化学構造である。ある特定の実施形態では、スペーサーは、天然起源のアミノ酸、非天然起源のアミノ酸、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号６８～２１７のアミノ酸配列（表３～７に示される）を有する。

本開示は、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物も対象とする。いくつかの実施形態では、開示の組成物は、複数のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、患者の幅広い遺伝的背景をカバーするためにＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの混合物（例えば、配列番号６８～２１７の任意の組み合わせ）を含む。ペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含む組成物は、単一のペプチド免疫原コンストラクトのみを含む組成物と比較して、ＡＬＳ、ＦＴＤ、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態を予防及び／または治療するための免疫化を行ったときのレスポンダー率のパーセントを高め得る。

本開示は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態を予防及び／または治療するための医薬組成物も対象とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーを、ペプチド免疫原複合体を含む組成物と混合することによって静電気的な結合を介して形成される安定化された免疫刺激性複合体の形態で開示のペプチド免疫原コンストラクトを含む。そのような安定化された免疫刺激性複合体は、ペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性をさらに増強することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アラムゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）、または油中水型エマルション（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５１もしくはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ７２０を含む）を含めて、アジュバント（無機塩など）を含む。

本開示は、開示のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された抗体も対象とする。具体的には、本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、対象に投与されるとＤＰＲアミノ酸配列（配列番号１～１５）と交差反応する高度に特異的な抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原コンストラクトによって生成される高度に特異的な抗体は、組換えＤＰＲ含有タンパク質と交差反応する。開示の抗体は、それぞれのＤＰＲに対して高度に特異的に結合し、免疫原性の増強に用いられる異種Ｔｈエピトープに対して指向化された抗体は、仮に伴うとしても多くはなく、このことは、そのようなペプチド抗原性増強に使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体とは際立って対照的である。

本開示は、開示のペプチド免疫原コンストラクト及び／またはペプチド免疫原コンストラクトに対して指向化された抗体を使用してＡＬＳ、ＦＴＤ、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態を予防及び／または治療するための方法も含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＳ、ＦＴＤ、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態を予防及び／または治療するための方法は、開示のペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法において利用される組成物は、静電気的な結合を介して生じる負荷電オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴマーなど）との安定な免疫刺激性複合体の形態で開示のペプチド免疫原コンストラクトを含み、この複合体には、ＡＬＳ、ＦＴＤ、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態を有する患者に投与するためのアジュバントとして無機塩または油が任意選択でさらに追加される。開示の方法は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、及び／またはＤＰＲが存在することによって生じる任意の他の状態、を有するリスクを有するか、または有する宿主にペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投薬レジメン、剤形、及び経路も含む。

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成を目的とするものにすぎず、記載対象を限定するものと解釈してはならない。本出願において引用される参考文献または参考文献の一部はすべて、それらの全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に明確に組み込まれる。

別段の説明がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数の用語は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という言葉は、別に文脈上明確に示されない限り、「及び」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、もしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。ポリペプチドに対して与えられるすべてのアミノ酸サイズ、及びすべての分子量値または分子質量値はおよそのものであり、説明のために提供されるものであることがさらに理解されよう。開示の方法の実施または試験においては、本明細書記載のものと同様または同等の方法及び材料を使用することができるが、以下には適切な方法及び材料が記載される。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾が生じる場合は、用語の説明を含めて、本明細書が優先されることになる。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。

ジペプチドリピート（ＤＰＲ）ペプチド免疫原コンストラクト
本開示は、ＤＰＲに由来するアミノ酸配列を有するＢ細胞エピトープが異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して直接的に共有結合で連結されたもの、または任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結されたものを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。

本明細書で使用される「ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト」または「ペプチド免疫原コンストラクト」という語句は、（ａ）ＤＰＲのアミノ酸残基を約２０個以上有するＢ細胞エピトープと、（ｂ）異種Ｔｈエピトープと、（ｃ）任意選択の異種スペーサーと、を含むペプチドを指す。

ある特定の実施形態では、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
｛（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＤＰＲ）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ｝_ｙ－Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＤＰＲ）は、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
それぞれのｍは、０～約４であり、
それぞれのｎは、０～約１０であり、
ｙは、１～約５である。

以下には、開示のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトのさまざまな構成要素について記載される。

ａ．Ｂ細胞エピトープ（ＤＰＲ）
ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを含む、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質に由来するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、リピート回数が複数回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを有するＤＰＲである。Ｂ細胞エピトープは、リピート回数が２～５０回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを有し得る。例えば、Ｂ細胞エピトープは、リピート回数が２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、または５０回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを有し得る。

いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、リピート回数が約１０～約２５回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを有するＤＰＲである。ある特定の実施形態では、ＤＰＲは、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＧＡ（配列番号１～３）、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＧＰ（配列番号４～５）、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＧＲ（配列番号７～９）、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＰＲ（配列番号１０～１２）、またはリピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＰＡ（配列番号１３～１５）（表１に示される）を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、内在性のヘルパーＴ細胞エピトープを含まない。したがって、Ｂ細胞エピトープ部分は、それ単独では、免疫原性ではないか、または免疫原性が非常に低い。

ｂ．異種Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、Ｃ９ｏｒｆ７２に由来するジペプチドリピート（ＤＰＲ）タンパク質に由来するＢ細胞エピトープが異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して直接的に共有結合で連結されたもの、または任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結されたものを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。

ペプチド免疫原コンストラクト中の異種Ｔｈエピトープは、ＤＰＲ断片の免疫原性を増強し、これによって、合理的設計によってＤＰＲに対して指向化された特異的な高力価抗体の産生が促進される。

本明細書で使用される「異種」という用語は、アミノ酸配列が、ＤＰＲの野生型配列の一部ではないアミノ酸配列に由来するものであること指すか、またはアミノ酸配列が、ＤＰＲの野生型配列と相同的ではないアミノ酸配列に由来するものであることを指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、ＤＰＲ中に天然には見られないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（すなわち、Ｔｈエピトープは、ＤＰＲに由来するものではない）。こうしたＴｈエピトープは、ＤＰＲに対して異種のものであるため、ＤＰＲ断片に対してこうした異種Ｔｈエピトープが共有結合で連結されても、ＤＰＲの天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

本開示の異種Ｔｈエピトープは、ＤＰＲ中に天然に見られるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、任意の種（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、モルモットなど）に由来するアミノ酸配列を有し得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に非選択的に結合するモチーフも有し得る。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に非選択的に結合するモチーフを複数含むことで、ヘルパーＴ細胞を最大限に活性化することを可能にし、これによって免疫応答の開始及び調節を引き起こす。Ｔｈエピトープは、好ましくは、それ単独では免疫学的に静的であり、すなわち、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体のうちでＴｈエピトープに対して指向化されることになるものは、仮に存在するとしても極めて少なく、それによって、ＤＰＲの標的Ｂ細胞エピトープに指向化された非常に集中的な免疫応答を引き起こすことを可能にする。

本開示のＴｈエピトープには、限定されないが、外来病原体に由来するアミノ酸配列（表２に例示されるもの（配列番号１６～６７））が含まれる。さらに、異種Ｔｈエピトープは、単一配列（例えば、配列番号２１、配列番号２２、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号４３～４６）または組み合わせ配列（例えば、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３９、及び配列番号４２）のいずれかの形態で、理想化された人工Ｔｈエピトープを含み得る。組み合わせ配列（例えば、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３９、及び配列番号４２）として示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドに対する相同体の可変残基に基づくペプチドフレームワーク内の特定の位置に示されるアミノ酸残基の混合物を含む。組み合わせペプチドの集合物は、合成プロセスの間に、指定の保護アミノ酸の混合物を１つの特定のアミノ酸の代わりに特定の位置に付加することによって１つのプロセスにおいて合成され得る。そのような組み合わせ異種Ｔｈエピトープペプチド集合物は、多様な遺伝的背景を有する動物に対するＴｈエピトープ適用範囲を広げることを可能にし得る。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な組み合わせ配列には、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３９、及び配列番号４２（表２に示される）が含まれる。本発明のＴｈエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団に由来する動物及び患者に対して幅広い反応性及び免疫原性を与える。

ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを構成するＴｈエピトープは、ＤＰＲ断片との直列配置で単回の固相ペプチド合成において同時に生成される。Ｔｈエピトープには、既知のＴｈエピトープの免疫学的類似体も含まれ得る。免疫学的Ｔｈ類似体には、免疫増強性類似体、交差反応性類似体、及びこうしたＴｈエピトープのいずれかのセグメントであって、ＤＰＲ断片に対する免疫応答を増強または刺激する上で十分なものが含まれる。

Ｔｈエピトープペプチドの機能性の免疫学的類似体も有効であり、本開示の一部として含まれる。機能性の免疫学的Ｔｈ類似体は、あるアミノ酸位置での保存的置換、全体電荷の変更、別の部分への共有結合での付加、またはアミノ酸の追加、挿入、もしくは欠失、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。そのような免疫学的に機能性の類似体は、開示のＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しない。

保存的置換は、あるアミノ酸残基が、類似の化学特性を有する別のアミノ酸残基に置換されるものである。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ、正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ、負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。

保存的な置換、追加、及び挿入は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸を用いて達成され得る。非天然起源のアミノ酸には、限定されないが、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ；６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロ－チロシン、ピログルタミン酸、及び同様のものが含まれる。天然起源のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。

表２には、Ｔｈエピトープペプチドの機能性類似体の別のバリエーションが示される。具体的には、ＭｖＦ１ Ｔｈ及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号２１及び配列番号２２は、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号３１及び配列番号３２の機能性類似体であり、これは、これらの配列のアミノ酸フレームが、Ｎ末端及びＣ末端のそれぞれから２つのアミノ酸が欠失することによって異なるか（配列番号２１及び配列番号２２）、またはＮ末端及びＣ末端のそれぞれに２つのアミノ酸が含められることによって異なる（配列番号３１及び３２配列番号）という観点によるものである。こうした２つの一連の類似配列の間の差異は、こうした配列中に含まれるＴｈエピトープの機能に影響を与えないと想定される。したがって、機能性の免疫学的Ｔｈ類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質に由来するＴｈエピトープ（ＭｖＦ１～５ Ｔｈ）のいくつかのバージョン（配列番号２１～３３）、及び肝炎表面タンパク質に由来するＴｈエピトープ（ＨＢｓＡｇ１～３ Ｔｈ）のいくつかのバージョン（配列番号３４～４６）が含まれる。

開示のペプチド免疫原コンストラクト中のＴｈエピトープは、ＤＰＲ配列のＮ末端もしくはＣ末端または両末端に共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＤＰＲペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＤＰＲペプチドのＣ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、複数のＴｈエピトープがＤＰＲ断片に共有結合で連結される。複数のＴｈエピトープがＤＰＲ断片に連結される場合、各Ｔｈエピトープは、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。さらに、複数のＴｈエピトープがＤＰＲ断片に連結される場合、これらのＴｈエピトープは任意の順序で配置され得る。例えば、これらのＴｈエピトープは、ＤＰＲ断片のＮ末端に連続して連結されるか、もしくはＤＰＲ断片のＣ末端に連続して連結され得る。または、ＤＰＲ断片のＮ末端にＴｈエピトープが共有結合で連結され得る一方で、ＤＰＲ断片のＣ末端には別のＴｈエピトープが共有結合で連結される。ＤＰＲ断片との関係においてＴｈエピトープの配置に制限は存在しない。

いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、ＤＰＲ断片に対して直接的に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、以下にさらに詳述される異種スペーサーを介してＤＰＲ断片に共有結合で連結される。

ｃ．異種スペーサー
開示のペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＰＲタンパク質に由来するＢ細胞エピトープを異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合で連結する異種スペーサーを任意選択で含む。

上に議論されるように、「異種」という用語は、アミノ酸配列が、ＤＰＲの野生型配列の一部ではないアミノ酸配列に由来するものであること指すか、またはアミノ酸配列が、ＤＰＲの野生型配列と相同的ではないアミノ酸配列に由来するものであることを指す。したがって、ＤＰＲに由来するＢ細胞エピトープに対して異種スペーサーが共有結合で連結されても、このスペーサーは、ＤＰＲ配列に対して異種のものであるため、ＤＰＲの天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれにも延長されない。

スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に連結する能力を有する任意の分子または化学構造である。スペーサーの長さまたは極性は、用途に応じて異なり得る。スペーサーの付加は、アミド結合またはカルボキシル結合を介して行われ得るが、他の官能性を利用することも可能である。スペーサーは、化合物、天然起源のアミノ酸、または非天然起源のアミノ酸を含み得る。

スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトに対して構造特徴を付与し得る。構造的には、スペーサーは、ＤＰＲ断片のＢ細胞エピトープからＴｈエピトープを物理的に分離し得る。スペーサーによる物理的な分離は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープに連結することによって創出される任意の人工二次構造を破壊し得る。さらに、スペーサーによってＢ細胞及びＴｈエピトープを物理的に分離すると、Ｔｈ細胞応答及び／またはＢ細胞応答の間の干渉が除去され得る。さらに、スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトの二次構造を創出または改変するように設計され得る。例えば、スペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＢ細胞エピトープの分離を増進させるための可動性ヒンジとして働くように設計され得る。可動性ヒンジスペーサーは、提示されるペプチド免疫原と、適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間の相互作用の効率性を促進してＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を増強することも可能にし得る。可動性ヒンジをコードする配列の例は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域に見られ、こうした配列はプロリンを多く含むことが多い。スペーサーとして使用され得る特に有用な可動性ヒンジの１つは、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏという配列（配列番号２２０）によって提供され、配列中、Ｘａａは、任意のアミノ酸であり、好ましくは、アスパラギン酸である。

スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトに対して機能特徴も付与し得る。例えば、ペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷が変化するようにスペーサーを設計することができ、これによって、ペプチド免疫原コンストラクトの溶解性に影響を与えることができる。さらに、ペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷を変化させると、ペプチド免疫原コンストラクトが他の化合物及び試薬と結び付く能力に影響を与えることができる。以下にさらに詳述されるように、ペプチド免疫原コンストラクトは、高度に荷電したオリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴマーなど）と静電気的な結合を介して安定な免疫刺激性複合体を形成するようになり得る。ペプチド免疫原コンストラクトの全体電荷は、こうした安定な免疫刺激性複合体の形成に重要である。

スペーサーとして使用され得る化合物には、限定されないが、（２－アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５－アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６－アミノカプロン酸（Ａｈｘ）、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニＰＥＧ１）、１２－アミノ－４，７，１０－トリオキサドデカン酸（ミニＰＥＧ２）、１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタ－デカン酸（ミニＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン－コハク酸（Ｔｔｄｓ）、１２－アミノ－ドデカン酸、Ｆｍｏｃ－５－アミノ－３－オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）、及び同様のものが含まれる。

スペーサーとして使用され得る天然起源のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。

スペーサーとして使用され得る非天然起源のアミノ酸には、限定されないが、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ；６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロ－チロシン、ピログルタミン酸、及び同様のものが含まれる。

ペプチド免疫原コンストラクト中に含めるスペーサーは、ＤＰＲ配列のＮ末端、Ｃ末端、または両末端に共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＴｈエピトープのＣ末端及びＤＰＲのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、スペーサーは、ＤＰＲのＣ末端及びＴｈエピトープのＮ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、複数のスペーサーを使用することができ、この使用は、例えば、ペプチド免疫原コンストラクト中に複数のＴｈエピトープが存在する場合に行われる。複数のスペーサーが使用される場合、各スペーサーは同じか、または異なり得る。さらに、ペプチド免疫原コンストラクト中に複数のＴｈエピトープが連続して存在する場合、これらの連続Ｔｈエピトープは、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープから分離するために使用されるスペーサーと同じまたは異なるスペーサーで互いに分離され得る。ＴｈエピトープまたはＤＰＲ断片との関係においてスペーサーの配置に制限は存在しない。

ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然起源のアミノ酸または非天然起源のアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは、天然起源のアミノ酸または非天然起源のアミノ酸を複数含む。特定の実施形態では、スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）である。

ｄ．ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの特定の実施形態
ある特定の実施形態では、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトは、下記の式：
｛（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＤＰＲ）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ｝_ｙ－Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは、異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａは、異種スペーサーであり、
（ＤＰＲ）は、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
（ＤＰＲ）は、リピート回数が約４～約５０回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを有し、
それぞれのｍは、０～約４であり、
それぞれのｎは、０～約１０であり、
ｙは、１～約５である。

ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクト中の異種Ｔｈエピトープは、配列番号１６～６７（表２に示される）またはそれらの組み合わせ、のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、配列番号１６～４６のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、複数のＴｈエピトープを含む。

ある特定の実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）、及びそれらの組み合わせ、のうちのいずれかから選択される。特定の実施形態では、異種スペーサーは、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）、及びそれらの組み合わせ、のうちのいずれかから選択される。

ある特定の実施形態では、ＤＰＲは、リピート回数が約１０～約２５回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを有するＢ細胞エピトープである。特定の実施形態では、ＤＰＲは、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＧＡ（配列番号１～３）、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＧＰ（配列番号４～５）、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＧＲ（配列番号７～９）、リピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＰＲ（配列番号１０～１２）、またはリピート回数が１０回、１５回、もしくは２５回のポリＰＡ（配列番号１３～１５）（表１に示される）を含む。

ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、１つ以上のＴｈエピトープ配列に対してリピート回数が約１０～約２５回のポリＧＡが、任意選択のスペーサーを介して共有結合で連結されたもの（表３に示される）を含む。他の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、１つ以上のＴｈエピトープ配列に対してリピート回数が約１０～約２５回のポリＧＰが、任意選択のスペーサーを介して共有結合で連結されたもの（表４に示される）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、１つ以上のＴｈエピトープ配列に対してリピート回数が約１０～約２５回のポリＧＲが、任意選択のスペーサーを介して共有結合で連結されたもの（表５に示される）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、１つ以上のＴｈエピトープ配列に対してリピート回数が約１０～約２５回のポリＰＲが、任意選択のスペーサーを介して共有結合で連結されたもの（表６に示される）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、１つ以上のＴｈエピトープ配列に対してリピート回数が約１０～約２５回のポリＰＡが、任意選択のスペーサーを介して共有結合で連結されたもの（表７に示される）を含む。

特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１０、配列番号１３０、配列番号１４８、配列番号１６１、配列番号１７３、配列番号２１８、及び配列番号２１９（表９に示される）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、炎症性Ｔ細胞応答を活性化することなく、コンストラクトのＢ細胞エピトープ領域に対して指向化された抗体産生を誘発する能力を有する。

組成物
本開示は、開示のペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物も提供する。

ａ．ペプチド組成物
開示のペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物は、液体形態または固体形態のものであり得る。液体組成物は、水、緩衝液、溶媒、塩、及び／またはペプチド免疫原コンストラクトの構造特性もしくは機能特性を変化させない任意の他の許容可能な試薬を含み得る。ペプチド組成物は、開示のペプチド免疫原コンストラクトのうちの１つ以上を含み得る。

組成物は、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを含む単一のＢ細胞エピトープを含む１つのペプチド免疫原コンストラクトを含み得る。例えば、この実施形態では、組成物は、リピート回数がＸ回の（ａ）ポリＧＡ、（ｂ）ポリＧＰ、（ｃ）ポリＧＲ、（ｄ）ポリＰＲ、または（ｅ）ポリＰＡのいずれかを含むペプチド免疫原コンストラクトを含み得る（Ｘは、２～５０の数字を表す）。

組成物は、複数のペプチド免疫原コンストラクトも含み得、組成物中のこれらのペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＲＰの長さ、ＤＲＰの配列、またはこれら両方が異なる。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｂ細胞エピトープとして２つ、３つ、４つ、または５つの異なるＤＰＲ配列を有するペプチド免疫原コンストラクトを含み得、すなわち、組成物は、（ａ）ポリＧＡ、（ｂ）ポリＧＰ、（ｃ）ポリＧＲ、（ｄ）ポリＰＲ、及び／または（ｅ）ポリＰＡを含むペプチド免疫原コンストラクトの任意の組み合わせを含み得る。

組成物の例としては、限定されないが、下記のものが挙げられる：
ａ．（１）リピート回数がＸ回の（ａ）ポリＧＡ、（ｂ）ポリＧＰ、（ｃ）ポリＧＲ、（ｄ）ポリＰＲ、または（ｅ）ポリＰＡのいずれかを有するペプチド免疫原コンストラクトと、（２）リピート回数がＹ回の同じＤＰＲを含む別のペプチド免疫原コンストラクトと、を一緒に含む組成物（Ｘ及びＹは、２～５０の数を表し、ＸとＹとは同じ数ではない）。
ｂ．（１）リピート回数がＸ回の（ａ）ポリＧＡ、（ｂ）ポリＧＰ、（ｃ）ポリＧＲ、（ｄ）ポリＰＲ、または（ｅ）ポリＰＡを含むペプチド免疫原コンストラクトと、（２）リピート回数がＹ回の（ａ）ポリＧＡ、（ｂ）ポリＧＰ、（ｃ）ポリＧＲ、（ｄ）ポリＰＲ、または（ｅ）ポリＰＡを含む別のペプチド免疫原コンストラクトと、を含む組成物（（１）のペプチド免疫原コンストラクトと（２）のペプチド免疫原コンストラクトとは異なるものであり、Ｘ及びＹは、同じ数または異なる数であり得る２～５０の数を表す）。
ｃ．（１）リピート回数がＶ回のポリＧＡを含むペプチド免疫原コンストラクトと、（２）リピート回数がＷ回のポリＧＰを含むペプチド免疫原コンストラクトと、（３）リピート回数がＸ回のポリＧＲを含むペプチド免疫原コンストラクトと、（４）リピート回数がＹ回のポリＰＲを含むペプチド免疫原コンストラクトと、（５）リピート回数がＺ回のポリＰＡを含むペプチド免疫原コンストラクトと、を含む組成物（Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺはそれぞれ、同じ数または異なる数であり得る２～５０の数を表す）。

ペプチド組成物に含められ得るペプチド免疫原コンストラクトの組み合わせに制限は存在しない。

ｂ．医薬組成物
本開示は、開示のペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も対象とする。

医薬組成物は、医薬的に許容可能な送達系において担体及び／または他の添加剤を含み得る。したがって、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、及び／または他の医薬品添加物（希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、及び同様のものなど）と一緒に医薬的に有効な量のペプチド免疫原コンストラクトを含み得る。

医薬組成物は、ペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を、それ自体はいずれの特定の抗原性作用も有することなく促進、延長、または増強するように働く１つ以上のアジュバントを含み得る。医薬組成物において使用されるアジュバントには、油、アルミニウム塩、ビロソーム、リン酸アルミニウム（例えばＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、ｌｉｐｏｓｙｎ、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ７２０、ならびに他のアジュバント及び乳化剤が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルション生成用の植物油及びオレイン酸マンニドから構成される油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０もしくはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンオレイン酸モノエステルとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄを含む水中油中水型（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ型）エマルションである。

医薬組成物は、即放型製剤または徐放型製剤として製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、微粒子を用いる免疫原の封入及び同時投与を介して全身免疫または局所粘膜免疫が誘導されるように製剤化され得る。そのような送達系は、当業者によって容易に決定される。

医薬組成物は、注射剤（溶液または懸濁液としてのもの）として調製され得る。ペプチド免疫原コンストラクトを含む液体媒体は、注射前に調製されるものでもあり得る。医薬組成物は、任意の適切な適用様式（例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下など）によって投与されることも、任意の適切な送達機器において投与されることもあり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、または筋肉内投与向けに製剤化される。経口適用及び鼻腔内適用を含めて、他の投与様式に適した医薬組成物も調製され得る。

医薬組成物は、即放型製剤または徐放型製剤として製剤化され得る。さらに、医薬組成物は、微粒子を用いる免疫原の封入及び同時投与を介して全身免疫または局所粘膜免疫が誘導されるように製剤化され得る。そのような送達系は、当業者によって容易に決定される。

