IT9019800A1 - Composti immunogenici e loro impiego per la preparazione di vaccini sintetici geneticamente non ristretti per la determinazione immunoenzimatica di anticorpi anti-sporozoita di plasmodium malariae - Google Patents

Description

amminoacidico scelto tra L-Asp, L-His, L-Cys, L-Gln, L-Thr, L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Phe, L-Glu, L-Arg, L-Tyr, L-Asn, L-Ser, L-Gly, L-Val, L-Ile, L-Pro e L-Trp;

R2 è OH o NH2;

R è idrogeno o un radicale acilico;

ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili.

Composti di formula (I) sono particolarmente adatti come antigeni per la preparazione di un vaccino anti-sporozoita di Plasmodium malariae geneticamente non ristretto e in diagnostica per la determinazione mediante saggio immunoenzimatico di anticorpi anti-sporozoita di Plasmodium malariae in campioni di sangue, siero e blood-spots. Ancora composti di formula (I) sono adatti come molecole carriera per migliorare la immunogenicità di apteni.

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda una nuova classe di composti immunogenici (I), il procedimento per la loro sintesi e il loro impiego come antigeni in diagnostica per la determinazione mediante saggio immunoenzimatico di anticorpi antisporozoita di Plasmodium malariae e per la preparazione di un vaccino anti-sporozoita di Plasmodium malariae geneticamente non ristretto.

Ancora, la presente invezione riguarda l’uso di composti di formula (I) come molecole carriere per migliorare 1'immunogenicità di apteni.

Con il termine aptene si intende una molecola capace di legare gli anticorpi specifici (antigenica) ma non di indurne la formazione o di indurla ad un titolo anticorpale basso (non immunogenica).

In particolare, sono apteni molecole polipeptidiche o polisaccaridiche (antigeni timo-indipendenti ) isolate e purificate da agenti patogeni o corti peptidi con una sequenza corrispondente a quella di uno o più epitopi B di un antigene naturale ottenuti per sintesi chimica o via DNA ricombinante.

Con il termine antiqene si intende una molecola capace di indurre la formazione di anticorpi specifici (immunogenica) e di reagire con essi (antigenica).

Sono antigeni naturali microorganismi, cellule e loro prodotti solubili.

L'agente eziologico della malaria è un protozoo del genere Plasmodium che viene trasmesso all’ospite vertebrato (per esempio l'uomo) attraverso la puntura della zanzara anofele. Delle quattro specie infettive per l'uomo, Plasmodium malariae (P.malariae), Plasmodium ovale (P.ovale) Plasmodium falciparum (P.falciparum) e Plasmodium vivax (P.vivax), quest' ultime due causano la maggior parte della morbilità e mortalità associate alla malattia.

Attualmente la malaria costituisce uno dei maggiori problemi sanitari a livello mondiale.. Infatti, ogni anno questa malattia colpisce circa 250 milioni di individui provocando nella prima infanzia una mortalità che può raggiungere il 50% dei casi.

Da ciò consegue l'esigenza di sviluppare un vaccino antimalaria capace di conferire nell'uomo una immunità protettiva contro l'agente patogeno che causa detta infezione.

I parassiti malarici si sviluppano secondo un ciclo a più stadi presentando all'ospite un grandissimo numero di componenti antigenici ed ogni forma di sviluppo del parassita contiene antigeni tra loro differenti e stadio specifici.

Nel tentativo di individuare antigeni plasmodiali protettivi, l'interesse dei ricercatori si è indirizzato verso quelli esposti al sistema immunitario e presenti sia sulla superficie del parassita che sulla membrana del globulo rosso infettato.

Un particolare interesse ha rivestito lo studio degli sporozoiti di Plasmodium in quanto la preparazione di un vaccino contro questo stadio, se completamente efficace nell'uomo, è in grado di prevenire lo sviluppo del plasmodio nell'ospite e quindi di indurre una immunità protettiva sterile.

E' noto che la somministrazione in roditori, scimmie e uomo di sporozoiti irradiati con raggi X conferisce una immunità protettiva che è stadio specifica ma non ceppo specifica (Cochrane, A.H. et al., (1980) Academic Press, New York pp.163 -202).

Infatti, incubando gli sporozoiti di Plasmodium con antisieri (anticorpi) ottenuti da animali immunizzati con sporozoiti irradiati con i raggi X della stessa specie si ottiene la formazione di un precipitato sulla superficie che indica che detti anticorpi riconoscono gli antigeni specifici.

L'impiego di anticorpi monoclonali ha reso possibile l'identificazione di detti antigeni che appartengono ad una famiglia di polipeptidi (proteina Circumsporozoitica o CSP) che ricoprono l'intera superficie dello sporozoita e inducono una risposta anticorpale specifica che conferisce una protezione contro infezioni malariche.

I recenti sviluppi nel campo della biologia molecolare hanno consentito di identificare i geni che codificano per proteine antigeniche del Plasmodium.

In particolare, sono stati clonati e sequenziati i geni che codifcano la CSP di P.falciparum, di P.vivax e di P.malariae.

L'analisi delle caratteristiche di dette proteine ha evidenziato la presenza di un dominio centrale o epitopo immunodominante B costituito da unità che si ripetono un certo numero di volte.

Per P.falciparum detto epitopo immunodominante è costituito dal tetrapeptide Asn-Ala-Asn-Pro (NANP) ripetuto 37 volte e da 4 quadruplette con la sequenza amminoacidica Asn-Val-Asp-Pro (NVDP), mentre per P.vivax e P.malariae sono, rispettivamente, Asp-Arg-Ala-Asp/Ala-Gly-Gln-Pro-Ala-Gly (DRAD/AGQPAG) e Asn-Ala-Ala-Gly (NAAG).

In alcuni modelli sperimentali, anticorpi anti-unità ripetentisi erano capaci di conferire una immunità protettiva contro infezioni sperimentali (Potocnjak, P. et al, (1980), J.Exp.Med., 151:1504; Gysin,J. et al., (1984), J.Exp.Med., 160:935; Zavalla, F. et al.,(1987) J.Exp.Med, 167:1591). Pertanto polipeptidi comprendenti gli epitopi B delle proteine CSP sono stati considerati dei candidati validi per lo sviluppo di vaccini anti-sporozoita di Plasmodium.

Tuttavia, studi effettuati in diversi laboratori hanno evidenziato che la capacità dei topi a rispondere ai peptidi sintetici o ricombinanti della sequenza ripetitiva di CSP di P.falciparum (Good, M.F. et al., (1986), J.Exp.Med., 164:655; Del Giudice, G. et al., (1986), J.Immunol., 137:2952), P.vivax (Nardin, E.H. et al.(1988), Eur.J.Immunol ., _18:1119), P.yoelli, P .berqhei (Hoffman, S.L. et al.,(1989), J. Immunol.,142: 3581) è geneticamente controllata dai geni H-2 del complesso di istocompatibilità murinico. Cioè solo topi con aplotipo H-2b o H-2K (topi responders) sono capaci di produrre anticorpi specifici.

Per tali motivi detti peptidi sintetici, se geneticamente ristretti anche nell'uomo, non sono adatti allo sviluppo di vaccini antimalaria.

E' noto che la risposta immunitaria verso un agente estraneo ad un organismo implica la cooperazione di diversi tipi di cellule: cellule che presentano 1'antigene (Antigen Presenting Cells o AFC), linfociti di tipo B (produttori di anticorpi e in grado di funzionare come APC), linfociti di tipo T -adiuvante (T-helper o Th) e linfociti di tipo T-citotossici responsabili dell'uccisione diretta delle cellule infettate dal patogeno .

L'immunità può essere di tipo umorale (mediata dagli anticorpi prodotti dalle cellule B) o di tipo cellulare.

Prendendo in considerazione l'immunità di tipo umorale, il requisito minimo per l'instaurazione di una risposta immunitaria efficace è data dal riconoscimento da parte dei linfociti B circolanti nell'organismo di un determinante antigenico della sostanza estranea (epitopo B) e quello da parte delle cellule Th di un determinante, generalmente diverso da quello B, della sostanza stessa (epitopo T).

