IT9019914A1 - Composti immunogenici, il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria - Google Patents
Composti immunogenici, il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalariaInfo
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda composti immunogenici (I), il procedimento per la loro sintesi e il loro impiego in diagnostica per la determinazione di anticorpi anti Plasmodium in un campione biologico e per la preparazione di una composizione immunogenica adatta come vaccino antimalaria geneticamente non ristretto.
L'agente eziologico della malaria è un protozoo del genere Plasmodium che viene trasmesso all'ospite vertebrato (per esempio l'uomo) attraverso la puntura della zanzara anofele. Delle quattro specie infettive per l'uomo, il Plasmodium falciparum (P.falciparum) e il Plasmodium vivax (P.vivax) rappresentano quelle che causano la maggior parte della morbilità e mortalità associate alla malattia.
Attualmente la malaria costituisce uno dei maggiori problemi sanitari a livello mondiale. Infatti, ogni anno questa malattia colpisce circa 250 milioni di individui provocando nella prima infanzia una mortalità che può raggiungere il 50% dei casi.
Da ciò consegue l'esigenza di sviluppare un vaccino antimalaria capace di conferire nell'uomo una immunità protettiva contro l'agente patogeno che causa detta infezione.
I parassiti malarici si sviluppano secondo un ciclo a più stadi presentando all’ospite un grandissimo numero di componenti antigenici ed ogni forma di sviluppo del parassita contiene antigeni tra loro differenti e stadio specifici.
Nel tentativo di individuare antigeni plasmodiali protettivi, l'interesse dei ricercatori si è indirizzato verso quelli esposti al sistema immunitario e presenti sia sulla superficie del parassita che sulla membrana del globulo rosso infettato.
Un particolare interesse ha rivestito lo studio degli sporozoiti di Plasmodium in quanto la preparazione di un vaccino contro questo stadio, se completamente efficace nell'uomo, è in grado di prevenire lo sviluppo del plasmodio nell'ospite e quindi di indurre una immunità protettiva sterile.
E'noto che la somministrazione in roditori, scimmie e uomo di sporozoiti irradiati con raggi X conferisce una immunità protettiva che è stadio specifica ma non ceppo specifica {Cochrane, A.H. et al., (1980) Academic Press, New York pp. 163 Infatti, incubando gli sporozoiti di Plasmodium con antisieri (anticorpi) ottenuti da animaliimmunizzati con sporozoiti irradiati con i raggi X della stessa specie si ottiene la formazione di un precipitato sulla superficie che indica che detti anticorpi riconoscono gli antigeni specifici.
L'impiego di anticorpi monoclonali ha reso possibile l'identificazione di detti antigeni che appartengono ad una famiglia di polipeptidi (proteina Circumsporozoitica o CSP) che ricoprono l'intera superficie dello sporozoita e inducono una risposta anticorpale specifica che conferisce una protezione contro infezioni malariche.
I recenti sviluppi nel campo della biologia molecolare hanno consentito di identificare i geni che codificano per proteine antigeniche del Plasmodium.
In particolare, sono stati clonati e sequenziati i geni che codificano la CSP di P.falciparum, di P.vivax e di P.malariae. L'analisi delle caratteristiche di queste proteine ha evidenziato la presenza di un dominio centrale o epitopo immunodominante B costituito da unità ripetentisi un certo numero di volte.
Per P .falciparum detto epitopo immunodominante è costituito dal tetrapeptide Asn-Ala-Asn-Pro (NANP) ripetuto 37 volte e da 4 quadruplette con la sequenza amminoacidica Asn-Val-Asp-Pro (NVDP), mentre per P.vivax e P.malariae sono, rispettivamente,
Sono stati messi a punto vaccini sintetici basati essenzialmente sull'impiego di peptidi di sintesi comprendenti o costituiti dal tetrapeptide NANP e/o NVDP (si veda a tale proposito le domande di brevetto italiane 21.718 A/85, 21.666 A/88 e 19.110 A/89) o peptidi di fusione (otte nuti via DNA ricombinante come descritto da Good et al·., (1986), J.Exp.Med., 164: 655).
Tuttavia, studi effettuati in diversi laboratori (Del Giudice, G. et al., (1986), J.Immunol.,137: 2952; Good et al., (1986), J.Exp.Med., 164: 655) hanno mostrato che la risposta anticorpale verso detti antigeni sintetici è geneticamente ristretta in animali da esperimento, cioè solo, topi nel cui corredo genetico è presente il gene I-A° (topi responders) sono capaci di produrre anticorpi specifici.
Inoltre è stata evidenziata una scarsa immunogenicità di detti antigeni sintetici (limitata produzione di anticorpi specifici).