医薬組成物は、適切な単位剤形でも製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重ｋｇ当たり約０．５μｇ～約１ｍｇのペプチド免疫原コンストラクトを含む。医薬組成物の有効用量は、多くの異なる因子に応じて異なり得、こうした因子には、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、他の投与薬剤、及び治療が予防的または治療的であるかどうかが含まれる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含めて、非ヒト哺乳類も治療され得る。医薬組成物は、複数回用量で送達される場合、単位剤形当たり適切な量へと好都合に分割され得る。投与量は、対象の年齢、体重、及び総体的な健康に依存することになり、こうしたことは、治療分野でよく知られている。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数のペプチド免疫原コンストラクトを含む。上記のペプチド組成物と同様に、医薬組成物は、複数のペプチド免疫原コンストラクトを含み得、組成物中のこれらのペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＲＰの長さ、ＤＲＰの配列、またはこれら両方が異なる。複数のペプチド免疫原コンストラクトの混合物を医薬組成物に含めることで、コンストラクトの免疫効力を相乗的に増強することが可能となる。複数のペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ適用範囲が広いことで、より大きな遺伝的集団において有効性が向上し得るため、ペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を改善させる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１０、配列番号１３０、配列番号１４８、配列番号１６１、配列番号１７３から選択されるペプチド免疫原コンストラクト、ならびにその相同体、類似体、及び／または組み合わせを含む。

ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用することで、投与時に宿主において免疫応答が誘発され、抗体が産生され得る。

ｃ．免疫刺激性複合体
本開示は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激性複合体の形態でペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も対象とする。そのような免疫刺激性複合体は、具体的には、アジュバントかつペプチド免疫原安定化剤として働くことに適したものである。免疫刺激性複合体は、微粒子の形態をとり、この微粒子は、ペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生じさせ得る。免疫刺激性複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化され得る。免疫刺激性複合体は、ｗ／ｏ型エマルションの形態で製剤化されるか、無機塩と組み合わさった懸濁液として製剤化されるか、または非経口投与後に宿主の免疫系の細胞にペプチド免疫原を効率的に送達するためのインサイチュゲル化ポリマーと共に製剤化されることもあり得る。

ペプチド免疫原コンストラクトを、アニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせと静電気的な結合を介して複合体化させることによって、安定化された免疫刺激性複合体が形成され得る。安定化された免疫刺激性複合体は、免疫原送達系として医薬組成物に組み込まれ得る。

ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、５．０～８．０のｐＨ範囲で正に荷電するカチオン性部分を含むように設計される。ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分上の正味の電荷またはコンストラクトの混合物のカチオン性部分上の正味の電荷は、それぞれのリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）については＋１の電荷、それぞれのアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）については－１の電荷、当該配列内の他のアミノ酸については０の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分内で合計され、正味の平均電荷として表される。適切なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１であるカチオン性部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、＋２を超える範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は異種スペーサーである。ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は、スペーサー配列が（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）である場合、＋４の電荷を有する。

本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０～８．０のｐＨ範囲で負に荷電する任意の分子を指す。ある特定の実施形態では、アニオン性分子は、オリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー上またはポリマー上の正味の負電荷は、オリゴマー中のそれぞれのホスホジエステル基またはホスホロチオエート基について－１の電荷を割り当てることによって計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基数が８～６４であり、ＣｐＧモチーフのリピート数の範囲が１～１０の一本鎖ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は、含有ヌクレオチド塩基数が１８～４８であり、ＣｐＧモチーフのリピート数の範囲が３～８のものであり得る。

ある特定の実施形態では、アニオン性オリゴヌクレオチドは、５’Ｘ^１ＣＧＸ^２３’という式によって表され、式中、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ^１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ^２は、Ｃ（シトシン）またはＴ（チミン）である。または、アニオン性オリゴヌクレオチドは、５’（Ｘ^３）_２ＣＧ（Ｘ^４）_２３’という式によって表され、Ｃ及びＧは、メチル化されておらず、Ｘ^３は、Ａ、Ｔ、またはＧからなる群から選択され、Ｘ^４は、ＣまたはＴである。特定の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＣＧ ＴＴ ３’（ＣｐＧ１）配列番号２２３（オリゴマー長３２塩基）及び５’ｎＴＣ ＧＴＣ ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ Ｔ ３’（ＣｐＧ２）配列番号２２４（オリゴマー長２４塩基＋ホスホロチオエート基（５’末端にｎとして示される））からなる群から選択される。

得られる免疫刺激性複合体は、サイズが典型的には１～５０ミクロンの範囲の粒子の形態をとり、相互作用種の相対的電荷化学量論及び分子量を含めて、多くの因子の影響を受けるものである。微粒子状の免疫刺激性複合体は、インビボで特定の免疫応答のアジュバント作用及び上方制御を与えるという利点を有する。さらに、安定化された免疫刺激性複合体は、油中水型エマルション、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含めて、さまざまなプロセスによる医薬組成物の調製に適する。

抗体
本開示は、ペプチド免疫原コンストラクトによって誘導される抗体も提供する。

開示のペプチド免疫原コンストラクトは、ＤＰＲ断片、異種Ｔｈエピトープ、及び任意選択の異種スペーサーを含むものであり、宿主に投与されると免疫応答及び抗体産生を誘発する能力を有する。ペプチド免疫原コンストラクトを設計することで、自己タンパク質に対する寛容性が壊れ、部位特異的抗体の産生が誘発され得る。

開示の抗体は、それぞれのＤＰＲに対して高度に特異的に結合し、免疫原性の増強に用いられる異種Ｔｈエピトープに対して指向化された抗体は、仮に伴うとしても多くはなく、このことは、そのようなペプチド抗原性増強に使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体とは際立って対照的である。

開示の抗体は、試料（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）または組織）中のＤＰＲタンパク質の存在を検出するためのアッセイにおいて使用され得る。

方法
本開示は、ペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び医薬組成物の調製方法及び使用方法も対象とする。

ａ．ペプチド免疫原コンストラクトを製造するための方法
本開示のペプチド免疫原コンストラクトは、当業者によく知られる化学合成法によって調製され得る（例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY,1992, p.77を参照のこと）。ペプチド免疫原コンストラクトは、自動化メリフィールド固相合成手法を使用して合成することができ、この手法は、側鎖保護アミノ酸を使用してｔ－Ｂｏｃ化学またはＦ－ｍｏｃ化学のいずれかによってα－ＮＨ_２を保護することによって行われ、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizerのモデル４３０Ａまたはモデル４３１で行われる。Ｔｈエピトープの組み合わせライブラリーペプチドを含むペプチド免疫原コンストラクトの調製は、所与の可変位置の時点でのカップリングに代替アミノ酸の混合物を使用することによって達成され得る。

所望のペプチド免疫原コンストラクトが完全に構築された後、標準的な手順に従って樹脂を処理することで、樹脂からペプチドを切断し得、アミノ酸側鎖上の官能基を脱保護し得る。遊離のペプチドは、ＨＰＬＣによって精製され、生化学的に特徴付けられ得る。この特徴付けは、例えば、アミノ酸分析または配列決定によって行われる。ペプチドの精製方法及び特徴付け方法は、当業者によく知られている。

この化学プロセスによって生成されるペプチドの品質は、制御及び規定することができるものであり、結果として、ペプチド免疫原コンストラクト、免疫原性、及び収率の再現性が保証され得る。固相ペプチド合成を介するペプチド免疫原コンストラクトの製造についての詳細説明は実施例１に示される。

意図する免疫学的活性の保持を可能にする構造可変性範囲は、小分子薬物による特定の薬物活性の保持を可能にする構造可変性範囲、または生物学的に得られる薬物と共に生じる大分子に見られる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造可変性範囲と比較してはるかに柔軟なものであることが明らかになっている。したがって、ペプチド類似体は、意図的に設計されるものにしても、意図するペプチドと同様のクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する欠損配列副生成物の混合物として合成プロセスのエラーによって不可避的に生じるものにしても、所望のペプチドの精製調製物と同じくらい有効であることが多い。設計される類似体及び意図しない類似体混合物は、製造プロセス及び製品評価プロセスの両方を監視するために識別ＱＣ手順が開発されて、こうしたペプチドを用いる最終製品の再現性及び効力が保証される限りにおいては、有効である。

ペプチド免疫原コンストラクトは、核酸分子、ベクター、及び／または宿主細胞を含めて、組換えＤＮＡ技術を使用しても調製され得る。したがって、ペプチド免疫原コンストラクトをコードする核酸分子、及びペプチド免疫原コンストラクトの免疫学的に機能性の類似体をコードする核酸分子もまた、本発明の一部として本開示によって包含される。同様に、核酸分子を含むベクター（発現ベクターを含む）ならびにそうしたベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の一部として本開示によって包含される。

