CN113227116A - 针对源自c9orf72二肽重复蛋白的肽免疫原构建体 - Google Patents
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Abstract
本公开关于二肽重复(DPR)肽免疫原构建体、含有构建体的组合物、利用构建体引发的抗体，以及制备和使用构建体及其组合物的方法。公开的DPR肽免疫原构建体含衍生自源自C9orf72的DPR蛋白的B细胞表位，包含重复的poly‑GA、poly‑GP、poly‑GR、poly‑PR和poly‑PA，直接或通过任选异源性间隔区连接异源性T辅助细胞(Th)表位。肽免疫原构建体的B细胞表位部分含个别二肽序列约10至约25个重复。公开的肽免疫原构建体刺激针对DPR序列的高特异性抗体产生。公开的肽免疫原构建体作为免疫疗法供肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶失智症(FTD)及/或因DPRs存在引起的任何其他病症患者使用。
Description
本申请是PCT国际申请，其要求2018年10月1日提交的美国临时申请序列号62/739,794的优先权(其全部内容通过引用并入本文)。
技术领域
本公开涉及基于源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白部分的肽免疫原构建体及其制剂，其用于预防和治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶失智症(FTD)。
发明背景
人类C9ORF72基因内含子内GGGGCC六核苷酸序列的扩增与人类肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶失智症(FTD)有关(Ranum等人的专利申请案WO2014/159247)。显示在三个可变阅读框架(alternate reading frames)中的正义转录物(sense transcript、)的非常规非ATG转录，即扩增的六核苷酸重复，导致三种不同多肽的生产、产生与聚集，每种多肽由两个氨基酸重复单元(二肽重复，DPRs)组成，即poly-(Gly-Ala；GA)、poly-(Gly-Pro；GP)和poly-(Gly-Arg；GR)(Montrasio的专利申请案WO2016/050822A2)。此外，相对应反义转录物的转录造成poly-(Pro-Arg；PR)、poly-(Pro-Ala；PA)和poly-(Gly-Pro；GP)产生。已显示在美国和欧盟高加索人群体中观察到这些C9ORF72-二-肽重复(DPR)扩增占FTD患者达30％，占ALS患者达50％，且占具有最高突变频率的FTD-ALS患者达80％。
ALS是一种具有多种病因的衰竭性疾病，在每100,000人中影响2人(Ranum等人的专利申请案WO 2014/159247；Petrucelli的专利案US 9,448,232)。ALS传统上被认为是一种疾病，其上下运动神经元退化，且特征是进展快速的虚弱、肌肉萎缩、肌肉痉挛、说话困难(构音障碍)、吞咽困难(吞咽障碍)和呼吸困难(呼吸困难(dyspnea))。尽管症状发生顺序和速度因人而异，但最终大多数患者无法行走、自行起床或使用其手和手臂，且大多数ALS患者最终会因呼吸衰竭而死亡(通常是在症状发作后的三到五年内)。越来越多的人认识到ALS是一种多系统疾病，在高达50％的患者中具有额颞叶功能(例如认知及行为)损害。Riluzole
是目前唯一可用于治疗ALS的药物，但仅能减缓其进展并适度增加生存率。
FTD属于一群临床、病理和遗传异质性的疾病，与大脑额叶和颞叶的萎缩或缩小有关。它是早发性失智症第二大最常见的病因，仅次于阿兹海默症。认知症状是多变的且包括由于额叶和颞叶皮质退化引起的失智症、行为和人格改变、语言功能障碍及/或精神疾病。由其症状，FTD可分为三类(i)额颞叶失智症行为型(behavioral-variant frontotemporaldementia，bvFTD)，其涉及人格、行为和判断的改变；(ii)原发性进行性失语症(primaryprogressive aphasia，PPA)，其涉及表达能力(使用语言进行说、读、写和理解他人的话语)的改变；以及(iii)皮质基底节综合症(corticobasal syndrome，CBS)和进行性核上性麻痹(progressive supranuclearpalsy，PSP)，其影响动作、思考和语言能力的控制。因为没有适合的治疗方法，FTD患者在症状发作后5-10年死亡。然而，显示50％的FTD患者有阳性家族史，且与ALS相比，FTD似乎代表具有共同潜在发病机制的疾病连续体(diseasecontinuum)。
诊断和治疗ALS及/或FTD的新方法极有益于ALS和FTD患者。导致C9orf72中RNA扩增的基因突变造成遗传性神经退化的体染色体显性形式，其特征在于同时存在ALS和FTD。C9orf72突变被认为是ALS/FTD疾病最常见的遗传形式。
发明内容
本公开关于靶向源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白部分的个别肽免疫原构建体及其制剂，其用于预防和治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶失智症(FTD)。本公开还关于含有肽免疫原构建体的组合物、制备和使用肽免疫原构建体的方法，以及利用肽免疫原构建体产生的抗体。
在某些实施例中，DPR肽免疫原构建体可以以下分子式表示：
{(Th)m-(A)n-(DPR)-(A)n-(Th)m}y-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔区；
(DPR)为B细胞表位，其具有重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
每个m为0至约4；
每个n为0至约10；以及
y为1至约5。
公开的DPR肽免疫原构建体的个别组分如以下所述。
参考文献：
1.RANUM，L.，et al.“Di-amino acid repeat-containing proteins associatedwith ALS”，WO 2014/159247，October 2，2014
2.PETRUCELLI，L.，et a1.“Methods and materials for detecting C9ORF72hexanucleotide repeat expansion positive frontotemporal lobar degeneration orC9ORF72 hexanucleotide repeat expansion positive amyotrophic lateralsclerosis”，US Patent No.9，448，232，September 20，2016
3.MONTRASIO，F.，et al.“Human-derived anti-dipeptide repeats(DPRs)antibody”，WO 2016/050822，April 7，2016
4.FREIBAUM，B.D.，et a1.，“The role of dipeptide repeats in C9ORF72-related ALS-FTD”，Frontiers in Molecular Neuroscience，10(35)：1-35(2017)
附图简述
图1显示示意图用以说明由扩增的C9ORF72区域GGGGCC重复(SEQ ID NO：225)所产生正义RNA转录物的三个可变阅读框架的转录产物可产生重复的二肽(甘氨酸-精氨酸；GR)n(SEQ ID NO：226)、(甘氨酸-脯氨酸；GP)n(SEQ ID NO：227)和(甘氨酸-丙氨酸；GA)n(SEQID NO：228)，而反义RNA GGCCCC重复(SEQ ID NO：229)的三个可变阅读框架的转录产物可产生重复的二肽(甘氨酸-脯氨酸；GP)n(SEQ ID NO：230)、(脯氨酸-精氨酸；PR)n(SEQ IDNO：231)和(脯氨酸-丙氨酸；PA)n(SEQ ID NO：232)。
图2显示表格用以概述个别DPR种类的多种结构和功能特征以及其对其相互作用和毒性的影响。
图3A-3I显示图式用以说明在利用本公开肽免疫原构建体免疫天竺鼠后所获得的抗体效价。具体来说，在图3A-3D中分别地显示在利用poly-GA结构(SEQ ID NOs：68、69、70和88)免疫后所获得的抗体效价。在图3E-3F中分别地显示在利用poly-GP结构(SEQ IDNOs：98和99)免疫后所获得的抗体效价。在图3G-3H中分别地显示在利用poly-GR结构(SEQID NOs：130和148)免疫后所获得的抗体效价。在图3I中显示在利用poly-PR结构(SEQ IDNO：161)免疫后所获得的抗体效价。
图4A-4D显示图式用以说明在利用本公开肽免疫原构建体免疫天竺鼠后所获得的抗体效价。具体来说，在利用poly-GA结构(SEQ ID NOs：68、69、70、80和88)免疫后所获得的抗体效价显示为高效价；然而，如图4A所示，在利用(GA)5或(GA)10和(GA)15(SEQ ID NOs：1和2)(其含有未连接至用以增强免疫原性的
肽的poly-GA序列)免疫后所获得的抗体效价不具有免疫原性。在利用poly-GP结构(SEQ ID NOs：98、99和110)免疫后所获得的抗体效价显示为高效价；然而，如图4B所示，在利用(GP)10和(GP)15(SEQ ID NOs：4和5)(其含有未连接至用以增强免疫原性的
肽的poly-GP序列)免疫后所获得的抗体效价不具有免疫原性。在利用poly-GR结构(SEQ ID NOs：130和148)免疫后所获得的抗体效价显示为高效价；然而，如图4C所示，在利用(GR)10、(GR)15和(GR)25(SEQ ID NOs：7、8和9)(其含有未连接至用以增强免疫原性的
肽的poly-GR序列)免疫后所获得的抗体效价不具有免疫原性。在利用poly-PR结构(SEQ ID NOs：161和173)免疫后所获得的抗体效价显示为高效价；然而，如图4D所示，在利用(PR)10(SEQ ID NO：10)(其含有未连接至用以增强免疫原性的
肽的poly-PR序列)免疫后所获得的抗体效价展现免疫原性仅略高于背景值。
实施方式