Pertanto tali peptidi non sembrano possedere le caratterisiche attese per un buon antigene quali immunogenicità, cioè capacità di sviluppare una risposta anticorpale ad un titolo elevato e non ristretta geneticamente, e antigenicità cioè capacità di sviluppare anticorpi in grado di neutralizzare l'agente patogeno.
E 'stata ora trovato che è possibile superare i problemi della tecnica nota mediante una nuova classe di composti immunogenici, ciò che costituisce uno scopo della presente invenzione, adatti per la preparazione di vaccini antimalaria effi¬
caci definibile mediante la seguente formula (I):
dove :
D è L-lisina o poli (L-lisina) ramificata con un numero n di residui amminoacidici lisinici (Lys) in legame a ed e ammidico;
n è un numero intero dispari variabile da 1 a 15; A e B, uguali o diversi tra loro, sono un polipeptide costituito da uno o più epitopi B plasmodiali legati covalentemente ad uno o più peptidi con una sequenza amminoacidica corrispondente a quella di un epitopo T quale
(TT2), un composto ad attività adiuvante oppure
rappresentano un legame diretto oppure o R-B-CO sono un gruppo protettore dell'ex o e-amminogruppo del residuo amminoacidico L-lisina con la condizione che A e B non siano entrambi contemporaneamente un adiuvante oppure un legame diretto o un gruppo protettore;
R è idrogeno o un radicale acilico;
ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili.
Gli amminoacidi sono indicati con il codice a lettera singola:
Asp (D), Lys (K), His (H), Cys (C), Gin (Q), Thr
Ai fini della presente invenzione, il termine "radicale acilico" identifica i radicali acilici derivanti da acidi alcanoici a catena lineare o ramificata contenenti da 1 a 6 atomi di carbonio quali, ad esempio, formile, acetile, propionile, succinoile ed i radicali acilici aromatici derivanti dall’acido benzoico e dell'acido benzoico sostituito quali, ad esempio, benzoile, 4-nitrobenzoile, 2,3,4-trimetossibenzoile, etc..
Come qui utilizzato il termine "sali farmaceuticamente accettabili" sta ad indicare quei sali di addizione acida o basica in cui l'anione od il catione rispettivamente siano non tossici ed innocui quando i composti vengono somministrati, sotto forma appunto di sali di addizione, ai dosaggi terapeuticamente efficaci.
Acidi in grado di formare sali di addizione acida farmaceuticamente accettabili con i composti di formula (I) possono essere scelti tra gli acidi inorganici quali, ad esempio, l'acido cloridrico, l'acido bromidrico, l'acido fosforico o solforico e gli acidi organici carbossilici quali, ad esempio, l'acido formico, l'acido acetico, l'acido propionico, l'acido lattico, l'acido maionico, l’acido succinico e gli acidi organici solfonici quali ad esempio, l'acido metansolfonico o l'acido naftalensolfonico .
Basi in grado di formare sali di addizione farmaceuticamente accettabili con i composti di formula (I) comprendono ad esempio le basi minerali, quali l'idrossido di sodio o potassio, l'idrossido d'ammonio e le basi organiche quali ad esempio la trietilammina, la trietanolammina etc.
Tali sali di addizione possono essere preparati o direttamente durante il procedimento di sintesi dei composti di formula (I) oppure possono essere ottenuti, secondo metodiche convenzionali, facendo reagire detti composti (I) con uno o più equivalenti dell'acido o della base prescelta.
Con il termine "composto adiuvante" si intende un composto capace di aumentare la immunogenicità di peptidi sintetici. Tale composto può essere di natura peptidica quale, ad esempio, MuramiIdipeptide (MDP) N-acetil-muramil-L-Alanil--D-Isoglutammina, VQGEESNDK (Antoni, G: et al., (1986), J.Immunol., 137: 820), la tuftsina retroinversa (EP-25.3190/B), gli analoghi retroinversi della Timopentina (Domamde di brevetto italiane N°20.257 A/89, N°21.037 A/89, N°23.099 A/88 ed EP-282. 891/A) , o di natura diversa da quella peptidica quale, ad esempio, tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (Deras et al., (1989), Nature, 242: 561);
Un gruppo preferito di composti di formula (I) secondo la presente invenzione comprende quei composti in cui:
D è una poli (L-lisina) ramificata in cui n è compreso tra 3 e 7;
l'epitopo plasmodiale contenuto in A è scelto tra
X, quando è possibile, è un residuo amminoacidico non presente in A e/o B e
R è idrogena o un radicale acilico metabolicamente labile ovvero un radicale acilico il cui legame con il gruppo amminico venga rapidamente scisso nelle prime fasi del cammino metabolico del prodotto e che non abbia effetti tossici o comunque controindicati in terapia, alla concentrazione in cui il composto di formula (I) esplica l'effetto desiderato.
Particolarmente preferiti secondo la presente invenzione sono i composti di formula (I) in cui B ed A sono diversi tra loro ed uno di essi è un composto ad attività adiuvante.