さまざまな例示の実施形態は、ペプチド免疫原コンストラクト及びその免疫学的に機能性の類似体の生成方法も包含する。例えば、方法は、ペプチド免疫原コンストラクト及び／またはその免疫学的に機能性の類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、そうしたペプチド及び／または類似体が発現する条件の下でインキュベートするステップを含み得る。よく知られる組換えＤＮＡ手法によって、より長い合成ペプチド免疫原が合成され得る。そのような手法は、詳細なプロトコールと共に、よく知られるマニュアルにおいて提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するには、アミノ酸配列をコードする核酸配列を、アミノ酸配列を逆翻訳して得ることができ、こうした核酸配列では、好ましくは、遺伝子が発現することになる生物に最適なコドンが用いられる。次に、典型的には、ペプチド及び必要に応じて任意の制御エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子が調製される。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入され、宿主細胞にトランスフェクトされる。その後、ペプチドは、選択される発現系及び宿主に適した適切な条件の下で発現される。ペプチドは、標準的な方法によって精製され、特徴付けられる。

ｂ．免疫刺激性複合体を製造するための方法
さまざまな例示の実施形態は、ペプチド免疫原コンストラクト及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子を含む免疫刺激性複合体の生成方法も包含する。安定化された免疫刺激性複合体（ＩＳＣ）は、ペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分及びポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮ分子から得られる。この自己集合系は、電荷の静電気的な中和によって促進される。アニオン性オリゴマーに対するペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分のモル電荷比の化学量論によって集合の程度が決まる。ペプチド免疫原コンストラクトとＣｐＧ ＯＤＮとの非共有結合性の静電気的な結合は、完全に再現性のあるプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激性複合集合体は、免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する提示を促進し、それによって自体の免疫原性をさらに増強する。こうした複合体は、製造の間の品質制御のための特徴付けが容易なものである。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣのインビボでの忍容性は良好である。ＣｐＧ ＯＤＮ及びペプチド免疫原コンストラクトを含むこの微粒子系は、ＣｐＧ ＯＤＮの使用と関連する全般的なＢ細胞分裂促進性を利用し、さらにはＴｈ－１／Ｔｈ－２型応答のバランス取りを促進するように設計される。

開示の医薬組成物中のＣｐＧ ＯＤＮは、反対電荷の静電気的な中和によって媒介されるプロセスにおいて免疫原に１００％結合し、その結果、ミクロンサイズの微粒子を形成する。この微粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの従来の使用と比較してＣｐＧの投与量を顕著に減らし、有害な自然免疫応答が生じる可能を下げることが可能であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原プロセシング経路を促進する。したがって、そのような製剤は概念的に新規のものであり、代替の機構による免疫応答の刺激を促進することによって利益をもたらすことが見込まれる。

ｃ．医薬組成物を製造するための方法
さまざまな例示の実施形態は、ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物も包含する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水型エマルションを用いるものであることもあり、無機塩を含む懸濁液に含められることもある。

大きな集団が医薬組成物を使用することを目的とし、これに加えてＤＰＲタンパク質のクリアランスも投与目標の一部である場合、安全性は、別の重要考慮因子となる。臨床試験においては多くの製剤で油中水型エマルションがヒトで使用されるものの、製剤において使用するための主要なアジュバントは依然としてアラムであり、これはアラムが安全性を有するが故のことである。したがって、臨床適用のための調製物におけるアジュバントとしてアラムまたはその無機塩（リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ））が使用されることが多い。

ｄ．医薬組成物の使用方法
本開示は、ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物の使用方法も含む。

ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、対象からのＤＰＲタンパク質のクリアランスに使用され得る。この方法は、薬理学的に有効な量のペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む。

特定の実施形態
本発明の特定の実施形態には、限定されないが、下記のものが含まれる：
（１）リピート回数が約１０～約２５回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを含むＢ細胞エピトープと、
配列番号１６～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む異種ヘルパーＴ細胞エピトープと、
アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーと、
を含むジペプチドリピート（ＤＰＲ）ペプチド免疫原コンストラクトであって、
前記Ｂ細胞エピトープが、前記ヘルパーＴ細胞エピトープに対して、直接的に共有結合で連結されるか、または前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（２）前記ポリＧＡリピートが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＧＰリピートが、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＧＲリピートが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＰＲリピートが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＰＡリピートが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（３）前記異種ヘルパーＴ細胞エピトープの前記アミノ酸配列が、配列番号３１、配列番号３２、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（４）前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）である、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（５）下記の式：
｛（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＤＰＲ）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ｝_ｙ－Ｘ
を含み、
式中、
Ｔｈが、前記異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
Ａが、前記異種スペーサーであり、
（ＤＰＲ）が、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘが、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
それぞれのｍが、０～約４であり、
それぞれのｎが、０～約１０であり、
ｙが、１～約５である、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（６）前記ポリＧＡリピートが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＧＰリピートが、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＧＲリピートが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＰＲリピートが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
前記ポリＰＡリピートが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、（５）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（７）前記異種ヘルパーＴ細胞エピトープの前記アミノ酸配列が、配列番号３１、配列番号３２、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、（５）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（８）前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）である、（５）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（９）配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（１０）６８、６９、７０、８０、８８、９８、９９、１１０、１３０、１４８、１６１、１７３、２１８、２１９、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。

（１１）（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。

（１２）（１）に記載のペプチド免疫原コンストラクトを複数含む組成物。

（１３）前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、（１１）に記載の組成物。

（１４）（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトと、医薬的に許容可能な送達媒体及び／またはアジュバントと、を含む医薬組成物。

（１５）ａ．前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
ｂ．前記アジュバントが、Ａｌ（ＯＨ）_３またはＡｌＰＯ_４からなる群から選択されるアルミニウムの無機塩である、（１４）に記載の医薬組成物。

（１６）ａ．前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
ｂ．前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、（１４）に記載の医薬組成物。

（１７）（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

（１８）前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトに結合した、（１７）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

（１９）（９）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。

（２０）（１７）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。

（２１）宿主におけるＤＰＲタンパク質を認識する抗体を産生させるための方法であって、前記方法が、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトと、送達媒体及び／またはアジュバントと、を含む組成物を前記宿主に投与することを含む、前記方法。

（２２）動物におけるＤＰＲタンパク質の量を低減するための方法であって、前記方法が、（１）に記載のＤＰＲペプチド免疫原を薬理学的に有効な量で前記動物に投与することを含む、前記方法。

（２３）前記動物が、ヒトである、（２２）に記載の方法。

（２４）生物学的試料中のＤＰＲタンパク質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ．（１７）に記載の抗体またはそのエピトープ結合断片がＤＰＲタンパク質に結合可能な条件の下で前記抗体またはそのエピトープ結合断片に前記生物学的試料を曝露すること、及び
ｂ．前記生物学的試料中の前記ＤＰＲタンパク質に結合した前記抗体またはそのエピトープ結合断片の量を検出すること、
を含む、前記方法。

実施例１
ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの合成及びその製剤の調製
ａ．ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの合成
ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを合成するための方法について記載される。これらのペプチドは、血清学的アッセイ、実験室パイロット試験、及びフィールド試験に有用な小スケール量で合成した。これらのペプチドは、大スケール（キログラム）量でも得ることができ、こうした量は、医薬組成物の工業的／商業的な生産に有用である。リピート回数が１０回、１５回、及び／または２５回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、またはポリＰＲを含むＤＰＲペプチドを調製した。これらの配列は表１に示される。

病原体タンパク質（麻疹ウイルス融合タンパク質）に由来する慎重に設計した１つ以上のヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに対して選択ＤＰＲ断片を合成的に連結することによって当該断片をＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトにした。具体的には、ＤＰＲ断片を、ＭｖＦ５ Ｔｈ（ＵＢＩＴｈ（登録商標）１、配列番号３２）またはＭｖＦ４ Ｔｈ（ＵＢＩＴｈ（登録商標）３、配列番号３１）に連結した。これらの配列は表２に示される。

