CN1215404A - 非树状骨架肽载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及被设计用作免疫原性物质和/或免疫介质载体的非树状肽、带有免疫原性物质和/或免疫介质载体的所述载体的构建体、用于制备具有较高且可预见免疫原性包括所述非树状肽载体的免疫原的方法、该免疫原在制备疫苗及在肽载体上包括免疫原性物质和/或免疫介质疫苗中的使用。本发明也涉及用该非树状肽载体的诊断或治疗实施方案、诊断或治疗组合物及其用于诊断疾病和妊娠及用于治疗中的方法。根据本发明的非树状肽载体包括10－50个氨基酸,它们从固相释放后在良性的缓冲液中形成二级结构。

Description

非树状骨架肽载体
本发明涉及被设计用作免疫原性物质和/或免疫介质载体的非树状肽、带有免疫原性物质和/或免疫介质载体的所述载体的构建体、用于制备具有较高且可预见免疫原性包括所述非树状肽载体的免疫原的方法、该免疫原在制备疫苗及在肽载体上包括免疫原性物质和/或免疫介质疫苗中的使用。本发明也涉及用该非树状肽载体的诊断或治疗实施方案、诊断或治疗组合物及其用于诊断疾病和妊娠及用于治疗中的方法。
非树状肽载体通过其C-末端经特异性可切割的“接头”偶联至固相上形成固相复合物用于在非树状肽载体从固相释放前在其上合成或偶联免疫原性物质的肽载体的制备。
背景
在WO 95/31480中，反向平行的“卷曲-螺旋”异二聚体用作免疫原载体。通过使用异二聚体，包括不同免疫原性靶分子物质的组合物的制备得到控制。制备包括混合2种不同的单体，所需的2种不同的靶分子分别附着于不同的单体上。由于每种单体被设计不形成同二聚体，故只有异二聚体得以顺利形成。获得的异二聚体包括所需的2种不同的免疫原性靶分子分别附着于不同的单体上。因此，该免疫原性组合物包括通过常规的偶联方法偶联至肽载体上的不同免疫原分子且只有于每种单体上的1种免疫原性物质得以显示。因此，此自我组装系统确保在相同二聚体中2种不同物质，如，分别为B-细胞和T-细胞抗原的组合。构象稳定化没有研究且低浓度时的解离问题也没有描述。亚单位肽有21-70个氨基酸。
在WO 95/11998中，列出了基于各种病原微生物抗原变化或T-细胞刺激序列所有组分(repertoire)而构建的肽库。其目的是为了获得对微生物变异体和宿主人群的的广泛反应行或免疫原性。该库在1次肽合成中同时合成，包括添加反应混合物，反应物代表的分布相应于代表该库的最终肽群体的所需分布。该库用固相合成，然而，除了含有可衍生(derivatizable)聚合物的常规赖氨酸外，没有公开具体的骨架结构。
在WO 94/29332中，反向平行的分子内“卷曲-螺旋”单体用作免疫原载体，其中的肽序列形式的免疫原性物质插入到形成单体的线形肽中从而总的免疫原组合物由纯的肽所组成。因此，描述的肽通过2个两亲性α螺旋再加上转角的分子内、反向平行排列加以稳定化，由于α螺旋束的存在其稳定性为非浓度依赖性的。其结构不是设计用于带有多种免疫原性物质的支架(scaffold)而是用于稳定设计的模板(template)。全长肽可具有32和＞200个残基。没有提到分支肽的附着。没有列出免疫实例。
已知有用于肽附着以产生“模板辅助性合成蛋白”(＂template assisted synthetic proteins＂)(＂TASP＂s)的环状或约束性(constrained)支架(scaffold)(Tuchscherer 1993)。特异性设计这些支架以将附着的肽定位于刚性模板上以增强这些肽的构象特征并且通过至少以α螺旋肽的圆二色性测定令人信服地显示出这一点。在佐剂存在下以TASPs的免疫似乎产生蛋白交叉反应抗体而没有进一步交联到其它载体上。它们的合成包括支架的固相合成，然后是部分的去保护和附着肽的合成，再进行切割和最常见的环化及HPLC的深入纯化。
预合成的肽硫酯向溴乙酰化支架的化学选择偶联也已描述过(WO 95/04543)。不同种结构可用正交化学偶联(Tuehscherer 1993)。结构，包括以不同比例与T-细胞和B-细胞肽混合的结构及其作为免疫原的使用也已报道(Kaumaya1993)。其中的支架由通过转角连接的2条短的β链所组成并且以导致抗体与肽和相应的天然蛋白反应的弗氏完全佐剂进行免疫。没有列出关于在附着肽中结构支撑的直接证据，且免疫一般在佐剂存在下进行。
GB 2 282 813 A描述了1种通过硫酯键环化并含有提供氨基作为附着位点的赖氨酸残基的支架，其中的环状B-细胞表位及线形肽T-细胞刺激抗原可被偶联。支架本身被合成、环化及纯化，且随后纯化的肽抗原，特别是环化肽B-细胞抗原及线形T-细胞抗原通过化学方法偶联。同样，糖类也可被偶联并可包括具有佐剂活性的基团，如，三棕榈酸-Cys-结构。产物不易溶解并以脂质体施用或为了免疫而被乳化。还没有关于结构支撑的数据也没有关于诱导蛋白-交叉-反应的能力的任何信息。没有提到在固相结合支架上的合成。
在美国专利No.5229490中，公开了具有“树状”结构的合成肽支架。描述了多种抗原肽系统，其中的大量抗原结合到也称为“多种抗原肽”(＂MAPs＂)的树状核心分子的官能团上。
呈递抗原的树状体通过α-和ε-未保护赖氨酸氨基上的多“层”(＂layer＂)化学合成、其C-末端向固相的交联而产生一般每个固相附着的赖氨酸残基4或8个可衍生氨基而产生。这些基团可被衍生而带来其它的功能性和/或间隔部分(spacer-moieties)(见WO 92/18528和Tam 1995)。通过将抗原肽附着到结合固相MAP-核心的外部氨基上，然后切割完成的结构，以最小的“核心”载体结构得到了所谓的高密度呈递(presentation)，外层中的每个赖氨酸部分带有2个抗原肽。这种MAPs可以是高度免疫原性的，至少在佐剂如弗氏不完全佐剂和氢氧化铝存在下注射时产生只对抗原肽“分枝”的抗体。然而在有些情况下，这些抗体即使对结合MAP的抗原肽具有高的亲和性，但与该肽从其衍生的天然结构不具有很高的反应性(见如Briand 1实施方案2)。此外，到处都是“分枝”-肽的数目影响单个分枝结构的迹象(见如1991)，且没有这样的事实，即在抗原肽分枝中肽结构的必须保留是否存在。它们的化学合成复杂，因为紧挨的分枝肽趋于聚集。因此，一般推荐“间接的方法”，其中的肽抗原作为预合成的整体而被偶联(Tam 1993)。然而，与合成无关的所有问题仍然存在。
也已发现MAPs难以用高压液相色谱(HPLC)进行特征分析和纯化。因此，MAPs通常以基本上不纯的状态施用(如除了脱盐步骤或粗凝胶过滤步骤)(见如Tam 1993)，从而削弱了用化学方法制备缀合物的优势。
为了改善疫苗和免疫，一个重要的目标是提纯使用的抗原且特别是保证其纯度和化学可定义性(definability)同时仍维持其诱发有利免疫学反应的能力。然而，已知的载体肽和这种肽的制备及免疫原性组合物在此方面是不充分的。一般需要脂质体制剂或具有水包油(oil-in-water)佐剂的制剂以产生充足的抗体反应。
建立用于增加肽免疫原性的良好方法是存在的(见如Plaue 1990)。常规方法一般包括通过化学方法肽向载体分子的交联(见如Van Regenmortel 1988)。本领域众所周知的化学交联方法包括以戊二醛(偶联至氨基和巯基)、碳二亚胺(偶联至氨基)、m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(从氨基至巯基的偶联)的偶联，和经氧化的偶联碳水化合物然后与伯氨基的反应与还原以及通过特异性试剂偶联硫(见如Van Regenmortel 1988)。载体一般为天然衍生的蛋白，如清蛋白、卵清蛋白、从结核分枝杆菌(M.Tuberculosis)得到的纯化蛋白(PPD)、匙孔血蓝蛋白、抗生物素蛋白、百喉类毒素、破伤风类毒素等。
免疫程序经常而且一般包括与佐剂一起经肌肉内、皮下或皮内多次连续地注射肽载体缀合物，其中的佐剂包括佐剂如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、EmulsigenR、TitermaxR、氢氧化铝等。目前允许人类使用的唯一佐剂为氢氧化铝。一种较为新型的佐剂为免疫刺激复合物(＂Iscom＂)(Morein 1984)，其中的两亲性抗原、Quil A、胆固醇、脂类和磷脂酰胆碱的组合导致了小(直径35nm)而高度免疫原性颗粒的形成，其中的抗原包埋于膜中使其亲水部分朝外。该方法特别显示出对病毒抗原有效。通过化学方法将肽交联至含有合适蛋白的完成(performed)Iscom上Iscom可用作肽载体/佐剂(Larsson 1993)。作为佐剂而起作用并可与合成肽使用的另一种载体为含有脂类A和用于肽化学偶联反应基团的脂质体(Friede 1993)。
然而通过载体交联制备免疫原性肽的方法主要为经验性的，且一般来说，预言用于诱导所需免疫反应的最佳载体、交联方法及交联密度是不可能的。重要的参数如肽抗原偶联至载体的方向，尽管对制备的抗体起主要作用，但不能控制。因此，本发明欲克服的问题包括如下的化学可定义性问题：
1．只以一定的难度测定肽对载体的比值，如用氨基酸分析、放射活性记数或基于准确分子量测定的估计。
2．在大多数化学中，肽以随机的方向并通过以变化数目的官能团沿着肽链附着而偶联到载体上从而导致电荷分布和肽结构的破坏。
3．肽-肽-和载体-蛋白-载体-蛋白聚合物形成仅可通过对反应条件仔细的特异性(case-to-case)优化可能再结合反应后的清除(clear-up)如，通过大小排阻层析加以排除。
4．天然得到的载体蛋白在化学上不具有统一的特征(not chemically totally characterized)。
5．交联方法增加了制备肽免疫原所需的时间，增加了合成后步骤且也增加了原料的损失。
6．形成的抗载体蛋白和交联基团的抗体可能导致问题。
7．天然得到的“免疫”级的载体蛋白相当昂贵。
最终，作为常规，不允许天然得到的(或重组的)载体蛋白作为免疫原施用于人类。
根据本发明，如果此载体以高密度产生(present)肽免疫原，提供必须的T-细胞表位并支撑该肽的构象，上述的缺陷可通过用完全合成的免疫原，如偶联至合成肽载体上的合成肽加以避免。
好处包括下面的可能性，包括定向，随后于固相结合的肽载体上的合成(无须合成后操作)，以及更多种易控制的化学方法，如允许不同的物质通过正交化学偶联并允许控制肽的定向。同样，避免了开发载体蛋白和偶联基团的抗体。
通过固相合成的肽的化学合成是众所周知的(Merrifield 1963,Atherton 1978)。肽连续地从C-末端合成，该C-末端通过人工可切割的化学“接头”结合到不溶性固相上。合成完成以后，通过切割接头而释放肽。4个化学基团被联合到一起，第一个用于激活待偶联氨基酸的α-羧基，其它2个分别用于保护α-氨基和侧链基团，第四个控制肽-至-固相接头的不稳定性。
在一个实施方案中，本发明涉及由常规的固相肽合成聚合物所组成的共聚体，后者上偶联有含有许多可自由接近官能团的寡肽，其它的肽可合成或偶联至该官能团上或可偶联上其它的本体(entity)。共聚体上肽的合成可通过常规的固相合成方法进行。合成或偶联后，所有复合物可被切割并带至溶液中且可通过常规方法加以纯化和分析。此外，可对偶联的肽进行测序。复合物十分有效地产生偶联肽，从而极大地增加了偶联肽的免疫原性。因此，该复合物可用作免疫方法，或者单独使用，或者与Iscom-形成剂或与其它佐剂联合使用。
为了完全的化学定义，如果可能，优选化学合成适当的抗原而不从天然来源中得到抗原。为了方便易行，这样的的合成应该是经济的并导致具有所需纯度的实际量的抗原。这种可容易而经济地合成的抗原包括短肽即包括少于约30个氨基酸残基的肽。
短的合成肽作为抗原在疫苗中的使用具有许多优势，包括增加的安全性，增加的可复制性，低制备成本和选择非-突变表位的可能性(见如Shinnick 1983)。产生的抗合成肽的抗体是针对蛋白的预定部分；这通过其它方法是不可能的。抗体也可是针对蛋白的非免疫原性部分或者针对非肽抗原，如碳水化合物或半抗原。癌症、病毒包括HIV、细菌及寄生虫感染已进行过关于基于肽疫苗的研究。
在基础研究领域，肽可用于制备抗基因序列已知的未鉴定蛋白的抗体及用于蛋白的作图位点。在疫苗领域，由于多种原因，包括经济、高度批量(batch-to-batch)的可复制性、增加的稳定性、不纯物的排除，所以总合成的疫苗是优越的，且上述获得“干净”反应的可能性仅针对病原体的关键部分。这种合成构件体作为抗原在诊断分析和治疗中具有多种用途。
然而已证实通过单一短的合成肽而产生的针对整个微生物的中和反应仅见于少数特殊的场合。这是由于这样的事实，即作为常规，肽是不具有免疫原性的，即自身不能够诱导实质性免疫反应。短肽不认为具有足够大以确保完全的免疫反应(体液及细胞反应)，因为主要组织相溶性复合物不结合肽，因为它们不具有正确的序列并缺乏见于较大免疫原同时对宿主细胞呈递多种表位的协同或合作效应(多价)。如果获得抗体，它们一般具有低的亲和性因为短肽的构象在水性环境中不能很好地定义；因此，得到的抗体没有筛选至包括其多肽天然状态肽的限定构象子(conformer)。这导致抗-肽抗体间不必要的低度交叉反应性及对大多数疫苗应用的相应的蛋白损害，其中的抗体反应应该中和入侵的病原体，如通过结合至特异性的毒素上，或结合至涉及病原体结合至宿主组织的表面分子或通过结合至制备用于吞噬作用微生物的病原体特异性抗原上。
在水性环境中维持结构的短肽(＜约30个氨基酸)的设计是主要的任务。通过限制肽构象自由度的化学言声可增强短肽的结构，如通过环化或聚合(见如Robey 1992和Gilon 1991)或通过包括进链中核心结构物质如，转角或α-螺旋诱导物(如Kahn 1993,Unson 1984,Kemp 1990,Hinds 1991,Dias 1993和Bambino 1994)或螯合的金属离子(如Ragan 1995)。然而，只有在水中能维持构象的单一未修饰的肽结构才是两亲性的α-螺旋(Mant 1993)，它通过聚集成同-或异二聚体或寡聚体而得以稳定。两亲性螺旋具有沿着其轴占据一半螺旋表面的疏水端和另一半的亲水端。两亲性α-螺旋一般以“束状”结合在一起从而遮住疏水性表面并暴露出亲水端以形成平行或反平行的同二聚体(Zhu 1993)或异二聚体和寡聚体(Zhu 1992)。
在本文中，使用了下面的定义：
肽载体为包括用作一个或更多个自身可为肽的部分载体的肽的物质，每部分经包括载体肽氨基酸侧链的键(linkage)偶联至所述的载体肽上。
非树状肽载体为不含任何可双衍生构建块(double-derivatizable building blocks)的肽载体，后者在任一衍生基团中以其它类似或不同的可双衍生构建块取代，所述的非树状载体肽进一步提供至少2个可衍生的官能团。
在描述非树状肽载体和衍生的非树状肽载体中，使用了下面的术语：
骨架肽表示非树状肽载体本身。分枝肽或“分枝-部分”表示偶联至从中衍生的非树状肽载体上的肽或部分。附着位点表示可用于衍生的非树状肽载体中的官能团。
脂质成分(lipidic moiety)定义为通过其羧基结合成为酰胺或酯的烷基或链烯基脂肪酸。
肽合成的固相接头为具有至少2个官能团的分子，1个用于提供连接到固相聚合物上的稳定共价键，且另1个用于肽合成过程中通过稳定的共价键附着C-末端氨基酸，所述的氨基酸附着键在肽合成条件下是稳定的，但对特异的化学处理具有一定的不稳定性，正因如此，依靠不同的化学处理，制备的肽可释放为自由酸或C-末端修饰的肽。
抗原为与特异性抗体或T-细胞反应的物质。
免疫原为能够诱导包括抗体或T-细胞反应的抗原性反应的物质。
免疫介质(mediator)为能够调节免疫系统活性的物质。这种调节效应可以指免疫系统的激活以及免疫系统的下行调节。术语免疫调节剂与术语免疫介质可交互使用。
粘附分子来自细胞表面并能够结合到另一种特异性的细胞表面产生的分子。选择蛋白和CAM分子为粘附分子的实例。
T-细胞刺激肽、-抗原、蛋白和T-细胞抗原可交互使用并且是指能够在免疫过的宿主中刺激特异性T-淋巴细胞克隆增殖的分子从而导致T-淋巴细胞介导的免疫原性反应以及与特异性T-淋巴细胞克隆起反应的分子。
B-细胞抗原为在受试者或测试动物中与特异性B-淋巴细胞克隆起反应或导致B-淋巴细胞介导的免疫原性反应的分子。
良好(benign)缓冲液为生理上相容性的水缓冲液，pH约6-8，盐浓度约50nM-500mM，优选约l00mM-200mM。
肽或多肽可交互使用以表示2-100或更多个氨基酸长度的聚酰胺。
稳定或支撑的二级结构定义为这里肽优选的构象状态，通过限制肽键的旋转，将肽通过“二级结构的支撑部分”包括进相对固定和界限良好的结构中而获得。
肽氨基酸残基总是从N-末端开始记数，N-末端记为1号。
肽和多肽的序列以氨基端到羧基端的顺序给出。
所有的氨基酸均以本领域常用的一个或三个字母的缩写表示。
如这里所使用的，天然氨基酸为蛋白中常见的L-或D-型的20个氨基酸，如丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、和丙氨酸。
非天然氨基酸包括但不限于D-和L-型ε-氨基己酸、γ-氨基丁酸、α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、α-氨基己二酸、别苏氨酸(allo-threonone)、别异亮氨酸、7-氨基庚酸(7-aminoheptanoic acid)、正亮氨酸(2-氨基己酸)、正缬氨酸(2-氨基庚酸)、δ-氨基戊酸(5-氨基庚酸)、l1-氨基-十一烯酸(undecanoic acid)、t-丁基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、γ羧基谷氨酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、同型瓜氨酸、同型精氨酸、同型苯丙氨酸、δ-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸、异天冬酰胺，异谷氨酰胺、异丝氨酸、青霉胺、苯基甘氨酸(phenylglycine)、甲状腺素、鸟氨酸等。
术语氨基酸指2个基团。
PNA或肽核酸物质由非天然氨基酸的肽链所组成的分子，非天然氨基酸选自其侧链中含有天然DNA-或核碱基(nucleobases)的氨基酸(见EO 95/01369)。
发明描述
提供通用的非树状肽载体是本发明的目的，其中的肽载体以预定特定的排列、定向及化学计量提供高密度的生物活性部分呈递。核心肽载体在为非免疫原性的且构件体在化学上上清楚的。偶联的抗原十分有效地呈递，从而很大程度地增加了它们的免疫原性，因此该复合物可单独或与Iscom-形成剂或其它佐剂一起用作免疫方法。
本发明定义的寡肽(非树状肽载体)包括一个以上可接近的官能团，此外通过强的疏水部分，优选长链脂肪酸如棕榈酸或豆蔻酸衍生于一个或更多个位点，并通过其C-末端氨基酸结合到称为固相的聚合物上。在所述的寡肽上，抗原本体通过直接的合成或偶联“en bloc”的化学法加以偶联，从而导致可从固相上切下其完整本体的分枝复合物并可进行特征分析且如果必要用标准方法从其中进行纯化。
本发明进一步包括用于合成寡肽及合成分枝复合物的方法。
非树状肽载体可用活性酯或原位/预激活的氨基酸(如溶于NMP TBTU/HOBt/NMM的)、氨基酸活性酯或对称的酐(见如Atherton 1989)于固相上通过标准的Fmoc-化学而合成，其中的固相包括商业上可得到的的聚合物如Polyhipe,Wang,Novasyn以及任何其它可以衍生且不溶于合成中所用溶剂的其它聚合物。依据固相聚合物的类型，取代度应该为每克固相0.01-0.1，优选0.05-0.1，且更优选约约0.05毫当量(mequivalents)。可得到商业上可得到的Novasyn KB树脂用于肽偶联，其中的树脂含有HMB-接头(4-羟基-甲基苯甲酸)，羟基约0.150毫当量每克。然后通过肽C-末端氨基酸残基在短时间内的孵育而酯化得到每克0.05毫当量的，仅导致接头羧基的部分替代。随后，在偶联氨基酸的α-氨基去保护之前，通过在酯取代度化催化剂N,N-二甲氨吡啶(dimethyaminopyridine)(DMAP)存在下与大量过剩的乙酸酐孵育而封闭其它的自由羧基。肽合成以后，可切割HMB以形成自由酸、氨甲酰、酰肼等。肽与固相之间的键可以是但不限于由碱可切割接头所构成。利用侧链的正交或梯度保护、α-氨基保护及接头的稳定性的任何其它策略都是容易控制的。在优选的方法中，赖氨酸残基的ε-氨基被正交保护成如Fmoc-K(Mtt)-OH,Fmoc-K(Dde)-OH及Fmoc-K(Aloc)-OH,其中的侧链保护基可分别通过1％TFA、2％肼和Pd(0)(催化加氢)而去除。合成以后，可完成α-氨基脂-偶联和选择性赖氨酸侧链解蔽、支链肽或部分的合成和偶联而没有干扰骨架肽其它氨基酸侧链，尤其是来自E的羧酸解蔽官能团的风险。如果使用未保护的基团，由于在分枝肽合成或偶联过程中羧基激活种类的产生或存在，此侧链羧基可与在分枝肽合成或偶联过程中产生的任何自由氨基或骨架赖氨酸本身的氨基形成内酰胺。
含有2种对赖氨酸保护的骨架肽载体也是优选的，其中选择性可切割的一种用于附着位点赖氨酸以及位于“c”-非附着位置的Boc保护的赖氨酸。
尤其优选的是固相骨架肽复合物，其中选择性保护的赖氨酸残基的亚基在去保护后构成附着位点，并且其中所有其它的保护基以及固相接头通过相同的化学处理，优选通过具有适当清除剂的95％TFA而切割。
其它优选的这种类型实施方案包括具有苄酯侧链保护氨基酸的Boc-化学、经碱不稳定接头如HMB连接至固相上的肽、3-硝基-4-(2-羟乙基)苯甲酸(NPE)、4-硝基二苯酮肟(4-nitrobenzophenone oxime)或可光切割的种类如酸稳定的2-溴丙酰基-α甲基苯乙酮酯(2-bromopropionyl-α methylphenacyl ester)、Fmoc-化学(tBu和Boc侧链保护)结合典型的Boc-接头(仅可通过HF或TFMSA切割)如取代的苯甲酯(氯甲基苯或4-羟甲基苯乙酸(PAM))、导致HF上的肽羧酰胺(carboxamide)可切割或可光切割的benzhydrylamine衍生物如上述的α-溴-苯甲酰甲基型、3-硝基-4-羟甲基苯甲酸(ONb)、和3-硝基4-氨甲基苯甲酸(Nonb,导致肽羧酰胺)。2种策略均可与在微弱的亲核物质存在下可由Pd(0)催化加氢而切割的羟-巴豆酰型接头一起使用(见如Atherton)。一组特别有用的接头为水可切割的部分如羟基乙酸衍生物(Hoffmann 1994)。
在一个实施方案中，本发明包括非树状脂肽载体(“骨架”)，优选由10-50个氨基酸所组成并具有α氨基-结合的脂肪酸，优选为棕榈酸或豆蔻酸或三棕榈酸(tripalitate)-Cys(见图4C)，并通过其C-末端羧基官能团经特异性可切割的接头共价结合到固相上。
这种肽优选在偶联到固相上的碱可切割HMB-接头上合成。对于赖氨酸(K),Boc(叔丁氧羰基-)使用了酸不稳定的侧链保护。保护固相的结合肽链合成以后，氨基端的Fmoc-基团通过以哌啶处理而去除，且棕榈酸作为对称的酸酐或通过NMP中的TBTU/-HOBt/NMM偶联直至Kaiser测试为阴性为止。随后，通过TFA/水(95％,1小时，室温)或TFA/DCM(50％,6次30分钟，室温)对赖氨酸进行侧链解保护并在进一步使用或干燥和储存之前充分冲洗。肽在固相上的最佳的上样密度一般低于官能团在固相上的其始密度。上样密度在酯化步骤中(第一个氨基酸偶联至固相)通过变化孵育时间而得到控制；短的孵育时间得到较低的上样密度。发现使用Novasyn树脂时最佳上样密度为每克固相0.05-0.1毫当量的范围。
附着分枝部分以后，该复合物可通过NaOH水溶液的切割而释放成自由酸。通过以甲醇铵(methanilic ammonia)切割，释放出肽酰胺，对于支撑α-螺旋结构来说C-末端酰胺更为优越。在DMF或NMP中以肼切割导致肽酰肼。
脂肽骨架含有许多自由可接近的官能团，优选氨基，优选多于2个，沿肽链空间平均排列。在此结构的变异中，脂肽骨架含有羧酸酯(carboxylates)作为官能团。在另一变异中，包括巯醇作为官能团。在另一变异中，羰基、卤代乙酰基(haloacetyls)、酰肼、α-氧代酰基(oxoacyl)、氨基氧乙酰基(即羟胺)、半胱氨酸、马来酰亚胺-基通过化学方法从伯氨基中得到。抗原整体或其它分子可逐步或一总(en bloc)偶联至这些骨架肽基团上并且可以是肽/碳水化合物/半抗原。
肽可容易地逐步化学合成于氨基一级侧链，优选合成到赖氨酸的ε-氨基或鸟氨酸的δ-氨基上。这些基团也可作为未保护肽、碳水化合物或含有适当官能团的任何其它整体的化学选择连接(见下面)的靶子而起作用。一总(En bloc)偶联可通过本领域众所周知的交联蛋白-蛋白及肽-肽的化学方法完成，包括对分子中待偶联的侧链官能团的暂时保护方法。这种优选的偶联方法包括：以戊二醛的偶联(偶联至氨基-和巯基)、碳二亚胺(偶联至氨基)、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(氨基-巯基的偶联)、经氧化后再经与伯氨基的反应与还原的碳水化合物、通N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)-(SPDP)的巯基方法(见如van Regenmortel1988)。
优选的暂时保护方法包括柠康酸化(citraconylation)(伯氨基保护，保护基团通过低的pH释放)和通过Fmoc-琥珀酰亚胺(伯氨基保护，保护基团通过哌啶释放)的Fmoc-衍生。除了通过有机溶剂中羧基激活的偶联外，侧链封闭的合成肽也可通过这种方法偶联。
优选的用于一总偶联的方法为“化学选择性连接”(由Tam(1995)综述)，因为这些方法可用于未保护片段的偶联，尤其是肽，且尤其是合成肽，此外还允许偶联极性或方向得以控制。这些方法已经用于偶联肽-肽骨架包括MAPs(如Lu 1991)和TASPs(如WO 95/04543)。
优选化学选择方法的典型实例为疏基亲核物质(thiolnucleophile)与适当的亲电子基团之间的反应。一种这样的反应为卤代乙酰基、优选氯乙酰基且更优选溴乙酰基与烷巯基(alkylthiol)之间的反应从而导致非常稳定的硫酯键的方便的形成(Wetzel 1990,Robey 1992)。通过偶联半胱氨酸可将烷巯基导入肽或其它分子的任何部位，并且通过与卤代乙酸酐的反应卤代乙酰化可在一级氨基上容易地进行(如Robey 1992)。它也可以在肽合成过程中用完成的衍生物与已经作为侧链插入的卤代乙酰基而导入(Ivanov 1995)。在优选的实施方案中，将卤代乙酰基导入结合到固相上的肽骨架脂肽的自由ε-氨基上并且待附着的肽或分子在所需位点以半胱氨酸修饰(如Lu 199l和Tam 1993)。类似且也优选的反应通过酰基巯基(硫代羧酸酯)(acylthiol)(thiocarboxylate)与卤代乙酰基的反应而获得，从而形成了硫酯(Schnolzer 1992)。酰基巯基可在待偶联肽的C-末端形成(通过常规已知的固相肽合成方法(Yamashiro 1988))；通过该方法，无须导入半胱氨酸。硫酯在中性和碱性pH值下不稳定。然而，如果让反应在N-末端半胱氨酸与酰基巯基之间发生，自发的重排导致稳定的酰胺键和半胱氨酸侧链巯基的重建(Dawson 1994)。该巯基如果不必要，可用本领域已知的方法封闭(烷基化)。其它与巯基的选择性反应包括与马来酰亚胺基的反应(添加反应)，从而导致稳定的硫酯。马来酰亚胺基可通过酰化一级氨基或在固相肽合成过程中作为N-末端整体的偶联而导入(见Tam 1995)。
导致新的二硫化物形成的巯基二硫化物交换反应也可优选作为SDP-偶联策略(Carlsson 1978)。此共价结合当然对还原一件很敏感，因而可用于有意识地释放分子。化学选择反应的另一个优选的实例为醛与弱碱之间的反应，优选为醛与hydrazide(酰肼)之间的反应从而导致可被还原成稳定替代肼的相对稳定的腙(见如Tam 1995)或醛与羟胺的反应而导致稳定的肟(Rose 1994)。这些反应可用于经碳水化合物的醛基选择性地偶联还原性碳水化合物或良性氧化的碳水化合物(单体、二体、寡聚体、多聚体或作为由高碘酸氧化的糖缀合物的一部分。羟胺或酰肼与由高碘酸氧化的N-末端丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸(它们对导致在肽N-末端选择性导入α-氧代酰基(oxo-acyl)的氧化特别敏感)，优选与丝氨酸的反应导致羟胺或含有酰肼的肽与其它肽的N-末端选择性的化学偶联(Rose 1994,Gaertner 1992)。通过肼切割连接酯可将酰基替代肼(酰肼)导入通过HMB-接头结合到固相上的固相肽中。同样，通过以Boc-单肼琥珀酸或以4-Boc-单肼苯甲酸得到自由的一级氨基，可将酰肼导入。通过与被保护的氨基氧乙酸的反应可方便地将羟胺导入(见Tam 1995)。在另一种方法中，通过保护的缩醛链烷酸(对HF不稳定因而限于固相肽合成的Fmoc策略)可将羰基导入一级氨基中(见Tam 1995)。特殊而优选的方法包括醛与N-末端丝氨酸之间的反应以产生噻唑烷。此方法特别有用的方面是其导入了可提供偶联肽构象稳定性(“刚性”)的杂环。
从上述偶联化学的实例，很显然，有了本发明，抗原可经大量的官能团偶联且抗原可以任何所需的方向偶联至非树状骨架肽上；同样，很显然，合成(保护或未保护)以及天然得到的肽可被偶联，以及其它抗原，特别是碳水化合物。
设计本发明脂肽非树状骨架以及完整的分枝复合物以在水环境中折叠成高度有序的结构。在实施例1中研究的特别优选及权利要求的实施方案中，寡肽的氨基酸序列通过赋予寡肽形成两亲性平行α-螺旋(同型二聚体卷曲)(homodimeric coiled coils)倾向的重复“heptads”的数目来定义。这基于下面的设计考虑：