X composti di formula (I) possono essere preparati mediante condensazione su fase solida utilizzando una delle tecniche note. Preferibilmente, si impiega il metodo "Flow-polyamide" descritto da A. Dryland e R.C. Sheppard (J. Chem-. Soc. Perkin Trans. I, 1986,125-137) che presenta, rispetto alla procedura classica di Merrifield (R.B.Merrifield, (1963), J.Am.Chem.Soc., 85; 2149-2154) i seguenti vantaggi:
- una solvatazione ottimale di tutto il sistema in quanto la matrice (di natura poliacrilammidica), il peptide (una poliammide funzionalizzata) ed il solvente impiegato in tutte le operazioni (DMF) hanno una natura chimica identica;
completamento della reazione dopo il primo coupling condotto a temperature ambientali;
- possibilità di un controllo analitico della reazione seguendo "on line" la traccia spettrofotometrica dell'eluato della colonna. L'analisi, che viene così effettuata sul contenuto totale della colonna, evita ogni potenziale rischio dovuto ad un campionamento non omogeneo.
Il controllo analitico delle reazioni di coupling è un elemento molto importante nella sintesi del composto in accordo con la presente invenzione, in quanto composti sintetici di tali dimensioni sono difficilmente purificabili al termine della sintesi. Errori come peptidi tronchi o mancanti di un amminoacido interno vengono amplificati e sono difficili da analizzare e da rimuovere;
- infine, la possibilità di sbloccare dalla resina il composto (I), in assenza di gruppi chimici particolarmente reattivi in catena laterale quali, Met, Cys, Trp, Arg, Tyr, con una miscela di acido trifluoroacetico (TFA) ed acqua (90:10,v/v) per cui, al termine della reazione, il peptide può essere recuperato con una semplice liofilizzazione.
In accordo con la presente invenzione composti di formula (I) vengono sintetizzati su fase solida mediante un procedimento che comprende: a) il condensare il primo residuo amminoacidico (X), protetto al gruppo α-amminico ed eventualmente alle funzioni reattive in catena laterale, ad un supporto insolubile mediante una reazione di esterificazione tra il gruppo carbossilico terminale attivato ed il gancio di connessione reversibile del supporto solido;
b) il rimuovere il gruppo protettore dall'aammìno gruppo del residuo amminoacidico X;
c) il condensare 1'amminoacido legato al supporto solido insolubile al residuo amminoacidico L-lisina (Lys) protetto agli a ed ε-ammino gruppi mediante reazione di acilazione tra il gruppo α-amminico deprotetto del residuo amminoacidico X ed il gruppo carbossilico attivato della Lys;
d) il rimuovere i gruppi protettori dell'a ed e ammino gruppi della L-lisina ed il condensare i residui di L-lisina necessari a completare la ramificazione desiderata del nucleo polilisinico, mediante reazione di acilazione tra i gruppi a ed ε amminici deprotetti del residuo amminoacidico Lys ed il gruppo carbossilico attivato della Lys;
e) il rimuovere i gruppi protettori dell*a ed e ammino gruppi della L-lisina ed il condensare i successivi residui amminoacidici secondo la strategia riportata nello stadio d) sino ad ottenimento del composto di formula (I);
f) lo sbloccare il composto di formula (I) così ottenuto dal supporto insolubile mediante idrolisi acida; e infine
g) il recuperare e purificare il composto (I) mediante dialisi e/o cromatografia.
Per quanto riguarda i supporti solidi insolubili questi possono essere scelti tra resine poliacrilamidiche commerciali quali, ad esempio, Pepsyn K funzionalizzata con Norleucina (Nle) come amminoacido di riferimento interno e con un gruppo di aggancio reversibile del peptide alla resina ("handle") quale ad esempio l'acido 4-idrossimetilf enossiacetico
COOH)
La reazione di funzionalizzazione viene condotta a temperatura ambiente (20-25°C) in presenza di quantità equivalenti di 1-idrossibenzotriazolo (HOBt).
Preferibilmente X è un residuo non presente nella sequenza amminoacidica di A o B.
Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione il residuo amminoacidico X, viene condensato all'"handle" della resina, previa protezione dell'a-ammino gruppo e delle eventuali funzioni reattive in catena laterale ed attivazione del gruppo carbossilico terminale, mediante reazione di esterificazione.
Esempi di gruppi protettori dell’a-ammino gruppo sono Benzilossicarbonile, Trifenilmetile (Tritile) (Trt), tert-amilossicarbonile, 2-nitrofenilsulfonile, Fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc) e tert-butilossicarbonile (Boc).
Tra questi gruppi protettori, preferiti sono Fmoc e Boc rimovibili in condizioni operative blande. Particolarmente preferito è il gruppo protettore Fmoc.