Pertanto due sequenze peptidiche devono essre presenti nel vaccino sintetico come requisito minimo per la sua efficacia: epitopo B ed epitopo T.

Mentre l'individuazione dell'epitopo o epitopi B contenuti in un antigene naturale è facilitata dalla possibilità di utilizzare anticorpi naturali anti-patogeno come reattivi, la localizzazione degli epitopi T presenta problemi molto complessi.

Infatti, nel primo caso si tratta di una interazione diretta fra 1'anticorpo anti-patogeno e 1’antigene, mentre nel secondo caso l'attivazione del clone cellulare T specifico per un epitopo dell'antigene avviene solo dopo che questo è stato interiorizzato da una APC, processato mediante proteolisi o denaturazione o entrambe in corti frammenti peptidici, e quindi riesteriorizzato sulla superficie dell'APC in associazione con una molecola di membrana della cellula di classe II (per i Th) codificata da un gene del Maggior Complesso di Istocompatibilità (MHC). Il recettore del linfocita Th riconosce dunque non 1'antigene libero ma il complesso formato da un suo frammento e da una parte della molecola di classe II di MHC.

Queste molecole sono raggruppate in tre famiglie DR-DP e DQ per l'uomo (HLA) e IA e IE per il topo e sono estremamente polimorfe.

Il polimorfismo è dovuto ad un gran numero di alleli per ciascuno dei geni che codificano per questa molecola.

Questa diversità permette un gran numero di combinazioni in un cromosoma (aplotipo).

Pertanto è molto difficile trovare individui non legati da parentela che presentino un MHC identico .

Proprio per il fatto che solo alcuni dei peptidi derivati dalla degradazione dell<1 >antigene siano in grado di associarsi ad un antigene di istocompatibilità dell'ospite fa sì che il corredo genetico dell'ospite, che codifica per detti antigeni, restringa di fatto il numero dei peptidi in grado di formare con essi un complesso che è un requisito indispensabile per l'attivazione dei linfociti Th.

Si parla dunque di "restrizione genetica" degli epitopi T nel senso che detti frammenti peptidici sono ristretti nell'interazione con il recettore dei linfociti T dalle proteine cui sono associati. Da ciò la difficoltà di individuare all'interno di un antigene naturale l'epitopo o epitopi T con una restrizione genetica assente o minima adatti per lo sviluppo di vaccini acellulari sintetici con una efficacia ampia cioè capaci di indurre una immunizzazione protettiva contro l'agente patogeno di interesse in individui con corredi genetici MHC diversi.

Fino ad ora tale difficoltà è stata molto spesso superata utilizzando come fonte di epitopi T una macromolecola, detta anche carrier, alla quale viene legato covalentemente un aptene naturale o sintetico, peptidico o polisaccaridico derivato da un agente patogeno di interesse.

Esempi di carriere adatti a tale scopo sono il tossoide tetanico (TT), il tossoide difterico (CRM), la sieroalbumina e 1'emocianina di lampreda (KLH) in guanto conferiscono al coniugato risultante una restrizione genetica minima.

Coniugati comprendenti detti carriers, noti anche con il termine di carriers universali, sono capaci di funzionare da attivatori di cloni cellulari T in individui dotati di corredi genetici molto diversi tra loro.

Infatti, la maggior parte degli animali utilizzati per i saggi in vivo e aventi corredi genetici differenti sono in grado di attivare una risposta anticorpale verso 1'antigene del coniugato sono cioè "responder".

Anche se questo approccio al problema si è dimostrata efficace, l'uso di coniugati carrier macromolecolare-aptene in un processo di immunizzazione contro un agente patogeno presenta ancora numerosi inconvenienti dovuti alla difficoltà di standardizzare i vari stadi di preparazione, alla possibile alterazione delle proprietà antigeniche dell'aptene come conseguenza della reazione di coniugazione (J.P. Briand et al., J. Immunol. Methods, TQ. (1985) 59-69) e infine al fenomeno noto come "soppressione epitopica indotta dal carrier" che causa la soppressione della produzione di anticorpi anti-aptene in un individuo già immunizzato con il solo carrier (H. Etlinger et al. J. Immunol. 140, (1988), 626).

Questo fenomeno viene osservato nei casi in cui il carrier utilizzato è una proteina alla quale l'ospite è già stato esposto come, ad esempio, il tossoide tetanico impiegato per la vaccinazione anti-tetanica .

Inoltre, l'utilizzazione di sequenze peptidiche corte come immunogeni, anche nel caso in cui queste comprendono sia un epitopo B che un epitopo T dell<1 >antigene naturale, ha generalmente condotto ad una risposta immunitaria molto più ristretta geneticamente, cioè riduzione del numero di animali e/o di individui "responder" (si veda ad esempio A.R. Togna et al., J. Immunol., 137 (1986) 2956-2960; G. Del Giudice et al., J. Immunol. 137, (1986), 2962-2955; G. Del Giudice et al., Immunology 63, (1988) 187-191.

Accanto al problema di sviluppare un vaccino antimalaria con una elevata attività protettiva, esiste inoltre anche quello di delineare un quadro epidemiologico dettagliato della situazione all'interno di ogni area endemica. L'elevato numero di persone che vive in zone a rischio, rende evidente come un programma di vaccinazione di massa non sia possibile e che questo debba essere inizialmente indirizzato verso i gruppi a più alto rischio. La conoscenza delle zone in cui la trasmissione dell'infezione è molto elevata appare, quindi, un obiettivo indispensabile per un controllo accurato della malaria. Una tale strategia richiede un monitoraggio continuo, capillare e su larga scala.

Da qui la necessità di disporre di metodi diagnostici che non implichino l'uso di tecniche sofisticate o di attrezzature poco diffuse in paesi tropicali e che, contemporaneamente, permettano il campionamento in aree remote senza richiedere il mantenimento dei campioni a bassa temperatura e/o l'immediato trasporto al centro di monitoraggio. I saggi immunoenzimatici (EIA)

quali, ad esempio, il saggio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) sono particolarmente adatti nelle indagini epidemiologiche in quanto consentono di testare numerosi campioni contemporaneamente, sono di facile esecuzione e non richiedono attrezzature sofisticate. Naturalmente la messa a punto di un tale saggio richiede la disponibilità di un antigene specifico, con un elevato grado di purezza, ottenibile in quantità adeguate e in condizioni di completa riproducibilità.

Peptidi corrispondenti alla sequenza immunodominante di un antigene quale, ad esempio, la proteina CS, ottenuti per sintesi chimica, sono particolarmente adatti allo scopo.

Le caratteristiche che «questi peptidi devono possedere, da un punto di vista dell'attività immunodiagnostica, sono:

a) specificità, cioè devono essere in grado di discriminare efficacemente, tra le molecole anticorpali presenti nei campioni esaminati, solamente quelle reattive verso 1'antigene desiderato;

b) capacità di adsorbimento su un supporto solido, ad esempio una piastra di tipo ELISA, e di resistenza ai lavaggi ed ai trattamenti necessari fino alla reazione finale di sviluppo del colore.

Recentemente Lai, A.A. et al., (1988), J.Biol., 263:5495-5498) hanno descritto la sintesi del peptide (NAAG)5 e il suo impiego in un saggio di immunoflorescenza (IFA) per uno studio sulla correlazione fra gli anticorpi che riconoscono il peptide sintetico e quelli che riconoscono sporozoiti di P.malariae.

Tuttavia, tale peptide, come mostrato nell'esempio 2 che segue in cui si riporta l'impiego del peptide (NAAG)g-NA, non è adatto come antigene per lo sviluppo di un saggio immunoenzimatico, quale il saggio ELISA, per la scarsa tendezza ad aderire ad un supporto quale, ad esempio, pozzetti di piastre di microtitolazione costruite, generalmente, in polistirene.

Infatti per avere un adsorbimento (coating) di tale peptide sono necessarie elevate concentrazioni (3-5 yug/ml).

Operando in queste condizioni, pur evidenziando una certa capacità di rivelare anticorpi monoclonali (Mab) anti-sporozoita di P.malariae il saggio difetta di sensibilità ed ha una soglia di rivelazione troppo elevata per essere un affidabile strumento epidemiologico.