作为表面残基(a和d位置)，I、L和V是优选的。作为顶部和底部残基(e和g位置)，D和E及K、R和H分别是优选的。外部(非相互作用)残基(b,c和f位置)可得到其它的相互作用，包括如内酰胺桥的形成、组氨酸螯合、和附着位点。平行装配的优先是常见的，且当强的疏水相互作用存在时(如I-L)，同二聚化是优选的，甚至当充电样(like-charged)的e和g对存在时，但带有相反电荷的e和g对有利于同二聚化形成。
二聚体卷曲为浓度依赖性的，不适合体内使用。本发明的目的是通过导入其它的稳定要素，一般为脂质成分而消除或降低浓度依赖性。
选择基本的heptad作为VAKLEAK。V和L在链-链相互作用的a和d位置构成了大的疏水基。E和K在e和g位置提供相反的电荷，从而有利于平行包装。除了c(用于K在螺旋的外侧产生侧链附着位点)之外，具有高度螺旋倾向的残基A占据了其余的位置。
基本的序列修饰成应用的序列：
    abcdefgabcdefg
Palm-avhklehkvakleakgkgky,Palm＂代表α-N-附着的棕榈酸。
该肽具有稳定的螺旋形成所需的最小长度(2个转角)。HX3H导入到2个分离转角的彼此相对的螺旋外侧以产生表示和稳定-螺旋的金属螯合位点。N-末端电荷通过α-N-附着的棕榈酸加以封闭且N-末端电荷(其也抵消α-螺旋大偶极(macrodipole))优选封闭成如酰胺。然而添加C-末端GKGKY-序列以用作封闭电荷的α-螺旋C-末端加帽序列。此外，该非-构建的延伸可经其C-末端残基偶联至其它基团上而不影响螺旋的稳定性。包括进Y作为280nm的吸附受体基团和K残基作为附着基团。
在另一种优选的设计中，为了在去保护后随后附着到其它K-残基的侧链分枝时保护g-位置上的稳定正电荷，选择性地保护g-位置上的K残基。
在另一种优选的实施方案中，b-位置也被K-残基占据以在螺旋的外部产生更多的附着位点。
在另一种优选的实施方案中，在一种heptads，优选N-末端的heptads的连续的b和f位置的外部残基之间，通过以E/K对替代H-残基而形成内内酰胺桥、稳定的螺旋。这可由熟练的操作人员利用这些侧链的正交保护和通过BOP/DITA或TBTU/HOBt/NMM影响内酰胺形成或类似的仍附着到固相上肽的原位激活方法而容易地完成。
此复合物的结构导致附着抗原整体向环境高密度的呈递，这或者通过该结构的脂质部分与疏水表面的相互作用或自身聚集成分子团而进一步加强而完成，两种情况甚至在低浓度时仍维持二聚体-结构。
此外，附着肽抗原的紧密包装允许支撑肽中固有构象特征的相临链间的相互作用，继而增加了该肽与作为多肽序列一部分的相同肽构象的类似性，这是本领域通过短的合成肽而模仿天然表位的重要考虑。可导入其它的肽(“辅助”肽)，如T-细胞刺激肽。
因此该结构代表了总合成的完全化学定义的免疫原。当获得时，肽载体部分(脂质肽骨架)本身没有免疫原性。以下是脂肽骨架的特征，包括其可通过标准的固相化学方法合成并且抗原、肽、碳水化合物或半抗原以及天然得到或合成的分子可通过已知的方法偶联至结合预制固相的脂肽上且该肽可通过已知的固相肽合成方法直接合成于结合固相的结构上。从固相释放后，所有的复合物形成稳定的聚集体(aggregate)从而可通过HPLC分析并用于免疫。附着肽可以测序而不影响寡肽脂肽。当与Iscom-形成物质一起配制时，该复合物通过其脂质部分插入到Iscom-膜中，在外部呈现出分枝结构。
在固相化学的特定变异体中，可完成同时合成但分别释放结合的肽-聚合物以及游离肽。以该游离肽免疫后能够测试获得抗体的反应性常是有用的。在另一优选实施方案中的脂肽-结构被设计成呈递游离氨基端。这通过偶联分子的脂质部分与至内部氨基酸的侧链而完成。该脂类-偶联的侧链优选位于或靠近脂肽的一个末端。
在另一种方案中，基本的结构或者作为脂肽的完整部分或者作为偶联抗原的一部分与其它(辅助)肽(T-细胞表位，吞噬作用激素(tuftsin)或其它的免疫调节物质)结合。
在本发明的变异体中，此结构被设计从而在线形序列中插入肽抗原作为环，产生也将插入脂膜(lipohilic membranes)的模仿环(loop-mimetics)。
在另一实施方案中，该结构仅作为附着碳水化合物至脂膜上的锚定物而起作用。在该形式中，肽作为酰肼而合成，该酰肼与柔和氧化的碳水化合物的羰基具有高度的反应性，并且此肽序列插入了T-细胞表位、吞噬作用激素或其它的免疫调节辅助肽。通过肼切割4-羟甲基苯甲酸而获得该肽酰肼。
在该结构的另一实施方案中，为了通过杂交结合特定的DNA部分，可包括特异性的“肽核酸”(“PNA”)或DNA-嵌入物质(DNA-intercalating substance)。
除了用这种构建体进行免疫而诱导抗抗原分支的抗体外，本发明也包括用这种构建体作为治疗及诊断方案。
本发明也涉及用根据本发明固相复合物肽的诊断实施方案、含有所述肽的诊断组合物及其用于诊断疾病或妊娠的方法。本发明进一步涉及其疫苗成分包括连接上免疫原性物质的固相复合物肽的疫苗以及免疫动物和用所述的疫苗成分赋予对疾病抗性的方法。
本发明另一个重要的方面涉及其中的治疗剂被连接到固相复合物肽上的治疗组分、含有该治疗组分的治疗组合物以及其对治疗和/或预防疾病或免疫反应调节的作用。
在本发明临床诊断实施方案中，连接到固相复合物肽上形成本发明诊断组分的诊断试剂可与适当的方法如，标记联合使用以通过其结合到诊断组分上而测定特异性分子的存在。特别地，本发明涉及源于细菌、病毒和寄生虫的传染病的诊断以及癌症、恶性肿瘤和自主免疫疾病的检测。此外，通过将能够结合到标识分子或来自妊娠的分子连接到本发明的肽上，本发明可用于检测妊娠，因此该方面也构成本发明另一个感兴趣的部分。
待连接到本发明固相复合物肽上的诊断试剂可以是任何分子。其可自然得到或化学合成。本发明特别感兴趣的方面是连接以下的分子，包括多肽、碳水化合物、脂类、或其任何糖基化或脂化的形式或核苷酸序列，该核苷酸序列能够结合来自妊娠或疾病的分子或它们的标识分子，疾病包括癌症、自主免疫疾病和传染病。
典型的检测方法可利用如，放射性种类、酶活性或其它标记配体如抗生物素蛋白/生物素和半抗原/抗-半抗原检测系统，它们可直接或间接检测。在优选的诊断方案中，人们可能倾向使用酶标记如碱性磷酸酶或过氧化物酶而不用放射性或其他产生不良环境影响的试剂。酶标记，如经常利用可容易用分光光度计测量的生色指示底物，它们中的许多位于可见光范围。为了更高的敏感性可用发光底物。
本发明一个特别感兴趣的实施方案是用抗原作为诊断试剂。在免疫诊断和疫苗制备中，从已知免疫原性多肽或碳水化合物的片段制备抗原常是可能的而且也是更为实际的。一些表位区可用于产生类似于整个抗原多肽或碳水化合物产生的反应。通过众多方法中的任何一种，如Kyte-Doolittle,抗原性分析(见如，Kyte和Doolittle,1982或美国专利No.4,554,101)，可鉴定潜在的抗原性或免疫原性区域。疏水性分析确定了每个氨基酸残基的平均疏水值并且从这些值可计算平均亲水值并测定具有最大亲水性的区域。
优选的免疫分析包括本领域已知的各种酶联免疫分析(ELISAS)、免疫印迹技术等。然而，容易理解并不限于这些使用方法，且有用的实施方案包括放免分析(RIA)和其它非酶连抗体结合分析或方法。本发明的其它免疫诊断实施方案可基于免疫沉淀分析，凝集分析等。
诊断妊娠或疾病的方法也包括进本发明。在一个实施方案中，基于抗体的方法包括从被怀疑患病或妊娠的病人中获取样本、将该样本暴露至本发明的诊断组分，后者上连接有来自待诊断疾病或其标识性的多肽、碳水化合物等的一个或更多个表位，且最后测定样品中抗体与一个或更多个这样的表位的反应性。检测的实质性的免疫反应性是该疾病存在与否的标志。从病人中可获取的典型样品包括人血清、血浆、全血、脑脊液、精液或阴道液、渗出物等。
可发展基于抗原方法的几种变异，如，仅用附着到本发明肽上一种或几种表位或用多种抗原组合的间接ELISA。最佳的抗原浓度可通过棋盘滴定(checker board titration)和表位或整个分子，如表位从其中产生的多肽或碳水化合物的诊断能力加以测定。该分析可通过在疾病的不同时期测试如实验动物的血清来进一步检测或改善。这些结果可表示每种分析血清转换的相对时间进程。
在进一步的方面，本发明涉及用于检测包括以下分子的试剂盒，包括多肽、碳水化合物或核苷酸序列，后者能够结合到连接到本发明肽的特异性选定的诊断试剂上形成本发明的诊断组分，此外还涉及用于检测诊断组分和能够结合到其上的分子之间的特异性结合的试剂(mean)。合适试剂的实例包括直接附着到诊断组分上的标记、或对诊断组分具有特异性的二级抗体。或者，也可使用抗生物素蛋白-生物素介导的金黄色葡萄球菌结合。例如，可将单克隆抗体生物素化从而与和酶或荧光化合物复合(complexed)的抗生物素蛋白反应。
本发明特别的实施方案涉及用于检测抗连接到固相复合物肽上抗原的抗体。该试剂盒的抗原可以是多肽、碳水化合物、脂类或其一部分或获自天然来源或人工合成的核苷酸序列。或者，抗原可通过大肠杆菌或别的细菌或非细菌宿主中的重组DNA加以制备。用于分析的样品可以是体液或来自人或动物的其它组织样品。样品中活性抗体的存在可通过抗体结合至诊断组分然后通过众多方法中的任何一种，包括ELISA、RIA、荧光、凝集或沉淀反应、浊度测定法或这些分析中用抗生物素蛋白-生物素反应的任何一种分析加以证实。反应性程度可通过与对照样品比较加以评估，且反应性程度可用作目前或过去感染或疾病的尺度。该分析也可用于监测疾病过程中的反应性，如检测治疗的有效性。
术语“实质性的免疫学反应性”意思是指一方面的抗体/抗血清与另一方面的诊断组分在理化参数及诊断组分浓度严格限定的条件下明显的免疫学结合。因此，实质性的免疫学反应性应该可与抗体/抗血清和诊断组分之间的非特异性反应清楚地区分开来。例如，这种区分可通过下面的方法完成，包括将抗体/抗血清与已知浓度且以前显示与该抗体/抗血清没有特异性反应的诊断组分反应，然后用该反应作为阴性对照。阳性对照可适当地为抗体/抗血清与相同浓度的用于免疫而产生该抗体/抗血清的诊断组分之间的反应。
术语“表位”意为抗原的一个空间部分，其负责特异性结合至抗体或T-淋巴细胞的抗原结合部分。
术语“多肽”理解为包括至少2个氨基酸分子通过肽键而结合的分子。因此术语多肽表示小肽(不到10个氨基酸残基)、寡肽(10-100个氨基酸残基)、蛋白(包括以下成分的功能整体：至少一个肽和/或辅基和/或糖基化和/或脂化，如脂多肽和糖多肽等)以及传统的多肽(大于100个氨基酸残基)。用于连接到本发明分枝聚合物上的感兴趣的多肽为可根据一般已知的方法制备的重组多肽。
可单独使用或与连接到本发明肽且所述的连接构成了本发明的重要方面的其它分子联合使用的特别感兴趣的分子为介质或免疫调节剂如细胞因子或在免疫反应调节中，特别是T-细胞反应中具有重要功能的生物活性细胞因子序列。
特别感兴趣的方面是重组体、合成制备的或天然介质的使用，如细胞因子或其具有细胞因子活性的一部分插入到免疫原性复合物如Iscom或其它载体如微粒再加上连接上至少一种其它分子的本发明肽。其它的组合可以是在混合物中带有细胞因子或其具有细胞因子活性的一部分的免疫原性复合物，免疫原性复合物带有分枝的肽-构建体或其可以是带有本发明肽的免疫原性复合物，本发明肽上连接有免疫调节剂的活性部分和其它的肽。相关的细胞因子有白细胞介素l-18、TNE(肿瘤坏死因子)、淋巴毒素、和干扰素-α、-β、-γ。或者，具有细胞因子活性的生物活性细胞因子一特异性的序列可以是连接到本发明肽上的部分序列。
用其中的免疫原性试剂附着到本发明固相复合物肽上的疫苗组分制备的疫苗组合物也是本发明的一部分，与存在于以前没有暴露至感染性生物的动物中抗性程度相比，该疫苗组分的量对于赋予所研究的动物，包括人类抵抗感染性病原体如细菌、病毒或寄生虫的实质上增加的抗性是有效的。因此，本发明也涉及免疫原性成分在制备疫苗组合物中的使用和用本发明的疫苗免疫动物，包括人类从而抵抗感染性生物的方法。
合适的免疫原性试剂包括多肽、碳水化合物、核苷酸序列中的一种或与任选其它物质，如上述的免疫调节剂或能够增加免疫组分免疫原性效应的化学化合物的不同组合。本发明感兴趣的方面包括来自不同感染性生物免疫原性试剂的不同组合，从这些生物中获得能够赋予对多种感染性生物增强的抗性的疫苗组合物。
该疫苗组合物可任选与药物上可接受的载体或赋形剂一起配制且该疫苗可任选进一步包括佐剂。
术语“赋予对感染实质上增强的抗性”疫苗组合物向动物的施用具有以下的效应，即避免或减轻了感染性病原体感染所致的疾病或者至少患病的风险显著降低。
一般地，根据本发明的疫苗组合物制备成可注射的液体溶液或悬液；也可制备在注射之前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式。此制品也可被乳化。疫苗组合物常与药物上可接受的和与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂有，如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等或其组合。此外，如果必要，疫苗组合物就含有少量的辅助物质如增湿或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗组合物效应的佐剂。
疫苗组合物一般为肠道外施用，例如通过皮下或鼻内注射。适于其它方式施用的其它制剂包括栓剂及有些场合的口腔制剂。对于栓剂，传统的结合剂或载体可包括，例如，polyalklene glycols或三酰甘油；这种栓剂可从含有0.5％-10％，优选1-2％活性成分的混合物中形成。口腔制剂包括这种常用的赋形剂如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖化钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉剂的形式且含有10-95％，优选25-70％的活性成分。
疫苗组合物可配制成中性或盐的形式。药物上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)并且与无机酸如盐酸或磷酸，或有机酸如草酰乙酸(acetic oxalic)、酒石酸、扁桃酸等形成。与自由羧基形成的盐也可来自无机基质(base)如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁和有机基质如丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
疫苗组合物以与剂量配方相容的方式和治疗上有效且具有免疫原性的量施用。待施用的量依赖于待治疗的对象，包括如个体免疫系统合成抗体的能力和需要保护的程度。需要施用活性成分的准确的量依赖于医生的判断。然而，用于人的合适的量为每次免疫几百微克活性成分的级别，优选范围为约1ug-500ug，特别是在10ug-50ug的范围中。用于初次免疫和加强的合适方案也是可变的但一般是初次免疫后再进行随后的接种或其它的施用。
使用方式可广泛地改变。任何一种施用疫苗的常规方法均是可用的。认为这些方法包括在固体生理上可接受的基质或生理上可接受的扩散上的口腔使用、通过注射等的肠道外使用，包括鼻内使用和在其它合适身体表面的使用。疫苗的剂量将依赖于施用的途径并将根据宿主的大小而变化。
获得本发明疫苗组合物佐剂效应的各种方法包括以下物质的使用，如氢氧化铝或磷酸(铝)，常用成磷酸缓冲盐水中0.05-0.1％的溶液，混合以0.25％溶液的蔗糖的合成聚合物(Carbopol)，分别通过70-101℃30秒至2分钟的热处理而使疫苗中的蛋白聚集。也可使用通过胃蛋白酶处理的(Fab)清蛋白抗体而重新激活的聚集、具有细菌如C.Parvum或内毒素或革兰氏阴性细菌脂多糖成分的混合物、位于生理上可接受的油性赋形剂如mannide单油酸酯(mono-oleate)(AracelA)中的乳剂或具有20％作为封闭替代物(block substitute)的全氟化碳碳(Fluosol-DA)的乳剂。
在许多实例中，将需要多次施用疫苗，通常不超过6次，更常见不超过4次且优选2或3次种痘。种痘一般以2-12周的间隔，更为常见的是3-5周的间隔。以1-5年，通常3年的间隔的周期性加强对维持抗体的水平将是必要的。免疫过程以后分析抗原的抗体。分析可通过以常见的标记如，放射核素、酶、荧光物质等的标记而完成。这些技术在本领域是众所周知的。
认为本发明的疫苗对激活免疫系统的双臂(both arms)应该是有效的。因此，能够诱发细胞-介导的免疫反应的疫苗也是本发明的一部分。
以本发明疫苗主动免疫动物，包括哺乳动物如人类抵抗至少一种感染原的方法也是本发明的一部分。该方法一般由施用免疫原性有效量的本发明疫苗至动物所组成。
本发明进一步涉及治疗成分，其中包括本发明固相复合物肽，后者上至少连接有一种能够治疗或预防疾病，如传染病、癌症或自主免疫疾病的治疗或预防试剂。该治疗剂可以是任何一种能够作为预防试剂、治疗试剂或作为疾病预防或复发中或妊娠的预防或终止中的试剂。该试剂可以是多肽、糖肽、脂肽、磷脂、多糖、脂多糖、碳水化合物、核苷酸序列或其任何的组合或修饰。
在本发明特别感兴趣的实施方案中，治疗组分包括一种或更多种治疗或预防试剂以及至少一种免疫原性物质或能够控制或加强该治疗或预防试剂效应的免疫介质。该免疫原性物质或免疫原性物质或可以是任何的分子如碳水化合物或肽天然、合成或重组得到的核苷酸，或者介质可以是化学化合物。
本发明也涉及任何含有本发明治疗组分的治疗组合物。包括一种或更多种治疗组分其中含有能够预防或治疗相同或不同疾病或终止妊娠的不同治疗剂的治疗组合物构成了本发明的另一方面。本发明进一步涉及本发明治疗组合物在预防或治疗疾病或预防或终止妊娠中的使用。该治疗组合物可以任何方便的方式施用，包括肌肉内、皮下、皮内、口腔内、鼻内和静脉内施用。
本发明此部分一个感兴趣的方面由治疗组合物所组成，后者包括附着到载体上的本发明治疗组合物，如免疫刺激复合物与至少一种介质或其具有介质活性的一部分。介质或其具有介质活性的一部分可连接到本发明的肽上并可进一步附着到与带有该治疗组分免疫刺激复合物相同或不同的免疫刺激复合物上。特别感兴趣的介质包括免疫调节剂，如细胞因子，包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子或其具有免疫调节剂活性的一部分。
本发明此部分另一个感兴趣的方面包括这样的治疗组分，即其上面附着有能够结合存在于体内，包括人类特定位置靶分子的分子从而介导该治疗组分至其发挥效应的特定位置。能够结合靶分子的分子提供了用于靶向该治疗剂活性的方法。抗或能够结合靶分子的抗体构成了该分子感兴趣的实例。
本发明的另一方面涉及这样的药物组合物，其用于在建立高危产生自主免疫疾病人群后的预防、由感染原导致的自主免疫疾病、癌症或传染病复发的治疗或预防，所述的组合物包括本发明分枝的聚合物，其上连接有治疗剂或不同治疗剂的组合。该药物组合物可基于药物上可接受的赋形剂根据已知的方法加以配制。
此外，本发明涉及根据本发明的药物组合物在抵抗、预防或治疗传染原、自主免疫疾病或癌症中的使用。
可以下面的方式使用非树状肽，即不添加或添加佐剂如弗氏佐剂和氢氧化铝或插入或不插入到免疫刺激复合物(Iscom)或脂质体中。
为了免疫的目的，可使用任何品系的小鼠(近交和远交)、大鼠、豚鼠、水貂或其它动物。人和动物均可以非树状肽免疫。免疫的数目和间隔可以改变。本发明非树状肽载体-免疫原性复合物可以腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内、口腔、鼻腔、肛门、阴道等免疫而使用。此外，非树状肽载体-免疫原性复合物也可用于诱导amamnestic反应。
发明详述
一方面，本发明涉及非树状肽载体，其通过其C-末端经可特异性切割的接头偶联至固相上而形成肽载体-固相复合物。非树状肽载体优选包括约10-50个从固相释放后在良性缓冲液中能形成二级结构的氨基酸，该肽复合物进一步包括偶联到其中的免疫原性物质。在良性缓冲液中的二级结构当从固相释放时导致非树状肽载体的稳定功能。偶联至非树状肽上的免疫原性物质包括共价偶联到其中的抗原性物质。
二级结构可以是α-螺旋、β-链、β-转角、γ-转角、锌指(Zinc-finger)结构及其组合。此结构的主要功能是保证此免疫原性物质以稳定而可预见的形式呈递给环境。因此，任何一种在给定环境中提供该免疫原性物质合适定向的二级结构均在本发明的范围之内。
两亲性α-螺旋一般研究得比较彻底(如Mant 1993)并且为在水中维持良好构象的相对简单的肽结构。两性螺旋具有沿着其轴占据一半螺旋的疏水一侧和另一半的亲水一侧。两亲性α-螺旋一般以“束状”结合以遮住疏水的表面且暴露亲水一侧以形成平行或反平行的同型二聚体(Zhu 1993)或异二聚体和寡聚体(Zhu 1992)。
两亲性螺旋一般具有由α-螺旋转折周期率所决定的“heptads”特征，其中的位置a、b、c、d、e、f和g被氨基酸按一些简单的规则占据：位置a和d主要由疏水性氨基酸(特别是亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸和较低程度的丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)而其它位置除了脯氨酸和甘氨酸外对任何其它氨基酸开放；可能有的残基具有形成高度螺旋的倾向(丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异亮氨酸)。
由α-螺旋对联合形成分子内复合物的准确安排可通过其它的设计规则(见如Mant 1993和Zhu 1993)进一步加以限制，如通过选择不同疏水性和大小的a/d残基(改变“大”和“小”(如分别为丙氨酸和亮氨酸)使平行包装去稳定且使反向平行包装稳定化)切通过选择相反电荷(有利于平行方向)或相同电荷(有利于反向-平行方向)的e和g位置(见如WO95/31480和Chang 1994)。
很显然这种结构特别坚固通用，具有诱人的简并性(degeneracy)从而增加了设计的自由度(见如Kamtekar,1993的“半随机”(“semirandom”)设计)。形成螺旋所需肽的长度在化学合成的范围之内(最小长度约15-20个氨基酸(Kamtetar 1993,Bryson 1995,Fezoui 1995))。由α-螺旋中H-XXX-H组氨酸对螯合的金属离子可用于探测和稳定α-螺旋结构。
二级结构可通过金属离子螯合以及内酰胺或二硫桥而进一步稳定化。
根据本发明的非树状肽载体也可包括2种或更多种不同二级结构的混合物。这种混合结构的实例将经常包括α-螺旋，如两个α-螺旋通过β-转角结合。此外，非树状肽可部分包括没有严格定义二级结构的肽，包括随机卷曲组、Ω-环和未定义的环或其组合。严格定义结构的肽或肽片段对非树状肽载体在良好缓冲液中形成二级结构没有影响。此部分中没有二级结构的氨基酸数目有利于本发明非树状肽载体的整个数目om氨基酸。
特定而严格定义的金属离子稳定化的复合结构为DNA-蛋白结合特征性的“锌-指(Zinc-finger)”区域，具有Y,F-X-C-X2,4-C-X3-F-X3-H-X3,4-H的一般结构，其中的X可为任何氨基酸(Krizek 1991)且其中的Zn++由两条不同链的C和H残基呈四面体结合(tetrahedrally coordinated)。得到的Zn支撑的ββα-结构在水中是稳定的。A26氨基酸残基连续序列已由Krizek(1991)鉴定(PYKCPECGKSFSQKSDLVKHQRTHTG)并由Bianchi(1995)用于构建组合库而研究α-螺旋沿肽链替代的稳定性。该结构(1996)称为基于锌指序列但不需要锌支撑的23个氨基酸残基的构象稳定结构。
在一个实施方案中，即由于由单体超二级发夹结构中的转角结合的2个α-螺旋在分子内的反向平行排列，肽载体在良性缓冲液中形成两亲性螺旋的非树状肽形式。
优选地，非树状肽通过螯合选自Cu++、Co++、Zn++、Ca++、Ni++和Cd++的二价金属离子而稳定。
一般地，非树状肽载体的二级结构通过分别包括进一个或更多个α-螺旋-、β-链-、转角或氨基酸的锌指诱导序列或其组合的肽而获得。
在一个实施方案中，该二级结构可通过下面的成核结构分子构建单元(structure-nucleating molecular building blocks)加以诱导：
1)α-螺旋诱导物氨基异丁酸、具有甲硫桥(thiamethylen bridge)和HX3H的acetylpropylprolin、可由C替代的任何一个H-残基、螯合的二价金属离子；和
2)β-链诱导物4-(2-氨乙基)6-二苯并呋喃(6-dibenzofuran)和diacylaminoepindolidione和HXH、可由C替代的任何一个H-残基、螯合的二价金属离子；和
3)β-转角-诱导物(S)-α-甲基脯氨酸和HX2H，可由C替代的任何一个H-残基、螯合的二价金属离子；和
4)一般稳定的分子构建单元如脯氨酸和噻唑烷。
在另一个实施方案中，该肽通过其C-末端连接到双分枝(dibranching)分子产生平行的双分子肽。此双分枝分子在本领域是已知的如鸟氨酸和赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的非树状肽载体产生α-螺旋卷曲型的平行同型二聚体。
对于免疫原性物质的附着，在一个实施方案中，本发明的非树状肽载体带有至少2个附着位点，一般定义为可衍生或可接近的官能团。这些官能团包括羟胺基-、氨基-、hydrozy-、巯基-、环乙酰基-、羰基-、α-氧代酰基(oxoacyl)、硫胺基-(thiolamin-)、酰肼、烷巯基(alkylthiol)、硫酰基(acylthiol)、羧化基及其混合物。附着位点的数目根据终产物中所需免疫原性物质的数目加以选择，因此，非树状肽可包括至少4个附着位点或根据肽长度可能的任何其它所需的数目。
附着位点可为本领域已知的官能团。优选的附着位点选自赖氨酸侧链中的ε-氨基或衍生的ε-氨基和自由α-氨基。在一方面，根据本发明的非树状肽载体包括偶联至最初附着位点赖氨酸残基ε-氨基上的赖氨酸残基ε-和/或α-氨基，因而导致双功能性附着位点，或者，通过进一步以赖氨酸残基衍生成多功能性附着位点。双功能性附着位点的一个官能团，或多功能性附着位点的至少一个官能团在一方面可以封闭。该封闭可通过如以Fmoc-和Boc-切割的正交化学处理来保护可切割基团而进行。保护基团包括Dde(1(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己胺(dioxocyclohexylidine)-乙基)和烯丙(allylic)保护基如Aloc(烯丙氧羰基)(allyloxycarbonyl)。
上述方法的优势为引入所谓的“正交”策略分别用于α-氨基保护和侧链官能团保护和固相连接。“正交化学”意为一种类型的保护基对用于切割另一种保护基的化学处理保持稳定并且反之亦然。这其中的一种十分流行的策略利用了碱不稳定的芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基保护基和侧链酸不稳定保护基以及酸不稳定“接头”。已知有对于如，酸、碱、水等具有不同稳定性的接头范围，从而导致肽释放为自由酸或特异性衍生物，最典型的为酰胺。
本发明的非树状肽载体也可包括位于附着到该C端氨基酸上的侧链的二个或更多个氨基。
在另一个实施方案中，根据本发明的非树状肽载体可包括在其它赖氨酸残基侧链上的ε-氨基和游离氨基亚类，所述的亚类包括至少一种这样的被保护基保护的氨基，其中的保护基可由Fmoc-和Boc-切割的化学处理的正交化学处理而切割。
在一方面，用作附着位点的氨基可进一步通过下面的化学方法得到：
1)以二价酸酐(di-acid anhydride)，优选琥珀酸酐处理以得到游离侧链羧酸，和
2)以卤代乙酸酐，优选以溴乙酸处理以得到游离的卤代乙酰基，优选溴乙酰基，和
3)以激活的顺丁烯二酰亚胺，优选m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯处理得到游离的顺丁烯二酰亚胺基，或用SPDD处理得到游离的吡啶基二硫基，和
4)以羧基-激活的α-氨基-保护的半胱氨酸处理以产生游离的巯基，和
5)以羧基-激活的α-氨基-保护的半胱氨酸处理以产生游离的巯基，然后通过α-氨基的解保护以产生游离的l,2巯基-硫-氨基，和
6)以谷氨酸或天冬氨酸处理以产生游离的侧链羧基，和
7)以氨基-氧代乙酸(oxyacetic)处理以产生游离的羟胺基，和
8)以α-氨基-保护的、羧基激活的丝氨酸处理以在α-氨基-解保护后产生游离的l,2-氨基乙醇(aminoalcohols)，其反过来又可被氧化成游离α-氧代酰(oxoacyl)基，和
9)以Boc-单酰肼琥珀酸处理以产生的游离酰基取代肼。
根据本发明的非树状肽载体也可包括用作附着位点的侧链官能团，它们通过支持二级结构的且可衍生的构建单元衍生：
1)α-螺旋诱导物氨基异丁酸、具有甲硫桥(thiamethylen bridge)和HX3H的acetylpropylprolin、可由C替代的任何一个H-残基、螯合的二价金属离子；和
2)β-转角-诱导物(S)-α-甲基脯氨酸和HX2H，可由C替代的任何一个H-残基、螯合的二价金属离子；和
3)β-链诱导物4-(2-氨乙基)6-二苯并呋喃和diacylaminoepindolidione和HXH、可由C替代的任何一个H-残基、螯合的二价金属离子；和
3)一般稳定的分子构建单元如脯氨酸和噻唑烷。
在一个实施方案中，用作附着位点的非树状肽载体侧链官能团可以选自图4A和图4B中描述结构的双分枝残基而衍生。
在一方面，非树状肽载体包括至少2个位于附着到C-末端氨基酸，优选赖氨酸侧链上的游离的羧酸或氨基，或所述的侧链附着于靠近C-末端的氨基酸，所述的非树状肽进一步包括不是由羧酸构成的其它附着位点。与用于对掺入到肽的剩余部分中氨基酸的保护和在骨架肽合成处理之前对侧链羧基的解闭相比，用于制备侧链中包括至少2个羧基附着或靠近C-末端的非树状肽方法的一个实例用对α-氨基的正交保护在选定位于C-末端赖氨酸的ε-氨基上优选通过合成导入一个或更多个谷氨酸或天冬氨酸残基。
