KR20000005429A - 비수지성 주쇄 펩티드 담체 - Google Patents

비수지성 주쇄 펩티드 담체

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KR20000005429A
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피터 미카엘 헬벡 히가드
팔레 호이 야콥슨
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야콥슨 팔레, 히가드 피터
펩리서치 에이/에스
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Abstract

본 발명은 면역원성 물질의 담체 및/또는 면역 매개자로서 사용하기 위하여 고안된 비수지성 펩티드, 면역원성 물질 그리고/또는 면역 매개자를 운반하는 상기 담체의 구조, 상기 비수지성 펩티드를 포함하는 고도의 예측가능한 면역원성을 갖는 면역원의 제조방법, 백신생산 그리고 펩티드 담체상에서 면역원성 물질 및/또는 면역 매개자를 포함하는 백신에 대한 상기 면역원의 사용방법과 관련된다. 본 발명은 또한 비수지성 펩티드 담체를 사용하는 진단 또는 치료 실시예, 진단 또는 치료 조성물 그리고 질병과 임신의 치료는 물론 진단에 있어서 상기의 사용방법과 관련된다. 본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체는 고체상으로부터의 이탈후에 양성 완충액하에서 2차 구조를 형성할 수 있는 10-50개의 아미노산을 포함한다

Description

비수지성 주쇄 펩티드 담체
국제특허 95/31480에 있어서, 역평행 "이중나선" 이형 이량체가 면역원성 담체로 사용되었다. 이형 이량체의 사용에 의하여 서로 다른 면역원성 표적 분자 물질을 구성하는 조성물의 제조가 조절된다. 그 제조는 희망하는 두 개의 다른 표적 분자가 부착되는 두 개의 서로 다른 단량체를 혼합하는 것을 포함한다. 하나의 표적분자가 하나의 단량체에 각각 부착된다. 각 단량체는 동형 이량체를 형성하지 않도록 고안되었기 때문에 단지 이형 이량체의 형성이 주가 된다. 얻어진 이형이량체들은 각 단량체에 하나씩 두 개의 서로 다른 면역 표적분자를 구성한다.
따라서, 면역원의 조성물은 공지의 결합법에 의하여 펩티드 수송체에 결합된 서로 다른 면역 분자를 구성하고, 각 단량체에는 단지 하나의 면역 물질이 나타난다. 이러한 셀프 어셈블링 체계(self assembling system)는 예를 들어, 비-세포(B-cell)와 티-세포(T-cell) 에피토프(epitope)와 같이, 같은 이량체에서 두 개의 서로 다른 물질의 결합을 보증한다. 구조적 안정화(conformational stabilization)는 조사되지 아니하였고, 저농도에서의 분리 문제는 다루어지지 아니하였다. 서브유니트(sub-unit) 펩티드는 21 내지 70 아미노산 사이다.
국제특허 95/11998에서, 구조 펩티드 목록(library)은 다양한 병원성 미생물에 있어서 항원변화 또는 T-세포 자극 서열의 레퍼토리에 기초하여 제시된다. 그 목적은 미생물의 변종과 숙주 개수 양자에 대한 광범위한 반응성 또는 면역성을 얻기 위한 것이다. 그 라이브러리(library)는 그 라이브러리를 대표하는 최종 펩티드의 개수의 바람직한 분포에 상응하는 분포를 보이는 반응물의 혼합물을 첨가하는 것을 구성하는 단일 펩티드 합성과 동시에 합성된다. 그러나 라이브러리는 고체상을 사용하여 합성된다. 어떠한 특이한 주쇄(backbone) 구조도 유도가능 폴리머를 함유하는 공지의 리신으로부터 분리되어 공개되지 아니하였다.
국제특허 94/29332 에서는 역평행 내분자(intramolecular) "이중나선" 단량체가 면역원의 담체로서 사용되었다. 펩티드 서열 형태에서 면역물질은 단량체를 형성하는 선형 펩티드 내부에 존재하고, 반면에 전체 면역 조성물은 순수한 펩티드를 구성한다. 따라서, 담체는 회전에 의하여 결합된 2개의 양친매성α-나선의 분자내, 역평행 정렬에 의하여 안정화되고, 그 안정성은 알파-나선 번들의 경우와 같은 농도의존은 아닌 것으로 기술된다. 그 구조는 다수의 면역 물질 수송하기 위해 고안된 스카폴드(scaffold)가 아니라, 안정한 고안을 위한 템플리트(templete)이다. 전체 펩티드는 32와 200이상 잔기 사이일 수 있다. 분지 펩티드 부착은 언급되지 아니하였다. 어떠한 면역화 실시예도 제시되지 아니하였다.
"템플리트 보조 합성단백질"("TASPS")의 제조를 위한 시클릭(cyclic) 또는 컨스트레인드(constrained) 스카폴드가 알려졌다(Tuchscherer 1993). 이들 스카폴드는 부착 단백질을 단단한 템플리트에 두어 이들 펩티드의 구조적인 특성(trait)을 증가시키기 위하여 특별히 고안되었고, 적어도 알파 나선(α-helical) 펩티드에 있어서 원형 이색성 방법(circular dichroism mesurement)은 이를 입증하였다. 보조 액의 존재하에 TASPS를 사용한 면역은 다른 담체에 대한 그 이상의 축합 없이도 단백질 교차 반응 항체를 생산하는 것으로 보인다. 그 합성은 스카폴드의 고체상 합성을 포함하고, 부분적인 비보호와 부착 단백질의 합성, 쪼개짐과, 가장 빈번한 시클리화와 HPLC에 의한 광범위한 정제가 이어진다.
또한, 미리 합성된 펩티드의 티오에스테르(thioester)의 브로모아세틸레이티드(bromoasetylated)로의 화학선택적 결합은 국제특허 950543에 기술되었다.
다른 형태의 구조가 오르토고날 화학(orthogonal chemistry)을 사용하여 결합될 수 있다(Tuchscherer 1993). 다양한 비율의 티-세포와 비-세포 펩티드의 혼합구조를 포함하는 구조들과 그 면역원으로서의 용도 또한 보고되었다.(Kaumaya 1993).
여기서 스카폴드는 교대로 연결된 짧은 2개의 베타-선(β-strand)으로 구성되고, 면역화는 항체가 펩티드 그리고 그에 상응하는 천연 단백질과 반응하도록 유도하는 프로인트 컴플리트 보조액으로 실시되었다.
GB 2 282 81 A는 티오에스테르 결합에 의하여 시클라이즈되는 스카폴드를 기술하고, 선형 펩티드 티-세포 자극 항원은 물론 시클릭 비-세포 에피토프가 결합할 수 있는 부착점으로서의 아미노기를 제공하는 리신 잔기를 포함한다. 스카폴드 자체는 합성되고, 시클라이즈되고, 정제되어 결과적으로는 정제된 펩티드 항원 상세하게는 시클라이즈드 펩티드 비-세포 항원과 선형 티-세포 항원들이 화학적 방법에 의하여 결합된다. 또한 탄화수소가 결합될 수 있고, 예를 들어 트리팔미테이트(tripalmitate) 시스 구조와 같은, 보조액 활성을 갖는 기가 포함될 수 있다. 그 생성물들은 쉽게 용해되지 않고, 리포좀(liposome)으로 투입되거나 면역을 위하여 에멀션화된다. 구조 지지를 위한 아무런 자료가 없고, 단백질 교차반응 항체를 유도하는 능력에 대하여 제시된 것이 아무것도 없다. 스카폴드 결합 고체상에의 합성에 대한 언급도 없다.
미국 특허 제5229490호에는, "수지성(dentric)" 구조를 가지고 있는 합성 펩티드 스카폴드가 공개되었다. 많은 수의 항원 펩티드 체계가 기술되어있고, 많은 수의 항원들이 수지성 중심 분자의 관능기에 결합되어 있고, "다수 항원 펩티드"로 호칭된다("MAPs"). 항원 발현 덴드리머(dendrimer)는 고체상 부착 리신잔기 하나에 대하여 전형적으로 4 또는 8의 유도 아미노기를 생성하면서, 알파- 그리고 에타- 비보호 리신 양자 모두에서 다수 "층(layers)"의 화학합성에 의하여 생성되고, C- 말단에 의하여 고체상에 축합된다. 이 기는 유도되어 다른 기능들 그리고/또는 스페이서 성분(spacer moiety)를 나타낸다.(국제특허 92/18528 그리고 Tam 1995 참조). 항원 펩티드를 고체상 결합 MAP-중심의 외부 아미노기에, 컴플리티드 구조의 쪼개짐이 수반되는 부착에 의하여, 최소의 "중심" 담체구조를 갖는 이른바 고농도 발현이 이루어진다. 외층에 존재하는 각각의 리신 성분은 2개의 항원 펩티드를 수송한다.
그러한 MAPs는 적어도 프로인트 인컴플리트 보조액과 항원 펩티드 "분지"에만 지향된 알루미늄 수산화물을 생산하는 보조액의 존재하에 주사되었을 때, 고도의 면역원성을 갖는다. 그러나, 어떤 경우에는 이들 항체들이 비록 MAP-결합 항원 펩티드에 고도의 친화성이 있다고 하더라도, 펩티드가 유도된 천연구조와 반응은 그리 높지 않다(Briand 1992 참조). 또한, "분지" 펩티드의 수가 각각의 분지 (예를 들어 Francis 1991참조)의 구조에 영향을 주고있음을 보여준다. 그리고, 항원 펩티드 분지내 펩티드 구조의 바람직한 유지(retention)가 존재하는지에 관하여 어떠한 것도 제시된 바 없다.
그들의 화학적 합성은 시간이 오래 걸린다. 왜냐하면, 인접 위치한 분지- 펩티드들은 응집하는 경향이 있기 때문이다. 따라서, 프로토콜은 대체로 "간접적인 접근"을 일반적으로 권한다. 여기서 펩티드 항원은 미리 결합된 엔터티(entity)로서 결합된다(Tam 1993). 그러나, 결합과 관련이 없는 모든 문제들이 여전히 존재한다.
MAPs는 또한 고압 액체 크로마토 그래피(HPLC)에 의하여 특정하고 정제하는 것이 어려움이 발견되었다. 따라서, MAPs는 축합을 생성하기 위한 화학적 방법을 사용하는 이점을 감쇄하면서, 본질적으로 비정제된 상태에서 면역화를 위하여(예를 들어 염석, 또는 조 겔 여과(crude gel filtration)를 제외하고) 정상적으로 사용된다.
백신과 면역화를 향상시키기 위하여, 중요한 목적은 유용한 면역학적 반응을 생성하기 위한 그 능력을 여전히 유지하면서 사용된 항원을 정제하고, 특히 그 순도와 그 화학적 일정성을 보증하는 것이다. 그러나, 공지의 담체 펩티드들 그리고 그러한 펩티드의 생산, 그리고 면역원성 화합물들은 이러한 관점에서 부적절하다. 일반적으로 리포좀 형성 또는 물내 기름과 형성된 보조액이 적절한 항체반응을 생성하기 위하여 필요하다. 존재하는 펩티드의 면역성을 향상시키기 위해 잘 구성된 방법이 있다(Flaue 1990 참조). 공지의 방법은 일반적으로 펩티드 등의 화학적 방법에 의한 담체 분자에의 결합을 포함한다(Van Regemortel 1988). 당업자에게 잘알려진 화학적 축합법은 글루타릭 알데히드(glutaric aldehyde)(아미노기 그리고 티올기와의 결합), 카르보디이미데스(carbodiimides)(아미노기와 결합),
엠-말레이미드 벤조일-앤-하이드록시석시니마이드 에스테르
(m-maleimide benzoyl-N-hydroxysuccinimide esters)(아미노기로부터 티올기로 결합)와 결합, 그리고 특이 시약에 의한 티올(thiol)결합은 물론 일차 아미노기와의 반응과 환원(reduction)이 수반하는 산화를 통한 탄화수소의 결합을 구성한다(Van Regemortel 1988). 담체는 전형적으로 천연유도 단백질, 예를 들어, 알부민(albumin), 오발부민(ovalbumin), 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis)로부터 유도 정제된 단백질 유도체(PPD), 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 아비딘(avidin), 디프테리아 독소(diphthria toxoid), 테타누스톡소이드(tetanus toxoid) 등이다.
면역화 계획은 종종 그리고 전형적으로 피하, 피내(subcutaneously, intradermally) 프로인트 컴플리트 보조액, 프로인트 인컴플리트 보조액, 에멀시겐(EmulsigenR),타이터터막스(TitermaxR), 알루미늄 수산화물 등을 포함하는 보조액과 함께 펩티드 담체 축합체의 근육내의, 피하(subcutaneously, intradermally) 수회 연속 주사를 수반한다. 오늘날 인간에게 사용하는 것이 허락된 유일한 보조액은 알부민 수산화물이다. 다소 새로운 형태의 보조액으로는 면역자극 복합물(immunostimulating complex)("Iscom")(Morein 1984)이 있고, 여기서 양친매성(amphiphilic)항원, 퀼 에이(quil A), 콜레스테롤, 지방, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholin)의 조합이 막의 바깥쪽으로 그 친수성 부위가 향하도록 구현된 항원이 있는, 작고(직경 35nm) 고도의 면역원성 성분의 형성을 유도한다. 이 방법은 특히 세균성(viral) 항원들과 함께 작용하는 것으로 제시되었다. 이스컴즈는 펩티드를 적절한 단백질(Larsson 1993)을 함유하는 미리 형성된 이스컴으로 화학적 방법에 의한 축합으로 펩티드 담체/보조액으로 사용될 수도 있다. 보조액으로서 기능을 하고, 합성펩티드와 같이 사용이 가능한 담체의 또 다른 형태는 지방A 그리고 펩티드와의 화학결합을 위한 반응기를 함유하는 리포좀이다(Friede 1993).
그러나, 면역원성 펩티드를 제조하는 방법들은 대체로 경험적이고, 정상적으로, 최적의 담체, 축합법 그리고 바람직한 면역반응의 유도를 위한 축합 밀도를 예측하는 것은 불가능하다. 비록 생산된 항체에 대하여 매우 중요할지라도, 펩티드 항원이 담체에 결합되는 것에 의하여 지향(orientation)되는 것과 같은 중요한 매개변수(parameter)는 조절되지 아니한다. 따라서, 본 발명에 의하여 극복되는 문제들은 다음과 같은 화학적인 일정성(defineability) 문제를 포함한다. :
1. 펩티드 대 담체의 비율은 약간의 어려움 속에서 아미노산 분석법, 방사성 측정 또는 정확한 분자량 결정에 기초한 평가에 의해서만이 측정할 수 있다.
2. 대부분의 화학에 있어서, 펩티드는 담체에 무작위 방향으로 결합되고, 이는 전하-분포와 펩티드 구조의 붕괴를 유도할 수 있는 펩티드 사슬을 따르는 다양한 수의 관능기 부착에 의한다.
3. 펩티드-펩티드 그리고 담체-펩티드-담체-펩티드 폴리머 형성은, 예를 들면 사이즈 익스클루젼 크로마토그라피(size-exclusion chromatography)에 의한, 후-반응(post-reaction)의 크린-업(clean-up)과 조합할 수 있는 반응 조건의 주의 깊은 사안별 최적화에 의하여만이 가능하다.
4. 천연적으로 유도된 담체 단백질은 화학적으로 전체적인 특정화가되어 있지 아니하였다.
5. 축합과정은 후-합성 단계를 더하고, 재료 손실을 증가시키면서, 펩티드-이뮤노겐 생성 소요시간을 증가시킨다.
6. 담체 단백질에 대하여 형성된 항체와 축합기는 문제를 야기할 수 있다.
7. 천연 유도된 담체 단백질의 "면역화" 품질은 매우 값비싸다.
끝으로, 일반적으로 천연유도(또는 재조합체) 담체-단백질은 면역원으로서 인체내 투입이 허용되지 아니한다.
본 발명에 따르면, 상기에서 언급한 문제는, 만약 담체가 고농도에서 펩티드 이뮤노겐을 발현하고, 필요한 티-세포 에피토프를 공급하고, 펩티드 형성을 지지한다면, 예를 들어 합성펩티드 담체에 결합된 합성펩티드와 같은, 합성 이뮤노겐을 사용함에 의하여 극복될 수 있다. 장점으로는 펩티드 담체 기초 고체-상 결합 펩티드 담체에의 직접적이고, 연속적인 합성가능성(후-합성 조작의 필요없이) 그리고, 예를 들어 오르토고날 화학에 의하여 서로 다른 물질이 결합하는 것과 펩티드의 방향조절을 가능하게 하는 것과 같은, 적용가능한 화학적 방법의 보다 큰 다양성을 포함한다. 또한, 담체 단백질에의 항체생성과 결합기는 피해진다.
고체상 합성에 의한 펩티드의 화학합성이 잘 알려져있다(Merrifield 1963, Atherton 1978). 펩티드는 C 말단으로부터 연속적으로 합성되고, 이는 특이적으로 쪼개질 수 있는 화학적 "결합체"에 의하여 불용성 고체상으로 결합된다. 합성이 완성된 이후에 펩티드는 링커의 쪼개짐에 의하여 이탈된다. 4분야의 화학이 조합된다. 첫째는 결합될 아미노산 알파-카르복실기(α-carboxylic group)의 활성화에 사용되고, 다른 2 분야는 각각 알파-아미노기와 곁-사슬(side-chine)을 보호하는데 사용되며, 네 번째는 펩티드와 고체상 링커의 변화를 조절하는데 사용된다.
한 실시예에서, 본 발명은 자유롭게 접근 가능한 수개의 기능기를 가진 올리고펩티드에 결합된 공지의 고체-상 펩티드 합성 폴리머를 구성하는 코폴리머와 관계한다. 상기 기능기에는 추가의 펩티드가 합성 또는 결합될 수 있고, 또한 다른 물질이 결합될 수 있다. 코폴리머에서의 펩티드의 합성은 공지의 고체-상 합성법에 의하여 수행될 수 있다. 합성 또는 결합 후에, 전체의 화합물은 쪼개지고, 용액에 도입되며, 공지의 방법에 의하여 정제, 분석될 수 있다. 또한, 펩티드의 결합은 연속적으로 될 수 있다. 그 복합물은 결합된 펩티드의 면역성을 상당히 높이면서 결합된 펩티드를 매우 효율적으로 제시할 수 있다. 따라서, 그 복합물은 단독으로 또는 이스콤 형성 시약(agents) 또는 다른 보조액과 함께 면역화 수단으로 사용될 수 있다.
완전한 화학적 정의를 위하여, 가능하면 천연원료로부터 항원을 유도하는 것보다 화학적으로 적절한 항원을 합성하는 것이 선호된다. 실시가능하기 위하여 그러한 합성은 경제적이어야 하고, 바람직한 순도의 항원이 실질적인 양만큼 유도되어야 한다. 그 같은 용이하면서도, 경제적으로 합성 가능한 항원은 짧은 펩티드, 즉 약30개미만의 아미노산 잔기 펩티드를 포함한다.
백신에서의 짧은 합성 펩티드의 항원으로서의 사용은 많은 장점이 있다. 이는 향상된 안정성, 재생산성, 낮은 생산비용, 그리고 비 변성(non-mutation) 에피토프의 선택 가능성을 포함한다(Shinick 1983 참조). 합성 펩티드에 대응하여 생성된 항체는 단백질의 미리 결정된 부분으로 향한다; 이는 다른 방법에서는 불가능하다. 또한, 항체는 단백질의 비면역원성(non-immunogenic)부분으로, 예컨데 탄화수소 또는 합텐(hapten), 향할 수 있다. 암, HIV를 포함하는 세균성 박테리아 그리고 기생(parasitic) 감염 등이 펩티드-기초 백신에 대하여 조사되었다.
기초 연구세팅에 있어서, 단백질은 그 유전자 배열이 알려져 있는 비동일인식(non-identified) 단백질에 대한 항체의 생산과 단백질에서의 위치 지도화를 위하여 사용될 수 있다. 백신 분야 있어서, 완전히 합성된 백신은 경제성, 고도의 배치 대 배치(batch-tobatch) 재생산성, 안정성의 향상, 불순물의 배재, 그리고 오로지 상기에서 언급한 특정부위의 병원균(pathogen)에 대하여만 지향되는 "클린(clean)"반응을 얻을 수 있는 가능성 등의 몇가지 장점이 있다. 그러한 합성구조는 또한 진단분석에서 항원으로 그리고 치료제로서 많은 적용범위를 갖는다.
그러나, 단일의 짧은 합성 펩티드에 의하여 배양된 전체 미생물에 대한 중화(neutralizing)반응은 단지 몇몇의 특정 경우에만 입증되었다. 이는 펩티드가 일반적으로는 면역원성이 아니기 때문이다. 즉, 그 자체로서 본질적인 면역반응(immune reaction)을 유도할 수 없기 때문이다. 짧은 펩티드는 완전한 면역반응을 담보할 수 있을만큼 충분히 크지 않은 것으로 여겨진다(세포반응은 물론 체액에서). 왜냐하면, 주요한 히스토컴페터빌리티(histocompatibility) 복합물이 결합 펩티드를 가지고 있지 아니하기 때문이다. 상기 결합 펩티드는 오른쪽 서열이 없고, 동시에 숙주세포에 대하여 수개의 에피토프를 발현하는(multivalency) 커다란 이뮤노겐에서 볼 수 있는 상승 또는 협력 효과가 결핍된다. 얻어진 항체는 전형적으로 친화성이 낮으므로, 짧은 펩티드의 형성은 수중 환경에서 매우 잘 정의되지는 아니한다.; 따라서, 그 결과적인 항체는 그 폴리펩티드 형성(enclose)에서 펩티드의 압축된 형성체로서 선택되어지지 아니한다. 이는 항-펩티드 항체와 대부분의 백신 적용에 있어서 그에 대응하는 단백질 유해(detrimental) 사이에서 바람직하지 못한 저도의 교차반응을 이끈다. 상기 백신적용에 있어서 항체-반응은 침입 병원균을, 예를들어 특정 독소에 결합하거나 또는 병원균이 숙주 조직에 결합하는 과정에서 임플리케이트(implicated)된 표면분자에 결합함에 의하여, 또는 직에 결합하는 과정에서 임플리케이트(implicated)된 표면분자에 결합함에 의하여, 또는 식세포(phagocytosis)를 위한 미생물의 제조하는 병원균-특정 항원에 결합함에 의하여 중화시켜야 한다.
수중 환경에서 그 구조를 유지하는 짧은 길이의 펩티드 설계( ca.. 30아미노산 미만)가 주된 과제이다. 짧은 펩티드의 구조는 펩티드의 구조적 자유를 제한하는 화학적 유도에 의하여 증가할 수 있다. 예를 들어, 시클리제이션, 또는 폴리머화(Robey 1992, Gilon 1991 참조), 또는 회전- 또는 α-나선 유도체(Kahn 1993, Unson 1984, Kemp 1990, Hind 1991, Dias 1993 그리고 Bambino 1994) 또는 킬레이트 금속이온과 같은 구조-뉴클리에이팅 물질의 사슬내에 포함하는 것이 이에 해당한다. 그러나, 물속에서 그 구조를 유지하는 능력을 갖는 유일한 하나의 비변형 펩티드는 동형- 또는 이형이량체 또는 올리고머로 응집하여 안정화되는 양친매성 알파나선이다(Mant 1993). 양친매성 나선은 그 축을 따라 바쪽 표면을 점유하는 비친수성 면을 가지고있고 다른 반쪽은 친수성 면이다. 양친매성 알파나선 구조는 전형적으로 비친수성면을 덮으면서 "번들(bundle)"로 결합하고, 친수성 면을 노출시켜 평행 또는 역평행 동형이량체(Zhu 1993) 또는 이형이량체와 올리고머를 형성한다(Zhu 1992).
본 명세서에서 아래와 같이 정의한다.:
단백질 담체란 그 스스로가 펩티드일 수 있는 하나 또는 그 이상의 모이어티의 담체로서 작용하는 펩티드를 구성하는 물질이다. 각각의 모이어티는 담체 펩티드의 아미노산 곁사슬을 포함하는 연결을 통하여 상기 담체 펩티드에 화학적으로 결합된다.
비수지성 펩티드 담체란 그 유도기의 어느 하나에 있어서 또다른 유사 또는 상이한 이중-유도 빌딩블록으로 치환된 어떠한 이중-유도 빌딩 블록을 함유하지 아니하는 펩티드 담체다. 상기 비-수지성 펩티드 담체는 최소한 2개의 유도 기는기를 제공한다.
비수지성 펩티드 담체 그리고 유도 비수지성 담체를 기술함에 있어서 다음의 용어가 사용된다.:
주쇄 펩티드는 비수지성 펩티드 담체 그 자체를 지칭한다. 분지-펩티드 또는 "분지-성분"은 유도되는 비수지성 펩티드 수송다체에 결합된 펩티드 또는 성분을 의미한다. 부착점은 유도화가 가능한 비수지성 펩티드 담체에서의 기능기를 의미한다.
지질성분은 카르복실 기능에 의해 아마이드(amide) 또는 에스테르(ester)로서 결합되는 알킬(alkyl) 또는 알케닐(alkenyl) 지방산으로 정의된다.
펩티드 합성을 위한 고체-상 링커는 두 개의 기능기를 가진 분자이다. 하나는 고상 폴리머에 안정적인 공유결합을 제공하는데 사용되고, 다른 하나는 펩티드 합성 중에 안정한 공유결합에 의하여 C-말단 아미노산을 부착하는데 사용된다. 상기의 아미노산 부착 연결은 펩티드 합성조건에서 안정하나 처리되는 화학물질에 따라 생성된 펩티드가 자유산 또는 C-말단으로 수정된 펩티드로서 이탈되거나 특정의 화학처리에 대하여 불안정성을 갖는다.
항원이란 티-세포 또는 특정의 항체에 반응하는 물질이다.
면역원(immunogen)이란 항체와 티-세포 반응을 포함하는 항원반응을 유도할 수 있는 물질이다.
면역매개자(immune mediator)란 면역체계의 활성을 조절할 수 있는 물질이다. 그같은 조절능력은 면역계의 하조절은 물론 면역계의 활성에 관한 것이기도 하다. 면역조절자(immunomdulator)는 면역매개자와 번갈아 사용된다.
부착분자(adhesion molecule)란 세포의 표면으로부터 유도되고 다른 특정세포의 표면에 결합능력이 있다. 셀렉틴(selectins)과 CAM분자가 부착분자의 예이다.
T-세포자극 펩티드, -항원, 단백질 그리고 T-세포 항원 등이 같은 의미로 사용되었고 면역화된 숙주세포에서 특정 T-림포사이트(T-limpocyte) 클론(clone)의 생성을 자극하여 그 결과 특정 T-림포사이트 클론과 반응하는 분자는 물론 티-림포사이트-미디에이티드 면역원성 반응을 초래하는 능력이 있는 분자를 의미한다.
B-세포 항원은 특정 비-림포사이트 클론과 반응성이 있는 분자이거나 또는 주제 또는 실험동물에서 B-림포사이트-미디에이트 면역원성 반응을 이끌어내는 분자이다.
양성(benign) 완충액은 생리학적으로 양립가능한 pH가 약 6 내지 약 8의 수용성 완충액으로, 염농도는 약 50mM 내지 약 500mM이며, 바람직스럽게는 약 100mM과 200mM이다.
펩티드와 폴리펩티드는 2개 내지 100개 또는 그 이상 길이의 아미노산의 폴리아마이드(polyamide) 사슬을 의미한다.
안정화된 또는 지지되는 2차구조는 문제되는 펩티드의 바람직스로운 구조적 상태로 정의되고, 펩티드를 구성하는 펩티드 결합의 회전을 제한하여 상대적으로 고정시키므로써 얻어지며, "모이어티 지지 이차구조"에 의하여 잘 정의된다.
펩티드 아미노산자기는 N-말단으로부터 셈하여 지고, N-말단이 1 이다.
펩티드와 폴리펩티드를 위한 연속배열은 아미노 말단에서 카르복실 말단의 순서로 주어진다.
모든 아미노산은 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되드시 표준의 1 또는 3자의 약자로서 나타내어진다
여기 사용되는 것과 같이, 천연 아미노산은 20개의 아미노산이고, 단백질에서 흔히 발견되는 L- 또는 D- 형태이다, 그 예로는 알라닌(alanine), 아스파틱산(aspartic acid), 아스파라긴(asparagine), 아르기닌(arginine), 시스타인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamin), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 이소류신(isoleucine) 류신(leucine), 리신(lycine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 타이로신(tyrosine), 트립토판(tryptophan), 그리고 알라닌(alanine)이다.
합성 아미노산은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 아니한다. D-형 그리고 L-형의 엡실론-아미노헥사노익산, 감마-아미노 뷰틱릭산, 알파-아미노 뷰티릭산, 알파-아미노 이소뷰티릭산, 알파-아미노아디픽산, 알로-트레오닌, 알로-이소류신, 7-아미노 헵타노익산, 노르류신(2-아미노헥사노익산), 노르발린(2-아미노펜타노익산), 델타- 아미노발러릭산(5-아미노펜타노익산), 11-아미노-언데카노익, t-뷰틸-알라닌, t-뷰틸-글리신, 감마-카르복시글루탐산, 시트룰린, 호모시스타인, 호모시트룰린, 호모아르기닌, 호모페닐알라닌, 델타-하이드록시리신, 4-하이드록시-프롤린, 이소아스파라긴, 이소글루타민, 이소세린, 페니실아민, 페닐글리신, 티록신, 오르니틴 등이다.
아미노산은 천연, 합성 양자를 모두 지칭한다.
PNA 또는 펩티드 핵산 물질은 그 분지 사슬내의 자연적으로 발생하는 DNA 또는 핵염기(nucleobases)를 함유하는 아미노산으로부터 선택된 합성 아미노산으로 이루어진 펩티드 사슬을 구성하는 분자이다(국제특허 95/01369).
본 발명은 면역원성 물질(immunogenic substance) 그리고/또는 면역매개자(immune mediator)의 담체로서 사용되기 위해 고안된 비수지성 펩티드, 면역원성 물질 및/또는 면역매개자를 수반하는 상기 담체의 구조, 상기 비수지성 펩티드 담체를 구성하는 높고 예측 가능한 면역성을 갖는 면역원(immunogen)의 제조를 위한 공정, 백신 생산을 위한 이뮤노겐의 용도와 펩티드 담체에 면역원성 물질 그리고/또는 면역매개자를 구성하는 백신의 용도에 관련된다. 본 발명은 또한 비수지성 펩티드 담체를 진단 또는 치료 조성물에 이용하는 진단 또는 치료의 실시예와 치료는 물론 질병과 임신의 진단에 이용하는 방법에 관계한다. 비수지성 펩티드 담체는 C-말단에 의하여 특이적으로 쪼개질 수 있는 "결합체(linker)"를 통하여 고체상으로부터 펩티드 담체가 방출되기 전에 그 위에 면역원성 물질을 합성 또는 결합하는 담체 펩티드의 제조를 위한 고체상 복합물의 형성하는 고체상에 결합된다.
도 1a는 면역원성 물질의 부착이전의 비수지성 펩티드 담체-고체상 복합물을 나타낸다.
도 1b는 보조단편이 부착된 비수지성 펩티드 담체-고체상 복합물을 나타낸다.
도 1c는 면역원성 분지 펩티드가 부착된 비수지성 펩티드 담체-고체상 복합물을 구성하는 분지 펩티드 구성물을 나타낸다.
도 1d는 이중 부착점에 결합된 보조단편을 구성하고 도 1c에 제시된 분지 펩티드 복합물과 유사한 것을 나타낸다.
도 1e는 도 1c에 제시된 분지 펩티드 복합물과 유사하나 분지 펩티드 선형 정렬내에 결합된 보조단편을 포함한다.
도 2a는 팔미틱산(조제품)(실시예 1참조)의 주쇄-펩티드에 대한 결합 이전의 HPLC-분석을 나타낸다.
도 2b는 팔미틱산(조제품)(실시예 1참조)의 주쇄-펩티드에 대한 결합 후의 HPLC-분석을 나타낸다.
도 3은 피손(Fison) 선형 모드 질량 분석계와 기질로서 알파-시아노(α-cyano) 4- 히드록시 시나믹산(cinnamic acid)을 사용하여, 실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조된 팔미톨화된(palmitoilated) 주쇄-펩티드(HPLC-정제된)에 대한 기질-보조 레이져 디솝션 타임-오브-플라이트(laser desorption time-of-flight) 질량분석을 나타낸다.
도 4a는 양분지 결합체 A를 나타낸다.
도 4b는 양분지 결합체B를 나타낸다.
도 4c는 트리팔미테이트 부분의 구조를 나타낸다. N -팔미토일-S-[2,3-비스 (팔미토일-옥시)-(2RS)]-프로필-[R]-시스타이닐(N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoil-dxy)-(2RS)]-propyl-[R}-Cyteinyl).
도 4d는 글리콜산 결합체를 나타낸다.
도 5는 펩티드의 희석 곡선에 대한 HIV-1 혈청양성의 항체 반응성을 나타낸다. gp41(aa598-609)은 각각 단독 또는 실시예 19에서 기술된 것과 같은 비수지성 펩티드 담체에 연결되어 테스트된다.
도 6은 비수지성 펩티드 담체 구조에 대하여 테스트된 HIV-2 혈청양성 공여체(-)와 HIV-2 혈청음성공여체(---)로부터 얻어진 혈청 희석곡선을 나타낸다.
혈청음성 대조 혈청이 테스트된 모든 희석액에 있어서 음부호인 반면에 테스트된 모든 HIV-2 혈청양성 혈청은 양부호가 얻어졌다.(실시예 19)
도 7은 비수지성 펩티드 담체에 결합된 펩티드와 단독의 펩티드에 대하여 테스트된 HIV-2 혈청양성 공여체와 HIV-2 혈청음성 공여체의 페널(panel)로부터 얻어진 혈청의 일정 희석으로부터의 결과를 나타낸다(실시예 19 참조). 혈청은 또한 재조합 단백질 HIV-2 gp36에 대하여 테스트 되었다. 모든 혈청양성 공여 혈청이 반응하였으나 혈청음성 대조 혈청의 반응은 감지되지 아니하였다.
도 8은 단독의 gp36 펩티드에 대하여 그리고 비수지성 펩티드 담체에 결합된 gp36 펩티드에 대하여 테스트된 HIV-2 혈청양성 공여체와 HIV-2 혈청음성 공여체로부터 얻어진 혈청 희석곡선을 나타낸다. 혈청은 또한 재조합 단백질 HIV-2 gp36에 대하여도 테스트 되었다. 펩티드는 비수지성 펩티드 담체에 결합되었을 경우 펩티드 단독인 경우와 비교할 때, 혈청양성 혈청의 높은 희석에서 인식되었다. 실시예19 참조.
도 9는 실시예 9에서 기술된 바와 같은 항체 생산에 의한 면역후에 비수지성 펩티드 담체 EBA 펩티드-PPD 축합에 대응한 쥐 생산 항체를 나타낸다. 3차 면역후에 가장 강력한 항체반응이 감지되었다. 알루미늄 수산화물의 흡착은 첫 번째 면역 이후는 항체 생산을 증가시켰으나, 2차, 3차 면역 이후에는 그러하지 아니하였다. (실시예 20 참조)
도 10는 유도 비수지성 펩티드 담체 EBA 펩티드 단독으로 복강내 면역후 또는 프로인트 보조액과 혼합된 유도 비수지성 펩티드 담체 EBA 펩티드로 면역후에 쥐의 EBA 펩티드에 대한 반응을 나타낸다. 항체 반응성의 수준이 분지 펩티드 구조와 프로인트 보조액을 혼합함에 의하여 높아졌다. (실시예 20 참조)
도 11은 비수지성 펩티드 담체로 유도된 이 펩티드를 사용한 면역과 프로인트 보조액과 함께 혼합한 면역후에 있어서의 gp120 펩티드에 대한 쥐의 반응을 나타낸다. 가장 강력한 항체 반응은 3차 면역후에 감지되었다.(실시예 20 참조)
도 12는 말라리아 기생체 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)으로부터의 항원으로 자극된 인간 단핵 세포로부터의 IL-6 분비의 저해도를 백분율로 나타낸다: (━━) 펩티드 담체에 결합된 베타-2-당단백질 펩티드에 의한 저해를 나타낸다.; (----) 단독의 펩티드에 의한 저해를 나타낸다. 2개의 다른 실험예를 나타낸다(실시예 22 참조).
도 13은 HIV gp120-펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 구조 형태2 (표1참조)의 HPLC 분석을 제시한다. 조생성물에 대한 HPLC 분석은 280nm(위), 220nm(아래) 로 하였다. "X"는 주사 정점이고, "Y"는 계 정점이며, "P"는 바람직스러운 생성물 정점이다.
도 14는 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 비수지성 펩티드 담체로 유도된 EBA 펩티드를 사용한 피하 면역에 반응하여 쥐가 IgG1을 생성하였음을 나타낸다.
도 15는 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 비수지성 펩티드 담체로 유도된 EBA 펩티드를 사용한 피하 면역에 반응한 쥐가 IgG2a를 생성하였음을 나타낸다.
도 16는 쥐가 프로인트 컴플리트 보조액과 함께 그리고 없이 HIV-1 gp120(aa152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체 펩티드와 혼합된 LERLLL HIV-1 펩티드 유도 비수지성 펩티드 + 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 LERLLL HIV-1 gp41 펩티드에 대한 IgG를 생산하였음을 나타낸다.
도 17은 쥐가 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 HIV-1 gp120(aa 152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하는 재조합 HIV-1 gp120에 대하여 IgG를 생산하였음을 나타낸다
도 18은 쥐가 프로인트 컴플리트 보조액과 HIV-1 gp120(aa 152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체와 혼합된 LERLLL HIV-1펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 재조합 HIV-1 gp120에 대한 IgG를 생산하였음을 나타낸다
도 19는 쥐가 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 HIV-1 gp120(aa 152-176) 펩티드를 사용한 피하 면역에 반응하여 HIV-1 gp120(aa 152-176)에 대한 IgG1을 생산하였음을 나타낸다
도 20는 쥐가 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 HIV-1 gp120(aa 152-176) 펩티드를 사용한 피하 면역에 반응하여 HIV-1 gp120(aa 152-176)에 대한 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다
도 21은 쥐가 HIV-1 gp120(aa152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체 펩티드와 혼합된 LERLLL HIV-1 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 LERLLL HIV-1 gp41 펩티드에 대한 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 22는 쥐가 HIV-1 gp120(aa 152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체 펩티드와 혼합된 LERLLL HIV-1펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 LERLLL HIV-1 gp41 펩티드에 대한 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 23은 생체내에서 CKNKEKKC- 그리고 KNGMLKGDKVS-유도 비수지성 펩티드 담체에 의한 LPS에 의하여 자극되는 TNF 분비의 저해를 나타낸다.
도 24는 쥐가 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 EBA 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 3차례 피하 면역에 반응하여 IgG를 생산하였음을 나타낸다. 그러나, IgG 반응은 프로인트 컴플리트 보조액과 쥐의 재조합 IL-10으로 혼합된 EBA 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 4차 면역이후에는 프로인트 컴플리트 보조액 단독으로 혼합된 EBA 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 4차 면역과 비교할 때 감소하였다.
도 25는 쥐가 서로 다른 쥐 재조합 사이토킨 또는 백반 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 L1 레이슈마니아(leishmania) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대한 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 26은 쥐가 쥐 재조합 TNF 또는 사이토킨 또는 백반 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG2a을 생산하였음을 나타낸다.
도 27은 쥐가 터프신 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 28은 쥐가 터프신과 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 29는 쥐가 서로 다른 감마-인터페론 특이성 펩티드 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 30은 쥐가 서로 다른 감마-인터페론 특이성 펩티드 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 31은 쥐가 서로 다른 감마-인터페론 특이성 펩티드와 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 복강내 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 32는 쥐가 서로 다른 감마-인터페론 특이성 펩티드와 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 복강내 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 33은 쥐가 재조합 TNF 또는 TNF 특이성 펩티드, 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 34는 쥐가 재조합 TNF 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 L1 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L1 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 35는 쥐가 TNF 특이성 펩티드와 함께 또는 없이, 또는 터프신과 함께 또는 없이 L2 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 L2 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 36은 쥐가 TNF 특이성 펩티드와 L2 레이슈마니아 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 한차례 단일의 피하 면역에 반응하여 L2 레이슈마니아 펩티드에 대하여 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 37은 쥐가 TNF 특이성 펩티드 또는 감마-인터페론 특이성 펩티드 또는 터프신과 HIV-1 gp120(aa152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 HIV-1 gp120(aa 152-176)에 대하여 IgG1을 생산하였음을 나타낸다.
도 38는 쥐가 TNF 특이성 펩티드 또는 감마-인터페론 특이성 펩티드 또는 터프신과 HIV-1 gp120(aa152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 첫 번째 그리고 3번째 피하 면역에 반응하여 HIV-1 gp120(aa 152-176)에 대하여 IgG2a를 생산하였음을 나타낸다.
도 39는 쥐가 IL-1 특이성 펩티드 또는 터프신과 함께 또는 없이, 또는 프로인트 컴플리트 보조액과 혼합된 HIV-1 gp120(aa152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 HIV-1 gp120(aa 152-176)에 대하여 IgG를 생산하였음을 나타낸다.
도 40은 쥐가 IL-1 특이성 펩티드 함께 또는 없이 HIV-1 gp120(aa152-176) 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역에 반응하여 HIV-1 gp120(aa 152-176)에 대하여 IgG를 생산하였음을 나타낸다.
도 41은 PPD에 축합된 펩티드와 보조액의 사용과 함께 또는 없이 비수지성 펩티드 담체(NDPC)에 결합된 펩티드를 사용한 면역후에 Tbp-펩티드에 대한 항체의 생성을 나타낸다. 분석은 ELISA에 의하여 실시되었다.
도 42는 PPD에 축합된 펩티드와 비수지성 펩티드 담체(NDPC)에 결합된 펩티드를 사용한 면역후에 PalA-펩티드에 대한 항체의 생성을 나타낸다. 비결합된 선형 펩티드가 면역 대조로 사용되었다. 분석은 ELISA에 의하여 실시되었다.
도 43은 PPD-결합 Tbp-펩티드 4에 대하여 생성된 모노클로널 항체를 사용한 서로 다른 구조(주쇄 펩티드 번호는 표 1참조)의 반응성을 나타낸다. 서로 다른 구조가 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 피복에 사용되고 모노클로널 항체를 사용하여 조사되었다.
본 발명의 목적은 미리 정의된 분자 배열, 배향, 그리고 확학식량에서 고농도의 생체 활성성분의 발현을 나타내는 일반적인 비수지성 담체 제공하는데 있다. 중심 펩티드 담체는 면역원성이 하지 아니하고, 그 구조는 모호하지 아니하다. 결합된 항원은 그 면역성을 상당한 정도 향상시키면서 매우 효과적으로 발현된다. 따라서, 그 화합물은 면역화 수단으로서 단독으로 또는 이스콤 형성 에이전트 또는 보조액과 함께 결합하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 정의된 올리고 펩티드(비수지성 펩티드 담체)는 하나 이상의 접근가능한 기능기를 구성하고, 나아가 하나 또는 둘이상의 위치에서 강력한 비친수성 성분, 바람직스럽게는 팔미틱산(palmatic acid) 또는 미리스틱산(myristic acid)과 같은 긴 사슬 지방산에 의하여 유도되어지고, 그 C-말단의 아미노산에 의하여 고체-상의 폴리머에 결합된다. 상기 올리고 펩티드에 있어서, 항원물질은 직접적인 결합 또는 "엔블록(en bloc)"결합에 의한 화학적 수단에 의하여 결합될 수 있다. 이는 고체-상으로부터 그 접촉 물질에서 쪼깨질수 있고, 특정될 수 있으며, 필요하다면 표준방범에 의하여 정제가능한 분지 복합물을 이룬다.
본 발명은 또한 분지 복합물은 물론 올리고 펩티드의 합성을 위한 방법을 구성한다. 비 수지성 펩티드 운반체는 활성 에스터(active esters) 또는 인 시투(in situ)/미리 활성된 아미노산(예를들어 NMP하에서 TBTU/HOBt/NMM), 아미노산 활성 에스터 또는 시메트릭 무수물(Atherton 1989)을 사용하는 표준 Fmoc-화학에 의하여 유도 가능하고, 합성에 사용되는 용매에 불용성인 다른 폴리머는 물론 폴리하이프(Polyhipe), 왕(Wang), 노바신(Novasyn)과 같은 상업적으로 유용한 폴리머를 포함하는 적절한 고체-상에서 합성될 수 있다. 고체-상 폴리머의 형태에 따라, 치환은 0.01 에서 0.1, 바람직스럽게는 0.05 에서 0.1, 보다 더 바람직스럽게는 약 0.05 메퀴발런츠 (mequivalents)/g고체-상이 될 것이다.; 전형적으로 노바신은 약 0.05 메퀴발런츠/g이다. HMB-링커(4-하이드록시-메틸 벤조산, 4-hydroxy-metyl benzoic acid), 히드록실기 약 0.150 메퀴벨런츠/g고체-상 함유하고 있는 상업적으로 유용한 노바신 KB 수지가 펩티드 결합에 유용하다. 0.05 메퀴벨런츠/g의 치환은 짧은 반응시간 동안 링커에 있어서 단지 히드록실기의 부분적인 치환만을 초래하면서 펩티드의 C-말단 아미노산 잔기의 에스테르화(esterification)에 의하여 얻어진다. 계속하여, 결합된 아미노산의 비보호 전에, 추가적인 자유 수산기는 에스테르화 촉매인 N, N-디메틸아미노피리미딘(dimethylaminpyridine)의 존재하에 과량의 아세트 무수물(acetic anhydride)과 함께 배양함에 의해 차단된다. 펩티드 합성후에, HMB는 자유산, 카르복아마이드(carboxamide), 아실하이드라진(acylhydrazine) 등을 형성하기 위하여 쪼개질 수 있다. 고체-상에의 펩티드 연결은 염기-쪼개짐 링커에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. 곁사슬의 오토고날(orthogonal) 또는 계단적 보호, 알파 아미노기의 보호 그리고 링커의 안정성을 고용하는 다른 체계가 이용가능하다. 바람직스러운 방법에 있어서, 리신 잔기는 예를 들어, Fmoc-K(Mtt)-OH, Fmoc-K(Dde)-OH 그리고 Fmoc-K(Aloc)-OH와 같은 그 엡실론(epsilon)-아미노기내에서 오토고널하게 보호된다. 여기서 곁 사슬 보호기는 1%의 TFA, 2%의 히드라진 그리고 Pd(0)(촉매적 수소화반응)에 의하여 제거 가능하다. 합성후에, 알파 아미노 지방-결합과 선택적인 리신-곁 사슬 디마스킹(demasking), 분지 펩이드 또는 성분의 합성 또는 결합은 주쇄 펩티드에 있는 다른 아미노산의 곁 사슬내의 언마스크된(unmasked) 기능기로부터의 간섭의 위험부담 없이 완성가능하다. 만약 비보호상테에서 사용된다면, 분지 펩티드 합성 도는 결합의 과정에서 카르복실릭 활성 종(species)의 생산 또는 존재 때문에, 이 곁사슬 카르복실기는 분지 펩티드의 합성 또는 결합의 과정에서 생산되는 다른 아미노기, 또는 주쇄 리신잔기의 아미노기와 함께 락탐(lactam)을 형성할 것이다.