Eventuali gruppi funzionali reattivi presenti nelle catene laterali degli amminoacidi vengono protetti impiegando gruppi protettivi convenzionali.
Generalmente si utilizzano gruppi protettivi stabili nelle condizioni di rimozione del gruppo a.-ammino protettore.
Esempi di detti gruppi sono tert-butile o ter^-amile per il carbossile e per l’ossidrile della tirosina, i gruppi Boc, trifluoroacetile, orto-bromobenzilossicarbonile (o-Brz) o benzilossicarbonile per il gruppo amminico della lisina, il gruppo tritilico o N -4-metossi,2,3,6 -trimetil-benzensolf onilico (Mtr) per il gruppo guanidinico dell arginina, il gruppo tert-butilestere (OBut per l'acido aspartico e glutammico e il gruppo Trifenilmetil e Boc per l'istidina.
Questi gruppi protettori possono essere rimossi contemporaneamente allo sblocco del composto (I) dalla resina.
In accordo con la presente invenzione l'attivazione del gruppo carbossilico terminale dell' amminoacido X, opportunamente protetto all'a ammino gruppo e ai gruppi funzionali in catena laterale, è condotta impiegando quantità equimolari dell'amminoacido X e di un derivato del fenolo per formare l’estere attivo al carbossile terminale.
Derivati del fenolo utilizzabili nel procedimento della presente invenzione sono quelli fluorurati o clorurati quali ad esempio pentafluorofenolo, triclorofenolo, pentaclorofenolo e para-nitrofenolo.
Si procede quindi alla condensazione (esterificazione) dell'amminoacido attivato come estere all "handle" della resina.
In particolare la reazione di esterificazione è condotta in solvente organico polare Dimetilformammide (DMF) in presenza di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) ed N-metilmorfolina (NMM) a temperatura ambiente per un periodo di circa 15 minuti.
Stadio b)
Nello stadio b) del procedimento della presente invenzione si effettua la rimozione del gruppo protettore dell'a-animino gruppo del residuo amminoacidico X mediante tecniche convenzionali.
Quando il gruppo protettore dell'a-animinogruppo è, ad esempio, Fmoc la sua rimozione è condotta impiegando una miscela di piperidina/dimetilformammide (20:80, v/v).
Stadi c) e d)
Negli stadi c e d) del procedimento della presente invenzione si condensa mediante reazione di acilazione il derivato amminoacidico L-lisina opportunamente protetto agli a ed ε amminogruppi ed attivato al gruppo carbossilico terminale all'a-ammino gruppo deprotetto del residuo amminoacidico X.
Gruppi protettori delle funzioni a ed e amminiche possono essere scelti tra quelli della tecnica nota e riportati nello stadio a).
L'attivazione del gruppo carbossilico terminale della L-lisina può essere condotta utilizzando una delle tecniche convenzionali.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione le reazioni di attivazione ed acilazione sono condotte contemporaneamente impiegando BOP (benzotriazol-l-il-ossi-tris (dimetilammino ) fosfonio esafluorofosfato) in presenza di HOBt e N-metilmorfolina (NMM).
Tali reazioni sono condotte a temperatura ambiente (20-25°C) per 30-60 minuti, impiegando un rapporto molare amminoacido/BOP/HOBt/NMM di 1/1/1,1/2, (v/v). Al termine della reazione di acilazione si procede nello stadio d) allo sblocco dei gruppi protettori dall'a ed ε amminogruppi del residuo L-lisina.
Quando si sintetizzano composti di formula (I) in cui D è una poli (L-lisina) con un numero di residui amminoacidi superiore ad 1 si utilizzano nelle varie reazioni di coupling quantità crescenti del residuo amminoacidco Lys, protetto all a ed e amminogruppo ed attivato al carbossile terminale, a causa dell'aumento progressivo degli amminogruppi presenti sulla resina.
Tipicamente, tra una reazione di coupling e l'altra si effettuano la rimozione dei gruppi protettori dell'a ed e amminogruppi della L-lisina operando come riportato nello stadio b) e ripetuti lavaggi con DMF.
Nel caso in cui la sequenza B del composto (I) sia diversa da A, gli a ed ε amminogruppi dei residui L-lisina vengono protetti con gruppi protettori diversi fra loro dei quali uno è stabile nelle condizioni di rimozione dell'altro.
Così, ad esempio, se uno dei due gruppi protettori è quello preferito Fmoc il trattamento usuale con piperidina/DMF sbloccherà solo tale gruppo protettore e la sintesi avverrà unicamente sugli amminogruppi deprotetti della L-lisina.
Terminato il montaggio della prima sequenza, il secondo gruppo protettore, diverso da Fmoc e scelto tra quelli della tecnica nota, viene rimosso mediante un trattamento convenzionale e si procede poi con la sintesi della seconda sequenza, che risulterà montata su tutti gli altri amminogruppi della L-lisina.