本公开关于靶向源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白部分的个别肽免疫原构建体及其制剂，其用于预防和治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶失智症(FTD)。本公开还关于含有肽免疫原构建体的组合物、制备和使用肽免疫原构建体的方法，以及利用肽免疫原构建体产生的抗体。
公开的肽免疫原构建体含有B细胞表位和T辅助细胞表位，且具有约20个或更多个的氨基酸。
肽免疫原构建体含有源自源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白部分的B细胞表位，包括poly-GA重复、poly-GP重复、poly-GR重复、poly-PR重复和poly-PA重复的序列。B细胞表位可通过任选的异源性间隔区连接至衍生自病原体蛋白质的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对DPRs的高特异性抗体的产生。公开的肽免疫原构建体可作为罹患肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶失智症(FTD)及/或因DPRs存在所引起的任何其他病症患者的免疫疗法。
肽免疫原构建体的B细胞表位部分具有衍生自源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白的氨基酸序列，包括poly-GA重复(SEQ ID NOs：1-3)、poly-GP重复(SEQ ID NOs：4-5)、poly-GR重复(SEQ ID NOs：7-9)、poly-PR重复(SEQ ID NOs：10-12)和poly-PA重复(SEQ IDNOs：13-15)的序列，如表1所示。
本公开的肽免疫原构建体含有衍生自病原体蛋白质的异源性Th表位氨基酸序列(例如SEQ ID NOs：16-67)，如表2所示。在某些实施例中，异源性Th表位衍生自天然病原体，例如白喉毒素(SEQ ID NO：55)、恶性疟原虫(SEQ ID NO：66)、霍乱毒素(SEQ ID NO：48)。在其他实施例中，异源性Th表位为单一序列(例如SEQ ID NOs：21、22、32、33和43-46)或组合序列(例如SEQ ID NOs：20、25、28、31、39和42)形式的衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg1至3)的理想化人工Th表位。本公开的肽免疫原构建体可引发针对构建体中B细胞表位区域的抗体产生而不会活化发炎性T细胞反应。
在一些实施例中，肽免疫原构建体含有源自DPR的B细胞表位，其通过任选的异源性间隔区连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。在某些实施例中，肽免疫原构建体含有B细胞抗原位点，其具有源自DPR的氨基酸序列(例如SEQ ID NOs：1至15)，通过任选的异源性间隔区连接至衍生自病原体蛋白质的异源性Th表位(例如SEQ ID NOs：16至67)。在一些实施例中，任选的异源性间隔区为能够将两个氨基酸及/或肽连接在一起的任何分子或化学结构。在某些实施例中，间隔区是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。在具体实施例中，肽免疫原构建体具有SEQ ID NOs：68至217的氨基酸序列，如表3-7所示。
本公开也关于含有DPR肽免疫原构建体的组合物。在一些实施例中，公开的组合物含有一种以上的DPR肽免疫原构建体。在某些实施例中，组合物含有DPR肽免疫原构建体的混合物(例如SEQ ID NOs：68至217的任意组合)以覆盖患者中广泛的遗传背景。与仅含有单一种肽免疫原构建体的组合物相比，含有肽免疫原构建体混合物的组合物可导致免疫后更高百分比的反应率，用于预防及/或治疗ALS、FTD及/或因DPRs存在所引起的任何其他病症。
本公开还关于用于预防及/或治疗ALS、FTD或因DPRs存在所引起的任何其他病症的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物含有公开的肽免疫原构建体，其以稳定化的免疫刺激复合物形式存在，稳定化的免疫刺激复合物是藉由将CpG寡聚合物与含有肽免疫原的组合物混合通过静电结合复合而形成。此种稳定化的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施例中，药物组合物含有佐剂，例如矿物盐(包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS))或油包水乳液(包括MONTANIDE ISA 51或720)。
本公开也关于针对公开的DPR肽免疫原构建体的抗体。特别是，当施用个体时，本公开的肽免疫原构建体可刺激与DPR氨基酸序列(SEQ ID NOs：1-15)交叉反应的高特异性抗体的产生。由肽免疫原构建体产生的高特异性抗体可与重组含有DPR的蛋白质交叉反应。公开的抗体利用高特异性结合至个别的DPR，没有太多，如果有的话，则是针对用于免疫原性增强的异源性Th表位，此与利用用于此种肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。
本公开还包括利用公开的肽免疫原构建体及/或针对肽免疫原构建体的抗体预防及/或治疗ALS、FTD及/或因DPRs存在所引起的任何其他病症的方法。在一些实施例中，用以预防及/或治疗ALS、FTD及/或因DPRs存在所引起的任何其他病症的方法包括将含有公开的肽免疫原构建体的组合物施用宿主。在某些实施例中，所述方法中使用的组合物含有公开的肽免疫原构建体，肽免疫原构建体通过静电结合与带有负电荷的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成稳定的免疫刺激复合物，其可进一步任选地与佐剂(矿物盐或油类)一同添加，施用患有ALS、FTD及/或因DPRs存在所引起的任何其他病症的患者。公开的方法还包括用于施用肽免疫原构建体的给药方案、剂型和给药途径，以施用肽免疫原构建体给具有ALS、FTD及/或因DPRs存在所引起的任何其他病症风险或已患病的宿主。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被理解为限制所述主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的部分出于任何目的通过引用明确地将整体并入本文。
除非特别说明，在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出，否则单词“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数形式。类似地，单词“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更应被理解的是，用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供作为描述之用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述公开的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非意指加以限制。
二肽重复(DPR)肽免疫原构建体
本公开提供肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体含有具有源自DPR的氨基酸序列的B细胞表位，其直接地或通过任选的异源性间隔区共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
本文使用术语“DPR肽免疫原构建体”或“肽免疫原构建体”是指肽，其含有(a)具有DPR的约20个或更多个氨基酸残基的B细胞表位；(b)异源性Th表位；以及(c)任选的异源性间隔区。
在某些实施例中，DPR肽免疫原构建体可利用以下分子式表示：
{(Th)m-(A)n-(DPR)-(A)n-(Th)m}y-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔区；
(DPR)为B细胞表位，其具有重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
每个m为0至约4；
每个n为0至约10；以及
y为1至约5。
公开的DPR肽免疫原构建体的个别组分如以下所述。
a.B细胞表位(DPRs)
肽免疫原构建体的B细胞表位部分具有衍生自源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白的氨基酸序列，包括重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA。
在一些实施例中，B细胞表位是具有一个以上重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA的DPR。B细胞表位可具有2至50个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA。例如，B细胞表位可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA。
在一些实施例中，B细胞表位是具有约10至约25个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA的DPR。在某些实施例中，DPR包含10、15或25个重复的poly-GA(SEQID NOs：1-3)、poly-GP(SEQ ID NOs：4-5)、poly-GR(SEQ ID NOs：7-9)、poly-PR(SEQ IDNOs：10-12)或poly-PA(SEQ ID NOs：13-15)，如表1所示。
在一些实施例中，DPR肽免疫原构建体的B细胞表位部分不含内源性T辅助细胞表位。因此，B细胞表位部分本身不具有免疫原性，或具有很少的免疫原性。
b.异源性T辅助细胞表位(Th表位)
本公开提供肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体含有衍生自源自C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白的B细胞表位，其直接地或通过任选的异源性间隔区共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
肽免疫原构建体中的异源性Th表位可增强DPR片段的免疫原性，其通过合理设计促进针对DPR的特异性高效价抗体的生产。