또한, 선호되는 것은 리신에 대하여 "C" 비부착 위치에서 Boc-보호 리신은 물론 리신 부착 지점에서 선택적으로 쪼깨지는 두 가지의 보호형태를 갖는 주쇄 펩티드 수소담체이다.
특히 선호되는 것은 고체-상 주쇄 펩티드 복합물로서, 리신 잔기에서 선택적으로 보호되는 서브그룹(subgroup)은 비보호 이후에 부착점울 구성하고, 고체상 링커는 물론 다른 모든 보호기들은 동일한 화학처리에 의하여, 바람직스럽게는 적절한 스카빈저(scavenger)와 95%의 TFA, 쪼개진다.
이러한 형태의 또 다른 바람직한 실시예는 벤질 에스터(benzyl ester) 곁-사슬 보호 아미노산과 Boc-화학을 포함하고, 여기서 펩티드는 HMB, 3-니트로-4-(2-히드록시에틸) 벤조산(3-nitro-4-hydroxyethyl benzoic acid)(NPE), 4-니트로벤조페논옥사임(4-nitrobenzophenone oxime)과 같은 염기-불안정 링커 또는 산-안정(acid stable) 2-브로모프로피오닐-알파 메틸펜아실 에스테르(2-bromopropionyl-α methylphenacyl ester)와 같은 광-쪼개짐 물질에 연결된다. 또한 상기 실시예는 치환된 벤질에스터(클로로메틸 페닐, chloromethylphenyl 또는 4-히드록시메틸아세트산, hydroxymethylphenacylacetic acid(PAM)), HF-쪼개짐 또는 상기에서 언급한 알파-브로모-펜아실 형태의 광쪼개짐을 유도하는 벤질하이드릴아민
(benzylhydrylamine)유도체(예를들어 4-메틸벤질 히드릴아민,
4-methylbenzylhydrylamine), 3-니트로-4-히드록시메틸 벤조익산
(3-nitro-4-aminmethylbenzoic acid, ONb)과 같은 전형적 Boc-링커와 조합된
Fmoc- 화학(tBU 그리고 BOC 곁-사슬 보호)을 포합한다.
양 방법 모두 약한 친핵기(아더톤, Atherton, 1989)의 존재하에 Pd(0)에 의한 촉매적 수소화에 의하여 쪼깨질 수 있는 히드록시-크로토닐(crotonyl) 형태의 링커와 사용 가능하다. 특별히 유용한 링커로는 글리콜릭산 유도체와 같은 물-쪼개짐성 성분들이 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 비-수지성 리포펩티드(lipopeptid) 담체를 구성한다("주쇄"). 바람직하게는 알파 아미노 결합 지방산이 있는 10 내지 50의 아미노산이 존재하고, 바람직스럽게는 팔미틱산(palmitic acid) 또는 미리스틱산(myristic acid), 또는 트리팔미테이트(tripalmitate)-Cys(제4도 (다)) , 그리고 그 C-말단의 카르복실 기능에 의하여 적절한 고체-상에 특이적으로 깨어지는 링커에 의하여 공유결합되었다.
바람직하게는 이러한 형태의 펩티이드가 고체상에 결합된 염기-쪼개짐성 HMB- 링커에 합성될 수 있다. 리신(K), Boc(tert-butoxycarbonyl-)에 대하여 산-불안정 곁사슬 보호에 사용된다. 보호된 고체-상 결합 펩티드 사슬의 합성 이후에, 아미노-말단의 Fmoc-기는 피퍼리딘(piperridine)처리에 의하여 제거되고, 팔미티산은 대칭의 무수물로서 또는 NMP하에서 TBTU/HOBt/NMM에 의하여 카이저 테스트(Kaiser test)에서 음성일 때까지 결합된다. 계속하여, 리신은 TFA/물(95%. 1시간, 상온) 또는 TFA/DCM(50%, 6×30분, 상온)에 의하여 곁-사슬-비보호되고 이후의 사용, 또는 건조와 저장에 앞서 광범위하게 새척된다. 고체상-에의 최적 적하농도는 전형적으로 고체상의 기능기 초기 농도 보다 낮다. 적하농도는 에스테르화 단계에서(일차 아미노기의 고체상에의 결합) 인큐베이션(incubation) 시간을 변화시킴에 의하여 조절된다; 짧은 인큐베이션 시간은 낮은 적하농도를 가져온다. 노바신 수지를 사용함에 있어서 0.05 에서 0.1밀릴그램등량(milliequivalents)/g고체상 범위가 최적 임이 밝혀졌다.
분지-성분을 에칭한 이후에, 그 복합물은 수성 수산화나트륨과 쪼개짐에 의하여 자유산으로서 자유로와 질 수 있다. 메타놀 암모니아(methanolic ammonia)와 쪼개짐에 의하여, 펩티드 아마이드는 이탈될 수 있고, C-말단의 아미드는 알파-나선 구조(α-helical)를 지지한다는 관점에서 더욱 장점이 된다. DMF 또는 NMP내에서 하이드라진과 함께 쪼개짐은 펩티드 히드라지드를 유도한다.
리포펩티드 주쇄는 수 개의 자유롭게 접근 가능한 기능기를 함유하고, 바람직하게는 아미노기이며, 바랍직하게는 2개이상이고, 펩티드 사슬을 따라 균형되게 공간배치된다. 이 구조의 변형에 있어서, 리포펩티드 주쇄는 기능기로서 카르복실레이트를 포함한다. 한편, 또 다른 변형에 있어서 기능기로서 티올(thiol)이 함유된다. 또 다른 변형에 있어서는, 카르보닐(carbonyls), 할로아세틸(haloacetyls), 히드라지드(hydrazides) 알파-옥사실(α-oxacyl), 아미노 옥시아세틸(amino oxiacetyl, 예를 들어 히드록실아민), 시스타인, 말레이미드(maleimide)-기가 일차 아미노기로부터 화학적 수단에 의하여 유도된다. 항원체, 또는 다른 분자들은 단계적 또는 엔 블록(en bloc) 으로 이들 주쇄-펩티드기에 결합될 수 있고, 펩티드/탄화수소/합텐(haptens)일 수 있다. 펩티드는 일차 곁-사슬 위치된 아미노기, 바람직하게는 리신의 에타-아미노기 또는 오르니틴(orinithine)의 델타-아미노기로의 단계적 화학합성에 쉽게 이용가능하다. 이들 기는 또한 화학선택적인 비보호 펩티드, 틴화수소, 또는 다른 적절한 기능기를 함유하고 있는 물질의 라이게이션(ligation)(아래 참조)의 표적으로서 기능할 수도 있다. 앤 블록 결합은 단백질과 단백질, 펩티드와 펩티드를 축합하는 기술분야의 전문가에게 널리 알려져 있는 화학적 수단에 의하여 결합될 분자내의 곁-사슬 기능성의 일시적인 보호방법을 포함하여 수행될 수 있다. 바람직스러운 결합 수단은 다음을 포함한다: 글루타릭알데히드(glutaric aidehyde)(아미노산과 티올기에의 결합), 카르보이미드(carboimide, 아미노기에의 결합),
엠-말레이미드 벤조일-엔- 하드록시수시니미드 에스테르
(m-maleimid benzoyl-N-hydroysuccinimide)(아미노-와 티올기로부터 티올기로의 결합), 일차 아미노기와의 반응과 환원이 수반하는 산화에 의한 탄화수소, 엔-수시니이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트- (SPDP-) 방법
(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate-)(반 레겐모르텔,
Van Regen-mortel, 1988)에 의한 티올과의 결합.
바람직스러운 일시적인 보호수단은 시트라코닐레이션(citraconylation)(일차 아미노기의 보호, 낮은 pH에서 방출되는 보호기)와 Fmoc-수시니미드(일차 아미노기 보호, 그 보호기는 피퍼리딘에 의하여 방출된다.)에 의한 Fmoc-유도를 포함한다. 또한 곁-사슬 차단 합성 펩티드는 유기용매에서 카르복실-활성에 의한 결합에 더하여 그와 같은 수단에 의하여 결합되어질 수 있다. 엔 블록 결합을 위한 수단의 바람직한 기는 "화학선택적인 라이게이션"(Tam, 1995)이다. 왜냐하면, 이들 수단들은 비보호 단편, 특히 펩티드, 그리고 특히 합성펩티드의 결합에 사용될 수 있기 때문이며 나아가 결합-극성 또는 -지향성이 조절되는 것을 허락하기 때문이다. 이들 수단들은 MAPs(루, Lu 1991)와 TASPs(국제특허 95/04543)을 포함한 펩티드 스카폴드에 펩티드를 결하보하는데 사용되었다.
바람직스러운 화학선택적수단의 전형적인 예는 티올 친핵기와 적절한 일렉트로 필릭(electrophilic)기의 반응이다. 그러한 반응의 하나는 할로아세틸기, 바람직하게는 클로로아세틸, 그리고 보다 바직스럽게는 브로모아세틸기와 일킬티올과의 반응으로 매우 안정된 티오이터(tioether) 결합의 형성을 이룬다(웨첼, Wetzel 1990, 로비 Robey 1992). 알킬티올기는 펩티드 또는 결합 시스타인에 의하여 다른 분자내의 어디든지 도입될 수 있고, 할로아세틸화는 일차 아미노기에서 할로아세트산 무수물과의 반응에 의하여 쉽게 수행된다(로비 Robey 1992). 그것은 또한 펩티드 합성과정에서 형성된 유도체와 곁-사슬로서 이미 상호결합된 할로아세틸을 사용하여 도입될 수 있다(이바노프, Ivanov 1995). 바람직스러운 실시예에 있어서, 할로아세틸은 고체상에 부작된 리포펩티드 주쇄 펩티드에 있는 자유 에타-미노기에 도입되고, 부착될 펩티드 또는 분자는 바람직한 위치에서 시스타인과 함께 변형된다(루, Lu 1991 그리고 탐, Tam 1993). 유사하고 또한 바람직스러운 반응은 아실티올기(acylthiol)(티올 카르복실레이트)와 할로아세틸기와의 반응에 의하여 얻어지고 이에 의하여 티오에스터(thioester)가 형성된다(쉬넬쳐, schnolzer 1992). 아실티올기는 결합될 펩티드의 C-말단에서 형성된다(일반적으로 알려진 고체-상 펩티드 결합에 의하여(야마시로, Yamashiro 1988)); 이 방법에 의하여, 시스타인이 도입될 필요가 전혀 없다. 티오 에스터는 자연상태 그리고 기본 pH-값에서는 불안정하다(탐, Tam 1995). 그러나, 만약 그 반응이 N-말단 시스타인과 아실티올기 사이에서 발생한다면 자발적인 재정렬은 안정한 아미드 결합과 시스타인 곁-사슬의 재형성을 유도한다(다우손, Dawson 1994). 티올기는, 바람직스럽지 않다면, 공지의 방법에 의하여 차단(알킬화)될 수 있다. 티올기와의 또다른 선택적인 반응은, 안정한 티오에스터를 이루면서 말레이미드기(첨가반응)를 포함한다. 말레이미드기는 고체-상 펩티드 합성중에 일차 아미노기의 아실화 또는 N-말단체로서의 결합에 의하여 도입될 수 있다(탐 1995).
또한, 새로운 이황산염을 유도하는 티올-이황산염 교환반응은 SPDP-결합체계에 있어서 바람직할 수 있다(칼슨, Carlsson 1978). 비록 공유적일지라도, 물론 이러한 결합은 환원조건에서 매우 민감하고, 분자의 계획적인 방출에 사용될 수 있다. 화학선택적인 반응의 또 다른 바람직스런 예는 상대적으로 안정한 히드라존(hydrazone)을 이루는 알데히드와 약염기의 반응이다. 바람직스럽게는 안정한 치환된 하이드라진으로 환원될 수 있는(탐, Tam 1995) 상대적으로 안정한 하이드로존을 유도하는 알데히드와 히드라지드(아실하이드리진, acylhydrzine)의 반응 또는 안정한 옥심을 유도하는 알데하이드와 하이드록실아민의 반응(로즈, Rose 1994). 이들 반응은 환원 탄화수소 또는 마일드하게 산화된 탄화수소(단량체, 이량체, 올리고머, 폴리머 또는 과요오드산염에 의하여 산화된 글리코축합의 일부로서)의 선택적인 결합에 사용딜 수 있다. 히드록실아민 또는 히드라지드와 과요오드산염-산화 N-말단 세린, 트레오닌(threonine) 또는 시스타인(펩티드내 N-말단의 알파-옥소-아실기의 선택적인 도입을 유도하는 이러한 산화에 특히 민감하다.) 반응은, 바람직하기로는 세린에 존재하는 아미노산, 히드록실아민 또는 히드라지드 함유 펩티드와 다른 펩티드의 N-말단()과의 화학 선택적인 결합을 유도한다(로즈, Rose 1994, 가트너 Gaertner 1992). 아실-치환 히드라진(히드라지드)은 HMB-링커에 의하여 고체-상에 결합된 고체-상 펩티드내에서(히드라지드) 히드라진에 의한 링킹 에스터를 쪼개는 것에 의하여 도입될 수 있다. 또한, 아실하이드라진은 Boc-모노히드라지드 수시닉산 또는 4-Boc-히드라지노벤조익산과 일차 아미노기와 함께 자유 일차 아미노기에 유도함에하여여 도입될 수 있다. 히드록실 아민은 일반적으로 보호 아미노옥시아세트산과의 반응에 의하여 도입된다(탐, Tam 1995). 또 다른 방법에 있어서, 카보닐기는 보호 아세탈 알카노익 산에 의하여 일차 아미노기에 도입된다(HF에 불안정하고 따라서 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-방법으로 제한된다.). 특별하고 바림직스러운 방법은 알데히드와 N-말단 시스타인의 반응을 티아졸리딘(thiazolidine)을 생성하도록 한다. 이 방법의 특히 유용한 면은 결합된 펩티드에 구조적인 안정성("견고성")을 제공하는 이형시클릭 링을 유도한다는 것이다.
상기에서 기술한 결합 화학의 예들로부터 본 발명에 있어서, 항원은 많은 수의 기능기를 통하여 결합될 수 있고, 항원은 비-수지성 주쇄 펩티드에 어떠한 원하는 방향으로도 결합할 수 있다; 또한, 천연 유도펩티드는 물론 합성 펩티드(보호 또는 비보호)가 다른 항원은 물론, 특히 탄화수소 결합할 수 있음이 명확하다.
본 발명의 컴플리트 분지 복합물은 물론 리포펩티드 비수지성 주쇄는 수성조건에서 고도로 정돈된 구조를 형성하도록 고안되었다. 특히 바람직스럽고 청구된 실시예는 실시예1에서 연구되었다. 올리고펩티드의 아미노산 서열은 올리고펩티드에 대하여 양친매성 평행 알파-헬리스(동형이량체 이중나선)를 형성하고자 하는 경향을 주는 반복 "헵타즈"의 개수에 의해 정의된다. 이는 다음의 고안 고려에 기초한다:
도치(facing) 잔기로서(a 그리고 d 위치) I, L 그리고 V가 바람직하다. 정상과 바닥의 잔기로서는(e 와 g 위치) D, E, K, R, H 가 각각 바람직하다. 바깥잔기(비상호 관계)(b, c, 그리고 f 위치)는 예를들어 락탐-브리지 형성, 히스티딘 킬레이션, 그리고 부착위치를 포함하는 다른 상호작용에 유용하다. 일반적으로 평행 어셈블리(assembly)에 바람직하게 보이고, 유사-전하된 e 와 g 쌍이 존재할 지라도 강력한 소수성 상호작용이 허락된 때는(예를들어 I-L), 동형이량체화가 바람직하다. 그러나 반대전하된 e-, g- 쌍은 호모이량체 형성을 선호한다.
이량체 이중나선은 생체내에서의 사용이 적절하지 아니한 농도 의존성이다. 본 발명의 목적은 보다 더 안정화하는 물질, 전형적으로는 지방성분을 도입하여 농도의존성배제하거나 약화시키는 것이다.
기본 헵타드는 VAKLEAK 로서 선택되었다. V 와 L 은 a 와 d 위치에서 상호작용하는 사슬-대-사슬에서 큰 소수성분을 구성한다. E 와 K는 평행 전입을 선호하면서 e와 g위치에 반대 전하를 공급한다. 매우 높은 나선성 잔기 A는 나선의 바깥으로 곁-사슬 부착점을 형성하는 K 사용되는 c를 제외한 그 위치의 나머지를 점유하고 있다.
기본 서열은 응용 서열로 수정되었다:
abcdefgabcdefg
Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY,
알파-앤-부착 팔머틱산을 표시하는 Palm".
펩티드는 안정된 나선형성을 위하여 요구되는 최소한를 길이를 갖는다(2회전). HX3H는 나선-지시 그리고 -안정화 금속-착화지점을 형성하기 위하여 헬릭스-외부 에서 비스-아-비스(vis-a-vis) 각각 2개의 분리 회전에서 2회전 헬릭스를 형성하기 위하여 도입되었다. N-말단 전하는 알파-앤-부착 팔미틱산에 의하여 차단되고 C-말단 전하(이는 또한 알파-나선 거대쌍극자와 상호작용한다)에, 예를들어 아미드, 의하여 바람직스럽게 차단된다.
C-말단의 GKGKY-서열이 부가되나, 전하를 차단하는 알파-나선 C-말단 캡핑(capping)서열로서 작용한다. 나아가, 이 비-구조적 스트레치(stretch)는 C-말단 잔기를 통하여 나선-안정성에 영향을 미침이 없이 다른기에 결합될 수 있다. Y는 280㎚흡착 리포터(repoter)로서 포함되고, K-잔기는 부착기로서 포함된다.
다른 바람직스러운 고안에 있어서, g위치의 K-잔기는 다른 잔기로의 분지사슬가지 부착에 이어지는 비보호 이후에 g위치에서 안정화 양전하를 유지하기 위하여 선택적으로 보호된다.
또 다른 바람직스러운 실시예에 있어서, b-위치는 또한 나선 외부에 보다 많은 부착점을 허용하도록 K-잔기에 의하여 점유된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 나선을 안정화하는 락탐-브리지는 H잔기를 E/K쌍으로 치환함에 의하여, 헵타즈의 어느 하나에서 연속하는 b 와 f 위치의 외부-잔기 사이에서, 바람직하게는 N-말단하나, 형성된다. 이는 이들 곁-사슬의 오토고널 보호하고, 고체-상에 여전히 부착된 펩티드와 함께 실험실 조건에서 BOP/DIEA 또는TBTU /HOBt/ NMM 또는 유연(analogous) 활성방법에 의하여 락탐-형성에 영향을 미치게 함에 의하여 쉽게 완성된다.
이 복합물의 구조는, 구조의 지방부분에 의한 소수성 부위와의 상호작용과 보다 증진된 마이셀러구조로의 자기 응집에 의하여 주변으로 부착 항원체의 고농도 발현을 유도한다. 상기 두 경우 모두 낮은 농도일지라도 이량체 구조를 유지한다.
또한, 부착 펩티드 항원의 밀접한 전입은 펩티드에서의 본질적인 구조적인 특성을 지지하고, 그에 의하여 펩티드 구조와 폴리펩티드 서열의 일부로서 동일한 펩티드의 구조와의 유사성을 향상시키는 인접 사슬과의 상호작용을 허락한다. 이는 천연 에피토프를 짧은 합성 펩티드로 모방하는 기술분야에서 주된 관심사이다. 예를들어 T-세포 자극 펩티드와 같은 추가적인 펩티드("보조" 펩티드)가 도입될 수 있다.
따라서, 그 구조는 전적으로 합성된, 완전히 화학적으로 정의된 이뮤노겐을 나타낸다. 펩티드 담체 부분(리포펩티드 주쇄) 그 자체는 유도되어질 때 면역원성이 아니다. 리포펩티드 주쇄의 특성은 표준 고체-상 화학방법에 의하여 합성될 수 있다는 것이다. 그리고 항원, 펩티드, 탄화수소 또는 합텐 그리고 천연유도 또는 합성 분자들은 미리 제조된 고체-상 결합 리포펩티드에 공지의 기술에 의하여 결합될 수 있다. 그리고 펩티드는 고체-상 결합구조에 공지의 고체상 펩티드 합성방법에 의하여 직접적으로 결합될 수 있다. 고체-상으로부터의 이탈에 이어서 전체 복합물은 안정한 집합체를 형성하고 이는 HBLC에 의하여 분석되고 면역화에 이용될 수 있다. 부착된 펩티드는 올리고펩티드 리포펩티드로부터의 저해 없이 연속적일 수 있다. 이스콤-형성 기질과 함께 형성될 때, 그 복합물은 그 지방부분에 의해 이스콤-막에 삽입되어 외측에 분지 구조를 나타낸다.
고체상 화학의 특별한 변형에 있어서, 동시 합성되나 자유 펩티드는 물론 펩티드- 폴리머 결합 양자의 각각 방출이 이루어질 수 있다. 이는 종종 자유 펩티드로 면역화 후에 얻어진 항체의 반응성 시험에 이용가능하다. 다른 바람직한 실시예에 있어서 리포펩티드 구조는 아미노-말단을 만들도록 설계되었다. 이는 분자의 지방 부분을 내부 아미노산의 곁-사슬에 결합함에 의하여 이루어진다. 이 지방-결합 곁-사슬은 바람직스럽게는 리포펩티드의 말단 또는 그에 가까이 위치한다.
또 다른 배치에 있어서, 기본 구조는 추가(보조)펩티드(T-세포 에피토프, 터프신 또는 다른 이뮤노모듈레이트 물질)에 리포펩티드 등의 전체 부분이거나 또는 결합 항원의 일부로서 결합된다. 본 발명의 변형에 있어서, 구조는 또한 호지성막으로 상호결합될 수 있는 루프-모방을 생성하면서 펩티드 항원이 선서열에서 루프(loop)로서 결합되도록 고안되었다. 또 다른 실시예에 있어서, 탄화수소가 단순히 호지성막에 부착하는 앵커(anchor)로서 기능한다. 이러한 설에 있어서, 펩티드는 온화하게 산화된 탄화수소에서 카보닐기와 고도로 반응성이 있는 히드라지드로서, 그리고 T-세포 에피토프, 터프신 또는 다른 이뮤노모듈레이팅 보조 펩티드를 상호결합하는 펩티드 서열로서 합성될 수 있다. 펩티드 히드리지드는 4-히드록시메틸벤조익산 링커를 히드리진과 쪼개므로써 얻어진다.
다른 구조의 실시예에 있어서, 특이적인 "펩티드 핵산염"("PNA")서열 또는 DNA-상호작용 물질이 DNA의 특이적인 부분의 결합을 목적으로 교잡에 의하여 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기의 구조를 항원성의 분지에 대하여 항체를 유도하는 면역화에 사용하는 것외에, 상기 구조의 분석은 물론 치료적으로 사용하는 것을 구성한다.
본 발명은 또한 발명에 따라 고체상 복합물의 펩티드를 이용하는 진단의 실시예, 상기 펩티드를 함유하는 진단 조성물, 그리고 질병과 임신의 진단에 있어서 상기의 발명을 이용하는 방법에 관계한다. 나아가 본 발명은 백신 성분이 이뮤노게제가 연결된 고체-상 복합물 펩티드를 구성하는 백신 그리고 상기 백신 성분을 이용한 동물 면역화와 질병에 대한 저항성에 대한 검토에 관계한다.
본 발명의 또 다른 중요한 면은 고체상 복합물의 펩티드에 치료 시약이 연결되어 있는 치료성분, 치료성분을 함유하고 있는 치료 조성물과 질병의 치료 그리고/또는 예방 또는 면역반응의 조절을 의한 그 용도에 관계한다.
본 발명의 임상적인 진단 실시예는, 발명의 진단성분을 형성하는 고체-상 복합물의 펩티드에 연결된 진단제가 라벨과 같은 적절한 수단과 함께 진단성분에 결합을 통하여 특정 분자의 존재를 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 종양성 질병, 악성 종양, 그리고 자기면역질병 등의 탐지는 물론 박테리아, 바이러스, 그리고 기생체에 의한 감염성 질병의 진단에 관계한다. 나아가, 본 발명은 임신을 지시하는 분자 또는 그로부터 유도된 분자에 결합력이 있는 분자를 발명의 펩티드에 연결함에 의하여 임신의 진단에 사용될 수 있다. 그리고 이러한 면은 본 발명의 또 다른 흥미있는 부분이다.
본 발명인 고체-상 복함물의 펩티드에 연결되는 진단시약은 어떠한 분자도 가능하다. 그것은 천연적으로 유도되었거나, 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 특별히 흥미로운 것은 폴리펩티드, 탄화수소, 지방, 그리고 상기의 어떤 글리코실레이티화된 또는 리피데이티드된 형태, 또는 종양성 질병, 자기면역 질병 그리고 감염성 질병 등을 포함하는 질병 또는 임신을 지시, 또는 유도된 분자에 결합력이 있는 핵산염 서열의 연결이다.
탐지의 전형적인 수단으로서 직접적 또는 간접적으로 탐지할 수 있는 방사성종, 효소활성 또는 아비딘(avidin)/비오틴(biotin)과 같은 다른 마커 리간드(maker ligand), 그리고 합텐/항-합텐 탐지 체계를 이용할 수 있다. 바람직스러운 진단 실시예에 있어서, 환경에 바람직하지 못한 영향을 끼칠 수 있는 방사성 또는 약제들 보다는 알칼리성 인산효소(phospotase) 또는 과산화효소와 같은 효소택(tag)을 이용하는 것을 희망한다. 예컨데 효소택은 종종 분광측광으로 많은 경우 가시광선 영역에서 쉽게 탐지가능한 비색 지시제를 사용한다. 발광성 기질 또한 감도를 높이기 위하여 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에서 특히 흥미있는 실시예는 진단제로서 항원의 사용이다. 면역 분석과 백신 제조 양자에 있어서, 공지의 면역원성 폴리펩티드 또는 탄화수소의 단편으로부터 항원을 제조하는 것이 종종 가능하고 훨씬 유용하다. 특정 에피토프 영역이 전체 항원 폴리펩티드 또는 탄화수소에 의하여 야기되는 것과 유사한 반응을 초래하기 위해 사용될 수 있다. 잠재적인 항원 또는 이뮤노겐 영역은 예를들어 키트-두리틀 항원성 분석(Kyte-Doolittle, 1982 U.S. 특허 제4,554,101호)과 같은 몇몇의 접근에 의해 확인될 수 있다. 비친수성 분석은 평균적인 비친수성 값을 각각의 아미노산 잔기에 할당하고 이 값들로부터 친수성이 계산되며 최대 친수성을 갖는 영역이 결정된다.
바람직스러운 이뮤노분석은 당해 기술분야에 알려진 이뮤노블라트(immunoblot)법 등의 이뮤노분석(ELISAS)에 연결된 다양한 형태의 효소를 포함하므로써 완성된다. 그러나, 유용성이 그 같은 분석에 제한되지 아니함이 쉽게 평가되고, 유용한 실시예는 방사성이뮤노분석(RIAs) 그리고 다른 비효소 연결 항체 결합 분석 또는 공정을 포함한다. 본 발명의 다른 이뮤노분석 실시예는 이뮤노침강 분석, 응집반응 분석 등에 기초할 수 있다.
본 발명에는 임신 또는 질병의 진단 방법이 포함된다. 한 실시예에 있어서, 항체-기초법은 질병이 있거나 임신상태로 추정되는 환자로부터 샘플을 얻는 것, 그 샘플을 진단되어질 질병의 지시 또는 그로부터 유도되고 최종적으로 항체의 반응성을 결정하는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 에피토프, 탄화수소 등이 연결된 발명의 진단성분에 노출, 그리고 최종적으로 생체내에서 하나 또는 그 이상의 그러한 항체의 반응성을 결정하는 것을 포함한다.
측정되어진 본질적인 면역반응은 질병의 존재 또는 부존재를 지시한다. 환자로 부터 얻을 수 있는 전형적인 샘플은 인간 혈장, 혈장, 전체혈액, 뇌척수액, 정액 또는 질액, 삼출액 등을 포함한다.
항원-기초 방법의 몇몇 변형은 개발을 위하여 완성된다; 예를들어 하나 또는 수 개의 본 발명의 펩티드에 부착된 에피토프를 단독으로 또는 항원으로서 다양한 조합에 의해 사용하는 간접적인 ELISA. 항원의 최적농도는 체커 보드(checker board) 적정과 에피토프가 유도된 폴리펩티드 또는 탄화수소와 같은 에피토프 또는 전체 분자의 진단 포텐셜에 의하여 결정되어진다. 그 분석은 예를들어 질병의 다른단계에 있는 실험동물로부터의 혈청 테스팅에 의하여 보다 더 조사되어지거나 또는 개선될 수 있다. 이 결과는 각각의 분석에 있어서 혈청 전화에 대한 상대적인 시간 과정을 지시할 수 있다.
또한, 본 발명은 진단 성분을 형성하는 펩티드에 연결된 특정의 선택된 진단제에 결합하는 폴리펩티드, 탄화수소 또는 핵염산 서열 포함하면서 진단성분과 그에 결합력이 있는 분자 사이의 특이적 결합을 탐지할 수 있는 방법과 함께 분자의 탐지를 위한 키트(kit)를 제시한다. 적절한 수단의 예는 진단성분 또는 진단성분에 대하여 특이성을 갖는 이차적인 항체에 직접 부착된 라벨(lable)을 포함한다. 선택적으로, 아비딘-비오틴 중개 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 결합이 사용될 수 있다. 예를들어, 모노 클로널(monoclonal) 항체가 효소 또는 형광성 복합물로 복합된 아비딘과 반응할 수 있도록 비오티닐기화(biotinylated)될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예는 고체-상 복함물의 펩티드에 연결된 항원에 직접적으로 상응하는 항체의 탐지를 위한 키트와 관련된다. 키트에 대한 항원은 폴리펩티드, 탄화수소, 지방 또는 상기의 부분 또는 천연원 또는 인위적인 합성으로 핵산염 서열 일 수 있다. 선택적으로, 항원은 대장균(E. coli) 또는 다른 바이러스 또는 비 바이러스성인 숙주내의 재조합 DNA 백터에 의하여 생산되어질 수 있다. 분석을 위한 샘플은 인간 또는 다른 동물의 체액 또는 다른 조직 샘플일 수 있다. 샘플내의 반응성 항체의 존재는 진단성분에 결합되는 항체에 의하여 입증된다. 항원-항체 복합물 탐지는ELISA, RIA, 형광성, 응집과 침전 반응, 비탁법(nephelometry), 또는 아비딘-비오틴 반응을 이용하는 이들 분석법중 어느 하나에 의한다. 반응도는 대조 샘플과의 상대적 비교에 의하여 측정될 수 있고, 반응도는 현재 또는 과거의 감염 또는 질병의 측정에 이용될 수 있다. 그 분석은 치료의 효율 결정과 같이 질병의 진행과정에서 반응성을 기록하는데 이용될 수 있다.
"본질적인 면역학적 반응성"이란 한편으로는 항체/항혈청 사이의 현저한 면역학적 결합, 다른 한편으로는 진단성분의 농도는 물론 물리화학적 지표의 관점에서 잘 정의된 조건하에서의 진단성분을 의미하는 말이다. 따라서, 본질적인 면역학적 반응성은 항체/항혈청과 진단성분 사이의 비특이적 상호작용과 명확히 구별될 수 있어야 한다. 이러한 구별은, 예를들어, 항체/항혈청과 그 이전에는 항체/반혈장과 반응하지 아니하는 것으로 제시된 진단성분을의 일정 농도와 반응시키는 것에 의할 수 있고, 이 반응은 부대조로 사용된다. 정대조는 적절하게는 항체/항혈청과 같은 농도의 진단성분과의 반응일 수 있다. 상기 진단성분은 면역화에 사용되어 항체/항혈청의 생산한다.
"에피토프" 는 T-임파구 또는 항체의 항원 결합부위에 특이적으로 결합하게되는 항원의 특정부위를 의미한다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의하여 연결되는 적어도 2개의 아미노산을 구성하는 분자로 이해된다.
따라서 "폴리펩티드"라는 단어는 전통적인 폴리펩티드(100개 이상의 아미노산 잔기)는 물론 작은 펩티드(10개 이하의 아미노산 잔기), 올리고펩티드(10 내지 100개의 아미노산 잔기), 단백질(적어도 하나의 펩티드 그리고/또는 프로스테틱기(prosthetic) 그리고/또는 리포폴리펩티드 그리고 글리코폴리펩티드와 같은 글리코실레이션 그리고/또는 지방화를 포함하는 기능체). 발명의 분지 폴리머에 연결을 위한 흥미있는 폴리펩티드는 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있는 재조합 폴리펩티드 이다.
단독으로 사용되거나 또는 조합하여 본 발명의 펩티드에 다른 분자의 연결에 사용될 수 있고, 그 연결이 본 발명의 중요한 면을 구성하는 특히 흥미있는 분자는 특정 T-세포 반응에서의 면역반응조절에 있어서 중요한 기능을 갖는 사이토킨 또는 생체 활성 사이토킨 서열과 같은 매개자 또는 이뮤노모듈레이터이다.
특히 흥미 있는 면은 재조합체의 사용이다. 재조합체는 합성 제조된 것 또는 천연 매개자로서, 예를들어 사이토킨, 또는 이스콤과 같은 이뮤노겐 복합물 또는 미립자와 같은 다른 담체와 적어도 하나의 다른 분자가 연결된 본 발명의 펩티드와 함께 삽입되었을때, 사이토킨 활성을 갖는 상기의 일부분이다. 다른 조합은 사이토킨을 수반하는 이뮤노겐 복합물 또는 분지 펩티드-구조를 갖는 이뮤노겐 복합물과의 혼합에서 사이토킨 활성을 갖는 상기의 일부분일 수 있다. 또한 그것은 이뮤노모듈레이터의 활성부위가 다른 펩티드와 조합하여 연결되는 본 발명의 펩티드를 지닌 이뮤노겐 복합물일 수 있다. 적절한 사이토킨에는 인터류킨(interleukin) 1- 18, TNF (종양 괴사 인자), 림포톡신(limphotoxine), 그리고 인터페론 알파, -베타, -감마 등이 있다. 선택적으로, 사이토킨 활성을 갖는 생체활성 사이토킨-특정서열은 본 발명의 펩티드에 연결된 서열의 일부일 수 있다.
면역원성 제제가 발명의 고체상 복합물의 펩티드에 부착된 백신성분을 사용하여 제조된 백신 조성물 역시 본 발명의 일부이다. 백신성분의 양은 박테리아 바이러스 또는 기생체과 같은 감염제에 대하여 감염된 것으로 여겨지는 인간을 포함하는 동물에 대하여 과거에 감염 유기물에 노출된 적이 없는 동물에서의 저항도와 비교하여 본질적으로 향상된 저항을 보일 정도로 효과적인 양이다. 따라서, 본 발명은 백신성분의 제조를 위한 이뮤노겐 성분의 사용과 감염 유기물에 대하여 발명인 백신 조성물을 사용하여 인간을 포함한 동물의 면역화 위한 방법에도 관계한다.
적절한 면역원성 제제에는 폴리펩티드, 탄화수소, 지방 또는 핵산염 서열이 단독 또는 상기에서 언급한 이뮤노모듈레이터 또는 백신성분에 대하여 이뮤노겐 효과를 높일 수 있는 화학 합성물과 같은 다른 성분과, 선택적으로 함께, 다양한 조합을 포함한다. 본 발명의 흥미있는 부분은 서로 다른 감염 유기물로부터 유도된 이뮤노겐제의 다양한 조합을 포함하고 이에 의하여 몇몇 감염 유기물에 대한 증가된 저항성을 나타낼수 있는 백신 조성물이 얻어지는 것이다.
백신 조성물은 선택적으로 약제적으로 유용한 담체 또는 수송체와 선택적으로 보조액 구성하는 백신과 조합에 의하여 형성될 수 있다.
"감염에 대하여 본질적으로 향상된 저항을 수여"한다는 것은 백신 조성물의 동물에 대한 투여가 감염제로 감염되므로써 야기된 질병이 예방되거나 감소되는 효과 또는 최소한 질병에 걸릴 위험성이 현저히 감소되는 효과를 가지고 있음을 의미한다.
전형적으로는, 발명에 따른 백신 조성물은 액체 용액 또는 상등액으로 주사할 수 있게 제조된다; 용액 또는 상등액내 용도에 적당한 고체 형태, 주사에 앞선 액체가 제조될 수 있다. 제조는 에멀션화될 수 있다. 백신 조성물은 종종 약제적용 가능하고, 활성의 저하제와 길항하는 엑시피언츠(excipients)와 혼합된다. 적절한 엑시피언츠로는, 예를들어, 물, 염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올 등과 상기의 조합물이 있다. 나아가, 바람직스럽다면, 백신 조성물은 백신 조성물의 효과를 증진시키는 웨팅(wetting) 또는 에멀션제, pH 완충제, 또는 보조액과 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
백신조성물은 주사에 의하여, 예를들어 피하 또는 근육내로, 투여된다. 다른 투여 형태에 적절한 추가 형식화는 좌약, 그리고 어떤 경우, 경구 형식화를 포함한다. 좌약에 있어서, 전통적인 결합체와 담체는, 예를들어 폴리알칼렌글리콜(polyalkalene) 또는 트리글리혈청이드(trigycerides)를 포함한다; 그러한 좌약은 활성의 저하제를 0.5% 내지 10%, 바람직스럽게는 1% 내지 2% 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 형식화는 약제적인 등급의 만니톨(mannitol), 락토스(lactose), 스타치(starch), 마스네슘스티아레이트(magnesium stearate), 소디움 사카린(sodium saccharine), 셀룰로우즈(cellulose), 마그네슘 카르보네이트(magnesium carbonate) 등과 같은 정상적으로 사용되는 엑시피언츠를 포함한다. 이러한 조성물은 용액형태, 상등액, 테블렛(tablet), 알약, 캡슐, 또는 지속적인 방출 형식화 또는 분마의 형태 이고 10% - 95%, 바람직하게는 25%-70%의 활성 저하제를 함유한다.
백신 조성물은 중성 또는 염 형태로 형식화 될 수 있다. 약학적으로 받아들여지는 염은 산첨가 염(펩티드의 자유 아미노기와 형성된)을 포함하고, 예를들어 염산 또는 인산과 같은 비유기산, 또는 아세트옥살산, 주석산, 만델릭 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 자유 카르복실기와 형성된 염은 또한 비유기적 염기, 예를들어 소디움, 칼륨, 칼슘, 또는 수산화물, 그리고 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸 아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
백신 조성물은 용량 형식화에 경쟁하는 방법으로 투여되고, 그 정도의 양으로서 치료에 효과적이고, 이뮤노겐할 것이다. 투여될 양은 예를들어 항체를 합성하는 개개인의 면역체계의 능력 그리고 바람직스러운 보호의 정도를 포함하며 처리될 주체에 의존한다. 투여될 활성 저하제의 정확한 양은 실무자의 판단에 의한다. 그러나, 인간에 대한 적절한 투여량은 바람직하게는 1㎍ 내지 500㎍, 특히 바람직하게는 10㎍에서 50㎍ 범위를 사용한 백신화에 대한 수백 ㎍의 활성 저하제의 주문이다.
초기 투여에 대해 적절한 용법과 효력상승을 위한 방법은 또한 다양하나 초기투여에 뒤이은 계속적인 접종 또는 다른 투여에 의하여 특징된다.
적용의 방법은 폭넓게 변형될 수 있다. 백신 투여에 관한 공지의 방법이 모두 적용가능하다. 이는 코를 통한 적용 또는 다른 적절한 체피에의 적용을 포함하여 주시 등에 의한 생리학적으로 받아들어질 수 있는 분산 또는 경구 적용 포함한다. 백신의 투여℃량은 투여 경로에 의존하고, 숙주의 크기에 따라 다양하다.
본 발명의 백신 조성물에 대하여 보조액 효과를 얻기 위한 다양한 방법은 알루미늄수산화물 또는 인산염(백반) 일반적으로 사용되는 인산염 완충염에서의 0.05 내지 0.1% 용액, 0.25% 용액으로 사용되는 당의 합성폴리머와의 혼합물(카보폴, Carbopol), 각각 70℃ 내지 101℃의 온도 범위에서 30초 내지 2분간 열처리함에 의한 백신내 단백질의 응집과 같은 시약을 포함한다. 펩신처리 항체(Fab)를 사용한 재활성에 의한 알부민과 응집, C. 파르붐(C. pabrum)과 같은 세균 세포 또는 내톡신 또는 그램 음성 세균의 리포 폴리사카라이드 성분과 같은 세균 세포와의 혼합, 생리학적으로 받아들어질 수 있는 만니드 모노-올레인산염(mannide mono-oleate)(아라셀, Aracel A)와 같은 기름 운반자내에 에멀션, 또는 차단 치환으로 사용되는 퍼플루오로카본(perfluorocarbin)(플루솔, Flusol-DA) 20% 용액에 에멀션에 의한 응집이 적용될 수 있다.
많은 실시예에 있어서 다수의 백신 투여가, 일반적으로 6 백신화를 넘지 아니하고, 보다 보편적으로는 4 백신화넘지 않으며, 바람직스럽게는 2 또는 3 백신화, 바람직할 것이다. 정상적으로는 면역화는 2 내지 12 주의 간격으로 있게 되며, 보다 일반적로는 3 내지 5주 간격이다. 1 내지 5년 일반적으로는 3년의 기간에서 주기적인 강화는 항체의 수준을 유지하는데 바람직하다. 면역화 과정은 항원에 대한 항체의 분석이 뒤따른다. 그 분석은 방사성 핵산염, 효소, 형과물질 등과 같은 공지의 표식에의한 표식화에 의하여 수행된다. 이러한 기술은 공지이다.
본 발명의 백신이 면역체계의 양 분야를 활성화 시키는데 효과적이어야 한다. 따라서, 세포-매개 면역반응을 유도할 수 있는 백신이 본 발명의 일부를 이룬다. 적어도 하나의 감염제에 대하여 백신을 본 발명에 따라 이용하여 인간과 같은 포유동물을 포함한 동물을 활동적으로 면역화하는 방법 또한 본 발명의 일부이다. 그 방법은 대체로 본 발명 백신의 이뮤노겐 유효량을 동물에 투여하는 것으로 구성된다.
본 발명은 나아가 감염성, 종양성 또는 자기면역 질병과 같은 질병의 처리 또는 예방 능력이 있는 적어도 하나의 치료제 또는 치료 및 예방제(prophylatic)가 연결된 고체상 복합물의 펩티드를 구성하는 치료성분과 관련된다. 치료제는 유산치료 및 예방제제으로 활성이 있는 또는 질병의 예방 또는 재발 분석, 또는 임신의 예방 또는 유산에 있어서 시약으로 활성이 있는 어떤 것이든지 포함한다. 그 시약은 폴리펩티드, 글리코펩티드, 리포펩티드, 인지질, 지질다당류(lipoplysaccharide), 탄화수소, 핵염산 서열 또는 상기의 조합 또는 변형일 수 있다.
본 발명의 특히 흥미있는 실시예에서, 치료성분은 적어도 하나의 이뮤노게겐 물질 또는 치료 또는 치료 및 예방제의 효과를 조절 또는 향상 시킬수 있는 이뮨 매개자와 조합하는 하나 또는 그 이상의 치료 또는 치료 및 예방제를 구성한다. 이뮤노겐 물질 또는 이뮨 매개자는 탄화수소 또는 펩티드 또는 천연, 합성 또는 재조합적 으로 유도될 수 있는 핵산염과 같은 어떤 분자일 수 있다. 또한 매개자는 화학화합물일 수 있다.
발명은 또한 본 발명의 치료성분을 함유하고 있는 치료 조성물에 관계한다. 동일한 또는 서로 다른 질병, 또는 유산의 예방 또는 치료할 수 있는 능력의 하나 또는 그 이상의 치료 조성물을 구성하는 치료 조성물이 본 발명의 또 다른 면을 구성한다. 또한, 본 발명은 질병의 예방과 치료, 또는 임신의 예방과 유산에 사용되는 치료 조성물의 용도에 관련된다. 치료 조성물은 근육내, 피하, 피내, 경구, 코 그리고 정맥내를 포함하는 편리한 방법중 하나에 의하여 투여될 수 있다.
본 발명의 이 부분에서 흥미있는 면은 적어도 하나의 매개자 또는 매개자 활성을 갖는 그 일부와 조합된 면역자극 복합물과 같은 담체에 부착된 치료 성분을 포함하는 치료 조성물을 구성한다. 매개자 또는 매개자 활성을 갖는 그 일부는 본 발명 펩티드에 연결될 수 있고, 나아가 치료성분을 가진 면역자극복합물과 동일하거나 또는 다른 면역 자극 복합물에 부착될 수 있다. 특히 흥미있는 매개자는 인터류킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 또는 면역조절자 활성을 가진 상기의 일부를 포함하는 사이토킨과 같은 면역조절자를 포함한다.
본 발명의 이 부분의 또 다른 흥미있는 면은 신체의 특정 위치에 존재하는 표적 분자에 결합력이 있는 분자가 부착됨에 의하여 치료성분이 그 효과를 발휘하는 상기의 특정 위치로 치료성분을 지향하는 치료성분을 구성한다. 표적 분자에 결합할 수 있는 분자는 치료제의 활성을 표적화하는 수단을 제공한다. 표적 분자에 지향되고, 그에 결합력이 있는 항체는 그 같은 분자의 흥미있는 실시예를 구성한다.