同样地，与用于对掺入到肽的剩余部分中氨基酸的保护和在骨架肽合成处理之前对侧链羧基的不解蔽相比，用于制备侧链中包括至少2个羧基附着或靠近C-末端的非树状肽的方法用对α-氨基的正交保护在选定位于C-末端赖氨酸的ε-氨基上优选通过合成导入一个或更多个赖氨酸残基。
为了进一步改善免疫原性反应的免疫原性和通用性，具有佐剂效应的各种脂类可包括进根据本发明的免疫原性化合物中。根据本发明的基本设计已形成适用于多种不同的抗原和其它的实体如该结构中的烷基链。
因此，在进一步的方面，该非树状肽载体可包括一种或更多中烷基链，优选以共价结合到肽或氨基酸侧链上的饱和脂肪酸形式。上述烷基链的碳链可包括约4-25个碳原子如6-20个碳原子，优选7-17个碳原子的长度。在优选的方面，该碳链为包括棕榈酸或豆蔻酸或其混合物的脂质部分。这种脂质部分的一个实例为如图4C中所示的免疫刺激性palm3-Cys-分子。
在一个感兴趣的实施方案中，根据本发明的非树状肽载体包括至少一种以硫酯，优选经半胱氨酸侧链巯基结合至肽上的脂质成分。
一方面，该脂质成分通过偶联至赖氨酸和丝氨酸侧链上的脂肪酸，一般为棕榈酸或豆蔻酸所提供。赖氨酸和丝氨酸可构成线形肽链并且优选为交替的手性，即D-氨基酸后接L-氨基酸且L-氨基酸后接D-氨基酸。
在进一步的实施方案中，该非树状肽载体包括脂质部分如位于或靠近C-末端的棕榈酸或豆蔻酸。一方面，此肽不包括游离且可接近的侧链官能团而包括为保护的N-末端α-氨基是优选的。
根据本发明非树状肽载体的一方面为包括20-50个氨基酸且其序列中包括具有“abcdefg”形式的重复“heptad”的载体。优选地，位置“a”和“d”被疏水性氨基酸I、V、L、F和A所占据，位置“e”和“g”被带相反电荷的氨基酸E、D和K所占据。位置“b”、“c”和“f”优选被下面的任何氨基酸残基所占据，包括A、R、N、D、E、C、Q、E、H、I、L、K、M、F、S、T、W、或V，但优选为A、S、T、C、H或K，产生2-10，优选4-6个平衡间隔(evenly spaced)具有自由可得到ε-氨基的赖氨酸残基。在优选的实施实施方案中，至少一对组氨酸或组氨酸与半胱氨酸在肽链中占据了连续的“b”和“f”位置。
在一个实施实施方案中，重复“heptad”位于其内部序列中，即，位于相应于从氨基酸2-5至n-2-5)片段，优选相应于从氨基酸3至n-3片段肽段的序列中，其中的n为肽的氨基酸数目。在进一步优选的方面，占据“e”和“g”位置的赖氨酸残基与占据“b”，“c”和“f”位置的赖氨酸残基相比，侧链被正交保护。正交保护基优选对处理，如Fmoc-以及Boc-的切割处理稳定。在另一个方面，至少一个“f”位置由C所占据。
该载体也可包括至少一个，优选一个连接位于末端heptad中“b”和“f”氨基酸的内酰胺桥，“b”和“f”为E和K或K和E，E在两种情况均可由D替代。此外，该载体可包括包括进该序列中的一个Y或W，优选作为2-5 C-末端氨基酸中的一个。
T-细胞辅助对有效的免疫是重要的。T-细胞通过与抗原呈递细胞主要组织相容性复合物(MHC)上结合的肽相互作用而激活。个体的MHC只结合与该个体具有一致序列特征的一组肽(见Rammensee,1995)。“混杂”肽被描述为被大量个体的包括这里大部分种类的MHCs所结合的肽。在待免疫的肽构建体中掺入T-细胞刺激部分的技术是众所周知的。除了一般的“刺激物”包括吞噬作用激素(-=[Thr-Lys-Pro-Arg]N)(如Fridkin 1989)、胞壁酰二肽(MDP=N-乙酰胞壁酰L-丙氨酰D-异谷氨酰胺)(Ellouz 1974)和脂肽(Wiesmuller 1992)或简单的脂类(Flinn 1994,Vitiello 1995)之外，已描述过大量结合至多种MHS-分子上的“混杂”肽(Panina-Bordignon 1989)。这些物质可与肽抗原以线形(如WO 95/00540,Wang 1995,Vitiello 1995和Kaumaya 1993)或分枝的排列(美国专利5229490,WO 93/22343,Pawan 1994,Flinn 1994,Jackson 1995)而结合。Wiesmuller(1992)的脂-结构特别有效(Defoort 1992)并且甚至显示出在具有二聚体碳水化合物抗原的线形构建体中是有效的(toyokuni 1994)。重要的是已发现只含有几种T-细胞刺激肽核心序列的“混合”线形多-抗原表位(重组表达的)刺激所有结合该个体肽的种类(Thomson 1995)。通过DNA-免疫领域已知的方法直接注射这种DNA构建体并以这种方式获得相似的广泛的刺激未被证明但是可能的。
可附着肽的DNA结合物质包括非特异性结合DNA的嵌入剂(如喹啉(Brown 1994))和可与DNA以序列特异性方式杂交的肽核酸(PNA)(WO 95/01369)。
同样，也可包括特异性的免疫调节剂如，细胞因子或细胞因子片段(如，Kumaratilake,1995，欧洲专利0 604 727 A1)。
因此，为了避免主要组织相容性复合物的局限性，除了免疫原性物质外，特异性T-细胞刺激肽可包括进本发明的免疫原性复合物中。这可通过用正交化学或通过附着复合的线形构建体的肽合成加以完成。
因此，本发明的非树状肽可包括一个或更多拷贝的肽部分或多个肽部分的组合。在一个实施方案中，该肽部分可以其侧链和N-末端-封闭的形式位于非树状肽载体一个或两个末端。这种肽部分的实例包括以下内容：
1)[TKPR]N，其中的N优选为1-5(吞噬作用激素寡聚体)、胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰L-丙氨酰D-异谷氨酰胺)或其变异体，和
2)选自以下的T-细胞刺激肽，包括QYIKANSKFIGITE(破伤风类毒素830-843)和FNNFTVSFWLHRVKVSASHLE(破伤风类毒素947-967)、DQVHFQPLPPAVVKLSDALI(结核分支杆菌38 kD抗原350-369)、DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)环子孢子蛋白378-398)、KLLSLIKGVIVHRLEGVE、麻疹病毒F-蛋白286-302、LDNIKGNVGKMEDYIKKNNK(恶性疟原虫MSP-1,260-279)、LQTMVKLFNRIK、NSVDDALINSTKIYSYFPSV、QYIKANSKFIGITELK和PGINGKAIHLVNNESS；和
3)选自多T-细胞表位的T-细胞刺激肽，其中的T-细胞表位成分以基本上线形的构建排列，包括嵌入的最小T-细胞表位肽片段，优选没有侧翼序列，和
4)细胞因子源生肽，选自
IFN-γ(1-39)HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG,
IFN-γ(95-133)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC，
TNF(70-80)PSTHVLITHTI
IL-1β(163-171)VQGEESNDK；
及其组合。
在一个实施方案中，非树状肽载体可在其保护的侧链但N-末端未保护的形式中包括特定的肽部分，所述的肽部分作为分枝肽偶联至骨架肽的至少一个附着位点上。这种附着位点的实例有赖氨酸侧链中的ε-氨基。
在进一步的实施方案中，该非树状肽在其保护的侧链但N-末端未保护的形式中包括特定的肽部分，所述的肽部分作为分枝肽偶联至骨架肽的至少一个附着位点上，所述的附着位点为双功能性或多功能性附着位点。相关组可以是偶联至原始附着位点赖氨酸残基的ε-氨基可以是赖氨酸残基的ε-和α-氨基。
在另一个实施方案中，该非树状肽在其保护的侧链和其N-末端保护或未保护的形式中包括特定的肽部分，所述的肽部分作为分枝肽偶联至骨架肽的至少一个附着位点上，所述的附着位点为双功能性或多功能性附着位点。此附着位点可以是双功能性或多功能性附着位点且在进一步的实施方案中，其中的至少一个被正交保护至Fmoc和Boc及其它酸不稳定的保护基。
根据本发明的非树状肽也可包括至少一种PNA部分。该PNA可包括通过杂交而结合特异性-DNA分子的单体序列。在另一个实施方案中，此非树状肽载体包括至少一种有功能的DNA-嵌入剂部分。在一个实施方案中，此嵌入剂为喹啉。
此外，该非树状肽载体可包括至少一种DNA或RNA寡核苷酸部分。该DNA寡核苷酸部分优选为经其3’-末端偶联至所述肽氨基上的种类。此外，其可包括编码T-细胞刺激肽的核苷酸序列。在优选的实施方案中，该寡核苷酸序列通过杂交结合特异性的DNA-或RNA-分子。
在优选的实施方案中，附着的寡核苷酸包括一般化学式为(5’)PuPuCGPyPy(3＇)的六核苷酸，其中的Pu为嘌呤碱基，Py为嘧啶碱基且CG代表为甲基化的二核苷酸(dinucleotide)。此六核苷酸基元在免疫活性细胞的范围内已显示为强有力的细胞因子诱导物(Kliman 1996)。
该非树状肽载体可包括间隔分子。优选地，该间隔选自GN，其中的N=2-8。
非树状载体偶联其上的固相优选为聚合物，其中的固相复合物代表共聚物。将非树状肽经可通过特异性化学处理而选择性切割的接头结合至固相是具有优势的。
该固相一般由可衍生的聚合物(基质、树脂)所构成，其不溶于水和有机溶剂，包括二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、哌啶、diethylether和三氟乙酸。二乙烯苯/聚苯乙烯和聚丙烯酰胺有时结合宏观的支撑材料如硅藻土并以各种间隔物和接头得到。聚合物上的肽量可根据肽的大小或合成的特异性条件而改变。
一方面，该非树状肽载体可取代固相聚合物到每克(pr.gram)固相约0.001-5，优选如约0.01-1，更为优选约0.02-0.08，再更为优选约0.04-0.06，最为优选约0.05-0.1mmol.
从结合固相的接头中释放非树状载体肽的化学处理可以与用于从该肽侧链中预期的附着位点切割保护基的化学处理是正交的。这样的接头可选自可由光解切割的3-硝基-4羟甲基苯甲酸型接头、可由催化加氢切割的羟基-巴豆酰基-氨甲基型接头、可由氢氟酸或三氟甲烷磺酸(trifluoromethanesulfonic acid)切割的4-甲基二苯甲基胺树脂、可由水溶性三氟乙酸切割的未修饰的Rink-型接头(4-(2’,4’-二甲氧基苯基Fmoc-氨甲基)-苯氧乙酸)。
在一个实施方案中，该非树状载体肽作为酯结合到固相接头上，所述的肽可由水溶性碱切割。
该非树状载体肽也可连接到结合固相的4-羟甲基苯甲酸上，从而以羟基亲核物质处理时将肽释放为羧酸，以甲醇氨处理时释放酰胺且以肼处理时释放为酰肼。
在一个实施方案中，根据本发明的非树状肽载体也可经接头连接至固相上从而与水接触时释放肽，优选为具有图4D结构的乙醇酸接头或经二酮哌嗪形成而释放肽的接头。
在本发明的另一方面，固相复合物上的非树状肽载体包括5-50、优选10-20个氨基酸，该肽也包括共价结合的脂质部分，优选位于或靠近N-末端的棕榈酸或豆蔻酸，该肽由可通过肼切割切割的接头附着到固相上以形成固相复合物。
为了检测根据本发明的非树状肽载体，其也可包括具有特征性和可测量的光谱或放射特性，如UV-吸收特性、可见吸收或荧光特性的物质。
在进一步的实施方案中，本发明涉及上面定义的非树状肽载体作为通过其共价附着到所述肽可衍生基团而携带其它部分的支架的应用。在一个实施方案中，该可衍生的基团选自K的α-氨基、ε-氨基，K的ε-氨基化学制备衍生物和C-侧链的巯基。
在另一个实施方案中，本发明涉及上面定义的非树状肽载体作为制备化学衍生物的支架的应用，其特征在于附着位点共价附着的分子。该分子选自肽、碳水化合物、半抗原、糖肽、脂肽、DNA、RNA、PNA、蛋白和糖蛋白及其组合。
在其它的实施方案中，本发明涉及偶联至固相上作为固相复合物支架的上面定义的非树状肽载体的应用，其用于逐步常规的基于Fmoc-或Boc的固相肽合成，从而用于在结合固相的肽的附着位点上逐步合成具有定义序列的肽部分然后从固相上特异性地切割整个复合物。
根据上面定义的使用可偶联至非树状肽载体的成分可选自化学合成的保护肽、化学合成的未保护肽、重组的合成肽、天然得到的肽、天然得到或合成的碳水化合物、天然得到或合成的糖肽、天然得到或合成的脂肽、天然得到或合成的核酸、天然得到或合成的核糖核酸、肽核酸、半抗原或其它抗原或非抗原、或其它的氨基、羧基、环乙酰基、顺丁烯二酰亚胺、巯基、1,2-巯基-氨基、羟氨基、α-氧代酰基、羰基、和酰肼反应性物质和其混合物。
本发明的非树状肽载体也可用于制备构建的合成肽库，其与一般的肽库相比，其特征在于通过本发明非树状肽载体提供的结构支撑框架而得到的更高程度的构象明确性。此外，可由本发明获得的肽库可用于免疫。因此，获自本发明非树状肽载体的肽库的一个特别的方面为获得肽库容易地为天然抗体所识别。此外。该库可用于免疫以获得对如，病原性病毒变异体广泛的保护范围。
本发明的非树状肽载体可用于制备肽库的标准方法中，包括导致其中仅分枝肽偶联到相同的非树状肽载体上的一组衍生的非树状肽载体的拆分-结合方法(split-combine)。
本发明的非树状肽载体可用作偶联一种或更多种以下成分的支架，包括化学合成的保护肽、化学合成的未保护肽、重组的合成肽、天然得到的肽、环状肽、天然得到或合成的碳水化合物、天然得到或合成的糖肽、天然得到或合成的脂肽、天然得到或合成的核酸、天然得到或合成的核糖核酸、肽核酸、半抗原或其它抗原或非抗原、或其它的氨基、羧基、环乙酰基、顺丁烯二酰亚胺、巯基、1,2-巯基-氨基、羟氨基、α-氧代酰基、羰基、和酰肼反应性物质和其混合物。当非树状肽载体从固相释放时这种作为支架的使用可以完成。然而，一种或更多种上述成分的偶联通过仍然附着到固相上的非树状肽载体来完成是优选的。
根据本发明的肽载体-固相复合物也可用作经所述肽载体固相复合物中位于C-末端的羧酸而附着其它部分的支架，所述的附着位点一般为含有胺的化合物，最为一般的为合成或天然的肽或蛋白，它们经其氨基的选择性偶联可通过用于交联肽或蛋白至蛋白的已知方法来得到，然后，如果存在的话，切下骨架脂肽的保护基以及偶联的肽，再释放完整的复合物。
使用根据本发明的非树状肽载体固相复合物的进一步方法是通过将其与游离的肽酸结合，后者优选包括5-20个氨基酸并含有位于或靠近N-末端的脂质部分，所述的脂质部分优选为棕榈酸或豆蔻酸，所述的肽除了C-末端的羧酸外进一步不含有其它的自由官能团。该方法包括优选通过连续的肽合成将靶肽偶联至肽-载体固相复合物、通过偶联自由脂肽至结合固相肽的α-氨基而终止合成且随后切下保护基并释放完整的复合物，然后，释放将暴露合成的靶肽作为环。该肽结构可通过包括进将此肽2个末端桥连部分加以稳定，此桥的结构包括分子内内酰胺键、分子内S-S键和合适的双功能性间隔分子。
获自肽载体固相复合物肼切割的脂肽酰肼可用于偶联含醛基的化合物，如可天然得到的还原性碳水化合物或合成的碳水化合物或该碳水化合物被良性氧化以得到的开环，所述的方法由混合所述的还原性碳水化合物与脂肽酰肼所组成。
选自糖蛋白、糖肽或糖脂的糖缀合物可以是糖基化的免疫刺激性的糖缀合物，包括白细胞介素6，干扰素-γ，其它糖基化的细胞因子和免疫球蛋白可经其碳水化合物部分通过上述方法可选择性偶联至自由脂肽酰肼基团上。
非树状肽载体的免疫原复合物可通过脂质部分的特性掺入到免疫刺激复合物(Iscoms)或脂质体中而得到非树状肽载体-Iscom复合物。
2种或更多种不同的复合物可掺入到相同的Iscoms或脂质体中。该复合物可用于疫苗的制备。
在优选的实施方案中，根据本发明的非树状肽载体为非环状的。
如上所述，本发明涉及用于制备包括免疫原性物质偶联至其中的非树状肽载体的方法，包括以下步骤：
1)通过化学固相合成在接头上合成在前面任一权利要求中定义的非树状肽载体，和
2)直接在非树状肽载体上合成免疫原性物质，和
3)从固相切割非树状肽载体。此外，步骤2)可进一步包括通过用可从其中衍生的基团而共价附着其它部分至肽载体上。
根据本发明的非树状肽载体也可用作制备化学衍生物的支架，其特征在于附着位点上共价附着的分子，该分子选自肽、碳水化合物、半抗原、糖肽、脂肽、DNA、RNA、PNA、蛋白和糖蛋白及其组合。此外，该支架肽复合物可通过使用脂质部分掺入到免疫刺激复合物(Iscoms)中而得到非树状肽载体-Iscom复合物。2种或更多种不同的复合物可掺入到相同的Iscoms中。
上述定义的非树状肽载体适合用作检测分子或物质的一种或更多种诊断试剂的诊断组分，如抗原或抗体如多肽、脂多肽、糖多肽、磷脂、碳水化合物、脂多糖或核苷酸序列(包括DNA、RNA或其任何修饰序列)、PNA或任何组合或其修饰形式，它们可被连接至载体上。在一个实施方案中，该诊断组分包括至少2种不同的能够检测相同或不同分子的诊断试剂。
这样的诊断组分可直接体内用于动物或样品的体外使用。
该诊断试剂以可以有效可检测地与所述待测且该诊断试剂能够结合的分子的反应量使用。通过将该诊断组分与分子孵育对诊断组分足够的时间而将其用于检测分子，如在与对象反应的适当组合物中并形成复合物且通过将所述的复合物用于检测方法而检测结合分子的存在。
根据本发明，该诊断组分可用于检测来自妊娠或疾病的分子或其指示性分子，疾病如传染病、自主免疫疾病、癌症或任何其它的其中的指示性分子为已知的疾病，如通过使用来自组织的样品包括活检或组织提取物、细胞培养物或动物，包括人类。因此，样品可来自血清、血浆、全血、脑脊液、精液或阴道液、渗出物、唾液、尿液、粪便等。
在一个实施方案中，该诊断组分直接施用于动物，其中的诊断试剂互补于存在于动物中的分子并为所述动物疾病或妊娠的指示性分子。
在根据本发明的进一步使用中，得到的根据本发明的非树状肽载体用于特异性肽结合寡核苷酸、尤其是寡核糖核苷酸(“aptamer”)的筛选。已显示这样的aptamer能够象抗体结合一样以诱导适合(induced-fit)的模式与特异性的肽特异地结合并具有高的亲和性(Xu 1996)。抗-肽aptamer在诊断分析和基于结合并封闭如从病毒得到的mRNA-结合蛋白的治疗中可用作抗体的替代。Aptamer在体外通过其与偶联固相的肽的结合而从大量随机寡核苷酸库中筛选出来。通过使用该衍生的非树状肽载体，这同时也是本发明的目的，认为可筛选出更好和更为特异性结合的aptamer，因为该肽以更为明确且结构支撑的方式存在。同样，在本发明中，由于直接使用固相偶联的复合物，该筛选步骤本身被简单化。
如上面所解释的，在进一步的实施方案中，本发明涉及包括上述非树状肽载体的疫苗组分，后者上附着有至少一种免疫原性试剂或介质。该免疫原性试剂可以为多肽、糖肽、脂肽、磷脂、多糖、脂多糖、碳水化合物、核苷酸序列、PNA或任何组合或其修饰形式。此外，能够影响疫苗组分免疫原性效应或暴露至该疫苗组分的免疫系统反应的至少一种介质可被连接或形成此肽载体的一部分。
这种介质的实例包括吞噬作用激素、免疫刺激剂如包括细胞因子如白细胞介素或干扰素、增强剂或上述具有介质活性的部分或其修饰。该介质可天然、合成或重组得到。
在另一个实施方案中，该疫苗组分附着到第二载体上，如免疫刺激复合物(Iscoms)或脂质体中，任选与介质组合或具有介质活性的一部分并附着到非树状肽载体和/或第二种载体上。
本发明的非树状肽载体也可与其它的第二种载体一起使用，包括类蛋白微球体，其由衍生的α-氨基酸(Haas 1996)和多(交酯-共乙交酯)(poly(lactide-coglycolide))聚合物缓释生物可降解的微观粒子(PLG)(Ertl 1996)组成。类蛋白微球体通过在低pH时自发形成微球体的衍生氨基酸而制备并且通过简单的混合氨基酸与抗原然后再酸化而包被抗原(Haas 1996)。有了PLG,PLG和抗原的乳化在冷冻干燥后形成(Rrtl 1996)。该粒子优选具有0.5-10，优选0.5-2um的直径且在2种情况下均为可生物降解的。
这种特别的制剂具有这样的优势，即它们可口腔施用并且通过口腔施用是具有免疫原性的。
本发明也涉及包括至少一种上述疫苗组分的疫苗组合物。该组合物优选包括有效量的疫苗组分以赋予动物对一种或更多种感染增强的抗性，该组合物任选进一步包括药物上可接受的载体或运载体、增强剂或佐剂。
佐剂使用的实例为非树状载体肽与希夫碱形成组分(schiff-base-forming component)的组合，已知后者作用同佐剂并增强抗原呈递细胞上羰基和氨基间希夫碱的形成和天然反应反应中T-细胞的发生(Gao 1990)。这可通过在疫苗制剂中包括进通过结合到其表面上的氨基而直接激活T-细胞的希夫碱形成物质或通过同时以免疫原性物质施用2个碳水化合物修饰酶neauraminidase和半乳糖氧化酶(＂NAGO＂佐剂)而完成(Rhodes 1995a)。在优选的实施方案中，希夫碱形成醛，如tucaresol(4(2-甲酰基-3-苯氧羟甲基(hydroxyphenoxymethyl)苯甲酸)在非树状肽载体中作为辅助部分而结合。这可通过经tucaresol中羧基的激活而偶联至非树状肽载体中选择性解保护的氨基上而完成。
根据本发明的疫苗组合物可通过鼻内、皮下、肌肉内或任何其它方便的途径施用疫苗组合物而用于免疫动物包括人类。
在进一步的方面，本发明涉及包括上述其中至少附着一种治疗性或预防性试剂的非树状肽载体的治疗组分，如上述定义的治疗组分。根据本发明的治疗组分可进一步包括至少一种介质，如定义用于上述疫苗的能够控制或增强连接到载体上治疗或预防试剂效应的治疗组分。
如用于上述疫苗的治疗组分，根据本发明的治疗组分也可包括第二种载体，如免疫刺激复合物(Iscoms)或脂质体，任选与介质组合或具有介质活性的一部分并附着到非树状肽载体和/或第二种载体上。
在本发明优选的实施方案中，根据本发明的治疗组分也可包括能够结合到靶物质上的靶分子，其中的靶物质存在于动物中的特定位点继而指导该治疗组分至其发挥效应的所述特定位点。该靶分子如为抗体。因此，该治疗性组合物可以能够预防，包括预防复发，或治疗疾病或能够以不同的有效的方式预防或终止妊娠。其中的靶物质被鉴定的任何疾病可根据本发明加以治疗。因此，本发明可适用的疾病包括传染病、癌症和自主免疫疾病。
该药物组分可以用于包括该治疗组分和药物上可接受的载体的组合物。
因此，本发明也涉及治疗和/或预防疾病的方法，包括给需要的病人施用治疗上或预防上有效量的上述组合物。
最后，本发明也涉及用于检测分子或物质的检测组分，该检测组分包括上述的其中连接有检测剂的非树状肽载体。
对于理解这里讲授内容的熟练技术人员来说，很显然，这里给出的任何范围或值可被扩展或改变而不丧失所需的效应。
附图描述
图1A显示在附着免疫原性物质之前的非树状肽载体固相复合物。
图1B显示另一个其上附着有辅助片段的非树状肽载体固相复合物的实施方案。
图1C显示由其中附着有免疫原性分枝肽的非树状肽载体固相复合物所组成的分枝肽复合物。
图1D显示与图1C类似的分枝肽复合物，其中还额外包括偶联至双附着位点上的辅助片段。
图1E显示与图1C类似的分枝肽复合物，但其中在分枝肽上包括以线形排列偶联的辅助片段。
图2显示在偶联棕榈酸之前(A)或之后(B)骨架肽的HPLC-分析(粗产物)(见实施例1)。
图3显示按实施例1中所述制备的棕榈酸化骨架肽(HPLC-纯化)的基质辅助的激光解吸附飞行时间质谱分析器(Matrix-assisted Laser desorption time-of-flight mass spectrometry)分析，用Fisons线形方式的质谱分析器，且用α-氰4-羟基肉桂酸作为基质。结果被校正并进行矩心调整(centroid adjusted)。
图4A和4B分别显示2个双分枝的接头A和B。
图4C显示三棕榈酸部分、N-棕榈酰-S-[2,3-二(棕榈酰-氧代)-(2RS)]-丙基-[R]-半胱酰基的结构。
图4D显示羟基乙酸接头。
图5显示HIV-1血清阳性供体对肽，gp41(aa598-609)稀释曲线的抗体反应性，gp41分别被单独测试或连接到实施例19中所述的非分枝肽载体上。
图6显示获自待测的HIV-2血清阳性供体(--)和HIV-2血清阴性供体(----)对非分枝肽载体构建体的稀释曲线。在所有测试的HIV-2血清阳性血清的稀释液中获得了阳性信号而在所有测试的HIV-2血清阴性对照血清的稀释液中获得了阴性信号(见实施例19)。
图7显示测试的获自HIV-2血清阳性供体和HIV-2血清阴性供体组的血清固定稀释液仅对偶联至非树状肽载体的肽或单独的结果(见实施例19)。也对血清进行了针对重组蛋白HIV-2 gp36的测试。所有的血清阳性供体血清均反应而在血清阴性对照血清中没能检测到反应性。
图8显示获自测试的HIV-2血清阳性供体和一个HIV-2血清阴性供体的仅对gp36肽和偶联至非树状肽载体的血清稀释曲线。也对血清进行了针对重组蛋白HIV-2 gp36的测试。当偶联至非树状肽载体时，与单独的肽相比，该肽以更高的血清阳性血清的稀释度被识别，见实施例19。
图9显示以按实施例9中所述而制备的抗体免疫后小鼠对衍生的非树状肽载体EBA肽-PPD缀合物的应答而产生的抗体。三次免疫后，能检测到最强的抗体反应。吸附到Al(OH)3上能增强一次免疫而非二或三次免疫后的抗体产生。
图10显示仅以衍生的非树状肽载体EBA肽免疫后或以衍生的非树状肽载体EBA肽混合以弗氏佐剂皮下免疫后对EBA肽应答的小鼠。当该分支的肽构建体和弗氏佐剂混合时提高了抗体的反应水平(见实施例20)。
图11显示在以衍生至非树状肽载体的该肽和混合以弗氏佐剂皮下免疫后对gp120肽应答的小鼠。最强的抗体反应可在3次免疫后检测到(见实施例20)。
图12显示以来自疟疾寄生虫恶性疟原虫抗原刺激人单核细胞时IL-6分泌的百分抑制：(--)偶联至非树状肽载体上β-2-糖蛋白Ⅰ肽的抑制；(----)仅由肽的抑制。显示了2种不同的实验方法。(见实施例22)。
图13显示以HIV gp120-肽衍生的非树状肽载体结构型2(见表1)的HPLC分析。在280nm(顶部)和220nm(底部)处对粗产物进行HPLC分析。“X”为注射峰，且“Y”为系统峰。“P”为所需的产物峰。
图14显示小鼠对以EBA肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的IgG1。
图15显示小鼠对以EBA肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的IgG2a。
图16显示小鼠对以LERLLL HIV-1肽获得的非树状肽载体混合以HIV-1gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体且具有或不具有弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗LERLLL HIV-1 gp41肽的IgG。
图17显示小鼠对以HIV-1gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗重组HIV-1gp120的IgG。
图18显示小鼠对以LERLLL HIV-1肽获得的非树状肽载体混合以HIV-1gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体肽和弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗重组HIV-1gp41的IgG。
图19显示小鼠对以HIV-1(aa152-176)肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗HIV-1gp120(aa 152-176)肽的IgG1。
图20显示小鼠对以HIV-1(aa152-176)肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗HIV-1gp120(aa152-176)的IgG2a。
图21显示小鼠对以LERLLL HIV-1肽获得的非树状肽载体混合以HIV-1 gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体肽后皮下免疫时的应答而产生的抗LERLLL HIV-1 gp41肽的IgG1。
图22显示小鼠对以LERLLL HIV-肽1获得的非树状肽载体混合以HIV-1 gp120(aa 152-176)肽获得的非树状肽载体肽后皮下免疫时的应答而产生的抗LERLLL HIV-1 gp41肽的IgG2a。
图23显示在体内由于LPS、CKNKEKKC和KNGMLKGDKVS-得到的非树状肽载体的刺激而对TNF分泌的抑制。
图24显示小鼠对以EBA肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂后三次皮下免疫时的应答而产生的IgG但与仅以EBA肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂的第4次免疫相比，IgG应答由于第4次以EBA肽获得的非树状肽载体混合以弗氏完全佐剂和鼠重组IL-10的免疫而降低。
图25显示小鼠对以L1利什曼肽(leishmania peptide)获得的非树状肽载体混合以不同的鼠重组细胞因子或明矾或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG1。
图26显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以鼠重组TNF或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG2a。