本文使用术语“异源性”是指衍生自并非DPR野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，异源性Th表位为衍生自非天然存在于DPR的氨基酸序列的Th表位(即Th表位对DPR而言不是自体衍生的)。因为Th表位对DPR而言是异源性的，当异源性Th表位共价连接至DPR片段时，DPR的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
本公开的异源性Th表位可为不具有天然存在于DPR的氨基酸序列的任何Th表位。Th表位可具有衍生自任何物种(例如人类、猪、牛、狗、大鼠、小鼠、天竺鼠等)的氨基酸序列。Th表位还可具有针对多种物种第2类MHC分子的混杂结合基序。在某些实施例中，Th表位包含多个混杂的第2类MHC结合基序，以允许T辅助细胞的最大活化，从而导致免疫反应的启动和调节。较佳的Th表位本身为非免疫原性的(即如果有的话，很少利用DPR肽免疫原构建体所产生的抗体是针对Th表位)，因此允许针对DPR的目标B细胞表位的非常集中的免疫反应。
本公开的Th表位包括，但不限于，衍生自外来病原菌的氨基酸序列，如表2(SEQ IDNOs：16至67)所例示。此外，异源性Th表位可包括单一序列(例如SEQ ID NOs：21、22、32、33和43-46)或组合序列(例如SEQ ID NOs：20、25、28、31、39和42)形式的理想化人工Th表位。异源性Th表位肽以组合序列(例如SEQ ID NOs：20、25、28、31、39和42)呈现，含有基于特定肽的同源物的可变残基在肽骨架内于特定位置处作为代表的氨基酸残基的混合物。可以利用在合成过程期间在特定位置添加选定受保护的氨基酸的混合物，而非一个特定的氨基酸，于单一过程中合成组合肽的集合。此种组合异源性Th表位肽集合可允许对具有不同遗传背景的动物广泛的Th表位覆盖。异源性Th表位肽的代表性组合序列包括如表2所示的SEQID NOs：20、25、28、31、39和42。本发明的Th表位肽对来自基因多样性群体的动物和患者提供广泛的反应性和免疫原性。
包含Th表位的DPR肽免疫原构建体可于与DPR片段串联的单一固相肽合成中同时产生。Th表位也可包括已知Th表位的免疫类似物。免疫Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应类似物和任何这些Th表位的片段，其足以增强或刺激针对DPR片段的免疫反应。
Th表位肽的功能免疫类似物也是有效的，且被包括作为本公开的一部分。功能免疫Th类似物可包括氨基酸位置的保守性取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除及/或其任意组合。此种免疫功能类似物实质上未改变公开的Th表位的Th刺激功能。
保守性取代是指一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质的氨基酸残基所取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
可利用天然或非天然氨基酸完成保守性取代、添加和插入。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，ε-N赖氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-胺基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、胺基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca；6-胺基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
表2辨识了Th表位肽的功能类似物的另一种变异物。具体而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs：21和22是MvF4和MvF5 Th的SEQ ID NOs：31和32的功能类似物，因为利用在氨基端和羧基端将各两个氨基酸删除(SEQ ID NOs：21和22)或插入(SEQ ID NOs：31和32)而使其氨基酸骨架有所区别。在类似序列的这两个系列之间的差异并不会影响包含于此些序列中的Th表位的功能。因此，功能免疫Th类似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-5Ths(SEQ ID NOs：21至33)和衍生自肝炎表面蛋白质HBsAg 1-3Ths(SEQ ID NOs：34至46)的Th表位的多种版本。
在公开的肽免疫原构建体中的Th表位可与DPR序列的氨基端或羧基端或二者共价连接。在一些实施例中，Th表位是共价连接至DPR肽的氨基端。在其他实施例中，Th表位是共价连接至DPR肽的羧基端。在某些实施例中，一个以上的Th表位共价连接至DPR片段。当一个以上的Th表位连接至DPR片段时，每一个Th表位可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。另外，当一个以上的Th表位连接至DPR片段时，Th表位可以任何顺序排列。例如，Th表位可连续地连接至DPR片段的氨基端，或连续地连接至DPR片段的羧基端，或当不同的Th表位共价连接至DPR片段的羧基端时，Th表位可共价连接至DPR片段的氨基端。Th表位相对于DPR片段的排列并无限制。
在一些实施例中，Th表位直接地共价连接至DPR片段。在其他实施例中，Th表位通过以下进一步详述的异源性间隔区共价连接至DPR片段。
c.异源性间隔区
公开的肽免疫原构建体任选地含有异源性间隔区，其将衍生自DPR蛋白的B细胞表位共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
如上所述，术语“异源性”是指衍生自并非DPR野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因为间隔区对DPR序列而言是异源性的，所以当异源性间隔区共价连接至源自DPR的B细胞表位时，DPR的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
间隔区为能够将两个氨基酸及/或肽连接在一起的任何分子或化学结构。依据应用的不同，间隔区的长度或极性可能会有所不同。间隔区连接可通过酰胺或羧基连结，但是其他官能基也是可能的。间隔区可包括化学化合物、天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。
间隔区可为肽免疫原构建体提供结构特征。结构上，间隔区提供Th表位与DPR片段的B细胞表位的物理分离。通过间隔区的物理分离可破坏通过将Th表位连接至B细胞表位所产生的任何人工二级结构。另外，通过间隔区的B细胞和Th表位的物理分离可消除Th细胞及/或B细胞反应之间的干扰。此外，可设计间隔区以产生或修饰肽免疫原构建体的二级结构。例如，可设计间隔区以作为柔性铰链，用以增强Th表位和B细胞表位的分离。柔性铰链间隔区也可允许所呈现的肽免疫原与适当的Th细胞和B细胞之间更有效率的交互作用，以增强对Th表位和B细胞表位的免疫反应。编码柔性铰链的序列的例示见于通常富含脯氨酸的免疫球蛋白重链铰链区。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：220)提供了一种作为间隔区使用的特别有用的柔性铰链，其中Xaa是任意氨基酸，以天冬氨酸为优选。
间隔区也可为肽免疫原构建体提供功能特征。例如，可设计间隔区以改变肽免疫原构建体的总电荷，其可影响肽免疫原构建体的溶解度。此外，改变肽免疫原构建体的总电荷可影响肽免疫原构建体与其他化合物和试剂结合的能力。如下文进一步详细讨论，肽免疫原构建体可通过静电结合与高度带电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成稳定的免疫刺激复合物。肽免疫原构建体的总电荷对于形成这些稳定的免疫刺激复合物是重要的。
可作为间隔区的化学化合物包括，但不限于，(2-胺基乙氧基)乙酸(AEA)、5-胺基戊酸(AVA)、6-胺基己酸(Ahx)、8-胺基-3，6-二氧杂辛酸(AEEA，mini-PEG1)、12-胺基-4，7，10-三氧杂十二酸(mini-PEG2)、15-胺基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-胺基十二烷酸、Fmoc-5-胺基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
可作为间隔区的天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
可作为间隔区的非天然存在的氨基酸包括，但不限于，ε-N赖氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-胺基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、胺基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca；6-胺基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。
在肽免疫原构建体中的间隔区可与DPR序列的氨基端、羧基端或二者共价连接。在一些实施例中，间隔区共价连接至Th表位的羧基端和DPR的氨基端。在其他实施例中，间隔区共价连接至DPR的羧基端和Th表位的氨基端。在某些实施例中，可使用一个以上的间隔区，例如，当在肽免疫原构建体中存在一个以上的Th表位时。当使用一个以上的间隔区时，每个间隔区可以彼此相同或不同。此外，当肽免疫原构建体中连续地存在一个以上的Th表位时，可利用间隔区将连续的Th表位彼此分隔开，此间隔区可与用于将Th表位与B细胞表位分开的间隔区相同或不同。间隔区相对于Th表位或DPR片段的排列没有限制。
在某些实施例中，异源性间隔区是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在其他实施例中，间隔区包含一个以上的天然存在或非天然存在的氨基酸。在具体实施例中，间隔区为Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)或Lys-Lys-Lys-i-N-Lys(SEQ ID NO：222)。