본 발명의 또 다른 면은 자기면역 질병이 발전할 위험성이 높은 집단이 설립된 이후에 자기면역 질병의 재발 방지와 치료, 종양성 질병, 감염제에 의한 감염성질병의 예방을 위한 약제 조성물에 관련된다. 상기 조성물은 치료제 또는 다양한 치료제의 조합이 연결되는 본 발명의 분지 폴리머를 구성한다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 수용가능한 부형제에 기초한 공지 수단에 의하여 형식화 될 수 있다.
나아가, 본 발명은 감염제, 자기면역 질병 또는 종양성 질병의 치료, 예방 또는 사멸을 위한 약제 조성물의 용도에 관게한다.
비수지성 펩티드는 보조액 또는 프로인트 보조액와 같은 보조액, 알루미늄수산화물과 조합하여 또는 면역자극 복합물(이스콤) 또는 리포좀에 삽입하여 그리고 삽입 없이 사용될 수 있다.
면역화 목적으로, 쥐 균주(동계교배 그리고 이계교배), 토끼, 기니아 돼지, 밍크 기타 동물들이 사용될 수 있다. 인간과 동물 양자 모두 비수지성 펩티드에 의하여 백신화 될 수 있다. 면역화의 횟수와 간격은 변경될 수 있다. 본 발명에 따르는 비수지성 펩티드 담체-이뮤노겐 복합물은 복강(ip.), 피하(sc.), 근육(im.), 정맥(iv.), 경구(oral.), 코(nasal.), 항문(anal.), 질(vaginal.) 등으로 면역화 목적에 사용될 수 있다. 이뮤노겐 펩티드의 서로 다른 양이 사용될 수 있다. 나아가, 비수지성 펩티드 담체-이뮤노겐 복합물은 건망증(amestic) 반응의 유도를 위해 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
한가지 면에서 본 발명은, 예를들어 C-말단에 의하여 특이적으로 쪼개질 수 있는 링커를 통하여 펩티드 담체-고체상 복합물을 형성하는 고체-상에 결합된 비수지성 펩티드 담체에 관계한다. 바람직하게는 비-수지성 펩티드 담체는 고체-상, 그에 결합되는 이뮤노겐 물질을 구성하는 펩티드 복합물로부터 이탈 후에 양성(benign) 완충액내에서 2차구조를 형성할 수 있는 약 10-50의 아미노산을 구성한다. 양성 완충액내에서의 2차구조는 고체-상으로부터 이탈되었을 때 비-수지성 펩티드의 안정적인 담체를 이룬다. 비-수지성 펩티드에 결합된 이뮤노겐 물질은 그에 공유결합된 항원 물질을 포함한다.
2차구조는 그 조합은 물론 알파-나선, 베타-사슬, 베타-회전, 감마-회전, 징크-핑거구조로부터 선택되어진 어떤 구조일 수 있다. 그 구조의 일차적인 기능은 이뮤노겐 물질이 안정적이고 예측가능한 형태로 외부로 배출되는 것을 보호하는 것이다. 따라서, 주어진 환경조건에서 이뮤노겐 물질의 적절한 배향을 제공하는 이차구조도 본 발명의 범주에 있다.
양친매성 알파-나선는 일반적으로 잘 연구되었고(만트, Mant 1993), 수중에서 잘 정의된 구조를 유지하는 상대적으로 짧은 펩티드 구조이다. 양친매성 나선는 그 축을 따라 나선의 반쪽을 점유하는 소수성 면과 다른 반쪽의 친수성면을 갖는다. 양친매성 알파-나선는 전형적으로 소수성면을 보호하고 친수성면을 노출시켜 평행 또는 역평행 동형이량체를(주, Zhu 1993) 또는 이형이량체 그리고 올리고머(주, Zhu 1992)를 형성하는 "번들(bundle)"로 결합한다.
양 친매성 나선는 일반적으로 알파-나선의 주기성에 의하여 명령된 "헵타즈"에 의하여 특징되어진다. 여기서 위치 a,b,c,d,e,f 그리고 g는 몇가지의 단순한 법칙을 따르면서 아미노산에 의하여 점유된다; 위치 a,와 d는 소수성 아미노산잔기(특히, 류신(leucin), 이소류신(isoleucine), 그리고 발린(valine), 그리고 보다 적은 양의 알라닌(alanine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 그리고 트립토판(tryptophane))에 의하여 점유된다. 반면에 다른 위치는 프롤린(proline)과 글리신(glycine)을 제외한 어떤 다른 잔기에 대하여 자유롭다; 높은 나선 경향이 있는 잔기로의 치우침이 있을 수 있다 (알라닌, 아르기닌(arginine), 류신, 리신(lysine), 메티오닌, 글루타민(glutamine), 그루탐산, 이소류신).
특이적이고 잘 알려진 금속이온 안정화된, 조성 구조는 DNA-결합 단백질의 특성을 지배하는 "징크-핑거"이다.
이는 다음의 일반구조 Y, F-X-C-X2,4-C-X3-F-X3-H-X3,4-H를 지닌다. 여기서 X는 어떤 아미노산이 될 수도 있다(크리첵 Krizek 1991). 그리고 아연이온(Zn++)이 2개의 다른 가닥인 C 와 H 잔기에 의하여 사면체로 결합되어 있다. 그 결과 아연 지지 ββα-구조는 수중에서 안정하다. A 26 아미노산 잔기 컨센서스(consensus)-서열은 크리첵에 의하여 정의되었고(1991)(PYKCPECGKSFSQKSDLVKHQRTHTG), 비안치(Bianchi 1995)에 의하여 펩티드 사슬을 따라 치환에 대한 알파-나선의 안정성을 조사하는 조합 목록를 창조하기 위하여 사용되었다. 스트루터(Struther 1996)등은 아연-핑거 서열에 기초한, 그러나 아연-지지를 필요로하지 아니한 구조적으로 안정한 23 아미노산 잔기를 고안하였다.
하나의 실시예에 있어서, 펩티드 담체는 양성 수성 용액하에서 단량체 초-이차 헤어핀 구조에서 회전에 의하여 연결되는 2개 알파-나선의 분자내 역-평행 정렬 양친매성 나선을 형성하는 비-수지성 펩티드 형태로 되어있다.
비수지성 펩티드는 구리 이온(Cu++), 코발트 이온(Co++), 아연 이온(Zn++), 칼슘 이온(Ca++), 니켈 이온(Ni++), 그리고 카드뮴 이온(Cd++)으로부터 선택된 2가 금속이온의 착화에 의하여 안정화되는 것이 바람직스럽다.
일반적으로 비수지성 펩티드 담체의 2차구조는 하나 이상의 알파-나선, 베타-사슬, 회전 또는 아미노산의 서열을 유도하는 징거-핑거가 각각의 또는 상기의 조합으로 포함되는 결과에 의하여 얻어진다.
하나의 실시예에 있어서; 2차구조는 차단을 형성하는 구조 핵산염화 분자에 의하여 유도되어질 수 있다.
1) 알파-나선 유도체 아미노이소뷰티르산(aminoisobutyric acid), 티아메틸렌 브리지(thiamethylen bridge)와 HX3H과 함께 아세틸프로필프롤린, 탄소에 의하여 교체될 수 있는 H-잔기, 2가의 금속이온 착화; 그리고
2) 2가 금속이온을 착화하는 베타-사슬 유도체 4-(2-아미노에틸)-6-디벤조푸란(4-(2-aminoethyl) 6-dibenzofuran) 그리고 디아실아미노에핀도리디온(diacylamino
epindolidione) 그리고 HXH, 탄소로 교체 가능한 H 잔기의 어느 하나; 그리고
3) 2가 금속이온을 착화하는 베타-회전-유도체 (S)-알파-메틸프로린 그리고 HX2H, 탄소에 의해 치환가능한 H잔기의 어느 하나; 그리고
4) 프로린 및 티아조리딘과 같이 차단을 형성한하는 일반적인 안정화 분자
그 밖의 실시예에서, 펩티드는 그 C-말단에 의하여 평행한 펩티드 2분자를 나타내는 양분지 분자에 연결된다. 양분지 분자는 당해 기술분야에서 오르니틴 또는 리신으로 알려지기도 한다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따르는 비-수지성 펩티드 담체는 알파-나선 형태의 평행 동형이량체를 생성한다.
한 실시예에 있어서, 이뮤노겐 물질의 부착을 위하여, 본 발명에 의한 비-수지성 펩티드 수송체는 적어도 2개 부착 지점이 있고, 일반적으로 유도할 수 있고 접근 가능한 기능기로 정의된다. 이들 기능기는 히드록실아민(hydroxylamine)-, 아미노(amino)-, 히드로지(hydrozy)-, 티올(thiol)-, 할로아세틸(haloacetyl)-, 카르보닐(carbonyl)-, 알파-옥소아실(-oxoacyl)-, 1,2-티올아민(thiolamine)-, 아실히드리진(acylhydrazine)-, 알킬티올(alkylthiol)-, 아실티올(acylthiol)-, 카르복실레이트-기, 그리고 상기의 혼합물을 포함한다. 부착점의 수는 최종 생산물의 이뮤노겐 물질의 바람직한 개수에 일치하여 선택된다. 따라서, 비수지성 펩티드는 적어도 4개 또는 펩티드의 길이에 따라 가능한 바람직한 개수의 부착점을 구성한다.
부착점은 기술분야에서 잘 알려진 기능기일 수 있다. 바람직한 부착점은 ε-아미노기 또는 리신과 자유 α-아미노기 곁-사슬의 유도 ε-아미노기로부터 선택되어진다. 한 가지 면에 있어서, 본 발명에 따르는 비-수지성 펩티드 담체는 부착점으로서 최초 부착점인 리신잔기의 ε-아미노기에 결합된 리신잔기의 ε- 그리고/또는 α-아미노기를 구성함에 의하여 더블-기능의 부착점을 이루고, 나아가 리신잔기를 다기능 부착점으로 유도한다. 양기능 부착점의 작용기의 하나, 또는 다기능 부착점의 작용기중 적어도 어느 하나는 한 가지 관점에서 차단될 수 있다. 그 차단은 Fmoc- 그리고 Boc- 쪼개짐 화학처리 양자에 오토고널한 것과 같은 화학처리에 의하여 쪼개질 수 있는 보호기에 의할 수 있다. 그 보호기는 Dde(1-(4,4-디메틸-2,6-디옥시클로헥실리딘)-에틸-) 그리고 Aloc(allyloxycarbonyl)과 같은 아릴 보호기를 포함한다.
상기 기술된 공정의 장점은 알파-아미노 보호와 곁-사슬 기능성-보호 그리고 고체상 연결, 각각에 대하여 소위 "오토고날"한 기법의 도입이다.
"오토고널 화학"은 다른 부분의 쪼개짐을 위한 화학적 처리에 대해 안정한 보호기의 한 형태를 의미하고 그 역도 마찬가지이다. 하나의 매우 잘 알려진 기법은 알파-아미노 보호기로서 염기-불안정 플루오레닐-메톡시카르보닐
(fluorenylmethoxycarbonyl)((Fmoc) 그리고 곁-사슬에 대한 산-불안정 보호기 그리고 산-불안정 "링커"를 적용한다. 예를들어 산, 염기, 물, 등에 대한 등급화된 불안정성을 갖는 링커의 범위가 알려져 있다. 이는 자유산 또는 특이적인 유도체로서의 펩티드의 이탈을 유도하고, 가장 전형적으로는 아마이드이다.
또한, 본 발명에 의한 비-수지성 펩티드 담체는 C-말단 아미노산에 부착되는 곁-사슬에 위치하는 두 개 또는 그 이상의 아미노기를 구성한다.
그 이상의 실시예에 있어서, 본 발명에 의한 비-수지성 펩티드는 다른 리신잔기와 자유 알파-아미노기의 곁-사슬에 있는 에타-아미노기의 서브클래스를 구성할 수 있다. 상기의 서브클래스는 Fmoc- 그리고 Boc- 쪼개짐 화학처리 양자에 오토고널한 화학처리에 의하여 쪼개질수 있는 보호기에 의하여 보호되는 적어도 하나의 아미노기를 구성한다.
한 가지 면에서, 부착점으로 작용하는 아미노기는 다음으로부터 선택된 화학적 수단에 의하여 유도될 수 있다.
1) 이-산 무수물(di-anhydrides)처리, 바람직하게는 자유 곁-사슬 카르복실산을 만들기 위한 숙신무수물 그리고,
2) 할로아세트산 무수물 처리, 바람직하게는 자유 할로아세틸기를 얻기 위한 브로모아세트산 무수물, 바람직하게는 브로모아세틸기, 그리고
3) 활성 말레이미드 처리, 바람직하게는 자유 말레이미드기를 얻기 위한 엠-말레이미드벤조일-엔-히드록시수시니미드에스터(m-maleimide benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) 또는 자유 피리딜디티오(pyridylditio)기를 얻기 위한 SPDD 처리, 그리고
4) 자유 티올기를 얻기 위한 카르복시-활성 알파-아미노-보호 시스타인 처리, 그리고
5) 자유 1, 2 티올-아미노기를 얻기 위한 알파-아미노기의 비보호가 수반하는 자유 티올기를 얻기 위한 카르복시 활성 알파-아미노 보호 시스타인 처리, 그리고
6) 자유 분지-사슬 카르복실기를 얻기 위한 글루타믹 또는 아스파틱산 처리, 그리고
7) 자유 히드록실아민을 derldnl한 아미노-옥시아세틱 처리, 그리고
8) 알파-아미노 비보호 이후에 교대로 자유 알파-옥시아실로 산화될 수 있는 자유 1, 2-아미노 알콜을 얻기 위한 알파-아미노 보호, 카르복시-활성 세린 처리, 그리고
9) 자유 아실-치환 히드라진를 얻기 위한 Boc-모노 히드라지드의 처리
본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체는 또한 다음으로부터 선택된 2차구조 지지, 유도가능한 빌딩(building) 차단, 부착점으로 작용하는 곁-사슬 기능기를 구성한다.
1) 2가의 금속이온을 착화하고 H-잔기의 어느 하나가 탄소에 의하여 치환가능한 알파-나선 유도체 아미노이소뷰트릭산, 티아메틸렌 브리지(thiamethylen bridge)와 HX3H를 함유하는 아세틸 프로필프로린, 그리고
2) 2가의 금속이온을 착화하고 H-잔기의 어느 하나가 탄소에 의하여 치환가능한 베타-회전-유도체 (S)-알파-메틸프로린 그리고 HX2H; 그리고
3) 2가의 금속이온을 착화하고 H-잔기의 어느 하나가 탄소에 의하여 치환가능한 베타-사슬 유도체 4-(2-아미노에틸) 6-디벤조퓨란
(4-(2-aminoethyl)6-dibenzofuran) 그리고 디아실아미노에핀돌이디온
(diacylamino-epindoline) 그리고 HXH; 그리고
4) 프로린 그리고 티아조리딘(thiazolidine)과 같은 차단 형성을 일반적으로 안정화하는 분자
한 실시예에 있어서, 부착점으로 작용하는 비-수지성 펩티드의 곁-사슬 기능기는, 도 4a와 도 4b에서 공개되는 구조로부터 선택되는 양분지 잔기와 함께 유도될 수 있다. 한가지 면에서, 비-수지성 펩티드는 적어도 2개의 자유 카르복실산 또는 C-말단 아미노산에 부착되는 곁-사슬에 위치하는 아미노기, 바람직하게는 리신, 또는 C-말단 아미노산 가까이에 부착된 상기 곁-사슬을 구성한다. 상기 비-수지성 펩티드는카르복실산에 의한 것이 아닌 그 이상의 다른 부착점을 구성한다.
C-말단 아미노산 또는 그 가까이에 부착되는 곁-사슬내 적어도 2개의 카르복실기를 구성하는 비-수지성 펩티드를 제조하기 위한 방법의 한 예는 하나 또는 다수의 글루탐산 잔기 또는 바람직하게는 알파-아미노기 대한 오토고널 보호를 사용하여 하나의 선택된 C-말단으로 위치한 리신잔기의 에타-아미노기에서의 합성에 의한 아스파르트산 잔기를 구성한다. 이는 주쇄 펩티드의 합성과정 전에 곁-사슬 카르복실기의 차폐제거와 잔여 펩티드와 결합하는 아미노산에 대한 보호용도와 비교된다.
유사하게, C-말단 아미노산 또는 그 가까이에 부착되는 곁-사슬내 적어도 2개의 아미노기를 구성하는 비-수지성 펩티드를 제조하기 위한 방법은, 하나 또는 다수의 리신잔기의, 바람직하게는 알파-아미기에 대한 오토고널 보호를 사용하는 하나의 선택된 C-말단으로 위치한 리신잔기의 에타-아미노기에서 합성되는 다수의 리신 잔기 도입을 구성한다. 이는 주쇄 펩티드의 합성공정 전에 곁-사슬 카르복실기의 차폐 제거가 없고 잔여 펩티드와 결합하는 아미노산에 대한 보호 용도과 비교된다.
면역원성 반응의 면역성와 다양성을 보다 더 개선하기 위하여, 보조액 효과를 지닌 다양한 지방이 본 발명에 의한 이뮤노겐 화합물에 포함될 수 있다. 본 발명에 의한 기본 고안은 다수의 서로 다른 항원과 구조내의 알킬사슬과 같은 다른 실체를 채택하도록 개발되었다.
따라서, 보다 상세한 면에 있어서, 비-수지성 펩티드 담체는 하나 또는 그 이상의 알킬-사슬, 바람직하게는 펩티드의 N-말단 또는 아미노산 곁-사슬에 공유결합된 포화지방산 형태를 구성한다. 상기에서 언급한 알킬-사슬의 탄소 사슬은 6-20 탄소원자와 같은 약 4-25 탄소원자, 바람직하게는 7-17 탄소원자 길이를 구성한다. 바람직스러운 면에 있어서, 탄소사슬은 팔미틱산 또는 미리스틱산 또는 상기의 혼합물을 구성하는 지방성분이다. 그러한 지방성분의 한 예는 도 4c에 나타난 것과 같은면역자극 palm3-Cys-분자이다.
하나의 흥미있는 실시예애 있어서, 본 발명에 의한 비-수지성 펩티드 담체는 티오에스터(thioester)로서 펩티드에 결합된, 바람직스럽게는 티올기의 시스타인 곁 사슬을 통하여, 적어도 하나의 지방성분을 구성한다.
한편, 지방 모이어티는 지방산, 전형적으로는 팔미틱산 또는 리신과 세린으로부터 선택된 아미노산의 분지사슬에 결합된 미리스틱산에 의하여 제공된다. 리신과 세린은 선형 펩티드 사슬과, 바람직하게는 선택적인 편광력이 있는, L-아미노산이 뒤있는 D-아미노산과 D-아미노산이 뒤있는 L-아미노산을 구성할수 있다.
상세한 실시예에 있어서, 비수지성 펩티드 담체는 C-말단에 위치하는 팔미틱 또는 미리스틱산과 같은 지방성분을 구성한다. 한편, 펩티드가 비자유 그리고 접근가능한 곁-사슬 기능성이 있으나 비보호 N-말단 알파-아미노기를 갖는 것이 바람직스럽다.
본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체는 20-50 아미노산을 구성하는 운반체이고, 그 서열에서는 "abcdefg "형태의 반복된 "헵타즈"를 구성한다. 바람직하게는, "a"와 "d"위치는 I, V, L, F 그리고 A로부터 선택된 비친수성 아미노산에 의하여 점유되고, "e"와 "g" 위치는 E, D, 그리고 K에 의하여 선택된 반대 하전된 아미노산에 의하여 점유된다. "b", "c" 그리고 "f" 위치는 A, R, N, D, E, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, S, T, W, Y 또는 V기로부터 선택된 아미노산 잔기에 의하여 그러나 바람직스럽게는 A, S, T, C, H 또는 K에 의하여 점유되어 2-10, 바람직하게는 자유롭게 접근 유도가능한 에타-아미노기를 갖는 4-6 균형되게 공간 배치된 리신잔기를 생산한다. 바람직스러운 실시예에 있어서, 적어도 한 쌍의 히스티딘 또는 히스티딘과 시스타인은 펩티드 사슬내의 축차의 "b"와 "f" 위치를 점유한다.
한 실시예에서, 반복 "헵타즈"는 그 내부 서열에 존재한다. 즉, 그 서열은 아미노산 2-5로부터 n-(2-5)까지의 단편에 상응하는, 바람직스럽게는 아미노산 3으로부터 n-3까지의 각편에 상응하는 펩티드의 단편내에 위치한다. 여기서 n은 펩티드 내의 아미노산의 개수이다. 보다 상세하게는 "e"와 "g"위치를 점유하는 리신잔기는 "b", "c", "f"위치를 점유하는 리신잔기와 비교할 때, 오토고널하게 곁-사슬 보호되었다. 바람직스럽게는 오토고널 보호기는 Boc-는 물론 Fmoc- 쪼개짐과 같은 처리에 대하여 안정하다. 다른 한편, 적어도 하나의 "f"위치는 탄소에 의해 점유된다.
담체는 또한 적어도 하나의 람담 브리지를 구성한다. 바람직하게는 말단 위치 헵티드내의 "b"와 "f" 아미노산을 연결하는 하나의 락탐 브리지이고, "b"와 "f"는 E와 K 또는 K와 E에 존재하고, E는 양자 모두의 경우에 D에 의해 교체될 수 있다. 또한, 담체는 서열에 포함된 하나의 Y 또는 W을, 바람직스럽게는 2-5의 C-말단 아미노산의 하나로서, 구성할 수 있다.
T-세포 헬프(help)는 효과적인 면역화를 위하여 중요하다. T-세포는 항원 발현 세포의 중요한 히스토컴페터빌리티(histocompatibility) 복합물(MHC)에 의한 펩티드 결합과의 상호작용에 의하여 활성화된다. 개개의 MHC는 펩티드의 서브세트(subset)를 결합하여 단지 개개의 서열 정의를 형성한다(Rammensee 1995). "프로미스커스(promisccous)" 펩티드는 문제되는 종의 많은 부분을 덮는 다수의 개개 MHCs에 의하여 결합되는 것으로 기술되었다. 면역화를 위하여 의도된 합성 펩티드 구조내에 T-세포 자극성분을 상호결합하는 기법은 잘 알려져 있다. 터프신(=[Thr-Lys-Pro-Arg]N)(Fridkin), 무라밀디펩티드(muramyldipeptid, MDP = N-아세틸 무라밀 L-알라닐 D-이소글루타민)(Ellouz 1974), 그리고 리포펩티드(Wiesmuller 1992)) 또는 단순 지질(Flinn 1994, Vitiello 1995)을 포함하는 일반적인 "자극제"에 더하여, MHC-분자의 커다란 서브세트에 결합하는 몇몇의 "프로미스커스" 펩티드가 기술되었다. 이러한 물질은 펩티드 항원과 선형(국제특허 95/00540, Wang 1995, Vitiello 1995 그리고 Kaumaya) 또는 분지정렬(미국특허 93/22343, 국제특허 93/22343, Pawan 1994, Flinn 1994, Jackson 1995)로 결합될수 있다. 비스뮐러에 의한 지질-구조(1992)는 특히 효과적이고(Defoort 1992), 선형구조에서 이량체 탄화수소 항원과 함께 효과적인 것으로 나타났다(Toyokuni 1994). 중요한 것으로서, 몇몇 T-세포 자극 펩티드의 단지 핵심의 서열만을 함유하는 "혼합된" 선형 폴리-에피토프(재조합적으로 표현된)가 개개의 펩티드(Thomson 1995)에 결합하는 모든 서브세트를 자극하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 공지의 DNA-면역법(Ulmer 1993)에 의하여 직접적으로 그러한 DNA-구조를 주사할 수 있는 것 그리고 이러한 방법으로 유사한 광범위한 자극을 얻는 것이 제시되지는 아니하였으나, 가능하다.
펩티드-부착가능 DNA-결합 물질은 DNA를 비특이적으로 결합하는 매개자(퀴놀린(Brown 1994))와 서열-특이성 방법(국제특허 95/01369)으로 DNA를 교잡할 수 있는 펩티드 핵산(PNA)를 포함한다.
또한, 특이적인 면역조절자가, 예를들어 사이토킨 또는 사이토킨 절편, 포함될 수 있다(Kumaratilake 1995, 유럽특허 0 604 727 A1).
따라서, 중요 히스토컴피터빌리티 복합물의 방해를 제한을 위하여 면역원성 물질에 더하여, 특이적인 T-세포 자극 펩티드가 본 발명에 의한 면역원성 물질 포함될 수 있다. 이는 오토고널 화학을 사용한 펩티드 합성 또는 선 구조를 부착함에 의하여 이루어질 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 비수지성 펩티드는 하나 또는 그 이상의 펩티드 성분 복사를 구성하거나 펩티드 성분의 조합을 구성한다. 한 실시예에서 펩티드 성분은 곁- 사슬과 N-말단-차단 형태의 비수지성 운반체의 한쪽 또는 양쪽끝에 위치할 수 있다. 그러한 펩티드 성분의 예는 다음을 포함한다:
1) (TKPR)N, 바람직하게는 1-5 (터프신올리고머), 뮤라밀디펩티드(N-아세틸-L-알라닐-D-이소글루타민)로부터의 N 또는 상기의 변형체, 그리고
2) QYIKANSKFIGITE(테타너스 톡소이드 830-843)과 FNNFTVSFWLHRVKVSA-
SHLE(테타너스 독소 947-967), DQVHFQPLPPAVVKLSDALI(미코박테리움 튜버큘로시스, Mycobacterium tuberculosis, 38kD 항원 350-369), DIEKKIAKMEKASSV-
FNVVNS(플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로조이테 단백질, Plasmodium falciparum
circumsporozoite, 378-398), KLLSLIKGVIVHRLEGVE, 미즐리스 바이러스 F-단백질 286-302, LDNIKGNVGKMEDYIKKNNK(플라스모디움 팔시파룸, Plasmodium falci-
parum, MSP-1, 260-279), LQTMVKLFNRIK, NSVDDALINSTKIYSYFPSV, QYIKANSKFIGITELK, 그리고 PGINGKAIHLVNNESS 로부터 선택된 T-세포 자극 펩티드; 그리고
3) T-세포 에피토프 원소가 내부에 위치한 최소의 T-세포 에피토프 펩티드 단편을, 바람직하게는 플랭킹 서열없이, 구성하는 본질적으로 선형구조로 정렬된 폴리 T- 세포 에피토프 구조로부터 선택된 T-세포 자극 펩티드; 그리고
4) IFN-감마(1-39) HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG, INF-감마(95-133) AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC,
TNF (70-80) PSTHVLITHTI
IL-1 베타 (163-171) VQGEESNDK;
그리고 상기의 조합.
한 실시예에 있어서, 비수지성 펩티드 담체는 보호된 곁-사슬에서, 그러나 N-말단으로 비보호된 형태, 특정된 펩티드 성분을 구성할 수 있다. 상기 펩티드 성분은 주쇄 펩티드의 적어도 하나의 곁-사슬 부착점에 분지 펩티드로서 결합된다.
보다 상세한 실시예에서, 비수지성 펩티드는 보호된 곁-사슬에서, 그러나 N-말단에서 비보호된 형태, 특이적인 펩티드 성분을 포함한다. 주쇄 펩티드에 있는 적어도 하나의 곁-사슬 부착점에 분지 펩티드로서 결합되는 상기 펩티드 성분을 포함한다, 상기 부착점은 양기능 또는 다기능 부착점이다. 관련는 최초 부착점의 리신잔기의 에타-아미노기에 결합되는 리신잔기의 에타-와 알파-아미노기가 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 비수지 담체는 곁-사슬이 보호되고, N-말단으로 보호되거나 보호되지 아니하는 형태에서 특이적인 펩티드 성분을 구성할 수 있다. 상기 펩티드 모이어티는 주쇄 펩티드의 적어도 하나의 분지 부착점에 결합된다. 그 부착점은 양기능 또는 다기능 부착점일 수 있고, 보다 상세한 실시예에 있어서 Fmoc 와 Boc와 산-불안정 곁-사슬 보호기에 대하여 오토고널하게 보다 더 보호된다.
본 발명에 의한 비수지성 펩티드는 적어도 하나의 PNA 성분을 구성할 수 있다. PNA는 특이적인 DNA분자에 교잡에 의하여 결합하는 단량체 서열을 구성할 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 비수지성 펩티드는 적어도 하나의 DNA 또는 RNA 올리고 핵산염성분을 구성할 수 있다. DNA 올리고핵산성분은 바람직하게는 그 3'-말단를 통하여 상기 펩티드의 아미노기에 결합한다. 더 나아가, 그것은 T-세포 자극 펩티드를 엔코딩(encoding)하는 핵산염 서열을 구성할 수 있다. 바람직스러운 실시예에 있어서, 올리고 핵산염 서열은 교잡에 의하여 특정 DNA- 또는 RNA-분자에 결합한다.
바람직스러운 실시예에 있어서, 부착된 올리고 핵산염은 일반적인 형식인 (5')PuPuCGPyPy(3')에 상응하는 헥사핵산염을 구성한다. 여기서 Pu는 퓨린 염기, Py는 피리미딘 염기, CG는 메틸화되지 아니한(unmetylated) CpG 이핵산염을 의미하다. 이 헥사핵산염 모티프는 면역능력 세포에 있어서 사이토킨의 잠재적 유도체로 보인다.
비수지성 펩티드 담체는 스페이서(spacer) 분자를 구성할 수 있다. 바람직하게는 그 스페이서는 GN, N=2-8으로부터 선택된다.
비수지 담체가 결합되는 고체상은 바람직하게는 고체-상 복합물이 코폴리머(copolymer)를 나타내는 폴리머이다. 그것은 비수지성 펩티드를 특이적인 화학 처리에 의하여 선택적으로 쪼개어질 수 있는 결합체를 통하여 고체상에 결합할 수 있는 장점이 있다.
고체상은 정상적으로 유도할 수 있는 물과 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 디메틸설프옥사이드(dimethylsulfoxide), N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone), 디클로로메탄(dichloromethan), 피퍼리딘(piperidine), 디에틸이터(diethylether) 그리고 수성 트리플루오로아세트산(trifluoloacetic acid)을 포함하는 유기용매에 불용성인 폴리머(기질, 수지)에 의하여 구성된다. 디비닐벤젠(divinylbenzen)/폴리스티렌(polystyrene)과 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 폴리머는 때때로 키젤거(kieselguhr) 같은 물질 육안적 지지체와 조합되거나 다양한 스페이서와 결합체로 유도된다. 폴리머상의 펩티드 양은 펩이드의 크기 또는 합성의 특이 조건에 따라 변한다.
한편, 비수지성 펩티드 담체는 고체상 폴리머를 약 0.001 에서 약 5, 바람직하게는 약 0.01 에서 약 1 까지, 보다 바람직하게는 약 0.02 에서 약 0.08 까지, 더욱 바람직스럽게는 약 0.04 에서 약 0.06 까지, 가장 바람직스럽게는 약 0.05 에서 약 0.1 mmole/g고체상 치환할 수 있다.
고체상 결합 결합체로부터 비수지성 펩티드를 이탈시키는 화학처리는 펩티드의 곁-사슬에 있는 의도하는 부착점으로부터 보호기의 쪼개짐에 사용되는 화학처리에 오토고널할 수 있다.
그러한 결합체들은 광분해에 의하여 쪼개질 수 있는 3-니트로-4-히드록시메틸 벤조산 형태 결합체, 촉매적인 수소첨가에 의하여 쪼개질 수 있는 히드록시-크로토닐-아미노메틸(hydroxy-crotonyl-aminomethyl) 형태의 결합체, 히드로플루오르산(hydrofluoric acid) 또는 트리플루오메탄술폰산(trifluoromethanesulfonic acid)에 의하여 쪼개질 수 있는 4-메틸벤즈히드릴아민(4-methylebenzhydrylamine) 형태의 결합체, 수성 트리플루오로아세트산에 의하여 쪼개질수 있는 비변형 결합체-형태의 결합체(4-(2',4'-디메톡시페닐 Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세틱산)(4-(2',4'-dimeth-
oxyphenyl Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetic acid)로부터 선택될 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 비수지 담체 펩티드는 결합체에 에스터로서 고체상에 결합한다. 상기 펩티드는 수성 염기에 의하여 쪼개질 수 있다.
비수지 운반체 펩티드는 히드록실 뉴클레오파일 처리시에는 펩티드를 카르복실산으로, 메타놀릭(methanolic) 암모니아 처리시에는 아마이드로서, 히드라진 처리시에는 히드라지드로서 이탈시키면서 고체상 결합 4-히드록시메틸벤조산에 연결될 수 있다.
본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체는, 한 실시예에서, 물, 바람직하게는 도 4d에 도시된 글리콜산 결합체와 접촉시 펩티드를 방출하는 결합체 또는 디켑토피퍼라진(dikeptopiperazine)형성에 의하여 펩티드를 하는 결합체를 통하여 고체상에 연결된다.
본 발명은 한편으로, 고체상 복합물내 비수지성 펩티드 담체는 5-50, 바람직하게는 10-20 아미노산을 구성한다. 또한, 펩티드는 공유적으로 결합된 지질성분, 바람직하게는 N- 말단 또는 N-말단 가까이에 위치하는 팔미틱 또는 미리스틱산을 구성하는 펩티드, 고체상 복합물을 형성하도록 히드라진 쪼개질 수 있는 결합체에 의해 고체상에 부착한다.
본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체를 탐지하기 위하여, 특징과 측정가능한 분광 또는 UV-흡수성, 가시광선 흡수 또는 형광성과 같은 방사성 특성을 가진 물질을 구성할 수 있다.
보다 상세한 실시예에 있어서, 본 발명은 비수지성 펩티드 담체가 상기에서 기술한 것과 같이 상기 펩티드의 유도할 수 있는 기에 공유결합함에 의하여 다른 성분을 운반하기 위한 스카폴드로서의 사용을 지향한다. 한 실시예에서 유도가능기는 알파-아미노기, K의 에타-아미노기, K의 에타-아미노기의 화학제조 유도체, 그리고 C- 분지 사슬의 티올기로부터 선택된다.
다른 실시예에 있어서, 본 발명은 비수지성 펩티드 담체의 상기에서 기술한 것과 같이 부착점에 공유적으로 부착된 분자에 의하여 특징되는 화학적 유도체의 생산을 위한 스카폴드로서의 사용을 지향한다. 그 분자는 펩티드, 탄화수소, 합텐, 글리코펩티드, 리포펩티드, DNA, RNA, PNA, 단백질 그리고 당단백질 그리고 상기의 조합으로부터 선택될 수 있다.
추가적인 실시예에서, 본 발명은 비수지 펩티드의 상기에서 기술한 것과 같이 고체상에 결합되어 고체상으로부터 전체 복합물의 특이적인 쪼개짐이 뒤따르는 고체상 결합 펩티드의 부착점에 정의된 서열을 갖는 펩티드 성분의 단계적 합성을 위한 단계적인 공지의 Fmoc- 또는 Boc- 기초 고체상 펩티드 합성을 위한 고체상 복합물 스카폴드로서의 사용을 지향한다.
상기에서 정의된 용도에 따라 비수지성 펩티드 담체에 결합할 수 있는 성분들은 화학적으로 합성된 비보호 펩티드, 합성 펩티드 재조합체, 천연유도 펩티드, 천연 유도 또는 합성 펩티드, 천연유도 또는 합성 글리코펩티드, 천연유도 또는 합성 리포펩티드, 천연유도 또는 합성 핵산, 천연유도 또는 합성 리보핵산, 펩티드 핵산, 합텐 또는 다른 항원 또는 비항원, 또는 다른 아미노-, 카르복실레이트, 할로아세틸, 말레이미드, 티올-1,2-티올-아미노-, 히드록실아민-, 알파-옥소아실-, 카르보닐-, 그리고 아실 히드라진-반응 물질 그리고 상기의 혼합물등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 비수지성 펩티드 담체는 정상의 펩티드 라이브러리와는 상반되게 본 발명에서 비수지성 펩티드 담체에 의하여 제공되는 구조 지지 틀에 의한 고도의 구조적 정의에 의하여 특징되는 합성 펩티드 라이브러리 생산을 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 얻어질 수 있는 라이브러리는 면역화를 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 비수지성 펩티드 담체로부터 유도된 펩티드 라이브러리의 특별한 면은 쉽게 인식되어지는 구조 라이브러리가 천연 항체로부터 쉽게 얻어진다는 것이다. 또한, 라이브러리는 광범위한 보호를, 예를들면, 병원성 바이러스 변형체의 범위에 대하여, 얻기위한 목적의 면역화에 사용될 수 있다.
비수지성 펩티드 담체는 단지 동일한 분지 펩티드만이 동일한 비수지성 펩티드 운반 분자에 결합되는 다수의 유도 비수지성 펩티드 담체 분자를 초래하는 분해결합(splitcombine) 접근을 포함하는 펩티드 라이브러리를 제조하는 표준 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체는 화학합성된 보호 펩티드, 천연유도 펩티드, 시클릭 펩티드, 천연유도 또는 합성 탄화수소, 천연유도 또는 합성 글리코펩티드, 천연유도 또는 합성 리포펩티드, 천연유도 또는 합성 핵산, 천연유도 또는 합성 리보핵산, 펩티드 핵산, 합텐 또는 다른 항원 또는 비항원, 또는 다른 아미노-, 카르복실레이트, 할로아세틸, 말레이미드, 티올-1,2,-티올-아미노-, 히드록실아민-, 알파-옥소아실-, 카보닐-, 그리고 아실 히드라진-반응 물질 그리고 상기의 혼합물등롭터 선택될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 성분의 결합을 위한 스카폴드로서 사용가능하다. 이러한 스카폴드로서의 사용은 비-수지 펩티드 운반체가 고체상으로부터 이탈될 때 이루어질 수 있다. 그러나, 상기에서 기술한 하나 또는 그 이상의 성분이 고체상에 부착된 상태로 있는 비수지성 펩티드 담체와 함께 실행되는 것이 바람직스럽다.
본 발명에 따른 펩티드 운반 고체상 복합물은 상기 펩티드 운반 고체상 복합물에서 C말단으로 위치한 카르복시실산을 통한 모이어티의 부착을 위한 스카폴드로서 사용될 수 있다. 상기 부착 모이어티는 전형적으로는 아민-함유 화합물, 가장 전형적으로는 펩티드와 단백질을 단백질에 결합시키고, 그에 따라 존재하는 결합 펩티드의 보호기는 물론, 주쇄 리포펩티드의 보호기를 쪼깨는, 그리고 모든 복합물의 이탈이 뒤따르는 공지의 방법에 의하여 아미노기를 통한 선택적 결합이 가능한 합성 또는 천연 펩티드 또는 단백질과의 선택적인 결합이 가능하다. 본 발명에 의한 비수지성펩티드 담체 고체상 복합물의 용법은 자유 펩티드산 바람직스럽게는 5-20 아미노산을 구성하고 N-말단 또는 N-말단 근처에 위치하는 지질성분을 함유하는, 바람직하게는 팔미티 또는 미리딕산인 상기 펩티드, C-말단 카르복실산 외에는 다른 자유가능기응 운반하지 아니하는 상기 펩티드, 자유 펩티드와 조합에 의한다. 그 방법은 결합, 바람직스럽게는 표적 펩티드의 펩티드 담체 고체상 복합물에 연속 펩티드 합성에 의한다. 합성은 자유 리포펩티드를 고체상 결합펩티드의 알파 아미노기에 결합시키고, 결과적으로 보호기를 쪼개며, 모든 복합물을 이탈시킴에 의하여 합성을 끝내고, 이탈 시점에서 합성된 표적 펩티드를 루프로서 노출시킨다. 펩티드 구조는 분자내 락탐-결합, 분자내 S-S-결합과 양기능 스페이서 분자로부터 선택된 구조에 의하여 안정화 될 수 있다.
펩티드 담체 고체상 복합물의 히드라진-쪼개짐으로부터 유도된 리포펩티드 히드라진은 천연적으로 발생할 수 있는 환원 탄화수소 또는 합성 탄화수소 또는 링 개방을 위해 온화하게 산화된 탄화수소와 같은 알데히드-함유 화합물의 결합에 사용될 수 있다. 상기 방법은 상기 환원 탄화수소와 리포펩티드 히드라지드의 혼합을 구성한다.
인터류킨(interleukin) 6, 인터페론-감마, 기타 글리코실레이티드 사이토킨 그리고 이뮤노글로블린으로부터 선택된 글리코실레이트된 면역조절 글리코축합일 수 있는 당단백질, 글리코펩티드, 또는 글리코지질로부터 선택된 글리코축합은 상기의 방법에 의하여 탄화수소 성분을 통하여 자유 리포펩티드의 히드라지드기로 선택적으로 결합될 수 있다.
비수지성 펩티드 담체 이뮤노겐 복합물은 면역자극 복합물(이스콤) 또는 리포솜으로 상호 결합되어 비수지 펩티드 담체-이스콤 복합물로 될 수 있다.
두 개 또는 그 이상의 서로다른 복합물은 같은 이스콤 또는 리포좀으로 상호결합될 수 있다. 그 복함물은 백신의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
바람직스러운 실시예에 있어서, 본 발명에 의한 비수지 펩티드 담체는 비-시클릭이다.
상기에서 언급한 바와 같이, 다음단계를 구성하면서 상기에 결합되는 면역원성 물질을 구성하는 비수지성 펩티드 담체를 제조하는 방법에 관련된다.
1) 결합체상에 화학적 고체상 합성에 의하여 선행의 청구항의 어느 하나에서 정의되는 것과 같은 비수지성 펩티드 담체의 합성, 그리고
2) 비수지성 펩티드 담체에 면역원성 물질의 직접적인 합성, 그리고
3) 고체상으로부터 비수지성 펩티드 담체의 쪼갬.
또한, 더나아가 단계 2)는 유도가능기의 사용에 의하여 펩티드 담체에 다른 성분의 공유결합을 구성할 수 있다.
본 발명에 의한 비수지성 펩티드 담체는 화학적 유도체, 부착점에 공유적으로 부착된 분자로 특징되는 스카폴드로서 사용될 수 있다. 그 분자는 펩티드, 탄화수소, 합텐, 글리코펩티드, 리포펩티드, DNA, RNA, PNA, 단백질 그리고 글리코프로테인 그리고 상기의 조합으로부터 선택된다. 또한, 스카폴드-펩티드 복합물은 지질성분 면역자극 복합물(이스콤)에 상호 결합되어 비수지성 펩티드 담체-이스콤 복합물로 된다. 두 개 또는 그 이상의 복합물은 동일한 이스콤으로 결합될 수 있다.
상기에서 정의된 것과 같이 비수지성 펩티드 담체는 담체에 결합할 수 있는 것으로서, 예를들어 폴리펩티드와 같은 항원 또는 항체, 리포폴리펩티드, 글리코폴리펩티드, 인지질, 탄화수소, 리포폴리사카라이드, 또는 핵산염 서열 (DNA서열, RNA서열 또는 상기의 변형을 포함하는), PNA 또는 상기의 변형물과 같은 하나 또는 그 이상의 진단제로서 적절하다. 한 실시예에서, 진단성분은 동일한 또는 다른 분자를 탐지할 수 있는 적어도 2개의 진단시약을 구성할 수 있다.
그러한 진단성분은 생체내에서 직접 동물에 사용하거나 또는 실험실에서 샘플에 사용될 수 있다.
탐지될 상기 분자와의 탐지반응에 효과적이고 진단성분이 결합할 수 있는 양으로 사용된다. 진단성분은 진단성분에 충분한 시간동안 분자와 진단성분을 인큐베이팅 함에 의하여, 예를들어 주체와 반응하기 위한 적절한 조성물과 함께, 분자의 탐지 그리고 복합물의 형성과 상기 복합물을 탐지 방법에 적용시킴에 의한 결합분자의 탐지에 사용된다. 진단성분은 예를들어 생검 또는 조직 추출물, 세포배양, 또는 인간을 포함하는 동물을 포함하는 조직으로부터 유도된 샘플의 사용에 의하여 지시 분자가 알려진 임신 또는 감염성 질병, 자기면역 질병, 종양성 질병 또는 기타 질병으로부터 유도된 또는 지시하는 분자의 탐지를 위한 목적으로 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서 샘플은 혈청, 혈장, 전혈, 뇌척수액, 정액 또는 질액. 삼출, 타액, 뇨, 변 등으로부터 유도될 수 있다. 하나의 실시예에 있어서 진단성분은 직접 동물에게 투여되고, 진단제는 동물내에서 보족(complement)되고 상기 동물의 질병 또는 임신을 지시한다.
본 발명의 세부 용도에 있어서, 본 발명에 의하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 특이적 펩티드 결합 올리고핵산염, 특히 올리고리보핵산염("압타머즈(aptamer)")의 선택에 사용된다. 그러한 압타머는 항체 결합을 닮은(Xu 1996) 유도-피트-모드에서 특이적으로 그리고 고 친화성으로 특정 펩티드에 결합할 수 있음이 알려졌다. 항-펩티드 압타머는 예를들어 바이러스-유도 mRNA-결합 단백질에의 결합과 차단에 기초한 진단분석과 치료에 있어서 항체에 선택적인 것으로서 흥미가 있다. 압타머는 무작위 올리고핵산염의 커다란 풀(pool)로부터 고체상 결합 펩티드에의 결합에 의하여 실험실 공정에서 선택된다. 본 발명의 목적인 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용함에 의하여, 보다 더 특이적으로 결합된 압타머가, 펩티드로서 선택될 수 있는, 보다 잘 정의되고 구조 지지된 방법으로 제조된다. 또한, 본 발명에 있어서, 선택절차 그 자체는 고체상 결합 복함물이 직접적으로 사용됨에 의하여 단순화된다.
상기에서 설명한 바와 같은 상세한 실시예에 있어서, 본 발명은 상술한 바와 같이 적어도 하나의 면역원제 또는 매개자가 부착된 비수지성 펩티드 담체를 구성하는 백신 성분에 관계한다. 면역원제는 폴리펩티드, 글리코펩티드, 리포펩티드, 인지질, 다당, 리포폴리사카라이드, 탄화수소, 핵산염 서열, PNA 또는 상기의 조합 또는 변형일 수 있다. 또한, 백신 성분의 면역원성 효과 또는 백신 성분에 노출된 면역계의 반응에 영향력이 있는 적어도 하나의 매개자는 또한 펩티드 담체에 연결되거나 그 일부를 구성할 수 있다.