图27显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以吞噬作用激素或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG1。
图28显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体与吞噬作用激素皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG2a。
图29显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以不同的γ-干扰素特异性肽或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG1。
图30显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以不同的γ-干扰素特异性肽或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG2a。
图31显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以不同的γ-干扰素特异性肽后腹膜内免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG1。
图32显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以不同的γ-干扰素特异性肽后腹膜内免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG2a。
图33显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以重组TNF或TNF特异性肽或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG1。
图34显示小鼠对以L1利什曼肽获得的非树状肽载体混合以重组TNF或弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗L1利什曼肽的IgG2a。
图35显示小鼠对以L2利什曼肽获得的非树状肽载体混合或不混合以TNF特异性肽或具有和不具有吞噬作用激素后皮下免疫时的应答而产生的抗L2利什曼肽的IgG1。
图36显示小鼠对以L2利什曼肽获得的非树状肽载体混合以TNF特异性肽一次皮下免疫时的应答而产生的抗L2利什曼原虫肽的IgG2a。
图37显示小鼠对以HIV-1 gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体混合以TNF特异性肽或γ-干扰素特异性肽或吞噬作用激素后皮下免疫的应答而产生的抗HIV-1gp120肽(aa152-176)的IgG1。
图38显示小鼠对以HIV-1 gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体混合以TNF特异性肽或γ-干扰素特异性肽后皮下免疫的应答而产生的抗HIV-1gp120(aa152-176)肽的IgG2a。
图39显示小鼠对以HIV-1 gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体具有或不具有IL-1特异性肽或吞噬作用激素或混合以弗氏完全佐剂后皮下免疫时的应答而产生的抗HIV-1gp120(aa152-176)肽的IgG。
图40显示小鼠对以HIV-1 gp120(aa152-176)肽获得的非树状肽载体具有或不具有IL-1特异性肽后皮下免疫时的应答而产生的抗HIV-1gp120(aa152-176)肽的IgG。
图41显示以缀合至PPD上的肽和偶联至非树状肽载体(NDPC)上肽在使用和不使用佐剂的免疫后抗Tbp-肽抗体的形成。分析用ELISA完成。
图42显示以缀合至PPD上的肽和偶联至非树状肽载体(NDPC)上肽免疫后抗Pa1A-肽抗体的形成。非偶联的线形肽用作免疫对照。分析用ELISA完成。
图43显示不同的构建体(骨架结构数目参照表1)与产生的抗PPD-偶联的Tbp-肽4单克隆抗体的反应性。不同的构建体用于包被微量滴定板且然后以单克隆抗体检测。分析用ELISA完成。
实施例
在下面的实施例中，使用了下面的简写：
用于氨基酸的标准的单-字母和三字母简写。
Aib:α氨基异丁酸。
Alo：烯丙氧羰基(allyloxycarbonyl).
BCG：卡介菌.
Boc：丁氧羰基(butyloxocarbonyl).
BrAc：溴乙酰基。
CA：柠康酐。
DCC：二环己基碳二亚胺。
DCM：二氯甲烷。
Dde:1-(4,4二甲基-2,6-二氧代亚环己基(dioxocyclohexylidine))乙基。
DMAP：二甲氨基吡啶。
DMSO：二甲基亚砜。
DSS：辛二酸二琥珀酰亚胺酯(disuccinimidyl suberate).
EBA：红细胞结合抗原
EDC:1-乙基-3[二甲基(氨基丙基)]碳化二亚胺
ELISA：酶联免疫吸附分析
Fmoc：芴甲氧羰基(fluorenymethoxycarbonyl).
HOBt：羟苯丙三唑。
HMB:4-羟甲基苯甲酸。
HMPA:4-羟甲基苯氧乙酸。
IFN：干扰素
IL：白细胞介素
i.p.：腹膜内
MSNT:1-(1,3,5-三甲苯基-2-磺酰基)-3-硝基-1-H-1,2,4-三唑
Mtt：甲基三苯甲游基。
NMM:N-甲基吗啉。
NMP:N-甲基吡咯烷酮。
Palm：棕榈酰残基(CH3(CH2)14CO-).
Pbf:2,2,4,6,7-五-甲基二氢苯并呋喃(methyldihrdrobenzofuran)-磺酰基
PDD：来自结核分支杆菌的纯化蛋白
s.c.：皮下
SPDP:N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯。
TBTU:2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲阳离子四氟硼酸(2-(1H-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate).
TFA：三氟乙酸。
TNF：肿瘤坏死因子
Trt：三苯甲游基
实施例1
两亲平行的α螺旋同二聚体形成的非树状肽载体
以上述的heptad-法则为基础，定义含有强α螺旋、平行同二聚体形成趋势的20-氨基酸α-N-棕榈酰化的脂肽：
palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY
其中palm=棕榈酰基(CH3(CH2)14CO-)。包含组氨酸残基以便在二价金属粒子螯合后形成螺旋，还包含作为280nm报道基团的酪氨酸。该肽对应于带有疏松结构的亲水C末端区(GKGKY)的α螺旋的两匝。
用Novasyn KB树脂(Nova-biochm 01-64-00025)完成合成，该树脂含有碱活泼的4-羟甲基苯甲酸(HMB-)接头以用于所述肽C末端的连接。所有氨基酸衍生物均来自Novabiochm，所有试剂均来自Merck。所用的氨基酸是带有下列侧链保护的α-氨基-Fmoc-保护的衍生物：天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸：三苯甲基(Trt)、赖氨酸、色氨酸：丁基氧羰基(Boc)、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸：叔丁基(tBu)、精氨酸：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-磺酰基(Pbf)。用来自Schafer-N(Copenhagen)的使用说明软件的Mark-Ⅲ肽合成仪，完成肽合成。在通风橱中完成所有操作。用定量的Kaiser试验(Kaiser1970)检测游离氨基。
按Grant(1992)所述，用公式[E301×dil.×vol.]/[10×重量克]测量释放的Fmoc(哌啶后)，其中dil.和vol.分别是所测量样品的稀释度和体积。重量是Fmoc基衍生自的肽树脂的重量。
作为例子，在室温将1克含0.15mmol/g羟基的Novasyn KB树脂(Novabiochem01-64-00025)放在NMP中20分钟，然后用DCM在滤纸上洗涤。将第一氨基酸(酪氨酸)作为酯结合(Blankemeyer-Menge 1990)：将300μmol(=2倍摩尔过量)Fmoc-酪氨酸(tBu)与225μmol甲基咪唑和300μmol1-(菜-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1,2,3-三唑(MSNT)在0.2M DCM中混合，然后在DCM中与KB-树脂保温，同时在室温(RT)振荡60分钟。将所述结合用新试剂在KB树脂的相同部分重复一次，然后与10当量的乙酸酐在存在1当量DMAP的条件下结合。15分钟完成加帽，然后用NMP彻底洗涤。分光光度法测定(301nm)从结合的酪氨酸裂解的Fmoc基团(在NMP中用20％哌啶裂解)得到134.8μmol/g树脂，这相当于89.9％的结合产率。在该点用少量树脂样品完成的Kaiser试验产生深兰色。在活化10分钟(TBTU/HOBt/NMM,1/1/2摩尔当量，类似NMP中的氨基酸)，用8倍摩尔过量结合30分钟，而异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸双倍结合2×30分钟后，依次偶联该点后的其余氨基酸。最终的Fmoc值相当于133.9μmol肽/g树脂(源重量)。这相当于类似于99.3％结合的第一氨基酸产率。所述Kaiser试验产生深兰色。在该点，取出少量树脂样品用于肽的裂解作为对照(在棕榈酰化前的肽，图2)。按下述将所述肽的剩余部分通过两次重复处理棕榈酰化：将相当于肽-树脂上α-氨基10倍的棕榈酸与TBTU、HOBt和NMM(相当于棕榈酸的1/1/2(mol/mol/mol))在NMP中混合，然后在RT振荡10分钟活化，接着在RT与肽-树脂保温30分钟。重复结合后，Kaiser试验产生澄清的无色溶液，取少量样品用于分析(棕榈酰化后的肽，图2B)。随后，用NMP、2-丙醇和DCM洗涤所述肽树脂。为了制备用于结合侧链抗原(“分枝”)的脂肽-树脂，在RT，通过用6×5ml DCM中的50％TFA在封闭的瓶中处理6×30分钟边振荡边除去赖氨酸中保护ε-氨基的Boc基团。然后用DCM、在NMP中的4％NMM、水和醚洗涤滤纸上的树脂。在该阶段，将所述肽-树脂准备用于结合分枝-抗原(见下文实施例)，Kaiser试验是深兰色。被保护氨基与中性结合点的结合通过常规激活化学法完成，用Kaiser试验得到澄清的肽树脂。
为了分析合成成功与否，将两种肽-树脂样品(非棕榈酰化样品和最终的脂肽-树脂)处理以除去上述侧链保护基，然后用下列方法从树脂中裂解：
将所述肽树脂(100mg)用5ml 1M NaOH在超声波水浴中于冰上处理10分钟。然后将所述树脂滤掉，将滤液收集在冰上0.1M乙酸中。用相同的方法重复该步骤并与2倍水(MilliQ)和100％乙腈保温2×10分钟，将所有滤液分别收集在乙酸中。然后用HPLC分析这些馏分肽产率和纯度，合并有关的馏分，用制备性反相HPLC脱盐(见实施例5)，然后冻干。在第一NaOH-洗涤液中非棕榈酰化的肽占大部分，而在两部分NaOH-洗涤液中均有棕榈酰化的肽。
所述产物在含水溶液中是高度可溶的，用HPLC很容易分析，有良好的纯度(＞80％)。HPLC分析：溶剂A:0.1％TFA/10％乙腈milliQ水溶液，溶剂B:0.1％TFA乙腈溶液。流速：1ml/分钟。柱：Merck Lichrosper 100,RP 18,5μm,250×4mm。通过高压侧双泵混合器(Jasco PU880泵)控制梯度，在t=0分钟时从100％A开始跑，在t=10分钟时，到20％A。用Varian9050检测仪监测在220nm的流出物。用Varian Star色谱软件收集数据。上样：50μl 1mg/ml，冻干，粗产物池脱盐。棕榈酰化肽中的主要杂质来自不完全的棕榈酰化。棕榈酸偶联的非树状肽比非棕榈酰化对照肽洗脱的要晚得多(在该HPLC-梯度中晚5分钟左右，图2中公开了HPLC分析)。典型的粗产物产率为80％左右，脱盐产率也在80％左右。
产物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(Matrix-assisted Laser-desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)得到与预期质量非常吻合的分子离子(在棕榈酰化产物的预期2473.1的2D内，见图3)。完成用于二级结构和非树状肽聚集状态的公众分析，包括Zn++-和Co++-离子的螯合和光谱学、环状二色性、酪氨酸荧光猝灭和凝胶过滤。
将非树状肽衍生的树脂洗涤、干燥并贮藏，然后直接用于分枝肽的标准肽合成或用于预合成肽或其他全分子的偶联。
通过用在这些位置的A代替双-组氨酸螯合位点得到同样有用的肽。
在另一合成中用Ⅰ代替Ⅴ。
作为用NaOH裂解的另一种方法，也可将甲醇(methanolic)氨用于该处理，得到优选的肽酰胺。
另外，用修饰的Rink接头(4-(2’,4’-二甲氧基苯基Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酸)和上述氨基酸衍生物合成所述肽。在该策略中，用在DCM中的25％TFA，通过3×10分钟处理，从K中除去Boc。这不会影响与修饰的Rink接头的结合。这样会得到最后优选的肽酰胺产物。另外，裂解和操作过程比上述用4-羟基甲基苯甲酸接头的简单。最后，修饰的Rink接头对于肼是稳定的，这样可以扩大Dde-保护的应用(见下文)。
用相互垂直保护的赖氨酸残基，如Fmoc-K(Mtt)-OH(Mtt=甲基三苯甲基)、Fmoc-K(Dde)-OH(Dde=-(4,4,-而甲基-2,6-二氧代亚环己基)-乙基)、Fmoc-K(Aloc)-OH(Aloc=烯丙氧基-羰基)业可以合成骨架肽，其中侧链保护基可分别用1％TFA、2％肼和Pd(0)(催化的氢化作用)除去。合成、α氨基类脂偶联以及选择性赖氨酸侧链解蔽后，可完成分枝肽和部分的合成或偶联而不会有来自骨架肽中其他氨基酸侧链，特别是来自E的羧酸的未掩蔽功能基的干扰。
将选择性可裂解保护基换成侧链氨基降低了最终侧链衍生的非树状肽载体的粗产物中的不均匀性(见实施例5)，因为排除了在游离侧链羧酸基团直接内酰胺形成的可能性，所述羧酸基团被来自分枝肽合成中的TBTU/HOBt/NMM激活并与肽载体和被合成的侧链肽的脱保护氨基反应。另外，选择性化学法可以仅使赖氨酸ε氨基去保护，保留赖氨酸上的电荷参与两亲螺旋的稳定(见下文表1，结构2、3、5、6、7)和/或使刺激性肽的加入不被侧链衍生的侧链所包含(图1，结构4和5)。
正如使用选择性化学法的接头和保护基策略的具体说明和优选实施例所说明的，将仅含一类连接位点的非树状肽载体在酸活泼的修饰Rink-接头以及超酸活泼的侧链氨基酸保护基(甲基三苯甲基-(Mtt-)，结构3和6)或肼-活泼的Dde-基(1-(4,4-二甲基2,6-二氧环亚己基)-乙基)(结构2,4,5)上合成。在下文表1中以结果2-7给出的非树状肽载体用下列条件合成：
所有条件下，上述溶剂和试剂，只有Fmoc-Lys(Dde)-OH和Fmoc-Mtt-OH是从Novabiochem购买的(分别为04-12-1121和04-12-1137)。为了结合第一(C-末端)个氨基酸，将修饰的Rink-树脂(4-2’,4’-二甲氧苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰甲基二苯甲基胺聚苯乙烯)，Novabiochemol-64-0037)用NMP中的20％哌啶处理2×5分钟，用NMP洗涤，然后用TBTU/HBot/NMM激活10分钟与过量8倍摩尔的氨基酸结合，在RT结合30分钟。用相同的条件第二次结合后，结合产率通常为80-90％。与NMP中的乙酸酐/DMAP(20当量乙酸酐，1当量叔胺(DMAP或NMM)，10分钟)结合接着用NMP彻底洗涤后，按上述完成自动合成。将最后的Fmoc基团裂解后，按上述加入棕榈酸，随后除去赖氨酸侧链保护基：
Mtt：在DCM中的5％三异丙基硅烷中的1％TFA溶液，3×5分钟处理。在470nm监测释放的Mtt。
Dde:2％肼的NMP溶液，3×5分钟，在290nm监测释放的Dde。
侧链连接点的产率通常为60-80％。
此后，为了分析非树状肽载体的纯度，用标准TFA裂解法(95％TFA水溶液，没有加入清除剂，在密封容器中处理3×30分钟，然后用冷二乙醚沉淀，过滤，溶解在水中并冻干)裂解少部分肽，然后用分析用反相HPLC分析。肽有良好的纯度和产率，预期主要粗产物峰的质谱得到的分子量值与表1中所给的理论分子量相差不超过5Da。
合成的结构
用Mtt-保护合成表2中所述的两种模型结构以便用MS分析证实结构。用1％TFA/5％三异丙基硅烷的DCM溶液除去Mtt，在各一半的骨架上合成分枝肽(分别为YLEN和WNSG)。裂解并纯化后，用MALDI-TOF质谱分析所有构建体。质谱分析预期的分子量与表2中所给的理论值相差不超过5Da。
又合成了许多含七价物模型的非树状肽载体，其中对赖氨酸使用了两种保护作用；一种对于结合点赖氨酸来说是可选择性裂解的，它仅在七价物(heptad)“c”-位置包含赖氨酸，在“g”-位置含Boc-保护的氨基酸。这样可以在“c”-位置进行衍生作用，同时保留“g”-位置的电荷。同样，可以使用另一种设计，其中将其他可选择性脱阻断的K-残基导入到f-位置。因此，用称为K的可选择性脱阻断的赖氨酸残基合成下列模型肽：
VAKLEAKVAKLEAK(1)
VAKLEAKVAKLEAK(2)
VAKLEKKVAKLEKK(3)
这些合成均在上述修饰的Rink-接头上完成。脱阻断K-残基后，将其用AELGGQFHHKSENG衍生，裂解，完成并分析α螺旋的含量以及与未取代的模型肽相比，同二聚体的形成。用抗所述肽的单克隆抗体分析连接肽的可接近性和抗原性。
与另两类肽相比，预期螺旋-以及同二聚体-形成在衍生肽(2)中有所减少，所述另两类肽甚至在侧链衍生后，也是良好的α螺旋-和二聚体-模型。另外，认为肽(1)和(3)存在与单克隆抗体更有效结合的侧链肽，从而导致在间接ELISA中比肽2的识别作用更有效。
其他变体
通过结合三种不同的侧链保护作用的不稳定性(弱酸、较强酸和肼)，用“正常”侧链连接点以及由于结合刺激性肽，如细胞因子肽的具体连接点可以合成非树状肽载体(见实施例5)(见表1，结构7)。
用相似的方法也可以合成一系列的其他标准肽载体变体并进行分析；这些变异体包括通过用赖氨酸-谷氨酸对取代组氨酸对，然后通过选择性保护的侧链使其侧链反应而内酰胺化稳定的肽载体；另一种变异体是在连接点用二级结构nucleator取代；还有一中变异体是在二分枝的接头分子上合成的，产生由在其C末端有两个连在一起的肽链组成的非树状肽；此外，还合成了用图3的三棕榈酸结构代替线性棕榈酸的变异体。
最后，合成了其中棕榈酸通过硫酯键与侧链N末端半胱氨酸中的硫醇基相连的非树状载体肽，并将其用于接种试验。
    表1
    非树状肽载体的类型，给出了未保护肽的分子量(mw)
    1     Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY-OH(K=K(Boc)),mw.:2473.1
    2     Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Dde)),mw.:2472.1
    3     Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Mtt)),mw.:2472.1
    4     Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKYVQGEESNDK-NH2(K=K(Dde)),mw.:3459.1
    5     Palm-AVHKLEHKVAKLEAKGKGKYVQGEESNDK-NH2(K=K(Dde)),mw.:3459.1
    6     Palm-AVAKLEAKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Mtt)),mw.:2340.0
    7     Palm-KVAKLEAKVAKLEAKGKGKY-NH2(K=K(Dde)and K=K(Mtt)),mw.:2397.1
    表2
    典型非树状肽载体的类型
    1     KGKGKGL-NH2palm-KGKGKGL-NH2
    2     KGKGKGL-NH2
    palm-KGKGKGL-NH2
    3     KGKGKGL-NH2palm-KGKGKGL-NH2
    K=Lys(Boc)K=Lys(Mtt).palm=棕榈酰残基给出了未保护肽的分子量Mw:685.9(非棕榈酰化的肽)924.3(棕榈酰化的肽)分枝肽：YLEN-所得分子量：1732.9(2连接点，非棕榈酰化)1971.4(2连接点，棕榈酰化)2256.6(3连接点，非棕榈酰化)2495.0(3连接点，棕榈酰化)
    4     GKGKGKLYL，其中K=Lys(Mtt)mw(未保护的)：962.2
    5     palm-GKGKGKLYL，其中K=Lys(Mtt)mw(未保护的)：1200.6
     6     Nε[WNSG]3-palm-GKGKGKLYL，其中K=Lys(Mtt)mw(未保护的)：2534.0
实施例2
用于同时合成但分别释放的衍生的非树状肽载体以及游离肽的固相
设计下列方法用于通过直接固相合成得到非树状肽载体(NDPC)结合的肽和同样肽的游离形式，所述游离形式可以直接观察所述合成是否成功并可以利用对照-肽进行接种试验以表征抗体等。
这可以通过用正交活泼的接头混合物，如酸活泼的接头如4-羟甲基苯氧基乙酸(HMPA)与碱活泼的4-羟甲基苯甲酸(HMB)来完成。然后暂时阻断其中的一个接头，同时在另一接头上合成非树状肽载体(NDPC)。除去NDPC侧链保护基的处理也可以除去在另一接头上的保护基。在所述合成的实施例中，通过将所述Novasyn碱树脂与TBTU/HOBt/NMM-激活的接头以与树脂上的氨基数0.1摩尔的比率保温，在振荡条件下室温在NMP中结合1×30分钟，从而用HMPA接头部分取代Novasyn碱树脂。然后用NMP洗涤所述树脂，室温振荡下，用5倍摩尔过量的按上述激活的Fmoc-正亮氨酸将剩余氨基阻断2×30分钟。用NMP洗涤后，通过米/咪唑结合将Boc-甘氨酸与HMPA接头的游离羟基结合(见实施例1)。用NMP洗涤后，Fmoc-L的α氨基用20％的NMP溶液脱除。再进行NMP洗涤后，通过激活并按上述用5倍摩尔过量结合两次来连接HMB-接头。按实施例1中的详细描述在所述固相上合成NDPC。将侧链保护基以及与HMPA接头结合的Boc-G用95％TFA水溶液裂解。现在将HMPA准备用于结合作为酯的另一作为酯的氨基酸。可将所得固相用于同时合成游离肽和肽衍生的NDPC，给释放的模型并用TFA处理(95％TFA水溶液)脱保护，而仅用碱处理释放衍生的NDPC(见实施例1)。
在完成的另一合成中，通过将树脂与TBTU/HOBt/NMM-激活的接头以与树脂上的氨基数0.1摩尔的比率保温，在振荡条件下室温在NMP中结合30分钟(一次)，从而用Fmoc-保护的RINK-接头部分取代树脂。然后，通过按上述激活，将5倍摩尔过量的HMB-接头与树脂上可得的剩余氨基结合2次(30分钟，室温，振荡)现在用20％哌啶/NMP虫Rink-接头中除去Fmoc基，并通过TBTU/HOBt/NMM激活化学法将Boc-G与游离氨基结合。与HMB接头的羟基的酯化作用相比，这些结合条件有利于与氨基的结合。现在按实施例1所述，在所述固相上合成NDPC。在用50％TFA的DCM溶液脱保护的步骤中，除去保护骨架赖氨酸的ε氨基和Rink-结合结合的G的Boc基。可将所得固相用于同时合成游离肽和肽衍生的NDPC，被释放的模型并用彻底的TFA处理(95％TFA水溶液)脱保护，而用碱处理仅释放衍生的NDPC(见实施例1)。用一甘氨酸残基在羧基末端延伸游离肽。
实施例3
用于产生回环肽的非树状肽构件
回环是很常见的并且是大部分已知三级结构的蛋白质的很容易区别的特征。此外，所述回环常常构成所述蛋白质的免疫显性部分，因此非常需要在诱导回环的set-up中，用于其容易并常规制备的方法。作为一个例子，这可用实施例1中详述的固相法，在Novasyn KB树脂上，通过合成第一个非树状构件，棕榈化四肽PC(Trt)L(Palm)L来完成。可将Fmoc基留在K上，按实施例1用50％TFA的DCM处理而将ε氨基脱保护。随后，按实施例1所述，将棕榈酸与该氨基结合，结合后，进行Kaiser检测。此后，裂解α氨基Fmoc基，然后合成其余的肽。裂解最后的Fmoc基后，将所述肽留在树脂上。另一构件可以是相同的肽并可溶，但按实施例1所述的NaOH处理可从树脂上裂解，单用酸不能脱保护并仍含有最后一个Fmoc基。作为可溶构件的另例子，再合成Palm-PC(Trt)LG。作为该可溶构件的另一例子，合成Palm-PK(BrAc)LB，其中BrAc是在用TFA/DCM将侧链脱保护后，通过将K残基的ε氨基与溴乙酸反应而导入的溴乙酰部分。现在用标准方法(实施例1)，在固相结合的肽的游离α氨基上合成将作为回环存在的靶肽(所包含的靶肽是相应于人IL-1β(LQGQDMEQQV(蛋白质循环形式中的aa31-40),DPKNYPKKKMEKRF(蛋白质循环形式中的aa86-99),VQGEESNDK(蛋白质循环形式中的aa47-55),GGTKGGQDIT(蛋白质循环形式中的aa135-144)和猪白细胞介素1β中的相应回环)。在含半胱氨酸的靶肽中，将靶肽C与C(Trt)正交保护。裂解了该固相结合肽的最后一个Fmoc基后，以大摩尔过量(10倍)激活游离的构件，然后按实施例1有关棕榈酸的描述，用NMP中的TBTU/HOBt/NMM与固相结合肽结合直到Kaiser检测为阴性。按实施例1所述，脱除Fmoc基和侧链保护基，通过与I2/NMP的氧化作用直到出现阴性Ellman-反应(Ellman,1959)，从而完成在树脂上的环化。用溴乙酰化的构件，在PBS,pH7.2中，在树脂上进行环化，同时释放HBr，形成稳定的硫醚。如果还有的，将剩余的Cys-保护基通过其具体处理而脱除，此后，按上述用NaOH释放全部复合物。在二硫键形成的条件(见Grant,1992)下，用低浓度肽将线性肽释放后，在溶液中完成二硫键的形成。用与上述类似的方法，可以使用其他功能基，只要回环肽中的任何强相互作用基团可以被正交保护。待完成的例子包括在谷氨酸或天冬氨酸与赖氨酸之间形成的内酰胺键。合成并裂解后，按实施例1所述，在HPLC上分析所述肽。认为环肽在相应的线性肽前被洗脱。
实施例4
锚定肽
HMB接头使得可以通过用肼裂解可制备肽酰肼类(C-酰基-肼)。肽酰肼是用于结合中度氧化的或还原的碳水化合物或含碳水化合物化合物，如糖蛋白质的优秀试剂。可合成所述肽的一个例子如下：
按实施例1所述合成肽(如下文所列的)，并在用50％肼-水化物的二噁烷/甲醇(9/1)溶液在4℃2小时脱保护前，用α-N-末端棕榈酸衍生，然后过滤，用相同的试剂洗涤并中和滤液，蒸发，最后溶解在水中并冻干(NovaBiochem1994)。所述肽选自下列：
-一般的T细胞刺激肽，如QYIKANSKFIGITE(破伤风类毒素830-843),FNNFTVSFWHRVKVSASHLE(破伤风类毒素947-967),DQVHFQPLPPAVVKLSDALI(结核分枝杆菌37 kD抗原350-369),DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(恶性疟原虫环子孢子蛋白378-398),KLLSLIKGVIVHRLEGVE(麻疹病毒F蛋白286-302),LDNIKGNVGKMEDYIKKNNK(恶性疟原虫MSP-1,260-279378-398)，和由线性共价排列的不合侧序列的许多不同T细胞表位组成的多表位构建体(见Thomson 1995)；
-一般的刺激肽如吞噬作用激素寡聚物[TLPR]N，其中N优选2-5，或胞壁酰二肽(N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)；间隔基肽，通过其Y含量提供可检测性，如在棕榈-YGLAELKG中；
-按实施例5和6中所述制备的肽衍生的非树状载体的组合，但不用肼释放以产生肽酰肼，其中所含的分枝肽可用上述任何T细胞刺激肽组建。
对于不合Y或W的肽，将一个Y优先插入了肽的一个末端。按实施例1所述的标准骨架肽的反相HPLC分析，与裂解为酰肼的相同肽的分析相比，可以表明在HPLC中，这两种肽的行为几乎没有差异，这均是就保留时间和纯度而言的。质谱表明肽增加了14D，相当于用-CONHNH2取代-COOH。然后将酰肼锚定肽脱盐，冻干，并用于碳水化合物与带可接近羰基的碳水化合物结合，所述羰基是通过受控制的中度高碘酸氧化得到的或通过还原碳水化合物的末端而提供的(见实施例10)。
实施例5
在非树状骨架肽载体上通过直接连续化学固相合成连接肽
可将与固相结合的非树状骨架肽载体直接用于常规固相肽合成。这样做的一种方法是使用常规连续肽合成方法，在实施例1所述类型的碱-或酸-可裂解骨架肽上，用以Fmoc为基础的化学法。合成分枝肽后，用TFA脱除保护基，在修饰的Rink-接头的情况下，同时从固相上裂解衍生的非树状肽载体，而在碱可裂解的HMB-接头的情况下，然后通过含水破标准裂解分枝肽复合物，并进行脱盐和冻干。作为这种情况的例子，用下列方法完成合成：