d.DPR肽免疫原构建体的具体实施例
在某些实施例中，DPR肽免疫原构建体可利用以下分子式表示：
{(Th)m-(A)n-(DPR)-(A)n-(Th)m}y-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔区；
(DPR)为B细胞表位，其具有重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
(DPR)具有介于约4至约50个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
每个m为0至约4；
每个n为0至约10；以及
y为1至约5。
在某些实施例中，肽免疫原构建体中的异源性Th表位具有选自SEQ ID NOs：16至67或其组合中的任一个的氨基酸序列，如表2所示。在具体实施例中，Th表位具有选自SEQID NOs：16至46中任一个的氨基酸序列。在某些实施例中，肽免疫原构建体含有一种以上的Th表位。
在某些实施例中，任选的异源性间隔区是选自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，i-N)Lys、i-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)、Lys-Lys-Lys-i-N-Lys(SEQ ID NO：222)及其组合中的任一个。在具体实施例中，异源性间隔区是选自(α，i-N)Lys、i-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)、Lys-Lys-Lys-i-N-Lys(SEQ ID NO：222)及其组合中的任一个。
在某些实施例中，DPR是B细胞表位，其具有约10至约25个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA。在具体实施例中，DPR含有10、15或25个重复的poly-GA(SEQ ID NOs：1-3)、poly-GP(SEQ ID NOs：4-5)、poly-GR(SEQ ID NOs：7-9)、poly-PR(SEQID NOs：10-12)或poly-PA(SEQ ID NOs：13-15)，如表1所示。
在某些实施例中，肽免疫原构建体含有约10至约25个重复的poly-GA，其通过任选的间隔区共价连接至一或多个Th表位序列，如表3所示。在其他实施例中，肽免疫原构建体含有约10至约25个重复的poly-GP，其通过任选的间隔区共价连接至一或多个Th表位序列，如表4所示。在某些实施例中，肽免疫原构建体含有约10至约25个重复的poly-GR，其通过任选的间隔区共价连接至一或多个Th表位序列，如表5所示。在某些实施例中，肽免疫原构建体含有约10至约25个重复的poly-PR，其通过任选的间隔区共价连接至一或多个Th表位序列，如表6所示。在某些实施例中，肽免疫原构建体含有约10至约25个重复的poly-PA，其通过任选的间隔区共价连接至一或多个Th表位序列，如表7所示。
在具体实施例中，肽免疫原构建体具有选自由SEQ ID NOs：68、69、70、80、88、98、99、110、130、148、161、173、218和219组成的群组的氨基酸序列，如表9所示。
本公开的肽免疫原构建体可引发针对构建体中B细胞表位区域的抗体产生而不会活化发炎性T细胞反应。
组合物
本公开还提供包含公开的肽免疫原构建体的组合物。
a.肽组合物
含有公开的肽免疫原构建体的组合物可为液体或固体形式。液体组合物可包括不改变肽免疫原构建体的结构或功能特性的水、缓冲液、溶剂、盐及/或任何其他可接受的试剂。肽组合物可含有一种或多种公开的肽免疫原构建体。
组合物可含有一种含有单一B细胞表位的肽免疫原构建体，此B细胞表位含有重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA。例如，在此实施例中，组合物可含有一种肽免疫原构建体，此肽免疫原构建体含有X个重复的(a)poly-GA、(b)poly-GP、(c)poly-GR、(d)poly-PR或(e)poly-PA，其中X代表介于2至50之间的数字。
组合物也可含有一种以上的肽免疫原构建体，其中组合物中的肽免疫原构建体的DPR长度、DPR序列或两者有所不同。在一些实施例中，组合物可含有肽免疫原构建体，此些肽免疫原构建体具有2、3、4或5个不同的DPR序列作为B细胞表位，即组合物可含有含有(a)poly-GA、(b)poly-GP、(c)poly-GR、(d)poly-PR及/或(e)poly-PA的肽免疫原构建体的任意组合。
组合物的非限制性例示包括：
a.一种组合物，含有(1)肽免疫原构建体，其具有X个重复的(a)poly-GA、(b)poly-GP、(c)poly-GR、(d)poly-PR或(e)poly-PA，以及(2)不同的肽免疫原构建体，其含有Y个重复的相同DPR，其中X和Y代表介于2至50之间的数字，并且不是相同的数字。
b.一种组合物，含有(1)肽免疫原构建体，其含有X个重复的(a)poly-GA、(b)poly-GP、(c)poly-GR、(d)poly-PR或(e)poly-PA，以及(2)不同的肽免疫原构建体，其含有Y个重复的(a)poly-GA、(b)poly-GP、(c)poly-GR、(d)poly-PR或(e)poly-PA，其中(1)和(2)的肽免疫原构建体是不同的，且X和Y代表介于2至50之间的数字，数字可为相同或不同。
c.一种组合物，含有(1)肽免疫原构建体，其含有V个重复的poly-GA；(2)肽免疫原构建体，其含有W个重复的poly-GP；(3)肽免疫原构建体，其含有X个重复的poly-GR；(4)肽免疫原构建体，其含有Y个重复的poly-PR；(5)肽免疫原构建体，其含有Z个重复的poly-PA，其中V、W、X、Y和Z分别代表介于2至50之间的数字，数字可为相同或不同。
对可以包含在肽组合物中的肽免疫原构建体的组合没有限制。
b.药物组合物
本公开也关于含有公开的肽免疫原构建体的药物组合物。
药物组合物可含有在药学上可接受的递送系统中的载体及/或其他添加剂。因此，药物组合物可含有肽免疫原构建体的药学上有效剂量以及药学上可接受的载体、佐剂及/或其它赋形剂(例如稀释剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂等)。
药物组合物可含有一种或多种佐剂，其作用是加速、延长或增强针对肽免疫原构建体的免疫反应，而本身不具有任何特异性抗原作用。药物组合物中使用的佐剂可包括油、铝盐、仿病毒颗粒(virosomes)、磷酸铝(例如
)、氢氧化铝(例如
)、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、
单磷酸脂质A(MPL)、QS21、ISA 35、ISA 206、ISA50V、ISA51、ISA 720，以及其他佐剂和乳化剂。
在一些实施例中，药物组合物含有MONTANIDETM ISA 51(由植物油和二缩甘露醇油酸酯所组成的油质佐剂组合物，用以制造油包水乳液)、
80(也称为聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意组合。在其他实施例中，药物组合物是以EMULSIGEN或EMULSIGEN D作为佐剂的水包油包水(即w/o/w)乳液。
药物组合物可配制成立即释放或缓续释放剂型。另外，可配制药物组合物用于通过免疫原包封和与微粒共同施用以诱导系统性或局部性黏膜免疫。所属技术领域中具有通常知识者很容易判定此种递送系统。
药物组合物可以以液体溶液或悬浮液型式配制成注射剂。含有肽免疫原构建体的液体载体也可在注射前制备。药物组合物可利用任何适合的用法施用，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等，并且可在任何适合的递送装置中施用。在某些实施例中，可配制药物组合物供静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。也可制备适用于其它给药方式的药物组合物，包括口服和鼻内应用。
药物组合物可配制成立即释放或缓续释放剂型。另外，可配制药物组合物用于通过免疫原包封和与微粒共同施用以诱导系统性或局部性黏膜免疫。所属技术领域中具有通常知识者很容易判定此种递送系统。
药物组合物也可以适合的剂量单位形式配制。在一些实施例中，药物组合物含有每公斤体重约0.5μg至约1mg的肽免疫原构建体。药物组合物的有效剂量取决于许多不同的因素，包括施用方式、靶点、患者的生理状态、患者是人类或动物、施用的其它药物，以及处理是供预防还是治疗。通常，患者是人类，但也可治疗包括基因转殖哺乳类动物的非人类哺乳类动物。当以多剂量递送时，药物组合物可以方便地分成每个剂量单位形式的适当量。如治疗领域众所周知的，施用的剂量取决于个体的年龄、体重和一般健康状况。
在一些实施例中，药物组合物含有一种以上的肽免疫原构建体。与上述肽组合物相似，药物组合物可含有一种以上的肽免疫原构建体，其中组合物中的肽免疫原构建体的差异在于DPR的长度、DPR的序列或两者。含有一种以上肽免疫原构建体的混合物的药物组合物允许协同性增强构建体的免疫效力。含有一种以上肽免疫原构建体的药物组合物可在更大的遗传群体中更为有效，这是由于广泛的第2类MHC覆盖，因此提供针对肽免疫原构建体的经改善的免疫反应。
在一些实施例中，药物组合物含有选自SEQ ID NOs：68、69、70、80、88、98、99、110、130、148、161、173的肽免疫原构建体，以及同源物、类似物及/或其组合。
含有肽免疫原构建体的药物组合物可用于施用后在宿主中引发免疫反应并产生抗体。
c.免疫刺激复合物
本公开也关于含有与CpG寡核苷酸形成免疫刺激复合物的肽免疫原构建体的药物组合物。此种免疫刺激复合物特别适合作为佐剂和肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物呈微粒形式，其可有效地将肽免疫原呈现给免疫系统的细胞以产生免疫反应。免疫刺激复合物可配制成用于肠胃外施用的悬浮液。免疫刺激复合物还可配制成油包水(w/o)乳液形式，作为与矿物盐或原位凝胶聚合物结合的悬浮液，用于在肠胃外施用后将肽免疫原有效递送至宿主免疫系统的细胞。
稳定化的免疫刺激复合物可藉由通过静电结合将肽免疫原构建体与阴离子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其组合复合而形成。稳定化的免疫刺激复合物可作为免疫原递送系统并入药物组合物中。