La tendenza dei peptidi ad assorbirsi non covalentemente su un supporto solido varia da sequenza a sequenza. In particolare, nel caso di sequenze che non presentano abbondanza di residui idrofobici e/o di residui carichi, si è visto che la capacità di legarsi ad un substrato è in relazione al suo peso molecolare. E' noto che, in alcuni casi, è possibile migliorare l'adesività del peptide mediante coniugazione dello stesso ad una proteina con buone capacità leganti quale, ad esempio, la sieroalbumina bovina (BSA).

Tuttavia, prove condotte utilizzando anticorpi monoclonali anti-CSP di P.malariae hanno rivelato che il coniugato (NAAG)^-NA-BSA, pur essendo migliorativo nei confronti del (NAAG)b--NA da solo, non rappresenta ancora la soluzione ottimale al problema.

Ciò è dovuto, probabilmente, all'insufficiente livello di coniugazione ottenuto nel coniugato utilizzato nel saggio, cioè un basso rapporto tra il numero di molecole di (NAAG)g-NA e il numero di molecole di BSA. In ogni caso coniugati di questo tipo presentano ancora degli inconvenienti derivanti dal fatto che le catene peptidiche dell 1antigene, cioè il (NAAG)g-NA, sulla superficie della BSA sono molto spaziate fra di loro e non permettono il legame cooperativo degli anticorpi anti-sporozoita di P.malariae. Un tale legame si ha infatti quando 1’antigene lega contemporaneamente i due siti di legame presenti nella molecola dell'anticorpo risultando in una interazione a più alta affinità e, conseguentemente, in una maggiore sensibilità del saggio.

Infine, da un punto di vista industriale, è difficile assicurare la standardizzazione dei procedimenti di preparazione e quindi la riproducibilità del coniugato ottenuto.

Ancora il peptide (NAAG)g-NA non è adatto per lo sviluppo di un vaccino anti-CSP di P.malariae in quanto poco immunogenico e geneticamente ristretto.

E'stato ora trovato che è possibile superare i problemi della tecnica nota mediante una nuova classe di composti aventi le proprietà immunogeniche desiderate.

Pertanto costituisce uno scopo della presente invenzione una nuova classe di composti inununogenlci costituiti da un nucleo di n residui di lisina in legame a. ed ε ammidico legati ad un numero m di ripetizioni della sequenza ripetitiva della CSP di P.malariae.

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione l'uso di detti composti per la determinazione mediante un saggio immunoenzimatico di anticorpi anti-sporozoita di P.malariae in un campione biologico.

Costituisce Inoltre uno scopo della presente invenzione un kit diagnostico per la rivelazione mediante saggio immunoenziamtico di anticorpi anti-sporozoita di P.malariae che comprende un supporto solido adsorbito con una quantità immunologicamente efficace di un composto come sopra definito .

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione una composizione immunologicamente attiva adatta come vaccino antisporozoita di P.malariae non ristretto geneticamente contenente una quantità immunologicamente efficace di un composto secondo la presente invenzione.

Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione l'uso di detti composti come molecole carriers di apteni per la preparazione di composizioni immunologicamente attive adatte come vaccini anti-aptene geneticamente non ristretti.

Ulteriori scopi della presente invenzione saranno evidenti dalla lettura del testo e dagli esempi che seguono.

In particolare i composti secondo la presente invenzione sono definibili mediante la seguente formula (I):

dove:

D è L-lisina o poli (L-lisina) ramificata con un numero n di residui amminoacidici L-lisina in legame a ed ε ammidico;

n è un numero intero dispari variabile da 1 a 15; m è un numero intero variabile da 3 a 40;

è la catena laterale di un residuo amminoacidico scelto tra L-Asp, L-His, L-Cys, L-Gln, L-Thr, L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Phe, L-Glu, L-Arg, L-Tyr, L-Asn, L-Ser, L-Gly, L-Val, L-Ile, L-Pro e L-Trp;

R2 è OH, NH2;

R è idrogeno o un radicale acilico;

ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili.

Gli amminoacidi sono indicati con il codice a lettera singola:

Asp (D), Lys (K), His (H), Cys (C), Gin (Q), Thr (T), Ala (A), Leu (L), Met (M), Phe (F), Giu (E), Arg <R), Tyr (Y), Asn (N), Ser (S), Gly (G), Val (V), Ileu (I), Pro <P), Trp (W).

Ai fini della presente invenzione, il termine "radicale acilico" identifica i radicali acilici derivanti da acidi alcanoici a catena lineare o ramificata contenenti da 1 a 6 atomi di carbonio quali, ad esempio, formile, acetile, propionile, succinoile ed i radicali acilici aromatici derivanti dall’acido benzoico e dell'acido benzoico sostituito quali, ad esempio, benzoile, 4-nitrobenzoile, 2,3, 4-trimetossibenzoile.

Come qui utilizzato il termine "sali farmaceuticamente accettabili" sta ad indicare quei sali di addizione acida o basica in cui l'anione od il catione rispettivamente siano non tossici ed innocui quando i composti vengono somministrati, sotto forma appunto di sali di addizione, ai dosaggi terapeuticamente efficaci.

Acidi in grado di formare sali di addizione acida farmaceuticamente accettabili con i composti di formula I possono essere scelti tra gli acidi inorganici quali, ad esempio, l'acido cloridrico, l'acido bromidrico, l'acido fosforico o solforico e gli acidi organici carbossilici quali, ad esempio, l'acido formico, l'acido acetico, l'acido propionico, l'acido lattico, l'acido maionico, l'acido succinico e gli acidi organici solfonici quali ad esempio, l'acido metansolfonico o l'acido naftalensolfonico .

Basi in grado di formare sali di addizione farmaceuticamente accettabili con i composti di formula (I) comprendono ad esempio le basi minerali, quali l'idrossido di sodio o potassio, l'idrossido d'ammonio e le basi organiche quali ad esempio la trietilammina, la trietanolammina etc.

Tali sali di addizione possono essere preparati o direttamente durante il procedimento di sintesi dei composti di formula I oppure possono essere ottenuti, secondo metodiche convenzionali, facendo reagire detti composti (I) con uno o poù equivalenti dell'acido o della base prescelta.

Un gruppo preferito di composti di formula (I) secondo la presente invenzione comprende quei composti in cui:

n è un numero intero dispari compreso tra 3 e 15; R^, quando è possibile, è la catena laterale di un residuo amminoacidico diverso da N, A, e G .

R è idrogeno o un radicale acilico metabolicamente labile ovvero un radicale acilico il cui legame con il gruppo amminico venga rapidamente scisso nelle prime fasi del cammino metabolico del prodotto e che non abbia effetti tossici o comunque controindicati in terapia, alla concentrazione in cui il composto di formula (I) esplica l'ef-· fetto desiderato.

In accordo con la presente invenzione i composti (I) sono indicati qui di seguito MAP.[{-NAAG) ] .

'm n

I composti di formula (I) possono essere preparati mediante condensazione su fase solida utilizzando una delle tecniche note. Preferibilmente, si impiega il metodo "Flow-polyamide" descritto da A. Drylan e R.C. Sheppard (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1986,125-137) che presenta, rispetto alla procedura classica di Merrifield (R.B .Merrifield, (1963), J.Am.Chem. Soc., 85: 2149-2154) i seguenti vantaggi:

- una solvatazione ottimale di tutto il sistema in quanto la matrice (di natura poliacrilammidica), il peptide (una poliammide funzionalizzata) ed il solvente impiegato in tutte le operazioni (DMF) hanno una natura chimica identica;

completamento della reazione dopo il primo coupling condotto a temperature ambientali;

possibilità di un controllo analitico della reazione seguendo "on line” la traccia spettrofotometrica dell'eluato della colonna. L’analisi, che viene così effettuata sul contenuto totale della colonna, evita ogni potenziale rischio dovuto ad un campionamento non omogeneo.