그러한 매개자의 예로는 터프신과 면역조절자를 포함한다. 면역조절자는 인터류킨 또는 인터페론과 같은 사이토킨, 증강자(enhancer), 또는 매개자 활성을 갖는 상기의 변형물 또는 그 일부를 포함한다. 그 매개자는 천연적으로, 합성적으로, 재조합적으로 유도 가능하다.
다른 실시예에 있어서, 백신성분은 면역자극 복합물(이스콤) 또는 리포좀, 선택적으로 매개자 또는 매개자 활성이 있는 상기의 일부와의 조합과 같은 두번째 담체에 결합되고, 비수지성 펩티드 담체 그리고/또는 두 번째 담체에 결합된다.
본 발명의 비수지성 펩티드 담체는 유도된 알파-아미노산으로 구성된 프로티노이드(proteinoid) 중심체 그리고 폴리(락티드-코글리코라이드, lactide-coglycolide) 폴리머 저방출 생분해성 미립자(PLG)(Haas 1996)를 포함하는 다른 이차적인 운반체와 사용될 수 있다. 프로티노이드(proteinoid) 중심체는 자발적으로 저 PH에서 중심체를 형성하고 항원과 아미노산의 단순 혼합에 의하여 항원을 캡슐화 하는 유도 알파 아미노산에 의하여 제조된다. 다음으로 산성화가 이어진다. PLG와 함께, 친액성화가 이어지는 PLG와 항원의 에멀션이 형성된다(Ertl 1996). 그 입자는 바람직하게는 0.5 에서 10㎛, 바람직하게는 0.5 에서 2㎛ 직경을 갖고 양자 모두 생분해성이다.
그러한 입자 형태는 경구 투여될 수 있는 장점이 있고, 경구 투여에 의하여 면역원성이다. 그 바람직한 조성물은 동물에 있어서 하나 또는 그 이상의 감염에 대한 향상된 저항을 주는 백신성분의 효과적인 양, 더나아가 선택적으로 약학적으로 받아들일수 있는 담체 또는 운반자, 또는 보조액를 구성한다.
보조액 용도의 한 예는 항원 발현 세포와 자연 반응(Gao 1990) 동안에 발생하는 T-세포에서 보조액과 같이 작용하고 카르보닐기와 아미노기 사이의 시프염(Schiff-base) 형성을 증진시키는 것으로 알려진 시프염 형성 성분과 조합된 비수지담체 펩티드와의 조합이다. 이는 그 표면(Rhodes 1995a)에 아미노기를 결합함에 의하여 T-세포를 직접적으로 활성화 시키는 백신 형성을 포함하는 것 또는 면역원성 물질과 동시에 2개의 탄화수소-변형 효소 네아우르아미니다제(neauraminidase) 갈락토우즈 산화효소("NAGO" 보조액)(Rhodes 1995b)를 투여하는 것에 의하여 행해질 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 투카레졸(tucaresol)(4-(2-포밀-3-히드록시페녹시메틸)벤조산)과 같은 시프염 형성 알데히드가 비수지성 펩티드 담체에 보조성분으로서 결합한다. 이는 투카레졸의 카르복실산의 활성을 통한 선택적으로 비보호된 아미노기에 결합함에 의하여 이루어진다.
본 발명에 의한 백신 조성물은 백신 조성물을 코, 피하, 근육내, 또는 기타 공지의 경로를 통하여 투여함으로서 인간을 포함한 동물의 면역화에 이용될 수 있다.
보다 상세한 면에서, 본 발명은 상기에서 정의한 것과 같은 적어도 하나의 치료적 또는 치료 및 예방적으로, 예를 들어 상기 백신성분에 대하여 정의한 것과 같이, 부착된 비수지성 펩티드 담체를 구성하는 치료 성분에 관계한다. 본 발명에 의한 치료성분은, 예를들어 백신에 대하여 상기에서 정의한, 담체에 연결된 치료 또는 치료 및 예방제 효과를 조절 또는 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 매개자를 구성할 수 있다.
백신에 대하여 상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 의한 치료성분은 면역자극 복합물(이스콤) 또는 리포좀과 같은 2차 담체를 구성할 수 있다. 선택적으로 매개자 또는 매개자 활성이 있는 상기의 일부와 조합 그리고 비수지성 펩티드 담체 그리고/또는 2차 담체에 부착한다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 의한 치료성분은 치료성분이 그 효과를 발현하게될 동물의 특정 위치에 존재하는 표적 물질에 결합할 수 있는 표적분자를 구성할 수 있다. 그러한 표적분자는 예를들면 항체이다. 따라서, 치료성분은 질병의 예방, 재발의 방지를 포함하는, 또는 임신의 예방 또는 유산을 매우 효과적으로 할 수 있다. 따라서, 발명이 적용되는 질병에는 감염성 질병, 종양성 질병, 자가면역성 질병을 포함한다.
약제성분은 약제적으로 받아들일 수 있는 담체와 함께 치료성분을 구성하는 조성물로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기술한 약제 조성물의 치료적 또는 치료 및 예방의 효과적인 양을 상기 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 구성하는 질병의 치료 그리고/또는 예방의 방법과 관계한다. 마지막으로 본 발명은 또한 분자 또는 물질을 탐지하기 위한 탐지성분, 탐지시약이 연결되는 상기에서 기술한것과 같은 비수지성 펩티드 담체를 구성하는 성분에 관계한다.
본 발명의 기술 이해를 위한 전문가에 자명하게 될것이므로, 여기에서 주어지는 범위와 값은 찾고자 하는 효과를 상실함이 없이 확장 또는 변경될 수 있다.
아래의 실시예에서는, 다음과 같은 약칭이 사용되었다:
아미노산에 대한 표준 1자 및 3자 약어.
Aib : 알파 아미노 이소부틸산
Alo : 아릴옥시카보닐
BCG : 박테린 칼메트 게랑
Boc : 부틸옥소캅카보닐
BrAc : 브로모아세틸
CA : 무수시트라콘산
DCC : 디사이클로헥실카보디이미드
DCM : 디클로로메탄
Dde : 1-(4,4디메틸-2,6-디옥소시클로실이딘)에틸
DMAP : 디메틸아미노피리딘
DMSO : 디메틸설폭시드
DSS : 디석시니미딜 수베린산염
EBA : 적혈구결합항원
EDC : 1-에틸-3[디메틸(아미노프로필)]카보디이미드
ELISA : 효소결합이뮤노소번트 분석
Fmoc : 플루오레닐메톡시카보닐
HOBt : 히드록시벤조트리아졸
HMB : 4-히드록시메틸 벤조산
HMPA : 4-히드록시메틸 페녹시아세트산
IFN : 인터페론
IL :인터류킨
i.p. :복강내의
MSNT :1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1-H-1,2,4,-트리아졸
Mtt : 메틸트리틸
NMM : N-메틸모르포린
NMP ; N-메틸피롤리돈
Palm : 팔미톨 잔기(CH3(CH2)14CO-)
Pbf : 2,2,4,6,7,-펜타-메틸디히드로벤조퓨란-술포닐
PPD : 마이코 박테리움 튜버귤로시스로 부터의 정제된 단백질 유도체
s.c. : 피하의
SPDP : N-석시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트
TBTU : 2-(1H-벤조트리아졸-1-y1)-1,1,3,3-테트라메틸유로니움 테트라플루오레이트
TFA : 트리플루오로아세트산
TNF : 종양괴사인자
Trt: : 트리틸
실시예 1
양친매성 평행 알파-나선 호모이량체 형성 비수지 펩티드 담체
기초화학의 실시예
강한 알파-나선과 20 아미노산 알파-N-팔미토일레이티드 리포펩티드, 평행 호모이량체 형성 경향은 상술한 헵타드-법칙에 기초하는 것으로 정의된다;
palm- AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY,
palm=팔미토일 잔기(CH3(CH2)14CO-).
히스티딘 잔기는 디벨런트 메탈이온 킬레이션에서 나선 형성을 지지하는 것으로 포함되고, 티로신은 280㎚ 리포터 기로서 포함된다. 펩티드는 느슨한 구조 히드로필릭 C-말단 스트레치(GKGKY)와 알파-나선 2회전에 상응한다.
그 합성은 펩티드의 C말단 부착을 위한 염기-변성 4-히드록시-메틸벤조산(HMB-)결합체함유 노바신 KB수지(노바비오켐 01-64-0025)와 이루어진다. 모든 아미노산 유도체는 노바비오켐으로부터 유도되었고, 모든 용매는 메르크로부터 얻었다.
사용된 아미노산은 다음의 분지사슬보호를 갖는 알파-아미노-Fmoc-보호 유도체이다;
AsnCysGlnHis: 트리틸(Trt),Lys,Trp: 부틸옥시카보닐(Boc)GluAspSerThr그리고Tyr: 터트뷰틸(tBu), Arg : 2,2,4,6,7-펜타메틸 디히드로벤조퓨란-설포닐(Pbf).
펩티드 합성은 데디케이티드 소프트웨어를 사용하여 샤퍼N(코펜하겐)으로부터의 마크3 펩티드 합성제에 의하여 이루어진다. 모든 작동은 연무후드(fume hood)에서 이루어진다. 정량적 카이저 테스트(Kaiser 1970)는 유리 아미노기를 검출하기 위해 사용되었다. 이탈된 Fmoc(피퍼리딘후)의 측정은 301㎚ 에서 그랜트(1992)에 의해 기술된 공식 〔E301×dil.×vol.〕/〔10×중량gram〕을 이용하여 행하였다. 여기서 dil, vol은 각각 희석과 부피다. 질량은 Fmoc-기가 유도되는 펩티드-수지의 질량이다.
한 예로서, 0.15밀리몰/그램히드록시기를 함유하는 1그램 노바신 KB수지(노바비오켐 01-64-002)는 20분동안 상온에서 NMP에서 레프트되고, 다음에 DCM으로 필터에서 세척된다.
첫 번째 아미노산(티로신)은 에스테르(Blankemeyer-Menge 1990)로서 결합한다: 300 마이크로몰(=2배몰러서플스) Fmoc-Tyr(tBu)는 225마이크로몰 메틸이미다졸과 300마이클몰 1-(메시틸렌-2-설포닐)--니트로-1H-1,2,4-트리아졸(MSNT) DCM 에서의 0.2 몰 그리고 KB수지와 DCM에서 60분간 상온에서 (RT) 세이킹하면서 인큐베이트하였다.
이 결합은 1 eq(equivalent)의 DMAP 의 존재하에 아세틱 무수물의 10 eq의 캡핑이 뒤따르는 새로운 리전트와 KB-수지의 같은 포션에서 한 번 반복된다. 캡핑은 15분간 행해지고, NMP에서 광봄위한 세척이 이어졌다. Fmoc기의 결합 티로신으로부터 쪼개진(nmp에서 20% 피페리딘에 의하여 쪼개짐) 스펙트로포토메틱 결정(301㎚)은 134.8마이크로몰/그램 수지, 89.9%의 결합 일드에 상응하는. 이러한 면에서 소량의 수지로 행한 카이저 테스트는 진청색을 일드한다,
이 점이후의 아미노산의 잔여는 10분간(슈셔) 활성화와 30분간의 결합화 8배 몰러 과량에서, 이소류신, 트레오닌, 그리고 발린을 제외하고, 2*30분 동안 이중결합된, 연속적으로 결합된다. 최종 Fmoc -값은 그램당 133.9 마이크로몰 펩티드 수지(최초질량)에 비교되었다.
이것은 99.3%의 결합된 처음의 아미노산에 비교되는 일드에 상응한다. 카이저 테스트는 진청색을 나타냈다. 이 시점에서, 소량의 수지샘플은 대조(팔미토일레이션 이전의 펩티드, 도면 2A)로서의 펩티드의 쪼개짐을 위해 제거되었다. 펩티드의 잔여는 다음과 같은 2번 반복된 팔미테이트 처리에 의하여 팔미토일레이티드되었다:
펩티드-수지의 아미노기의 10배에 상응하는 팔미틴산은 TBTU , HOBt 그리고 NMM(1/1/2(몰/몰)팔미틴산에 상응하는)와 NMP하에서 혼합되었고, RT에서 30분간 펩티드-수지와 인큐베이팅전에 10분의 RT 진탕에 의하여 활성화되었다.
반복된 결합후에 카이저 테스트는 깨끗한 무색용액을 나타냈고, 소량의 샘플은 분석을 위하여 리테인되었다 (팔미토일레이션 후의 펩티드, 도면 2B). 연속적으로, 펩티드수지는 NMP, 2-프로판올과 DCM으로 세척되었다. 분지-사슬 항원의 부착을 위한 리포펩티드수지를 준비하기 위하여,("분지즈"), 리신의 에타-아미노-보호 Boc-기가 RT에서 진탕되는 밀폐용기내에서 DCM으로 6×30분 동안 6×5밀리리터 50% TFA처리에 의하여 제거되었다. 다음으로 DCM, NMP하의 4%NMM, 물, 그리고 에테르가와 함께 필터에서 수지를 세척하였다. 이 단계에서, 펩티드-수지는 분지-항원(하기의 실시예 참조)의 결합을 위해 준비되었고, 카이저테스트는 진청색이었다. 이 부착점에 대한 보호된 아미노산의 결합이 정상적인 활성화학에 의하여 수행되었고, 카이저 테스트에서 깨끗한 펩티드 수지의 결과를 얻었다.
합성의 성공을 위한 분석을 위하여, 2개의 펩티드-수지 샘플이(비팔미토일레이티드 샘플과 피니시드 리포펩티드-수지) 분지사슬 보호기를 제거하도록 처리되었고, 다음의 방법에 의해 수질부터 쪼개졌다.:
펩티드수지(100밀리그램)은 5밀리리터 1몰 수산화나트륨과 10분간 초음파 수조에서 얼음에서 처리되었다.
다음 수지는 여과되고 여과물은 얼음위에서 0.1 몰 아세트산하에서 모아졌다. 이는 반복되었고, 2×10분의 2배 물(밀리크)인큐베이션과 동일한 방법의 100%아세토니트릴 이 아세트산에서 모든 여과물을 각각 모으면서 뒤이었다. 이 비율은 펩티드 -수지 생산과 HPLC에 의한 순도를 위하여 분석되었고, 상대비가 풀되고, 프리페러티브 역상 HPLC에 의하여 탈염되었으며(실시예 5 참조), 동결 건조되었다. 비-팔미토일레이티드 펩티드가 첫 번째 수산화나트륨-세척에서 현저하게 발견된 반면에 팔미토일레이티드 펩티드는 양쪽의 수산화 나트륨-세척에서 발견되었다. 그 생산물은 고도로 수용성이고, HPLC에 의하여 좋은 순도로 (80%)쉽게 분석되었다.
HPLC 분석: 용매 A: 밀리크 수에서 0.1 % TFA/10% 아세토니트릴, 용매 B : 아세토니트릴하의 0.1% TFA.
플로우 : 1밀리리터/분, 칼럼 : 머크 릭로스퍼(Merk Lichrospher) 10, RP 18, 5마이크로미터, 25084 밀리미터.
구배는 고압 사이드 2-펌프 혼함(자스코 PU880펌프)에 의하여 조절되었고, t=0 분에서 100% A 로부터 t=10분에서 20%A 그리고 t=20분에서 0%A가 되었고, t=26분에서 100%A로 올라갔다. 유출은 바리안 9050에서 220㎚ 에서 기록되었다. 결과는 바리안스타크로마토그래피 소프트웨어에 의하여 수집되었다.
FHEM: 50 마이크로리터 1밀리그램/밀리리터, 동결건조, 탈염 조-생산물 풀.
팔미토일레이티드 펩타이등서 주요 불순물은 불완전 팔미토일레이션으로부터 유도되었다.
팔미테이트 결합비스지펩티드는 비-팔미토일레이티드 대조 펩티드(여기서 HPLC-구배는 약 5분후, HPLC-분석은 도면2에 공개되었다) 보다 휠씬후에 일루트된다. 전형적인 조제품생산은 약 80이고, 탈염 또한 약 80%이다.
생산물의 매트릭스-어시스티드 레이져-디솝션 이온화 시간-오브-플라이트 매스 스페트로미트리는 기대되는 질량(팔미토일레이티드 생산물에 대한여 2473.1의 기대 질량으로부터 2D , 도면 3 참조)잘 상응 하는 분자 이온을 낳았다. 아연이온, Zn++-, Co++-이온과 분광검사법, 서큘러 디크로이즘, 티로신 프루오레슨스 소진, 그리고 겔필트레이션을 포함하는 2차 구조와 비쉬 펩티드의 응집상태에 대한 다양한 분석이 행하여진다.
비수지 펩티드 유도수지 세척 건조,그리고 저장되고, 그리고 직접적으로 분지 펩티드의 표준펩티드합성을 위하여 또는 기합성된 펩티드 또는 다른 전체분자의 결합을 위하여 사용되었다.
동등하게 유용한 펩티드는 이들 위치에서 A를 사용하는 이중-히스티딘 킬레이팅 사이트의 교체에 의하여 얻어진다.
또다른 합성에서는, I가 V대신에 사용될 것이다.
수산화나트륨에 의한 쪼개짐에 선택적으로, 메탄올 암모니아가 사용됨에 따라, 이처리는 바람직스러운 펩티드 아마이드를 생산한다.
또한, 펩티드는 변형된 링크 결합체(4-(2,4- 디메톡시페닐 Fmoc-아미노메틸)페녹시 아세트사)와 상기에서 나열된 아미노산 유도산 유도체를 사용하면서 합성될 것이다. 이 기술에 있어서, Boc는 K로부터 DCM에서 25%의 TFA, 3×10분간의 처리에 의하여 제거될 것이다. 이것은 변형된 링크 결합체에의 결합에 영향을 미치지 아니한다. 이는 최종의, 바람직한 펩티드 아마이드 생성물을 유도한다. 또한 쪼개짐과 얼룩과정은 상기 기술한 4-히드록시메틸 벤조산 결합체와 함께 보다 단순하다.
최종적으로 변형 링크 결합체는 D 비보호의 광범위한 이용을 허락함으로써 히드라진에 대해 안정하다 (하기 참조).
주쇄 펩티드는 또한 오르토고날 보호 리신잔기와, 예를 들어 Fmoc-K(Mtt)-OH(Mtt=메틸트리틸),Fmoc-K(Dde)-OH(De=1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리딘)-에틸), Fmoc-K(Aloc)-OH(Aloc=아릴옥소카보닐), 여기서 분지사슬보호기는 1%TFA, 2% 히드라진 그리고 Pd(0)(카타리틱 히드리지네이션)에 의하여 각각 제거될 수 있다, 합성될 수 있다. 합성후, 알파 아미노 지방 결합과 선택적인 분지사슬 디마스킹, 분지 펩티드 또는 모이어티의 합성 또는 결합은 언 마스크드 주쇄 펩티드의 다른 아미노산의 분지사슬내의 기능기로부터, 특히 E 로부터 유도되는 카르복실산, 아무런 방해의 위험 없이 이루어질 수 있다.
분지 사슬아미노기에 대하여 선택적으로 쪼개질수 있는 보호기의 변화는 비수지성 펩티드 담체로부터 유도된 최종 분지 사슬의 조생성물에서의 헤테로 지네시티를감소시킨다(실시예 5 참조). 왜냐하면, 분지사슬합성과 펩티드운반체 그리고 합성되는 분지사슬펩티드의 비보호 아미노기로부터의 TBTU/HOBt/NMM에 의하여 활성화되는 유리 분지 사슬 카르복실릭기 락탐 형성 가능성의 배제 때문이다.
(도 1, 구조 nos. 4와 5)
결합체와 선택화학을 이용하는 보호기 방법을 사용하는 특별한 일러스트러티브 그리고 바람직스러운 실시예로서, 단지 하나의 부착위치 클래스를 함유하는 비수지성 펩티드 담체는 산-변성 변형된 링크-결합체에서 하이퍼 산-변성 분지사슬 아미노-보호기(메틸트리틸-(Mtt)기, 구조 nos. 3 그리고 6)또는 히드라진 변성Dde-기(1-(4,4-e디메틸 2,6,-디옥소시클로-헥시리딘)-에틸)(구조 2, 4, 5)와 조합하여 합성되었다.
표 1의 비수지성 펩티드 담체, 하기에 주어진 구조 nos. 2-7는 다음의 조건을 사용하여 합성되었다.
상기 모든 조건, 용매와 시약, Fmoc-Lys(Dde0-OH 그리고
Fmoc-Lys(Mtt)-OH,를 제외한,은 노바비켐으로부터 얻었다(nos. 04-12-1121 그리고 04-12-1137, 각각). 첫 번째 (C-말단)아미노산의 결합을 위하여, 변형된 링크-수지(4-(2'.4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸, 노바비오켐 01-64-0037)은 10분 동안
TBTUHOBtNMM활성을 사용하고 30분간 RT 에서 결합하면서, NMP에서 2*5분 동안 20%의 피퍼리딘으로 처리되고, NMP와 세척되었고, 8배몰러 과량에서 아미노산과 결합되었다. 동일한 조건을 사용하는 2차 결합이후에, 결합일드는 전형적으로 80-90%였다. NMP(20 아세틱 무수물 이퀴벌런츠, 4차아민(DMAP 또는 NMM)의 1이퀴버런츠, 10분)에서 아세틱 무수물/DMAP와 캡핑후에 NMP자동화된 합성에 의한 철저한 세척이 상기와 같이 행하여졌다. 최종 Fmoc-기의 쪼개짐이후에, 팔머틱산은 상기와 같이 도입되었고, 연속적으로, 리신 분지-사슬 보호기는 제거되었다.
Mtt: DCM에서 5% 트리이소프로필실라인하의 1% TFA, 3×5분 처리. 이탈 Mtt는 470㎚ 에서 기록되었다.
Dde : NMP에서 2%히드라진, 3*5분, 이탈 Dde는 290㎚ 에서 이탈되었다.
분지사슬 부착점의 일드는 일반적으로 60-80% 였다.
이후에, 비수지성 펩티드 담체의 순도를 분석하기 위하여, 펩탕;드 수지의 작은 포션이 표준 TFA-쪼개짐 과정(수중의 95%TFA, 스카빈거는 더해지지 아니하고, 물에서의 디솔루션 그리고 동결건조)에 의하여 쪼개지고 분석 역상 HPLC에 의하여 분석되었다.
펩티드는 순도와 일드가 좋았고, 주요 조생성물피크의 질량 광분석은 표1에서 주어진 이론적인 분자질량으로부터 5Da이상 다르지아니한 분자질량 값을 주는 것으로 기되된다.
합성된 구조
표 2에 표시된 2가지 형태의 모델 구조는ms-분석에 의하여 구조를 밝히기 위하여 MTT-보호와 합성되었다.
MTT는 DCM에서 1% TFA/5% 트리이소프로필실라인에 의하여 제거되었고 분지-펩티드(YLEN 그리고 WNSG, 각각)는 각 주쇄의 하프에서 합성되었다.
쪼개짐과 정제 이후에 모든 구성은 말디 -토프 질량광분석에 의하여 분석될 것이다.
이 지량 광분석은 표2에서 표시된 이론값과 5Da이상 다르지 아니한 분자량을 줄것으로 기대된다.
수개의 헵타드-함유 모델 비-수지 펩티드 운반체가 또한 합성될 수 있고, 2가지의 리신 보호형태가 사용되었다.; 리신 부착점에 대하여 선택적으로 쪼개질 수 있는 것으로 단지 헵타드의 "C"- 위치에 있는 리신과 "g"-위치에 Boc-보호되는 리신 만을 포함한다. 이는 "c"위치에서의 유도와 동시에 "g"위치에서의 전하의 유지를 허용한다.
또한, 추가적인 선택적 디블락커블 K-잔기가 f-위치에서 유도될 수 있는 이 사용될 수 있다.
따라서, 다음의 모델 펩티드는 K로 지시되는 선택적 탈불록화할 수 있는 리신잔기와 합성될 수 있다:
VAKLEAKVAKLEAK(1)
VAKLEAKVAKLEAK(2)
VAKLEKKVAKLEKK(3)
이들 합성은 상기 기술된 바와 같은 변형 링크-결합체에서 수행될 수 있다.
K-잔기의 디믈락킹후에, 그들은 비 치환된 모델 펩티드와 비교하여 호모이량체 형성은 물론 AELGGQFHHKSNG와의 유도, 쪼개짐, 그리고 제조(work up), 그리고 알파 나선 성분에 대해 분석될수 있다.
부착된 펩티드의 접근 가능성과 항원성은 펩티드에 대해 길러진 모노클로날 항체와 분석될 수 있다.
호모이량체 형성은 물론 나선- 는 분지 사슬 유도 이후에 훌륭한 알파 -핼릭스와 이량체-형성자인 것으로 기대되는 2개의 다른 펩티드와 비교하여 유도 펩티드(2)에서 감소될 것으로 기대된다.
또한, 펩타이즈(1)과 (3)은 간접ELISA에서 펩티드2 보다 효과적 인식을 초래하면서, 분지-사슬 펩티드를 모노 클로너 항체에 대하여 보다 효과적으로 발현할 것으로 기대된다.
다른 변형
세게의 분지사슬 보호 라벌리티를 결합함에 의하여(약산, 강산, 그리고 히드라진), 결합자극 펩티드에 대한 특이적인 부착점은 물론, 예를들어 시토신 펩티드(실시예5참조)(표1,구조7), "정상적" 분지 사슬 부착점 양자를 사용하는 비수지성 펩티드 담체를 합성하는 것이 가능하였다.
다른 표준 펩티드 운반체 변형물의 범위는 또한 동일한 방법으로 합성되고 분석될 수 있다; 이들 변형물은 히스티딘 페어를 리신-글루타믹산 페어로 치환, 연속적으로, 분지사슬을 선택적으로 비보호함에 의하여 분지사슬이 반응하는 것을 허용함 에 의하여 락탐-안정화되는 펩티드 운반체를 포함한다; 다른 변형물은 2차구조 뉴클리에이터에 의하여 부착점에서 치환된다.; 그러나 다른 변형물은 그 C -말단에서 함께 함께 지탱되는 2개의 펩티드 사슬을 구성하는 비수지 펩티드를 생성하는 ,이중 분지 결합체 분자에서 합성될 수 있다; 또한, 선형 팔미테이트 대신에, 도3의 트리팔미테이트 구조의 변형물이 합성될 수 있다.
최종적으로, N -말단 시스타인내의 분지 사슬 티올기에 티오에스테르 결합에 의하여 팔미테이트가 부착되는 비-수지 운반체 펩티드가 합성되고 면역화 실험을 위하여 사용된다.
표 1
비수지성 펩티드 담체의 형태(분자량(mw)은 비보호 펩타이에 대한 것임).
1 Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY-OH(K=K(Boc), mw ; 2473.1
2 Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Dde), mw ; 2472.1
3 Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Mtt), mw ; 2472.1
4 Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKYVQGEESNDK-NH2(K=K(Dde), mw ; 3459.1
5 Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKYVQGEESNDK-NH2(K=K(Dde), mw ; 3459.1
6 Palm-AVAKLEAKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Mtt), mw ; 2340.0
7 Palm-KVAKLEAKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Dde) 그리고 K=K(Mtt)), mw ; 2397.1
표 2
모델 비수지 펩타이드 운반체의 형태
1 KGKGKGL-NHpalm-KGKGKGL-NH2
2 KGKGKGL-NHpalm-KGKGKGL-NH2
3 KGKGKGL-NHpalm-KGKGKGL-NH2
K=Lys(Boc)K=Lys(Mtt)palm=palmatiol 잔기분자량(mw)은 비보호 펩타이드에대한 것Mw.: 685.9 (비-팔미토일레이티드 펩타이드)924.3 (팔미토일레이티드 펩타이드)분지-펩타이드 : YLEN-분자량 결과:1732.9(2 부착점, 비-팔미토일레이티드)1971.4(2부착점 팔미토일레이티드)2256.6(3부착점,비팔미테일레이티드 )2495.0(3부착점, 팔미토일레이티드)
4 GKGKGKL, K=Lys(Mtt)mw(비보호) : 962.2
5 Palm-GGKGKLYL, K=Lys(Mtt)mw(비보호) : 1200.6
6 N(WNSG)-팜-GKGKGKLYL, K=Lys(Mtt)mw(비보호) : 2534.0
실시예 2
자유 펩티드는 물론 비수지성 펩티드 담체의 동시 합성되나 개별적인 방출을 위한 고체상
다음의 방법은 고체상 합성에 의하여, 비수지성 펩티드 담체(NDPC)결합 펩티드와 합성성공의 직접적인 조사를 허락하고 면역화 실험에 있어서 대조-펩티드에 대한 접근을 주는, 자유형태의 동일한 펩티드를 직접적으로 얻기 위한 수단으로 고안되었다.
이는 고체상 수지를 라벌 결합체의 혼합물, 예를들어 염기-변성 4-히드록시메틸 벤조산(HBM)과 결합된 4-히드록시메틸페녹시 아세트산(HMPA)산-변성 결합체와 직교적으로 치환함에 의하여 달성될 수 있다. 다음 결합체 중의 하나는 일시적으로 차단된다. 비수지성 펩티드 담체(NDPC)가 다른 결합체에 합성되는 동안에.
그 처리 NDPC 분지사슬 보호 기를 제거하는,는 또한 다른 결합체의 보호기를 제거한다. 그러한 합성의 한 예로서, 노바신 염기 수지는 수지와 수지의 아미노기의 수에 대해 0.1 몰라비의 TBTU/HOBt/NMM 활성결합체를 상온, 진탕하에서 1*30분 동안 NMP 에서 결합하는 인큐베이션에 의하여 HMPA-결합체에 의하여 부분적으로 치환된다. 다음으로 수지는 NMP 의하여 세척되고, 잔여 아미노기는 상기데로 2*30분동안 상온 진탕으로 활성된 5배 몰러 과량의 Fmoc-뉴클레오신에 의하여 차단된다.
NMP에서 세척 후, Fmoc-L의 알파 - 아미노기는 NMP에서 20%피퍼리딘에 의하여 제거된다. 재 NMP 세척후에, HMB - 결합체는 상기에서 기술한 바와 같이 5배 몰러 과량으로활성화와 두 번째 결합에 의하여 부착된다. NDPC는 실시예 1에서 기술된 바와 같이 이 고체상에서 합성된다. HMPA-결합체에 결합된 Boc-G는 물론 분지-사슬 보호기는 물속에서 95% TFA에 의하여 쪼개진다. 그 결과인 고체상은 자유 펩티드와 펩티드 유도 NDPCDML 동시 합성에 사용될 수 있다. NDPC가 염기 처리에 의하여 단지 릴리즈 되는 반면에 전자는 TFA- 처리에 의하여 (수중의 95% TFA) 한 단계에서 이탈되고, 비보호된다 (실시예1 참조).
수행되는 또 다른 실시예에 있어서, 그 수지는 수지를 TBTU/HOBt/NMM-활성 결합체와 수지의 아미노기수에 대한 0.1몰러 비율에서 인큐베이팅, 상온에서 30분간 진탕으로 NMP 하에서 결합에의한 Fmoc-보호 링크-결합체에 의하여 부분적으로 치화뇐다. 연속적으로, HMB-결합체는 상기와 같은 활성화에 의하여 5배 몰러 과량으로 2번째 (30분, 상온, 진탕)결합하는 수지의 잔여 유용 아미노기에 결합된다. 다음 Fmoc-기는 링크-결합체로부터 20% 피퍼리딘/NMP에 의하여 제거되고 Boc -G는 자유 아미노기에 TBTU/HOBt/NMM 활성화학에 의하여 결합된다. 이러한 결합 조건은 HMB-결합체의 히드록실기에의 에스테르리피 케이션에 비하여 아미노기에 대한 결합을 선호한다. NDPC는 실시예1에서 나타낸 것과 같이 고체상에서 합성된다.
DCM 에서 50% TFA를 사용하는 비보호 단계에 있어서, 링크-결합체 결합 G의 Boc-기는 물론 주쇄 리신의 에타-아미노기를 보호하는 Boc-기도 제거된다. 그 결과인 고체상은 자유 펩티드와 펩티드 유도 NDPC와 동시 합성에 사용될 수 있다. NDPC가 염기 처리에 의하여 단지 릴리즈 되는 반면에, 전자는 광범위한 TFA- 처리에 의하여 (수중의 95% TFA) 이탈되고, 비보호된다 (실시예1 참조).
실시예 3
루프 펩티드 제조를 위한 비수지 펩티드 빌딩 차단
4 착조가 알려진 대부분의 단백질에서 루프는 매우 일반적이고, 쉽게 구별할 수 있는 모양이다. 게다가, 그러한 루프는 종종 단백질의 이뮤노도미넌트 부분을 구성하고 루푸 유도 셋업에서 쉽고, 일반적인 제조를 위한 방법은 따라서 매우 흥미있다. 예로서, 이것은 실시예 1에서 상술한 고체상 방법에 따라 노바신 KB수지 상에서 일차 비-수지 빌딩 차단, 팔미티올레이티드 테트라 펩티드 PC(Trt)K(Palm)를 합성함에 의하여 가능하다. Fmoc-기는 K에 놓여지고, 에타 아미노기는 실시예1에서와 같이 DCM 에서의 50%TFA처리에 의하여 비보호된다. 계속하여, 팔미틴산은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 이 아미노기에 결합되고, 그결합의 완성은 카이저 테스트에 의한다. 이후에, 알파 아미노 Fmoc-기는 쪼개지고, 잔여 펩티드는 합성된다. 펩티드는 마지막의 Fmoc-기의 쪼개짐 이후에 수지에 놓여진다. 다른 빌딩 블록이 이상적인 펩티드가 될 수 있으나, 용융성이고 실시예 1에서 기술한 바와 같은 수산화 나트륨 처리에 의하여 쪼개어지고, 산에 비보호되고 여전히 마지막 Fmoc기를 지니고 있다. 다른 용융성 빌딩 블록으로서 Palm-PK(BrAc)LB가 합성된다. 여기서 BrAc는 TFA/DCM으로 분지사슬 비보호 이후에 K잔기의 에타- 아미노기와 브로모아세트산과의 반응에 의하여 유도된 브로모아세틸 성분이다. 루프로서 발현될 표적-펩티드(포함되는 표적 펩티드는 인간IL-1베타 (LQGQDMEQQV(단백질의 원형상태의 aa31-40), DPKNYPKKKMEKRF (원형의 단백질에서aa86-99에 사응하는 펩티드),VQGEESN(원형의 단백질레서 aa47-55),GGTKGGQDIT(원형의 단백지과 포신 1베타 인터류킨-1베타에서 상응하는 루프)는 표준방법(실시예 1)에 의하여 고체상 결합 펩티드의 자유 알파 -아미노기에서 합성된다. t시스타인 함유 표적 팹타이등서, 표적 펩티드C는 C(Trt)에 직교하여 보호된다. 이들 고체상 결합 펩티드의 최종 Fmoc-기의 쪼개짐후에, 많은 몰러 과량(10배)하에서 자유 빌딩블록은 활성화되고, 실시예1에서 기술한 바와 같이 팔머틱산에 대하여 카이저 테스트가 네거티브 일때 까지, 고체상 결합 펩티드에TBTUHOBtNMM과 결합된다. Fmoc-기와 분지사슬 보호기는 실시예1에서 기술한 바와 같이 제거되고, 수지에의 시클리제이션은 음성의 엘만-반응때까지 I2/NMP와 산화에 의하여 이루어진다. 브로모 아세틸레이티드 아세트레이티드 빌딩 블록과 함께, 시클리제이션은 PBS, pH 7.2, 수지상에서HBr 의 동시 방출과 함께, 안정한 티오이스터를 형성하면서 이루어진다. 만일 잔여 Cys-보호기가 있다면, 그 특이적인 처리에 의하여 제거 될 것이다. 이후에 전체 복합불은 상기의 수산화 나트륨에 의하여 이탈될 것이다. 디설파이드 형성은 디설파이드형성조건(에를들러 그랜트1992)하에서 저 농도의 펩티드를 사용함에 의하여 선형펩티드의 이탈후에 용액상에서 이루어질 수 있다. 루프 펩티드 내에 잠재적으로 상호작용하는 어떤가거 있는 한, 다른 기능기쌍은 상기와 유사한 방법으로 사용될 수 있다. 실시예는 그루타믹산 또는 아스파틱산과 리신사이의 락탐브리지형성을 포함한다. 합성과 쪼개짐 이후에 펩티드는 실시예1에서 기술한 바와 같이 HPLC에서 분석될 것이다. 시클릭 펩티드는 그에 상응하는 선형 펩티드에 앞서 용출될 것으로 기대된다.
실시예 4
앤코링 펩티드
HMB결합체는 히드라진과의 쪼개짐에 의하여 펩티드 히드라지드(C-아실-히드라진)펩티드 히드라진의 조제를 허용한다. 펩티드 히드라지드는 온화하게 산화된 탄화수소 또는 화합물, 예를 들어 글리코단백질, 함유 탄화수소의 결합 또는 환원에 뛰어난 시약이다. 그러한 펩티드 합성의 예는 다음과 같다:
다음으로 나열하는 펩티드는, 4도씨 2시간 동안 다이옥산/메탄올(9/1)내의 50% 히드라진-히드라이트로 비보호에 앞서 실시예1에서 기술한 바와 같이 합성되고 알파-N-말단 팔머틱산에 의하여 유도된다. 다음으로 여과, 동일한 용매로 세척, 여과물의 중화, 증발, 그리고 최종적으로 수중 용출과 리포필레이션에 의해 유도된다. 펩티드는 다음으로부터 선택된다.
QYIKANSKFIGITE(테터너스 톡소이드 830-843), FNNFTVSFWHRVKVSASHLE(테터노스 독소 947-967), DQVHFQPLPPAVVKLSDALI(마이크로 박테리움 튜버큘로시스 38 kD 항원 350-369), DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로조이테 단백질378-398), KLLSLIKGVIVHRLEGVE(미즐 바이러스 F-단백질 286-302),LDNIKGNVGKMEDYIKKNNK(플라스미디움 팔시파룸 MSP-1, 260-279)와 같은 일반적 T-cell 자극 펩티드, 플랭킹 서열(Thomson 1995 참조) 이 없는 수개의 서로 다른 T-세포의 선형 공유 정렬을 구성하는 포리에피토프 구조;
푸트신 올리고머(TKPR)N,여기서 N은 바람직하게는 2-5, 또는 뮤라밀 디펩티드( N-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민);
팜-YGLAELKG에서와 같이, Y의 함량에 의한 탐지 가능성을 제공하는 공간 펩티드;
실시예 5, 6에서 기술한 바와 같이 제조된 그러나 펩티드 히드라진을 생성하기 우하여 이탈된 펩티드 유도 비수지성 펩티드 담체의 조합, 여기에서 포함된 분지 펩티드는 T-세포 자극 펩티드의 어느 하나에 의하여 구성된다.
Y 또는 W를 함유하지 아니한 펩티드에 있어서, 하나의 Y가 펩티드의 한쪽 끝으로 우선적으로 삽입된다.
표준 주쇄 펩티드의 실시예1에서 기술된 역상 HPLC-분석은, 히드라지드로서 쪼개진 동일한 펩티드분석과 비교하여, HPLC에서 리션 시간과 순도 양자에 있어서, 이들 두 펩티드의 행동사이에 매우 작은 차이만이 있다.
질량 광분석은 -CONHNH2에의한 -COOH의 치환에 대응하는 14D에 의하여 즈가된 펩티드 사출을 보여줄것이 기대된다.
히드라지드 엔코리 펩티드는 디솔트, 동결건조되고 탄화수소를 페리오데이트에 의하여 조절된 마일드 산화에 의해 얻어지거자 또는 탄화수소의 환원말단에 의하여 제공된 접근가능한 카보닐기와 탄화수소를 결합하는데 이용될 것이다.
실시예 5
비수지성 주쇄 펩티드 담체에의 직접적이고, 연속적인 화학적 고체상 합성에 의한 펩티드 부착.
고체상에 결합되는 비수지성 주쇄 펩티드 담체는 공지의 고체상 펩티드합성을 위하여 지접적으로 사용될 수 있다. 이를 행하는 하나의 방법은 Fmoc- 베이스드 화학을 실시예 1에서 기술된 형태의 염기- 또는 산- 쪼개지는 주쇄 펩티드에 사용하는, 공지의 연속 펩티드 합성을 이용하는 것이다. 유도 비수지성 펩티드 담체를 고체상으로부터 동시에 쪼개는 변형된 링크-결합체의 경우와 수성 염기와 디솔팅과 동결건조에 의한 워크업에 의한 분지 펩티드 복합물의 표준 쪼개짐이 뒤따르는 염기 쪼개짐성의 HMB-결합체의 경우에 있어서, 분지-펩티드의 합성이후에, 보호기는 TFA에 의하여 제거된다. 이러한 예로서, 합성은 다음과 같이 이루어진다.:
최초 아미노기에 대하여 에타-아미노기로서 최대 6배를 함유하고 있는 것으로 평가되는, 실시예 1(표 1, 구조 1)의 주쇄 리포펩티드로 유도된 노바신 KB수지는 수지의 각 아미노기에 도입된다. 1000밀리그램의 최초 수지에 대응하여 150밀리그램의 유도수지가 표준 Fmoc-화학과 실시예1에서 기술된 것과 같은 TBTUHOBtNMM 을 사용한는 합성에 사용되었다. 합성후에, 최종 F,moc -기와 분지-사슬보호기는 제거되고, 고체상으로부터 실시예 1에서 기술된 표준처리에 의하여 전체 분지 펩티드 복합물이 고체상으로부터 쪼개졌다. 펩티드 함유 부분은 2개의 자스코 PU880 펌프와 단게-구배를 사용하는 10밀리리터/분에서 라디얼리 압축된 델타-팍 C18 300옹 스트롱 카트리를 함유하고, 아세토니트릴/TFA를 100% 용출하며, 완성 펩티드 피크를 수집하고 동결건조하는 워터스 프립팍 25×10카트리지 홀더상에서 반투성 크레마토그라피에 의하여 풀로 디솔트 되었다. 동결 건조된 물질은 수성 버퍼에 고도로 용융성이다. HPLC는 분지 리포펩티드 복합물이 자유 리포펩티드-주쇄 단독 보다 리텐션 시간이 낮음을 나타내었다. 합성에 의하여 얻어진 실제의 분지의 수를 셈하는 것은 물론 질량 광 분석이 행하여졌다. 이론적인 Y/W- 함량과 분자량에 비교하여, 주지의 분지 펩티드 종도의 E280에 기초한 계산이 수행되었다.
특히 바람직한 실시예에서, 변형 링크-MBHA -수지가 실시예 1에서 언급한 선택적인 화학, 즉 표준 Boc-보호된 리신에 더하여 Mtt-그리고/또는 Dde-보호리신 사용되었다. 단지 단순한 TFA-쪼개짐 그리고 워크옵 절차, 그리고, 물론, 선택적 비차단에 의해 생성된 부착점을 제외하고는 분지 펩티드 합성의 원칙은 상기와 같다.
주쇄 번호1(표1), 다른 것은 지시되지 아니한다.
머티리얼 펩티드:
TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD(EBA펩티드)
LSKHMNRESDDGELYDENS(EBA펩티드)
플라스모디움 팔시파룸 Ag332로부터 펩티드:
(VTEEI)
([VTEEI]2)
([VTEEI]3)
레이슈마니아 펩티드:(주쇄 번호6 (표 1))
YDQLVTRVVTHEMAHA
EAEEAALQA
HIV 펩티드
LERLLL(HIV gp41펩티드)
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(HIV gp120 펩티드)
주쇄 2 상의 GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF, 도 13에서의 HPLC분석
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
VGCSKLICTTAVPWN(HIVgp41펩티드)
LQDQARLNSWGCAFRQVCHT(HIVgp36펩티드)
액티노바실러스 플레우로프네우모니에 펩티드
Tbp-2(트렌스퍼린-결합 단백질 타입 2)
SGGKGFDLEDV(펩티드1)
TEADYAKRAVLEY( 펩티드5)
히드로필리시티에의하여 선택된 유도 필라먼트 히포테티컬 단백질로부터의 펩티드
CASQRDRFQVHNPHENDA
CKSQSGIEKTTRILHHANISESTQQN
CQATAKMAEEQLTTLHVRSEQQS
리신 에타 아미노깅대한 두 개 또는 그 이상의 서로 다른 분지-사슬 보호기를 함유하는 보다 복잡한 구조가 합성되었다. 분지사슬 보호기의 3가지 다른 령태를 수반하는 비수지성 펩티드 담체의 사용의 예로서 실시예로서, 표1에서의 구조 번호7이 합성되었다. 팔미토일레이션후에, 분지- 사슬 Mtt- 기는 연속 합성 또는 앤블록 결합에 의한 분지 펩티드의 결합이 뒤있는 DCM하 1% TFA/5% TIS에 의하여 제거되었다. 분지사슬 펩티드의 알파 아미노기는 아세틱 무수물에 이하여 아실레이트화 되었다.
다음으로 Dde-기가 NMP하에서 2%의 히드라진에 의하여 제거되었고, 이탈된 아미노기는 SPDP로 유도되었다. 마지막으로, 시스틴 확장 펩티드와 결합되었다. 보다 복잡한 구조가 합성되었다. 표 1에서 숫자는 비수지성 펩티드 담체에 관한 것이다. Lys(Dde)와 Lys(Mtt)는 함성중 각각 Dde와 Mtt에 의하여 보호되는 잔기이다.