代表的なＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを、１００を超えるペプチドコンストラクトから選択し、調製した。これらのＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトは表９に示される（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１０、配列番号１３０、配列番号１４８、配列番号１６１、配列番号１７３、配列番号２１８、及び配列番号２１９）。ＤＰＲ抗体を検出及び／または測定するための免疫原性試験または関連血清学的試験に使用したペプチドはすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓのモデル４３０Ａペプチド合成機、モデル４３１ペプチド合成機、及び／またはモデル４３３ペプチド合成機によってＦ－ｍｏｃ化学を使用して小スケールで合成した。Ｎ末端をＦ－ｍｏｃで保護し、三官能性アミノ酸には側鎖保護基も用いて固相担体上での独立した合成によって各ペプチドを生成させた。合成が完了したペプチドを固相担体から切り離し、９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって側鎖保護基を除去した。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析によって合成ペプチド調製物を評価してアミノ酸内容が正しいことを確かめた。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によっても各合成ペプチドを評価して調製物の合成プロファイル及び濃度を確認した。合成プロセスの厳格な制御（カップリング効率のステップワイズ監視を含む）を行ったものの、アミノ酸の挿入、欠損、置換、及び中途終結を含めて、伸長サイクルの間に意図しない事象が生じたことに起因してペプチド類似体も生成された。したがって、合成した調製物には、典型的には、狙ったペプチドに加えて複数のペプチド類似体も一緒に含まれていた。そのような意図しないペプチド類似体は含まれていたものの、それでもなお、得られた合成ペプチド調製物は、免疫学的診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含めて、免疫学的応用における使用に適したものであった。典型的には、そのようなペプチド類似体は、意図的に設計したものにしても、副生成物の混合物として合成プロセスを介して生じたものにしても、製造プロセス及び製品評価プロセスの両方を監視するために識別ＱＣ手順が開発されて、こうしたペプチドを用いる最終製品の再現性及び効力が保証される限りにおいては、所望のペプチドの精製調製物と同じくらい有効であることが多い。

ｂ．ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物の調製
油中水型エマルションを用いる製剤、及び無機塩を含む懸濁液に含めた製剤を調製した。

簡潔に記載すると、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを、（ｉ）ヒトでの使用が認められた油としてＳｅｐｐｉｃ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルションに含めて調製するか、または（ｉｉ）ペプチドコンストラクトの量を変えて無機塩（ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）もしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム））と混合した（明記されるように行った）。典型的には、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを約２０～８００μｇ／ｍＬで水に溶解することによって組成物を調製し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ５１を用いて油中水型エマルション（体積で１：１）に組み込んで製剤化するか、または無機塩（すなわちＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（アラム））（体積で１：１）を用いて製剤化した。組成物を室温で約３０分間保持し、約１０～１５秒間ボルテックスによって混合してから免疫化に使用した。特定の組成物の２～３回用量を用いて何匹かの動物を免疫化し、これらの投与は、初回免疫化後経過週数（ｗｐｉ）が０の時点（プライム）及び３の時点（ブースター）で実施し、２回目のブーストについては任意選択で５ｗｐｉまたは６ｗｐｉの時点で実施し、これらの投与は、筋肉内経路によって実施した。その後、これらの免疫化動物を、選択したＢ細胞エピトープペプチド（複数可）を用いて試験することで、製剤中に存在するさまざまなペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性、ならびに関連する標的ペプチドまたは標的タンパク質とのその交差反応性を評価した。

実施例２
ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを用いる免疫化から得られる抗体力価
以下では、さまざまなＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの免疫化及び評価について詳述される。

ａ．免疫化及び血清収集
各試験群に明記した製剤には、一般に、異なる型のスペーサー（例えば、ペプチドコンストラクトの溶解性を増進させるためのεＬｙｓ（εＫ）またはリジン－リジン－リジン（ＫＫＫ））を介してＤＰＲ Ｂ細胞エピトープペプチドが連結されたセグメントと、非選択的ヘルパーＴ細胞エピトープ（麻疹ウイルス融合タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原に由来する２つの人工ヘルパーＴ細胞エピトープセットを含む）と、を含むすべての型のデザイナーＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含めた。ＤＰＲ Ｂ細胞エピトープペプチドは、デザイナーペプチドコンストラクトのＮ末端またはＣ末端に連結した。最初に行ったＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの評価では、その相対的な免疫原性について、対応するＤＰＲ Ｂ細胞エピトープペプチドまたはペプチド免疫原を用いてモルモットでの評価を行った。

各ペプチド免疫原をＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１及びＣｐＧにおいて製剤化してモルモット（群当たりのモルモット匹数３）を免疫化し、この免疫化では、プライム免疫化を４００μｇ／ｍｌの用量で行い、注射後経過週数（ＷＰＩ）が３、６、９の時点でブースト用量として１００μｇ／ｍｌで免疫化を行った。

ｂ．抗体力価の評価
ＥＬＩＳＡアッセイを実施してデザイナーＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を評価した。ＤＰＲ Ｂ細胞エピトープペプチドまたはペプチド免疫原コンストラクトを使用してプレートウェルをコートし、これらを標的ペプチドとした。１０倍の段階希釈によってモルモット免疫血清を１：１００～１：１００，０００に希釈した。試験した血清の力価は、Ｌｏｇ１０として表されており、Ａ_４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって計算した。すべてのペプチド免疫原が、プレートウェルにコートしたＢエピトープペプチドに対する強力な免疫原性力価を誘導した。

実施例３
血清学的アッセイ及び試薬
以下では、合成ペプチドコンストラクト及びその製剤の機能的な免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬について詳述される。

ａ．抗体特異性分析のためのペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験
免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを、以下に記載のように開発した。

標的ペプチドＤＰＲ断片またはペプチドコンストラクト（配列番号１０、配列番号６８～７０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１３０、配列番号１４８）を２μｇ／ｍＬ（別段の記載がない限り）で含めた１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．５）（別段の記載がない限り）を１００μＬ用いて９６ウェルプレートのウェルを３７℃で１時間、それぞれコートした。

ｂ．ＥＬＩＳＡ試験によるＤＰＲに対する抗体反応性の評価
ペプチド（配列番号１０、配列番号６８～７０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１３０、及び配列番号１４８）でコートしたウェルを、ゼラチン含量３重量％のＰＢＳ（２５０μＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合部位をブロッキングした後、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いて当該ウェルを３回洗浄し、乾燥させた。正常ヤギ血清含量２０体積％、ゼラチン含量１重量％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いて、分析対象の血清を（別段の記載がない限り）１：２０希釈した。希釈した検体（例えば、血清、血漿）のうちの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。次に、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いてウェルを６回洗浄して非結合抗体を除去した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型の種（例えば、マウス、モルモット、またはヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧを標識型トレーサーとして使用することで、陽性ウェルにおいて形成された抗体／ペプチド抗原複合体と結合させた。正常ヤギ血清含量１体積％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳ中に、あらかじめ力価測定して決定した最適な希釈率でペルオキシダーゼ標識型ヤギ抗ＩｇＧを含めたものを、各ウェルに１００マイクロリットル添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０含量０．０５体積％のＰＢＳを用いてウェルを６回洗浄して非結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を０．０４重量％、過酸化水素を０．１２体積％含む基質混合物１００μＬとウェルをさらに１５分間反応させた。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成させることによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ_４５０）を決定した。さまざまなＤＰＲに由来するペプチド免疫原を投与した免疫化動物の抗体力価の決定には、１０倍の段階希釈を行って１：１００～１：１０，０００とした血清を試験した。試験した血清の力価は、Ｌｏｇ１０として表されており、Ａ_４５０のカットオフ値を０．５としてＡ_４５０の線形回帰分析によって計算した。

ｃ．免疫原性の評価
免疫化の実験プロトコールに従って免疫前血清試料及び免疫血清試料を動物から収集し、５６℃で３０分間加熱して血清中補体因子を不活化した。ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物の投与後、プロトコールに従って血液試料を取得し、特定の標的部位（複数可）に対するその免疫原性を評価した。段階希釈した血清を試験し、希釈率の逆数のＬｏｇ_１０として陽性力価を表した。所望のＢ細胞応答を増強するために用いた「ヘルパーＴ細胞エピトープ」への抗体反応性を低いもの～無視できる程度のものに維持しながら、標的抗原内の所望のエピトープに対して特異的に指向化された高力価Ｂ細胞抗体応答を誘発する能力によって特定の医薬組成物の免疫原性を評価した。