Stadio e).
Dopo rimozione dei gruppi protettori degli a ed e amminogruppi del residuo e/o dei residui amminonoacidici della lisina, si procede alla condensazione mediante reazione di acilazione dei successivi amminoacidi opportunamente protetti con gruppi protettori scelti tra quelli della tecnica nota e attivati al gruppo carbossilico terminale come esteri operando come riportato nello stadio a) all'a-ammino gruppo deprotetto del composto (I) in crescita.
La reazione di acilazione viene condotta in solvente organico inerte in presenza eventualmente di catalizzatori.
Solventi organici inerti vengono scelti tra idrocarburi alifatici clorurati, chetoni alifatici o esteri alchilici. Preferibilmente vengono impiegati N,N.dimetilformammide (DME), cloruro di metilene, acetato di etile e tetraidrofurano.
I catalizzatori sono scelti fra quelli generalmente usati nella sintesi di peptidi, preferibilmente si impiega l-idrossibenzotriazolo in concentrazione da 1 a 2 equivalenti.
Le temperature alle quali viene condotta la reazione di acilazione possono variare tra -10°C e 40°C, preferibilmente 20-25°C ed i tempi di reazione corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanziale completamento la reazione.
Completata la sintesi del composto (I), dopo 10 sblocco del gruppo protettore dall’a-ammino gruppo, questo può essere acilato per evitare che 11 composto abbia la struttura di un policatione.<' >A tale scopo si possono utilizzare acidi alcanoici a catena lineare o ramificata contenenti da 1 a 6 atomi di carbonio quali, ad esempio, formile, acetile, propionile, succinoile ed i radicali acilici aromatici derivanti dall’acido benzoico e dell'acido benzoico sostituito quali, ad esempio, benzoile, 4-nitro-benzoile, 2,3,4-trimetossibenzoile .
Preferibilmente si impiegano gruppi metabolicamente labili ovvero un radicale acilico il cui legame con il gruppo amminico venga rapidamente scisso nelle prime fasi del cammino metabolico del prodotto e che non abbia effetti tossici o comunque controindicati in terapia, alla concentrazione in cui il composto di formula (I) esplica l'effetto desiderato.
Particolarmente preferito è il radicale acetilico (Ac) che viene introdotto mediante il reattivo (CH3C0)20.
Stadi f) e g)
Nello stadi f) e g) del procedimento della presente invenzione si procede alla rimozione della resina-peptide dalla colonna, si lava ripetutamente con un alcool quale, ad esempio, metanolo o etanolo o miscele di questi e quindi si secca sotto vuoto.
Lo sblocco del composto dalla resina è effettuato mediante l'impiego di una miscela Acido trifluoroacetico (TFA):H20 (90:10, v/v).
Ove necessario (presenza di residui di Arg, Trp, Tyr, Cys, Met) vengono addizionati alla miscela di sblocco opportuni "scavanger" quali fenolo e/o etanditiolo, in percentuali variabili dal 5 al 10% (p/v o v/v) e rimovibili mediante estrazione con etere etilico.
Al termine della reazione il prodotto desiderato di formula (I), come tale o sotto forma di sale d'addizione, viene recuperato e quindi purificato con metodi cromatografici convenzionali.
L'omogeneità dei composti ottenuti viene saggiata mediante tic ed HPLC, mentre la loro identità viene determinata mediante analisi amminoacidica e, ove possibile, con tecniche spettroscopiche (NMR, spettrometria di massa).
In accordo con la presente invenzione alcuni dei composti di formula (I), sintetizzati come riportato negli esempi sperimentali che seguono, sono stati saggiati in vivo (topi) ed i risultati hanno mostrato che sono immunogenici senza apprezzabile restrizione genetica.
Pertanto composti di formula (I), così come i loro sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili, possono essere impiegati per la formulazione di composizioni adatte come vaccini antimalaria capaci di conferire una immunità protettiva contro infezioni causate da Plasmodium non ristretta geneticamente.
Generalmente tali vaccini, che rientrano tra gli scopi della presente invenzione, vengono preparati liofilizzando nel dosaggio opportuno un composto di formula (I) e ricostituendo il vaccino al momento dell'uso con un veicolo acquoso adatto quale, acqua distillata, soluzione fisiologica o opportuni tamponi.
Tale vaccino potrà contenere anche altri componenti quali, stabilizzanti, conservanti etc.. Nel caso di formulazioni orali, tale vaccino potrà contenere degli aromatizzanti, come noto in tecnica farmaceutica, il tutto formulato in forme di dosaggio gastro-resistenti. In generale le dosi di antigene impiegate verranno scelte a seconda della via di somministrazione, dell'età e del peso corporeo .
Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione.