在某些实施例中，将肽免疫原构建体设计成包含阳离子部份，其于范围为5.0至8.0的pH下带有正电荷。肽免疫原构建体或构建体的混合物的阳离子部份的净电荷计算是依据，每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)带有+1电荷，每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)带有-1电荷，以及序列中其他氨基酸所带的电荷为0。将在肽免疫原构建体的阳离子部份中的电荷相加，并表示为净平均电荷。适合的肽免疫原具有具有净平均正电荷为+1的阳离子部份。较佳地，肽免疫原具有范围大于+2的净正电荷。在一些实施例中，肽免疫原构建体的阳离子部份为异源性间隔区。在某些实施例中，当间隔区序列为(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：222)时，肽免疫原构建体的阳离子部份具有+4的电荷。
如本文所述的“阴离子型分子”是指在范围为5.0至8.0的pH下带有负电荷的任何分子。在某些实施例中，阴离子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的净负电荷计算是依据，在寡聚合物中的每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团带有-1电荷。适合的阴离子型寡核苷酸是具有8至64个核苷酸碱基的单链DNA分子，CpG基序的重复数在1至10的范围内。在一些实施例中，CpG免疫刺激性单链DNA分子含有18至48个核苷酸碱基，CpG基序的重复数在3至8的范围内。
在某些实施例中，阴离子型寡核苷酸可以分子式5′X1CGX23′表示，其中C和G是未甲基化的；且X1是选自由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)组成的群组；且X2是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，阴离子型寡核苷酸可以分子式5′(X3)2CG(X4)23′表示，其中C和G是未甲基化的；且X3是选自由A、T或G组成的群组；且X4是C或T。在具体实施例中，CpG寡核苷酸是选自由以下组成的群组，包括：5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT3’(CpG1)SEQ ID NO：223(其为32个碱基长的寡聚合物)以及5’nTC GTC GTT TTG TCG TTTTGT CGT T 3’(CpG2)SEQ IDNO：224(其为24个碱基长的寡聚合物加上一个硫代磷酸酯基团(在5’端标记为n))。
所得到的免疫刺激复合物呈颗粒形式，其大小通常在1-50微米的范围内，且是许多因素(包括交互作用成份的相对电荷化学计量和分子量)的函数。微粒免疫刺激复合物具有提供佐剂化和体内特异性免疫反应的向上调节的优点。此外，稳定化的免疫刺激复合物适用于通过各种方法(包括油包水乳液、矿物盐悬浮液和聚合凝胶)制备药物组合物。
抗体
本公开还提供利用肽免疫原构建体引发的抗体。
公开的肽免疫原构建体包含DPR片段、异源性Th表位和任选的异源性间隔区，公开的肽免疫原构建体在施用宿主时可引发免疫反应并产生抗体。肽免疫原构建体的设计可以破坏对自身蛋白的耐受性，并引发位点特异性抗体的产生。
公开的抗体利用高特异性结合至个别的DPR，没有太多，如果有的话，则是针对用于免疫原性增强的异源性Th表位，此与利用用于此种肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。
公开的抗体可用于试验以检测样品(例如脑脊髓液、CSF或组织)中DPR蛋白的存在。
方法
本公开还关于制备和使用肽免疫原构建体、组合物和药物组合物的方法。
a.制备肽免疫原构建体的方法
本公开的肽免疫原构建体可利用普通技术人员所熟知的化学合成方法加以制备(参见例如Fields et al.，Chapter3in Synthetic Peptides：A User’s Guide，ed.Grant，W.H.Freeman&Co.，New York，NY，1992，p.77)。肽免疫原构建体可利用自动化美利弗德(Merrifield)固相合成法来合成，利用侧链受保护的氨基酸，以t-Boc或F-moc化学保护α-NH2，在例如应用生物系统肽合成仪430A或431型(Applied Biosystems PeptideSynthesizer Mode1 430A或431)上进行。包含Th表位的组合数据库肽的肽免疫原构建体的制备可通过提供用于在给定可变位置进行偶联的替代性氨基酸的混合物而达成。
在期望的肽免疫原构建体组装完成后，依照标准程序处理树脂，将肽从树脂上切下，并将氨基酸侧链上的官能基切除。可利用HPLC纯化游离的肽，并利用例如氨基酸分析或定序以描述生化特性。肽的纯化和表征方法是本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知的。
可以控制和确定通过此化学过程所产生的肽的质量，且结果是肽免疫原构建体的再现性、免疫原性和产量可以获得保证。通过固相肽合成的肽免疫原构建体的制造的详细描述显示于实施例1中。
已经发现允许保留欲求免疫活性的结构变异范围比起允许保留小分子药物特定药物活性或与于生物来源药品共同产生的大分子中存在欲求活性及非欲求毒性的结构变异范围更具包容性。因此，与欲求肽具有相似的色层分析和免疫学特性的肽类似物，不论是刻意设计或因合成过程错误而无法避免地作为删除序列副产物的混合物产生的，其通常如经纯化的欲求的肽制剂具有相同的效果。只要建立严格的QC程序，以监控制造过程与产品评估过程，确保使用这些肽的终产物的再现性与有效性，则经设计的类似物与非预期的类似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、载体及/或宿主细胞的重组DNA技术来制备肽免疫原构建体。因此，编码肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的核酸分子也包括在本公开中作为本发明的一部分。类似地，包含核酸分子的载体(包括表达载体)以及含有载体的宿主细胞也包括在本公开中作为本发明的一部分。
各种例示性实施例也包括制造肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的方法。例如，方法可包括在表达肽及/或类似物的条件下培养宿主细胞的步骤，宿主细胞包含含有编码肽免疫原构建体及/或其免疫功能类似物的核酸分子的表达载体。较长的合成肽免疫原可利用公知的重组DNA技术来合成。此种技术可于具有详细实验计划的众所周知的标准手册中加以提供。为了构建编码本发明肽的基因，可将氨基酸序列反向转录以获得编码氨基酸序列的核酸序列，较佳地利用对于其中具有待表达基因的生物体来说最适合的密码子。接下来，通常通过合成编码肽和任何调节因子(如有必要的话)的寡核苷酸以制造合成基因。将合成基因插入适合的克隆载体内并转染到宿主细胞中。然后在适合所选表达系统和宿主的合适条件下表达肽。利用标准方法纯化肽并描述其特性。
b.制备免疫刺激复合物的方法
各种例示性实施例还包括制造包含肽免疫原构建体和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激复合物的方法。稳定化的免疫刺激复合物(ISC)衍生自肽免疫原构建体的阳离子部份和聚阴离子CpG ODN分子。自行组合系统是由电荷的静电中和所驱动。肽免疫原构建体的阳离子部分对阴离子寡聚合物的摩尔电价比例的化学计量决定缔合的程度。肽免疫原构建体和CpG ODN的非共价静电结合是完全可再现的过程。此肽/CpG ODN免疫刺激复合物聚集体有助于呈现至免疫系统中“专业的”抗原呈现细胞(APC)，因此可进一步增强复合物的免疫原性。在制造过程中，可轻易地描绘此些复合物的特征以控制质量。肽/CpG ISC在体内具有良好的耐受性。设计这种包含CpG ODN和肽免疫原构建体的微粒系统，以利用与CpG ODN使用相关的广义B细胞促有丝分裂(mitogenicity)，但促进平衡的Th-1/Th-2型反应。
在公开的药物组合物中的CpG ODN在由相反电荷静电中和所介导的过程中100％结合至免疫原，导致微米大小的微粒的形成。微粒形式允许来自CpG佐剂常规使用的CpG剂量的显著减少，不利的先天性免疫反应的可能性更低，且促进包括抗原呈现细胞(APC)在内的替代性免疫原处理途径。因此，此种剂型在概念上是新颖的，且通过替代的机制藉由促进免疫反应的刺激而提供潜在的优点。
c.制备药物组合物的方法
各种例示性实施例还包括含有肽免疫原构建体的药物组合物。在某些实施例中，药物组合物是利用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。
为了使药物组合物可被广大群体所使用，且DPR蛋白的清除也是给药目标的一部分，安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在临床试验的许多剂型中都将油包水乳液用于人体，但基于其安全性，明矾仍然是制剂中使用的主要佐剂。因此，明矾或其矿物盐磷酸铝(ADJUPHOS)经常作为制剂中的佐剂供临床应用。
d.使用药物组合物的方法
本公开还包括使用含有肽免疫原构建体的药物组合物的方法。
在某些实施例中，含有肽免疫原构建体的药物组合物可用于从个体清除DPR蛋白。此方法包含施用包含肽免疫原构建体的药学上有效剂量的药物组合物给有其需要的宿主。
具体实施例
本发明的具体实施例包括，但不限于以下：
(1)一种二肽重复(DPR)肽免疫原构建体，包含：
B细胞表位，其包含约10至约25个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
异源性T辅助细胞表位，其包含选自由SEQ ID NOs：16至67组成的群组的氨基酸序列；以及
任选的异源性间隔区，其选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α，ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：222)组成的群组；以及
其中B细胞表位是直接地或通过任选的异源性间隔区共价连接至T辅助细胞表位。
(2)(1)的DPR肽免疫原构建体，其中
重复的poly-GA具有SEQ ID NOs：1、2或3的氨基酸序列；以及
重复的poly-GP具有SEQ ID NOs：4、5或6的氨基酸序列；以及
重复的poly-GR具有SEQ ID NOs：7、8或9的氨基酸序列；以及