ｄ．マウス免疫血清におけるＤＰＲレベルの免疫アッセイ
捕捉抗体として抗ＤＰＲ抗体、検出抗体としてビオチン標識型抗ＤＰＲ抗体を使用して、ＤＰＲ由来のペプチド免疫原を投与したマウスにおける血清中ＤＰＲレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｕｄ－ｃｌｏｎ、ＳＥＢ２２２Ｍｕ）によって測定した。簡潔に記載すると、抗体をコート用緩衝液（１５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．６））中に含めて１００ｎｇ／ウェルで９６ウェルプレート上に固定化し、４℃で一晩インキュベートした。コートしたウェルを、アッセイ希釈液（ＢＳＡ含量０．５％、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０含量０．０５％、ＰｒｏＣｌｉｎ３００含量０．０２％のＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで用いて室温で１時間ブロッキングした。洗浄緩衝液（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０含量０．０５％のＰＢＳ）を２００μＬ／ウェルで用いてプレートを３回洗浄した。精製組換えＤＰＲを使用してマウス血清５％含有アッセイ希釈液における標準曲線（２倍の段階希釈によって調製した１５６～１，２５０ｎｇ／ｍＬ範囲のもの）を作成した。コートしたウェルに対して希釈血清（１：２０）及び標準物質を５０マイクロリットル（５０μＬ）添加した。室温で１時間、インキュベートを実施した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを６回洗浄した。捕捉されたＤＰＲを１００μＬの検出抗体溶液（５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識型ＨＰ６０２９を含むアッセイ希釈液）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、結合したビオチン－ＨＰ６０２９を、ストレプトアビジンポリ－ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ）（１００μＬ／ウェル）を使用して１時間検出した。すべてのウェルの吸引処理を行い、洗浄緩衝液を２００μＬ／ウェルで用いてすべてのウェルを６回洗浄し、１ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ／ウェルで添加することによって反応を停止した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４パラメーターロジスティック曲線をあてはめることによって標準曲線を作成し、すべての試験試料中のＤＰＲの濃度計算に使用した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用することによってスチューデントｔ検定を使用するデータ比較を行った。

ｅ．抗ＤＰＲ抗体の精製
異なる配列のペプチドを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１０、配列番号１３０、配列番号１４８、配列番号１６１、及び配列番号１７３）を用いて免疫化したモルモットまたはマウスから注射後経過週数（ＷＰＩ）が３～１５の時点で収集した血清から、親和性カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用することによって抗ＤＰＲ抗体を精製した。簡潔に記載すると、緩衝液（０．１Ｍのリン酸及び０．１５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））での平衡化を行ってから、Ｎａｂ ＰｒｏｔｅｉｎＧスピンカラムに血清４００μＬを添加した後、１０分間反転混合し、５，８００×ｇ、１分間の遠心分離に供した。結合緩衝液（４００μＬ）を用いてカラムを３回洗浄した。その後、５，８００×ｇ、１分間の遠心分離後にスピンカラムに溶出緩衝液（４００μＬ、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０））を添加して抗体を溶出させた。溶出した抗体を中和緩衝液（４００μＬ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ８．０））と混合し、こうした精製抗体の濃度を、Ｎａｎ－Ｄｒｏｐを使用してＯＤ２８０で測定した。この測定では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準物質とした。

ｆ．結果
免疫化したモルモットの血清に由来する、ＤＰＲペプチドまたはペプチド免疫原に対する免疫原性力価をＥＬＩＳＡによって評価した。

表１０～１１及び図３Ａ～３Ｉは、１２の異なるＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを用いて免疫化したモルモットにおける抗血清の特性を１５週間にわたって示すものである。ｗｐｉが０、３、６、９、１２、及び１５の時点で得られたモルモット抗血清を１０倍の段階希釈によって希釈した。ＥＬＩＳＡプレートは、ＤＰＲペプチドまたはペプチド免疫原を用いてコートした。試験した血清の力価は、Ｌｏｇ_１０として表されており、Ａ_４５０のカットオフ値を０．５としてＡ４５０ｎｍの線形回帰分析によって計算した。

ポリＧＡペプチドを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト、ポリＧＰペプチドを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト、及びポリＧＲペプチドを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト（配列番号６８～７０、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１１０、配列番号１３０、及び配列番号１４８）についてのＥＬＩＳＡデータは表１０に示され、ポリＰＲを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１６１及び１７３配列番号）についてのＥＬＩＳＡデータは表１１に示される。

次に、図３Ａ～３Ｉに示されるグラフとしてＥＬＩＳＡデータをプロットした。このＥＬＩＳＡでは、動物の免疫化に使用したペプチド免疫原と同じペプチド免疫原を、分析のためのＥＬＩＳＡプレートに結合させた。具体的には、ポリＧＡコンストラクト（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、及び配列番号８８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、それぞれ図３Ａ～Ｄに示される。ポリＧＰコンストラクト（配列番号９８及び配列番号９９）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、それぞれ図３Ｅ～Ｆに示される。ポリＧＲコンストラクト（配列番号１３０及び配列番号１４８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、それぞれ図３Ｇ～Ｈに示される。ポリＧＲコンストラクト（配列番号１６１）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は、図３Ｉに示される。

ＤＰＲ免疫原コンストラクトはすべて、対応するＤＰＲペプチドまたはペプチド免疫原に対して高い免疫原性を示した。０週目の免疫化前時点では各群において検出可能な抗体力価は観測されないことがＥＬＩＳＡの結果から示された。３回の免疫化を行った後、各群の力価は６週目にピークに達し、この時点でのｌｏｇ_１０力価はほとんどの群で１２を超えており、各群の力価は１５週目に試験を終了するまでプラトーに達した状態を維持した（表１０～１１）。このデータは、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト中のジペプチドリピートの長さは抗体力価に対してあまり大きな影響を与えないように思われることを示している。例えば、表１０及び図３Ａ～３Ｄに示されるように、リピート回数が１０回、１５回、及び２５回のポリＧＡコンストラクト（配列番号６８～７０、配列番号８０、及び配列番号８８）が示す免疫原性は非常に類似している。

興味深いことに、ポリＧＡを含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号６８～７０、配列番号８０、及び配列番号８８）、ポリＧＰを含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１１０）、ならびにポリＧＲを含むペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１３０及び１４８）は、その対応するペプチド免疫原に対して高い免疫原性を示すだけなく、その他のペプチド免疫原コンストラクトのそれぞれに対してもある程度の交差反応性を誘発することが可能であった（表１０を参照のこと）。例えば、表１０は、ポリＧＡを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト（配列番号６８～７０、配列番号８０、配列番号８８）はすべて、ポリＧＰコンストラクト（配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１１０）に対する抗体力価ならびにポリＧＲコンストラクト（配列番号１３０及び配列番号１４８）に対する抗体力価を生じさせたことを示す。同様に、ポリＧＲを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトもまた、ポリＧＡ及びポリＧＰに対して同様の交差反応性を示す。一方で、ポリＧＰを含むＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト（配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１１０）では、ポリＧＲコンストラクトに対する交差反応性は低かった。

図４Ａ～４Ｄに示されるように、ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を、対応する標的Ｂ細胞エピトープペプチドのものとも比較した。

Ｔｈエピトープに連結されたポリＧＡコンストラクト（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、及び配列番号８８）を用いた免疫化の後に得られる抗体力価と、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＧＡコンストラクト（（ＧＡ）_５または（ＧＡ）_１０及び（ＧＡ）_１５（配列番号１及び配列番号２））を用いた免疫化の後に得られる抗体力価とを、配列番号７０の（ＧＡ）_２５－ＫＫＫ－εＫ－ＵＢＩＴｈ（登録商標）１コンストラクトに対するＥＬＩＳＡによって分析した。図４Ａでは、Ｔｈエピトープに連結されたポリＧＡコンストラクト（配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号８０、及び配列番号８８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は高度に免疫原性のものであり、高抗体力価となった一方で、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＧＡペプチド（（ＧＡ）_５または（ＧＡ）_１０及び（ＧＡ）_１５（配列番号１及び配列番号２））を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は免疫原性が存在しないものであったことが示される。