由于在树脂上的每个氨基导入了6个ε氨基，因此，估计实施例起用骨架脂肽衍生的Novasyn KB树脂(表1，结构1)含有源氨基酸残基的最大6倍。将150mg衍生的树脂(相当于100mg源树脂)用于按实施例1所述的用标准Fmoc化学法和TBTU/HOBt/NMM预激活的合成。合成后，脱除最后一个Fmoc基和侧链保护基，用实施例1所述的标准处理从固相上裂解全部的分枝肽复合物。用Waters PrepPak 25×10柱体容器上的半制备性色谱将含肽馏分脱盐，所述色谱柱含有用两个Jasco PU880泵以10ml/分钟径向压缩的Delta-Pak C18 300埃柱体，用100％乙腈/TFA洗脱，收集全部肽峰并冻干。冻干的物质在水缓冲液中是易溶的。HPLC分析表明分枝脂肽骨架复合物比只有脂肽骨架时的保留时间短。完成质谱并计算在所述合成中得到的分枝肽的实际数量。完成以已知浓度分枝肽的E280为基础的计算，与其理论Y/W-含量和分子量的比较。
作为一个特别优选的实施例，将修饰的Rink-MBHA-树脂以及选择性化学法用于实施例1所述的合成，即除标准Boc-保护的赖氨酸外，Mtt-和/或Dde-保护的赖氨酸。分枝肽合成的原理与上述相同，唯一的区别是简化TFA裂解和完成方法(见实施例1)和，当然，用选择性脱阻断产生连接点。
在骨架1号(表1)上，当没有其他说明时：
材料肽：
TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD(EBA肽)
LKSHMNRESDDGELYDENS(EBA肽)
来自恶性疟原虫的Ag332肽：
(VTEEI)
([VTEEI]2)
([VTEEI]3)
利什曼属(Leishmania)肽：(在骨架6号上(表1))
YDQLVTRVVTHEMAHA
EAEEAARLQA
HIV肽
LERLLL(HIV gp41肽)
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(HIV gp120肽)
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF在骨架2上，图13中的HPLC分析
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF在骨架4上
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF在骨架5上
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF在骨架6上
WGCSKLICTTAVPWN(HIV gp41肽)
LQDQARLNSWGCAFRQVCHT(HIV gp36肽)
大叶性肺炎放线杆菌肽
Tbp-2(运铁蛋白结合蛋白2型)
SGGKGSFDLEDV(肽1)
AELGGQFHHKSENG(肽4)
PalA(蛋白聚糖-相关脂蛋白)
GMTAEDLQTRYN(肽1)
TEADYAKNRAVLEY(肽5)
来自沙门氏菌属诱导的丝状假拟蛋白的肽，用亲水性筛选：
CASQRDRFQVHNPHENDA
CKSQSGIEKTTRILHHANISESTQQN
CQATAKMAEEQLTTLHVRSEQQS
合成了更多的复合物结构，其中非树状肽载体含有两个或多个不同的赖氨酸ε氨基的侧链保护基。作为携带的三种不同类型的侧链保护基的非树状肽载体用途的例子，合成表1中的结构7。棕榈酰化后，用1％TFA/5％TIS的DCM溶液将侧链Mtt基脱除，然后用连续合成法或en bloc偶联来来讲分枝肽。用乙酸酐将侧链肽的α氨基乙酰化。此后，用2％肼的NMP溶液将Dde基脱除，用SPDP将释放的氨基衍生。最后，将其与半胱氨酸延伸的肽相连。
合成下列更复杂的结构。数字指表1中的非树状肽载体结构。Lys(Dde)和Lys(Mtt)指在合成过程中分别用Dde和Mtt保护的赖氨酸残基。
Mw=分子量{[Nε(IL-1βpep-C-Cys)Lys(Dde)][Nε(gp120)Lys(Mtt)]4}-Structure 7,mw.:14862,{[Nε(IL-1βpep-N-Cys)Lys(Dde)][Nε(gp120)Lys(Mtt)]4}-Structure 7,mw.:14862,{[Nε(IFNγ-1)Lys(Dde)][Nε(gp120)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:18573,{[Nε(IFNγ-2)Lys(Dde)][Nε(gp120)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:18604,{[Nε(TNFα)Lys(Dde)][Nε(gp120)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:15231,{[Nε(IFNγ-1)Lys(Dde)][Nε(Leishmania 1)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)] -Structure 6,mw.:14594,{[Nε(IFNγ-2)Lys(Dde)][Nε(Leishmania 1)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:14625,{[Nε(TNFα)Lys(Dde)][Nε(Leishmania 1)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:11252,{[Nε(IFNγ-1)Lys(Dde)][Nε(Leishmania 2)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:11462,{[Nε(IFNγ-2)Lys(Dde)][Nε(Leishmania 2)Lys(Mtt)]4}-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:11493,{[Nε(TNFα)Lys(Dde)][Nε(Leishmania 2)Lys(Mtt)]4)-Nα[Lys(Dde)]-Structure 6,mw.:8120,其中IL-1βpep:VQGEESNDK(I1-1β(163-171)IL-1βpep-C-Cys:VQGEESNDKCIL-1βpep-N-Cys:CVQGEESNDKIFNγ1(1-39): HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG(C)IFN72(95-133):AKFEVNNPQVARAAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRCTNF-α(70-80):(C)PSTHVLLTHTIgp120:GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYEAFFLeishmania 1:YDQLYTRVVTHEMAHALeishmania 2:EAEEAARLQA
(C)指半胱氨酸残基，不是天然序列的一部分，加入它是为了通过SPDP偶联(见实施例7)。
用HPLC分析该肽的纯度，用质谱分析分子量。预期粗产物含有容易鉴定并纯化的主要肽产物(＞60％)，与上述所给在在5Da内的分子量一致。
作为计划合成的例子，在包括图1中所述3、5、6和7类型的许多骨架上合成下列肽：
[QGPGAP]4(疟疾环子孢子蛋白)
GHPLQKTY(带-3肽)
LTPLEELYP(带-3肽)
KNGMLKGDKVS(β2-糖蛋白-Ⅰ肽)
CKNKEKKC(β2-糖蛋白-Ⅰ肽)
来自人和猪IL-1β，用亲水性和同源性筛选：
见实施例3。
其他骨架还可以含有选自细胞因子肽和实施例4表中所含的混栖(promiscous)T细胞结合肽的辅助肽。具体地说，吞噬作用激素(tuftsin)-肽([TKPR]N,N=3-7)和IL-1β九肽VQGEESNDK被包含在许多线性和分枝排列中(除肽结构5(表1)中IL-1β肽的线性包函体外)。
此外，在下列实施例中将进一步说明合成肽的例子。
用质谱和反相HPLC分析所有构建体的分子量和纯度。对下列实施例中提到的所有构建体也进行这些分析。
骨架肽的少量上样
为了研究固相中非树状骨架肽载体的密度作为偶联分枝肽的支架对性能的影响，制备两种慎重低取代的(low-substituted)固相复合物，一种为31μmol/g(第一氨基酸的15分钟偶联)，另一种61μmol/g(第一氨基酸的30分钟偶联)，将两者与实施例1中Novasyn KB树脂(Novabiochem)130μmol/g左右的标准取代进行比较。在这两种情况下，在进一步合成前，用乙酸酐/DMAP阻断固相树脂上的其他连接点。通过直接合成，将模型肽GHLQKTY与非树状骨架肽固相复合物偶联，完成Kaiser检测，在合成中的每个步骤均测量Fmoc值。观察到最大量的分枝以更高的均一性更容易与低负载的固相复合物偶联。
直接与多连接点偶联
通过将α-Fmoc-K(ε-Fmoc)与非树状骨架肽载体氨基偶联来导入多连接点。在合成分枝肽的过程中，包括在第一赖氨酸后，可在任何点导入多连接点，以给连接点提供树状。应根据增加的当量数调整氨基酸和偶联试剂的偶联浓度。需要延长偶联时间以避免骨架“拥挤度”增加。
在本发明实施例中，将含Y[VYKLEAKVAKLEAK]两转α-螺旋两亲肽在正常非树状肽载体骨架上合成并用上述方法合成到双连接点取代的骨架上。在所有偶联步骤后确定Fmoc值并完成Kaiser试验。测量终产物的E280并与从分子中酪氨酸残基数的知识得到的理论值相比较。最后，进行质谱和圆二色性。认为结果表明通过选择适宜的反应条件双密度偶联是可能的，而且随着肽长度的增加，偶联越来越难进行。认为最终裂解并溶解产物的圆二色性说明了与正常衍生的非树状肽载体相比，α螺旋量相对增加。
将两种不同的肽偶联到相同的骨架中
1利用多连接点：
这可通过使用带ε氨基保护基的赖氨酸来完成，所述保护基对TFA和哌啶均是稳定的。一种所述基团是用NMP中的2％肼可裂解的Dde((1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环亚己基)-乙基)。这些赖氨酸衍生物均可从市场上购买到。将该氨基酸与非树状骨架肽偶联并用哌啶脱除Fmoc基的保护可使α氨基用于偶联第一种类型的分枝，这应用Boc-α氨基-保护的氨基终止。用NMP中的2％肼处理5×3分钟，然后NMP洗涤，ε氨基官能度用于偶联另一分枝。不能反顺序操作，因为Fmoc对肼是不稳定的。另外，HMB-接头也是肼活泼的，单短时间、低水平与非质子传递溶剂如NMP中可能不会影响HMB接头。
2在非树状肽载体的骨架部分包含其他肽或将其作为侧链或侧链的部分：
用上述原理，用非树状骨架肽，通过下列方法可将不同的肽或多肽包含在分枝肽中：
-不同保护的连接点(两种不同的肽)。
-在分枝中不同抗原的线性组合。
-在骨架肽的N-和/或C-末端不同抗原的线性组合。
如果包含在所述骨架肽中，就要给所述其他肽以足够的保护以避免那些骨架部分中的侧链取代。对位于正交连接点来说，也应将所述肽置于保护状态。如果所述肽是普遍使用的，可将其包含在一般预合成的“分枝骨架”结构中。在一实施方案中，合成了C末端衍生的实施例1的非树状骨架肽，所述C末端衍生由带有Dde-保护的赖氨酸的IL-1β肽VQGEESNDK(见实施例1，表1，结构4和5)。然后通过直接合成用该骨架肽偶联抗原HIV gp120肽，GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(见实施例5)并与下列实施例接种试验中不带IL-1β肽延伸的相同构建体进行比较。
在本发明实施例中，用实施例1中公开的非树状骨架肽，可以首先在α氨基上合成在实施例4表中所含的T细胞刺激肽，然后棕榈酰化并在ε氨基上合成抗原肽。
一种所述合成是用在α氨基上的T细胞刺激肽QYIKANSKFIGITE(破伤风类毒素830-843)和与ε氨基偶联的作为抗原肽的GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(HIV gp120肽)完成。在另一个合成中，偶联相同的抗原肽和IL-1β衍生的刺激肽VQGEESNDK。
实施例6
间接偶联：通过化学预合成的阻断肽偶联来连接
请注意，尽管这些实施例仅说明使用单连接点的合成，但在多连接点和不同保护的连接点进行类似的偶联也是可行的，只要不引入其他的非阻断功能基就可以。
以“N末端朝外”的方向偶联
在一合成实施例中，用在Novasyn KB上的Fmoc化学法合成待偶联的肽，然后在其侧链中从所述固相中裂解，用含碱溶液处理α氨基阻断形式，不包括哌啶和TFA处理。该阻断肽可直接使用而无需进一步纯化，可将其用TBTU/HOBY/NMM的NMP溶液预激活，随后以10倍，摩尔过量与固相中的骨架肽保温，直到Kaiser试验为阴性。为了得到完全偶联，而不将偶联时间延长到1小时以上，可以用激活的阻断肽的新部分重复偶联。
反向偶联
在本实施例中，在与Novasyn碱固相偶联的对酸非常活泼的3-(氨基-4-甲氧基苄基)-4,6-二甲氧基苯基-丙酸接头上合成待偶联的肽，包括α氨基Fmoc基的最后哌啶裂解，得到是酰胺的侧链保护肽。
通过戊二醛或EDC将该肽与固相结合的标准非树状骨架肽载体偶联(见实施例7)，洗涤，裂解并纯化。
实施例7
间接偶联：通过化学预合成的或重组表达的侧链非阻断肽偶联来进行连接
在此列举一些用于合成的或天然的(蛋白水解片段、重组片段等)非保护肽的化学选择性连接法的实施例。在合成或重组肽的具体情况下，在所述肽链的任何理想位置上，能够包括的具体氨基酸，特别是半胱氨酸的自由度促进了所述偶联并扩大了可以使用的偶联策略的范围。但是，确实存在用于化学选择性偶联任何序列的非保护肽的方法。
通过暂时保护与非修饰肽的标准骨架偶联
优选的暂时保护方法包括柠康酸化(citraconylation)(伯氨基保护，在低pH释放保护基)和用Fmoc琥珀酰亚胺Fmoc衍生(伯氨基保护，用哌啶释放保护基)。
在一实施例中，将2mg/ml预合成的肽溶解在0.1 M NaHCo3,pH9中，然后每毫升加入10微升柠康酸酐(CA)，用1M NaOH将pH调到9，然后再加入CA。重复该过程直到加入CA后pH保持稳定。然后在4℃保温过夜。然后每毫克肽加入10毫克EDC(1-乙基3[二甲基(氨基丙基)]碳化二亚胺，(来自Pierce Ltd.))并在加入仍与固相相连的非树状骨架肽载体前保温10分钟。随后，在室温，使该悬浮液搅拌下反应2小时。用实施例1中描述的方法完成产物(用酸除去柠康酸酐)。
在另一实施例中，用Fmoc进行暂时保护，作为加到1M碳酸盐(1当量)水/丙酮(1/1，体积/体积)溶液中的肽溶液内的琥珀酰亚胺引入，然后用浓盐酸将pH调到2，然后真空除去丙酮。用氯仿提取产物，用0.1M盐酸洗涤并从有机相中回收。
通过化学选择性连接与Cys-取代的肽的标准骨架偶联
可将半胱氨酸包含在合成或重组肽的任何位置，只要它不影响所述肽的反应性。当然，优选通过将其与赖氨酸残基的ε氨基相连，也可将其引入骨架中。如下列实施例所示，这是很重要的，因为可通过公众化学法选择性地导向半胱氨酸侧链硫醇基团，形成二硫键或更稳定的硫醚键，在硫醇与硫代羧基反应的具体情况下，通过重排形成酰胺键。
在一具体实施例中，在对应于天然序列中半胱氨酸位置的位置或在优选被转向骨架肽内的骨架肽部分，用半胱氨酸合成待游离的肽。用这种方法将下列肽偶联到非树状肽载体，结构1(表1)偶联，或在IL-1，IFNγ-1,IFNγ-2和TNFa的情况下，在表1结构7非树状肽载体中，先用Dde保护的赖氨酸侧链：
VQGEESNDKC(IL-1β)
CVQGEESNDK(IL-1β)
CPSTHVLLTHTI(TNFα)
HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQK(C)(IFNγ-1)
AKFEVNNPQVARAAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC(IFNγ-2)
CGMTAEDLQTRYN(PalA)
CTEADYAKNRAVLEY(PalA)
CSGGKGSFDLEDV(Tbp-2)CPKGGNYKYIGTWD(Tbp-2)NGSVGAVFGAK(Tbp-2)AELGGQFHHKSENG(Tbp-2)CASQRDRFQVHNPHENDA(SIF)CKSQSGIEKTTRILHHANISESTQQN(SIF)CQATAKMAEEQLTTLHVRSEQQS(SIF)
在修饰的Rink-树脂上合成这些肽并裂解、分析并纯化后，将其与非树状骨架肽偶联，在所述骨架肽中，通过以20倍摩尔过量与在NMP中SPDP反应将ε氨基转变成硫醇(导致阴性Kaiser试验)。在室温将NMP中2-3倍摩尔过量的肽偶联2小时。所述偶联开始形成二硫键，同时释放在343nm用分光光度法可测量的吡啶-2-硫酮，以表明取代程度(摩尔消光系数为8080)，发现取代占非树状肽载体中理论连接点的85％以上。此后，按常规从树脂上释放衍生的非树状肽载体。
在另一合成中，将含半胱氨酸的这些和其他肽与溴乙酰基修饰的骨架肽偶联得到硫醚。用相反的方法，将溴乙酰化的肽与半胱氨酸衍生的骨架肽偶联；在这些肽中，通过溴乙酸酐(在伯胺，通常在α氨基上)，或使用带有溴乙酰化测量的具体氨基酸(BBALInman 1991))在合成过程中引入溴乙酰基，以便在链中的任何位置包含官能度。用溴乙酸酐方法，也可以偶联天然肽片段，通过将pH保持在6.0，在0℃含水缓冲液中反应，以1/100以下的体积加入有机相中的溴乙酸酐，确保溴乙酸酐的α氨基反应性。
通过化学选择性连接与丝氨酸-取代的肽的标准骨架偶联
在特定条件下氧化后，可得到丝氨酸N末端(poly)-肽的特异性N末端偶联。所述氧化作用产生N-末端羰基功能，特别是与酰基肼(酰肼)和羟胺反应，分别得到腙和肟。
作为例子，用N末端S合成待偶联的肽，裂解并纯化，在SepPack纯化前用2mM高碘酸的50mM咪唑/HCl溶液，pH6.9氧化10分钟。然后在pH4-5的含水缓冲液中，将所述肽与酰肼衍生的非树状骨架肽载体(其中用TBTU/HOBt/NMM介导的Boc-单酰肼琥珀酸的偶联衍生游离氨基)溶液反应过夜，每种待游离的氧化肽使用2当量酰肼。用pH在4-5之间的0.2M氰基硼氢化物2天完成形成的腙与取代的肼的反应。
实施例8
间接偶联：用C末端选择性化学法通过预合成的侧链非阻断肽偶联进行连接
用化学选择性偶联，可将预合成的肽引入非树状肽载体(NDPC)上，而无需使用侧链或α氨基保护。在本实施例中，需将NDPC衍生以得到理想的选择性反应。
在计划的第一实施例中，在Novasyn KB树脂上合成待偶联的肽，然后在最后的哌啶处理和TFA处理后裂解。按实施例4中的详述，用肼的二噁烷/甲醇溶液完成裂解以得到肽酰肼，然后用制备性反相HPLC纯化。用所有连接点上的S(丝氨酸)衍生NDPC，高碘酸氧化得到α氧酰肼(在咪唑缓冲液中中性pH，见实施例7)，然后在4.5-5的pH之间用肽-酰肼反应，接着按实施例7所示将腙通过氰氢硼化物还原成肼(所有操作均在连接肽的固相上完成)。
在另一可行实施例中，用2,2-二甲氧基乙酸进行NDPC上羰基的引入，用浓缩的HCl脱保护。
在另一计划的实施例中，用特异性的Yamashiro接头(Yamashiro1988，由Schnolzer 1992和Dawson 1994使用的)，4-[(Boc-氨基酰基)硫代苄基]-苯氧基乙酸，在固相上将待偶联的肽合成为其硫代羧酸，用HF/10％对甲苯酚后得到硫代羧酸。纯化后，将所述肽硫代羧酸与固相结合的NDPC偶联，所述NDPC用溴代乙酸进一步衍生以得到溴乙酰基-取代的氨基作为连接点。预期所述终产物含有作为稳定的硫醚相连的分枝肽。
实施例9
天然衍生肽的连接
用高度的化学选择性最容易得到化学无歧义性(unambiguity)。该方法限定了方向并得到计量化学(stoechiometry)。如果天然肽含有可用上述方法进行偶联的半胱氨酸或N末端丝氨酸，就最容易达到该目的。如果情况不是这样，可暂时保护肽，然后按实施例7所述偶联。如果这样不适宜，通过优化反应物浓度、pH、温度和溶剂，用常规偶联法，即如戊醛(与氨基和硫醇偶联)、碳化二亚胺(与氨基偶联)以及间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(从氨基-到硫醇-基的偶联)达到一些选择性。这也可以与纯化步骤相结合。另一实施例是使用卤代乙酸酐以便仅在游离肽的α氨基选择性地引入如溴代-或氯乙酰基。所述基团然后与硫醇基反应。
在一实施例中，这可以用预合成的肽作为天然肽的模型来完成。在NMP中，用0.1M 2-(N-)吗啉代乙烷磺酸，pH6.0，使用通过DCC介导的激活作用制备的溴乙酸酐，以1/100(体积/体积)加到肽水溶液中，在室温保温3×3分钟(每次都加入新试剂)，将所述肽溴乙酰化。纯化后，将所述肽与半胱氨酸衍生的标准骨架肽偶联直到Ellman试验为阴性。
实施例10
通过偶联天然衍生的碳水化合物连接碳水化合物
在这些试验中，从鼠伤寒沙门氏菌LPS(脂多糖)达到碳水化合物免疫原。用中度酸处理将沙门氏菌LPS裂解成其类脂部分(不可溶的沉淀)和其碳水化合物部分(可溶的)。离心后达到可溶的LPS碳水化合物，然后以0.1M在黑暗中用偏高碘酸钠氧化，然后在Pharmacia PD-10柱上迅速脱盐。再偶联N-乙酰基-D-半乳糖胺。LPS寡糖和N-乙酰基-D-半乳糖胺构成熟知的碳水化合物表位，并在按下述方法偶联后可用单克隆抗体说明是否保持完整。
与非树状肽载体偶联
用Blomberg的方法(Blomberg,1993)在非树状骨架肽的氨基上引入碳水化合物。60℃，在DMSO中将氧化的碳水化合物以摩尔过量与固相骨架肽反应过夜，然后冷却到室温并在室温与乙酸酐(10当量)反应10分钟。
在另一实施方案中，将N-乙酰基-D-半乳糖胺通过其还原末端与非树状肽载体(NDPC)偶联以构成与Tn抗原的单克隆抗体反应的Tn抗原。
通过完成ELISA，用很容易包被的碳水化合物衍生的NDPC，在第一个试验中用鼠伤寒沙门氏菌LPS碳水化合物小鼠单克隆抗体(O链特异性抗体)并在第二个试验中用抗Tn抗原的单克隆抗体检测，来说明碳水化合物抗原结构的保留。
与酰肼-终止的“固定聚合物”偶联
在一可行的实施例中，室温下，将氧化的碳水化合物与骨架肽酰肼(见实施例4)以1/1(mol/mol)在0.1乙酸钠，pH5.5混合，并保温1小时。用SephadexG50凝胶过滤很容易纯化所得的结合物，在280nm检测。HPLC方向将表明在C-18反相柱(跑柱条件见有关图1的描述)上，在未结合的肽之前被洗脱下来。通过完成ELISA，用很容易包被的脂肽-碳水化合物复合物包被，用鼠伤寒沙门氏菌LPS碳水化合物小鼠单克隆抗体(O链特异性抗体)说明碳水化合物抗原结构的保留。
在另一实施例中，将N-乙酰基-D-半乳糖胺通过其还原末端与非树状肽载体(NDPC)偶联以构成与Tn抗原的单克隆抗体反应的Tn抗原。
另一计划的实施例涉及利用下列方法连接相同的碳水化合物抗原：
用常用的氨基-和羟基-反应性物质如碳化二亚胺、联乙烯砜成溴化氰衍生碳水化合物。然后与二胺间隔基如1,4-丁二胺反应，随后将衍生物溴乙酰化并与半胱氨酸衍生的NDPC反应。在另一实施方案中，在与半胱氨酸衍生的NDPC反应前，将所述衍生物与SPDP反应。
与酰肼取代的标准骨架偶联
在一可行的实施例中，按上述方法完成，使用通过Boc-单酰肼琥珀酸衍生的非树状载体肽以携带作为连接点的酰肼。
实施例11
半抗原的连接
半抗原可用于模型试验的标记，因为用市售抗体(带半抗原洋地黄毒苷和三硝基苯基)或抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(带半抗原生物素)可特异性检测半抗原。在与氨基偶联前，用琥珀酰亚胺酯或通过NMP中TBTU/HOBt/NMM激活的游离生物素很容易将生物素掺入到非树状肽骨架中。也可将洋地黄毒苷偶联为琥珀酰亚胺。三硝基苯磺酸与氨基迅速反应引入三苯基。在所有情况下，反应后均应进行Kaiser试验。
实施例12
通过偶联的DNA/RNA连接
可将DNA或RNA掺入到非树状肽载体或偶联为分枝、分枝部分的任何抗原部分，或作为“正交”分枝，缩合C-甲酰核苷形成亚胺键，所述亚胺键通过还原性烷基还原形成甲基烷基化胺键(Vasseur 1992)。随后，用自动DNA合成仪，优选在肽前偶联DNA并使用直接编码所需肽的偶联的DNA或结合一段通过与非树状肽载体杂交在宿主中待表达的“天然”DNA或用Klinman(1996)的CG寡核苷酸直接刺激，可将所得的3’-结合的核苷延伸成寡核苷酸。在一典型应用中，每个非树状肽载体(NDPC)只偶联一拷贝DNA。
在另一可行的实施例中，可将相应于T细胞刺激肽的寡核苷酸与用Dde或Mtt作为Boc的正交保护基选择性保护的侧链上的一特异性赖氨酸偶联。随后，通过TFA处理将其余的赖氨酸侧链脱保护，用上述方法将抗原肽直接偶联。所用的抗原肽包括GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(gp120肽)和DNA编码的T细胞刺激肽可以是例如QYIKANSKFIGITE(破伤风类毒素肽)。在另一合成中，可将一段结合DNA掺入NDPC中以结合由实施例4中提到的Thomson(1995)限定的多表位DNA。
实施例13
通过非共价引入(inclusion)的DNA/RNA连接
在本实施例中，用一多赖氨酸链在一特定的Dde-保护的赖氨酸侧链衍生非衍生的肽载体(NDPC)，所述多赖氨酸链由10和15个Dde-保护的赖氨酸(两个实验)组成，用乙酸酐给N末端赖氨酸加帽。将所述链置于保护状态下，同时将其余的骨架赖氨酸侧链脱保护并用于偶联包含GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(gp 120肽)抗原肽。此后，裂解所有的侧链保护基，并释放肽复合物，纯化然后，与纯化状态的适宜DNA或与其它限定DNA的确定化合物在中性pH和中度离子强度的含水缓冲液中混合。一种所述DNA对应于破伤风类毒素T细胞肽QYIKANSKFIGITE。另一所述化合物是每个对应于混杂(promiscous)T细胞DNA表位的DNA的混合物。所用的另一DNA是实施例4中提到的Thomson(1995)的“多表位”DNA。
实施例14
通过与PNA(肽核酸)杂交的DNA/RNA连接
按照实施例12完成这些计划的合成，在限定PNA序列的选择性脱保护的赖氨酸侧链上，用肽核酸(PNA,WO 95/01369)作为构件，所述PNA序列能通过杂交相应于T细胞刺激肽QYIKANSKFIGITE的破伤风类毒素DNA，在另一实验中，是实施例4中提到Thomson(1995)的多表位DNA结合。
实施例15
通过结合肽-结合的嵌入剂连接DNA/RNA
结合核酸的另一种方法是在结构中包含一嵌入剂。这要通过将作为硫醚的喹啉与非树状肽载体C末端包含的半胱氨酸侧链(Brown1994)偶联来完成。在Fmoc脱保护前，将半胱氨酸硫醇脱保护一般用喹啉进行取代。此外，继续合成，在最后一步，将赖氨酸侧链脱保护并将其用于偶联包含GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF(gp 120肽)的抗原肽。然后，裂解所有侧链保护基，并释放肽复合物，纯化，然后，与纯化状态的适宜DNA或与其它限定DNA的确定混合物在中性pH和中度离子强度的含水缓冲液中混合。一种所述DNA对应于破伤风类毒素T细胞肽QYIKANSKFIGITE。另一所述混合物是每个对应于混杂(promiscous)T细胞表位的DNA的混合物。所用的另一DNA是实施例4中提到的Thomson(1995)的“多表位”DNA。
实施例15A
在试剂盒中，非树状肽载体用于偶联抗原说明其用途
用下列实施例说明在试剂盒方案中，非树状肽载体(NDPC)的用途。
在Novabiochem的RINK-MBHA型固相上，合成NDPC至约0.05μmol/g-0.2μmol/g，优选0.05μmol/g-0.1μmol/g。所述NDPC包括在实施例1的序列表中，并且为了说明，除包括含选自下列侧链保护的辅助片段的NDPC外，还包括不含任何辅助片段的正常NDPC，所述辅助片段选自吞噬作用激素四聚体，白细胞介素-1九肽(VQGEESNDK)和实施例4中提到的T细胞刺激肽。合成后，通过裂解侧链保护基来裂解连接点，所述保护基与NDPC的其它侧链官能度被正交保护(见实施例1)。
在一实施例中，然后用SPDP衍生NDPC-固相，洗涤、干燥并贮存不同的时期直到检测含半胱氨酸肽的能力，所述能力通过吡啶-2-硫酮的释放和与抗固定肽抗体反应的能力来测量。待固定的肽包括实施例5的Tbp-2--肽和可用抗生物素蛋白检测的生物素化肽。
另外，可将用溴乙酰基衍生的NDPC用于连接相同的含半胱氨酸的肽。
在其它实施例中，通过EDC、DSS以及用TBTU/HOBt/NMM羧基激活或其它相等的激活方法来连接肽。此外，还可以连接阻断肽。
另外，还说明了半抗原，包括生物素和洋地黄毒苷，与碳水化合物的连接。
在所有情况下，都是用TFA释放最终的复合物并用HPLC分析。
认为所述结合用快速的两步法方法，所述两步法由结合反应和随后的释放以及常规完成。
实施例16
制备含衍生的非树状肽载体的免疫刺激复合物(Iscoms)
用标准方法(Morein 1984,Mowat1992，当前的免疫学方法，1992,Ⅳ节：“免疫刺激复合物的制备”，2.11.1-2.11.12)很容易制备免疫刺激复合物，和其本身的脂肽插入片段，所述插入片段具有免疫刺激复合物的最小干扰结构并其亲水部分朝外。