Mw.=분자량
{[N6(IL-1베타pep- C-Cys)Lys(Dde)][N6(gp120)Lys(Mtt)]4}- 구조 7,mw.: 14862
{[N6(IL-1베타pep- N-Cys)Lys(Dde)][N6(gp120)Lys(Mtt)]4}- 구조 7,mw.: 14862
{[N6(IFN감마-1)Lys(Dde)][N6(gp120)Lys(Mtt)]4}-
N알파Lys(Dde)-구조 6, mw.: 18573,
{[N6(IFN감마-2)Lys(Dde)][N6(gp120)Lys(Mtt)]4}-
N알파Lys(Dde)-구조 6, mw.: 18604,
{[N6(TNF알파)Lys(Dde)][N6(gp120)Lys(Mtt)]4}-
N알파Lys(Dde)-구조 6, mw.: 15231,
{[N6(IFN감마-1)Lys(Dde)][N6(라이쉬마니아)Lys(Mtt)]4}-
N알파[Lys(Dde)]-구조 6, mw.: 14594,
{[N6(IFN감마-2)Lys(Dde)][N6(라이쉬마니아)Lys(Mtt)]4}-
N알파[Lys(Dde)]-구조 6, mw.: 14625,
{[N6(TNF알파)Lys(Dde)][N6(라이쉬마니아1)Lys(Mtt)]4}-
N알파[Lys(Dde)]-구조 6, mw.: 11252,
{[N6(IFN감마-1)Lys(Dde)][N6(라이쉬마니아2)Lys(Mtt)]4}-
N알파[Lys(Dde)]-구조 6, mw.: 11462,
{[N6(IFNγ-2)Lys(Dde)][N6(라이쉬마니아 2)Lys(Mtt)]4}-
N알파[Lys(Dde)]-구조 6, mw.: 8120,
IL-1ßpep: VQGEESNDK(I1-1β(163-171))
IL-1ßpep-C-Cys: VQGEESNDKC
IL-1ßpep-N-Cys: CVQGEESNDK
IFNγ1(1-39): HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG(C)
IFNγ2(95-133):AFEVNNPQVARAAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKC
TNF-α(70-80): (C)PSTHVLLTHTI
gp120: GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYEAFF
레이슈마니아 1: YDQLVTRVVTHEMAHA
레이슈마니아 2: EAEEAARLQA
(C) 는 시스틴잔기 , 천연 서열의 이루가 아닌, 결합을 위하여 SPDPE를 통하여 더해진 것이다.(실시예 7 참고)
펩티드는 HPLC에의하여 슨도가분석되고 질량광도계에 의하여 분자량이; 분석된다.
조 생성물은 쉽게 구별되고 정제하는 것이 가능한 주요 펩티드 생성물(60%이상)을 상기 분자량을 5 Da 이내로 하면서 함유하는 것으로 기대된다.
합성의 실시예로서, 다음의 펩티드는 도1의 번호3,5,6 ,그리고7 형태를 포함하는 수개의 주쇄에서 합성된다.
[QGPGAP]4(말라리얼 서컴스포로조이테 단백질)
GHPLQKTY(밴드-3단백질)
LTPLEELYP(밴드-단백질)
KNGMLKGDKVS(β2- 글리코프로테인-I 펩티드)
CKNKEKKC(β2- 글리코프로테인-I 펩티드)
히드로 필리시티와 호몰로지 고려에 의하여 선택된 인간과 돼지의 IL-1β;
실시예 3 참조
다른 주쇄는 시토키네 펩티드와 실시예4의 목록에 포함된 프로미스커스 T-세포 결합 펩티드 선택된 보족 펩티드를 함유하게 된다. 특히, 터프신-펩티드([TKPR]N,N=3-7)와 IL- 노나펩티드VQGEESNDK는 수개의 선형 그리고 분지 정렬내에 포함된다.(펩티드 구조 5번(표1)내의 IL-1베타-펩티드 선형 포함에 더하여)
또한, 함성펩티드의 실시예는 아래의 실시예에 언급된다.
모든 구성은 분자량과 수도에 대하여 질량 광분석계와 역상 HPLC로 분석된다. 이것은 또한 다음의 실시예에서 기술하는 모든 구성에 대하여도 그렇다.
주쇄 펩티드의 저 부하
고체상에서 분지 펩티드 결합을 위한 주쇄로서 작용중에 비수지성 주쇄 펩티드 담체의 영향을 조사하기 위하여 2개의 계획된 낮은 농도의 고체상 복합물이 준비되었다. 하나는 31 마이크로몰/그램(일차 아미노산과 15분 결합)에서, 다른하나는 61마이크로몰/그램(일차 아미노산의 30분 결합), 그리고 양자는 노바신 KB상에서 실시예 1에서와 같이 약130마이크로몰/그램의 표준 치환에 비교되었다.
양 경우에, 고체상 수지 에서의 추가적인 부착점은 합성에 앞서 아세틱 무수물/DAMP에 의하여 차단되었다. 모델 펩티드GHPLQKTY가 비수지성 주쇄 펩티드 고체상 복합물에 상기와 같은 직접 합성에 의하여 결합되었고, Fmoc값이 함성의 각 각단게에서 측정되었다. 분지의 최대 숫자가 높은 호모게니어티로 저적하 고체상 복합물과 결합되는 것이 관찰되었다.
복수 부착점에의 직접결합
알파-Fmoc-K( 에타-Fmoc)를 비수지성 주쇄 펩티드 담체 아미노기에 결합시킴에 으하여 복수화된 부착점이 도입된다. 복수화된 부착점은 분지 펩티드 합성중에 부착점에 비수지성을 도입하기 위하여 일차 리신 다음을 포함한 어디든지 도입될 수 있다. 아미노산과 결합시약의 결합농도는 이퀴벌런츠의 증가된 수에 따라 조절되어야한다. 백본의 증가된 "크라우드니스"를 극복하기 위하여 증가한 결합시간이 필요할 수 있다. 본 실시예에 있어서, Y [VYKLEAKVAKLEAK]를 함유하는 2회전 알파-헬리칼 양친매성 펩티드는 상기에서 기술한 방법에 의하여 양 부착점치환된 주쇄은 물론 정상의 비수지성 펩티드담체 주쇄에서 합성될 수 있다.
모든 결합단계 후에 Fmoc-값이 결정되고, 카이저 테스트가 행하여진다. 최종 생성물의의 E280이 또한 측정되고 분자내의 티로신 잔기로부터의 유도된 이론값과 비교된다 (퍼킨스1986 참조). 마지막으로, 질량광도계와 서큘러 디크로이즘이 행하여진다. 그 결과는 적절한 반응 조선을 선택함에 의하여 2배 농도결합이 가능하였고, 펩티드의 길이가 증가함에 따라 결합의 완성이 점차 어려워진다는 것을 보여줄 것으로 기대된다. 최종의 쪼개지고 그리고 용해도나생성물의 서큘러 디크로이즘은 정상적 유도 비수지성 펩티드담체와 비교하여 알파 나선의 상대적 증가된 양을 보일 것으로 기대된다.
두 개의 다른 펩티드의 동일한 주쇄에 결합
1. 다중 부착점의 사용 :
이는 리신을 TFA와 피퍼리딘에 대하여 안정한 에타-아미노 보호기와 함께 사용함에 의하여 달성된다. 그러한 한가지 기가 NMP에서 2%히드리진에 의하여 쪼개지는 Dde((1(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥시리딘)-에틸)이다. 또다른 그러한 기는 Pd(0)-촉매 히도러지네이션에 의해 쪼개지는 Aloc(알릴옥시-카보닐) 이다. 이들 리신 유도체들은 모두 상업적으로 유용하다. 이 아미노기의 비수지성 펩티드에의 결합과 피퍼리딘으로 Fmoc-기를 보호하는 것은 Boc- 알파- 아미노보호된 아미노산으로 끝나야 하는 일차 형태 분지의 결합을 위한 알파-아미노기를 제공한다. 그 다음 NMP에서 2%히드라진 히드레이트로 5*3분 처리한 후 NMP세척에 의하여 에타-아미노-기능성이 다른 분지의 결합을 위하여 유용하다. Fmoc rk 히드라지에 대해 불안정하므로 그 역순서의 실험은 불가능하다. 또한, HMP-결합체가 히드라진-변성이나, NMP와 같은 아프로틱 용액에 단시간, 저농도의 노출은 HMB-결합체에 영향을 미치지 아니한다.
2. 비수지성 펩티드 담체의 주쇄부분내에 또는 분지사슬 또는 분지사슬의 일부로서 추가적 펩티드의 포함
상시에서 기술한 원칙을 사용하여, 서로 다른 펩티드 또는 폴리 펩티드는 비수지성 주쇄 펩티드를 사용하는 분지 펩티드 복합물에 포함될 수 있다. 이는 다음에 의하여 도입된다.
-다르게 보호된 부착점(두개의 다른 펩티드)
-분지 내에서 다른 항원의 선형조합
-주쇄 펩티드의 N- 그리고/또는 C-말단에서 다른 항원의 선형 조합
만약 주쇄 펩티드내에 포함된 다면, 그러한 추가적인 펩티드는 주쇄의 저들 부분에서 분지사슬 치환을 피하기 위하여 적절하게 보호된다. 직교의 부착점에 위치하기 위하여, 펩티드는 또한 보호되는 위치에 놓여져야한다. 만약 그러한 펩티드가 광범위한 용도가 있다면, 그것은 일반적이고, 기합성된 "분지주쇄"구조에 포함될 수 있다. 하나의 실싱에 있어서, 실시예 1에 의한 비수지성 주쇄 펩티드는 IL-1-베타 펩티드 VQGEESNDK를 구성하는 C-말단 확장, Dde-보호 리신(실시예 1, 표 1, 구조번호 4, 5 참조)으로 합성되었다. 다음으로 이 주쇄 페티드는 직접 합성에 의한 항원성의 HIV gp120펩티드, GEIKNCSFNISTSIRGKVQKYAFF(실시예5참조) 결합에 사용되고, 다음의 실시예에서 면역화 실험내에서 IL-1-베타 펩티드 확장이 없는 동일한 구조와 비교된다.
본 실시예에 있어서, 실시예 1에서 공개된 비수지성 주쇄 펩티드를 사용하는, 실시예4에서 주어진 목록에 포함된 T-세포 자극 펩티드는 알파 아미노기에서 합성될 것이다. 다음으로 에타- 아미노기에서 항원성 펩티드의 팔미토일레이션과 함성이 있다. 하나의 그러한 합성이 T-세포 자극펩티드 QYIKANSKFIGITTE(테타너스 톡소이드 830-843)와 알파-아미노기 상에서 수행되고, 항원성 펩티드로서 GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF (HIV gp120 펩티드)가 에타-아미노기에 결합될 것이다. 또다른 합성에 있어서, 항원성 펩티드는 IL-1-베타-유도 자극 펩티드 VQGEESNDK와 조합하여 결합될 것이다.
실시예 6
간접 결합: 화학적 기합성, 차단 펩티드와 결합에 의한 부착
이러한 실시예가 단독 부착점을 사용하는 합성만을 제시하고 있으나, 추가의 비;차단 기능기의 도입이 있는한 동일한 결합이 다수 부착점과 다르게 보호된 부착점에서 가능하다.
"N-말단 종료" 지향 에서의 결합
합성 실시예에 있어서, 결합될 펩티드는 노바신 KB에 Fmoc-화학을 사용하여 합성될 것이고, 그 분지 사슬에서 고체상으로부터 쪼개지고, 피페리딘을 생성하는 수용성 염기 처리와 TFA-처리에 의하여 차단되는 형태의 알파 아미노기가 될 것이다. 이 차단 펩티드는 그 이상의 정제 없이 직접 사용되고, NMP에서 TBTUHOBtNMM에 의한 선 활성화, 그리고 연속적으로 카이저 테스트가 음성일 때 까지 고체상의 주쇄 펩티드와 10배 몰러 과량하에서 인큐베이트된다. 한 시간 이상도안 결합 시간을 연장함 이 없이 완성된 결합을 얻기 위하여, 활성화되고, 차단된 새로운 포션으로 결합은 반복된다.
역 지향에서의 결합
본 실시예에 있어서, 결합될 펩티드는 알파-아미노 Fmoc -기의 최종적 피퍼리딘-쪼개짐을 포함하고, 아마이드로서 분지사슬 보호펩티드를 생성하면서, 바로 노바신 베이스 고체-상에 결합된 산-변성 3-(아미노-메톡시벤질)-4,6-디메톡시페닐프로피오닉 산 결합체에 합성될 것이다. 이 펩티드는 고체상 결합 표준 비-수지성 주쇄 펩티드 담체의 아미노기에 글루타르 알데히드 또는 EDC(실시예7 참조)에 의하여 결합되고, 세척되며, 쪼개지고, 정제된다.
실시예7
간접적인 결합: 화학적 선합성 또는 재조함적으로 발현된 분지-사슬 비- 차단 펩티드에 의한 부착
여기서는 합성 또는 천연의 비보호 펩티드(프로테오리틱 절편, 재조합 절편 등)에 대한 화학 선택적인 리게이션 화학에 관한 몇 몇 실시예가 제시된다.
합성 도는 재조합 펩티드의 특별한 경우, 펩티드 사슬에서 원하는 위치에 특이한 아미노산, 특히 시스타인을 포함할 수 있는 자유는 그러한 결합을 가능하게 하고, 유용한 결합 방법으의 범위를 확장한다. 그러나 어떤 서열의 비보호 펩티드를 화학선택적으로 결합하는 수단이 실재한다.
일시적 보호에 의한 비 변형 펩티드의 표준 주쇄에의 결합
바람직스러운 일시적인 보호 방법은 시트라코닐레이션(일차 아미노기 보호, 저pH에 의하여 방출된 보호기) 그리고 Fmoc-수시니미드(일차 아미노기 보호, 보호하는 기는 피퍼리딘에 의하여 방출된다)에 의한 Fmoc-유도를 포함한다.
하나의 실시예에 있어서, 선 합성된 펩티드는 0.1M NaHCO3하에서의 2 밀리그램/미리리터, pH9,에 용융되고, ㎖당 10마이크로리터 시트라코닉 무수물(CA)가 더하여 진다. 이는 CA첨가에 pH RK 안정한 상태로 유지될 때까지 반복된다. 다음 인큐베이션이 4도씨에서 하룻밤 수행된다. 다음 10밀리그램EDC(1 - 에틸-3-[디메틸(아미노프로필)] 카보니미드,(피어스 엘티디.로부터))이 밀리그램 펩티드당 더하여 지고, 고체상에 여전히 부착되어 있는 비수지성 주쇄 펩티드의 첨가에 앞서10분간 인큐베이트 된다. 계속적으로, 이 상등액은 상온에서 2시간동안 아지테이션에 의하여 반응하도록 허락된다. 그 생성물은 실시예 1(시트라코닉 무수물기는 산에 의해 제거된다)에서 기술한 절차를 사용하여 만들어 질 것이다.
또 다른 실시예에 있어서, 일시적인 보호가 석신니미드로서(1 equivalent) 물/아세톤(1/1, vol/vol)내에서 1M의 카보네이트(1 equivalent)하의 펩티드 용액 Fmoc에 의하여 달성된다. 다음 pH는 진한 염화수소로 2로 조정되고, 아세톤은 바쿠오에서 제거된다. 생성물은 클로로포름내에서 얻어지고, 0.1M의 염화수소로 세척되며, 유기상으로부터 회수된다.
화학선택적인 리게이션에 의한 Cys-치환 표주 주쇄과 결합
시스틴은 그것이 펩티드의 반응성을 방해하지 아니하는 한 합성 도는 재조합 펩티드의 어느위치에서 포함될 수 있다. 그것은 또한 골겨 펩티드내에서, 바람직스럽게는 그것을 리신잔기의 에타기에 부착시킴에 의하여 유도될 수 있다. 다음의 실시예에서 알 수 있드시, 시스틴 분지-사슬 티올기가 디설파이드 결합 또는 더 안정한 티오에스테르 결합을 유도하는 다양한 화학적 방법에 의하여 서택적으로 표적이 될 수 있기 때문에 이것은 중요하다. 그리고, 티오카르복실과 반응하는 티올반응의 특별한 경우에, 아미드 결합이 재정렬에 의하여 형성된다.
실질적인 실시예에 있어서, 결합될 펩티드는 시스틴과 천연 서열에서 또는 골겨 펩티드로 안쪽으로 회전하는 경향이 있는 펩티드의 일부에서의 시스틴 위치에 대응하는 위치에서 합성되었다. 이어지는 페비드는 이와같은 방법으로 비수지성펩티드 담체에, 구조1(표1), 또는 IL-1, IFNγ-1, IFNγ-2, 그리고 TNFa , 표1의 구조 7 비-수지성 펩티드 담체에서 Dde로 이미 보호된 리신 분지-사슬에 결합되었다:
VQGEESNDKC(IL-1베타)
CVQGEESNDK(I-1베타)
CPSTHVLLTHTI(TNFα)
HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQK(C)(IFNγ-1)
AKFEVNNPQVARAAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC (IFNγ-2)
CGMTAEDLQTRYN(PalA)
CTEADYAKNRAVLEY(PalA)
CSGGKSFDLEDV(Tbp-2)
CPKGGNYKYIGTWD(Tbp-2)
NGSVGAVFGAK(Tbp-2)
AELGGQFHHKSEG(Tbp-2)
CASQRDRFQHNPHENDA(SIF)
CKSQSGIEKTTRILHHAISESTQQN(SIF)
CQATAKMAEEQLTTLHVRSEQQS(SIF)
쪼개짐, 분석 그리고 정제가 이어지는 변형된 링크-쉬 에의 이들 펩티드의 합성 이후에 그들은 비수지성 주쇄 펩티드에 결합되었고 여기서 에타-아미노기는 NMP하의 SPDP로 상온에서 20배 몰러 과량(음성 카이져 테스트가 된다.)에서 반응함에 의하여 티올로 전환되었다. 펩티드는 상온에서 2시간동안 NMP하에서 2-3배 몰러 과량에서 결합되었다. 이 결합은, 343㎚에서 광분석적으로 측정되어 치환정도를 (분자 익스팅션 계수가 8080이다.)나타낼수 있고, 그 치환은 비수지성 펩티드담체 내에서 이론적으로 유용한 부착점의 85%이상 이상임이 밝혀진, 피리딘-2-티온의 동시 방출과 함께 디설파이드 결합의 형성에 의하여 진행되었다. 다음 유도된 비수지성 펩티드 담체는 평소와 같이 수지로부터 이탈되었다.
또 다른 합성에 있어서, 펩티드를 함유하는 이들 그리고 다른 시스타인은 브로모아세틸-변형 주쇄 펩티드에 티오에테르로서 결합될 것이다. 역접근을 이용하여, 브로모아세틸레이티드 펩티드는 또한 시스타인 유도 주쇄 펩티드에 결합할 것이다; 이들 펩티드에 있어서, 브로모아세틸기는 브로모아세틱 무수물(일차 아민 상에서, 특히 알파 아미노기), 또는 합성과정에서 브로모아세틸레이티드 분지사슬과 함께 특별한 아미노산(BBAL(인만 1991))을 사용하여 사슬내의 어느 위치의 기능성을 포함하기 위하여 도입된다. 브로모아세틱 무수물 방법과 함께, 천연 펩티드 절편은 또한 pH를 6.0으로유지하고, 0℃의 수성 완충액에서 반응을 진행하고, 유기용매에서 브로모아세틱 무수물을 1/100부피 미만으로 첨가함에 의하여 브로모아세틱 무수물의 알파 아미노 반응성을 보증하며 결합될 것이다.
화학 선택적인 리게이션에 의한 SER-치환 펩티드의 표존 주쇄에의 결합
SER N-말단(폴리)-펩티드의 특이적인 N-말단 결합은 특이한 조산에서의 산화후에 얻어진다. 그러한 산화는 N-말단 카보닐 기능, 특히 아실히드라진(히드라지데스) 그리고 히드록실아민과, 히드라존과 옥심, 각각을 생성하면서,과 반응서인있는,을 생성한다.
한 예로서, 결합될 펩티드는 N-말단 S와 합성되고, 쪼개지고, 정제되며, 니펙 정제전에 10분간 pH6.9, 50 밀리몰 이미다졸/HCL하에서 2미리몰 페리오데이트에 의하여 용액내에서 산화된다. 다음으로 펩티드는 히드라지드-유도의 비수지성 주쇄 펩티드 담체와(여기서 자유아미노기는 Boc-모노히드라지드 수시닐산의 TBTU/HOBt/NMM-매개결합에 의하여 히드라지드로 유도되었다. )하룻밤 동안 용액상태에서 pH 4와 5 사이의 수성 완충액 하에서, 결합될 각각의 산화 펩티드에 대한 2개의 히드라지드 이퀴버런츠를 사용하는, 반응할 것이다. 형성된 히드라존의 치환된 히드라진으로의 환원은 pH 4와 5사이에서 0.2 M의 카보로히드라이드와 2일간 실행된다.
실시예8
간접 결합: C-말단-선택화학에 의하여 선합성된, 분지사슬 비수지성 펩티드를 결합함에 의한 부착
화학 선택적인 결합을 통하여, 선 합성된 펩티드를 분자사슬 또는 알파 아미노기 보호를 사용하지 아니하고, 비수지성 펩티드 담체(NDPC)상에 결합하는 거이 가능하다. 이러한 실시예로서, NDPC는 원하는 선택적인 반응성을 얻기 위하여 유도되어야 한다.
계획된 첫 번째 실시예에 있어서, 펩티드는 노바신 KB-수지에 합성되고, TFA-처리가 이어진는 최종의 피퍼리딘 처리후에 쪼개진다. 펩티드 히드라진을 생성하기 위하여 실시예4에서 기술된 바와 같이 디옥산/메탄올내에서 히드라진에 의한 쪼개짐이수행되고, 다음 프리페러티브 역상 HPLC에 의하여 정제된다. NDPC는 모든 부착점에서 S(세린)로 유도되고, 페리오데이트 산화되어 알파-옥소아실기를 생성하고(이미다졸 완충액에서 중성pH, 실시예 7 참조), 실시예 7에서 보는 바와 같이 히드라존의 히드라진으로 시아노보로히드라이드 환원이 이어지는 pH 4.5 와 5사이에서 펩티드-히드라진과 반응된다(모든 반응은 고체상 부착 펩티드에서 이루어진다).
또 다른 가능한 실시예에 있어서, NDPC에의 카보닐의 유도는 진한 염화수송에 의하여 비보호 되면서, 2,2,-디메톡시아세트산과 완성된다.
또 다른 계획된 실시예에에 있어서, 결합될 펩티드는 HF/10% p-크레졸과 쪼개질 때 티오카르복실산을 생성하면서, 특별한 야마시로 결합체(야마시로 1988, 스뇔처 1992, 그리고 다우손 1994에 의하여 사용된), 4-[(Boc-아미노아실)티오벤질]-페녹시 아세트산을 사용하면서 고체상에서 티오카보닐산으로산으로서 합성될 수 있다. 정제후에, 펩티드 티오카르복실산은 브로모아세트산으로 보다 더 유도되어 부착점으로서 브로모아세틸-치환된 아미노기를 생성하도록된 고체상 결합 NDPC에 결합된다. 최종 생성물은 안정한 티오에스테르로서 부착된 분지 펩티드를 함유하는 것으로 기대된다.
실시예9
천연유도 펩티드의 부착
화학적 자명성은 고도의 화학 선택성에 의하여 매우 쉽게 얻어진다. 이러한 방법에 의한 정의된 지향과 화학량론이 얻어진다. 이것은 만약 천연 펩티드가 상기에서 주어진 방법에 의한 결합에 사요오딜 수 이는 시스타인 또는 N-말단의 세린를 가지고 있다면 가장 쉽게 얻을 수 있다. 만약 그러하지 아니하다면, 펩티드는 실시예 7에서 제시된 바와 같이 일시적으로 보호되고 결합될 수 있다. 만약 이것이 적절하지 아니하다면, 공지의 결합방법, 즉 상대적인 반응농도, pH, 온도 그리고 용매를 최적화함에 의한 글르타릭 알데히드(아미노와 티올기에의 결합), 카보이마이드(아미노기에의결합), 그리고 m-밀리아미드 벤조일-N-히드록시 수시니미드에스테르(아미노-로부터 티올-기로의 결함)을 사용하는 몇몇의 선택성이 얻어질 수 있다. 다른 실시예는 선택적으로 단지 자유 펩티드에서 알파 아미노기에, 예를 들어, 브로모 또는 클로로아세틸기를 선택적으로 도입하기 위하 여할로아세틱 무수물의 사용이 있다.
한 실시예에 이어서, 천연 발생 펩티드의 모델로서 사전 합성된 펩티드와 실행된다. 펩티드는 pH 6.0의 0.1 M 2-( N-모폴리노)에탄 술폰산 용액에서 DCC-미디에이티드 활성, NMP에 의한 산으로부터 제조되고, 1/100(vol/vol)에서 구성 펩티드 용액으로 첨가되고, 상온에서(각 시간 새로운 시약을 첨가하며) 3×3분간 인큐베이팅하는 브로모아세틱 무수물을 이용하면서 브로모아세틸레이티드 된다. 정제후에 펩티드는 음성의 엘만 테스트까지 시스타인-유도 표준 주쇄 펩티드에 결합된다.
실시예 10
천연유도 카르보히드레이트의 결합에 의한 카르보히드레이트의 부착
이들 실시예에 있어서, 탄화수소 이뮤노겐은 살모넬라 타이피무리움 LPS(리포폴리사카라이드)로부터 유도된다. 살모넬라 LSP는 마일드산 처리에 의하여 그 지방부위(비용융성 침전) 그리고 탄화수소 부분(용융성)으로 쪼개진다. 용융성의 LPS 탄화수소는 원심분리에 의하여 얻어지고, 암실에서 0.1M 10분간 소디움 메타페리오데이트에 의하여 산화되고, 파마시아 PD-10칼럼상에서 급속한 염석이 뒤따른다. 또한, N-아세틸-D-갈락토스아민이 결합된다. LPS 올리고사카라이드와 N-아세틸-갈락토스아민은 잘 알려진 카보히드라이트 에피토프를 구성하고 모노크로널 항체에 의하여 다음으로 사술하는 것 과같은 결합후에 접촉한체로 남는 것으로 보안다.
비수지성 펩티드 담체에의 결합
블롬버그의 방법론 (블롬버그 1993)은 비수지성 주쇄 펩티드내에서 탄화수소를 아미노기에 도입하는데 사용되었다. 산화된 탄화수소는 분자과량에서 고체상 결합 주쇄 펩티드와 DMSOI 내에서 60도씨로 하룻밤 반응하도록 허락된다. 다음으로 상온으로 냉각되고, 아세트 무수물과 4시간동안 상온에서 반응(10 eq)이 이어진다.
또 다른 실시예에 있어서, N-아세틸-D-갈락토스아민은 그 환원 말단에 의하여 비수지성 펩티드 운반체에(NDPC)결합되어 Tn항원에 대한 모노클로널 항체와 반응성이 있는 Tn-항원을 구성한다.
탄화수소의 항원구조의 유지는 쉽게 피복 가능한 탄화수소 유도 NDPC와의 코팅, 그리고 살모넬라 티피모리움 첫 번째 실시예에서의 LPS 탄화수소(O-사슬 특이성의 항체)에 대한 마우스의 모노크로널 항체 그리고 두 번쩨 실시예에서의 Tn- 항원에 대한 모노클로널 항체로 탐지하는 ELISA를 형성함에 의하여 제시된다.
히드로지드 말단 "엔코딩 포리머"에 대한 결합
가능한 실시예에 있어서, 산화 탄화수소는 상온에서 주쇄 펩티드 히드러진과 (실시예4 참조)pH 5.5, 0.1 소디움 아세테이트에서 1/1 mol/mol로 혼합되고, 1시간 동안인큐베이트된다. 그 결과인 축합은 세파덱스 G 50에 겔 여과에 의하여 쉽게 정제되고, 280 ㎚ 에서 기록된다. HPLC -분석은 그것이 C-18 역상 칼럼(도1에 기술된 런닝 조건)사에서 비축함 펩티드 이전에 용출되는 것을 보여준다. 탄화수소의 항원구조 유지는 ELISA를 실행히고, 쉽게 피복가능한 리포펩티드탄화수소 복함물을 코팅하며, 그것을 살모넬라 티피무리움 LPS탄화수소에 대한 마우스 모노크롤날 항체로 탐지함에 의하여 보여진다.
또 다른 실시예에 있어서, N-아세틸-D-갈락토스아민은 항원말단에 의하여 NDPC로 결합되어 Tn-항원에 대한 모노클로널 항체와 반응성의 Tn-항원을 구성한다.
다른 계획된 실시예는 동일한 탄화수소 항원을 부착하는데 대하여 다음의 화학기술을 포함한다.
탄화수소는 카보이미드, 다이비닐설폰 또는 시아노겐 브로마이드와 같은 일반적 아미노- 그리고 히드록실 반응의 물질과 유도된다. 이는 예를 들어, 1,4-부탄에디아민과 같은 디아민 스페이서와 반응이 유도되고, 그리고 연속적으로, 그 유도체는 브로모아실레이티드되고, 다음으로 시스타인 -유도 NDPC와 반응된다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기의 유도체는 SPDP와 시스타인 유도 NDPC와 반응에 앞서 반응된다.
히드라지드-치환 표준 -주쇄에의 결합
가능한 실시예에 잇어서, 상기와 같이, 부착점으로서 히드라지드기를 사용하기 위하여 Boc-모노히드라지드 석시니산으로 유도된 비수지성 담체 펩티드를 사용하면서, 이루어진다.
실시예 11
합텐의 부착
합텐은 모델 실시예에 대한 표식로서 유용한데 그 이유는 화학적으로 얻을 수 있는 항체(합텐 디곡시게닌과 트리니트로페닐과 함께) 또는 아미딘 또는 스트렙타비딘(합텐 비오틴과 함께)에 의하여 특이적으로 탐지 가능하기 때문이다. 비오틴은 석시니미드 에스테르 또는 활성 자유 비오틴을 사용하면서 TBTUHOBtNMM에 의하여 아미노기 결합 이전에 비수지성 펩티드 주쇄에 쉽게 결합될 수 있다. 트리니트로페닐 설폰산은 아미노기와 반응하여 트리페니릭를 도입한다. 모든 경우에, 반응은 카이저 테스트가 이어질 수 있다.
실시예 22
결합에 의한 DNA/RNA의 부착
DNA 또는 RNA는 환원성의 알킬레이션에 의하여 환원되어 메틸 알킬레이티드 아민 결합(바세르 1992)을 형성하는 이민 링키지를 형성하도록 C-포밀 알데히드 뉴클레오시드의 알데히드를 응축하는, 비수지성 펩티드 담체와 상호 결합되거나, 다른 항원과 분지,분지의 일부, 또는 "직교"분지가트은 항원모이어티로서 결합된다. 연속적으로, 결과안 3'-결함 뉴클레오시드는 자동화된 DNA -합성을 이용하면서, 바람직하게는 펩티드 전에 DNA 의 결합 그리고 결합 DNA를 관심있는 펩티드에 직접적으로 인코드하거나 비수지성 펩티드 담체에 히브리디제이션에 의한 숙주내에서 발현될 "천연" DNA의 일부를 결합하기 위하여 또는 클린만(1996)의 CG 올리고 뉴클레오티드와 함께와 같이 작접 자극을 위하여 결합 DNA를 사용하면서 올리고뉴크레오티드로 연장될 수 있다. 전형적인 출원에 있어서는, 단지 하나의 DNA-카피만이 비수지성 펩티드 담체(NDPC)에 결합될 수 있다.
그 이상의 가능한 실시예에 있어서, T-세포 자극 펩티드에 대응하는 오리고뉴크레오티드는 하나의 특이적인 Boc에 대하여 직교의 보호기로서 Dde 또는 Mtt를 사용하는 리신 선택적 보호 분지 사슬에 결합된다. 연속적으로, 리신 분지-사슬은 TFA-처리에 의하여 보호되고, 항원 펩티드는 상기에서 개략한 방법에 의하여 직접적으로 결합된다. 사용될 항원펩티드는 GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(gp120펩티드), 그리고 DNA- 엔코디드 T- 세포 자극 펩티드는, 예를 들어,
QYIKASKFIGITE(테타누어스 톡소이드 펩티드)일 수 있다. 그 이상의 합성에 있어서, 결합DNA의 일부는 NDPC로 상호 결합되어 실시예4에서 기술한바와 같이 톰슨에 의하여 정의된 포리에피토픽 DNA를 결합할 수 있다.
실시예 13
비공유적 포함에 의한 DNA/ RNA의 부착
이 제안된 실시예에 있어서, 비수지성 펩티드 담체(NDPC)는 하나의 특이적인 Dde-보호리신 분지-사슬에서 10에서 15Dde-보호리신(2개의 다른 실시예)을 구성하는 폴리리신 사슬과 함께 유도되고, N-말단 리신은 아세틱 무수물에 의하여 캡된다. 이 사슬은 보호된 상태로 놓여지게 되는 반면에, 주쇄리신 분지 사슬의 잔여는 비보호되고, GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(gp120 펩티드)를 포함하는 항원 펩티드의 결합에 사용된다. 이후에, 모든 분지-사슬 보호기는 쪼개지고, 그리고 펩티드 복합물은 방출되고, 정제되며, 정제된 상태 또는 정제된 상태에서의 적절한 움의 모더리트 이온 강도, 또는 다른 정의된 DNAs 와 정의된 혼밥내에서 적절한 DNA수성 완충액에 혼합된다. 하나의 그러한 DNA는 테타누스 톡소이드 T-세포 펩티드 QYIKANSKFIGITE에 대응한다. 또 다른 그러한 혼합물은 각각 프로미스커스 T-세포 에피토프에 대응하는 DNAs 의 혼함물이다. 그러나, 사용될 또다른 DNA는 실시예4에서 기술한 톰슨의 " 폴리-에피토프"DNA (1995)이다.
실시예 14
PNA(펩티드핵산)로의 히브리디제이션에 의한 DNA/RNA의 부착
이들 계획된 합성은 T-세포 자극 펩티드 QYIKANSKFIGITE 그리고, 다른 실시예에 있어서는, 실시예 4에서 기술한(1995) 톰슨의 폴리에피토프 DNA에 대응하는 테타너스 톡소이드 DNA를 하이브리디제이션함에 의하여 결합할 수 있는 RNA서열을 정의하는 선택적으로 비보호되는 리신 분지-사슬상에 빌딩 블록으로서 펩티드 핵산을 (PNA,재 95/01369)사용하면서, 실시예12에서와 같이 진행될 것이다.
실시예 15
펩티드 결합 인터컬러터에 결합함에 의한 DNA/RNA의 부착
핵산을 결합하는 또하나의 방법은 구조내에 인터컬레이터를 인크로즈하는 것이다. 이것은 티오에스터를 퀴노린으로서 비수지성 펩티드담체의 C-말단 일부내에 포함된 시스타인 분지사슬에 (브라운 1994) 결합함에 의하여 이루어진다. 싯타인 티올은 Fmoc-비보호에 앞서 비보호되더 퀴노린과 치환되는 것을 허락한다. 이 다음, 합성이 계속되고, 마지막 단게에서, 리신 분지-사슬은 비보호되고 GEIKNCFNISTSIRGKVQKEYAFF를 포함하는 항원펩티드의 결합에 사용된다. 다음으로, 모든 분지 사슬보호기는 쪼개지고, 펩티드 복합물은 방출되며, 정제되고, 중성의 pH의 수성 완충액에서 정제된 상태의 적절한 DNA 또는 다른 정의된 DNAs와 혼합으로 모더리트 이온강도로 혼합된다. 그러한 적절한 DNA의 하나는 테타누스 톡소이드 T-세포 펩티드 QYIKANSKFIGITE 이다. 또 다른 그러한 혼합물은 각각 푸로미스커스 T-세포 에피토프에 대응하는 DNAs의 혼합물이다. 또한 또다른 DNA는 실시예4에서 언급한 톰슨(1995)의 "폴리 에피토프"DNA이다.
실시예 15A
키드에서의 그 사용을 이러스트하는 항원의 결함을 위한 비수지성 펩티드 담체의 사용
키트 형식으로 비수지성 펩티드 담체(NDPC)의 사용은 다음의 계획된 실험에 의하여 일러스트된다:
하나의 NDPC는 노바비오켐으로부터의 링크-MBHA-형태의 고체상에서 합성되어 0.05마이크로몰/그램 으로부터 0.2 마이크로몰/그램으로, 바람직하게는 0.05에서 0.1 마이크로몰/그램으로 치환된다. NDPC는 실시예1에서의 서열에 포함되고, 일러스트러티브 목적으로, 터프신 테트라머, 인터류킨-1 노나펩티드(VQGEESN아), 실시예4에서 기술한 그리고 T-세포 자극 펩티드한쪽의 분지사슬 보호 보조성분을 함유하는 NDPC에 더하는 보족의 성문 없이정상의 NDPC를 포함한다. 함성이후에, NDPC의 다른 분지사슬 기능기에 직교하여 보호되는 분지사슬 보호기의 쪼개짐에 의하여 부착점이 생성된다.(실시예 1 참조)
하나의 실시예에 있어서, NDPC -고체상은 SPDP로 유도되고, 세척,건조되고 그리고 피리딘-2-티온의 방출 과 고정화 펩티드와 반응력에 의하여 측정되는 바와 같이 Cys- 함유 펩티드를 결합할 수 있는 능력을 측정할 때까지 다른 시간동안 저장된다. 고정화될 펩티드는 실시예5의 Tbp-2-펩티드와 아미딘에 의하여 팀지되는 비오티닐레이티드 펩티드를 포함한다.
또한, 브로모아세틸기로 유도된 NDPC 유도는 동일한 Cys- 펩티드의 부착을 위하여 사용된다. 다른 실시예에 있어서, 펩티드는 EDC, DSS, 그리고 TBTUHOBtNMM 또는 다른 이큅런트 활성과정에 의한 카르복실 활성에 의하여 부착된다. 또한, 차단된 펩티드는 부착되게 된다.
더하여, 비오틴과 디그옥시게닌을 함유하는 합텐의 부착과 탄화수소가 보인다.
모든 경우에, 최종의 목합물은 TFA에 의하여 이탈되고, HPLCFH 분석된다.
그러한 축합은 이탈과 평소와 같은 얼룩이 뒤있는 축합반응을 구성하고 있는 신속한 2-단계의 공정에서 이루어질 것으로 기대된다.
실시예16
비수지성 펩티드담체를 함유하는 이뮨-자극 복합물(이스콤)의 제조
이스콤은 표준방법(모레인 1984, 모오하트,1992, 커런트 프로토콜 인 이뮤놀로지, 1992, 섹션 4:"이뮨자극 복함물의 제조",2,11,1-2,11,12)으로 쉽게 제조되고, 그리고 리포펩티드는 이스컴 구조의 최소한의 퍼터베이션과 그들의 치누성부위를 바깥으로 향하면서 그들 스스로를 삽입한다.
비수지성 -주쇄 펩티드 담체는 상기와 같이 합성되고, 분지사슬 보호되고, 쪼개짐이전에 분지사슬 항원 펩티드의 결합 또는 합성에 사용된다. 정제후에, 펩티드는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 그리고 퀴일A와 함께 상기에서 기술한 표준 절차에 따라서 이스콤으로 상호결합된다.
일러스트러티브 실시예로서, 비수지성 펩티드 담체팔미테이트-GKGKGKGKGKGG 는 펩신 KB고체상(염기-변성 4-히드록시메틸 벤조산 결합체상에서)에서 130마이크로몰/그램내에서 합성되었다. 합성완료후에, K-잔기상의 Boc-보호기는 음성으로부터 양성의 카이저 테스트로 점진적 변화와 함께 95%의 TFA/물에서 2*15분 세척에 의하여 제거되었다. NMP에서의 중성화와 세척후에, 비오틴의 2배과량과 10분의 선활성\화에 의하여 진행된 30분간 상온에서의 2 결합을 사용하면서, 비오틴은 TBTUHOBtNMM에 의하여 부착되었다. NMP와 물에서의 세척 후에, 분지-사슬 비오티닐레이티드 펩티드는 수산화 나트륨/물에 의하여 실시예1에서와 같이 쪼개졌고, 동결건조가 이어지는 프리페러티브 HPLC사에서의 염석에 의하여 얼룩되고 다음으로 이스콤으로의 포함을 위한 그 이상의 정제없이 펩티드를 이스콤 형성 시약(펩티드/퀴일 A=1/5,W/W)과 표준잘차에 따라(상기 참조)혼합함에 의하여 사용된다. 이스콤은 스크로즈-구배 초여과에 의하여 특성되었고, 비율은 이스콤-형성에 대하여는 전자현미경 그리고 비오틴에 대하여는 HRP-스트렙타미딘 ELISA에 의하여 분석되었다. 전자 현미경에 의하여 잘 정의된 정상의 이스콤 구조를 보이는 이스콤함유 비율은 ELISA에 의하여 비오틴이 HRP- 스트렙타비딘-시약과 반응에 접근할 수 있는 생성물내의 비오틴-펩티드 또한 함유하고 있는 것으로 발견되었다. 정제된 이스콤-비율은 광범위한 분석이후에까지도 아비딘 반응성을 유지하였고, 이는 다트-블라팅에 의하여서도 쉽게 볼수 있다. 나아가, 이스콤의 직접적 역상-HPLC 분석에 의하여 정제 이스콤내에서 입증되었다.
실시예17
항원보이어티의 부착을 위한 적하된 이스콤의 제조와 사용
아미노기와의 담체
하나의 실시예에 있어서, 발명의 비수지성 펩티드담체( NDPC)항원 분지-모이어티 결합에 앞서 이스콤에 포함된다. 이는 이미 제조된 "적하" 이스컴의 제조를 허락하고, 합성의 그리고 이스콤-삽입 담체로서 특별히 고안된 NDPS리포펩티드를 사용함에 특징인 방법에서 분지-모이어티의 엔 블록 결합을 위한 준비를 허락한다. 표준 주쇄 -리포펩티드는 상기에서 주어지 방법에 의하여 합성되고, 비보호되고, 체상으로부터 쪼개지고, 정제되고, 리오필라이즈되고, 용융되고, 모레인(1984)에 따라 이스콤-형성 물질과 함께 인큐베이트된다. 인큐베이션의 일련과정에서, 펩티드대 퀼A 의 비율은 1 : 2로부터 1 : 10까지와 같이 약 1 : 5로 변한다. 이스콤의 제조후에, 그들은 전자현비경에 의한 인테그러티와 일반적인 겉모양, 자유 아미노기(아미노기에 도입된 트리니트로페닐기에 간접 결합되는 금-표식된 면역글로불린, 또는 비오티닐레이티드 아미노기를 표식링하는 금표식된 아비딘)의 합텐 유도에 의한 주쇄-펩티드 아미노기의 접근가능성에 대하여, 그리고 펩티드-적하된 이스콤의 퀀티터티브 HPLC 에 의한 적하하는 "농도"(펩티드의 양 pr 퀼 A)에 대하여 분석될 것이다.
하나의 특정한 실시예에 있어서, NPDC는 고체상에서 물-쪼개짐성의 결합체를 사용하는 고체상에서 합성될 것이다 (호프만, 1994). 그 다음 펩티드는 결과물의 단순 혼합에 의하여 이스콤-인클로즈드 형태로 얻어질 것으로 기대된다. 그러나, 여전히 고체상 결합 펩티드오 이스콤 형성 시약은 2-24시간 동안 수성 완충액에 있고,다음 고체상은 여과 제거된다.
항원성 분지 구조의 연속적 결합을 위한 경쟁력인있는 결합 체계는 유기 용매의 사용 그리고/또는 pH 의 익스트림(예를들어 레겐모텔 1988)의 사용을 포함하지 함유하는 방법을 포함하지 아니한다. 예로서, 실시예 5에 나열된 펩티드는 그러한 결합 체계를 사용하면서 결합될 수 있다. 그 결과인 펩티드 -적하 이스콤은 적하 "농도"에 대하여 전자현미경과 HPLC에 의하여 분석될 수 있다.
올리고사카라이드의 결함을 위한 C-말단 히드라지드와의 결합
C 말단히드라지드를 함유하는 주쇄-펩티드는, 바람직스럽게는 상기에서 기술한 바와 같은 (노바비오켐 1994) 히드라진/ NMP에 의하여 고체상으로부터 펩티드의 쪼개짐에 의하여 얻어지는, 단순히 PBS내에서 성분을 혼합하고, 24시간동안 상온에서 인큐베이팅하고, 다음으로 수크로즈 구배-원심분리에 의하여 이스콤을 정제함에 의하려 그와 같이 이스콤내 포함된다. 탄화수소는 N-아세틸 갈락토스아민 또는, 천연 또는 산화 살모넬라 LPS O-탄화수소(실시예 10 참조)가 되고, 실시예 10에서 기술한 바와 같이 부착된다. 이스콤은 전자 현미경에 의하여 조사되어지고, 수개의 탄화수소 특이성 항체의 이스콤에 대한 결합을 연구함에 의하여 분석된다, 전자 현미경내에서 금-표식된 항체에 의하고 코팅을 위하여 적하된 이스콤을 사용하는 ELISA에 의한 안타-Tn항체 그리고 안타- LPS항체를 포함한다.
실시예 18
바이러스에 대한 보호를 얻기 위하여 비수지성 펩티드 담체의 고정화 적용: 밍크 엔터리티 바이러스 모델
이 모델에 있어서, 바이러스 캡티드 펩티드, DGAVQPDGGQPAVRNER, 근본적으로 카니네 파보바이러스로부터 유도된, 는 밍크 엔테리티스 유도 질병에 대하여 보호적인 에피토프(란지벨드1995) 를 구성한다.
이러한 실시예에 있어서, 이 펩티드는 N-말단 시스타인을 포함하고, SPDP- 유도 비수지성 펩티드 담체에 결합함에 이하여 " C-외향" 지향으로 결합하게 된다. "N-외향"지향은 동일한 형탱의 주쇄 펩티드에 정상적인 서열의 합성에 의하여 성취된다. 비수지성 주쇄 펩티드 담체로서, -a 테타누스 톡소이드 T-세포 자극 펩티드, TT(QYIKANSKFIGITE), - IL-1베타 노나 펩티드(VQGEESN아), 또는 부착점 리신 잔기에서는 Mtt-보호 분지-사슬을 그리고 다른 리신 잔기에대하여는 Boc-보호를 사용하는 -터프신 테트라머 ([TKPR]4)로 C- 밀단으로 확장된 동일한 펩티드 표 1의 주쇄펩티드 번호 6이 사용된다.
이들 4개의 기에 대응하는 펩티드의 합성이후에 , HPLC그리고 MS분석, 면역화이 다음의 동물 집단에 대한 1000마이크로리터 PBS내의 50-200마이크로그람 펩티드구성물을 한 번의 서브커테이니어스 주사함에 의하여 수행된다.