重复的poly-PR具有SEQ ID NOs：10、11或12的氨基酸序列；以及
重复的poly-PA具有SEQ ID NOs：13、14或15的氨基酸序列。
(3)(1)的DPR肽免疫原构建体，其中异源性T辅助细胞表位的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：31、32及其组合组成的群组。
(4)(1)的DPR肽免疫原构建体，其中任选的异源性间隔区为(α，ε-N)Lys、i-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)或Lys-Lys-Lys-i-N-Lys(SEQ ID NO：222)。
(5)(1)的DPR肽免疫原构建体，其包含以下分子式：
{(Th)m-(A)n-(DPR)-(A)n-(Th)m}y-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位；
A为异源性间隔区；
(DPR)为B细胞表位，其具有重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
每个m为0至约4；
每个n为0至约10；以及
y为1至约5。
(6)(5)的DPR肽免疫原构建体，其中
重复的poly-GA具有SEQ ID NOs：1、2或3的氨基酸序列；以及
重复的poly-GP具有SEQ ID NOs：4、5或6的氨基酸序列；以及
重复的poly-GR具有SEQ ID NOs：7、8或9的氨基酸序列；以及
重复的poly-PR具有SEQ ID NOs：10、11或12的氨基酸序列；以及
重复的poly-PA具有SEQ ID NOs：13、14或15的氨基酸序列。
(7)(5)的DPR肽免疫原构建体，其中异源性T辅助细胞表位的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO：31、32及其组合组成的群组。
(8)(5)的DPR肽免疫原构建体，其中任选的异源性间隔区为(α，i-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：221)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO：222)。
(9)(1)的DPR肽免疫原构建体，其包含选自由SEQ ID NOs：68至219及其任意组合组成的群组的氨基酸序列。
(10)(1)的DPR肽免疫原构建体，其包含选自由SEQ ID NOs：68、69、70、80、88、98、99、110、130、148、161、173、218、219及其任意组合组成的群组的氨基酸序列。
(11)一种组合物，其包含(1)的DPR肽免疫原构建体。
(12)一种组合物，其包含一种以上(1)的DPR肽免疫原构建体。
(13)(11)的组合物，其中DPR肽免疫原构建体具有选自由SEQ ID NOs：68至219及其任意组合组成的群组的氨基酸序列。
(14)一种药物组合物，其包含(1)的DPR肽免疫原构建体和药学上可接受的递送载体及/或佐剂。
(15)(14)的药物组合物，其中
a.DPR肽免疫原构建体是选自由SEQ ID NOs：68至219及其任意组合组成的群组；且
b.佐剂为铝的矿物盐，其选自由Al(OH)3或ALPO4组成的群组。
(16)(14)的药物组合物，其中
a.DPR肽免疫原构建体是选自由SEQ ID NOs：68至219及其任意组合组成的群组；且
b.DPR肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化免疫刺激复合物。
(17)一种分离的抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至(1)的DPR肽免疫原构建体的B细胞表位。
(18)依据(17)的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至DPR肽免疫原构建体。
(19)一种分离的抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至(9)的DPR肽免疫原构建体的B细胞表位。
(20)一种组合物，其包含依据(17)的分离的抗体或其表位结合片段。
(21)一种用于产生识别宿主中DPR蛋白的抗体的方法，其包含对宿主施用组合物，组合物包含(1)的DPR肽免疫原构建体和递送载体及/或佐剂。
(22)一种用以降低动物中的DPR蛋白量的方法，其包含对动物施用药学上有效剂量的(1)的DPR肽免疫原。
(23)(22)的方法，其中动物为人类。
(24)一种用以鉴定生物样品中DPR蛋白的方法，其包含：
a.在允许抗体或其表位结合片段结合至DPR蛋白的条件下，将生物样品暴露于依据(17)的抗体或其表位结合片段；以及
b.检测生物样品中与DPR蛋白结合的抗体或其表位结合片段的量。
实施例
实施例1.DPR肽免疫原构建体的合成及其制剂的制备
a.DPR肽免疫原构建体的合成
描述了合成DPR肽免疫原构建体的方法。以小规模量合成的肽用于血清学分析、实验室试验和田间试验。大规模(千克)量生产的肽则用于药物组合物的工业/商业生产。制备含有10、15及/或25个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA的DPR肽，其序列如表1所示。
通过将片段合成连接至衍生自病原体蛋白麻疹病毒融合蛋白的一个或多个精心设计的T辅助(Th)细胞表位，将选定的DPR片段制成DPR肽免疫原构建体。具体而言，将DPR片段连接至MvF5 Th(
SEQ ID NO：32)或MvF4 Th(
SEQ ID NO：31)，其序列如表2所示。
制备代表性DPR肽免疫原构建体，其选自超过100种肽构建体，并识别于表9中(SEQID NOs：68、69、70、80、88、98、99、110、130、148、161、173、218和219)。用于供DPR抗体检测及/或测量的免疫原性研究或相关血清学测试的所有肽是在应用生物系统肽合成仪430A、431及/或433型上利用F-moc化学小规模合成。每一个肽是通过在固相载体上的独立合成所制备，在三官能基氨基酸的氨基端与侧链保护基团具有F-moc保护。将完整的肽从固相载体上切下，并用90％三氟乙酸(TFA)移除侧链保护基团。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪评估合成的肽产物以确定正确的氨基酸组成。也利用反相HPLC(RP-HPLC)评估各个合成肽以确认产物的合成样态与浓度。尽管严格控制合成过程(包括逐步地监测偶合效率)，由于在延长循环中的意外事件，包括氨基酸的插入、缺失、取代及提前终止，仍会产生肽类似物。因此，合成产物一般包括多种肽类似物与目标肽。尽管包括这些非预期的肽类似物，但最后的合成肽产物仍可用作免疫应用，包括免疫诊断(作为抗体捕捉抗原)与药物组合物(作为肽免疫原)。一般来说，只要开发一严格的QC程序来监测制造过程及产品质量评估程序，以确保使用这些肽的最终产物的再现性与有效性，此肽类似物，包括刻意设计或合成程序中产生的副产物混合物，通常可如期望肽的纯化产物同样有效。
b.含有DPR肽免疫原构建体的组合物的制备
制备采用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。
简而言之，以(i)利用经核准供人类使用的油剂Seppic MontanideTM ISA 51制备油包水乳液，或(ii)与矿物盐ADJUPHOS(磷酸铝)或ALHYDROGEL(明矾)混合，制备DPR肽免疫原构建体，如指定配制不同量的肽构建体。通常利用将DPR肽免疫原构建体以约20至800μg/mL浓度溶解于水中，并与MontanideTM ISA 51配制成油包水乳液(1∶1体积)，或者与矿物盐或ALHYDROGEL(明矾)(1∶1体积)配制，以制成组合物。将组合物置于室温下约30分钟，并在免疫接种前利用漩涡震荡混合约10至15秒。利用2至3个剂量的特定组合物免疫接种一些动物，其在时间0(初次免疫)和初次免疫后(wpi)3周(加强免疫)施用，任选5或6wpi进行第二次加强免疫，通过肌内途径投药。然后利用选定的B细胞表位肽测试这些接受免疫接种的动物以评估存在于剂型中的各种肽免疫原构建体的免疫原性，以及其与相关目标肽或蛋白质的交叉反应性。
实施例2.从利用DPR肽免疫原构建体进行免疫接种所获得的抗体效价
在以下内容详细描述各种DPR肽免疫原构建体的免疫接种和评估。
a.免疫接种和血清收集
在每个实验组中所指定的剂型通常含有所有类型专门设计的DPR肽免疫原构建体，其具有DPRB细胞表位肽片段，DPRB细胞表位肽片段通过不同类型间隔区(例如εLys(εK)或Lysine-lysine-lysine(KKK)以增强肽构建体的溶解度)连接至混杂T辅助细胞表位，混杂T辅助细胞表位包含衍生自麻疹病毒融合蛋白和B型肝炎表面抗原的两组人工T辅助细胞表位。DPRB细胞表位肽连接至专门设计的肽构建体的氨基端或羧基端。首先，针对其与相对应DPRB细胞表位肽或肽免疫原的相对免疫原性，在天竺鼠中对DPR肽免疫原构建体进行评估。
将每种肽免疫原配制于MONTANIDETM ISA51和CpG中以在初次免疫时利用400μg/ml剂量对天竺鼠进行免疫，并在初次免疫后(WPI)3、6、9周时以100μg/ml剂量进行加强免疫，每个组别为3只天竺鼠。
b.抗体效价的评估
进行ELISA试验以评估专门设计的DPR肽免疫原构建体的免疫原性。利用DPRB细胞表位肽或肽免疫原构建体涂覆微量盘的孔洞，其作为标靶肽。利用10倍连续稀释将天竺鼠免疫血清从1∶100稀释至1∶100,000。利用A450临界值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。所有肽免疫原均引发针对涂覆于微量盘孔洞中的B细胞表位肽的强免疫原性效价。
实施例3.血清学试验和试剂
以下详细描述用以评估合成肽构建体及其制剂的功能性免疫原性的血清学试验和试剂。
a.供抗体特异性分析的基于肽的ELISA试验
如以下所述开发用以评估免疫血清样品的ELISA试验。
利用配制于pH 9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的目标肽DPR片段或肽构建体(SEQ ID NOs：10、68-70、88、98、99、130、148)，将其以100μL体积于37℃下作用1小时，以分别地涂覆96孔盘的孔洞。
b.利用ELISA试验评估针对DPRs的抗体反应性