Il controllo analitico delle reazioni di coupling è un elemento molto importante nella sintesi del composto in accordo alla ■presente invenzione, in quanto composti sintetici di tali dimensioni sono difficilmente purificabili al termine della sintesi. Errori come peptidi tronchi o mancanti di un amminoacido interno vengono amplificati e sono difficili da analizzare e da rimuovere;

- infine, la possibilità di sbloccare dalla resina il composto (I), in assenza di gruppi chimici particolarmente reattivi in catena laterale quali, Met, Cys, Trp, Arg, Tyr, con una miscela di acido trifluoroacetico (TFA) ed acqua (90:10,v/v) per cui, al termine della reazione, il peptide può essere recuperato con una semplice liofilizzazione.

In accordo con la presente invenzione composti di formula (I) vengono sintetizzati in fase solida mediante il procedimento che comprende:

a) il condensare il primo residuo amminoacidico protetto al gruppo o-amminico ed eventualmente alle funzioni reattive in catena laterale, ad un supporto insolubile mediante una· reazione di esterificazione tra il gruppo carbossilico terminale attivato ed il gancio di connessione reversibile del supporto solido;

b) il rimuovere il gruppo protettore dall'aammino gruppo del residuo amminoacidico esterificato come nello stadio a);

c) il condensare il residuo amminoacidico L-lisina (K) protetto all'a ed ε animino gruppi mediante reazione di acilazione tra il gruppo amminico deprotetto del residuo amminoacidico legato alla resina ed il gruppo carbossilico attivato di K;

d) il rimuovere i gruppi protettori dell’ex ed ε ammino gruppi del primo residuo lisinico;

e) il condensare i residui K necessari ad ottenere il nucleo polilisinico desiderato mediante reazione di acilazione fra il loro carbossile terminale attivato ed i gruppi a ed E amminici deprotetti del residuo e/o residui di lisina legati alla resina;

f) il rimuovere i gruppi protettori dell'a-ed ε ammino gruppi dei residui lisinici e il condensare i successivi residui amminoacidici mediante reazione di acilazione tra il carbossile terminale attivato e gli a ed ε amminogruppi deprotetti del residuo amminoacidico della catena peptidica in crescita sino a completamento del composto di formula (I);

g) lo sbloccare il composto di formula (I) così ottenuto dal supporto insolubile mediante idrolisi acida e il recuperare e purificare il composto (I) mediante dialisi e/o cromatografia.

Per guanto riguarda i supporti solidi insolubili questi possono essere scelti tra resine poliacrilamidiche commerciali quali, ad esempio, Pepsyn K funzionalizzata con Norleucina (Nle) come amminoacido di riferimento interno e con un gruppo di aggancio reversibile del peptide alla resina ("handle”) quale ad esempio l’acido 4-idrossimetilfenossiacetico (HO-CH O-CH COOH).

La reazione di funzionalizzazione viene condotta a temperatura ambiente (20-25°C) in presenza di quantità equivalenti di 1-idrossibenzotriazolo (HOBt).

Stadio a)

Il primo residuo amminoacidico costituisce il punto di attacco alla resina su cui il composto (I) verrà sintetizzato ed è scelto nel gruppo dei residui amminoacidici L-Asp, L-His, L-Cys, L~Gln, L-Thr, L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Phe, L-Glu, L-Arg, L-Tyr, L-Asn, L-Ser, L-Gly, L-Val, L-Ile, L-Pro e L-Trp. Preferibilmente tale residuo non è contenuto in NAAG e nell’epitopo eventualmente legato al suo carbossile terminale.

Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione il residuo amminoacidico viene condensato all' "handle" della resina, previa protezione dell'a-ammino gruppo e delle eventuali funzioni reattive in catena laterale ed attivazione del gruppo carbossilico terminale, mediante reazione di esterificazione.

Esempi di gruppi protettori dell 'a-ammino gruppo sono Benzilossicarbonile, Trif enilmetile (Tritile) (Trt), tert-amilossicarbonile, 2-nitrofenilsulfonile, Fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc) e tert-butilossicarbonile (Boc).

Tra questi gruppi protettori, preferiti sono Fmoc e Boc rimovibili in condizioni operative blande. Particolarmente preferito è il gruppo protettore Fmoc.

Eventuali gruppi funzionali reattivi presenti nelle catene laterali degli amminoacidi vengono protetti impiegando gruppi protettivi convenzionali.

Generalmente si utilizzano gruppi protettivi stabili nelle condizioni di rimozione del gruppo α-ammino protettore.

Esempi di detti gruppi sono tert-butile o ter-amile per il carbossile e per l'ossidrile della tirosina, i gruppi Boc, trifluoroacetile, orto-bromobenzilossicarbonile (o-Brz) o benzilossicarbonile per il gruppo amminico della lisina, il gruppo tritilico o N -4-metossi,2,3,6

-trimeti1-benzensolfoni lico (Mtr) per il gruppo guanidinico dell'arginina, il gruppo tert-butilestere (OBu^) per l'acido aspartico e glutammico e il gruppo Trifenilmetil e Boc per l'istidina.

Questi gruppi protettori possono essere rimossi contemporaneamente allo sblocco del composto (I) dalla resina.

In accordo con la presente invenzione l'attivazione del gruppo carbossilico terminale del residuo amminoacidico, opportunamente protetto all*a animino gruppo e ai gruppi funzionali in catena laterale, è condotta impiegando quantità equimolari dell'amminoacido e di un derivato del fenolo per formare l’estere attivo al carbossile terminale.

Derivati del fenolo utilizzabili nel procedimento della presente invenzione sono quelli fluorurati o clorurati quali ad esempio pentafluorofenolo, triclorofenolo, pentaclorofenolo e para-nitrofenolo .

Si procede quindi alla condensazione (esterificazione) dell'amminoacido attivato come estere all' "handle” della resina.

In particolare la reazione di esterificazione è condotta in solvente organico polare Dimetilformammide (DMF) in presenza di 4-dimetilaminino -piridina (DMAP) ed N-metilmorfolina (NMM) a temperatura ambiente per un periodo di circa 15 minuti.

Stadio b)

Nello stadio b) del procedimento della presente invenzione si effettua la rimozione del gruppo protettore dell1ct-ammino gruppo del residuo amminoacidico mediante tecniche convenzionali.

Quando il gruppo protettore dell'a-amitiinogruppo è, ad esempio, Fmoc la sua rimozione è condotta impiegando una miscela di piperidina:dimetilformammide (20:80, v/v).

Stadi c) d) ed e)

Negli stadi c), d) ed e) del procedimentodella presente invenzione si procede alla condensazione del primo residuo amminoacidico L-lisina opportunamente protetto all'a ed ε amminogruppi e attivato al gruppo carbossilico terminale mediante reazione di acilazione all'o-ammino gruppo deprotetto del residuo amminoacidico legato alla resina.

L'attivazione del gruppo carbossilico terminale può essere condotta impiegando una delle tecniche note. Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione la reazione di attivazione è effettuata utilizzando Dicicloesilcarbodiimmide (DCC).

La reazione di acilazione può essere effettuata secondo tecniche convenzionali in solvente organico inerte in presenza, eventualmente, di catalizzatori .

Solventi organici inerti vengono scelti tra idrocarburi alifatici clorurati, chetoni alifatici o esteri alchilici. Preferibilmente vengono impiegati N,N,dimetilformammide (DMF), cloruro di metilene, acetato di etile e tetraidrofurano.

I catalizzatori sono scelti fra quelli generalmente usati nella sintesi di peptidi, preferibilmenti si impiega 1-idrossibenzotriazolo· in concentrazione da 1 a 2 equivalenti.

Le temperature alle quali viene condotta la reazione di acilazione possono variare tra -10°C e 40°C, preferibilmente 20-25°C, ed i tempi di reazione corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanziale completamento la reazione.

Al termine della reazione di acilazione si procede allo sblocco dei gruppi protettori dall'a ed E amminogruppi del residuo L-lisina

Quando si sintetizzano compósti di formula (I) in cui D è una poli (L-lisina) con un numero di residui amminoacidi superiore ad 1 si utilizzano nelle varie reazioni di coupling quantità crescenti del residuo amminoacidico L-lisina, protetto agli a ed ε amminogruppi ed attivato al gruppo carbossilico terminale, a causa dell'aumento progressivo degli amminogruppi presenti sulla resina.