Le reazioni di funzionalizzazione della resina e di esterificazione del primo residuo amminoacidico a questa sono condotti in "batch", mentre le successive operazioni di sintesi sono effettute in colonna di vetro 10x1 cm Omnifit utilizzando un sintetizzatore automatico di peptidi (Biolynx modello 4170, Pharmacia-LKB) in accordo con le istruzioni del fabbricante.
Si impiega 1 g di resina commerciale Pepsyn (Milligen, Millipore Co., Beldford, MA, USA) funzionalizzata con 0,1 meq/g di Sarcosina metilestere e trattata per una notte a temperatura ambiente (20-25°C) con 20 mi di etilendiammina distillata.
La resina è poi lavata con dimetilformammide (DMF) per 10 volte, funzionalizzata con NLe come amminoacido di riferimento interno (reazione con 0,3 mmoli di Fmoc-NLe-OpfP, dove con OpfP si intende Pentafluorofenilestere) in presenza di 0,33 mmoli di 1-idrossibenzotriazolo (HOBt), per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo lo sblocco del gruppo protettore Fmoc, condotto mediante trattamento con 10 mi di una soluzione di Piperidina:DMF (20:80, v/v) per 10 minuti a temperatura ambiente e lavaggi intermedi (10) con DMF, la resina viene funzionalizzata con il gruppo di aggancio reversibile del peptide {"handle"). La
reazione di funzionalizzazione è condotta facendo
Sempre in "batch" si effettua la reazione di esterificazione del primo residuo amminoacidico F (Phe) all' "handle". A causa dell'elevata densità strutturale del composto, per ridurre la funzionalizzazione di partenza della resina si impiega un tempo di reazione di 15 minuti (inferiore al normale tempo di 30 minuti). In pratica, 0,3 mmoli di Fmoc-Phe-Opf P, 0,03 mmoli di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 0,3 mmoli di N-metilmorfolina (NMM) sono sciolte in 3 mi di DMF e poste a contatto con la resina per 15 minuti.
Si ottiene così una incorporazione di 0,0107 mmoli/g di resina.
Quindi la resina risultante viene caricata nel sintetizzatore automatico.
Il derivato amminoacidico Fmoc-Lys(Fmoc)OH, viene attivato mediante reazione con BOP (benzotriazol-l-il-ossi-tris (dimetilammino)
fosfonio esafluorofosfato) in presenza di HOBt e
Quindi la miscela risultante viene caricata nel sintetizzatore (attraverso la pompa dello strumento, al flusso di 2ml/ minuto), mettendo poi il sistema in ricircolo per 45 minuti.
Terminata la reazione di condensazione del primo residuo di lisina all'a-ammino gruppo del residuo amminoacidico F, si procede alla condensazione degli altri due residui Lys all'a ed ε amminogruppi del residuo amminoacidico lisina.
Per il primo coupling della lisina (reazione di acilazione) sono utilizzate 0,075 mmoli di Fmoc-Lys(Fmoc)OH, 0,75 mmoli di BOP, 0,09 mmoli di HOBt e 0,15 mmoli di NMM sciolte in 3 mi di DMF e poste a contatto con la resina per 1 ora. Per il secondo coupling sono utilizzate 0,15 mmoli di Fmoc-Lys(Fmoc)OH, 0,15 mmoli di BOP, 0,18 mmoli di HOBt e 0,2 mmoli di NMM nelle stesse condizioni sopra riportate.
Lo sblocco del gruppo protettore Fmoc tra un coupling e l'altro viene effettuato mediante una soluzione di piperidina in DMF (20:80 v/v) che viene pompata nel sintetizzatore ad un flusso di 3,5 ml/minuto per 10 minuti, mentre i lavaggi intermedi sono effettuati pompando in colonna DMF al flusso di 3,5 ml/minuto per un tempo compreso tra 5 e 10 minuti.
Si procede quindi con la sintesi del composto introducendo il residuo amminoacidico Fmoc(Pro) attivato come pentafluorofenilestere che si legherà mediante legame ammidico ai gruppi a ed ε amminici della lisina.
Si effettuano numerosi cicli completi di acilazione-sblocco, utilizzando in sequenza gli opportuni amminoacidi attivati alla concentrazione di 0,3 mmoli/3 mi di DMF in presenza di 1,1 equivalenti (0,33 mmoli) di HOBt.
Dopo sblocco del gruppo Fmoc e lavaggi con DMF condotti come sopra riportato vengono introdotti gli altri residui amminoacidici sino a completamento del composto desiderato.
Tutte le reazioni risultano complete al termine dei periodi fissati, come accertato dalla traccia spettrofotometrica fornita dallo strumento e test colorimetrici di conferma (E., Kaiser et al., Anal. Biochem., 1970, 34; 595) oltre che, successivamente, dall'analisi amminoacidica dei prodotti finali.