주쇄[C-외향]4
주쇄[N-외향]4
주쇄[C-외향]4+ 알히드로겔
주쇄[N-외향]4+ 알히드로겔
주쇄 - TT 펩티드 [C-외향]4
주쇄 - TT 펩티드 [N-외향]4
주쇄 - 터프신[C-외향]4
주쇄 - 터프신[N-외향]4
주쇄-IL-1[C-외향]4
주쇄-IL-1[N-외향]4
(동물의 10집단, 각각 4)
면역화는 전체적인 바이러스 첼린지 21일에서, 그리고 동물은 감염(바이러스 분리)에 대하여 그리고 질병첼린지 이후 14일 동안 검사된다. 코팅 항원으로서 상대적 이뮨니제이션 펩티드를 사용하는 ELISA에 의하여 전체를 통하여 티터가 뒤따른다.
실시예 19
감염성의 질병의 진단에 있어서 진단을 위한 비수지성 펩티드 담체
진단의 면역분석에 있어서 비수지성 펩티드 담체의 사용은 다음의 실시예에 의하여 일러스트레이티드된다. 여기서 감염성의 항원으로부터 유도된 펩티드 서열이 감염서의 항원에 노출된 샘플에 존재하는 항체에 의하여 인식된다.
HIV-1 및 HIV-2감염을 탐지하기 위한 진단 면역분석
테스트-혈청 패널
보스톤 바이오 메디카, 인크.로부터 테스트 시럼 페널.이 진단 테스팅 전체를 통하여 사용되었다.
HIV-1과 HIV-2에 대하여 특이적인 펩티드를 수송하는 비수지성 펩티드 담체의 제조
HIV-1에 대하여 특이적이고, 종종 HIV-1에 감염된 환자에 의하여 인식되는 다음의 펩티드 서열은 HIV-1에 대하여 선택된다.:
gp 41(aa598-609):
Leu-Gly-Ile-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys
HIV에 특이적이고 종종 HIV-2감염 환자에 의하여 인식되는 다음의 펩티드 서열은 HIV-2 DP 대하여 선택된다.
gp36(aa587-605)
Leu-Gln-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr
다른 진단 성분이 실시예1과 2에서 기술된 절차에 따라 펩티드 서열을 비수지성 펩티드 담체에 결합함에 의하여 생성된다.
비수지성 펩티드 담체는 ELISA, 선-블라탕, 그리고 어글루티네이션 분석을 포함하는 진단분석에서 다양하게 사용될 수 있는 각 펩티드 서열의 멀티머 발현을 제공한다.
HIV특이성 펩티드를 수송하는 각각의 비수지성 펩티드 담체는 동일한 펩티드로 쑤송펩티드에 연결되지 아니한 것 그리고 상응하는 재조합 단백질 HIV-1 gp41과 평행하여 테스트된다.
엘리사(ELISA)분석
합성 펩티드는 멕시소프 마이크로티터 접시에서 피복되었다.(Nunc, Roskilde, Denmark). 펩티드(10마이크로그람/밀리그람)는 100밀리몰 NAHCO3하에서 pH9.6 또는 pH2.5에서 0.1밀리몰의 글리신-염화수소하에서 플레이트로 피복되었다.
모든 코팅은 4도씨에서 하룻밤 실시되었다. 그 벽은 0.5몰 염화 나트륨, 3밀리몰 염화칼륨, 1밀리몰의 KH2PO4,8밀리몰 NA2HPO4, 2H2O, 1% 트리튼 X-100에서 세척되었다. 이러한 세척 과정은 다음의 인큐베이션 각 단계 이후에 반복되었다.
1) 플라즈마 샘플, 인큐베이션 완충액내에서 (세척 완충액 더하기 15 미리몰 보빈 알부민, pH7.2)1%(V/V),은 상온에서 인큐베이트되었다.
2) 말의 레디쉬 퍼옥시데이즈-축함-토끼 안티-사람 클래스 -특이적 항체(DAKO, 코펜하겐, 덴마크)의 100마이크로리터 퍼 웰이 인큐베이션 완충액에서 희석된, 상온에서 1시간 동안 더하여 졌다.
효소활성은 100마이크로리터 퍼 웰 0.67밀리그람/밀리리터 과산화수소 0.015%(V/V)를 함유하는 pH5.0, 100밀리몰 시트릭산-포스페이트 완충액내에서 용해된 1,2-페닐디아민 히드로클로라이드( DAKO)의 첨가후에 퀀티테이트되었다.
이 반응은 2.5 몰의 H2SO4의 50 마이크로리터 퍼웰첨가에 의하여 정지되었다, 그리고 최적 농도는 492㎚ 에서 ELISA 스캔너에서 측정되었다.
모든 테스트가 듀프리케이트하여 시행되었다.
결과
ELISA 절차는 가각 펩티드의 다른 농도를 테스팅함에 의하여 최적화되었고, 담체에 가각 결합되었다. 도 5는 단독으로 테스트되고, 담체에 연결되는 gp41(aa598-609)펩티드의 희석 곡선에 대한 HIV-1세로포지티브 공여체 의 항체 반응성을 보여준다. ELISA절차는 다른 농도의 펩티드 테스트에 의하여 최적화된다.
도 6은 gp36(aa587-605)펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체에 대하여 테스트된 HIV- 2 세로 포지티브 공여체와 HIV-2 세로네가티브 공여체로부터 얻어진 희석 곡선을 보여준다. 포지티브 신호는 양성 신호가 테스트된 HIV-2 세로포비티브 혈청의 모든 희석에서 얻어진 반면에 세로네가티브 대조 혈청는 모든 희석에서 음성이었다.
도 7은 HIV-2의 페널 그리고 gp36단독에 대하여 테스트된 HIV-2 세로 네거티브 공여체로부터 얻어지고, 비수지성 펩티드 담체에 결합된 혈청의 고정된 희석의 결과를 보여준다. 모든 세로포지티브 공여체 혈청는 비수지성 펩티드 담체에 결합된 gp 36 펩티드를 사용하는 분석에 반응성이 있는 반면에 혈청 네가타브 대조 혈청와는 아무런 반응이 탐지되지 아니하였다.
도 8은 단독으로 그리고 비수지성 펩티드 담체에 결합된 gp36펩티드에 대하여 HIV-2 세로포지티브 공여체와 HIV-2 세로네가티브 공여체 로부터 얻어진 혈청의 희석 곡선을 도시한다.
담체에 결합된 펩티드는펩티드 단독에 비교하여 세로포지티브 세럼의 보다높은 희석에서 인식되었다.
어떤 변형없이 비수지성 펩티드 담체에 결합된 HIV 특이적인 gp-36펩티드는전체 재조함 HIV-2 gp-36단백질과 같이 진단목적으로 유용하였다. 비수지성 담체에 결합된 gp36 펩티드는 HIV-2 세로 포지티브 혈청에 의하여 펩티드 단독보다 낮은 농도 희석에서 인식되었다.
HIV-1 그리고 HIV-2의 진단을 위한 다트-블라팅 분석
공정
펩티드 단독으로는 물론 HIV 펩티드로 유도된 (app. 50 마이크로그람/밀리리터)비수지성 펩티드담체는 2.5 마이크로 리터 부피에서 니트로셀룰로스막에 피복된다. 니트로셀룰로스의 차단은 pH .4 + 0.5 M 염화나트륨 + 0.5 % 트윈 20, 0.05 M트리스 완충액으로, 10분간 시행된다. 테스트 혈청는 분석-완충액에서 한시간 동안 인큐베이트되고, 희석된다: 트리스 완충액, pH 7.4 + 0.5 M염화나트룸 + 0.05% 트윈 20.세척후에 , 니트로셀룰로스막은 분석 -완충액으로 2회 인큐베이트되고, 퍼옥시데이즈 - 축합 안티-휴먼 이뮤노글로불린이 이어진다. 펩티드와 인간 이뮤노그로불린의 반응성은 기질 3-아미노 -9 에틸카바졸을 사용하여 탐지된다. 실험결과는 가시적으로 조사된다.
1차 스크리닝
1차 스크리닝이 app. 10 HIV-1 환자, 5 HIV-2환자, 그리고 비감염된 개인으로부터의 혈청 페널로 실시되었다.
분석의 감도와 특이성이 평가되었고, 분석의 재생성이 시럼 샘플의 반목 테스트에 의하여 시험되었다.
2차 스크리닝
2차 스크리닝이 HIV-1바이러스에 대한 항체의 낮은 티터와 14혈청를 사용하면서 시행된다. HIV에 대한 낮고 불확실한 반응성을 사용하는 테스트는 다른 상업적인 분석과 비교하여 HIV에 대한 항체를 탐지하는 데 있어서 비수지성 펩티드의 감도와 특이성의 평가를 허락한다.
3차 스크리닝
3차 스크리닝은 감염을 수반하는 세로 전환 시간부근에서 수집되어진 수개의 혈액샘플로부터 app.5 공여체로부터 혈청를 사용하여 실시 되었다. 이 테스트는 노출로부터 세로 전환시까지의, 이 시점에서 사람은 HIV-1-특이성 항체의 생성을 시작한다, 시간-창의 크기를 평가한다.
실시예 20
백신으로 사용하기 위한 면역원성 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체
면역원성 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체는 어떤 면역원성 항원에 대하여 항체와 T-세포 반응을 자극하는 면역화 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 비수지성 펩티드 담체는 페토게닉 마이크로기관에 대한 보호를 위한 백시네이션 목적을 위하여 사용될수 있다. 이 비수지성 펩티드 담체의 이러한 사용의 하나의 예는 아래에서 주어진다, 여기서 마우스들은 기생 질병 말라리아에 대하여 면역되어있다.
플라스모디움 팔시파룸으로부터의 항원 - 175 결합 에리트로사이트롭틔 펩티드 서열과 유도된 비수지성 펩티드 수송담첼 사용한 마우스의 면역화
재료와 방법
마우스는 다음과 같은 합성 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 면역화 되었다:
TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD
이 펩티드는 말라리아 기생 플라스모디움 팔시파룸으로부터 유도되었다. 펩티드는 에리트로사이트의 기생체 침입에 포함된 에리트로사이트 결합 항원-175(EBA-175)의 서열을 포괄한다. 그러나, 그 서열은 감염동안 면역시스템에 의하여 정상적으로 인식되지는 아니한다.
실험 설계
6-8주된 (C57B1*BALB/C) 암컷 F1 마우스가 이 실험에 사용되었다.
BCG 프람드 마우스가 알루미늄 히드록시드에 부착 그리고 부착없이 정제된 단백질 유도체(PPD)에 축합된 EBA-175펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체의 16마이크로 그람으로 0,21,그리고49일에 3차레 복강내로 면역되었다.
두 번째 실헙세트에서는, 마우스는 어떠한 축합도 없는 EBA-175펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 면역되었다. 몇몇 마우스는 복강내로 0, 21, 그리고49일 3차레, 16마이크로그람의 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화된 반면에, 다른 마우스는 피하로 3차례. 0, 21, 그리고 49일 3 차례 프로이드의 컴플리트(1차 면역) 또는 인컴플리트(1,3차 면역)보조액와 1+1로 혼합된 16마이크로 그람의 유도 비수지성 펩티드 담체로서 면역화 되었다.
마우스는 -1, 12, 33, 그리고 61일 배양되었다. 혈청는 배양으로부터 수집되어 ELISA에서 면역화에 사용되는 펩티드에 대하여 항체 반응성에 대하여 테스트 되었다.
ELISA에서 합성 펩티드와 항체 반응성
오브알부민(1마이그로그람/밀리리터)에 축합된 합성펩티드는 멕시소프마이크로티터( Nunc, 로스킬데, 덴마크)상에서 pH 9.6의 100밀리몰 NACO-3에서 코팅되었다. 모든 코팅은 4도에서 실시되었다. 웰은 0.5몰의 염화나트륨, 3밀리몰 염화칼륨, 1밀리몰 KH2PO4, 8밀리몰Na2HPO4, 1%트리튼 X-100.에서 4차레 세척되었다.
이로한 세척 과정은 다음의 각 인큐베이션 단계 후에 반복되었다.
1) 인큐베이션 완충액하(pH 7.2에서 세척 완충액에 15밀리몰의 보빈 알부민이 더해진것)에서 1%(V/V)로 제조된 마우스 혈청가 상온에서 1시간 인큐베이트되었다.
2) 100마이크로리터 퍼 비오티닐레이티드 토끼 안티-마우스 IgG항체(아머샴)웰(well)이 인큐베이터 완충액에 희석되었다., 그리고
3) 웰(well)당 100마이크로리터의 스트렙타비딘옥시다제(DAKO, 코페하겐, 덴마크)가 인큐베이션 완충액에 희석된, 1시간 동안 상온에서 가해졌다.
효소 활성은 0.015%(V/V)과산화수소함유, pH 5.0, 100밀리몰 구연산-포스페이트에 용해된 웰 당 100마이크로리터의 0.67 밀리그람/미리리터 1.2-페닐디아민 히드로크로라이드(DAKO) 첨가후에 정량되었다. 반응은 웰 당 50마이크로리터의 2.5몰 황화수소첨가에 의하여 정지되어었고, 최적의 농도는 492 나노미터의 ELISA스캐너에서 측정되었다.
각각의 ELISA마이크로티터 플레이트상에서, 하나의 포지티브 대도 혈장 그리고 하나의 음성 대조 혈장이 혈장이 없는(백그라운드) 대조 웰은 물론 분석되엇다. 모든 테스트는 2회 실시되었다.
결과
도 9는 마우스가 EBA-175 펩티드-PPD축합으로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용한 면역화에 반응하여 항체를 생산하였음을 보인다. 강력한 항체 반응이 3차례 면역화후에 탐지되었다. 알루미늄 히드록시드에의 흡착은 1차 면역 이후에 항체 생성을 증진시켰으나, 2,3차 면역 이후에는 그러하지 아니하였다.
도 10은 마우스가 프로이드 보조액와 혼합된 EBA-175펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용한 피하 면역화에 반응하여 펩티드 특이성 항체를 생산하였음을 보인다. 그 반응은 2회의 면역 이후에 탐지되었다. 몇몇의 마우스는 복강내 3회 면역화 이후에 단독의 비수지성 분지 펩티드에 대한 약한 펩티드-특이성 항체 반응성을 보인다.
IgG1 반응성은 Th2 반응성의 마커인 반면에, IgG2a 반응성은 Th1반응성의 마커이다.
프로이드 애부번트와 EBA-175펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 면역화된 마우스는 펩티드에 대하여 IgG1 와 IgG2a 반응성을 모두 보였다 (도 14와 15).
HIV-1로부터의 펩티드 서열로 가각 유도된 2개의 서로 다른 비수지성 펩티드 담체를 사용한 면역화
마우스는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 gp120으로부터 펩티드 aa 152-176으로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 면역화되었다.:
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
이 펩티드는 알려진 B- 그리고 T-세포 에피토프를 가지고 있다.
비수지성 펩티드 담체에 연결되어 백신으로 사용되는 또 다른 펩티드는 다음의 아미노산 서열을 구성하는 HIV-1 gp41로부터의 펩티드이다.
LERLLL
이 펩티드는 인터류킨-2 호모로지(라이어 111,1986)가 있다.
실험설계
6-8주된 암컷 마우스, BALB/cJ 가 이 연구에 사용되었다. 일단의 마우스는 HIV-1 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체 16 마이크로그람을 사용하여 복강내로 3차레, 0, 21, 그리고 49일, 면역되는 반면에, 다른 일단의 마우스는 피하로 3차례. 0, 21, 그리고 49일 3차례 프로이드의 컴플리트(1차 면역) 또는 인컴플리트(1, 3차 면역)보조액와 1+1로 혼합된 16마이크로 그람의 유도 비수지성 펩티드 담체로서 면역되었다.
마우스는 -1, 12, 33 그리고 61일 사육되었다. 혈청는 블리딩으로부터 수집되어 ELISA를 사용하여 펩티드에 대한 항체 반응성을, 말라리아 펩티드에 대해 기술한 것과 같이 ELISA를 사용하여 분석되었다.
결과
도 11은 마우스가 프로이드 보조액와 혼함된 유도 비수지성 펩티드 담체로 피하 면역화 이후에 gp120에 대하여 반응했음을 보인다. 3회 면역 이후에 강력한 항체 반응이 탐지 되었다.
마우스는 단독의 gp-41 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 복강내 면역화된후에 gp-41펩티드에대하여 약하게 반응하였다 (도 16). 어떤 마우스는 gp-120과 헤-41이 조합하여 유도된 2개의 비수지성 펩티드 담체를 받았다. 이들 마우스는 gp-41 트기성 항체를 생성했다 (도 16).
마우스는 또한 프로이드 애부번트와 혼합된 gp-120펩티드와 gp-41펩티드로 유도된 2개의 비수지성 펩티드 담체 각각에 프로이드 보조액와 혼합된 gp-120 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체 사용한 피하 면역화에 반응하여 재조합 단백질 gp120과 gp41에 반응성을 보였다 (도 17, 도 18).
마우스는 프로이드 보조액와 혼함된 gp120펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 피하 면역화에 반응하여 gp-120펩티드 -특이성 IgG1과 IgG2 항체를 생성하였다. 그러나, 만약 면역화 동안에 gp120펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체가 gp41펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체와 혼합되면 IgG2a 반응은 제거되었다 (도 19 그리고 20).
마우스는 프로이드 애부번트와 혼합된 gp120펩티드와 gp41펩티드로 유도된 2개의 비수지성 펩티드 담체의 혼합을 사용한 피하 면역화에 반응하여 gp41 펩티드-특이성 IgG1 과 IgG2a 를 생산한 반면에, 프로이드 보조액와 단독으로 혼함된 gp41로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 피하 면역화된 이후에는 마무런 반응이 탐지되지 아니하였다 (도 21 그리고 22). gp-120펩티드는 gp41 펩티드에 대하여 IgG반응성을 유도하기 위한 T-세포 자극을 제공하는 gp41 펩티드에 대하여 담체로서 기능하였다.
다른 백신 구조
아미노산 서열의 반복
면역원성 펩디드에 있어서, 아미노산 서열의 반복의 중요성을 평가하기 위하여, 펩티드 (VTEEI)1,(VTEEI)2,(VTEEI)3이 다른 말라리아 펩티드에 대하여 기술한 것과 동일한 절차를 따라 테스트된다.
B-세포와 T-세포 에피토프의 포합
펩티드 구조의 면역성는 이뮤니티가 희망되는 분자에 더하여 비수지성 펩티드 담체에 펩티드로서 하나 또는 그 이상의 B-세포 그리고 T-세포 에피토프의 포함과 같은 몇몇 방법에 의하여 보다 향상될 수 있다.
광범위한 T-세포 에피토프의 포함은 MHC제한의 극복의 효과를 가질수 있다. 이러한 면은 T-세포 에피토프로부터 비수지성 펩티드 담체로 이뮤니게이션하고자하는 펩티드와 조합하여 펩티드를 연결함에 의하여 테스트될 수 있다. 면역원성펩티드와 T-세포 에피토프 기능을 갖는 펩티드의 조함은 펩티드의 이용에 기초하여 이용된다:
QYIKANSKFIGITEL
그리고
FNNFTVSFWLHRVKVSASHLE
이들 양자는 모두 광범위한 T-세포 에피토프로 알려졌고,(왕 1995), 조합하여 사용된다:
(QGPGAP)4(말라리아 특이성)
그리고 TCTKEYEDIVLKSHMNRESDD와 함께
(에리트로사이트 결합 항원 -175로부터의)
펩티드의 테스팅은 실시예 20에서 기술한 실헙설계를 사용하여 실시된다.
다른 흥미있는 에피토프
유사하게, 수개의 흥미있는 에피토프가 단독 또는 조합의 비수지성 펩티드 담체에 포함돨 수 있다. 그러한 흥미있는 에피토프는 시토톡식 T-세포, 지방 또는 면역 체계의 활성을 위한 터프신 서열, 그리고 시토키네스 또는 비오액티브 시토키네 서열의 자극을 위한 Tcyt 에피토프를 포함한다.
시토키네스와 같은 재조합 또는 천연의 이뮤노모듈레이터는 비수지성 펩티드 담체구조와 함께 이스콤으로 삽입될 수 있다. 시토키네스는 예를들어 인터류킨 1-18, 인터페론 감마, 인터페론 -알파, 인터페론 베타, 그리고 TNF(종양 네크로시스 인자).를 포함할 수 있다. 선택적으로, 생체활성 시토키네-특이성의 아미노산 서열은 분지 펩티드 구조내에 포함된 서열의 일부일 수 있다.
수개의 다른 HIV-1펩티드는 상기에서 기슬한 실시예에 따라 사용될 수 있다. 그러한 펩티드는 gp120그리고 gp41의 다양한 다른 펩티드를 포함한다.
실시예21
다양한 질병의 치료에서 치료 시약의 용도로서 비수지성 펩티드 담체
질병의 예방 또는 치료 또는 질병확산의 감소 능력이 있는 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체는 본 발명의 매우 흥미있는 면을 구성한다.
본 발명의 이러한 적용을 일러스트하기 위하여, 다음의 실시예는 이러한 예다:
질병과 같은 셉시스의 처리를 위한 비수지성 펩티드 담체
패혈증과 같은 질병의 확산은 그램음성 세균의 지방A 같은 미생물로 부터의 인지질 그리고 말라리아 기생체의 구조를 함유하고 있는 포스파티딜 이노시톨에 의하여 유도되었다. 베타-2-글리코프로테인 1은 일반적으로 음성으로 하전된 인지질에 결합하는 것으로 알려진 혈자 단백질이다. 이러한 글리코프로테인의 서열을 비수지성 펩티드 담체에 연결함에 의하여, 인지질에의 결합은 조정될 수 있다, 반면에 질병의 에방 또는 치료 시약으로 유도된 어떤 비수지성 펩티드 담체의 특이적인 표적화가 이루어질 수 있다.
다음의 펩티드가 합성되었다:
베타-2- 글리코프로테인 1 펩티드 aa268-278:
KNGMLKGDKVS
이 펩티드는 인지질에 대하여 결합하고, 따라서, 자가면역 질병에 관련이 있다.
베타-2-글리코프로테인 1 펩티드 aa 281-288:
CKNKEKKC
이 펩티드는 인지질을 결합한다.
펩티드 및 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체는 패혈증류 질환의 증후에 대한 그들의 예방효과에 대해 생체내 분석에서 3회 테스트되었다. 이 테스트는 TNF(종양괴사인자) 레벨의 측정과 관련이 있다.
실험계획
처치개요
8-12주된 (C57BLxBALB/c) 암컷 F1마우스를 2마리씩 그룹을 만들었다.
펩티드가 자극적인 독소(10㎍ 리포다당류)와 혼합되고, 이 혼합물이 마우스에게 복강내로 투여되었다.
TNF 분석을 위해, 자극적인 독소를 주사하기 전에 7-10일간 마우스에 BCG를 주입하였다.
혈액수집
10㎕의 꼬리혈이 EDTA 혈장으로 수집되었고, TNF 분석을 위해 다음과 같이 채혈이 수행되었다:
0, 1, 2 및 4 시간 후에
세포 생활력
세포생활력이 트리파네블 배출로 평가되었다.
TNF 엘리사 분석
혈청에서의 쥐과 동물 TNF-알파 레벨이 제조자의 지시에 따라 수행되는 상업적인 엘리사 방법으로 측정되었다 (Genzyme, Cambridge, MA).
결과
비수지성 펩티드 담체는 마우스에 있어서, 쥐과 동물 혈청에서의 종양괴사인자의 농도로 측정된 것과 같이 리포다당류 독성을 감소시킨다.
대조군의 팹티드가 단독으로 블로킹을 유도하지 않는데 비해, 비수지성 펩티드 담체는 리포다당류로 유도된 마우스 생체내의 TNF 분비가 억제되는CKNKEKKC 펩티드 또는 KNGMLKGDKVS 펩티드로 유도된다 (도 23).
다른 질병
본 발명에 따른 비수지성 펩티드 담체의 다른 치료적 용도에는 HIV-1 단백분해효소 저해 펩티드를, 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 혈관-뇌장벽 특정 펩티드의 구조 또는 결합에 결합시키는 것이 포함된다.
THLVAIQNKEEIEYL
또는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 백일해 독소인 S2
RALTVAELRGSGDLQEYL
실시예 28 참조.
실시예 22
베타-2-당단백 Ⅰ 펩티드를 비수지성 펩티드 담체에 결합시키는 것에 의한 말라리아 항원 유도 사이토킨 분비의 억제
배경
열대성 말라리아 기생충의 병원성은 복합적인 기생, 내분비세포에 대한 세포융합성 및 TNF-알파 및 IL-6과 같은 사이토킨의 유도와 관련되는 것으로 보인다. 말라리아 치료제는 복합적인 기생을 차단하도록 설계되나, 세포융합성 기생 또는 사이토킨 분비를 유도하는 기생을 저해하는 그 들의 능력은, 비록 최근의 연구에서 클로로퀸이 지질다당류로 자극된 사람의 모노사이트로부터의 TNF-알파 분비를 감소시키는 것을 보여주었다 해도, 드물게 조사된다. 아프리카의 어린이들은 말라리아 약물로 그들의 기생충을 제거한 후 뇌내의 감염성 반응 때문에 사망할 수 있다. 세포융합성 기생 또는 사이토킨 분비를 유도하는 기생의 저해를 매개하는 약물은 말라리아 기생충에 의해 야기된 사망률 및 이환률을 감소시키는 경향이 있다.
재료와 방법
합성 펩티드
베타-2-당단백질 Ⅰ 펩티드 aa 281-288 :
KNGMLKGDKVS
이 펩티드는 인지질에 대항하여 항체와 결합하고, 따라서 또한 자가면역성 질환과 관계된다.
베타-2-당단백질 Ⅰ 펩티드 aa 281-288 :
CKNKEKKC
이 펩티드는 인지질과 결합한다.
말라리아 기생체의 배양
P. 팔시파룸 분리 3D7은 21밀리몰 소디움 바이카보네이트, 25밀리몰 HEPES완충액 , 그리고 10%의 인간 혈장으로 보충된 RPMI 1640을 사용하는 배양에 두었다. 기생체는 4%V/V 그룹 0 양성의 인간 적혈구에서 길러졌다.
사이토킨 생성의 자극을 위한 P. 팔시파룸의 엑소항원
엑소항원(exoantigen)은 이전에 기술한 바와 같이(자코센 등, 1988) 리간드로서 클리닉컬리 이뮨 아프리카 성인으로부터의 IgG의 풀을 사용하면서 배양 배지로부터 어피니티 정제되었다. 크로마토그라피에 앞서, 배양 배지는 7000g에서 10분간 원심분리 되고, 0.22 마이크로미터 막을 사용하여 여과되었으며, 칼럼완충액네 대하여 하룻밤 투석되었다.
인간의 단핵세포로부터의 시토키네-방출 자극
서로 다른 데니쉬 공여자로부터의 인간의 페리퍼럴 혈액 단핵세포가 RPMI1640 내에서의 3%(v/v)의 인간 혈장내에서 상등되고, 밀리리터당 2*106세포로 조정되었다.; 연속적으로, 0.1 밀리리터 부피가 96-웰 마이크로티터플레이트의 웰로 디스펜디드 되었다. 3% 혈장의 RPMI 1640내에 희석된, 2-폴드 희석의(0-100 마이크로그람/밀리리터)과 자극 말라리아 항원의 최적농도내의 펩티드는 전체 부피 0.2 밀리리터에 더하여졌다. 펩티드없이 자극항원과 인큐베이트된 단핵 세포단독으로 배지에서 인큐베이트된 세포는 양성과 음성의 콘트롤로 각각 사용되었다.
배양액은 IL-6과 TNF 분석을 위하여 하룻밤 인큐베이트 되었다.
IL-6에 대한 ELISA
슈퍼너턴트는 수집되었고 있따르는 변형과 함께 ELISA과정(한센 등 ,1991; 지콥슨 등,1993)에 의하여 IL-6에 대하여 분석되었다. ELISA 멕시소프 플레이트(NUNC, 로스킬데, 덴마크)는 pH9.6, 100밀리몰의 NaHCO3내에서 인간 재조합 IL-6에 대한 2.5 마이크로그람/미리리리터의 토끼 폴리클로널 IgG 의 웰당 100마이크로 리터로 4℃에서 24시간 동안 피복되었다. 비부착 부위는 pH7.2의 포스피이트 완충된 염하에서(37도에서 1시간) 2%의 인간 혈장 알부민의 웰당 100마이크로리터에 의하여 1시간 동안 차단되었다.
웰은 2.5 염화 나트륨, 0.1% 트윈20( 머크, 담스타트, 독일)내에서 4회 세척되었다. 세척과정은 다음의 각 인큐베이션 단계후에 시행되었다.:
1) 인큐베이션 완충액하에서(인 완충의 염내에서 4%(v/v)정상 토끼 혈청, (DAKO 코드 902), 1% 폴리에틸렌 글라이콜(몰.wt 6000), 2.5%염화수소, 0.2 % 트윈 20) 50%(V/V)로 만들어진 100마이크로리터 배양 수퍼터넌트는37도에서 2시간 인큐베이트되고, 동일한 인큐베이션 버퍼내의 재조합 시토키네 표준으의 희석은 실험된 수퍼터넌트와 평행하게 분석되었다.
2) 재조합된 IL-6 (0.5 %의 인간 혈장 알부민과 PBS내의 0.1%의 트윈 20내의 1.5 마이크로그람/밀리릴터)에 대하여 웰당 100마이크로리터의 비오티닐레이트화된 토끼 항체가 1시간동안 37도에서 가해졌다.
웰당 100마이크로리터의 0.67밀리그람/밀리리터의 1,2-페닐다이아민 히드로클로라이드(DAKO)가 0.015%의 (V/V)과산화수소함유, pH5.0시트릭산-포스페이트 완충액100밀리몰에 용해되었다.
그 반응은 웰당 2.4몰의 황산수소50마이크로리터를 첨가함에 의하여 정지되엇고, 적정 밀도는 620㎚ 의 대조테스트에 대하여 490 ㎚ 에서의 ELISA스케너를 사용하여 측정되었다.
결과
비수지성 펩티드 담체는 종양괴사 인자와 인터류킨-6의 분비에 의하여 측정되는 바와 같이 시험관내에서 말라리아 기생체 독소활성을 방해하였다. 시험관내에서 펩티드는 리포폴리사카라이드독성에 영향을 미치지 아니하였다. 세포 활성이 영향을 바디 아니하는 것과 마찬가지로 말라리아 기생체 독소 활성은 세포에 대한 독성에 의하여 야기되지 아니하였다.
파일럿 실험에 있어서, CKNKEKKC펩티드를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 말라리아 항원에 의하여 유도된 IL-6분비를 저해하엿다, 반면에 단독의 대조 펩티드는 단지 IL-6의 소부분 차단만을 일으켰다.(제12도).
두 실험의 방법이 상기도면에 도시되었다.
CKNKEKKC펩티드를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 말라리아 기생체 외부항원(아래의 표3)을 사용하여 자극된 인간 모노뉴클리어 세포로부터 분비된 TNF-알파와 IIL-6 모두의 분비를 저해하였다. 대조 펩티드는 아무런 차단효과를 보이지 아니하였다. 펩티드중 어느하나도 리포사카라이드 유도 사이토킨 분비를 차단하지 아니하였다(아래의 표4). 펩티드의 어느하나도 세포화렁에 영향을 미치지 아니하였는데 이는 펩티드가 전혀 또는 낮은 독성을 구성함을 나타내었다.
표 3
시험관내에서 말라리아 외항원의 백분율 저해는 펩티드 CKNKEKKC 또는 KNGMLKGDKVS과 대조 펩티드-CKNKEKKC에 의하여 유도된 유도 비수지성 펩티드 담체(NDPC)에 의하여 인간 척수 단핵세포로부터 TNFUI-알파와 IL-6을 유도하였다.
표 3
펩티드(마그/밀리리) TNF-알파 IL-6
CKNKEKKC(NDPC)2001005025 n=761.9%(28.6)47.5%(27.4)50.0%(36.5)34.2%(27.7) n=755.5%(33.2)34.4%(41.2)40.8%(38.8)24.8%(37.0)
CKNKEKKC(대조)2001005025 n=719.6%(15.7)15.7%(10.3)10.7%(36.5)12.2%(18.2) n=70.7%(9.4)-6.2%(6.7)-2.4%(11.4)-3.7%(9.4)
KNGMLKGDKVS(NDPC)2001005025 n=713.9%(19.9)-8.9%(27.0)14.0%(25.0)8.5%(19.4) n=719.9%(18.8)5.3%(6.4)1.7%(15.2)-7.6%(7.4)
표 4
시험관내에서 대장균 리포폴리사카라이드의 백분율 저해는 펩티드 CKNKEKKC 또는 KNGMLKGDKVS과 대조 펩티드-CKNKEKKC에 의하여 유도된 유도 비수지성 펩티드 담체(NDPC)에 의GKS 인간 척수 단핵세포로부터 TNFUI-알파와 IL-6을 유도하였다.
표 4
펩티드(마그/밀리리) TNF-알파 IL-6
CKNKEKKC(NDPC)2001005025 n=4-7.7%(17.5)-15.0%(25.1)-27.0%(21.7)-14.4%(41.7) n=4-13.0%(6.1)-13.0%(3.1)-22.5%(7.2)-12.9%(4.4)
CKNKEKKC(대조)2001005025 n=4-5.6%(7.7)3.9%(22.7)9.1%(7.5)10.9%(20.0) n=4-6.6%(7.1)-9.5%(10.2)-4.7%(2.6)-2.7%(2.7)
KNGMLKGDKVS(NDPC)2001005025 n=416.4%(34.3)2.6%(22.9)9.5%(50.6)-3.7%(42.5) n=42.0%(8.6)-4.9%(6.4)-8.5%(7.9)-7.7%(7.4)
표 5
말라리아 기생체 외항원과 펩티드를 사용한 인큐베이션이후에 단핵세포활성 백분율. 3가지 실험의 평균과 표준오차가 표시되었다. 펩티드 없이 항원자극후의 세포활성은 96.3%(1.04)엿고, 자극이후의 세포활성은 96.9%(2.95)였다.
표 5
CKNKEKKC(NDPC) 항원 항원없음
200마이그/밀리 96.3%(1.99) 96.4%(1.89)
100 97.1%(1.45) 97.8%(1.43)
50 94.6%(1.01) 96.7%(0.71)
25 94.5%(3.26) 96.9%(3.26)
CKNKEKKC(대조) 항원 항원없음
200 98.0%(1.45) 96.5%(0.72)
100 96.8%(1.81) 97.3%(0.97)
50 97.2%(1.91) 96.0%(2.50)
25 97.5%(1.67) 98.2%(1.78)
KNGMLKGDKVS(NDPC) 항원 항원없음
200 96.4%(2.76) 95.6%(3.01)
100 97.4%(1.85) 96.9%(1.00)
50 96.7%(1.98) 95.2%(2.29)
25 97.4%(1.44) 96.1%(1.75)
실시예 23
비수지성 펩티드 담체에 의한 자가면역성 질환과 관련된 면역계의 억제조절
비수지성 펩티드 담체는 어떤 면역원성 시약에 대하여 면역반응의 특이성 하조절에 대하여 생체활성 펩티드와 조합하여 면역원성 펩티드를 포함할 수 있다. 선택적으로, 면역원성 펩티드에 의하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 IL-10과 TGF와 같은 이뮤노서프레시브 사이토킨과 조합하여 어떤 면역원성 시약에 대한 면역반응의 특이적 하조절을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 특이성 펩티드에 대한 톨러런스 또는 단백질 단백질 단편이 포함될 수 있다. 이 방법은 독성질병, 자가면역질병(당뇨병, 관절염, 스클레로시스 등)에 대한 치료 또는 예방을 위하여 사용될 수 있다.
모듈레이팅 효과 의 한가지 예가 다음에 제시된다. 마우스가 펩티드에 대하여 고도의 항체 반응성을 포함하는 말라리아 EBA-175펩티드를 사용하여 3차례 면역화되었다. EBA-175를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 마우스 IL-10 과 혼합되고, 면역화가 4차레 실시되었다. 다음으로 펩티드 특이성 항체에 대한 배양과 스크린닝이 행하여졌다.
재료와 방법
마우스가 하나의 모델 펩티드를 함유하는 비수지성 담체구조를 사용하여 면역화되었다:
TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD
이 펩티드는 말라리아 기생체 플라스모디움 팔시파룸으로부터 유도되었다.
펩티드는 적혈구 기생체 침입을 포함하는 항원 -175(EBA-175)결함 적혈구의 서열을 포괄한다. 그러나 그 서열은 감염과정에서 면역계에 의하여 정상적으로는 인식되지 아니한다.
이 실험에서는 6-8주된 암컷 F1 (C57BI*BALB/C) 마우스가 사용되었다.
마우스는 EBA-175펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화되었다. 몇몇의 마우스는 프로이즈 컴플리트(1차 면역화) 또는 인컴플리트(2차 그리고 3차 면역화)보조액를 사용하여 1+1로 혼합된 펩티드 구성물의 16마이크로 3차례, 0일, 21일, 49일에, 피하 면역화 되었다. 마우스는 70일째에 마우스 재조합 IL-10 의 1마이크로그램 함유 그리고 함유하지아니한 프로이즈 인컴플리트 보조액가 혼함된 펩티드 구성물을 사용하여 4번째 피하 면역화 되었다. 마우스는 -1,12,33,61,82일 배양되었다. 혈액으로부터 혈청이 수집되었고, 대조 EBA-175펩티드에 대한 항체 반응성을 위하여 ELSA에서 테스트된다.
ELISA는 본 출워너의 실시예20에서와 같은 방법으로 시행되었다.
결과:
프로인트 컴플리트 보조액의 EBA-175에 대응하는 8마리의 마우스가 1번더 (4번째)면역화 되었다. 4마리의 마우스는 EBA-175펩티드와 프로이즈 인컴플리트 보조액로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 받았고, 4 마리의 마우스는 사이와 동일한 것에 면역계의 하조절자인 마우스 재조합 IL-10를 받았다.
제 24도는 보조액 단독으로 펩티드와 조함된 것으로서 면역화된 마우스는 항체 반응성에 있어서 안정하거나 또는 약간의 감소가 있었다. 반면에 IL-10가 첨가된 펩티드-보조액 조합으로 면역화된 마우스는 항체 반응에서 현저한 감고를 보였음을 나타낸다.
또한, 비수지성 펩티드 담체는 일반적으로 펩티드 약품과 같은 메디카먼트의 순환에서 수명을 연장시키는데 사용될 수 있다.
실시예 24
Th-1유사 그리고 Th-2유사 반응의 특이적인 유도를 위한 면역원성 펩티드를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체
면역원성 펩티드를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체가 면역원성 시약에 대한 Th-1유사 그리고 Th-2유사 셀룰러 반응의 특이적인 유도를 위하여 사이토킨과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 그러한 반응의 특이적인 유도와 관련하여, 사이토킨과 조합된 비수지성 펩티드 담체는 병원성 미생물에 대한 예방, 감염성 질병, 자기면역 질병에 대한 치료를 위한 백신화의 목적으로 사용될 수 있다. Th-1유사 반응의 특이적인 유도는 라쉬마니아시스, 튜버큘로시스. AIDS와 같은 질병의 예방, 알러지 질환 등에 대한 치료에 사요오딜 수 있다. 반면에 Th-2유사 반응의 특이적인 유도는 암 질병을 에방, 그리고 독성 질병의(패혈증, 수막염 등) 치료목적으로 사용될 수 있다.
비수지성 펩티드 담체에 의한 면역계 조절의 예는 아래에 보여지고, 여기서 마우스는 합성 인간 면역결핍성 바이러스-1 특이성 펩티드 또는 레이슈마니아 메이져 특이성 펩티드를 사용하여 면역화된다.
재료와 방법
마우스는 하나 또는 그 이상의 서로 다른 모델-펩티드를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체로서 면역화되었다.:
HIV-1 펩티드 gp120,
aa152-176, (GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF),
와 알려진 B- 그리고 T-세포 에피토프.
L1: YDQLVTRVVTHEMAHA
이 라쉬마니아 특이성 펩티드는 T-세포 에피토프를 함유하는 것으로 보고된다.
L2: EAEEAARLQA (Balb/C 마우스 내의 H-2d_ 제한 Th2에피토프 ).
사이토킨 펩티드:
INF-감마 생체활성 서열:
IFN-감마(1-39)
HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG
IFN-감마(95-133)
AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
TNF 생체활성 서열(TNF70-80);
Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ile-Thr-His-Thr-Ile
터프신 펩티드:
TKPR
재조합 마우스 IFN-감마,IL-4,IL-12,그리고 TNF -알파는 구입하였다.
재조합된 감마 인터페론, IL-12, IL-18 또는 상기의 합성 펩티드 서열은 Th-1반응의 유도를 위하여 사용될 수 있다. 재조합 IL-4, IL-5, IL-13 또는 상기의 합성 펩티드서열은 Th-2반응의 유도를 위하여 사용될 수 있다. 또한 B7-1, B7-2, P-셀렉틴, 또는 E-셀렉틴과 같은 부착 분자의 첨가는 Th-1와 Th-2반응의 유도에 영향을 준다. 펩티드 그리고/또는 사이토킨 그리고/또는 부착 분자는 단독으로 또는 운반체내에서, 보조액와 함께, 리포좀 등의 면역자극 복합물에 삽입되어 사용될 수 있다.
세포를 프리젠팅하는 서로가른 항원의 첨가는 물론 펩티드의 용량은 Th-1과 Th-2반응의 유도에 영향을 줄 수 있다.
실험절차
6-8주된 BALB/cJ 암컷 마우스 (Th2대응 마우스로 보고된)가 본 연구에 사용되었다.
마우스는 어떤 축합이 없는 레이슈마니아 또는 HIV-1 펩티드를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체로서 면역화 되었다. 어떤마우스는 0, 21, 49일에 복강으로 펩티드 구성물 16마이그를 사용하여 면역화되었다. 반면에, 다른 마우스는 0, 21, 49일에 펩티드 구성물 단독 또는 알럼, 알럼과 재조합 사이토킨 또는 프로이드 컴플리트(1차면역) 또는 인컴플리트(2,3차면역) 보조액 1+1로 혼합되어 16마이그로 복강내 면역화되었다.
마우스는 -1, 12, 33, 그리고 61일 배양되었다. 혈액으로부터 혈청가 채취되고 라이쉬마니아 펩티드 또는 HIV-1 gp-120펩티드에 대한 IgG2a(Th1의 마커) 그리고 IgG1(Th2의 마커)항체 반응성에 대하여 엘사에서 테스트 되었다.
ELSA는 출원서의 실시예 20에서 기술된 것과 같이 실시되었다.
시험관내에서 페리퍼럴 단핵 세포, 림프 노드 세포, 그리고 스플린 세포는 수집되고, 적정 농도의 펩티드 또는 재조합 gp120 또는 PPD로 자극되었다. 5-7일간의 인큐베이션 이후에, 수퍼터넌트가 채취되고, 감마 인터페론(Th반응의 지시물)과 인터류킨-4(Th2반응의 지시물로서)의 함량이 제조자의 지침에 따라 상용의 ELSA를 사용하여 테스트 되었다. 세포내의 감마-인터페론 mRNA와 인터류킨-4 mRNA의 정량이 또한 실시되었다.
결과
레이슈마니아 L1을 사용한 면역화 실험 : 마우스는 L1 펩티드에 알럼 단독의 첨가 또는 프로이드의 컴플리트 보조액와 알럼의 첨가 또는 알럼과 다음의 재조함 마우스 사이토킨을 첨가한 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화 되었다: 인터페론 감마, 종양괴사 인자(TNF), IL-12 또는 IL-4.
제 25도는 이들 L1 조합으로 면역화된 마우스의 IgG 반응(추정적인 Th2 반응)을 나타낸다. 모든 마우스는 3회 면역화 후에 IgG1을 생산하였다. 최대 반응은 재조합 TNF, 재조합 IFN-감마 또는 프로이드 컴플리트 보조액를 사용한 면역화 이후에 탐지될 수 있었다.
재조합 TNF 또는 재조합 IL-12를 사용하여 면역화된 마우스는 2회 면역화 이후에 반응하였다.
제 26도는 동일한 L1조합으로 면역화된 마우스의 IgG2a 반응(추정적인 Th1반응)을 보여준다.
재조합 TNF 또는 프로이드 컴플리트 보조액를 사용하여 면역화된 마우스는 3차 면역화 이후에 반응하였다. 약한 반응이 다른 L1 조합으로 탐지될 수 있었다.
바이파식 IgG2a반응 이 기록되었다.
대부분의 조합으로 면역화된 마우스는 한차례의 면역화 이후에 IgG2a반응을 보였다.
결론
L1 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체로 면역화된 마우스와 재조합 사이토킨은 L1펩티드에 강한 항체 반응을 보였다. 비록 많은 수가 Th1 사이토킨으로 면역화되었으나, 모든 마우스는 3차 면역화 이후에 강한 Th2 유사 IgG1 반응을 보였다. IgG1과 IgG2a는 Th2와 Th1반응에 대하여 신뢰할 만한 마커가 아니고, 또한 Th1사이토킨 역시 반복된 노출이후에는 Th2 반응을 유도할 수 있을을 알 수 있다. 실험 중에서 Th1 반응이 Th2 반응에 앞서 발전하는 것임이 보고되었다. 단 한 번의 면여화 이후에 전이 IgG2a반응(추정적인 Th1 반응)이 기록디었다. 이들 마우스;의 몇몇은 반복된 면역화 이후에도 IgG2a반응을 보이지 아니하였다. 3 차례의 면역화 이후에 2개의 집단에서 탐지되는 강력한 IgG2a반응은 1차 면역화 이후에 기록되는 IgG2a반응과는 매우 다를 수 있다.
한 차례의 면역화 이후에 합성 펩티드 조합이 면역원성을 나타낼 수 있다는 것은 새로운 발견이었다. 그러한 발견은 단지 DNA백신과 어테뉴에이티드 미생물에 대해서만 기록되었다. 1 차례의 면역화 이후에, IgG2a 반응은 Th1반응의 마커일 수 있다.