Tipicamente, tra una reazione di coupling e l'altra si effettua la rimozione dei gruppi protettori dell'e ed ε amminogruppi della lisina operando come riportato nello stadio b) e ripetuti lavaggi con DMF.

Stadio f)

Dopo rimozione dei gruppi protettori dell'a ed ε amminogruppi del residuo e/o dei residui amminonoacidici L-lisina, si procede alla condensazione mediante reazione di acilazione dei successivi amminoacidi, opportunamente protetti con gruppi protettori scelti tra quelli della tecnica nota èd attivati al gruppo carbossilico terminale come esteri operando come riportato nello stadio a), all'α-ammino gruppo deprotetto del composto (I) in crescita.

Completata la sintesi del composto (I), dopo 10 sblocco del gruppo protettore dall'a-ammino gruppo, questo può essere acilato per evitare che 11 composto abbia la struttura di un policatione.

A tale scopo si possono utilizzare acidi alcanoici a catena lineare o ramificata contenenti da 1 a 6 atomi di carbonio quali, ad esempio, formile, acetile, propionile, succinoile ed i radicali acilici aromatici derivanti dall'acido benzoico e dell'acido benzoico sostituito quali, ad esempio, benzoile, 4-nitro-benzoile, 2,3,4-trimetossibenzoile .

Preferibilmente si impiegano gruppi metabolicamente labili ovvero un radicale acilico il cui legame con il gruppo amminico venga rapidamente scisso nelle prime fasi del cammino metabolico del prodotto e che non abbia effetti tossici o comunque controindicati in terapia, alla concentrazione in cui il composto di formula (I) esplica l'effetto desiderato.

Particolarmente preferito è il radicale acetilico (Ac) che viene introdotto mediante il reattivo (CH^CO^O.

Stadio q)

Nello stadio g) del procedimento della presente invenzione si rimuove la resina-peptide dalla colonna, si lava ripetutamente con un alcool quale, ad esempio, metanolo o etanolo o miscele di questi e quindi si secca sotto vuoto.

Lo sblocco del composto (I) dalla resina può essere effettuato mediante tecniche convenzionali. Preferibilmente si impiega una miscela Acido trifluoroacetico (TFAJ/H^O (90/10/ v/v).

Al termine della reazione il prodotto desiderato di formula (I), come tale o sotto forma di sale d'addizione, viene recuperato e quindi purificato mediante dialisi e/o con metodi cromatografici convenzionali.

L'omogeneità dei composti ottenuti viene saggiata mediante tic ed HPLC, mentre la loro identità viene determinata mediante analisi amminoacidica e, ove possibile, con tecniche spettroscopiche (NMR, spettrometria di massa).

Rientrano fra gli scopi della presente invenzione composti di formula (I) portanti uno o più apteni e definibili con la formula generale (II):

dove :

B ed E, uguali o diversi tra di loro, rappresentano un aptene naturale o sintetico, polisaccaridico o polipeptidico isolato da agenti patogeni

di interesse;

p e q sono 0 o 1 con la condizione che p e q non siano entrambi 0;

R, D, m, n ed R^ hanno lo stesso significato prima riportato;

ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili.

Esempi di apteni presenti nei composti di formula (II) sono polipeptidi o polisaccaridi derivati da differenti agenti patogeni virali e batterici quali, ad esempio, meningococci, pneumococci, Haemophilus influenzae, B-hemolytic streptococci, Escherichia coli, Bordetella pertussis e Plasmodium.

In particolare, gli apteni possono essere scelti tra peptidi sintetici aventi la sequenza corrispondente a quella di uno o più epitopi B di un antigene naturale.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione 1'aptene del composto di formula (II) è scelto tra gli epitopi B della CSP di P.falciparum (NANP) e di P.vivax (DRAD/AGQPA-G)r in cui r è un numero intero compreso tra 3 e 40, preferibilmente tra 5 e 16.

Composti di formula (II) possono essere preparati mediante coniugazione fra un composto di formula (I) in cui è OH ed è H con 1'aptene e/o gli apteni opportuni impiegando una delle tecniche convenzionali quali, condensazione in fase omogenea in solvente organico inerte o impiegando un agente legante tipo la glutaraldeide come riportato, ad esempio, da Avremas e Ternynck (Immunochemistry , 6, 53,1969).

Secondo una forma di attuazione della presente invenzione composti di formula (II) in cui B è un aptene polipeptidico e q è 0 possono essere preparati coniugando mediante reazione di acilazione al (NAAG)m gli amminoacidi opportunamente protetti sino a completamento della sequenza polipeptidica dell1aptene.

Composti di formula (I) secondo la presente invenzione sono antigeni particolarmente adatti per lo sviluppo di un saggio immunodiagnostico di tipo ELISA per la determinazione di anticorpi anti-sporozoita di P.malarlae in campioni quali sangue intero, siero e blood-spots, cioè campioni di sangue assorbito su carta da filtro ed eluito al momento del test.

Infatti detti composti sono caratterizzati da un nucleo polilisinico piccolo e da un'alta densità di antigene stratificato intorno ad esso (la maggior parte (94%) del peptide è costituita dall'antigene) che favorisce il binding di legame cooperativo .

Questa situazione è in netto contrasto con quella dei convenzionali coniugati peptide-carrier dove è presente una bassa densità di antigene distribuito casualmente sul supporto macromolecolare, tipo BSA, in forma non identificata.

Inoltre il procedimento di sintesi, altamente· controllato e riproducibile, si presta facilmente ad uno scaling-up industriale.

In accordo con la presente invenzione alcuni dei composti di formula (I) saggiati in topi provvisti di un corredo genetico diverso erano capaci di indurre una risposta anticorpale antisporozoita di P.malariae ad un titolo elevato e non ristretta geneticamente.

Pertanto composti di formula (I), così come i loro sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili, possono essere impiegati per la formulazione di composizioni adatte come vaccini antisporozoita di P.malariae capaci di conferire una immunità protettiva geneticamente non ristretta.

Inoltre composti di formula (II) in cui 1'aptene è 1'epitopo B della CSP di P.falciparum saggiati in topi non respondér al (NANP)n erano in grado di produrre un titolo elevato di anticorpi anti-NANP.

In conclusione i composti di formula (I) secondo la presente invenzione sono adatti come molecole carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici di formula (II) capaci di indurre una immunità protettiva e non ristretta geneticamente o con una restrizione genetica ridotta contro differenti agenti patogeni.

Generalmente i vaccini vengono preparati liofilizzando nel dosaggio opportuno un composto di formula I e ricostituendo il vaccino al momento dell'uso con un veicolo acquoso adatto quale, acqua distillata, soluzione fisiologica o opportuni tamponi.

Tale vaccino potrà contenere anche altri componenti quali,stabilizzanti, conservanti etc.. Nel caso di formulazioni orali, tale vaccino potrà contenere degli aromatizzanti, come noto in tecnica farmaceutica, il tutto formulato in forme di dosaggio gastro-resistenti. In generale le dosi di antigene impiegate verranno scelte a seconda della via di somministrazione, dell'età del peso corporeo e della gravità della malattia.

Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione.

Breve descrizione delle figure:

Figura 1: si riporta la risposta anticorpale verso il peptide MAF((NAAG)g)g in ceppi di topi con differenti aplotipi H-2. Si riportano le medie delle densità ottiche a 414 nm con sieri diluiti 1:100 /- la deviazione standard.

Figura 2: in ascissa si riportano le concentrazioni dei peptidi MAP((NAAG)6)8 (Q ), (NAAG)6 (Δ ) e Lys^ (o) con i quali vengono incubati i sieri prelevati dai topi immunizzati con MAP((NAAG)g)g prima del saggio ELISA; in ordinate si riportano i valori di OD a 414 nm. Ogni punto rappresenta la media di valori in doppio.

Figura 3: si mostra l'effetto carrier del peptide MAP((NAAG)g)8 sulla produzione di anticorpi anti-(NANP) . I simboli rappresentano la media di valori in doppio.

Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione.

Esempio 1

Sintesi del composto MAPI{NAAG) ^jQ.

Le reazioni di funzionalizzazione della resina, di esterificazione del primo residuo amminoacidico (F) a questa e di acilazione dei residui di L-lisina sono condotti in "batch", mentre le succesive operazioni di sintesi sono effettute utilizzando un sintetizzatore automatico di peptidi (Biolynx modello 4170, Pharmacia-LKB) in accordo con le istruzioni del produttore ed una colonna di vetro adatta per la sintesi a flusso (Omnifit,10X1 citi).

Si impiegano 1 g di resina commerciale Pepsyn K (Milligen, Millipore Co., Beldford, MA, USA) funzionalizzata con 0,1 meq/g di Sarcosina metilestere viene trattata per una notte a temperatura ambiente (20-22°C) con 20 mi di etilendiammina distillata.

La resina è poi lavata con dimetilformammide (DMF) per 10 volte, funzionalizzata con NLe come amminoacido di riferimento interno (reazione con 0,3 mmoli di Fmoc-NLe-OpfP, dove con OpfP si intende Pentafluorofenilestere) in presenza di 0,33 mmoli di 1-idrossibenzotriazolo (HOBt), per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo lo sblocco del gruppo protettore Fmoc, condotto mediante trattamento con 10 mi di una soluzione di Piperidina /DMF (20:80,v/v) per 10 minuti a temperatura ambiente e lavaggi intermedi (10) con DMF, la resina viene funzionalizzata con il gruppo di aggancio reversibile del peptide ("handle"), facendola reagire con 0,3 mmoli di HO-CH OCH -COOpfP in presenza di 0,33 mmoli di HOBt, per 45 minuti a temperatura ambiente.

Sempre in "batch" si effettua la reazione di esterificazione del primo residuo animinoacidico (F) all'handle.

A causa dell'elevata densità strutturale del composto, per ridurre la funzionalizzazione di partenza della resina si impiega un tempo di reazione di 15 minuti inferiore al normale (30 minuti). In pratica, 0,3 mmoli di Fmoc-(F)-OpfP, 0,03 mmoli di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 0,3 mmoli di N-metilmorfolina (NMM) sono sciolte in 3 mi di DMF e posti a contatto con la resina per 15 minuti.

Il livello di incorporazione dell'amminoacido F risulta pari a 0,0107 mmoli/g di resina. Poiché il derivato amminoacidico utilizzato per l'incorporazione della L-lisina (K), Fmoc-K(Fmoc)0H, deve essere attivato mediante reazione con Dicicloesilcarbodiimmide (DCC), il che comporta la precipitazione di Dicicloesilurea (DCU) poco solubile nel mezzo di reazione, le tre reazioni di legame (coupling) dei residui della L-lisina sono effettuate in batch utilizzando quantità crescenti di Fmoc-K(Fmoc)OH a causa dell'aumento progressivo degli amminogruppi presenti sulla resina.

Per il primo coupling si impiegano 0,075 mmoli di Fmoc-K(Fmoc)OH, 0,75 mmoli di DCC e 0,09 mmoli di HOBt sciolte in 3 mi di DMF e poste a contatto con la resina per 2,30 ore.

Per il secondo coupling si impiegano 0,15 mmoli di Fmoc-K(Fmoc)0H, 0,15 mmoli di DCC e 0,18 mmoli di HOBt nelle stesse condizioni sopra riportate.

Per il terzo coupling infine si impiegano 0,3 mmoli di Fmoc-K{Fmoc)0H, 0,3 mmoli di DCC e 0,36 mmoli di HOBt, sempre nelle stesse condizioni sopra riportate.

Lo sblocco del gruppo protettore Fmoc tra un coupling e l'altro ed i lavaggi intermedi sono condotti come descritto in precedenza per il coupling della NLe.

Tutti gli altri cicli operativi sono condotti in un sintetizzatore automatico di peptidi (Biolynx modello 4170, Pharmacia-LKB) in accordo con le istruzioni del produttore ed una colonna di vetro adatta per la sintesi a flusso (Omnifit,10X1 cm). In particolare, il ciclo di lavaggio è effettuato introducendo in colonna DMF al flusso di 3,5 ml/minuto per tempi variabili tra 5 e 10 minuti, il ciclo di sblocco dello Fmoc consiste è condotto introducendo in colonna una soluzione di piperidina in DMF (20:80 v/v) al flusso di 3,5 ml/minuto per 10 minuti, ed infine il ciclo di acilazione (coupling) consiste nello sciogliere in 3 mi di DMF 11amminoacido attivato come estere di Pentafluorofenolo (0,3 mmoli) insieme a 0,33 mmoli di HOBt, e di aggiungere la soluzione risultante alla colonna (attraverso la pompa dello strumento, al flusso di 2ml/ minuto), mettendo poi il sistema in ricircolo per 45 minuti.

Tutte le reazioni risultano complete al termine dei periodi fissati come accertato dalla traccia spettrofotometrica fornita dallo strumento e test colorimetrici di conferma (E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 1970, 34: 595) e dall'analisi amminoacidica del prodotto finale. Si effettuano 24 cicli completi di acilazione-sblocco, utilizzando in sequenza gli opportuni amminoacidi attivati (Fmoc-G-OpfP, Fmoc-A-OpfP, Fmoc-N-OpfP ) alla concentrazione di 0,3 mmoli/3 mi di DMF in presenza di 1,1 equivalenti (0,33 mmoli) di HOBt. Dopo lo sblocco del gruppo protettore del residuo α-amminico di Asn (24° ciclo), 1'amminogruppo è acetilato mediante trattamento con una soluzione di (CH3C0)20 (0,3 mmoli) e NMM (0,3 mmoli) in 3 mi di DMF per un tempo di reazione di 60 minuti.

La resina-peptide è rimossa dalla colonna.

trasferita su un filtro in vetro a porosità 3 (G-3), lavata prima con DMF, poi con metanolo ed infine con Etere Etilico e quindi seccata sotto vuoto a temperatura ambiente per 18 ore. Lo sblocco del peptide MAP{(NAAG)Q,.)O„ dalla resina è effettuato ponendo in contatto, a temperatura ambiente per 3 ore, 20 mi della miscela Acido trifluoroacetico (TFA):H20 (90:10, v/v) con 500 mg di resina secca. Al termine della reazione, la resina viene filtrata, lavata con 20 mi della· stessa miscela e quindi con 20 mi di H20 (resa di sblocco 90%).

I filtrati combinati sono evaporati sotto vuoto per eliminare il TFA, e la soluzione acida risultante è liofilizzata (92 mg, 4,81 ^Limoli). Una aliquota del liofilo tal quale è utilizzata nel test ELISA, mentre un'altra aliquota è ulteriormente purificata per Gel-filtrazione su una colonna 80x2,6 cm di Sephadex G-50, raccogliendo le frazioni corrispondenti al picco principale (flusso=36 ml/ora, eluente CHgCOOH 0,1 M, rivelazione UV uguale a 227 nm) e quindi impiegata in un saggio ELISA.

Per entrambi i liofii si ottengono risultati identici che indicano la possibilità di impiegare nel saggio immunoenzimatico il prodotto di sintesi senza alcuna purificazione.

L’omogeneità del composto MAP[(NAAG)g]g è confermata mediante cromatografia HPLC in fase inversa (è presente un solo picco principale poco allargato accompagnato da impurezze minori). La purezza stimata per integrazione del segnale UV risulta dell'85%.

Condizioni HPLC: colonna Vyrdac C-18, 15x0,4 cm,300 A0,5 uni; eluente A=H20 (0,1% TEA, 1% CH3CN), eluente B^ H^CN; gradiente lineare 10% B-70% B in 15 minuti; flusso 1,5 ml/minuto, rivelazione UV ~X = 230 nm; tR del prodotto=6,02 minuti).