按上述合成非树状骨架肽载体，将其侧链脱保护，然后在裂解前用于偶联或合成侧链抗原肽。纯化后，按上述提到的标准方法，通过与胆甾醇、磷脂酰胆碱和quilA混合，将所述肽插入免疫刺激复合物中(Iscoms)。
作为一说明性实施例，在Pepsyn KB固相(在碱活泼的4-羟甲基苯甲酸接头上)上，以130mol/g的规模合成非树状肽载体棕榈酸酯-GKGKGKGKGKGG。完成合成后，用95％TFA/水洗涤2×15分钟除去K残基上的Boc保护基，同时Kaiser实验表明电荷从负变成正。中和并用NMP洗涤后，用2倍过量的生物素，在室温预激活10分钟后，进行2×30分钟偶联，通过TBTU/HObt/NMM连接生物素。用NMP和水洗涤后，按实施例1所述用NaOH/水裂解侧链生物素化的肽，在制备性HPLC脱盐然后冻干，然后，无需进一步纯化，按标准方法可用于通过将所述肽与免疫刺激复合物形成试剂(肽/quilA=1/5,W/W)混合，包含到免疫刺激复合物中。用蔗糖梯度超离心表征免疫刺激复合物，用电子显微镜分析馏份免疫刺激复合物的形成并HRP-链霉抗生物素蛋白ELISA分析生物素。用电子显微镜表明有很确定的正常免疫刺激复合物结构的含免疫刺激复合物的馏份，用ELISA发现在外观中也生物素-肽，其中生物素可与HR-链霉抗生物素蛋白试剂反应。甚至在广泛透析后，纯化的免疫刺激复合物立方也保留了抗生物素蛋白反应性，这用点印迹很容易说明。此外，用免疫刺激复合物的直接反相HPLC分析表明在纯化免疫刺激复合物中有肽。
实施例17
制备并使用用于连接抗原部分的负载的免疫刺激复合物
带氨基的载体
在一实施方案中，在偶联抗原分枝部分前，本发明的非树状肽载体(NDPC)脂肽包括在免疫刺激复合物中。这样可以制备现成的“负载”免疫刺激复合物，准备以一种方式en-bloc偶联分枝部分，所述方式具体地使用合成的并特别设计的NDPC脂肽为插入免疫刺激复合物的载体。
用上述方法合成标准骨架脂肽，将其脱保护，从固相上裂解下来，纯化，冻干并溶解，然后按照Morein(1984)的方法与形成免疫刺激复合物的物质一起保温。在一系列的保温中，肽与quilA的比例为1∶5左右，如1∶2到1∶10。制备免疫刺激复合物后，用电子显微镜分析其整合性和一般外观，通过游离氨基的半抗原衍生作用(用与引到氨基的三硝基苯间接结合的金标记的免疫球蛋白或金标记的抗生物素蛋白标记的生物素化氨基)，然后用电子显微镜观察分析骨架肽氨基的可利用性，用肽-负载的免疫刺激复合物的定量HPLC分析负载“密度”(每quilA的肽量)。
在一具体实施方案中，用水-可裂解的接头在固相上合成NDPC(Hoffmann,1994)。然后，通过简单将完成的但仍是固相结合的肽与免疫刺激复合物-形成试剂在含水缓冲液中混合2-24小时，然后滤掉固相，预期可得到免疫刺激复合物包封形式的肽。
用于随后偶联抗原分枝结构的相容性偶联方案包括不使用有机溶剂和/或极端pH(如Regenmortel 1988)的方法。例如，可将在实施例5表中所包含的肽用所述偶联方案偶联。将所得的肽负载的免疫刺激复合物用电子显微镜分析并用HPLC分析负载“密度”。
带有用于偶联寡糖的C末端酰肼的载体
通过简单混合PBS中的组分，在室温保温24小时，然后用蔗糖梯度纯化免疫刺激复合物，可将含C末端酰肼骨架肽(优选按上述通过肼/NMP从固相上裂解所述肽)包含在所述免疫刺激复合物中。碳水化合物部分可以是N-乙酰半乳糖胺或天然或氧化的沙门氏菌LPS O-碳水化合物(见实施例10)，然后可按实施例10所述将其连接。用电子显微镜可观察免疫刺激复合物，然后通过研究与许多碳水化合物特异性抗体的免疫刺激复合物的结合来进行分析，所述抗原包括抗Tn抗体和抗LPS抗体，这两种抗体均可用金标记的抗体的电子显微镜下观察并利用用于涂层(coating)的负载免疫刺激复合物的ELISA进行分析。
实施例18
将非树状肽载体用于免疫接种以产生抗病毒的保护作用：水貂肠炎病毒模型
在该模型中，来自犬细小病毒的病毒壳肽DGAVQPDGGQPAVRNER组成抗水貂肠炎病毒诱发的疾病的保护性表位(Langeveld 1995)。
在一实施例中，通过包含N末端半胱氨酸并与SPDP衍生的非树状肽载体偶联，将所述肽以“C-向外”的方向偶联。在相同类型的骨架肽上，通过正常依次合成得到“N-向外”方向。
作为非树状骨架肽载体，可以使用表1中的骨架肽6以及具有下列情况之一的C末端延伸的相同肽：
-破伤风类毒素T细胞刺激肽，TT(QYIKANSKFIGITE),
-IL-1β九肽(VQGEESNDK)，或
-吞噬作用(tuftsin)激素四聚体([TKPR]4)
在连接点-赖氨酸残基中使用Mtt保护的侧链，将Boc保护用于其他赖氨酸残基。
合成了相应这四组的肽并进行了HPLC和MS分析后，通过给下列组的动物皮下注射50-200μg肽构建体的1000μlPBS溶液来完成免疫接种：
骨架[C-向外]4
骨架[N-向外]4
骨架[C-向外]4+Alhydrogel
骨架[N-向外]4+Alhydrogel
骨架-TT肽[C-向外]4
骨架-TT肽[N-向]外4
骨架-吞噬作用激素[C-向外]4
骨架-吞噬作用激素[N-向外]4
骨架IL-1[C-向外]4
骨架IL-1[N-向外]4
(10组动物，每组4只)
免疫接种后，在21天用全病毒攻击，在攻击后14天检查动物的感染情况(分离病毒)和临床疾病。用相关免疫接种肽作为包被抗原，通过ELISA检测效价。
实施例19
在诊断感染性疾病的过程中用非树状肽载体作为诊断试剂
用下列实施例说明非树状肽载体在诊断免疫检测中的用途，其中衍生于感染试剂的肽序列被来自与感染试剂接触的人源样品中的抗体识别。
用于检测HIV-1和HIV-2感染的诊断性免疫检测
实验-血清组
将来自Boston Biomedica的实验血清组用于整个诊断实验。
制备携带HIV-1和HIV-2特异性之肽的非树状肽载体
选HIV-1特异性并常被HIV-1感染患者识别的下列肽序列用于HIV-1：
gp41(aa598-609)：
Leu-GLy-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ile-Cys
选HIV-2特异性并常被HIV-2感染患者识别的下列肽序列用于HIV-2：
gp36(aa587-605)：
Leu-GLn-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr
按照实施例1和2中所述的方法，通过将肽序列与非树状肽载体偶联生产不同诊断组分。
非树状肽载体提供了多聚体呈递各肽序列，所述肽序列可用于不同的诊断检测，包括ELISA，线印迹(line-blotting)和凝集检测。
将携带HIV特异性肽的每个非树状肽载体与不与载体肽相连的相同的肽以及相应于重组蛋白HIV-1 gp41同时检测。
ELISA检测
将合成的肽涂在Maxisorp微滴定板(Nunc,Roshilde,Denmark)上。将肽(10μg/ml)涂在含100nM NaCHCO3,pH9.6或0.1mM甘氨酸-HCl,pH2.5的平板中。将所有涂覆均在4℃过夜完成。将孔用0.5M NaCl,3mM KCl,1mM KH2PO4,8mM NaH2PO4,2H2O,1％Triton X-100洗涤4次。在完成下列每个保温步骤后，重复所述洗涤过程：
1)将在保温缓冲液(洗涤缓冲液加15mM牛白蛋白，pH7.2)中的血浆样品，1％(v/v)在室温保温1小时。
2)将用保温缓冲液稀释的辣根过氧化物酶结合的兔抗人特异性抗体(DAKO,Copenhagen,Denmark)以每孔100μl在室温小加入1小时。
每孔加入100μl溶解于含0.015％(v/v)H2O2的100mM柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0中的0.67mg/ml 1,2-苯二胺氯化物(DAKO)后，定量分析酶活性。通过每孔加入50μl 2.5M H2SO4终止反应，在492nm用ELISA扫描器测量光密度。
所有实验均一式两份。
结果
通过分别检测不同浓度的肽和与载体偶联的肽使ELISA方法最佳化。图5说明HIV血清阳性供体对gp41(aa598-609)肽(单独检测的和与载体相连的)稀释曲线的抗体反应。通过检测不同浓度的肽使ELISA方法最佳化。
图6说明用从抗经gp36(aa587-605)肽衍生的非树状肽载体的HIV-2血清阳性和阴性供体得到的血清的稀释曲线。在所检测的所有稀释度的HIV-2血清阳性血清中均得到阳性信号，而在所有检测稀释度中血清阴性对照血清均为阴性。
图7说明用固定稀释度的血清得到的结果，所述血清获自抗单独的或偶联到非分枝肽载体JP36肽的HIV-2和HIV-2血清阴性供体。还检测了该血清抗重组蛋白HIV-2gp36。在使用与非树状肽载体偶联的gp36肽的检测中，所有血清阳性供体血清均是反应性的，而用血清阴性对照血清检测不到反应。
图8说明血清得到的稀释曲线，所述血清得自抗单独的gp36肽和与非树状肽载体偶联的一个HIV-1血清阳性供体和一个HIV-2血清阴性供体。还用重组HIV-2 gp36检测了所述血清。与仅有肽的情况相比，与载体偶联的肽在较高稀释度的血清阳性血清也被识别。
将没有任何修饰的与非树状肽载体偶联的HIV-2特异性gp36肽与全重组HIV-2 gp36蛋白质一样均可用于诊断目的。在比单独肽低的稀释度，HIV-2血清阳性血清也识别与非树状载体偶联的gp36肽。
用于HIV-1和HIV-2诊断的点印迹检测
方法
将用HIV肽衍生的非树状肽载体(约50μg/ml)与所述肽本身以2.5μl的体积涂在硝酸纤维素膜上。用0.05M Tris缓冲液pH7.4+0.5MNaCl+0.5％吐温20阻断硝酸纤维素膜。将用检测缓冲液：0.05 M Tris缓冲液pH7.4+0.5MNaCl+0.5％吐温20稀释的实验血清保温1小时。洗涤后，将硝酸纤维素膜与检测缓冲液保温2次，用过氧化物酶结合的抗人免疫球蛋白接着保温。用底物3-氨基-9-乙基咔唑检测具有肽反应性的人免疫球蛋白。肉眼观察实验结果。
第一次筛选
用来自约10名HIV-1患者，5名HIV-2患者和50名未感染个体的一组血清完成第一次筛选。
评估检测的灵敏度和特异性，通过血清样品的重复实验测量检测的重现性。
第二次筛选
用低抗效价的HIV-1病毒抗体14个血清完成第二次筛选。使用具有低或不确定HIV反应性的血清的所述实验可以评估与其他商业化检测相比，在检测抗HIV感染的抗体过程中非树状肽的灵敏度和特异性。
第三次筛选
用来自约5名供体的血清完成第三次筛选，在感染后血清转变附近时已从所述供体收集了数次血液样品。该实验评估从接触到人开始生产HIV-1特异性抗体的血清转变的时间窗口的大小。
实施例20
将用免疫原肽衍生的非树状肽载体用作疫苗
将用免疫原肽衍生的非树状肽载体用与免疫接种目的以刺激抗任何免疫原试剂的抗体和T细胞反应。因此，可将非树状肽载体用于接种目的以产生抗病原体微生物的保护作用。下文给出非树状肽载体的所述用途的一个例子，其中小鼠免疫接种以使其抗寄生虫疾病疟疾。
用通过肽序列衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠，所述肽序列来自恶性疟原虫的红细胞结合抗原-175
材料和方法
用通过下列合成肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠：
TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD
该肽衍生于疟疾寄生虫恶性疟原虫。该肽含有与红细胞的寄生虫侵染有关的红细胞结合抗原-175序列(EBA-175)。但是在感染过程中，免疫系统通常不识别所述序列。
实验设计
在这些研究中使用6-8周龄的F1雌性小鼠(C57B1xBALB/c)。
用和不用与氢氧化铝的吸收作用，通过用16μg与纯化蛋白质衍生物(PPD)结合的EBA-175肽衍生的非树状肽载体，在0、21和49天腹膜内免疫接种BDG接触(primed)过的小鼠3次。
在第二组实验中，通过没有任何结合的EBA-175肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠。在0、21和49天，用16μg衍生的非树状肽载体腹膜内免疫接种一部分小鼠3次，而在0、21和49天，用16μg与弗氏完全佐剂(第一次免疫接种)或不完全佐剂(第二次和第三次免疫接种)1+1混合的衍生的非树状肽载体皮下免疫接种另一部分小鼠。
在-1、12、33和61天，取小鼠血。从血样中收集血清，然后用ELISA检测对用于免疫接种之肽的抗体反应性。
在ELISA中与合成肽的血清抗体反应性
将与卵白蛋白(1μg/ml)结合的合成肽100mM NaHCO3,pH9.6中在包被Maxisorp微滴定板(Nunc.Roskilde,Denmark)。所有包被均在4℃过夜完成。用0.5M NaCl,3mM KCl,1mM K2HPO4,8mM Na2HPO4,1％TritonX-100将孔洗涤4次。在每个下列保温步骤后，均重复上述洗涤过程：
1)将用保温缓冲液(洗涤缓冲液加15mM牛白蛋白，pH7.2)制备的1％(v/v)小鼠血清在室温保温1小时，
2)每孔加入100μl用保温缓冲液稀释的生物素化兔抗小鼠IgG抗体(Amersham)，和
3)室温下，每孔加入100μl用保温缓冲液稀释的链霉抗生物素蛋白过氧化物酶(DAKO,Copenhagen,Denmark)1小时。
每孔加入100μ1溶解于含0.015％(v/v)H2O2的100mM柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0中的0.67mg/ml 1,2-苯二胺氢氯化物(DAKO)后，定量分析酶活性。通过每孔加入50μl 2.5M H2SO4终止反应，在492nm用ELISA扫描器测量光密度。
在每个ELISA微滴定平板上，检测一个阳性对照血清和一个阴性对照血清以及不含血清的对照孔(背景)。所有实验均做两份。
结果
图9说明小鼠在应答通过EBA-175肽-PPD结合物衍生的非树状肽载体的免疫接种过程中，产生了抗体。在免疫接种3次后可检测到最强的抗体反应。在一次免疫接种后，但不在2或3次免疫接种后，对氢氧化铝的吸收提高了抗体产生。
图10说明小鼠在应答通过与弗氏佐剂混合的EBA-175肽衍生的非树状肽载体的皮下免疫接种过程中，产生了肽特异性抗体。2次免疫接种后可检测到反应。有些小鼠在仅用非树状分枝肽腹膜内免疫接种3次后也有弱肽特异性抗体反应。
IgG1反应性是Th2反应性的标志，而IgG2a反应性是Th1反应性的标志。
用EBA-175肽和弗氏佐剂衍生的非树状肽载体免疫接种的小鼠对所述肽有IgG1和IgG2a反应性(图14和15)。
用每个用来自HIV-1肽序列衍生的两种不同非树状肽载体免疫接种
用经具有如下氨基酸序列的来自HIV-1gp120的肽aa152-176衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠：
GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
该肽具有已知的B-和T细胞表位。
用作与非树状肽载体相连之疫苗的另一种肽所由下列氨基酸序列组成的来自HIV-1 gp41的肽：
LERLLL
该肽具有白细胞介素-2同源性(ReiherⅢ,1986)。
实验设计
在这些实验中使用6-8周龄雌性BALB/cJ小鼠。
在0、21和49天，用16μg经HIV-1肽衍生的非树状肽载体腹膜内免疫接种一组小鼠3次，而在0、21和49天，用16μg经与弗氏完全佐剂1+1混合的HIV-1肽(第一次免疫接种)或不完全佐剂(第2次和第3次免疫接种)衍生的非树状肽载体皮下免疫接种另一组小鼠3次。
在-1、12、33和61天，取小鼠血。从血样中收集血清，然后按有关疟疾的描述，用ELISA检测对用于免疫接种之肽的抗体反应性。
结果
图11说明在用与弗氏佐剂混合的衍生的非树状肽载体皮下免疫接种后，小鼠对gp120肽产生了反应。在第3次免疫接种后可检测到最强反应。
在用仅经gp41肽衍生的非树状肽载体腹膜内免疫接种后，小鼠对gp41肽也产生了弱反应(图16)。有些小鼠接受了用gp120和gp41肽组合衍生的非树状肽载体。这些小鼠产生GP-41特异性抗体(图16)。
对分别与弗氏佐剂混合的gp-120肽衍生的非树状肽载体与弗氏佐剂混合的gp-120肽和gp-41肽衍生的两种非树状肽载体皮下免疫接种后，小鼠对重组蛋白质gp-120和gp-41均有反应性(图17和18)。
对用经与弗氏佐剂混合的gp120肽衍生的非树状肽载体皮下免疫接种后，小鼠产生gp120肽特异性IgG1和IgG2a抗体，但如果在免疫接种过程中，用gp120肽衍生的非树状肽载体与用gp41肽衍生的非树状肽载体混合，IgG2a反应就会消失(图19和20)。
对分别用经与弗氏佐剂混合的gp-120肽和gp-41肽衍生的两种非树状肽载体皮下免疫接种后，消失产生gp41特异性的IgG1和IgG2a抗体，而在用仅与弗氏佐剂混合物的gp41肽衍生的非树状肽载体皮下免疫接种后，没有检测到反应(图21和22)。gp120肽作为gp41肽的载体提供了T细胞刺激作用，以诱导对gp41肽的IgG反应。
其它疫苗构建体
氨基酸序列的重复
为了评估重复氨基酸序列在免疫原性肽中的重要性，按照与有关疟疾肽描述相同的方法，检测肽(VTBEI)1,(VTBEI)2，和(VTBEI)3。
B细胞和T细胞表位的引入(inclusion)
除所需免疫性所针对分子外，通过数种方法如通过在非树状肽载体中引入作为肽的一种或多种B细胞和T细胞表位，可进一步提高肽构建体的免疫原性。
广泛T细胞表位的引入具有克服MHC限制的作用。这可通过将来自T细胞表位的肽与非树状肽载体以及免疫接种所针对的肽相连来检测。可下列肽的用途为基础，使用免疫原性肽与具有T细胞表位功能的肽的组合：
QYIKANSKFIGITEL
和
FNNFTVSFWLHRVKVSASHLE
已知这两种序列均是广泛T细胞表位(见Wang,1995)并可与下列肽组合使用：
(QGPGAP)4(疟疾特异性)
和TCTKEYEDIVLKSHMNRESDD(来自红细胞结合抗原-175)
用实施例20中描述的实验设计完成所述肽的检测。
其它有用的表位
同样，在仅含非树状肽载体或组合的情况下，可以包含许多其它有用的表位。所述有用的表位包括用于刺激细胞毒T细胞的Tcyt表位，用于激活免疫系统的类脂或吞噬作用激素序列，以及细胞因子或生物活性的细胞因子序列。
可将重组或天然免疫调节剂如细胞因子与非树状肽载体构建体一起插入到免疫刺激复合物中。细胞因子可包括如白细胞介素1-18，干扰素γ、干扰素α、干扰素β和TNF(肿瘤坏死因子)。或者可将生物活性细胞因子特异性氨基酸序列作作为部分序列包含在分枝肽构建体中。
也可将序列其它HIV-1肽按上述实验使用。所述肽包括来自gp120和gp41的各种其它肽序列。
实施例21
在各种疾病的治疗方法中，用非树状肽载体作为治疗剂
用能够预防或治愈疾病或缓解疾病的肽序列衍生的非树状肽载体构成了本发明很有用的方面。
为了说明本发明的这种应用，下面给出实施例：
非树状肽载体用于治疗脓毒样疾病
由来自微生物的磷脂如革兰氏阴性菌的类脂A和含疟疾寄生虫结构的磷脂酰肌醇诱发了脓毒氧疾病表现。β-2-糖蛋白Ⅰ是已知通常与负电荷磷脂结合的血清蛋白。通过将该糖蛋白的序列与非树状肽载体相连，可介导与磷脂的结合，由此特异性地导向任何用疾病预防或治愈剂衍生的非树状肽载体。
合成下列肽：
β-2-糖蛋白Ⅰ肽aa268-278：
KNGMLKGDKVS
该肽结合抗磷脂的抗体并因此也与自身免疫性疾病有关。
β-2-糖蛋白Ⅰ肽aa281-288：
CKNKEKKC
该肽结合磷脂。
用3个体内实验检测单独的肽和用所述肽衍生的非树状肽载体对脓毒样疾病表现有保护作用。实验涉及测量TNF(肿瘤坏死因子)水平。
实验设计
治疗方案
在每组使用2只8-12周龄的(C57BLxBALB/c)F1小鼠。将肽与刺激毒素(10μg脂多糖)混合，然后将混合物腹膜内注射到小鼠中。
为了进行TNF检测，在注射刺激毒素前7-10天，将小鼠与BCG接触。
血液收集
将10μl尾血收集为EDTA血浆，完成下列取血后用于TNF检测：
0、1、2和4小时后。
细胞生存力
用锥虫蓝(tryphaneblue)排除评估细胞生存力。
TNFELISA实验
按照制造商(Genzyme,Cambridge,MA)说明的商业化ELISA方法，测量鼠TNF水平。
结果
如用鼠血清中肿瘤坏死因子浓度测量的，非树状肽载体降低了小鼠中脂多糖的毒性。
用CKNKEKKC肽或KNGMLKGDKVS肽衍生的非树状肽载体抑制了小鼠体内有脂多糖诱发的TNF分泌，而单独用对照肽没有引起阻断(图23)。
其它疾病
本发明非树状肽载体的其它治疗用途包括将HIV-1蛋白酶抑制剂肽与所述构建体相连或连接将血-脑屏障特异性肽如具有下列氨基酸序列的E-选择蛋白：
THLVAIQNKEEIEYL
或具有下列氨基酸序列的百日咳毒素：
RALTVAELRGSGDLQEYL
参见实施例28。
实施例22
通过将β-2-糖蛋白Ⅰ肽与非树状肽载体相连抑制疟疾抗原诱导的细胞因子分泌
背景
恶性疟原虫疟疾寄生虫的的致病性似乎与寄生虫增殖、与内皮细胞的细胞粘附和其细胞因子如TNFα和IL-6的诱导作用有关。设计疟疾药物以阻断寄生虫的增殖，但是尽管最近的研究表明氯喹降低来自因脂多糖刺激的人单细胞的TNFα分泌，但对其干扰寄生虫细胞粘附或细胞因子分泌的寄生虫诱导作用的能力仍没有什么研究。在用疟疾药物消除了寄生虫后，非洲儿童仍可能死亡，这可能是由于大脑中的炎症反应。药物介导的对寄生虫细胞粘附或寄生虫诱导的细胞因子生产的干扰可能会降低由疟疾寄生虫引起的死亡率和发病率。
材料和方法
合成的肽
β-2-糖蛋白Ⅰ肽aa281-288：
KNGMLKGDKVS
该肽结合抗磷脂的抗体并因此与自身免疫性疾病有关。
β-2-糖蛋白Ⅰ肽aa281-288：
CKNKEKKC
该肽结合磷脂。
疟疾寄生虫培养物
通过用21mM碳酸氢钠，25mM HEPES缓冲液和10％人血清补偿的RPMI 1640，以连续培养保持恶性疟原虫(P.falciparum)分离物3D7。使寄生虫在4％v/v O型阳性人红细胞中生长。
用于刺激细胞因子生产的恶性疟原虫外抗原
将来自不同丹麦人供体的人外周血单核细胞悬浮在RPMI 1640中的3％(v/v)人血清中，并调整到每ml有2×106个细胞；随后，将0.1ml1640分散到96孔微滴定板的孔中。然后加入用含3％血清的RPMI 1640稀释的2倍稀释的肽(0-100μg/ml)和最佳浓度的刺激疟疾抗原，达到0.2ml的总体积。将单核细胞分别与不含肽的刺激抗原、细胞和与作为阳性和阴性对照的单独培养基保温。保温过夜进行培养物的IL-6和TNF检测。
IL-6的ELISA
收集上清液并用有下列改动的ELISA方法(Hansen等，1991；Jakobsen等，1993)进行Ⅰ-6检测。在4℃，用每孔100μl的2.5μg/ml对在100mMNaHCO3,pH9.6中的人重组IL-6的兔多克隆IgG涂覆ELISA Maxisorp平板(NUNC,Roshilde,Denmark)24小时。用100μl/孔的2％人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.2将非连接位点阻断(block)1小时(37℃1小时)
用2.5％NaCl,0.1％吐温20(Mergk,Darmstadt,Germany)将孔洗涤4次。在下列的每个保温步骤后完成所述洗涤步骤：
1)将用保温缓冲液(4％(v/v)正常兔血清，(DAKO码X902),1％聚乙二醇(分子量6000),2.5％NaCl,0.2％吐温20的磷酸缓冲的盐)制成50％(v/v)的100μl培养上清液在37℃保温2小时，将用相同保温缓冲液稀释的重组细胞因子标准物与待测上清液平行检测。
2)将生物素化的抗重组IL-6兔抗体(在人血清白蛋白、中1.5μg/ml,在PBS中的0.1％吐温20)以每孔100μl在37℃小加入11/2小时。
每孔加入100μl溶解于含0.015％(v/v)H2O2的100mM柠檬酸-磷酸缓冲液，pH5.0中的0.67mg/ml 1,2-苯二胺氯化物(DAKO)后，定量分析酶活性。通过每孔加入50μl 2.5M H2SO4终止反应，参考在620nm的实验参考值，在490nm用ELISA扫描器测量光密度。
结果
如通过肿瘤坏死因子和白细胞介素-6的分泌测量的，非树状肽载体抑制疟疾寄生虫毒素的体外活性。所述肽在体外不影响脂多糖毒性。疟疾寄生虫毒素活性的抑制作用不是由对细胞的毒性引起的，因为细胞生存力没有受到影响。
在预实验中，用CKNKEKKC肽衍生的非树状肽载体抑制由疟疾抗原诱导的IL-6的分泌，而单独的对照肽对IL-6的分泌只有很小的阻断作用(图12)。在图中列出了两个实验的平均值。
用CKNKEKKC肽衍生的非树状肽载体抑制了用疟疾寄生虫外抗原刺激的人单核细胞的TNF-α和IL-6两者的分泌(下列表3)。对照肽没有阻断作用。肽阻断的脂多糖没有一个诱导细胞因子分泌(下列表4)。另外，没有一个肽影响细胞生存力(下列表5)，这说明肽构建体没有毒性或只有很低的毒性。
表3
用肽CKNKEKKC或KNGMLKGDKVS衍生的衍生非树状肽载体(NDPC)和对照CKNKEKKC肽体外对人外周单核细胞的疟疾外抗原诱导的TNF-α和IL-6分泌的抑制百分比。列出了平均值和标准偏差。
    表3
    肽(μg/ml)     TNF-α     IL-6
    CKNKEKKC(NDPC)2001005025     n=761.9％(28.6)47.5％(27.4)50.0％(36.5)34.2％(27.7)     n=755.5％(33.2)34.4％(41.2)40.8％(38.8)24.8％(37.0)
    CKNKEKKC(对照)2001005025     n=719.6％(15.7)15.7％(10.3)10.7％(36.5)12.2％(18.2)     n=70.7％(9.4)-6.2％(6.7)-2.4％(11.4)-3.7％(9.4)
    KNGMLKGDKVS(NDPC)20010050     n=713.9％(19.9)-8.9％(27.0)14.0％(25.0)     n=719.9％(18.8)5.3％(6.4)1.7％(15.2)
    25     85％(19.4)     -7.6％(7.4)
表4
用肽CKNKEKKC或KNGMLKGDKVS衍生的衍生非树状肽载体(NDPC)和对照CKNKEKKC肽体外对人外周单核细胞的大肠杆菌脂多糖诱导的TNF-α和IL-6分泌的抑制百分比。列出了平均值和标准偏差。
    表4
    肽(μg/ml)     TNF-α     IL-6
    CKNKEKKC(NDPC)2001005025     n=4-7.7％(17.5)-15.0％(25.1)-27.0％(21.7)-14.4％(41.7)     n=4-13.0％(6.1)-13.0％(3.1)-22.5％(7.2)-12.9％(4.4)
    CKNKEKKC(对照)2001005025     n=4-5.6％(7.7)3.9％(22.7)9.1％(7.5)10.9％(20.0)     n=4-6.6％(7.1)-9.5％(10.2)-4.7％(2.6)-2.7％(2.7)
    KNGMLKGDKVS(NDPC)2001005025     n=416.4％(34.3)2.6％(22.9)9.5％(50.6)-3.7％(42.5)     n=42.0％(8.6)-4.9％(6.4)-8.5％(7.9)-7.7％(7.4)
表5
与肽和疟疾寄生虫外抗原保温后单核细胞生存力百分比。给出了3个实验的平均值和标准偏差。不含肽时抗原刺激后的细胞生存力为96.3％(1.04)，而不刺激后，细胞生存力为96.9％(2.95)。
    表5
 CKNKEKKC(NDPC)     有抗原     无抗原
    200μg/ml     96.3％(1.99)     96.4％(1.89)
    100μg/ml     97.1％(1.45)     97.8％(1.43)
    50μg/ml     94.6％(1.01)     96.7％(0.71)
    25μg/ml     94.5％(3.26)     96.9％(3.26)
    CKNKEKKC(对照)     有抗原     无抗原
    200μg/ml     98.0％(1.45)     96.5％(0.72)
    100μg/ml     96.8％(1.81)     97.3％(0.97)
    50μg/ml     97.2％(1.91)     96.0％(2.50)
    25μg/ml     97.5％(1.67)     98.2％(1.78)
    KNGMLKGDKVS(NDPC)     有抗原     无抗原
    200μg/ml     96.4％(2.76)     95.6％(3.01)
    100μg/ml     97.4％(1.85)     96.9％(1.00)
    50μg/ml     96.7％(1.98)     95.2％(2.29)
    25μg/ml     97.4％(1.44)     96.1％(1.75)
实施例23
用非树状肽载体下调与自身免疫性疾病有关的免疫系统