마우스는 L1 펩티드와 터프신으로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화된 sc. 그리고 ip였다. 마우스는 L1-터프신 구성 sc.에 대하여 강력한 IgG1반응을 보였고, L1-터프신 구성 ip.와 L1구성 단독의 sc.에 대하여는 중간의 반응을 보였다 (제27도). L1-터프신 조합은 IgG2a 반응을 유도하지 아니하였다 (제28도). 따라서 터프신은 면역계의 한 부분만을 유도한다는 점에서 흥미롭다.
마우스는 또한 IFN-감마 수용체에 결합을 조절하는 것으로 알려진 IFN-감마의 2개 서로다른 서열을 포괄하는 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화 되었다. 서로 다른 조합은 3차례 면역화 sc.(도 29) 이후 면역원성이 되었다. L1을 사용한 면역화 와 IFN-감마 펩티드는 강력한 IgG1반응을 유도하였고, 이 조함은 2차레의 면역화 이후에 이뮤노게닉 하였다. 이 조합은 또한 3차 면역 이후에는 IgG2a 반응을 유도할 수 있었다 (도 30).
서로 다른 IFN-감마 펩티드는 또한 ip면역화(도 31) 이후에 상대적으로 약한 IgG1 반응을 유도하였으나, IgG2a 반응은 유도하지 아니하였다 (도 32).
마지막으로 마우스는 또한 TNF서열을 포함하는 펩티드와 함께 L1펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화되었다. L1-TNFUI -펩티드 조합 피하주사는 강력한 IgG1반응을 유도한 반면에(제33도), 복강내 투여 면역화는 IgG1 반응(테이타가 보이자 아니함)을 유도하지 않았다.
L1-TNF 펩티드 조합으로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용한 sc. 면역화는 도한 재조합 TNFUI 와 혼합된 L1 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체에 비교될 만한 바이페이직 IgG2a 반응을 유도하였다. 반면에 ip면역는 IgG2a 반응을 유도하지 아니하였다 (도 34).
결과의 재현이 Th2 유도 펩티드로 알려진 라쉬마니아 펩티드, L2를 사용하여 테스트 되었다. L2펩티드 단독 또는 터프신과 또는 TNF와 함께 조합되어 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 모두 sc. 면역화 이후에 IgG1반응을 유도하였다. 반면에 ip면역화는 이뮤노게닉하지 아니하였다 (도 35). sc. 면역화는 IgG2a 반응을 유도하지 아니하였으나, L2-터프신 또는 L2-TNF-펩티드 조합 ip로 유도된 ip면역화는 1차 면역화 이후에 IgG2a 반응을 유도하였으나, 3차면역화 이후에는 유도하지 아니하였다 (도 36).
터프신 또는 TNF 펩티드의 두 개의 IFN-감마 펩티드가 조합 사용되어 유도된 비수지성 펩티드 담체가 또한 HIV-1 gp120 펩티드와 조합하여 테스트되었다. 면역화 sc.는 가장 이뮤노게닉한 구조를 함유하는 TNF 펩티드와 IgG1생산을 자극하였다 (도 37). 면역화 ip.는 이뮤노게닉하지 아니하였다.
IFN펩티드 또는 TNF 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용한 면역화 sc.는 탐지가능한 바이페이직 IgG2a 반응을 첫 번째와 세 번째 면역화(도 38)이후에 유도하였다. 면역화 ip.는 한 번의 면역화 이후에 이뮤노게닉하였으나, 3번의 면역화 이후에는 그러하지 아니하였다. 구성을 함유하는 터프신은 IgG2a 반응을 유도하지 아니하였다.
결론
몇몇의 합성 펩티드 조합이 담체나 보조액의 사용없이 강력한 항체반응을 유도하였다. 매우 많은 서로다른 항원성 펩티드 사이토킨 펩티드 조합이 강력한 이뮤노겐이라는 사실은 완전히 새로운 발견이다.
실시예25
향상된 셀룰러 반응의 특이적인 유도를 위한 면역원성 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체
배경:
비수지성 펩티드 담체는 어떤 면역원성 시약에 대한 향상된 셀룰러 반응의 특이적인 유도를 위한 생체활성 사이토킨 펩티드와 조합하여 면역원성펩티드를 포함할 수 있다.
선택적으로, 면역원성 펩티드로 유도된 비수지성 담체는 어떤 면역원성 시약에 대한 향상된 셀룰러 반응의 특이적인 유도를 위하여 사이토킨 분자와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 사이토킨과 조합한 비수지성 담체는 병원성 미생물에 대한 예방, 감염성질병, 독성 질병, 자가면역질병 등에 대한 치료를 위한 백신화를 위하여 사용될 수 있다.
비수성 펩티드 수소담체의 이러한 한 에가 아래에 제시된다. 여기서 마우스는 합성 인간 이뮤노디피션시 바이러스-1특이성 펩티드 그리고 구조에 포함된 IL-1베타 펩티드 또는 터프신 펩티드의 단일 복사를 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체로 면역화 되었다.
재료와 방법:
하나의 IL-1베타 생체활성 서열:
VQGEESNDK/Val-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys
또는 TNF 생체활성 서열:
Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ile-Thr-His-Thr-Ile
또는 터프신 서열:
TKPR,
HIV-1 gp120으로부터의 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체내의 N- 또는 C- 말단으로 합성됨:
aa152-176: GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
공지의 B-,T-세포 에피토프와 함께.
비- 수지성 펩티드 담체 구성이 PPD에의 축합후, 면역자극 복합물 또는 리포좀에의 삽입후, 재조합사이토킨, 부착 분자, 보조액, 비클, 담체 등의 부가후에 단독으로 사용될 수 있다.
다음으로 상기의 실시예 20에서 기술한 바와 같은 동일한 실험과 테스팅 공정이 실시되었다.
6-8주된 (C57BI*BALB/c) 암컷 F1 마우스가 본 연구에 사용되었다.
마우스는 어떠한 축합이 없이 IL-1또는 터프신 서열이 있는 그리고 없는 HIV-1 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화 되었다. 마우스는 피하 4차레, 0일,21,49, 그리고 70일에 16마이그의 단독의 펩티드 구성 또는 프로이드의 컴플리트(1차 면역화)또는 인컴플리트(2, 3차 면역화)보조액와 1+1혼합된 펩티드로면역화 되었다.
마우스는 -1, 12, 33, 61 그리고 82일간 배양되었다. 혈청은 혈액으로부터 채마우스되었고, 선형 HIV-1 gp-120 펩티드에 대한 항체 반응성을 위하여 ELISA에서 테스트 되었다.
ELISA는 본 출원서의 실시예 20에서 기술한 것과 같이 실시되었다.
결과:
실험은 HIV-1 gp-120 단독 또는 IL-1 베타 특이성 펩티드 서열 또는 터프신 서열과 함께 유도된 비수지성 펩티드 담체가 보조액의 사용법이 면역원성을 나타낸다. 비수지성 담체 구조는 인간에 사용되어질 수 있고, 백신기술에서의 적용과 함께 인간 면역계에 강력한 면역원성 자극을 제공한다.
gp-120 펩티드(배치Ⅱ) 단독, 프로이드 보조액와 조합하여, IL-1펩티드와 조합하여 도는 터프신 펩티드와 조합하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 3차 면역화 sc.이후에 하에 생성을 유도하였다 (도 39). 가장 강력한 자극제는 gp120펩티드 첨가 터프신 구성이었다.
gp-120 펩티드(배치Ⅳ) 단독 또는 IL-1펩티드와 조합을 사용하여 유도된 비수지성 펩티드 담체는 3차 면역화 sc. 이후에 항체 생성을 유도 하였다(도 40)
실시예 26
암치료에서 치료제로서 용도를 위한 비수지성 펩티드 담체
비수지성 펩티드 담체는 암세포 성장 그리고/또는 메타스타시스에 대한 직접적인 중화에 의하여, 그리고 암세포에 대하여 중화하는 면역반응을 유도함에 의하여 암의 치료 또는 제해하느데 사용될 수 있다.
본 발명의 이러한 적용레를 보여주는 실시예는 아래와 같다.
재료과 방법
다음의 합성 펩티드가 합성된다.
야생의 p53 펩티드: KYMCNSSCM,
변종 p53 펩티드 : KYICNSCM,
그리고 MAGE, BAGE GAGE, MART,멜란,그리고, 티로신나제 또는 43kDa단백질, 다음을 포함하는:
다음을 포함하는 kDa 단백질로부터의 QDLTMKYQIF
MART-1/멜란-A 단백질로부터의 AAGIGILTV 그리고 ILTVILGVL
MAGE-1로부터의 SAYGEPRKL
티로신나제로부터의 SEIWRDIDF
GAGE-1로부터의 YRPRPRRY
그리고 멜라노마단백질 YLEPGPVTA
펩티드는 대조 펩티드 또는 사이토킨(TNFUI-알파, GM-CSF), 사이토킨 펩티드 또는 B7 또는 B7리간드 CD28 또는 CTLA-4 같은 부착 분자가 있는 또는 없는 유도된 비수지성 펩티드 담체 구성에 존재한다.
BALB/c (10-16주)암컷 마우스가 사용된다. 마우스는 36마이그의 펩티드 컨스트럭츠로 1-4차례 면역된다.
Tcyt활성:
3×106면역 스플린 세포가 시험관에서 5-7일간 펩티드를 사용하여 레스티뮬레이트된다.(app. 5 마이크몰). 레스티물레이티드 세포의 시토리틱 활성은 스플린 세포를51C-표시된 표적과 듀플리케이트 혼함함에 의하여 측정되고, 37도에서 4시간 인큐베이트된다. 수퍼터넌츠는 채취게에서 채취되고, 감마 카운터에서 방사활성이 측정.
퍼센트- 특이성 라이시스는 다음의 수식에 의하여 계산된다.:
100×((실험방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발방출).
종양에방:
마우스(집단당5마리)는 비수지성 펩티드 담체로 면역화되고, 암세포(1.9*105사르코마 세포 또는 마스토시토마 세포)를 사용하여 i.v.또는 s.c. 시도된다.
인테그린 부착 분자 서열 그리고 RGD서열의 포리머는 비수지성 펩티드 담체에 삽입되고, BALB/c 마우스에있어서 멜라노마 세포 메타스타시스 차단력이 테스트된다.
암-세포 툭이 서열 또는 Lex같은탄화수소 구조는 비수지성 펩티드 담체 구조에 삽입되고, 미세 메타스타제의 분석적 확인에 사용되었다. 이때, 실시예 19에서 기술된 ELISA방법을 사용한다.
실시예 27
자가면역성 질환에 대한 비수지성 펩티드 담체: 예방, 치료, 그리고 진단.
예를 들어, 자가 면역질병과 관련된 면역계의 하조절이 비수지성 펩티드 담체에 연결된 렐러번트 펩티드를 어드미니스트레이팅 함에 의하여 실시될 수 있다. 류마토이드 아뜨라이티스의 치료를 위한 이러한 용도의 한 예는 경구 또는 시스테미 인테이크를 위한 치료 조성물의 제조이다. 여기서 관절염과 관련된 것으로 다음의 서열을 가진 펩티드 마이코 박테리움 보비스 HSP60 aa 180-188는 비수지성 펩티드 담체에 연결된다:
TFGLQLELT
또는 다음의 서열을 가진 HLA 그리고 DnaJ HSP :
Q(K/R)RAA,
는 비수지성 펩티드 담체에 연결된다.
인브레드 루이스 토끼와 피셔 토끼가 사용된다. 모든 토끼는 6-8주 이다. 프로이드 컴플리트 보조액에서 미코박테리움 튜버큘로시스의 주사에 의하여 관절염이 유도된다. 토끼는 10 ㎎/㎖의 M. 튜버큘로시스 100㎕를 사용하여 꼬리의 기저부에서 피하 주사된다. 토끼는 관절염치료가 관찰되고, 홍반, 부품, 디포미티에 기초하여 0에서 4까지 각포단위로 기록된다. 모든 4 개의 다리가 기록되고, 가장 높은 점수는 16이된다.
토끼는 1-3차례 복가내 또는 피하로 5.35.와 펩티드 컨스트럭츠 200마이크로그람(일부 실험에서는 사이토킨 서열과 다른 면역조절자 서열을 부가 app.로 면역화된다. 과절염 유도전 35일 과 치료 곤절염의 점수가 얻어진다. 림프 노드 림포사이테스는 면역화 이후 9일 채취된다. 그리고 임파구는 시험관내에서, M. 튜버큘로시스와 펩티드 구성에 대응한 증식, IFN-감마, IL-4생산이 테스트 된다. 펩티드 컨스트럭츠에 대한 면역적 반응은 쥐 아류(subclass)에 대하여 펩티드에 대한 Ig반응성을 테스트함에 의하여 측정된다.
또 다른 예는 뇌수막염(스크레로시스)와 관련된 다양한 펩티드를 비 수지성 펩티드 담체에 연결하는 것이다. 그러한 펩티드의 예는 다음을 포함한다:
토끼 T-세포 수용체, 다음의 펩티드 서열을 가진:
DMGHGLRLIHYSYDDVNSTEKG,
토끼 T-세포 수용체, 다음의 펩티드 서열을 가진 :
ASSDSGNTE, 그리고,
마이엘린 기초 단백질 Ac1-11: AcASQKRPSQRSK, 여기서 "Ac"는 아세틸기를 지칭한다.
그리고, 마이엘린 기초 단백질 p87-89: 아미노산 치환이 있는 그리고 없는 VHFFKNIVTPRTP, 그리고
마이엘린 프로테오리피드 단백질로부터의 NTWTTCQSIAFPSK 또는 SKTSASIGSLCADARMYGVL 또는 LINVIHAFQYV 그리고 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질부터의 PGYPIRALVGD.
실험절차
6-12주된 암컷의 루이스 마우스 또는 (PL/J*DJL/J)F1마우스 또는 BALB/c마우스 또는 CBA마우스 또는 Biozi ABH 마우스가 사용된다.
마우스는 1-3차레 5.35 그리고 200㎍의 펩티드 구성물(일부 실험에서는 사이토킨 서열과 다른 이뮤노모듈러터리 서열이 첨가된다)app를 사용하여 복강내 또는 피하 면역화된다. 이는 열사된 1㎎ 미코박테리움 튜버큘로시스(1+1)sc.가 보충된 프로이드 인컴플리트 보조액와 함께 또는 그 35일전에 이루어진다. 30일째에 각 토끼는 마이얼린 기초 단백질로 첼린지된다(컴플리트 프로이드 보조액 또는 유사 단백질하의 50마이크그람). 토끼는 치료적 표식을 위하여 9일부터 매일 기록된다(꼬리 약화 림브 파라리시스). 선택적으로, 토끼는 실험시작 2일전에 펩티드를 먹일수 있다.
림프노드 림포사이테스는 면역화 이후에 9일간 채취되고, 림포사이테스는 시험관에서 M. 튜버큘로시스 그리고 펩티드 컨스트럭츠에 대응하여 증식, IFN-감마, 그리고 IL-4생산이 테스트 된다.
펩티드 구성물에 대한 면역 반응은 마우스 서브 클래스에 대하여 펩티드 컨스트럭트에 대한 Ig 반응성을 테스팅함에 의하여 측정돤다.
다른 실시예는 다이아베트와 관련된 다양한 펩티드를 비수지성 펩티드 담체에 연결하는 것이다. 그러한 펩티드의 예는 다음을 포한한다.:
슈도모나스 HSP60 펩티드:
-VLGGGCALLRCIPACDSTLPANED
-PALDSLTPANEA
크루타믹산 디카르복실라제 펩티드E GAD65253-265: IARFKMFPEVKEK
글루탐산 디카르목실라제 펩티드E GAD65524-543: SRLSKVAPVIKARMMEYGTT.
HLA펩티드 TPQGRP(V/A/D/S)AEY 또는 이 서열을 포함하는 펩티드,
그리고 조절 펩티드:
cks17: LQNRRGLDLLFLKEGGL.
본 연구는 당뇨가 진행중인 3-22주된 Non-Obese Diabetic 마우스(NOD 마우스)에서 실시된다. NOD 마우스는 1-3차례 (3,7,10주에)펩티드 컨스트럭츠 (5-500마이크로그람)단독 또는 터프신 또는 사이토킨(펩티드 그리고 재조합프로틴)과 함께 사용되어 경구 또는 항문 투입에 의하여 s.c., i.p.면역된다. 면역 반응은 쥐 아류에 대하여 펩티드에 대한 Ig반응성 테스팅에 의하여 측정되고, 시험관내에서 펩티드 자극에 반응하여 림프 노드, 스플린 세포 증식, 감마-인터페론 인터류킨-4생산 을 테스팅함에 의하여 측정된다. 백신화된 마우스에서 app. 12주 이후에 당뇨의 발병이 기록된다.
당뇨의 어세스머트를 위하여, 마우스는 희생되어, 판크레아타, 침샘은 포르말린에서 고정되고, 파라핀에 놓여지고, 헤마톡시린/에오신으로 염색되며, 이슬렛 병력에 대해 기록된다. 마우스는 상용 키트로 매주 글루코수리아를 측정한다. 혈당은 혈당계를 사용하여 측정한다.
모든 그렇나 비수지성 펩티드 담체는 면역조절자 또는 면역조절자 활성이 있는 상기의 일부와 함께 주어진다. 렐러번트 면역조절자는 인터류킨-4, 인터류킨-10 그리고 TGF-베타를 포함한다.
다른 실시예는 달걀 알러지와 관련된 다양한 펩티드를 비수지성 펩티드 담체에 연결하는 것이다. 그러한 펩티드의 예는 다음을 포함한다:
EFRADHPFLF 또는 바소필로부터의 히스타민 방출의 오발부민 저해로부터 이러한 서열을 포함하는:
N-2-히드록시에틸피퍼라진-N'-2-에타네설포닉산 (20 밀밀몰/l)-티로드스 완충액에서 1:2로 희석된 모든 혈액이(50마이크리) 도 4에서 24시간 동안 동일한 완충액애 0-28,000마이크그람/밀리리터 농도로 용해된 40마이크로미터의 펩티드 컨스트럭트와
혼합된다. 펩티드로 선처리된 혈액은 37도에서 0분간 50마이크리터의 다양한 알레르겐 희석으로 첼린지된다. 이 반응은 4도 5분간 1500g의 원심분리로 정지한다.
히스타민은 효소 결합 이뮤노소번트 분석 또는 방사성이뮤노분석에 의하여 측정된다. 이러한 분석은 2회 실시된다. 세포로 부터 자발적인 히스타민의 방출은 계산된 히스타민 방출로부터 서브트랙트된다. 펩티드 컨스트럭트에 의한 히스타민 방출 저해 백분율이 측정된다.
실시예 28
펩티드, 진단 표지 그리고 다른 물질에 대한 혈액-브레인 침투성을 증가시키기 위한 비수지성 펩티드 담체의 용도
비수지성 펩티드 담체는 뇌와 신경계의 치료와 정맥(iv.)투입에 의한 진단 목적으로 혈액-브레인 배리어 전달을 촉진하는데 사용될 수 있다.: 이는 다음의 두 실시예에 제시된다.
N-아세틸그루코자민-N-아세틸 무라믹산-Ala-Glu-Dap-Ala를 포함하는 혈액-브레인 장벽감소 물질, 여기서 Dap는 다이 아미노 피멀리닉산 ,(스펠러버그 1995),은 분지-모이어티로서 표1에서 기술된 표준 고안의 NDPC에 결합된다.
혈관-뇌 장벽 퍼미어빌리제이션은 상술한 바와 같이 토끼에서의 DNDPCDML 정맥주사후에 일정 시점에서 4, 10, 20, 그리고 50kD FITC-덱스트란 iv 주사에 의하여 분석된다(스펠러버그 1995). 어네스티제이션 이후에 뇌 척수액은 수집되고, 플루오레슨스 분석된다.
DNDPC가 20kD이하의 분자에 대한 BBB-침투성을 트렌지언트리 향상시키는 것으로 기대된다. DNDPC-투입 이후에 최대 침투성이 약 4시간 지속된다.
또 다른 실시예에 있어서, DNDPC는 DNDPC 그 자체의 BBB를 통하여 펩티드-특이성 전달을 향상시키는 데 효과 적인 것으로 보인다. DNDPC는 다음으로 부터 선택된 부착 모이어티의 하나의 형태의 수 개의 복사로 준비된다:
-YGGFM
-YGGFL
-LysN,여기서 N=3-8
그리고 다른 형태의 부착 요소, 이 실시예에서는 비오틴-표식된 모델 펩티드이다.
비오틴 - LKYGGENKPGG.
본 실험에서, iv 주사되고, 뇌 척수액은 연속하여 ELISA에 의한 아비딘 결합을 위하여 분석된다.
모든 경우에 있어서, 비오틴-펩티드가 단독으로 투입되었을 경우보다 DNDPC의 일부로 투입되어었을 때, 비오틴-펩티드의 존재는 증가할 것으로 기대된다.
실시예 29
세포-기질 부착을 저해하기 위한 비수지성 펩티드 담체의(DNDPC) 용도
본 실시예는 암세포가 기질에 부착하는 것을 저해함에 의하여 그 확산을 막기 위한 비수지성 펩티드 담체의 치료적 용도를 입증한다. DNDPC 내에 부착 펩티드로서 세포-기질 결합 저해 펩티드포함함에 의하여, 매우 효율적인 저해제가 얻어질 것이 기대된다. 본 실험에서, 다음으로부터 선택된 서열함유 펩티드 RGDS, RLDS, YIGSR 그리고 상기의 멀티머(N=2-4)(후지 1995, Nomizu 1993)는 NDPC에 부착될 것이고, 노미주 등에서 기술된 실험의 프로토콜(1993) 또는 이퀴버런트 프로토콜을 사용하여 생체내에서 종양의 성장과 상응하는 자유 펩티드와 비교하여 메타스타시스의 저해를 위하여 테스트 된다.
요약하면, 메타스타시스의 판단을 위하여, 마우스는 꼬리혈관으로 펩티드의 존재 또는 부존재하에서 디테치드 멜라노마 세포와 주사된다. 그리고 약 21/2주 후에, 마우스는 희생되고 렁 콜로니의 수가에뉴머레이트 된다. 종양성장에 대하여, 동일한 세포가 피하 투입된다. 다음으로 매일 펩티드의 i.p. 주사가 이어진다. 10일째에 마우스는 희생되고 피하 종양이 중량된다.
실시예 30
진단과 백신화에 대한 탄화수소-특이성 항체의 생산을 위한 탄화수소 항원 미모토프를 함유하는 유도 비수지성 펩티드 담체(DNDPC)의 사용: Tn-항원에의 적용
탄화수소 에피토프를 모방하는 펩티드(펩티드 미모토프)는 문제의 탄화수소 에피토프에 대하여 적절한 모노클로널 항체를 사용하는 펩티드 라이브러리 스케닝(scanning) 방법에 의하여 정의될 수 있다. 그러한 미모토우프 펩티드는 암과 HIV의 활성의 면역치료에 있어서 면역원성으로서의 용도가 있는 것으로 기대된다. 그리고 특히, 면역 기억을 유도한다는 점에 있어서 대응하는 탄화수소 항원보다 우수한 면역원으로 기대된다. 암과 HIV-감염에 관련된 Tn-항원(세린 또는 트레오닌의 N-아세틸-D-갈락토스아민)(N-acetyl-D-galactosamine), 그리고 Tn-탄화수소 항원에 대응하는 미모토우프가 다음 제시된 방법에 따라 사용된다.:
Tn-미모토우프 펩티드는 실시예 1에서 기술된 바와 같은 비수지성 펩티드 담체 (NDPC)에 부착된 항원성 펩티드로서 RINK-MBHA 고체상을 사용하여 합성된다. 이탈된 전체 복합물은 정상적인 면역화 체계(실시예 20 참조)를 따르고 프로인트 인컴플리트 보조액를 사용하는 마우스와 토끼의 면역화를 위하여 사용된다. 또한, 포함된 유도 NDPC 또는 터프신 사량체, 시토킨 단편 또는 T-세포 자극 펩티드를 포함하는 자극 서열과 함께 투입된 유도 NDPC는 실시예 20에 기술된 것과 같은 보조액없이 면역화에 사용될 수 있다. 그 결과로서 항체반응은 면역화 펩티드 그리고 Tn-에페토프 그 자체에 대한 특이성 분석에 이용된다. Tn-에피토프는 시그마(Sigma)로부터 구입한 양(ovine) 하악골(submaxillary) 무친(mucin)으로부터 얻어진다. Tn- 항원에 대하여 우수한 항체반응이 얻어질 것이 기대되고, 시험관내에서, 이 Tn-특이성, 펩티드-지향 항체는 HIV-감염과 합포체(syncytium) 형성을 차단한다.
실시예 31
프리온(prion) 질병 소의 스폰지폼(spongiform) 뇌염에 대한 이뮤노히스토화학(immunohistochemical) 진단분석에 있어서 유도 비수지성 펩티드 담체의 사용
프리온 질병은 잘못 형성된 프리온 단백질에 의하여 특징 지어진다. 이는 외인성의 잘못 결합된 프리온 단백질의 영향에 의한 것으로 추정된다. 비정상적인 프리온 단백질이 이질(scrapie)-감염 양으로부터 편도(tonsil) 생검에서의 이뮤노히스토화학에 의하여 임상전으로 탐지되는 것이 제시되었다(Schreuder 1996).
소의 프리온 질병에 대한 동일한 형태의 진단 항체를 개발하기 위하여, 프리온 펩티드가 실시에 1에서 기술된 것에 따라 표준 고안된 비수지성 펩티드 담체상에 합성되고, 연속하여 정상의 면역화 체계에서 보조액과 함께 축합됨에 의하여 토끼와 마우스에서의 진단항체의 생산에 사용된다(실시예 20 참조). 또한, 포함되거나 터프신 사량체, 시토킨 단편 또는 T-세포 자극 펩티드와 같은 자극 서열과 함께 투여되는 유도 NDPC는 실시예 20에서와 기술된 것과 같은 보조액이 없이도 면역에 사용될 수 있다. 다음의 프리온 펩티드 각각은 비수지성 펩티드 담체에 부착되고, 바람직하게는 5개의 서로 다른 면역화 DNDPCs를 구성하기 위하여 직접적인 화학합성에 의한다.:
GQGGTHGQWNKP
GQWNKPSKPKTN
GGLGGYMLGSAMSRPLIH
GSDYEDRYYREMHRYPNQVYRPVDQYSNQNN
RESQAYYQRGAS
이들 DNDPCs에 대하여 생산된 항체는 정상적인 가축으로부터 그리고 스폰지폼 뇌염의 전임상 상태의 가축으로부터 편도 생검에서 테스트된다.
요약하면, 편도 생검은 포름산으로 선처리되고, 수화 가압멸균되며, PBS에 희석된 항혈청과 인큐베이트된다. 다음으로 항체 탐지와 염색이 이어진다(van Keulen 1995). 이 처리는 선택적으로 프리온 단백질의 BSE-특이적 형태의 면역 반응성을 증진시킨다.
감염된 동물은 질병의 어떤 임상적 표시를 보이기 이전에 항체-양성 생검을 나타낸다.
실시예 32
결핵에 대한 면역화
ESAT-6 항원(Brandt, 1996)으로부터 다음의 합성 펩티드가 대조 펩티드로서 합성되고 비수지성 펩티드 담체로 유도된다:
VQGVGGKWDATATELNNALQ
그리고
MTEQQWNFAGIEAAASAIQG
미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 대한 마우스의 면역화를 위하여 펩티드가 사용될 수 있다.
실험절차
마우스:
암컷의 8-12주된 C57BL/6J 마우스가 사용된다.
세균:
M. 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv가 로웬스타인-젠센(Lowenstein-Jensen) 배지상에서 또는 0.5% 소디움 피로베이트(sodium pyrovate) 와 0.5% 포도당이 보충된 사우톤(Sauton) 배지내의 현탁액에서 37℃로 배양된다.
백신화 실시와 검사:
마우스는 3차례 합성 펩티드 구조의 최적 농도로 2㎍ IL-12와 함께 그리고 없이 s.c. i.p. 면역화 된다. 12-14주 이후에 마우스는 PBS에 현탁한 M.튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 5×104콜로니(colony) 형성 단위의 i.v. 주사에 의하여 시행된다. 질병의 추이는 대응하는 비면역화된 마우스의 집단과 28일간 비교된다. 감염된 마우스의 비장내에서의 박테리아의 산출은 로웬스타인-젠센 배지에서 비장 균질화(homogenated)된 더블 시리얼(double serial) 10배 희석을 이식함에 의하여 이루어진다. 배양 3-4주 이후에 콜로니가 셈하여 진다.
임파구 배양:
비장 세포 또는 임파선 세포는 미리 면역화한지 2-3주 후에 분리된다. 그리고 시험관내에서 펩티드 또는 M. 튜보큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원과 활성화된다. 세포 증식은 48시간의 인큐베이션 이후에 티미딘으로 배양물을 진동함에 의하여 조사되고, 이식 이전에 22시간 동안의 추가 배양이 채집되고 액체 신틸레이션(sintillation) 카운팅을 위하여 처리된다.
배양 상징액은 24시간후에 인큐베이션의 평행 배양으로부터 IL-2, IL-4, 그리고 IL-5로부터 채집되고, 48시간 후에는 인터페론-감마의 결정을 위하여 채집된다.
시토킨 분석;
배양 상징액에 존재하는 시토킨의 양은 상업적으로 유용한 ELISA 키트를 사용하여 정량화 된다.
서로 다른 IgG 이소 타입의 항체 역가:
혈청 샘플은 각 면역화 이후에 수집되고, 펩티드 또는 M. 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로 피복된 ELISA 플레리트에서 2배 희석하에서 분석된다. 반응성은 염소 항-마우스 IgG 또는 항-마우스 IgG1 또는 항-마우스 IgG2a로 표식된 과산화효소로 테스트 된다. 이는 실시예 20에서 기술된 ELISA에 따른다.
시토킨 mRNA의 탐지:
임파선 세포 (106)은 용해되고, 전 RNA는 정제된다. RNA는 cDNA로 역전사되고, 개개의 시토킨에 대한 특이적인 프리머로 PCR 증폭된다. PCR 생성물은 서던 블라트(sourthern blot)에서 시토킨에 대해 특이적으로 표식된 올리고 핵산염으로 교잡 된다.
실시예 33
엑티노바실러스 플레우로프뉴모니에(Actinobacillus pleuropneumoniae)에서 외막단백질에 대한 항체의 생산을 위한 유도 비수지성 펩티드 담체의 사용
마우스는 표1의 2과 3 형태에 대응하는 것으로서 다음의 분지 펩티드를 수반하는 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화 되었다.
AELGGQFHHKSENG(Tbp 펩티드 4)
엑티노바실러스 플레우로프뉴모니에(Actinobacillus pleuropneumoniae)로부터 트란스페린(transferrin)-결합 단백질 타입 2로부터, 그리고 마우스의 다른 그룹이 표1의 형태3에 대응하는 유도된 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 면역화 되었다. 이는 다음의 분지 펩티드를 수반한다.
동일한 세균으로부터의 프로테오글리칸(proteoglycan)-관련 단백질로부터
TEADYAKNRAVEY (PalA 펩티드 5).
펩티드는 프로인트 인컴플리트 보조액와 단독으로 또는 조합하여 사용되었다. 피하 주사되었다.
마우스는 14일 간격으로 3차례 면역화 되었다. 채혈이 첫 번째 면역화(0) 이전에 실시 되었고, 각 면역화(1, 2, 3)후 10일에 실시되었다.
비교를 위하여, 다른 두 집단의 마우스는 시스타인에서 PPD("정제 단백 유도체") 서열에 이르는 SPDP에 의하여 고전적인 펩티드-단백질 축합 면역화 방법의 한 예로서 BCG-프라이밍으로 축합된 대응하는 펩티드로 면역화 되었다.
혈액은 피복 시약으로서 다양한 면역화 펩티드를 사용하는 ELISA에 의하여 분석되었다. 펩티드는 멕시소르프(Maxisorp)(Nunc) 마이크로 타이터 플레이트상에서 PBS하에서 4℃, 1ug/ml에서 하룻밤 피복되었다. 계속적인 실험이 상온에서 행하여졌다. PBS + 1% BSA하에서 1시간 동안의 차단과 PBS + 트윈20(0.1%)에서의 세척 후에, 마우스 혈청이 차단 완충액에 1/200 첨가되고, 1시간 인큐베이트 되었다. 계속하여, 플레이트가 상기와 같이 세척되었고, 1시간 동안 말 무우 과산화효소-축합 토끼 항-마우스 이뮤노글로블린(DAKO)에 의하여 진행되었다. 다음으로 OPD와 과산화물에 의하여 칼라 현상되었다.(도 41, 도 42)
PPD-결합 Tbp-펩티드 4에 대하여 배양된 항체가 클론되었다. 결과적인 모노클로널 항체는 피복 항원으로서 서로 다른 펩티드를 사용하는 간접의 ELISA를 사용하여 서로 다른 발현(도 43)에 있어서 Tbp-펩티드 4를 인식하는 능력이 테스트 되었다.
또한, 펩티드의 반응성이 엑티노바실러스 플레우로프네우모니에(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 전체 세포 추출물의 웨스턴 블라트(western blotting)에 의하여 분석되었다(제시되지 아니함).
결론적으로, 비수지성 펩티드 담체와 프로인트 인컴플리트 보조액에 대한 반응은 PPD-축합으로 얻어진 반응과 유사하다(도 41, 도 42 참조), 단백질-반응성 항체는 블라팅에 의하여(제시되지 아니함) 보이는 바와 같은 양자의 방법에 의하여 얻어진다. 또한, 모노클로널 항-PPD-Tbp-펩티드 4 항체는 선택적으로 주쇄-축합 펩티드 를 인식한다. 이스콤내에서 든지 아니든지 비유리-펩티드이다(도 43). 이것은 본 발명의 비수지성 펩티드 담체에의 축합이 적어도 고전적인 축합 방법에의하여 얻어지는 만큼 분지 펩티드의 구조를 안정화 시킨다.
참고문헌
Ahlborg, N., et al., 1991, Mol. Bioch. Parasitol. 46, 89-96.
Appella, E., et al., 1995, "Synthetic antigenic peptides as a new strategy for immunotherapy of cancer", Biomed. Pept. Prot. & Nucl. Acids 1, 177-184.
Atherton, E., and Sheppard, R.C., 1989, "Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach", IRL press.
Atherton, E., Fox, H., Harkiss, D., Logan, C.J., Sheppard, R.C., and Williams, B.J., 1978, "A mild procedure for solid phase peptide synthesis: Use of fluorencylmethoxycarbonylamino acids", J. Chem. Soc. Chem. Commun., 537-539.
Bambino, F., et al., 1994, "Synthesis of a symmetrically branched template for parallel α-helix dimers", Tetrahedron Lett. 35, 4619-4622.
Bate, C.A.W.., et al., 1989, Immunol. 66, 600-605.
Bianchi, E., te al., 1995, "A Conformationally Homogeneous Combinatorial Peptide Library", J. Mol. Biol. 247, 154-160.
Bisang, C., 1995, "Stabilization of Type-I β-Turn Conformations in Peptides Containing the NPNA-repeat Motif of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein by Substituting Proline for (S)-α-methylproline", J. Am. Chem. Soc. 117, 7904-7915.
Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., and Frank, R., 1990, "An efficient method for anchoring Fmoc-amino acids to hydroxylfuntionalised solid supports", Tetrahedron Lett. 31, 1701-1704.
Blomberg, L., Wieslander, J., and Norberg, T., 1993, "Immobilization of reducing oligosaccharides to matrices by a glycosylamide linkage", J. Carbohydrate Chem. 12, 265-276.
Brandt, L., Oettlinger T., Holm A., Andersen A.B., and Andersen P. (1996), Key Epitopes on the ESAT-6 antigen Recognized in Mice during the Recall of Protective Immunity to Mycobacterium tuberculosis. J. immunol. 157: 3527-3533.
Briand, J.P., et al., 1992, "Application and limitations of the multiple antigen peptide (MAP) system in the production and evaluation of anti-peptide and anti-protein antibodies", J. Imm. Methods 156, 255-265.
Briand, J.P., Muller, S., and van Regenmortel, H.M.V., 1985, "Synthetic peptides as antigens: Pitfalls of conjugation method", J. Immunol. Meth. 78, 59-69.
Brown, C.L., and Harding, M.M., 1994, "Synthetic α-helical peptides incorporating intercalators for DNA Recognition", J. Mol. Recogn. 7, 215-220.
Bryson, J.W. 1995, "Protein Design: A Hierachic Approach", Science 270, 935-941.
Chang, H.-C., 1994, "A general method for facilitating heterodimeric pairing between two proteins: Application two expressoion of α and β T-cell receptor extracellular segments", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 11408-11412.
DK 90/00311, Holm, A., "A method for the stepwise, controlled synthesis of chemical species, particularly peptides, coupled products obtained by the method and the use of these coupled products, e.g. as vaccines."
Dawson, P.E., Muir, T.W., Clark-Lewis, I., and Kent, S.B.H., 1994, "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation", Science 266, 776-779.
Defoort, J.-P., Nardelli, B., Huang, W., and Tam, J.P., 1992, "A rational design of synthetic peptide vaccine with a builtin adjuvant", Int. J. Pept. Prot. Res. 40, 214-221.
Dias, H., 1993, "The design of water soluble β-sheet structure, based on a nucleation strategy", Tetrahedron Lett. 49, 3533-3545.
Drijfhout, J.W., and Bloemhoff, W., 1991, "A new synthetic funtionalized antigen carrier", Int. J. Pept. Prot. res. 37, 27-32.
Edwards, R.J., Singleton, A.M., Boobis, A.R., and Davies, D.S., 1989, "Cross-reaction of antibodies to coupling groups used in the production of anti-peptide antibodies", J. Immunol. Mrth. 117, 215-220.
Elased K. and Playfair J.H.L.: Hypoglycemia and hyperinsulinemia in rodent models of severe malaria infection. Infection and Immunity. 62, 5157-5160, 1994.
Ellouf, F., Adam, A., Ciorbaru, R., and Lederer, E., 1974, "Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives", Biochem. Biophys. Res. Comm. 55, 1317.
Ellman, G.L., 1959, Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77.
Ertl, H.C.J., Varga, I., Xiang, Z.Q., KaISER, k., Stephens, L., and Ostvos, Jr., L., 1996, "Poly(DL-lactide-co-glycolide) microspheres as carriers for peptide vaccines", Vaccines 14, 879-885.
Eur. patent 0 604 727 Al: Daley, M.J., Frenchick, P., and Pillai, S.P., "impoved immunogenicity of a vaccine by incorporation of a cytokine within an immune-stimulating complex containing an antigen"
Fezoui, Y., et al., 1995, "Strategies and rationales for the de novo design of a helical hairpin peptide", Protein Sci. 4, 286-295.
Flinn, N., et al., 1994, "A lipidic α-amino acid based synthetic adjuvant peptide complex for increasing immunogenicity of vaccines", Biochem. Soc. Trans. 222, 1055-1058.
Francis, M.J., Hastings, G.Z., Brown, F., McDermed, J., Lu, Y.-A., and Tam, J.P., 1991, "Immunological evaluation of the multiple antigen peptide (MAP) system using the major immunogenic site of foot-and-mouth disease virus", Immunol. 73, 249-254.
Fridkin, M., and Najjar, V.A., 1989, "Tuftsin: Its chemistry, biology and clinical potential", Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 1-40.
Friede, M., et al., 1993, "Lyophilized liposomes as Shelf items for the preparation of immunogenic liposome-peptide conjugates", Anal. Biochem. 211, 117-122.
Fuji, H., Komazawa, H., Mori, H., Kojima, M., Itoh, I., Murata, J., Azuma, I., and Saiki, I., 1995, "Antimetastatic activities of synthetic Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) and Arg-Leu-Asp-Ser (RLDS) peptide analogues and their inhibitory mechanisms", Biol. Pharm. Bull. 18, 1681-1688.
Gaertner, H.F., Rose, K., Cotton, R., Timms, D., Camble, R., and Offord, R.E., 1992, "Construction of Protein Analogues by Site-Specific Condensation of Unprotected Fragments", Bioconj. Chem. 3, 262-268.
Gao, X.-M., and Rhodes, J., 1990, "An essential role for constitutive Schiff base-forming ligands in antigen presentation to murine Y-cell clones", J. Immunol. 144, 2883-2890
GB 2 282 813 A, Cunningham, B., Hannah, J., and Tolman, R.L., 1995, "Annular antigen scaffolds comprising thioether"
Gilon, C., et al., 1991, "Backbone cyclization: A new method for conferring conformational contraints on peptides", Biopolymers 31, 745-750.
Golvano, J., Lasarte, J.J., Sarobe, P., Gullon, A., Prieto, J., and Borras-Cuesta, F., 1990, "Polarity of immunogens: implications for vaccine design", Eur. J. Immunol. 20, 2363-2366.
Haas, S., Miura-Fraboni, J., Zavala, F., Murata, K., Le bay, A., and Santiago, N., 1996, "Oral immunization wit. model protein entrapped in microspheres prepared from atized alpha-amino acids", Vaccine 14, 1391-1397.
Hansen, M.B., M. Svenson, M. Diamant, K. Bendtzen: Anti-interleukin-6 antibodies in normal human serum. Scandinavian Journal of Immunology 33 (1991) 777-781.
Hinds, M.A., et al., 1991, "Synthesis, conformational properties, and antibody recognition of peptides containing β-turn mimetics based on α-alkylproline derivatives", J. Med. Chem. 34, 1777-1789.
Hoffmann, S., and Frank, R., 1994, "A new safety-catch peptide-resin linkage for the direct release of peptides into aqueous buffers", Tetrahedron Lett. 35, 7763-7766.
Ivanov, B., Grzesik, W., and Robey, F.A., 1995, "Synthesis and Use of a New Bromoacetyl-derivatized Heterotrifunctional Amino Acid for Conjugation of Cyclic RGD-containing Peptides derived from Human Bone Sialoprotein", Bioconj. 6, 269-277.
Jakobsen, P.H., L. Baek, S. Jepsen: Demonstration of soluble Plasmodium falciparum antigens reactive with Limulus Amebocyte Lysate an Polymyxin B. Parasite Immunology 10 (1988) 593-606.
Jakobsen, P.H., R. Moon, R.G. Ridley, C.A. W. Bate, J. Taverne, B. Takacs, J.H. L. Playfair, J.S. McBride: Tumour necrosis factor and interleukin-6 production induced by components associated with merozoite proteins of Plasmodium falciparum. Parasite Immunology 15 (1993) 229-237.
Kahn, M., ed., 1993, "Peptide secondary structure mimetics" (Tetrahedron Symposia-in-Print 50), Pergamon Press.
Kaiser, R., Colescott, R.L., Bossinger, C.D., an Cook, P.I., 1970, "Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides", Anal. Biochem. 34, 595-598.
Kamtekar, S., et al., 1993, "Protein Design by Binary Patterning of Polar and Nonpolar Amino Acids", Science 262, 1680-1685.
Kaumaya, P.T.P., et al., 1993, "Peptide vaccines incorporating a "promiscous" T-cell epitope bypass certain haplotype restricted immune responses and provide broad spectrum Immunogenicity", J. Mol. Recogn. 6, 81-94.
kemp, D.S., 1990, "Peptidomimetics and the template approach to nucleation of β-sheets and α-helices in peptides", TIBTECH 8, 249-255.
Klinman, D.M., Yi, A.-K., Beaucage, S., Conover, J.M., and Krieg, A.M., 1996, "CpG motif present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12 and interferon gamma", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 2879-2883.
Krizek, B.A., et al., 1991, "A consensus Zinc Finger Peptide: Design, High-affinity metal Binding, a ph-Dependent Structure, and a His to Cys Sequence variant", J. Am. Chem. Soc. 113, 4518-4523.
Kumaratilake, L.M., et al., 1995, "A synthetic tumor necrosis factor-α agonist peptide enhances human polymorphonuclear leukocyte-mediated killing of Plasmodium falciparum in vitro and suppresses Plasmodium chabaudium infection in mice", J. Clin. Invest. 95, 2315-2323.
Landschulz, W.H., et al., 1988, "The Leucine Zipper: A Hypothetical Structure Common to a new class of DNA-Binding proteins", Science 240, 1759-1764.
Langeveld, J.P.M., Kamstrup, S., Uttenthal, A., Strandby-gaard, B., Vela, C., Dalsgaard, K., Beekman, N.J.C.M., Meloen, R.H., and Casal, J.I., 1995, "Full protection in mink against mink enteritis virus with new generation canine parvovirus vaccines based on synthetic peptide or recombinant protein", Vaccine 13, 1033-1037.
Larsson, M., et al., 1993, "Immunopotentiation of synthetic oligopeptides by chemical conjugation to iscoms", J. Immunol. Meth. 162, 257-260.
Lees, A., et al., 1994, "Enhanced immunogenicity of proteindextran conjugates: I. Rapid stimulation of enhanced antibody responses to poorly immunogenic molecules", Vaccine 12, 1160-1166.
Lu, Y.-A., Clavijo, P., Galantino, M., Shen, Z.-Y., Liu, W., and Tam, J.P., 1991, "Chemically Unambiguous Peptide Immunogen: Preparation, orientation and antigenicicty of purified peptide conjugated to the multiple antigen peptide system", Mol. Immunol. 28, 623-630.
Mant, C.T., Zhou, N.E., and hodges, R.S., 1993, "The role of amphipathic helices in stabilizing peptide and protein structure" in Epand, R.M., ed., "The amphipathic Helix", CRC Press, 1993, 39-64.
Merrifield, B., 1963, "Solid phase peptide synthesis I. the synthesis of a tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154.
Morein, B., Sundquist, B., Hoglund, S., Dalsgaard, K., and Osterhaus, A., 1984, "Iscom, a novel structure for antigenic presentation of membrane proteins from enveloped viruses", Nature 308, 457-460.
Mowat, A.M., and Reid, G., 1992, Curr. Protocols Immunology, suppl. 4, "Preparation of Immune Stimulating Complexes (Iscoms) as adjuvants", 2.11.1-2.11.12.
Myszka, D.G., and Chaiken, I.M., 1994, "Design and Characterization of an intramolecular Antiparallel Coiled Coil Peptide", Biochem. 33, 2363-2372.
Nomizu, M., Yamamura, K., Kleinman, H.K., and Yamada, Y., 1993, "Multimeric forms of Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) peptide enhance the inhibition of tumor growth and metastasis", Cancer Res. 53, 3459-3461.