L'analisi amminoacidica del MAP[(NAAG)^]g risulta: Phe Lys Asn Ala Gly 1,00 7,10(7) 44,85(48) 94,08(96) 51,47(48) tra parentesi sono riportati i valori teorici. La resa complessiva di sintesi, calcolata sul primo amminoacido legato alla resina è del 76%. Esempio 2

Saggio ELISA: confronto fra (NAAO ^NA, (NAAO ^-NA--BSA, ΜΑΡΓ(NAAG>C1Q.

Si utilizzano piastre a fondo piatto da 96 pozzetti per microtitolazioni Nunc (Nunc-Immunoplate 1, Nunc, Roskilde, Danimarca). Le piastre sono incubate per una notte a temperatura ambiente (20-25°C) in una camera umida con 100 jul/ pozzetto di una soluzione dei suddetti peptidi in tampone fosfato salino (PBS) pH 7,2. Dopo 4 lavaggi con ΡΒΞ contenente Tween-200,05% (PBS-T), le piastre vengono saturate per 1 ora a temperatura ambiente con 200 yul di PBS-T contenente 5 % di latte in polvere. Poi, 100 ^ul di siero umano diluito in PBS-T contenente 2,5% di latte in polvere sono addizionati in doppio in ciascun pozzetto delle micropiastre e incubati a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo 4 lavaggi con PBS-T, in ogni pozzetto si aggiungono 100 yul del coniugato perossidasi-IgG di coniglio antiuomo diluite 1:5000 in PBS-T contenente 2,5% latte in polvere. Le piastre sono incubate a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo 4 lavaggi con PBS-T, si aggiungono 100 jul di substrato specifico (ortofenilendiammina (Fluka, AG, Buschs, CH), 0,4 mg/ml in tampone citrato 0,1 M pH 5,0 contenente 0,01% di acqua ossigenata). La reazione enzimatica è bloccata dopo 20 minuti aggiungendo 50 ^ul di I^SO^ 2,5 N. La densità ottica (O.D.) è letta in assorbanza a 492 nm usando un lettore Titertek Multiskan ( Flow Laboratories, McLean, VA ). Per ogni analisi sono utilizzate piastre non adsorbite con 1'antigene e incubate con PBS pH 7,2 e poi processate come le piastre adsorbite. I risultati vengono espressi come differenza fra i valori di O.D. ottenuti per entrambe le piastre.

Allo scopo di ottimizzare il protocollo di adsorbimento si sono utilizzate:

a) piastre Greisner, Dynatec e Titertek;

b) tampone di adsorbimento ^ 200^ pH 9,8 (1 pg/ml) ;

c) concentrazioni di MAP((NAAG )gjg di 2, 1, 0.5, 0.25 jug/ml;

d) trattamento a secco (lavaggio delle piastre con acqua ed essiccamento in un essiccatore) e ad umido (nessun essiccamento) dopo coating delle piastre con BSA.

La reattività degli antigeni è misurata impiegando anticorpi monoclonali MAb POX anti P.malariae e sieri provenienti dall'Africa e dall'Italia.

I risultati ottenuti hanno mostrato che:

- il coating con tampone carbonato da per tutti i tipi di piastre valori di O.D. più alti del 15-20% rispetto al tampone PBS (misurato con il MAb POX); - per tutte le piastre la concentrazione ottimale dell 'antigene è 1 pg/ml; con una concentrazione del 2% si ottengono valori di O.D. di circa il 5% più alti, mentre con una concentrazione di 0,5 % valori di O.D. di circa il 5% più bassi (misurati utlizzando il MAb POX);

- coating a secco e ad umido: i migliori risultati sono ottenuti con il coating a secco. Esso abbassa i valori X dei sieri italiani del 25-40% e quelli degli africani del 20-25%;

- le piastre Nunc danno i migliori risultati per guanto riguarda il rapporto di legame specifico/ aspecifico; sulle piastre Nunc l'X dei sieri dei campioni italiani è il 29% dell'X dei sieri africani; sulle altre piastre la media dei valori dei sieri italiani raggiunge valori in % più alti; su piastre Greiner 31%, Titertek 35% e Dynatec 36%.

Il saggio ELISA condotto utilizzando il (NAAG)g-NA ad una concentrazione e gli altri due peptidi ad una concetrazione di 1 e misurando la reattività verso il MAb POX anti-P.malariae dava i valori più alti con MAP[-(NAAG) ,]Q. Circa il 50% di questi valori sono ottenuti con (NAAG)gNA-BSA e solo il 25 % con (NAAG)g-NA. Anche con i sieri africani i risultati migliori sono ottenuti con il peptide sintetico MAP[(NAAG)6]Q.

SPECIFICITÀ1 DEL PEPTIDE MAPf (NAAG)c1Q Reattività con sieri

Degli 88 sieri italiani saggiati, nessuno da un O.D. più alto di 0,330. Fra i 40 sieri africani, 4 danno valori di O.D. superiori a 1,200 e 2 superiori a 0,500.

34 sieri italiani, per i quali si era ottenuta una elevata assorbanza su piastre adsorbite con il peptide MAP£(NAAG)g^g/ sono saggiati in parallelo su piastre adsorbite con il composto MAP[(NAAG)g]g e con (NANP)4Q. Valori leggermente più alti erano ottenuti con MAP[(NAAG)g]g (X =0,229) che con (NANP)4Q (X=0,215)

Reattività con MAb anti-P.malariae.

Il composto MAPI(NAAG)g]g è riconosciuto da anticorpi monoclonali antisporozoita di P.malariae e non reagisce con il MAb 2A10 diretto contro gli sporozoiti di P.falciparum.

Ancora il composto MAP[(NAAG)g]g è riconosciuto dai MAb anti-sporozoita di P. malariae sia in soluzione che legato su fase solida.

Esperimenti di competizione rivelano che gli anticorpi presenti in un campione di siero positivo africano riconoscono lo stesso epitopo riconosciuto dal MAb anti-sporozoita di P. malariae.

Esempio 3

Immunizzazione con il MAP[(NAAG)g]g.

A) Produzione di antlcorpi.

La capacità del composto MAP[(NAAG)g]g di stimolare in vivo una risposta anticorpale viene determinata impiegando topi BALB/c (H-2^), C57BL/6 (H-2b), C3H/He (H-2k) (Università di Ginevra, CH), B10.G, B10.M, B10.S e B10.RIII (71NS) (forniti da Olac 1976 Ltd,Bicester,UK) , C57BL/6nu/nu (GL Bomholtgard, Ltd., Ry, Danimarca) dì circa 8-12 settimane, di entrambi i sessi. Gruppi di 5 o 10 topi vengono trattati per via intramuscolare alla base della coda con una soluzione salina apirogena (50 jul) da sola o contenente 50 jiq dei peptidi (NAAG)g-NA, Lys? ((K)?-F-0H) (controlli) e MAP-[(NAAG)g]g emulsionati 1:1 in adiuvante completo di Freund (FCA). Dopo 3 e 5 settimane gli animali vengono nuovamente inoculati, sempre alla base della coda, con le stesse concentrazioni di peptidi in adiuvante incompleto di Freund (FIA). Sette giorni dopo l'ultima immunizzazione, si prelevano i campioni di sangue dal plesso retroorbitale dei topi e si saggiano i sieri mediante saggio ELISA per la determinazione degli anticorpi specifici.

I campioni di siero opportunamente diluiti vengono introdotti in pozzetti di una micropiastra adsorbita con il MAP[(NAAG)g]g (2 pg/ml) o con il peptide di controllo Lys^ (10 jug/ml) e fatti reagire a 4°C per una notte. Gli anticorpi legati a detti antigeni vengono rivelati dopo un periodo di incubazione di 3 ore a 37°C con il coniugato perossidasi-anticorpi IgG di vitello anti-topo (Zymed Laboratories Ine, San Francisco, CA) in presenza del substrato specifico (ortofenilendiammina (Fluka, AG, Busche, CH), 0,4 mg/ml in tampone citrato 0,1 M pH 5,0 contenente 0,01% di acqua ossigenata). La reazione enzimatica è bloccata dopo 20 minuti aggiungendo 50 ul di I^SO^ 2,5 N. I risultati sono letti, dopo circa 1 ora come densità ottica a 492 nm usando un lettore Titertek Multiskan (Flow Laboratories, McLean, VA). Campioni di siero che daveno valori di OD < 0,2 alla diluizione di 1:100 erano considerati negativi. Tutti i topi inoculati con (NAAG)g-NA dopo tre immunizzazioni in adiuvante completo di Freund non inducono la formazione di anticorpi.