Dopo lo sblocco del gruppo protettore dell'
La resina-composto (I) è quindi rimossa dalla colonna, trasferita su un filtro in vetro a porosità 3 (G-3), e lavata sequenzialmente con DMF, metanolo ed Etere Etilico e quindi seccata sotto vuoto a temperatura ambiente per 18 ore. Lo sblocco del composto dalla resina è effettuato ponendo in contatto, a temperatura ambiente per 6 ore, 20 mi di una miscela Acido trifluoroacetico (TFA):H20 90:10 (v/v) contenente etanditiolo (5% (v/v)) con 500 mg di resina secca.
Al termine della reazione la miscela risultante viene estratta con , per allontanare 1’etanditiolo, e filtrata per separare la resina. Questa viene lavata prima con 20 mi di miscela Acido trifluoroacetico (TFA):H20 90:10 (v/v) e poi con 20 mi di H20 (resa di sblocco 90%).
I filtrati riuniti sono sottoposti ad evaporazione sotto vuoto per eliminare il TFA, e la soluzione acida risultante è liofilizzata.
La purificazione del composto risultante viene effettuata per dialisi utilizzando tubi BRL con un cut-off di 12.000-14.000 daltons.
La resa dopo dialisi è risultata del 70% (190 mg, 7,2 umoli).
L'analisi del contenuto amminoacidico del composto è risultata:
Si opera come riportato nell'esempio 1 che precede effettuando dopo il secondo coupling dei residui di lisina un terzo coupling in cui si utilizzano 0,03 mmoli di Fmoc-Lys-(TFA)-OH, in cui gli a ed ε amminogruppi sono protetti, rispettivamente, con il gruppo protettore Fmoc e con il gruppo protettore Trif luoroacetile (TFA), 0,3 mmoli di BOP, 0,36 mmoli di HOBt e 0,6 mmoli di NMM sempre nelle stesse condizioni.
Il trattamento usuale con piperidina/DMF staccherà solamente il gruppo Fmoc e la sintesi avverrà solamente sugli amminogruppi in a.
Terminato il montaggio della prima sequenza, il gruppo TFA viene rimosso mediante trattamento con 1 M piperidina in acqua e si prosegue con la sintesi della seconda sequenza, che risulterà montata su tutti gli ε-amminogruppi della lisina del composto.
Lo sblocco finale del composto dalla resina viene effettuato per trattamento con TFA/fenolo/Etanditiolo (95:3:2, v/p/v)per 6 ore a temperatura ambiente.
La resa dopo dialisi è del 60% (100 mg, 3,6 umoli ).
Si opera come riportato nell'esempio 1. Dopo dialisi si ottiene una resa del 58% (626 mg, 12 umoli ),
L'analisi del contenuto amminoacidico del
composto è risultata:
Asn n.d.; Thr 11,0 (16); Ser 36,1 (32); Glu 26,2 (24); Pro 40,0 (56); Ala 52,1 (64); Val 24,0; Ile 18,7 (24); Leu 8,7 (8); Tyr 6,0 (8); Phe 31,4 (33); His 10,8 (8); Lys 27,3 (31); Arg 7,8 (8); Trp n.d. (non determinato).
Tra parentesi sono riportati i valori teorici.
H
Si opera come riportato nell'esempio 2 in cui i gruppi ε amminici della lisina vengono protetti con il gruppo protettore TFA e rimuovendo questo gruppo al termine della sintesi della sequenza amminoacidica legata al terminale a amminico.
Dopo dialisi la resa è del 65 % ( 152 mg, 4 , 82 umoli ) .
L'analisi del contenuto amminoacidico del composto è risultata:
Asn 97,5 (88); Thr 2,8 (4); Ser 14,1 (12); Giu 5,7 (4); Pro 52,0 (44); Ala 65,3 (44); Val 12,0; Leu 6,3 (8); Phe 13,3 (13); His 5,1 (4); Lys 12,0 (11); Arg 4,0 (4); Trp n.d. (non determinato). Tra parentesi sono riportati i valori teorici.
Il composto viene sintetizzato come riportato nell'esempio 4 senza procedere alla rimozione del gruppo protettore TFA. La resa dopo dialisi è del 62% (145 mg, 4,60 ^umoli).
Esempio 7
Immunogenicità del composto (a) in topi non responder al (NANP)
La capacità del composto (a) sintetizzato nell'esempio 1 di stimolare in vivo una risposta anticorpale viene determinata impiegando topi BALB/C (H-2<d>) e CBA di circa 8-12 settimane, di entrambi i sessi non responder al (NANP)) (Università di Ginevra, CH).
Gruppi di 5 o 10 topi vengono immunizzati per via intramuscolare alla base della coda con una soluzione salina apirogena (50 yul) da sola o contenente 50 composto (a) emulsionato 1:1 in adiuvante completo di Freund (FCA). Dopo 2 settimane dal primo inoculo agli animali vengono iniettati, con le modalità sopra riportate, 25 jig del composto sciolti in 25 pi di adiuvante incompleto di Freud (dose richiamo o "booster").