Novabiochem, "Technical Note" 1/94, "Peptide-resin cleavage in Fmoc Chemistry"
Panina-Bordignon, P., et al., 1989, "Universally immunogenic T Cell epitopes: promiscous binding to human MHC class II and promiscous recognition by T cells", Eur. J. Immunol. 19, 2237-2242.
Pawan, K., et al., 1994, "Construction of a synthetic immunogen: use of the natural immunomodulator polytuftsin in malaria vaccines against RESA antigen of Plasmodium falciparum", Vaccine 12, 819-824.
Perkins, S.J., 1986, "Protein volumes and hydration effects", Eur. J. Biochem. 157, 169-180.
Plaue, S., Muller, S., Briand, J.P., and van Regenmortel, M.H.V., 1990, "Recent advances in Solid-phase Peptide Synthesis and Preparation of Antibodies to Synthetic Peptides", Biologicals 18, 147-157.
Rammensee, H.-G., Friede, T., and Stevanovic, S., 1995, "MHC-ligands and peptide motifs: A first listing", Immunogenetics 41, 178-228.
Rap, C., and Tam, J.P., 1994, "Synthesis of Peptide Dendrimer", J. Am. Chem. Soc. 116, 6975-6976.
Regan, L., 1995, "Protein Design: Novel metal-binding sites", TIBS 20, 280-285.
Reiher III, W.E., 1986, PNAS, USA 83, 9188-9192.
Rhodes, J., Chen, H., Hall, S.R., Beesley, J.E., Lenkins, D.C., Collins, P., Zheng, B., 1995a, "Therapeutic potentiation of the immune systenm by costimulatory Schiff-base-forming drugs", Nature 377, 71-75.
Rhodes, J., Zheng, B., Morrison, C.A., 1995b, "Galactose oxidation as a potent vaccine adjuvant strategy", in "Combined vaccines and simultaneous administration" (Ann. N.Y. Acad. Sci. 754), 169-186.
Robey, F.A., 1992, "Use of Bromoacetylation for preparing Conformationally Constrained cyclic and polymeric peptides and peptide-carrier conjugates", Curr. Protpcpls Immunol. suppl. 4, 9.5.1.-9.5.12.
Rose, K., 1994, "Facile synthesis of Homogeneous Artificial Proteins", J. Am. Chem. Soc. 116, 30-33.
Schnolzer, M., and Kent, S.B., 1992, "Construction Proteins by Dovetailing Unprotected Synthetic Peptides: Backbone-Engineered HIV Protease", Science 256, 221-225.
Schaaper, W.M.M., Lankhof, H., Puijk, W.C., and Meloen, R.H., 1989, "Manipulation of antipeptide immune response by varying the coupling of the peptide with the carrier protein", Mol. Immunol. 26, 81-85.
Schreuder, B.E.C., van Keulen, L.J.M., Vromans, M.E.W., Langeveld, J.P.M., and Smits, M.A., 1996, "Preclinical test for prion diseases". Nature 381, 563.
Shinnick, T.M., 1983, "Synthetic peptides immunogens as vaccines", Ann. Rev. Microbiol. 37, 425-446.
Spellerberg, B., Prasad, S., Cabellos, C., Burroughs, M., Cahill, P., and Toumanen, E., 1995, "Penetration of the blood-brain barrier: Enhancement of drug delivery and imaging by bacterial glycopeptides", J. Exp. Med. 182, 1037-1044.
Spetzler, J.C., and Tam, J. P., 1995, "Unprotected peptides as building blocks for branched peptides and peptide dendrimers", Int. J. Pept. Prot. Res. 45, 78-85.
Struthers, M.D., et al., 1996, "Design of a monomeric 23-residue polypeptide with defined tertiary structure", Science 271, 342-345.
Tam, J.P., and Spetzler, J.C., 1995, "Chemoselective Approaches to the Preparation of Peptide Dendrimers and Branched Artificial Proteins Using Unprotected Peptides as Building Blocks", Biomed. Pep. Prot. Nucl. Acids, 1, 123-132.
Tam, J.P., and Shao, J., 1993, "Synthesis and Use of Multiple Antigen Peptide (MAP) Systems", Current Protpcpls in Immunology, suppl. 7, 9.6.1.-9.6.19.
Tam, J.P., 1988, "Synthetic peptide vaccine design: Synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85, 5409-5413.
Taylor K., Bate C.A.W., Carr R.E., Butcher G.A., Taverne J., and Playfair J.H.L.: Phospholipid-containing toxic malaria antigens induce hypoglycaemia. Clin.Exp.Immunol. 90, 1-5, 1992.
Thomson, S.A., et al., 1995, "Minimal epitopes expressed in a recombinant polyepitope protein are processed and presented to CD8+ cytotoxic T cells: Implication for vaccine design", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 5845-5849.
Toyokuni, T., et al., 1994, "Synthetic Vaccines: Synthesis of a dimeric Tn antigen-lipopeptide conjugate that elicits immune responses against Tn-expressing glycoproteins", J. Am. Chem. Soc. 116, 395-396.
Tuchscherer, G., Domer, B., Sila, U., Kamber, B., and Mutter, M., 1993, "The TASP concept: Mimetics of peptide ligands, protein surfaces and folding units", Tetrahedron 49, 3559-3575.
Ulmer, J.B., Donnelly, J.J., Parker, S.E., Rhodes, G.E., Felgner, P.L:, Dwarki, V.J., Gromkowski, S.H., Deck, R.R., Dewitt, C.M., Friedman, A., Hawa, L.A., Leander, K.R., Martinez, D., Perry, H.C., Shiver, J.W., Montgomery, D.L., and Liu, M.A,, 1993, Science 259, 1745-1749.
Unson, C.G., et al., 1984, "Protein Engineering: Design and Synthesis of a Protein", Fed. Proc. 43, 1837.
US 4,554,101
US Patent No. 5,229,490 Multiple antigen peptide system, July 1993.
van Keulen, L.J.M., Schreuder, B.E.C., Meloen, R.H., Poelen-van den Berg, M., Mooij-Harkes, G., Vromans, M.E.W., and Langeveld, J.P.M., 1995, "Immunohistochemical detection and localization of prion protein in brain tissue of sheep with natural scrapie", Vet. Pathol. 32, 299-308.
van Regenmortel, M.H.V., Briand, J.P., Muller, S., Plaue, S., 1988, "Synthetic Peptides as Antigeng" ("Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Burdin, R.H., and van Knippenberg, P.H., eds.), Elsevier.
Vasseur, J.-J., Debart, F., Sanghvi, Y.S., and Cook, P.D., 1992, "Oligonucleosides: Synthesis of a novel methylhydroxyl-amine-linked mucleoside dimer and its inncorporation into antisense sequences", J. Am. Chem. Soc. 114, 4006.
Vitiello, A., 1995, "Development of a Lipopeptide-based Therapeutic Vaccine to treat Chronic HBV Infection", J. Clin. Invest. 95, 341-349.
Wang, R., et al., 1995, "Induction of Protective Polyclonal Antibodies by Immunization with a Plamodium yoelii Circum-sporozoite Protein multiple antigen peptide vaccine", J. Immunol. 154, 2784-2793.
Westerink, M.A.J., Giardina, P.C., Apicella, M.A., and Kieber-Emmons, T., 1995, "Peptide mimicry of the meningococcal group C capsular polysaccharide", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92, 4021-4025.
Wetzel, r., Halualani, R., Stults, J.T., and Quan c., 1990, "A General Method for Highly Selective Cross-Linking of Unprotected Polypeptides via pH-Controlled Modification of N-Terminal α-Amino Croups", Bioconf. Chem. 1, 114-122.
Wiesmuller, K.-H., et al., 1992, "Solid phase synthesis of lipopeptide vaccines eliciting epitope-specific B-, T-helper and T-killer cell response", Int. J. Pept. Prot. Res. 40, 255-260.
WO 95/01369, Buchardt, O., Nielsen, P.E., and Berg, R., 1995, "Double-stranded peptide-nucleic acids".
WO 94/29332, Chaiken, I.M., Myszka, D.G., and Graddis, T.J., 1994, "Coiled-coil stem loop templates".
WO 95/04543, Dawson, P.E., and Kent, S.B., "Template assisted synthetic protein".
WO 95/31480, Houston, M.E., Zhou, N.E., Kay, C.M., Hodges, R.C., Cachia, P.J., and Irvin, R.T., 1995, "Heterodimer polypeptide immunogen carrier composition and method".
WO 94/02506, Toth, I., and Gibbons, W.A., 1994, "Peptide Compounds".
WO 93/22343: Tam, J.P.,
Multiple antigen peptide system having adjuvant properties and vaccines prepared therefrom.
WO 95/00540, Webber, R., 1995, "Synthetic carrier and immunogen".
WO 92/18528, Marsden, H.S., and Subak-Sharpe, J.H., 1992, "Branched peptides in assays for antibodies".
WO 95/11998, Wang, C.Y., Zamb, T.J., Ye, J., Kaminsky, S.M., Hosein, B., Nixon, d.F., Koff, C.W., Kowalski, J., and Walfield, A.M., "Structured synthetic antigen libraries as diagnostics, vaccines, and therapeutics".
Xu, W., and Ellington, A.D., 1996, "Anti-peptide aptamers recognize amino acid sequence and bind a protein epitope", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 7475-7480.
Yamashiro, D., and Li, C.H., 1988, "New segment synthesis of α-inhibin-92 by the acyl disulfide method", Int. J. Pept. Prot. res. 31, 322-334.
Zhu, B.-Y., et al., 1993, "Packing and Hydrophobicity Effects on protein folding and stability: Effects of β-branched amino acids, valine and isoleucine, on the formation and stability of two-stranded α-helical coiled-coils/leucine zippers", Protein Sci. 2, 383-394.
Zhu, B.-Y., et al., 1992, "Design, synthesis, and structural characterization of model heterodimeric coiled-coil proteins", Int. J. Peptide Prot. Res. 40, 171-179.
Zlokovic, B.V., 1995, "Cerebrovascular permeability to peptides: manipulations of transport systems at the blood-brain barrier", Pharmaceut. Res. 12, 1395-1406.
서열 리스트
(1) 일반적 정보
(ⅰ) 출원인
(A) 성명 : 피터 미카엘 헬벡 히가드
(B) 거리 : 노드보게이드 10, 2. 티에취.
(C) 도시 : 코펜하겐
(E) 국가 : 덴마크
(F) 우편번호 : DK-4600
(A) 성명 : 팔레 호이 야콥슨
(B) 거리 : 올시메이글, 마그놀리비쥐 26
(C) 도시 : 코게
(E) 국가 : 덴마크
(F) 우편번호 : DK-4600
(ⅱ) 발명의 명칭 : 비수지성 주쇄 펩티드 담체
(ⅲ) 서열의 개수 : 52
(ⅳ) 컴퓨터 인식 양식:
(A) 미디엄 타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:
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20 25
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(ⅰ) 서열 특징:
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(ⅰ) 서열 특징:
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(2) 서열 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
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(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 20 아미노산
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(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
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Asp Ala Leu Ile
20
(2) 서열 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 21 아미노산
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(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
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(ⅰ) 서열 특징:
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20
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(ⅰ) 서열 특징:
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20
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(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
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20
(2) 서열 29에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
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Thr Leu Thr Lys Glu Tyr Glu Asp Ile Val Leu Lys Ser His Met Asn
1 5 10 15
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(2) 서열 30에 대한 정보:
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(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
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(2) 서열 31에 대한 정보:
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(A) 길이 : 11 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
1 5 10
(2) 서열 32에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 5 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Val Thr Glu Glu Ile
1 5
(2) 서열 33에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Val Thr Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Ile
1 5 10
(2) 서열 34에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Val Thr Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Ile
1 5 10 15
(2) 서열 35에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 14 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Val Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Val Ala Lys Leu Glu Ala Lys
1 5 10
(2) 서열 36에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 22 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Cys Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val
1 5 10 15
Arg Asn Glu Arg Ala Thr
20
(2) 서열 37에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val
1 5 10 15
(2) 서열 38에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr
1 5 10 15
(2) 서열 39에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 22 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Asp Met Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Tyr Asp Asp Val
1 5 10 15
Asn Ser Thr Glu Lys Gly
20
(2) 서열 40에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 9 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Ala Ser Ser Asp Ser Gly Asn Thr Glu
1 5
(2) 서열 41에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Thr Leu Phe Gln Leu Glu Leu Thr
1 5
(2) 서열 42에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 18 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Arg Ala Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly Ser Gly Asp Leu Gln Glu
1 5 10 15
Tyr Leu
(2) 서열 43에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Glu Tyr Leu
1 5 10 15
(2) 서열 44에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 9 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5
(2) 서열 45에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 9 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala
1 5
(2) 서열 46에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 20 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln
1 5 10 15
Val Cys His Thr
20
(2) 서열 47에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn
1 5 10 15
(2) 서열 48에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 12 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys
1 5 10
(2) 서열 49에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 12 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys
1 5 10
(2) 서열 50에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 20 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Pro Ser Val
20
(2) 서열 51에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys
1 5 10 15
(2) 서열 52에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 16 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 꼬임 : 외가닥
(D) 위상(topology) : 선형
(ⅱ) 분자 타입: 펩티드
Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser
1 5 10 15
본 발명에는 또한 다음과 같은 서열 No. 53-130이 포함된다.
VAKLEAKVAKLEAK
AVAKLEAKVAKLEAKGKGKY
KVAKLEAKVAKLEAKGKGKY
AVHKLEHKVAKLEAKGKGKYVQGEESNDK
KGKGKGL
KGKGKGLYL
WNSG
YLEN
YDQLVTRVVTHEMAHA
EAEEAARLQA
SGGKGSFDLEDV
AELGGQFHHKSENG
GKTAEDLQTRYN
TEADYAKNRAVLEY
CASQRDRFQVHNPHENDA
CKSQSGIEKTTRILHHANISESTQQN
CQATAKMAEEQLTTLHVRSEQQS
QGPGAPQGPGAPQGPGAPQGPGAP
GKGKGKGKGKGG
AIHKLEHKIAKLEAKGKGKY
PYKCPECGKSFSQKSDLVKHQRTHTG
KKK
KKKK
KKKKK
KKKKKK
KKKKKKK
KKKKKKKK
LKYGGENKPGG
YGGFM
YGGFL
RGDS
RLDS
YIGSR
GQGGTHGQWNKP
GQWNKPSKOKTN
GGLGGYMLGSAMSEPLIH
GSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQYSNQNN
RESQAYYQRGAS
KYMCNSSCM
KYICNSSCM
QDLTMKYQIF
ILTVILGVL
SAYGPRKL
SEIWRDIDF
YRPRPRRY
TFGLQLELT
QKRAA
QRRAA
DMGHGLRLIHYSYDDVNSTEKG
ASQKRPSQRSK
VHFFKNIVTPRTP
NTWTTCQSIAFPSK
SKTSASIGSLCADARMYGVL
LINVIHAFQYV
PGYPIRALVGD
VLGGGCALLRCIPACDSTLPANED
PALDSLTPANEA
IARFKMFPEVKEK
SRLSKVAPVIKARMMEYGTT
TPQGRPVAEY
TPQGRVAAEY
TPQGRVDAEY
TPQGRVSAEY
EFRADHPFLF
HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG
AKFEVNNPQVARAAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
YQGVQQKWDATATELNNALQ
MTEQQWNFAGIEAAASAIQ
LQNRRGLDLLFLKEGGL
RGD
GACRGDCLGA
GRGDSP
CRGDCL
CRGDCA
CVLNGRME
NGRAHA
DGRAHA
ALNGREESP

Claims (107)

  1. 비수지성 펩티드-고상 복합물을 형성하는 고상에 결합체(linker)를 통하여 연결된 비수지성 펩티드 담체, 고상으로부터의 이탈후에 양성(benign) 완충액하에서 2차구조를 형성할 수 있는 10-50개의 아미노산을 포함하는 비수지성 펩티드 담체, 나아가 비수지성 펩티드 담체에 결합된 면역원성 물질(immunogenic substance) 및/또는 면역매개자(immune mediator)를 포함하는 비수지성 펩티드-고상 복합물.
  2. 제1항에 있어서, 공유적으로 결합하는 지질성분(lipidic moiety)를 구성하는 비수지성 펩티드 담체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고상으로부터 이탈후에 양성 완충액하에서 2차구조를 형성할 수 있는 10-26의 아미노산을 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 일단의 알파-나선(α-helices), 베타-사슬(β-strand), 베타-회전(β-turns), 감마-회전(γ-βturns), 징크-핑거구조(zinc-finger) 그리고 상기의 조합으로부터 선택되는 2차구조를 가지는 비수지성 펩티드 담체.
  5. 제4항에 있어서, 2차구조가 α-나선인 비수지성 펩티드 담체.
  6. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서, 2차구조가 아미노산 서열을 유도하는 각각 알파-나선-, 베타-사슬-, 회전- 또는 징크-핑거-, 또는 상기의 조합인 펩티드에 포함되는 결과인 비수지성 펩티드 담체.
  7. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 있어서, 두 개의 평행한 펩티드를 발현하는 이분지 분자에 C-말단으로 연결되는 비수지성 펩티드 담체.
  8. 제1항 내지 제7항의 어느 한항에 있어서, 펩티드가 양성 수용액에서 단량체로 존재하는 비수지성 펩티드 담체.
  9. 제1항 내지 제8항의 어느 한 항에 있어서, 단량체 초이차 헤어핀(supersecondary hairpin)구조에서 회전에 의하여 연결된 두개 알파-나선 분자내의 역-평행 정렬을 야기하면서, 양성 수용액하에서 양친매성 알파-나선을 형성하는 비수지성 펩티드 담체.
  10. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서, 양성 수용액에서 이량체로 존재하는 비수지성 펩티드 담체.
  11. 제10항에 있어서, 수용액하에서 양친매성 알파-나선의 형성하고, 알파-나선 이중나선형태의 평행한 단량체를 유도하는 비수지성 펩티드 담체.
  12. 제1항 내지 제11항의 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 유도가능하고, 접근 가능한 부착점을 수반하는 비수지성 펩티드 담체.
  13. 제12항에 있어서, 부착점이 ε-아미노기 또는 리신(lysine) 또는 오르니틴(ornithine), α,γ-디아미노뷰티르산(diaminobutyric acid) 또는 α,β-디아미노프로피닐산(diaminopropinyl acid)과 같은 리신 아날로그(analogue) 그리고 자유 α-아미노기로부터 선택된 비수지성 펩티드 담체.
  14. 제13항에 있어서, 다른 리신잔기의 곁-사슬 그리고 자유 α-아미노기의 곁-사슬에 있는, Fmoc- 그리고 Boc- 쪼개짐(cleaving) 화학처리 양자에 오토고널 화학처리에 의하여 쪼개질 수 있는 보호기에 의하여 보호되는, 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 ε-아미노기의 서브클래스(subclass)를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  15. 제14항에 있어서, 부착점으로서 이중-기능 부착점, 및/또는 다중-기능성 부착점을 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  16. 제15항에 있어서, 이중-기능 부착점의 기능기중 하나 또는 다중-기능 부착점의 기능기중 적어도 하나가 가역적으로 차단되는 비수지성 펩티드 담체.
  17. 제11항 내지 제15항의 어느 한 항에 있어서, 부착점으로서 작용하는 곁-사슬 기능기가 이차구조 지지 그리고 유도가능 빌딩 블록(building blocks)으로 유도되는 비수지성 펩티드 담체.
  18. 제11항 내지 제15항의 어느 한 항에 있어서, 부착점으로 작용하는 곁-사슬 기능기가 제4도 (가) 그리고 제4도 (나)에 제시되는 구조로부터 선택된 이분지 잔기로 유도되는 비수지성 펩티드 담체.
  19. 제1항 내지 제18항의 어느 한 항에 있어서, C-말단 아미노산 근처에 부착된 곁-사슬에 위치한 적어도 두 개의 카르복실산(carboxylic acid) 또는 아미노기를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  20. 제1항 내지 제19항의 어느 한 항에 있어서, 지질성분로서 적어도 하나의 알킬- 및/또는 알케닐 사슬, 바람직하게는 펩티드의 N-말단 또는 아미노산 곁-사슬에 공유결합된 지방산의 형태를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  21. 제20항에 있어서, 알킬- 또는 알케닐 사슬의 탄소 사슬은 6-20의 탄소원자 정도로서 약4-25의 탄소원자, 바람직하게는 7-17 탄소원자 길이를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  22. 제21항에 있어서, 지질성분의 탄소사슬은 팔미틱산(palmitic acid) 또는 미리스틱산(myristic acid) 또는 상기의 혼합인 비수지성 펩티드 담체.
  23. 제20항 내지 제22항의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 지질성분이 티오에스터(thioester)로서 펩티드에, 바람직하게는 시스타인 분지사슬 티올기(thiol group)를 통하여, 결합되는 비수지성 펩티드 담체.
  24. 제20항 내지 제23항의 어느 한 항에 있어서, 지질성분은 제4도 (다)에 제시된 면역자극(immunostimulatory) palm3-Cys-분자인 비수지성 펩티드 담체.
  25. 제20항 내지 제24항의 어느 한 항에 있어서, 지질성분은 선택적 편광력의, L-아미노산이 이어지는 D-아미노산 그리고 D-아미노산이 이어지는 L-아미노산, 리신과 세린으로부터 선택되는 아미노산의 곁사슬에 결합되는 비수지성 펩티드 담체.
  26. 제1항 내지 제25항의 어느 한 항에 있어서, 15-50의 아미노산을 구성하고 그 서열내에서 "abcdefg"형태의 반복된 "헵타드(heptads)"를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  27. 제26항에 있어서, 반복된 "헵타드"가 그 내부 서열에, n이 펩티드에서의 아미노산의 개수일 때, 아미노산 2-5로부터 n-(2-5)까지의 단편, 바람직하게는 아미노산 3으로부터 n-3까지의 단편에 대응하는 펩티드 담체의 단편내에 위치하는 서열,위치하는 비수지성 펩티드 담체.
  28. 제26항 내지 제27항의 어느 한항에 있어서, "e" 와 "g" 위치를 점유하는 리신 잔기가 "b", "c" 그리고 "f" 위치를 점유하는 리신잔기와 비교하여 직교하여 곁-사슬 보호되는 비수지성 펩티드 담체.
  29. 제26항 내지 제28항의 어느 한 항에 있어서에 있어서, 적어도 하나의 "f"위치가 탄소에 의하여 점유된 비수지성 펩티드 담체.
  30. 제1항 내지 제29항의 어느 한 항에 있어서, 다음으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 펩티드 성분를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
    1) [TKPR]N, 여기서 N은 바람직하게는 1-5 (터프신 올리고머), 무라밀디펩티드(N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민) 또는 상기의 변형물;
    2) QYIKANSKFIGITE(테타너스 유독소, tetanus toxide, 830-843) 및 FNNFTVSFWLHRVKVSASHLE(테나너스 유독소 947-967), DQVHFQPLPPAVVKLSDALI(미코박테리움 튜버큘로시스, Mycobacterium tuberculosis 38 kD 항원 350-369), DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로조이테, Plasmodium falciparum circumsporozoite, 단백질 378-398), KLLSLIKGVIVHRLEGVE, 미즐 바이러스 F-단백질 286-302, LDNIKGNVGKMEDYIKKNNK(플라스모디움 팔시파룸, Plasmodium falciparum MSP-1, 260-279), LQTMVKLFRIK, NSVDDALINSTKIYSYFPSV, QYIKANSKFIGITELK, 그리고 PGINGKAIHLVNNESS 로부터 선택된 T-세포 자극 펩티드;
    3) T-세포-에피토프(epitope) 성분이 바람직하게는 측면에 접하는 서열이 없이 내재하는 최소의 T-세포-에피토프 펩티드 단편을 포함하는 선 구조로 정렬되는 폴리 T-세포-에피토프 구조 자극 펩티드로부터 선택된 T-세포자극 펩티드;
    4) IFN-감마(1-39) HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG, IFN-감마(95-133) AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC, TNF (70-80) PSTHVLITHTI, 그리고 IL-1 베타(163-171) VQGEESNDK
    로부터 선택되는 펩티드로 유도된 사이토킨.
    5) 이들의 복제물을 포함하는 조합.
  31. 제1항 내지 제30항의 어느 한 항에 있어서, 교잡(hybridization)에 의하여 특정 DNA-분자에 결합하는 단량체 서열을 포함하는 최소한 하나의 PNA 성분를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  32. 제1항 내지 제30항의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 기능적인 DNA-삽입 성분를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  33. 제1항 내지 제30항의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 DNA 올리고핵산염 성분를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  34. 제33항에 있어서, DNA 성분로서 Pu가 퓨린염기 이고 Py가 피리미딘염기인 서열 (5')PuPuCpGPyPy(3')을 포함하는 올리고핵산염을 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  35. 제1항 내지 제30항의 어느 한 항에 있어서, 폴리양이온 성분, 바람직하게는 리신의 수가 10에서 15인 폴리-리신, 을 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  36. 제1항 내지 제35항의 어느 한 항에 있어서, 고체-상이 바람직하게는 약0.001mM/g고상에서 약1mM/g고상 정도인 약0.001mM/g고상에서 약5mM/g고상, 보다 바람직하게는 약0.02mM/g고상 에서 약0.08mM/g고상, 보다 더 바람직하게는 약0.04mM/g고상에서 약0.06mM/g고상, 가장 바람직하게는 약0.05mM/g고상에서 0.1mM/g고상으로 치환되는 비수지성 펩티드 담체.
  37. 제1항 내지 제36항의 어느 한 항에 있어서, 펩티드를 고체-상 결합 결합체로부터 분리하는 화학처리가 펩티드의 곁-사슬내의 의도하는 부착점으로터 보호기를 쪼개기 위하여 사용되는 화학처리에 오토고널한 비수지성 펩티드 담체.
  38. 제37항에 있어서, 펩티드가 물과 접촉시 펩티드를 방출하는 결합체, 바람직하게는 제4도(라)에 구조가 제시된 글리콜산 결합체 또는 디켑토피퍼라진(dikeptopiperazine) 형성을 통하여 펩티드를 방출하는 결합체, 를 통하여 고상에 연결된 비수지성 펩티드 담체.
  39. 제1항 내지 제38항의 어느 한 항에 있어서, 10-26의 아미노산을 구성하고, C-말단 또는 C- 말단 부근에서 바람직하게는 팔미틱 또는 미리스틱산 지질성분를 함유하고, 자유롭고 접근가능한 곁-사슬 기능성이 없고, 비보호 N-말단의 α-아미노기를 함유하는 펩티드를 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  40. 제1항 또는 제2항에 있어서, 5-50의 아미노산을 포함하는, 바람직하게는 팔미틱 또는 미리딕산인 N- 말단 또는 N-말단 부근의 공유결합 지질성분을 포함하는 상기 펩티드, 히드라진-쪼개짐 결합체에 의하여 고상 복합물을 형성하는 고상에 부착된 상기펩티드인 비수지성 펩티드 담체.
  41. 제30항에 있어서, 고체-상이 비수지성 펩티드 담체에 오토고널하게 쪼개지고 펩티드 고정(anchoring) 성분로서 고안된 일정 비율로 선택적으로 쪼개지는 결합체를 사용하여 유도되는 비수지성 펩티드 담체.
  42. 제1항 내지 제41항의 어느 한 항에 있어서, UV -흡수성, 가시흡수 또는 형광성과 같은 고유하고 측정가능한 분광의 또는 방사성 특성을 포함하는 비수지성 펩티드 담체.
  43. 제1항 내지 제42항의 어느 한 항에 있어서, 비고리형(non-cyclic)인 비수지성 펩티드 담체.
  44. 다음의 단계에 따라, 면역원성 물질 또는 그에 결합되는 면역 매개자를 포함하는 비수지성 펩티드 담체의 제조방법.
    1) 결합체에 화학적 고체-상 합성에 의한 상기 청구항에서 정의된 비수지성 펩티드 담체를 합성, 그리고
    2) 비수지성 펩티드 담체상에 직접적인 면역원성 및/또는 면역 매개자의 합성, 및
    3) 고상으로부터 비수지성 펩티드 담체의 분리.
  45. 제44항에 있어서, 2)단계가 유도기에 의해 펩티드 담체에 다른 성분의 공유적 부착을 포함하는 제조방법.
  46. 그 분자가 폴리펩티드, 탄화수소, 합텐, 글리코펩티드, 리포펩티드, DNA, RNA, PNA, 단백질 그리고 당단백질 그리고 상기의 조합이고, 부착점에 공유적으로 결합하는 것이 특성인 화학적 유도체의 생성을 위한 제1항 내지 제43항의 어느 한 항에서 정의된 비수지성 펩티드 담체 복합물의 주쇄로서의 용도.
  47. 고상 결합 비수지성 펩티드의 부착-점상에서 일정 서열로 펩티드 성분의 단계적인 Fmoc- 또는 Boc- 기초 고상 펩티드 합성을 위한, 제1항 내지 제46항의 어느 한 항에서 정의된 비수지성 펩티드 담체 복합물의 주쇄로서의 용도.
  48. 면역자극복합물(Immunostimulating Complex, Iscom)에 상호결합하여 비수지성 펩티드 담체-이스콤(Iscom)을 형성하기 위한, 제1항 내지 제43항의 어느 한항에서 정의된 비수지성펩티드 담체 복합물의 주쇄-펩티드로서의 용도.
  49. 제48항에 있어서, 공지방법에 의하여 펩티드를 단백질에 축합시키는 방법에 의하여 수용액에서 항원물질의 화학적 결합을 위한 비수지성 펩티드 담체- 이스콤 복합물의 용도.
  50. 제1항 내지 제43항의 어느 한 항에 있어서, 피브로넥틴-유사(fibronection-like), 라미닌-유사(laminin-like), 또는 비트로넥틴-유사(vitronectin-like) 결합 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 펩티드로 유도된 비수지성 펩티드 담체.
  51. 제50항에 있어서, 피브로넥틴-유사, 라미닌-유사 또는 비트로넥틴-유사 결합활성을 갖는 펩티드가 그 서열에서 RGD, GACRGDCLGA, GRGDSP, CRGDCL, CRGDCA, CVLNGRME, NGRAHA, DGRAHA, ALNGREESP, YIGSR, RLDS, 또는 상기의 변형물을 포함하는 유도 비수지성 펩티드 담체.
  52. 세포-부착전에 플라스틱 표면을 유도 비수지성 펩티드 담체를 사용하여 피복하는 것을 포함하는, 플라스틱 표면에 세포부착을 증진시키기 위한 제50항 내지 51항의 어느 한 항의 유도 비수지성 펩티드 담체의 용도.
  53. 종양의 증식과 전이를 저해하기 위한 제50항 내지 제52항의 어느 한 항의 유도 비수지성 펩티드 담체의 용도.
  54. 펩티드를 손상조직에 피복함에 의하여 상처치료를 증진시키기 위한 제50항 내지 제53항의 어느 한 항의 유도 비수지성 펩티드 담체의 용도.
  55. 특이적으로 결합하는 압타머(aptamers)의 선택을 위한 제1항 내지 제43항중 어느 한 항의 유도 비수지성 펩티드 담체의 용도.
  56. 진단제(diagnostic agent)가 연결된 분자 또는 제1항 내지 제43항의 어느 한 항의 유도 비수지성 펩티드 담체를 포함하는 물질을 감지하기 위한 진단성분.
  57. 제56항에 있어서, 진단제는 항원 또는 항체인 진단 성분.
  58. 제56항 내지 제57항의 어느 한 항에 있어서, 압타머를 감지하기 위한 진단성분.
  59. 제56항 내지 제58항의 어느 한 항에 있어서, 진단성분은 동일 또는 다른 분자를 감지할 수 있는 적어도 2개의 서로 다른 진단제를 포함하는 진단성분.
  60. 제56항 내지 제59항의 어느 한 항에 있어서, 진단제가 폴리펩티드; 리포폴리펩티드; 글리코폴리펩티드; 포스포리피드; 탄화수소; 리포폴리사카라이드; DNA서열 또는RNA서열과 같은 핵산염 서열; PNA; 또는 상기의 조합 또는 변형을 포함하는 집단으로부터 선택된 분자인 진단성분.
  61. 제56항 내지 제60항의 어느 한 항에 있어서, 진단제의 양이 진단제가 결합할 수 있고 감지대상인 상기 분자와의 반응이 감지될 만큼 효과적인 진단성분.
  62. 분자내 진단 조성물이 목적물과 반응, 복합물을 형성하고, 상기 복합물을 감지 수단에 적용함에 의하여 결합분자의 존재를 감지하는데 충분한 시간동안 상기 분자와 인큐베이션되는 분자의 감지를 위한 제56항 내지 제61항의 어느 한 항의 진단성분의 용도.
  63. 제62항에 있어서, 임신, 감염성 질병, 자기면역 질병, 종양성 질병과 같은 질병, 기타 지시 분자가 알려진 질병을 나타태는 분자 또는 그로부터 유도된 분자의 감지를 위한 용도.
  64. 제62항 내지 제63항중 어느 한항에 있어서, 조직 또는 조직 추출물, 세포배양 또는 인간을 포함한 포유동물로부터 유도된 샘플내에서 분자의 감지를 위한 용도.
  65. 제64항에 있어서, 샘플이 생검(biopsy)에서와 같은 조직, 또는 조직 추출물, 세포, 또는 상기 포유동물의 세포배양으로부터 유도되는 용도.
  66. 진단제가 생체내에서 상기 포유동물의 질병 또는 임신을 나타내는 분자 또는 그로부터 유도된 분자를 감지하는 제56항 내지 제61항중 어느 한 항의 진단 조성물을 포함하는 인간을 포함하는 포유동물의 질병 또는 임신을 진단하는 방법.
  67. 진단제가 생체내에서 상기 포유동물의 질병 또는 임신을 나타내는 분자 또는 그로부터 유도된 분자 그리고 샘플에 존재하는 분자를 감지하는 제56항 내지 제61항중 어느 한 항의 진단 조성물의 인큐베이팅을 포함하는 인간을 포함하는 포유 동물의 질병 또는 임신을 진단하는 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 감염성 질병, 자기면역질병, 종양성질병 등을 지시하는 또는 그로부터 유도된 분자의 감지에 사용하는 진단방법.
  69. 제66항 또는 제67항에 있어서, 생검에서와 같은 조직, 또는 조직 추출물, 세포, 상기 포유동물 세포배양으로부터 유도된 샘플내 분자를 감지하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 샘플이 혈청, 플라즈마, 전혈, 뇌척수액, 정액 또는 질액, 타액, 삼출액(exudates), 뇨, 변 등으로부터 유도되는 진단방법.
  71. 제55항 내지 제61항의 어느 한 항에 의한 진단 성분을 포함하는 진단키트.
  72. 적어도 하나의 이뮤노게겐제(immunogen agent) 또는 매개자가 부착되는 제1항 내지 제43항의 어느 하나에서 정의되는 비수지성 펩티드 담체를 포함하는 백신성분.
  73. 제72항에 있어서, 이뮤노겐제가 폴리펩티드, 글리코펩티드, 리포펩티드, 포스포리피드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 탄화수소, 핵산염서열, PNA 또는 상기의 조합또는 변형인 백신성분.
  74. 제72 내지 제73항중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노겐제 또는 매개자가 펩티드의 혼합물인 백신성분 .
  75. 제72 내지 제74항중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노겐제 또는 매개자가 백신 조성물에 노출된 이뮤노겐 효과 또는 면역계 반응에 영향을 줄 수 있는 백신성분.
  76. 제76항에 있어서, 면역 매개자가 터프신(tuffsin), 사이토킨, 부착분자, 상기의 부분 또는 변형물인 백신성분.
  77. 제72 내지 제74항중 어느 한 항에 있어서, 백신 성분이 리포좀, 또는 면역 미립자(microparticle), 선택적으로 매개자 또는 매개자 활성이 있고 2차 수송 담체에 부착되는 상기의 부분과 조합하여 면역자극 복합물(이스콤), 리포좀, 또는 면역 미립자(microparticle) 같은 2차 담체에 부착되는 백신성분.
  78. 적어도 하나의 제72항 내지 제77항중 어느 한 항에 의한 적어도 하나의 백신성분을 포함하는 백신 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 포유동물에서 하나 또는 그 이상의 감염에 대한 저항력을 증가시키는 백신의 효과적인 양을 포함하는, 선택적으로 약제적으로 받아들여지는 담체, 운반자(vehicle), 증강물질 또는 보조액, 또는 상기의 혼합물인 백신 조성물.
  80. 포유동물에게 제78항 또는 제79항에 따르는 백신 조성물의 면역적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는, 질병에 대하여 인간을 포함한 포유동물을 면역화 방법.
  81. 제80항에 있어서, 백신조성물을 경구, 코, 항문, 피하, 피내, 또는 근육내, 또는 어느 점막표면으로 투여하는 것을 포함하는 인간을 포함한 포유동물을 면역화 방법.
  82. 적어도 하나의 치료제 또는 예방제가 부착되는, 제1항 내지 제43항중 어느 한 항에 의하여 정의되는 비수지성 펩티드 담체를 포함하는 치료성분.
  83. 제82항에 있어서, 치료제 또는 예방제가 폴리펩티드, 글리코펩티드, 리포펩티드, 포스포리피드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 탄화수소, 핵산염 서열, PNA, 또는 상기의 조합 또는 변형인 치료성분.
  84. 제82항 내지 제83항중 어느 한 항에 있어서, 담체에 연결되어 치료제 또는 예방제의 효과를 향상시키거나 또는 조절하는 능력이 있는 적어도 하나의 매개자를 포함하는 치료성분.
  85. 제84항에 있어서, 매개자가 터프신, 사이토킨을 포함하는 이뮤노모듈레이터, 부착분자, 또는 상기의 부분 또는 변형인 치료성분.
  86. 제82항 내지 제85항의 어느 한 항에 있어서, 치료성분이 면역자극 복합물(이스콤), 리포좀, 또는 미립자와 같은 2차 담체에 부착되는, 선택적으로는 매개자 또는 매개자 활성이 있고, 2차 담체에 부착된 상기의 부분과 조합하여 부착되는, 치료성분.
  87. 제82항 내지 제86항의 어느 한 항에 있어서, 치료성분이 그 효과를 나타내는 상기 특정 위치에 치료성분을 배향시키므로써, 포유동물에서 특정부위에 있는 표적물질에 결합할 수 있는 능력이 있는 표적분자를 포함하는 치료성분.
  88. 제87항에 있어서, 표적분자가 항체인 치료성분.
  89. 제87항 내지 제88항의 어느하나에 있어서, 재발방지를 포함하는 예방, 또는 질병의 치료능력 또는 임신의 예방 또는 중절 능력이 있는 치료성분.
  90. 선택적으로 약제적용가능 담체와 함께 제82항 내지 제89항의 어느 하나의 치료성분을 포함하는 약제 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 감염성의 질병, 종양성 질병, 또는 자기면역 질병과 같은 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물.
  92. 약제 조성물의 제조를 위한 제82항 내지 제89항의 어느 한 항에 따르는 치료 성분의 용도.
  93. 필요한 환자에게 제90항 내지 제91항의 어느 한 항에 의하는 치료적 또는 예방적으로 효과적인 약제 조성물의 양을 투여하는 질병의 치료 및/또는 예방방법.
  94. 약제 조성물의 제조를 위하여 제82항 내지 제89항의 어느 한 항에 따르는 치료성분의 용도.
  95. 감지제가 연결된 제1항 내지 제43항의 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 비수지성 펩티드 담체를 포함하는, 분자 또는 물질의 감지를 위한 감지성분.
  96. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노겐제가 다음의 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 gp120으로부터의 펩티드 aa 152-176 인 백신 성분: GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF.
  97. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 제제 또는 매개자가 다음의 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 gp41로부터 펩티드인 백신성분: LERLLL.
  98. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역원성 제제가 YDQLVTRVVTHEMAHA인 백신 성분.
  99. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 제제가 EAEEAARLQA인 백신성분.
  100. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역매개자가 IFN-감마(1-39) HITVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG인 백신성분.
  101. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역매개자가 IFN-감마(95-133) AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC인 백신성분.
  102. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역매개자가 TNF 생체활성 서열( TNF70-80): Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ile-Thr-His-Thr-Ile 인 백신성분.
  103. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역매개자가 터프신 펩티드 TKPR 또는 상기 올리고머인 백신성분.
  104. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 면역매개자가 IL-1 베타 생체활성 서열 : VQGEESNDK/Val-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys 인 백신성분.
  105. 제72항 내지 제79항중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노겐제가 EBA 175-펩티드 : TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD인 백신성분.
  106. 제82항 내지 제94항중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 KNGMLKGDKVS인 치료성분.
  107. 제82항 내지 제94항중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 CKNKEKKC인 치료 성분.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6103239A (en) 1996-08-09 2000-08-15 Cel-Sci Corporation Modified HGP-30 heteroconjugates, compositions and methods of use
US6251866B1 (en) 1997-08-05 2001-06-26 Watson Laboratories, Inc. Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor
US6582700B1 (en) * 1997-11-18 2003-06-24 Medical University Of South Carolina Linear antigen supporting units
US6472367B1 (en) * 1998-05-05 2002-10-29 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion
US7481999B2 (en) 1998-05-05 2009-01-27 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating OB-cadherin-mediated function
EP1246597B1 (en) * 1999-08-03 2015-01-14 The Ohio State University Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to her-2 protein
GB9930591D0 (en) * 1999-12-23 2000-02-16 Univ London Component for vaccine
WO2001060848A2 (en) * 2000-02-18 2001-08-23 Watson Pharmaceuticals, Inc. Conjugates targeted to target receptors
US6555543B2 (en) 2000-08-04 2003-04-29 Dmi Biosciences, Inc. Method of using diketopiperazines and composition containing them
US7303907B2 (en) 2001-01-08 2007-12-04 Health Protection Agency Degradation and detection of TSE infectivity
CA2481437A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-16 The Scripps Research Institute Motif-grafted hybrid polypeptides and uses thereof
US20060057636A1 (en) * 2002-08-21 2006-03-16 Peter Heegaard Composite peptide compounds for diagnosis and treatment of diseases caused by prion proteins
AU2003298475A1 (en) 2002-11-14 2004-06-18 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating desmosomal and atypical cadherin-mediated cell adhesion
US7354589B2 (en) * 2003-01-16 2008-04-08 The Wistar Institute Multiple antigenic agents and methods for using the same
KR20150080004A (ko) 2003-05-15 2015-07-08 앰피오 파마슈티컬스 인코퍼레이티드 Ｔ-세포 매개성 질환의 치료 방법
US7740860B2 (en) 2005-03-29 2010-06-22 The Wistar Institute Composition and method for preventing or treating a virus infection
AU2006261342B2 (en) 2005-06-15 2012-02-02 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
KR100787393B1 (ko) * 2006-03-23 2007-12-21 학교법인 한림대학교 세포 도입성 ｆｋ506 결합 단백질의 융합 단백질
JP5856843B2 (ja) 2008-05-27 2016-02-10 アンピオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド ジケトピペラジンを用いた医薬組成物
EP3301116A1 (en) 2008-08-25 2018-04-04 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Conserved influenza hemagglutinin epitope and antibodies thereto
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
CN102297968B (zh) * 2010-06-28 2013-10-30 程小星 辅助诊断结核病的试剂盒
CA2810844C (en) 2010-09-07 2017-03-21 Dmi Acquisition Corp. Diketopiperazine compositions for the treatment of metabolic syndrome and related conditions
WO2013055734A1 (en) 2011-10-10 2013-04-18 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Treatment of degenerative joint disease
MY172699A (en) 2011-10-10 2019-12-10 Ampio Pharmaceuticals Inc Implantable medical devices with increased immune tolerance, and methods for making and implanting
MX355446B (es) 2011-10-28 2018-04-18 Ampio Pharmaceuticals Inc Tratamiento de rinitis.
EP2968315B1 (en) 2013-03-15 2020-06-03 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Compositions for the mobilization, homing, expansion and differentiation of stem cells and methods of using the same
CN104231048B (zh) * 2013-06-05 2017-05-24 财团法人工业技术研究院 生发胜肽及药物组合物
TWI516272B (zh) 2013-06-05 2016-01-11 財團法人工業技術研究院 應用於生髮之方法及醫藥組成物
WO2016028790A1 (en) 2014-08-18 2016-02-25 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Treatment of joint conditions
US11389512B2 (en) 2015-06-22 2022-07-19 Ampio Pharmaceuticals, Inc. Use of low molecular weight fractions of human serum albumin in treating diseases
CN110636855B (zh) * 2017-03-28 2024-08-09 俄亥俄州创新基金会 人pd1肽疫苗及其用途
CN115087465A (zh) * 2019-10-29 2022-09-20 威斯康星校友研究基金会 肽-纳米颗粒缀合物
CN112851755B (zh) * 2021-01-13 2023-09-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种线性脂肽化合物及其制备方法与应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2217319A (en) * 1988-04-19 1989-10-25 Synpharm Ltd Racemic and optically active fatty amino acids, their homo- abd hetero-oligomers and conjugates, the process of their production, their pharmaceutical composi
GB9215780D0 (en) * 1992-07-24 1992-09-09 Univ London Pharmacy Peptide compounds
US5674977A (en) * 1993-02-05 1997-10-07 The Ontario Cancer Institute Branched synthetic peptide conjugate
CA2169284A1 (en) * 1993-08-11 1995-02-16 Philip E. Dawson Template assembled synthetic protein
GB2282813A (en) * 1993-10-15 1995-04-19 Merck & Co Inc Annular antigen scaffolds comprising thioether linkages
WO1995031480A1 (en) * 1994-05-18 1995-11-23 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Heterodimer polypeptide immunogen carrier composition and method

Also Published As

Publication number Publication date
NO984644L (no) 1998-12-03
HUP9901254A2 (hu) 1999-07-28
WO1997038011A1 (en) 1997-10-16
HUP9901254A3 (en) 2001-10-29
NO984644D0 (no) 1998-10-02
AU2567997A (en) 1997-10-29
AU704502B2 (en) 1999-04-22
JP2001502658A (ja) 2001-02-27
CN1215404A (zh) 1999-04-28
EP0896582A1 (en) 1999-02-17
CA2251464A1 (en) 1997-10-16
NZ331596A (en) 1999-07-29

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