非树状肽载体可包括免疫原性肽和对任何免疫原性试剂引起的免疫反应有特异性下降调节作用的生物活性肽。或者，可将用免疫原性肽衍生的非树状肽载体与免疫抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β联用，以特异性下调抗任何免疫原性试剂的免疫反应。因此，可诱导对特异性肽或肽片段的耐受性。可将该策略用于抗毒性疾病、自身免疫性疾病(糖尿病、关节炎，硬化等)的保护作用或用于其的治疗方法。
下文给出调节作用的一个例子。用通过疟疾EBA-175肽衍生的非树状肽载体将小鼠免疫接种3次，诱导抗所述肽的高抗体反应。然后将用EBA-175肽衍生的非树状肽载体与鼠IL-10混合，第4次完成免疫接种，然后取血并筛选肽特异性抗体。
材料和方法
用含下列模型肽的非树状肽载体构建体免疫接种小鼠：
TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD
该肽衍生于疟疾寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。该肽含与红细胞的寄生虫侵染有关的红细胞结合抗原-175(EBA-175)的序列。但是在感染过程中免疫系统通常不识别该序列。
在这些研究中使用6-8周龄雌性(C57BIxBALB/c)F1小鼠。
用EBA-175肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠。在0、21和49天，用16μg以1+1与弗氏完全佐剂(第一次免疫接种)或不完全佐剂(第2次和第3次免疫接种)混合的肽构建体皮下免疫接种一部分小鼠。在第70天，用含和不含1μg鼠重组IL-10的与弗氏不完全佐剂混合的肽构建体皮下给小鼠进行第4次免疫接种。
在第-1、12、33、61和82天取小鼠血。从血样中收集血清，然后用ELISA检测抗对照EBA-175肽的抗体反应性。
按本专利申请实施例20中的描述完成ELISA。
结果
将对EBA-175肽加弗氏完全佐剂产生反应的8只小鼠再免疫一次(第4次免疫接种)。4只接受EBA-175加弗氏不完全佐剂衍生的非树状肽载体，4只接受上述试剂再加鼠重组IL-10(免疫系统下调剂)。
图24说明单独用肽-佐剂组合免疫的小鼠在抗体反应方面有稳定或轻微的下降而用肽-佐剂组合加IL-10免疫的小鼠在抗体反应方面有显著的下降。
另外，通常可将非树状肽载体构建体用于延长任何药物如肽药物在循环中的存在时间。
实施例24
用免疫原性肽衍生的非树状肽载体用于特异性诱导Th1-样和Th2-样反应
可将用免疫原性肽衍生的非树状肽载体与特异性诱导对任何免疫原性试剂的Th1-样和Th2-样反应的细胞因子联用，因此，与特异性诱导该反应相关，可将非树状肽载体与细胞因子用于抵御病原微生物的接种疫苗，用于治疗感染性疾病，自身免疫性疾病的治疗方法。可将特异性诱导的Th1-样反应用于抵御疾病如利什曼病、结核和可能的AIDS，并用于治疗过敏性疾病等的治疗方法，而可将特异性诱导的Th2-样反应用于抵御蠕虫病并用于治疗毒性疾病(脓毒、脑膜炎等)的治疗方法。
下文给出用非树状肽载体调节免疫系统的例子，其中用合成的人免疫缺陷性病毒-1特异性肽或利什曼主要特异性肽免疫小鼠。
材料和方法
用下列一种或多种不同模型肽(model-peptide)衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠：
HIV-1肽gp120,
aa152-176(GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF),
具有已知的B和T细胞表位。
L1:YDQLVTRVVTHEMAHA
报道所述利什曼特异性肽含有T细胞表位。
L2:EAEEAARLQA(在Balb/C小鼠中限于Th2表位的H-2d)。
细胞因子肽：
IFN-γ生物活性序列：
IFN-γ(1-39)
HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG
IFN-γ(95-133)
AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
TNF生物活性序列(TNF70-80)：
Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ile-Thr-His-Thr-Ile
吞噬作用激素(Tuftsin)肽：
TKPR
购买重组鼠IFN-γ、IL-4、IL-12和TNFα。
将合成的γ干扰素、IL-12或IL-18肽序列或其重组用于诱发Th1反应。将合成的IL-4、IL-5或IL-13的肽序列或其重组体用于诱发Th2反应。加入粘附分子如B7-1、B7-2、P-选择蛋白或E-选择蛋白也可以影响Th1和Th2反应。肽和/或细胞因子和/或粘附分子可单独使用或与载体、佐剂一起使用，或插入到免疫刺激复合物、脂质体等中。
肽的剂量以及不同抗原呈递细胞的加入也可以影响Th1和Th2反应的诱导。
实验方法
在这些研究中使用6-8周龄的BALB/cJ小鼠(报道是Th2反应者小鼠)。用不带任何结合物的利什曼或HIV-1肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠。在第0、21和49天，用16μg肽构建体腹膜内免疫接种一部分小鼠3次，而在第0、21和49天，单独用16μg肽或以1+1与明矾、明矾和重组细胞因子或弗氏完全佐剂(第一次免疫接种)或弗氏不完全佐剂(第2次和第3次免疫接种)混合的肽构建体免疫接种另一部分小鼠。
在第-1、12、33和61天取小鼠血。从血样中收集血清，然后用ELISA检测IgG2a(Th1的标志)和IgG1(Th2的标志)抗利什曼肽或HIV-1 gp120肽的抗体反应性。
按本专利申请实施例20中的描述完成ELISA。
收集外周单核细胞、淋巴结细胞和脾细胞，然后用所述肽、重组gp120或PPD以最佳浓度体外刺激。在保温5-7天后，收集上清液并按照制造商的说明，用商业化ELISA检测其γ干扰素(作为Th1反应的标志)的含量和白细胞介素-4(作为Th2反应的标志)的含量。可以定量分析细胞内的γ干扰素mRNA和白细胞介素-4mRNA。
结果
用利什曼肽L1的免疫接种实验：用L1肽单独加明矾或与弗氏完全佐剂或与明矾和一下列重组鼠细胞因子之一衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠：γ干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-12或IL-4。
图25说明用这些L1组合免疫接种之小鼠的IgG1反应(推测的Th2反应)。在3次免疫接种后，所有小鼠均产生IgG1。在用重组TNF、重组γ干扰素或弗氏完全佐剂免疫接种后可检测到最大反应。
用重组TNF或重组IL-12免疫接种的小鼠在2次免疫接种后产生反应。
图26说明用相同L1组合免疫接种的小鼠的IgG2a(推测的Th1反应)反应。
在3次免疫接种后，用重组TNF或弗氏完全佐剂免疫接种的小鼠产生反应。用其它L1组合可检测到弱反应。
记录到双相IgG2a反应。用大部分组合免疫接种的小鼠在1次免疫接种后就有IgG2a反应。
结论：
用经L1肽和重组细胞因子衍生的非树状肽载体免疫接种的小鼠对L1肽有强抗体反应。所有小鼠在3次免疫接种后均有强Th2样IgG1反应，尽管其中许多是用Th1细胞因子免疫接种。这意味着IgG1和IgG2a可能不是Th2和Th1反应的可靠标志，或在重复接触后，Th1细胞因子也可诱导Th2反应。在实验性感染中，报道过Th1反应是在Th2反应前发生的。我们在一次免疫接种后，记录到暂时的IgG2a反应(推测的Th1反应)。在重复免疫接种后，一部分小鼠没有IgG2a反应。在3次免疫接种后，两组中可检测的强IgG2a反应与1次免疫接种后记录的IgG2a反应非常不同。
这是个新发现，即1次免疫接种后，合成肽组合可能是免疫原性的。只对DNA疫苗和减毒的微生物记录到过所述发现。1次免疫接种后，IgG2a反应可能是Th1反应的标志。
用经L1肽和吞噬作用激素衍生的非树状肽载体皮下和腹膜内免疫接种小鼠。小鼠对皮下L1-吞噬作用激素构建体有强IgG1反应，对腹膜内L1-吞噬作用激素构建体和对皮下单独L1构建体有中度反应(图27)。L1-吞噬作用激素组合不诱导IgG2a反应(图28)。因此，吞噬作用激素是令人感兴趣的，即它仅诱导免疫系统的一种分枝。
用通过含2个不同序列的γ干扰素的肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠，报道所述序列介导与γ干扰素受体的结合。在皮下免疫接种3次后，不同组合是免疫原性的(图29)。用L1和两种γ干扰素肽免疫接种诱导了最强的IgG1反应，所述组合在2次免疫接种后是免疫原性的。在3次免疫接种后，这种组合也能诱导IgG2a反应(图30)。
不同的γ干扰素肽在腹膜内免疫接种(图31)后也能诱导相对若的IgG1反应，但不诱导IgG2a反应(图32)。
最后，再用通过L1肽以及含TNF序列的肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠。皮下L1-TNF-肽组合诱导了强IgG1反应(图33)，而腹膜内免疫接种不诱导IgG1反应(数据为列出)。
用通过L1-TNF肽组合衍生的非树状肽载体的皮下注射免疫接种也诱导双相IgG2a反应，这与用与重组TNF混合的肽衍生的非树状肽载体相当，而腹膜内免疫接种不诱导IgG2a反应(图34)。
用另一利什曼肽L2(报道是Th2诱导肽)检测结果的重现性。单独用L2肽或与吞噬作用激素或TNF肽组合的L2肽衍生的非树状肽载体均在皮下免疫接种后诱导IgG1反应，而腹膜内免疫接种不是免疫原性的(图35)。皮下免疫接种不诱导IgG2a反应，但用通过L2-吞噬作用激素或L2-TNF肽组合衍生的非树状肽载体腹膜内免疫接种在1次免疫接种后而不是三次后诱导IgG2a反应(图36)。
与HIV-1 gp120肽组合，再检测用两种γ干扰素肽组合、吞噬作用激素或TNF肽衍生的非树状肽载体。用含最大免疫原性构建体的TNF肽皮下免疫接种刺激IgG1生产(图37)。腹膜内免疫接种不是免疫原性的。
用经IFN肽或TNF肽衍生的非树状肽载体皮下免疫接种诱导双相IgG2a反应，在第一次和第3次免疫接种后可检测到反应(图38)。在1次免疫接种后，腹膜内免疫接种是免疫原性的，但在3次免疫接种后不是。含构建体的吞噬作用激素不诱导IgG2a反应。结论不用佐剂或载体，多种合成肽组合就可诱导强抗体反应。许多不同抗原肽细胞因子肽组合是强免疫原的事实完全是新发现。实施例25用免疫原性肽衍生的非树状肽载体用于特异性诱导增强的细胞反应背景：
非树状肽载体可包括免疫原性肽和生物活性细胞因子肽以特异性诱导对任何免疫原性试剂的增强的细胞反应。
或者，将用免疫原性肽衍生的非树状肽载体与细胞因子分子一起使用以特异性诱导对任何免疫原性试剂的增强的细胞反应。因此，可将非树状肽载体和细胞因子用于接种目的以抵御病原微生物，用于感染性疾病、毒性疾病、自身免疫性疾病等的治疗。
下文给出非树状肽载体该用途的一个实施例，其中用通过合成的人免疫缺陷性病毒-1特异性肽和单拷贝IL-1β肽或结构中所包含的吞噬作用激素肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠。材料和方法：将IL-1β生物活性序列：VQGEESNDK/Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys或TNF生物活性序列：Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ile-Thr-His-Thr-Ilel或吞噬作用激素序列：TKPR合成在用具有B-和T细胞表位的下列HIV-1 gp120肽衍生的非树状肽载体内的N-或C-末端：aa152-176：GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF
非树状肽载体构建体可单独使用，在与PPD结合后、插入到免疫刺激复合物或脂质体中后，加入重组细胞因子、粘附分子、佐剂、载体等后使用。
用上述实施例20中所述的相同的实验和检测方法。
在这些研究中使用6-8周龄(C57BIxBALB/c)F1小鼠。
用通过含和不含没有任何结合的IL-1或吞噬作用激素序列的HIV-1肽衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠。在第0、21、49和70天，用16μg单独的或1+1与弗氏完全佐剂(第一次免疫接种)或不完全佐剂(第二次和第三次免疫接种)混合的肽构建体免疫接种小鼠。
在第-1、12、33、61和82天取小鼠血。从血样中收集血清并用ELISA检测其对线性HIV-1 gp120肽的抗体反应性。按本申请实施例20中的描述完成ELISA。结果：
实验表明不用佐剂，单独用HIV-1 gp120肽或同时包括UL-1β特异性肽序列或吞噬作用激素序列衍生的非树状肽载体是免疫原性的。可将所述非树状肽载体结构用于人，并应用在疫苗技术中给免疫系统提供强免疫原性刺激。用单独gp120肽(Ⅱ批)、与弗氏佐剂联用、与IL-1肽联用或与吞噬作用激素肽联用衍生的非树状肽载体在3次免疫接种后可诱导抗体生产(图39)。最强的刺激剂是gp120肽加吞噬作用激素构建体。用gp120肽(Ⅳ批)，单独或与IL-1肽联用衍生的非树状肽载体在3次免疫接种后可诱导抗体生产(图40)。实施例26非树状肽载体用作癌症治疗的治疗试剂通过直接中和癌症细胞生长和/或转移以及通过诱导对癌症细胞的中和免疫反应，可用非树状肽载体治愈或抑制癌症。为了说明本发明的所述应用，下文给出实施例：材料和方法合成下列合成的肽：野生型p53肽：KYMCNSSCM突变体p53肽：KYICNSSCM以及来自蛋白质如MAGE、BAGE、GAGE、MART、melan、和胰蛋白酶或43kDa蛋白质的肽，包括：来自kDa蛋白质的QDLTMKYQIF，包括来自MART-1/Melan-A蛋白质的AAGIGILTV和ILTVILGVL来自MAGE-1的SAYGEPRKL来自胰蛋白酶的SEIWRDIDF来自GAGE的YRPRPRRY和黑色素瘤肽YLEPGPVTA
将所述肽作为对照肽或用于含或不含细胞因子(TNF-α、GM-CSF)、细胞因子肽或粘附分子如B7或B7配体CD28或CTLA-4的衍生的非树状肽载体构建体中。
使用雌性BALB/c小鼠(10-16周龄)。用36μg肽构建体将小鼠免疫接种1-3次。Tcyt活性：
用肽(约5μM)将3×106免疫脾细胞体外再刺激5-7天。
通过将所述脾细胞与51Cr-标记的靶以一式两份混合测量再刺激细胞的细胞溶解活性，然后在37℃保温4小时。用收集系统收集上清液并用γ计数器计数放射性。
用下列等式计算特异性溶解百分比：100×((实验性释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))。抗肿瘤保护作用：
用非树状肽载体免疫接种小时(每组5只)，用癌细胞(1-9×105肉瘤细胞或肥大细胞瘤细胞)静脉内或皮下攻击。每隔7小时监测肿瘤生长，至少监测21天。
将整联蛋白粘附分子序列和RGD序列的聚合物插入到非树状肽载体结构中，检测其在BALB/c小鼠中阻断黑色素瘤细胞转移的能力。
将癌细胞特异性序列或碳水化合物结构如Lex插入到非树状肽载体结构中，并用实施例19中描述的ELISA方法，用于诊断鉴定微转移。实施例27非树状肽载体抗自身免疫性疾病：保护作用、治疗和诊断
通过施用与非树状肽载体相连的有关肽，可有利地下调与例如自身免疫性疾病有关的免疫系统。
用于治疗类风湿性关节炎的该用途的一个实例是制备用于经口或全身摄取的治疗组合物，其中牛分枝杆菌HSPaa 180-188肽与关节炎相关，含有序列TFGLQELT
或具有下列序列的HLA和DnaJ HSP肽：Q(K/R)RAA，与非树状肽载体相连。
使用近亲交配的Lewis大鼠和Fisher大鼠。所有大鼠均是6-8周龄的。通过注射在弗氏完全佐剂中的结核分枝杆菌诱发关节炎。给大鼠在尾基部皮内注射100μl 10mg/ml结核分枝杆菌。临床观察大鼠的关节炎并以关节的红斑、肿胀和变形为基础，将每只爪的级别记录为0-4。所有4条腿均记录，这样最大值是16。
在诱发关节炎前约35天，用5.35和200μg肽构建体(在部分实验中加细胞因子序列和其他免疫调节序列)腹膜内或皮下将大鼠免疫接种1-3次，然后得到临床关节炎的值。在免疫接种后9天收集淋巴结淋巴细胞，检测淋巴细胞应答结核分枝杆菌和肽结构图的体外增殖、γIFN和IL-4生产。
通过检测对所述肽的鼠亚型Ig反应性，测量对肽构建体的免疫反应。
另一实施例是将与脑脊髓炎(硬化)有关的各种肽与非树状肽载体相连。所述肽的实例包括：大鼠T细胞受体，含有下列肽序列：DMGHGLRLIHYSYDDVNSTEKG,大鼠T细胞受体，含有下列肽序列：ASSDSGNTE，和髓磷脂碱性蛋白Ac1-11:AcASQKRPSQRSK，其中Ac代表乙酰基，和髓磷脂碱性蛋白p87-99：含和不含氨基酸取代的VHFFKNIVTPRTP，和来自髓磷脂蛋白脂质蛋白的NTWTTCQSIAFPSK或SKTSASIGSLCADARMYGVL或LINVIHAFQYV以及来自髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白的PGYPIRALVGD。实验方法：
使用雌性Lewis大鼠，6-12周龄，或(PL/JxSJL/J)F1小鼠或BALB/c小鼠或CBA小鼠或Biozzi ABH小鼠。
在用加有热灭活的1mg结核分枝杆菌(1+1)皮下接种前，35天或同时，用5.35和200μg肽构建体(在部分实验中加细胞因子序列和其他免疫调节序列)腹膜内或皮下将大鼠免疫接种1-3次。在第30天，用髓磷脂碱性蛋白(50μg在弗氏完全佐剂或相似蛋白质中)攻击每只大鼠。从第9天每天检测大鼠的临床信号(尾无力和肢麻痹)。或者在攻击前2天用肽构建体喂养大鼠。
在免疫接种后9天收集淋巴结淋巴细胞，检测淋巴细胞应答结核分枝杆菌和肽构建体的体外增殖、γIFN和IL-4生产。
通过检测鼠对所述肽构建体的亚型Ig反应性，测量对肽构建体的免疫反应。
另一实施例是将与糖尿病有关的各种肽与非树状肽载体相连。所述肽的实例包括：假单胞菌HSP60肽：-VLGGGCALLRCIPACDSTLPANED-PALDSLTPANEA谷氨酸脱羧酶肽GAD65253-265:IARFKNFPEVKEK谷氨酸脱羧酶肽GAD65524-543:SRLSKVAPVIKARMMEYGTT。HLA肽TPQGRP(V/A/V/S)AEY或含该序列的肽，以及调节肽：cks17:LQNRRGLDLLFLKEGGL
用3-22周龄发展了糖尿病的非肥胖型糖尿病小鼠(NOD小鼠)完成研究。用单独肽构建体(5-500μg)或与吞噬作用激素或细胞因子(肽和重组蛋白质)联用，皮下、腹膜内、经口或通过鼻给药免疫接种NOD小鼠。
通过检测鼠对所述肽构建体的亚型Ig反应性并检测通过对肽刺激体外应答的淋巴结和脾细胞增殖和γ干扰素和白细胞介素-1生产来测量对肽的免疫反应。在接种的小鼠中，约12周后，监测到发生了糖尿病。
为了评估糖尿病，杀死小鼠并将胰和唾液腺固定在福尔马林中，石蜡包埋，然后用苏木精/曙红染色并记录胰岛的病理学情况。用市售试剂盒每周监测小鼠的葡糖尿。用血糖测量仪测量血糖。
可将所述非树状载体与任何免疫调节剂或其具有调节剂活性的部分联用。相关的免疫调节剂包括白细胞介素-4、白细胞介素-10和TGF-β。
另一实施例将与hen’s卵过敏有关的各种肽与非树状肽载体相连。所述肽的实例包括：从嗜碱性粒细胞释放的抑制组氨酸的，来自卵白蛋白的EFRADHPFLF或含该序列的肽：
在4℃，将用N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(20mmol/l)-Tyrode’s缓冲液以1∶2稀释的全血(50μl)与40μl溶解在相同缓冲液中的浓度为0-28000μg/ml的肽构建体混合。37℃，将用肽预处理的血用50μl各种稀释度的过敏原攻击30分钟。4℃以1500g离心5分钟终止反应。用ELISA和放射性免疫检测测量组氨酸。该检测完成两次。从计算的组氨酸释放中减去细胞的自发组氨酸释放。测量肽构建体对组氨酸释放的抑制百分比。实施例28衍生的非树状肽载体(DNDPC)用于提高血-脑屏障对肽、药物、诊断标记和其他物质的通透性的用途
将非树状肽载体用于促进血-脑屏障转移以达到通过静脉内给药脑和神经元治疗的目的以及进行诊断的目的；用下列两个计划实施例加以说明：
将血-脑屏障降低物质包括N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酸-Ala-Glu-Dap-Ala，其中Dap是二氨基庚二酸(Spellerberg 1995)作为分枝部分与表1中标准设计的NDPC偶联。
按所述(Spellerberg 1995)，在给兔静脉内注射DNDPC后在固定时间点，通过静脉内注射4、10、20和50kDa的FITC-葡聚糖来分析血-脑屏障通透性。麻醉后，收集脑脊液并进行荧光分析。
预期DNDPC暂时提高20kDa以下分子的BBB通透性，最大通透性在DNDPC给药后4小时。
在另一实验中，将表明通过DNDPC本身的BBB,DNDPC有效提高肽特异性运输。用多拷贝选自下列一种连接部分：-YGGFM-YGGFL-LysN其中N=3-8和另一种连接部分，其中该实施例是生物素标记的模型肽：生物素-LKYGGENKPGG制备DNDPC。在计划的实验中，静脉内注射兔，用ELISA分析脑脊液的抗生物素蛋白结合。在所有情况下，与单独给药相比，当将生物素-肽作为DNDPC的一部分给药时，预期生物素-肽的存在增加。实施例29衍生的非树状肽载体(DNDPC)抑制细胞-基质连接中的用途本实施例说明衍生的非树状肽载体通过抑制癌细胞的基质粘附而停止癌细胞扩散的治疗用途。在DNDPC中，用细胞-基质结合干扰肽作为粘附肽，预期可得到很有效的抑制物质。在计划的实验中，将含选自下列序列的肽：RGDSRLDSYIGSR和其多聚体(N=2-4)(Fujiil995,Nomizu1993)与NDPC相连，然后用Nomizu等(1993)描述的实验方法或相当的方法，与相应的游离肽比较，检测对肿瘤生长和转移的体内抑制作用。
总之，为了判断转移，通过尾静脉存在或不存在肽的情况下，用剥离的黑色素瘤细胞注射小鼠，2周半左右后，杀死小鼠，计算肺菌落数。对于肿瘤生长来说，将相同的细胞皮下给予，然后每天腹膜内注射肽。在第10天，杀死小鼠并给皮下肿瘤称重。实施例30含碳水化合物抗原模拟表位(mimotopes)的衍生的非树状肽载体(DNDPC)用于生产碳水化合物特异性抗体的用途，所述抗体用于诊断和接种；应用于Tn-抗原
用抗所需碳水化合物表位的适宜单克隆抗体，通过肽文库扫描法，可确定模拟碳水化合物表位(肽模拟表位)的肽。预期所述模拟表位肽在癌症和HIV的有效免疫治疗中，可用作免疫原，而且特别是就诱导免疫记忆而言，预期它是比相应的碳水化合物抗原更好的免疫原。
Tn-抗原(丝氨酸或苏氨酸上的N-乙酰基-D-半乳糖胺)是与癌症和HIV-感染有关，在下列说明性方法中使用相应于Tn-碳水化合物抗原的模拟表位：
用RINK-MBHA固相，按实施例1所述，在非树状肽载体(NDPC)上将Tn-模拟表位肽合成为连接的抗原肽。按正常的免疫接种方案(见实施例20)并用弗氏不完全佐剂，将释放的全复合物用于免疫接种小鼠和兔。另外，可将其中包含刺激序列或与刺激序列一起给药的衍生的NDPC按实施例20所述，用于不需佐剂的免疫接种，所述刺激序列包括吞噬作用激素四聚体，细胞因子的片段或T细胞刺激肽。分析所得的抗体反应对免疫肽和Tn-表位本身的特异性。从由Sigma得到并脱唾液酸化(desialylated)的ovine颌下粘蛋白得到Tn-表位。
预期对Tn-抗原可得到良好的抗体反应性，还预期这些Tn-特异性的肽指导的抗体能够阻断HIV感染和体外合胞体形成。实施例31抗衍生的非树状肽载体(DNDPC)抗体在用于朊病毒疾病牛海绵状脑炎的免疫组织化学诊断检测中的用途
朊病毒疾病的特征是存在错折叠的朊病毒蛋白，可能是由于外源错折叠的朊病毒蛋白引起错折叠而导致的。已经表明，用抗对应于异常朊病毒蛋白质序列的合成肽产生的抗体，用对瘙痒病-感染的羊的扁桃体进行免疫组织化学活检(Schreuder 1996)，可临床前检测羊中的异常朊病毒蛋白。
为了开发用于牛朊病毒疾病的相同类型的诊断抗体，在实施例1所述的标准设计的非树状肽载体上合成朊病毒肽，随后在兔和小鼠中，按正常的免疫接种方案(实施例20)通过与佐剂共注射来生产诊断性抗体。另外，可将其中包含刺激序列或与刺激序列一起给药的衍生的NDPC按实施例20所述，用于不需佐剂的免疫接种，所述刺激序列包括吞噬作用激素四聚体，细胞因子的片段或T细胞刺激肽。可将下列每个朊病毒肽均与非树状肽载体相连，优选通过直接化学合成，以构建5个不同的免疫接种DNDPC：
GQGGTHGQWNKQ
GQWNKPSKPKTN
GGLGGYMLGSAMSRPLIH
GSD YEDRYYRENMHRYPNQVYRPVDQYSNQNN
RESQAYYQRGAS
对来自正常牛和来自海绵状脑炎临床前状态的牛的扁桃体进行活检检测抗这些DNDPC产生的抗体。
简而言之，将扁桃体活检用甲酸预处理，水合(hydrated)高压灭菌，然后将其与用PBS稀释的抗血清保温，然后检测抗体并染色(按van Keulen1995所详述的)。该处理选择性地提高了朊病毒蛋白BSE特异性形式的免疫反应性。
预期在表现出所述疾病的任何临床信号前，受影响的动物有抗体阳性活检。实施例32抗结核病免疫接种合成来自ESAT-6抗原(Brandt,1996)的下列合成肽：
YQGVGGKWDATATELNNALQ
和
MTEQQWNFAGIEAAASAIQG作为对照肽，然后与非树状肽载体衍生。将所述肽用于小鼠抗结核分支杆菌的免疫接种。实验方法小鼠：使用C57BL/6J雌性小鼠，8-12周龄。细菌：
使结核分支杆菌H37Rv在37℃生长于培养基上或用0.5％丙酮酸钠和0.5％葡萄糖富集的Sauton培养基悬浮液中。接种攻击和尸体解剖
用最佳浓度的含和不含2μg重组IL-12的合成肽构建体皮下或腹膜内将小鼠免疫接种3次。12-14周后，通过静脉内注射5×104菌落形成单位的悬浮在PBS中的结核分支杆菌来攻击小鼠。在28天的过程中，将发病过程与未免疫组小鼠的进行比较。通过将双系列10倍稀释的匀浆脾铺在Lowenstein-Jensen培养基上，计数感染小鼠脾中的细菌。在保温3-4周后，计数菌落。淋巴细胞培养物：
在前免疫接种后2-3周，分离脾细胞或淋巴结细胞。并用肽或结核分支杆菌抗原体外激活。在保温48小时后，收集平板并进行液体闪烁计数前，通过用含氘胸苷脉冲(pulsing)培养基，然后进一步保温22小时，来研究细胞增殖。
保温24小时后从平行培养物中收集培养上清液用于确定IL-2、IL-4和IL-5，在48小时后，用于确定γ干扰素。细胞因子检测：用市售ELISA试剂盒定量培养上清液中细胞因子的量。不同IgG同种型的抗体效价：在每次免疫接种后收集血清样品，然后在用肽或结核分支杆菌抗原包被的ELISA平板上以2倍稀释度分析所述样品。按实施例20对ELISA方法的描述，用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG或抗小鼠IgGl或抗小鼠IgG2a检测反应性。细胞因子mRNA的检测：裂解淋巴结细胞(106)，然后纯化总RNA。将RNA反转录成cDNA，并用各个细胞因子特异性的引物进行PCR扩增。在Southern印迹中将PCR产物与特异性标记的细胞因子寡核苷酸探针杂交。实施例33衍生的非树状肽载体用于生产抗Actinobacillus pleuropneumoniae外膜蛋白质抗体的用途
用相应于表1中2和3型的衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠，所述肽载体携带下列来自Actinobacillus pleuropneumoniae运铁蛋白-结合蛋白2型作为分枝肽：AELGGQFHHKSENG(Tbp肽4)另一组小鼠用相应于表13型的衍生的非树状肽载体免疫接种小鼠，所述肽载体携带下列来自相同细菌的蛋白聚糖相关蛋白作为分枝肽：TEADYAKNRAVLEY(PalA肽5)
将所述肽单独使用或与弗氏不完全佐剂联用。使用皮下注射。
以14天的间隔将小鼠免疫接种3次。在第一次免疫接种(0)前和每次免疫接种(1、2、3)后10天取血。
为了进行比较，用按照经典肽-蛋白质结合物免疫接种法，在BCG激发(priming)后，用通过半胱氨酸到PPD的SPDP结合的，相应肽免疫接种另两组小鼠。
用作为包被抗原的各种免疫接种肽，通过ELISA分析血样。在4℃下，将在PBS中的肽以1ug/ml过夜包被在Maxisorp(Nunc)微滴定板上。以后的操作在室温下进行。用PBS+1％BSA阻断1小时并用PBS+吐温20(0.1％)洗涤后，使用在阻断缓冲液中1/200的小鼠血清，然后保温1小时。随后，按上述洗涤平板，并用辣根过氧化物酶-结合的兔抗小鼠免疫球蛋白(DAKO)展开(develop)1小时，然后用OPD和过氧化物显色(见图41和42)。
克隆抗PPD-偶联的Tbp肽4的抗体，通过使用不同肽作为包被抗原的间接ELISA，在不同呈递(presentation)中检测所得单克隆抗体识别Tbp-肽4的能力(见图43)。
此外，通过Actinobacillus pleuropneumoniae全细胞提取物的Western印迹分析与蛋白质的反应性(未给出)。可以得出结论，用弗氏不完全佐剂对衍生的非树状肽载体的反应与用PPC-结合的肽的反应相似(见图41和42)，而且如用印迹所说明的(未给出)用两种方法均可获得蛋白质-反应性抗体。此外，单克隆抗-PPD-Tbp-肽4抗体选择性识别骨架-结合的肽，不论是在免疫刺激复合物中与否，均不识别游离肽(图43)。这证实了与本发明非树状肽载体的结合稳定了分枝肽的构型，所述稳定情况至少与用经典结合方法相当。