Prelievi di sangue vengono effettuati, mediante puntura del plesso retroorbitale, dopo il primo e secondo inoculo (risposta primaria e secondaria , rispettivamente). I campioni di siero opportunamente diluiti vengono quindi analizzati mediante saggio immunoenzimatico ELISA che utilizza micropiastre adsorbite con dell an tigene (NANP)40 per valutare la risposta anticorpale (G. Del Giudice et al. 1987) J.Clin.Microbiol. , 2591-96). Le figure 1 e 2, nelle quali sono riportate in ascissa i valori della densità ottica e in ordinata il reciproco delle diluizioni del siero, mostrano che in entrambi i ceppi di topo vengono prodotti elevati titoli anticorpali già dopo la prima iniezione (risposta primaria) (fig.l), e che questi titoli aumentano notevolmente dopo la somministrazione della dose di richiamo (fig.2).
Esempi 8-11
Si opera come riportato nell'esempio 7 che precede immmunizzando i topi con i composti (b), (c), (d) ed (e) sintetizzati, rispettivamente negli esempi 2, 3, 4 e 5.
I risultati della risposta primaria e di quella di richiamo sono riportati, rispettivamente, nelle figure 3 e 4 (composto b), 5 (composto c), 6 e 7 (composto d) e 8 e 9 (composto e).
Da tali risultati si evidenzia che:
- i composti (b), (c), (d) ed (e) sono immunogenici in entrambi i ceppi di topo;
- i composti (b), (d) ed (e) inducono la produzione di anticorpi anti-NANP ad un titolo elevato già dopo la prima iniezione e questa aumenta notevolmente dopo la seconda in entrambi i ceppi di topo.
In figura 5 si riportano solo i risultati ottenuti nella risposta secondaria in topi CBA in quanto i topi BALB/C rispondono ma con titoli anticorpali bassi.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI Composto immunogenico definibile mediante la formula (I):dove: D è L-lisina o poli (L-lisina) ramificata con un numero n di residui amminoacidici lisinici (Lys) in legame a ed e ammidico; n è un numero intero dispari variabile da 1 a 15; A e B, uguali o diversi tra loro, sono un polipeptide costituito da uno o più epitopi B plasmodiali legati covalentemente ad uno o più peptidi con una sequenza amminoacidica corrispondente a quella di un epitopo T qualediretto oppure R-A-CO o R-B-CO sono un gruppo protettore dell'a o ε-amminogruppo del residuo amminoacidico L-lisina con la condizione che A e B non siano entrambi contemporaneamente un adiuvante oppure un legame diretto o un gruppo protettore;ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili. Composto in accordo alla rivendicazione 1, dove n è compreso tra 3 e 7. Composto in accordo alla rivendicazione 1, in cui l'epitopo B plasmodiale è scelto neldove m è un numero intero compreso tra 3 e 40. Composto in accordo alla rivendicazione 3, in cui m è compreso tra 6 e 15. Composto in accordo alla rivendicazione 1, in cui il composto adiuvante è scelto nel gruppo di Muramildipeptide (MDP) N-acetilmuramil-tuftsina retroinversa, gli analoghi retroinversi della Timopentina o tripalmitoil--S-glicerilcisteinil-seril-serina. 6. Composto in accordo alla rivendicazione 1, in cui X è un residuo amminoacidico non compreso in A e/o in B. 7. Composto in accordo alla rivendicazione 1, in cui il radicale acilico è derivato da acidi alcanoici a catena lineare o ramificata contenenti da 1 a 6 atomi di carbonio quali formile, acetile, propionile, succinone ed i radicali acilici aromatici derivanti dall'acido benzoico e dell'acido benzoico sostituito quali benzoile, 4-nitro-benzoile, 2,3,4-trimetossibenzoile . 8 Composto in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dalla sequenza: 9.14 Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1, per l'uso come antigene in un saggio immunoenzimatico (EIA) per la determinazione di anticorpi anti-Plasmodium in un campione di sangue, siero e blood-spots umani. 15. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 14, in cui il saggio immunoenzimatico è un saggio ELISA. 16. Composizione immunogenica adatta come vaccino antimalaria capace di indurre una immunità protettiva geneticamente non ristretta contro infezioni causate da Plasmodium caratterizzata dal fatto di contenere una quantità immunogenicamente efficace di un composto di formula (I). 17. Composizione immunogenica adatta come vaccino antisporozoita di Plasmodium falciparum capace di indurre una immunità protettiva geneticamente non ristretta contro infezioni causate da Plasmodium falciparum caratterizzata dal fatto di contenere una quantità immunogenicamente efficace di un composto in accordo ad ognuna delle rivendicazioni da 8 a 13
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