将肽涂覆的孔洞(SEQ ID NOs：10、68-70、88、98、99、130和148)与250μL配制于PBS中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时，以阻断非特异性蛋白质结合位点，接着利用含有0.05体积百分比
20的PBS洗涤孔洞三次并干燥。利用含有20体积百分比正常山羊血清、1重量百分比明胶和0.05体积百分比
20的PBS以1∶20比例(除非另有说明)稀释待测血清。将100μL稀释样品(例如血清、血浆)加入每个孔洞并于37℃下反应60分钟。然后利用配制于PBS中浓度为0.05体积百分比的
20洗涤孔洞6次，以移除未结合的抗体。使用辣根过氧化物酶(HRP)共轭物种(例如小鼠、天竺鼠或人类)特异性山羊抗IgG作为标记的示踪剂，以在阳性孔洞中与形成的抗体/肽抗原复合物结合。将100微升过氧化物酶标记的山羊抗IgG(其以预滴定的最佳稀释倍数配制于内含1体积百分比正常山羊血清与0.05体积百分比
20的PBS中)加到每个孔洞中，并在37℃下再反应30分钟。利用内含0.05体积百分比
20的PBS洗涤孔洞6次以移除未结合的抗体，并与100μL包含0.04重量百分比3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积百分比过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中的基质混合物再反应15分钟。藉由形成有色产物利用基质混合物以检测过氧化物酶标记。藉由加入100μL的1.0M硫酸终止反应并测定450nm处的吸光值(A450)。为了测定接受各种DPR衍生的肽免疫原的免疫接种动物的抗体效价，将从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清进行测试，且利用A450临界值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。
c.免疫原性评估
依照实验免疫接种程序收集来自动物的免疫前和免疫血清样品，并在56℃下加热30分钟以使血清补体因子失活。在施用含有DPR肽免疫原构建体的药物组合物后，根据程序获得血液样品，并评估其针对特定靶点的免疫原性。测试了连续稀释的血清，并将稀释倍数的倒数取对数(Log10)以表示阳性效价。藉由其能力(引发针对目标抗原内欲求表位特异性的高效价B细胞抗体反应，且同时将针对用以提供欲求B细胞反应增强的“T辅助细胞表位”的抗体反应性维持在低至可忽略)，而评估特定药物组合物的免疫原性。
d.小鼠免疫血清中DPR水平的免疫分析
使用抗DPR抗体作为捕获抗体，而生物素标记的抗DPR抗体作为检测抗体，通过三明治ELISA(Cloud-clon，SEB222Mu)测定接受DPR衍生肽免疫原接种的小鼠的血清DPR水平。简而言之，将抗体以100ng/孔洞的量配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH9.6)中以固定在96孔盘上，并在4℃下隔夜反应。利用200μL/孔洞的测定稀释液(含0.5％牛血清白蛋白、0.05％
-20和0.02％ProClin 300的PBS)在室温下反应1小时以封阻涂覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液(内含0.05％
的PBS)洗涤微量盘3次。使用纯化的重组DPR在具有5％小鼠血清的测定稀释液中产生标准曲线(通过2倍连续稀释，范围为156至1,250ng/mL)。将50μL的稀释血清(1∶20)和标准品加入涂覆的孔洞中。在室温下反应1小时。将所有孔洞吸干，并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。将捕获的DPR与100μL的侦测抗体溶液(在测定稀释液中内含50ng/ml生物素标记的HP6029)在室温下反应1小时。然后，使用链抗生物素蛋白(streptavidin)poly-HRP(1∶10,000稀释，ThermoPierce)侦测结合的生物素-HP60291小时(100μL/孔洞)。将所有孔洞吸干，并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次，且通过加入100μL/孔洞的1M硫酸终止反应。藉由使用SoftMaxPro软件(Molecular Devices)产生的4-参数罗吉特曲线拟合而产出标准曲线，并用其计算在所有试验样品中的DPR浓度。藉由使用Prism软件利用学生t检验(Student t tests)比较数据。
e.抗DPR抗体的纯化
利用亲和性管柱(Thermo Scientific，Rockford)从初次免疫后(WPI)3至15周的天竺鼠或小鼠收集的血清中纯化抗DPR抗体，所述天竺鼠或小鼠是利用含有不同序列的肽的DPR肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：68、69、70、80、88、98、99、110、130、148、161和173)进行免疫接种。简而言之，在缓冲液(0.1M磷酸盐和0.15M氯化钠，pH 7.2)平衡后，将400μL血清加入Nab Protein G Spin column中，然后翻滚式混合(end-over-end mixing)10分钟并以5,800x g离心1分钟。利用结合缓冲液(400μL)洗涤管柱三次。随后，将洗脱缓冲液(400μL，0.1M甘氨酸，pH2.0)加入spin column中在以5,800x g离心1分钟后洗脱抗体。将洗脱的抗体与中和缓冲液(400μL，0.1M Tris，pH 8.0)混合，并通过使用Nano-Drop于OD280测定以测量这些纯化抗体的浓度，以BSA(牛血清白蛋白)作为标准品。
f.结果
利用ELISA评估来自接受免疫接种的天竺鼠血清的针对DPR肽或肽免疫原的免疫原性效价。
表10-11和图3A-3I显示在利用12种不同DPR肽免疫原构建体免疫的天竺鼠中在15周期间内的抗血清特性。利用10倍连续稀释方式稀释来自0、3、6、9、12和15wpi的天竺鼠抗血清。利用DPR肽或肽免疫原涂覆ELISA微量盘。利用A450临界值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价，以Log10表示。
表10显示含有poly-GA、poly-GP和poly-GR肽的DPR肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：68-70、80、88、98、99、110、130和148)的ELISA数据，而表11显示含有poly-PR肽的DPR肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：161和173)的ELISA数据。
然后将ELISA数据绘制为如图3A-3I所示的图形，其中将用于免疫动物的相同肽免疫原结合到ELISA微量盘上用于分析。具体地，利用poly-GA结构(SEQ ID NOs：68、69、70和88)免疫后获得的抗体效价分别地显示在图3A-3D中。利用poly-GP结构(SEQ ID NOs：98和99)免疫后获得的抗体效价分别地显示在图3E-3F中。利用poly-GR结构(SEQ ID NOs：130和148)免疫后获得的抗体效价分别地显示在图3G-3H中。利用poly-PR结构(SEQ ID NO：161)免疫后获得的抗体效价显示在图3I中。
所有DPR免疫原构建体均表现出针对相对应DPR肽或肽免疫原的高免疫原性。ELISA结果显示，在免疫之前于第0周，各组别均未观察到可检测的抗体效价。在三次免疫后，各组别在第6周效价达到峰值，其Log10效价大多高于12，并且在到第15周试验结束时的整个期间内保持在高原期(表10-11)。数据显示DPR肽免疫原构建体中二肽重复的长度似乎对抗体效价没有太大影响。例如poly-GA10、15和25个重复的结构(SEQ ID NO：68-70、80和88)展现非常相似的免疫原性，如表10和图3A-3D所示。
有趣的是，肽免疫原构建体，其包含poly-GA(SEQ ID NOs：68-70、80和88)、poly-GP(SEQ ID NOs：98、99和110)和poly-GR(SEQ ID NOs：130和148)不仅显示出对其相对应肽免疫原的高免疫原性，而且还能够引起与任一个其他肽免疫原构建体的一定程度的交叉反应性(参见表10)。例如，表10显示所有含有poly-GA的DPR肽免疫原构建体(SEQ ID NO：68-70、80、88)均产生针对poly-GP结构(SEQ ID NO：98、99和110)和poly-GR结构(SEQ ID NO：130和148)的抗体效价。同样地，含有poly-GR的DPR肽免疫原构建体显示相似的与poly-GA和poly-GP的交叉反应性。然而，含有poly-GP的DPR肽免疫原构建体(SEQ ID NOs：98、99和110)具有较低的与poly-GR结构的交叉反应性。
如图4A-4D图所示，还将DPR肽免疫原构建体的免疫原性与相对应的目标B细胞表位肽进行比较。
针对SEQ ID NO：70的(GA)25-KKK-εK-
结构，将利用与Th表位连接的poly-GA结构(SEQ ID NOs：68、69、70、80和88)和未与Th表位连接的poly-GA结构((GA)5或(GA)10和(GA)15(SEQ ID NOs：1和2))免疫接种后获得的抗体效价利用ELISA进行分析。图4A显示在利用与Th表位连接的poly-GA结构(SEQ ID NOs：68、69、70、80和88)免疫接种后获得的抗体效价为高免疫原性的且制造高抗体效价；然而在利用未与Th表位连接的poly-GA肽((GA)5或(GA)10和(GA)15(SEQ ID NOs：1和2))免疫接种后获得的抗体效价为非免疫原性的。
针对SEQ ID NO：99的(GP)15-KKK-gK-
结构，将利用与Th表位连接的poly-GP结构(SEQ ID NOs：98、99和110)和未与Th表位连接的poly-GP结构((GP)10和(GP)15(SEQ ID NOs：4和5))免疫接种后获得的抗体效价利用ELISA进行分析。图4B显示在利用与Th表位连接的poly-GP结构(SEQ ID NOs：98、99和110)免疫接种后获得的抗体效价为高免疫原性的且制造高抗体效价；然而在利用未与Th表位连接的poly-GP肽((GP)10和(GP)15(SEQ ID NOs：4和5))免疫接种后获得的抗体效价为非免疫原性的。
针对SEQ ID NO：130的(GR)25-KKK-εK-