Ｔｈエピトープに連結されたポリＧＰコンストラクト（配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１１０）を用いた免疫化の後に得られる抗体力価と、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＧＰコンストラクト（（ＧＰ）_１０及び（ＧＰ）_１５（配列番号４及び配列番号５））を用いた免疫化の後に得られる抗体力価とを、配列番号９９の（ＧＰ）_１５－ＫＫＫ－εＫ－ＵＢＩＴｈ（登録商標）１コンストラクトに対するＥＬＩＳＡによって分析した。図４Ｂでは、Ｔｈエピトープに連結されたポリＧＰコンストラクト（配列番号９８、配列番号９９、及び配列番号１１０）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は高度に免疫原性のものであり、高抗体力価となった一方で、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＧＰペプチド（（ＧＰ）_１０及び（ＧＰ）_１５（配列番号４及び配列番号５））を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は免疫原性が存在しないものであったことが示される。

Ｔｈエピトープに連結されたポリＧＲコンストラクト（配列番号１３０及び配列番号１４８）を用いた免疫化の後に得られる抗体力価と、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＧＲコンストラクト（（ＧＲ）_１０、（ＧＲ）_１５、及び（ＧＲ）_２５（配列番号７、配列番号８、及び配列番号９））を用いた免疫化の後に得られる抗体力価とを、配列番号１３０の（ＧＲ）_２５－ＫＫＫ－εＫ－ＵＢＩＴｈ（登録商標）１コンストラクトに対するＥＬＩＳＡによって分析した。図４Ｃでは、Ｔｈエピトープに連結されたポリＧＲコンストラクト（配列番号１３０及び配列番号１４８）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は高度に免疫原性のものであり、高抗体力価となった一方で、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＧＲペプチド（（ＧＲ）_１０、（ＧＲ）_１５、及び（ＧＲ）_２５（配列番号７、配列番号８、及び配列番号９））を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は免疫原性が存在しないものであったことが示される。

Ｔｈエピトープに連結されたポリＰＲコンストラクト（配列番号１６１及び配列番号１７３）を用いた免疫化の後に得られる抗体力価と、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＰＲコンストラクト（（ＰＲ）_１０（配列番号１０））を用いた免疫化の後に得られる抗体力価とを、配列番号１０の（ＰＲ）_１０コンストラクトに対するＥＬＩＳＡによって分析した。図４Ｄでは、Ｔｈエピトープに連結されたポリＰＲコンストラクト（配列番号１６１及び配列番号１７３）を用いた免疫化の後に得られた抗体力価は高度に免疫原性のものであり、高抗体力価となった一方で、Ｔｈエピトープに連結されていないポリＰＲペプチド（（ＰＲ）_１０（配列番号１０））を用いた免疫化の後に得られた抗体力価はバックグラウンドレベルよりもわずかに高い免疫原性のものであったことが示される。

したがって、構造的には単純であるが、立体構造的には多様なこうしたＤＰＲは、それ単独では非免疫原性であることが多いものであるが、対応する標的Ｂ細胞エピトープペプチドに対する特殊な結合によってさまざまなＵＢＩＴｈ（登録商標）Ｔｈペプチドを用いる免疫原設計を行うことで、こうしたＤＰＲが、リピートの長さとは無関係に、そうした標的「Ｂ」エピトープに対する高力価抗体を誘導するように免疫原性になり得るという点は非常に興味深く、産業的有用性をもたらすものである。そのようなＤＰＲ免疫原は、製剤化してワクチンにすると、そのようなＤＰＲが脳に存在することに起因するある特定の神経変性疾患を有する患者の治療介入のために、こうした疾患の免疫療法として適用し得るものである。

そのようなワクチン製剤効力は、マウスモデル（Liu, Y., et al., “C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD”, Neuron, 90, 521-534 (2016)に記載のものなど）において評価され得る。例えば、そのようなマウスモデルが、本明細書に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトのうちの１つ以上を用いて免疫化されることで、こうした免疫化動物が、免疫原に応じて抗ＤＰＲ抗体（例えば、抗ＧＡ、抗ＧＰなど）を産生することが実証され得る。こうした免疫化動物をさらに分析することで、血清及び脳可溶化液の両方においてそうした抗体が検出され得るかどうかが決定され得る。その後、そのような免疫化動物が分析されることで、そのそれぞれのポリＤＰＲタンパク質凝集体とそうした抗ＤＰＲ特異的抗体とが共局在化するかどうかが決定され得る。その後、こうしたＤＰＲ免疫原コンストラクトを含むこうしたワクチン製剤は、年齢が適合し、かつリピート長が適合する対象のコホートにおいて試験され得る。

Claims (24)

1. リピート回数が約１０～約２５回のポリＧＡ、ポリＧＰ、ポリＧＲ、ポリＰＲ、またはポリＰＡを含むＢ細胞エピトープと、
   配列番号１６～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む異種ヘルパーＴ細胞エピトープと、
   アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）からなる群から選択される任意選択の異種スペーサーと、
   を含むジペプチドリピート（ＤＰＲ）ペプチド免疫原コンストラクトであって、
   前記Ｂ細胞エピトープが、前記ヘルパーＴ細胞エピトープに対して、直接的に共有結合で連結されるか、または前記任意選択の異種スペーサーを介して共有結合で連結される、前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
2. 前記ポリＧＡリピートが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＧＰリピートが、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＧＲリピートが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＰＲリピートが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＰＡリピートが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
3. 前記異種ヘルパーＴ細胞エピトープの前記アミノ酸配列が、配列番号３１、配列番号３２、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
4. 前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）である、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
5. 下記の式：
   ｛（Ｔｈ）_ｍ－（Ａ）_ｎ－（ＤＰＲ）－（Ａ）_ｎ－（Ｔｈ）_ｍ｝_ｙ－Ｘ
   を含み、
   式中、
   Ｔｈが、前記異種ヘルパーＴ細胞エピトープであり、
   Ａが、前記異種スペーサーであり、
   （ＤＰＲ）が、ポリＧＡリピート、ポリＧＰリピート、ポリＧＲリピート、ポリＰＲリピート、またはポリＰＡリピートを有するＢ細胞エピトープであり、
   Ｘが、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ_２であり、
   それぞれのｍが、０～約４であり、
   それぞれのｎが、０～約１０であり、
   ｙが、１～約５である、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
6. 前記ポリＧＡリピートが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＧＰリピートが、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＧＲリピートが、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＰＲリピートが、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
   前記ポリＰＡリピートが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
7. 前記異種ヘルパーＴ細胞エピトープの前記アミノ酸配列が、配列番号３１、配列番号３２、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項５に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
8. 前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号２２１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号２２２）である、請求項５に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
9. 配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
10. ６８、６９、７０、８０、８８、９８、９９、１１０、１３０、１４８、１６１、１７３、２１８、２１９、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクト。
11. 請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。
12. 請求項１に記載のペプチド免疫原コンストラクトを複数含む組成物。
13. 前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
14. 請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトと、医薬的に許容可能な送達媒体及び／またはアジュバントと、を含む医薬組成物。
15. ａ．前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
    ｂ．前記アジュバントが、Ａｌ（ＯＨ）_３またはＡｌＰＯ_４からなる群から選択されるアルミニウムの無機塩である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. ａ．前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号６８～２１９及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択され、
    ｂ．前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されることで、安定化された免疫刺激性複合体を形成する、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
18. 前記ＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトに結合した、請求項１７に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
19. 請求項９に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
20. 請求項１７に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。
21. 宿主におけるＤＰＲタンパク質を認識する抗体を産生させるための方法であって、前記方法が、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原コンストラクトと、送達媒体及び／またはアジュバントと、を含む組成物を前記宿主に投与することを含む、前記方法。
22. 動物におけるＤＰＲタンパク質の量を低減するための方法であって、前記方法が、請求項１に記載のＤＰＲペプチド免疫原を薬理学的に有効な量で前記動物に投与することを含む、前記方法。
23. 前記動物が、ヒトである、請求項２２に記載の方法。
24. 生物学的試料中のＤＰＲタンパク質を同定するための方法であって、前記方法が、
    ａ．請求項１７に記載の抗体またはそのエピトープ結合断片がＤＰＲタンパク質に結合可能な条件の下で前記抗体またはそのエピトープ結合断片に前記生物学的試料を曝露すること、及び
    ｂ．前記生物学的試料中の前記ＤＰＲタンパク質に結合した前記抗体またはそのエピトープ結合断片の量を検出すること、
    を含む、前記方法。

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