Come si osserva dalla figura 1 anticorpi anti -MAP[(NAAG)c]_ sono determinabili in tutti i campioni di siero ad eccezione di quelli ottenuti dai topi B10.RIII (H-2r). I valori dei titoli anticorpali più elevati sono determinabili nei sieri dei topi B10.M (H-2F), C57BL/6 (H-2b) e C3H/He (H-2k); i titoli anticorpali più bassi si riscontrano nei campioni di siero prelevati dai topi BALB/c (h-2d), B10.G (H-2q) e B10.S (H-2S). Nessuna risposta anticorpale anti-MAP[(NAAG)g]g viene determinata nel siero prelevato dai topi privi di timo C57BL/6nu/nu. Nessun legame tra gli anticorpi presenti nei campioni di siero prelevati dai topi immunizzati con il peptide di controllo Lys^ è determinabile mediante il saggio ELISA.

B) Analisi della specificità degli anticorpi anti-MAP[(NAAG)^ .

Scopo dell'esperimento è quello di verificare se gli anticorpi indotti mediante immunizzazione dei topi con il peptide MAP[(NAAG)g]g sono specifici per l'epitopo (NAAG)g e non per il nucleo polilisinico del MAP.

Campioni di siero ottenuti dai topi una settimana dopo la terza immunizzazione con 50 jig di MAP[-(NAAG)g]g in adiuvante completo di Freund, sono incubati a 37°C per 1,5 ore con differenti concentrazioni di MAP[(NAAG)^]g, (NAAG)g o Lys^ e poi saggiati mediante saggio ELISA utilizzando delle piastre adsorbite con il peptide MAP[(NAAG)g]g (2

Come mostrato in figura 2 la capacità degli anticorpi presenti nei campioni di siero prelevati da topi C57BL/6, C3H/He e B10.M a legarsi al peptide MAP[(NAAG)g]g è completamente inibita sia dallo stesso peptide che dal peptide (NAAG)g-NA privo del nucleo polilisinico, ma mai· dal peptide Lys^ privo del componenete NAAG. Questi risultati chiaramente mostrano che gli anticorpi che si sviluppano dopo immunizzazione con il peptide MAP[((NAAG)&])g riconoscono specificamente il peptide ripetentesi del P.malariae (NAAG) ma non il nucleo polilisinico in esso contentuo.

Esempio 4

Studio dell'effetto carrier del peptide

MAPI(NAAG)^lg sulla produzione di anticorpi antj-(NANPJ^Q.

Il composto MAP[(NAAG)g]g viene coniugato al peptide (NANP)^Q, ottenuto come riportato nella domanda di brevetto EP-209,643, utilizzando l-etil-3-(3-dimetilamminopropil)-carbodiimmide HC1 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) (Erlanger, B.F. Methods Enzymol., J70: 85, 1980).

Gruppi di 5 topi BALB/c e C3H/He (non responder al peptide (NANP)4Q) e C57BL/6 (responder al peptide (NANP)40) vengono trattati per via intramuscolare alla base della coda con una soluzione salina apirogena (50 ul) da sola o contenente 50 ug dei peptidi (NANP)40 o MAP[(NAAG)g] Q-(NANP)4Q emulsionati 1:1 in adiuvante completo di Freund (FCA). Dopo 3 settimane gli animali vengono nuovamente inoculati operando come sopra riportato. Dopo sette giorni dall'ultimo inoculo vengono prelevati campioni di sangue dal plesso retroorbitale ed i sieri sono esaminati mediante saggio ELISA come descritto nell'esempio 3 utilizzando micropiastre adsorbite con il peptide (NANP)4Q (1 jug/ml).

Come si osserva in figura 3, elevati titoli anticorpali anti-(NANP)4Q sono rilevabili in tutti i topi saggiati. Questi risultati indicano che il peptide MAP[(NAAG)g]Q agisce come molecola carrier per la produzione di anticorpi anti-(NANP) .

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti immunogenici definibili mediante la formula (I): R-(NAAG) -CON®H R-. O m \ (D) -CO-NH-CrH-Cu-R, n 2 R-(NAAG)m-CON H n+1 2 dove : D è L-lisina o poli (L-lisina) ramificata con un numero n di residui amminoacidici L-lisina in legame a ed ε ammidico; n è un numero intero dispari variabile da 1 a 15; m è un numero intero variabile da 3 a 40; R^ è la catena laterale di un residuo amminoacidico scelto tra L-Asp, L-His, L-Cys, L-Gln, L-Thr, L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Phe, L-Glu, L-Arg, L-Tyr, L-Asn, L-Ser, L-Gly, L-Val, L-Ile, L-Pro e L-Trp ed è OH o NH2; R2 è OH, NH2; R è idrogeno o un radicale acilico; ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili.
2. 2. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1, in cui n è un numero intero dispari variabile da 3 a 7
3. 3. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1, in cui m è un numero intero variabile da 6 a 15.
4. 4. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1, in cui R^ è la catena laterale di un residuo ammìnoacidico diverso da N, A e G.
5. 5. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1, portante uno o più apteni e definibile con la formula generale (II):

   dove: B ed E, uguali o diversi tra di loro, rappresentano un aptene polisaccaridico o polipeptidico derivato da un agente patogeno; p e g sono 0 o 1 con la condizione che p e g non siano entrambi 0; R, D, m, n ed hanno lo stesso significato prima riportato; ed i corrispondenti sali di addizione acida o basica farmaceuticamente accettabili.
6. 6. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 5, in cui l'aptene è (NANP)r o (DRAD/AGQPAG ) dove r è un numero intero compreso tra 3 e 40.
7. 7. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 6, in cui r è compreso tra 6 e 15.
8. 8. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1, per l'uso come antigene in un saggio immunoenzimatico (EIA) per la determinazione di anticorpi anti-sporozoita di Plasmodium malariae in un campione di sangue, siero e blood-spots umani.
9. 9. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 8, in cui il saggio immunoenzimatico è un saggio ELISA.
10. 10. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 9, in cui il saggio ELISA comprende il far adsorbire su un supporto solido un composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 1 in concentrazioni da 0,25 a 2 jug/ml in tampone di adsorbimento ed il lavare e portare a secco il supporto cosi adsorbito.
11. 11. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 10, in cui il tampone di adsorbimento è Na2CO^.
12. 12. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 10, in cui la concentrazione del composto adsorbito sul supporto solido è compresa tra 0,5 e 1,5 jug/ml.
13. 13. Composto immunogenico in accordo alla rivendicazione 12, in cui la concentrazione del composto adsorbito sul supporto solido è compresa tra 0.8 e 1,2 pg/ml.
14. 14. Composizione immunogenieamente attiva adatta come vaccino antisporozoita di Plasmodium malariae capace di indurre una immunità protettiva geneticamente non ristretta contro infezioni causate da Plasmodium malariae caratterizzata dal contenere una quantità immunogenicamente efficace di un composto di formula (I).
15. 15. Composizione immunogenicamente attiva adatta come vaccino antisporozoita di Plasmodium falciparum capace di indurre una immunità protettiva geneticamente non ristretta contro infezioni causate da Plasmodium falciparum caratterizzata dal contenere una quantità immunogenicamente efficace di un composto di formula (II) in accordo alla rivendicazione 5 in cui l'aptene B e/o E è (NANP)r dove r ha lo stesso significato prima riportato.
16. 16. Composizione immunogenicernente attiva adatta come vaccino antisporozoita di Plasmodium vivax capace di indurre una immunità protettiva geneticamente non ristretta contro infezioni causate da Plasmodium vivax caratterizzata dal contenere una quantità immunogenicamente efficace di un composto di formula (II) in accordo alla rivendicazione 5 in cui B e/o E è (DRAD/AGQPAG)^ ed r ha lo stesso significato prima riportato.