结构，将利用与Th表位连接的poly-GR结构(SEQ ID NOs：130和148)和未与Th表位连接的poly-GR结构((GR)10、(GR)15和(GR)25(SEQ ID NOs：7、8和9))免疫接种后获得的抗体效价利用ELISA进行分析。图4C显示在利用与Th表位连接的poly-GR结构(SEQ ID NOs：130和148)免疫接种后获得的抗体效价为高免疫原性的且制造高抗体效价；然而在利用未与Th表位连接的poly-GR肽((GR)10、(GR)15和(GR)25(SEQ ID NOs：7、8和9))免疫接种后获得的抗体效价为非免疫原性的。
针对SEQ ID NO：10的(PR)10结构，将利用与Th表位连接的poly-PR结构(SEQ IDNOs：161和173)和未与Th表位连接的poly-PR结构((PR)10(SEQ ID NO：10))免疫接种后获得的抗体效价利用ELISA进行分析。图4D显示在利用与Th表位连接的poly-PR结构(SEQ IDNOs：161和173)免疫接种后获得的抗体效价为高免疫原性的且制造高抗体效价；然而在利用未与Th表位连接的poly-PR肽((PR)10(SEQ ID NO：10))免疫接种后获得的抗体效价具有仅略高于背景值水平的免疫原性。
因此，具有极大兴趣和工业应用价值的是，在大多数情况下本身无免疫原性的这些结构简单但构型多样化的DPR，不论重复序列的长度为何，藉由与目标“B”表位的特殊连结，通过利用各种
Th肽的免疫原设计，可从而具有免疫原性以引发针对相对应目标B细胞表位肽的高效价抗体。由于在脑中存在此种DPRs，故当将此种DPR免疫原配制成疫苗时可以用于干预以治疗患有某些神经退化性疾病的患者，以对这些疾病进行免疫治疗。
可以在小鼠模型中评估此种疫苗制剂的功效，例如在Liu，Y.等人发表“C9orf72BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD”，Neuron，90，521-534(2016)中所描述的模型。例如，可利用一种或多种本文所述的DPR肽免疫原构建体免疫此种小鼠模型，以证明经免疫的动物产生抗DPR抗体(例如抗GA、抗GP等，取决于免疫原种类)。可进一步分析接受免疫接种的动物，以确定是否可以在血清和脑部溶胞产物中检测到抗体。然后可分析这些接受免疫接种的动物，以确定抗DPR特异性抗体是否与其各自的poly-DPR蛋白聚集体共位。然后这些含有这些DPR免疫原构建体的疫苗制剂可在年龄匹配、重复序列长度匹配的受试者群组中进行测试。
表1、C9orf72的二肽重复(DPR)蛋白的氨基酸序列
表2、
在肽免疫原构建体设计中使用的包括理想人工Th表位的病原体蛋白衍生的Th表位的氨基酸序列
Claims (24)
1.一种二肽重复(DPR)肽免疫原构建体(immunogen construct)，包含：
B细胞表位(epiptope)，其包含约10至约25个重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
异源性T辅助细胞表位，其包含选自由SEQ ID NOs:16至67组成的组的氨基酸序列；以及
任选的异源性间隔区(spacer)，其选自由氨基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:221)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO:222)组成的组；以及
其中所述B细胞表位是直接地或通过该任选的异源性间隔区共价连接至该T辅助细胞表位。
2.如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体，其中
所述重复的poly-GA具有SEQ ID NOs:1、2或3的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-GP具有SEQ ID NOs:4、5或6的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-GR具有SEQ ID NOs:7、8或9的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-PR具有SEQ ID NOs:10、11或12的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-PA具有SEQ ID NOs:13、14或15的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体，其中所述异源性T辅助细胞表位的氨基酸序列是选自由SEQ ID NO:31、32及其组合组成的组。
4.如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体，其中所述任选的异源性间隔区为(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:221)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO:222)。
5.如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体，其包含以下分子式：
{(Th)m–(A)n–(DPR)–(A)n–(Th)m}y–X
其中
Th为所述异源性T辅助细胞表位；
A为所述异源性间隔区；
(DPR)为B细胞表位，其具有重复的poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR或poly-PA；
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
每个m为0至约4；
每个n为0至约10；以及
y为1至约5。
6.如权利要求5所述的DPR肽免疫原构建体，其中
所述重复的poly-GA具有SEQ ID NOs:1、2或3的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-GP具有SEQ ID NOs:4、5或6的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-GR具有SEQ ID NOs:7、8或9的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-PR具有SEQ ID NOs:10、11或12的氨基酸序列；以及
所述重复的poly-PA具有SEQ ID NOs:13、14或15的氨基酸序列。
7.如权利要求5所述的DPR肽免疫原构建体，其中所述异源性T辅助细胞表位的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:31、32及其组合组成的组。
8.如权利要求5所述的DPR肽免疫原构建体，其中所述任选的异源性间隔区为(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:221)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys(SEQ ID NO:222)。
9.如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体，其包含选自由SEQ ID NOs:68至219及其任意组合组成的组的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体，其包含选自由SEQ ID NOs:68、69、70、80、88、98、99、110、130、148、161、173、218、219及其任意组合组成的组的氨基酸序列。
11.一种组合物，其包含如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体。
12.一种组合物，其包含一种以上如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体。
13.如权利要求11所述的组合物，其中所述DPR肽免疫原构建体具有选自由SEQ IDNOs:68至219及其任意组合组成的组的氨基酸序列。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体和药学上可接受的递送载体及/或佐剂。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中
a.所述DPR肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs:68至219及其任意组合组成的组；且
b.所述佐剂为铝的矿物盐，其选自由Al(OH)3或AlPO4组成的组。
16.如权利要求14所述的药物组合物，其中
a.所述DPR肽免疫原构建体选自由SEQ ID NOs:68至219及其任意组合组成的组；且
b.所述DPR肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化免疫刺激复合物。
17.一种分离的抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体的B细胞表位。
18.如权利要求17所述的分离的抗体或其表位结合片段，其结合至所述DPR肽免疫原构建体。
19.一种分离的抗体或其表位结合片段，其可特异性地结合至如权利要求9所述的DPR肽免疫原构建体的B细胞表位。
20.一种组合物，其包含如权利要求17所述的分离的抗体或其表位结合片段。
21.一种用于产生识别宿主中DPR蛋白的抗体的方法，其包含对所述宿主施用组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的DPR肽免疫原构建体和递送载体及/或佐剂。
22.一种用于降低动物中的DPR蛋白量的方法，其包含对所述动物施用药学上有效剂量的如权利要求1所述的DPR肽免疫原。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述动物为人类。
24.一种用于鉴定生物样品中DPR蛋白的方法，其包含：
a.在允许抗体或其表位结合片段结合至DPR蛋白的条件下，将所述生物样品暴露于如权利要求17所述的抗体或其表位结合片段；以及
b.检测所述生物样品中与所述DPR蛋白结合的所述抗体或其表位结合片段的量。
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