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                序列表(1)一般资料：(ⅰ)申请人：
(A)姓名：Peter Mikael Helweg Heegaard
(B)街道：Nordborggade 10,2.th.
(C)城市：Copenhagen
(E)国家：丹麦
(F)邮政编码(ZIP):DK-2100
(A)姓名：Palle Hoy Jakobsen
(B)街道：Magnolievej 26,Oelsemagle
(C)城市：Koege
(E)国家：丹麦
(F)邮政编码(ZIP)：DK-4600(ⅱ)发明题目：非树状骨架肽载体(ⅲ)序列数：52(ⅳ)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO:1的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:
Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Lys Ser Asp
1               5                   10                  15
Leu Val Lys His Gln Arg Thr His Thr Gly
            20                  25(2)SEQ ID NO:2的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：4个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Thr Lys Pro Arg1(2)SEQ ID NO:3的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg1               5(2)SEQ ID NO:4的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg1               5                   10(2)SEQ ID NO:5的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:6的资料：(ⅱ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:
Thr Lys Prc Arg Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg Thr Lys Pro Arg
1               5                   10                  15
Thr Lys Pro Arg
            20(2)SEQ ID NO:7的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：14个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1               5                   10(2)SEQ ID NO:8的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:9的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu His Arg Val Lys Val Ser1               5                   10                  15Ala Ser His Leu Glu
          20(2)SEQ ID NO:10的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:Asp Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu Ser1               5                   10                  15Asp Ala Leu Ile
          20(2)SEQ ID NO:11的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ )分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:11:Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1               5                   10                  15Asn Val Val Asn Ser
          20(2)SEQ ID NO:12的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ )分子类型：肽  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:Lys Leu Leu Ser Leu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly1               5                   10                  15Val Glu(2)SEQ ID NO:13的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:Leu Asp Asn Ile Lys Gly Asn Val Gly Lys Met Glu Asp Tyr Ile Lys1               5                   10                  15Lys Asn Asn Lys
          20(2)SEQ ID NO:14的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:Val Ala Lys Leu Glu Ala Lys1               5(2)SEQ ID NO:15的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:Ala Val His Lys Leu Glu His Lys Val Ala Lys Leu Glu Ala Lys Gly1               5                   10                  15Lys Gly Lys Tyr
          20(2)SEQ ID NO:16的资料：  (ⅰ)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val1               5                   10(2)SEQ ID NO:17的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：14个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17:Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe1               5                   10(2)SEQ ID NO:18的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys1               5(2)SEQ ID NO:19的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性  (ⅱ )分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr1               5                   10(2)SEQ ID NO:20的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:Tyr Gly Leu Ala Glu Leu Lys Gly1               5(2)SEQ ID NO:21的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:Gly His Pro Leu Gln Lys Thr Tyr1               5(2)SEQ ID NO:22的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:Leu Thr Pro Leu Glu Glu Leu Tyr Pro1               5(2)SEQ ID NO:23的资料：  (ⅰ)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:Lys Asn Gly Met Leu Lys Gly Asp Lys Val Ser1               5                   10(2)SEQ ID NO:24的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:Cys Lys Asn Lys Glu Lys Lys Cys1               5(2)SEQ ID NO:25的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：6个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:Leu Glu Arg Leu Leu Leu1               5(2)SEQ ID NO:26的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly1               5                   10                  15Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe
        20                  25(2)SEQ ID NO:27的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:Trp Gly Cys Ser Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:28的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln1               5                   10                  15Val Cys His Thr
          20(2)SEQ ID NO:29的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:Thr Leu Thr Lys Glu Tyr Glu Asp Ile Val Leu Lys Ser His Met Asn1               5                   10                  15Arg Glu Ser Asp Asp
              20(2)SEQ ID NO:30的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：19个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30:Leu Lys Ser His Met Asn Arg Glu Ser Asp Asp Gly Glu Leu Tyr Asp1               5                   10                  15Glu Asn Ser(2)SEQ ID NO:31的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile1           5                   10(2)SEQ ID NO:32的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：5个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ )分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:Val Thr Glu Glu Ile1               5(2)SEQ ID NO:33的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性  (ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:33:Val Thr Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Ile1               5                   10(2)SEQ ID NO:34的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:34:Val Thr Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Ile1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:35的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：14个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:35:Val Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Val Ala Lys Leu Glu Ala Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO:36的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：22个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ )分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:36:Cys Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val1               5                   10                  15Arg Asn Glu Arg Ala Thr
          20(2)SEQ ID NO:37的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:37:Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:38的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38:Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:39的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：22个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:39:Asp Met Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Tyr Asp Asp Val1               5                   10                  15Asn Ser Thr Glu Lys Gly
          20(2)SEQ ID NO:40的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:40:  Ala Ser Ser Asp Ser Gly Asn Thr Glu1               5(2)SEQ ID NO:41的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：8个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:41:Thr Leu Phe Gln Leu Glu Leu Thr1               5(2)SEQ ID NO:42的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：18个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:42:Arg Ala Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly Ser Gly Asp Leu Gln Glu1               5                   10                  15Tyr Leu(2)SEQ ID NO:43的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:43:Thr His Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys Glu Glu Ile Glu Tyr Leu1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:44的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:44:Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1               5(2)SEQ ID NO:45的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:45:Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala1               5(2)SEQ ID NO:46的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:46:Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln1               5                   10                  15Val Cys His Thr
          20(2)SEQ ID NO:47的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:48的资料：  (ⅰ)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO:49的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：12个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:49:Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys1               5                   10(2)SEQ ID NO:50的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:50:Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr1               5                   10                  15Phe Pro Ser Val
          20(2)SEQ ID NO:51的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:51:Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:52的资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:52:Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser Ser1               5                   10                  15下列第53-130号序列也在本发明的范围内：
53．VAKLEAKVAKLEAK
54．AVAKLEAKVAKLEAKGKGKY
55．KVAKLEAKVAKLEAKGKGKY
56．AVHKLEHKVAKLEAKGKGKYVQGEESNDK
57．KGKGKGL
58．KGKGKGLYL
59．WNSG
60．YLEN
61．YDQLVTRVVTHEMAHA
62．EAEEAARLQA
63．SGGKGSFDLEDV
64．AELGGQFHHKSENG
65．GMTAEDLQTRYN
66．TEADYAKNRAVLEY
67．CASQRDRFQVHNPHENDA
68．CKSQSGIEKTTRILHHANISESTQQN
69．CQATAKMAEEQLTTLHVRSEQQS
70．QGPGAPQGPGAPQGPGAPQGPGAP
71．GKGKGKGKGKGG
72．AIHKLEHKIAKLEAKGKGKY
73．PYKCPECGKSFSQKSDLVKHQRTHTG
74．KKK
75．KKKK
76．KKKKK
77．KKKKKK
78．KKKKKKK
79．KKKKKKKK
80．LKYGGENKPGG
81．YGGFM
82．YGGFL
83．RGDS
84．RLDS
85．YIGSR
86．GQGGTHGQWNKP
87．GQWNKPSKOKTN
88．GGLGGYMLGSAMSEPLIH
89．GSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPVDQYSNQNN
90．RESQAYYQRGAS
91．KYMCNSSCM
92．KYICNSSCM
93．QDLTMKYQIF
94．ILTVILGVL
95．SAYGEPRKL
96．SEIWRDIDF
97．YRPRPRRY
98．TFGLQLELT
99．QKRAA
100．QRRAA
101．DMGHGLRLIHYSYDDVNSTEKG
102．ASQKRPSQRSK
103．VHFFKNIVTPRTP
104．NTWTTCQSIAFPSK
105．SKTSASIGSLCADARMYGVL
106．LINVIHAFQYV
107．PGYPIRALVGD
108．VLGGGCALLRCIPACDSTLPANED
109．PALDSLTPANEA
110．IARFKMFPEVKEK
111．SRLSKVAPVIKARMMEYGTT
112．TPQGRPVAEY
113．TPQGRVAAEY
114．TPQGRVDAEY
115．TPQGRVSAEY
116．EFRADHPFLF
117．HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG
118．AKFEVNNPQVARAAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC
119．YQGVQQKWDATATELNNALQ
120．MTEQQWNFAGIEAAASAIQ
121．LQNRRGLDLLFLKEGGL
122．RGD
123．GACRGDCLGA
124．GRGDSP
125．CRGDCL
126．CRGDCA
127．CVLNGRME
128．NGRAHA
129．DGRAHA
130．ALNGREESP

Claims (107)

1．经接头偶联至固相上形成非树状肽固相复合物的非树状肽载体，该非树状肽载体包括10-50个从固相释放后能在良好缓冲液中形成二级结构的氨基酸，该非树状肽-固相复合物进一步包括偶联至非树状肽载体上的免疫原性物质和/或免疫介质。
2．权利要求1中定义的非树状肽载体，进一步包括共价结合脂质部分。
3．根据权利要求1或2的非树状肽载体，包括10-26个从固相释放后能在良好缓冲液中形成二级结构的氨基酸。
4．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的二级结构选自α-螺旋、β-链、β-转角、γ-转角、锌-指结构及其组合。
5．根据权利要求4的非树状肽载体，其中的二级结构为α-螺旋。
6．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的二级结构是在该肽中分别包括进一个或更多个氨基酸的α-螺旋、β-链、转角、锌-指诱导序列及其组合的结果。
7．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的非树状肽载体通过其C-末端连接至平行呈递肽两个分子的双分支分子。
8．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的肽在良好的水溶液中以单体形式存在。
9．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，并且其在良好的水溶液中形成两亲性螺旋，从而得到2个由单体超二级发夹结构中的转角结合的α-螺旋在分子内的反向平行排列。
10．根据权利要求1-5任何一个的非树状肽载体，在良好的水溶液中以二聚体形式存在。
11．根据权利要求10的非树状肽载体，并且其在水溶液中形成两亲性α-螺旋，从而得到α-螺旋卷曲型的平行同二聚体。
12．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其带有至少两个可衍生且可接近官能团的附着位点。
13．根据权利要求12的非树状肽载体，其中的附着位点选自ε-氨基、赖氨酸或赖氨酸类似物如鸟氨酸侧链中衍生的ε-氨基、α,γ-二氨基丁酸、或α,β-二氨基丙酸和游离α-氨基。
14．根据权利要求13的非树状肽载体，其进一步包括其它赖氨酸残基侧链中的ε-氨基亚类和游离α-氨基，所述的亚类包括至少一个被可由正交于Fmoc-和Boc-切割化学处理的化学处理切割的保护基所保护。
15．根据权利要求14的非树状肽载体，其包括作为附着位点的双功能性附着位点和/或多功能性附着位点。
16．根据权利要求15的非树状肽载体，其中的双功能性附着位点的一个官能团或至少一个多功能性附着位点的官能团被可逆地封闭。
17．根据权利要求11-15中任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的用作附着位点的侧链官能团以支撑二级结构且可衍生的构建单元衍生。
18．根据权利要求11-15中任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的用作附着位点的侧链官能团以选自图4A和图4B中所示结构的双分枝残基衍生。
19．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，在其靠近C-末端氨基酸附着的侧链中具有至少两个游离羧基或氨基。
20．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其中包括作为脂质部分的至少一个烷基和/或烯基链，优选以共价结合到肽N-末端或氨基酸侧链的脂肪酸形式。
21．根据权利要求20的非树状肽载体，其中的烷基或烯基链包括约4-25个碳原子如6-20个碳原子，优选7-17个碳原子的长度。
22．根据权利要求21的非树状肽载体，其中的脂质部分碳链包括棕榈酸或豆蔻酸或其混合物。
23．根据权利要求20-22中任何一个的非树状肽载体，其中的至少一个脂质部分作为硫酯，优选经半胱氨酸侧链巯基结合至肽上。
24．根据权利要求20-23中任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的脂质部分为图4C中所示的免疫刺激性的palm3-Cys-分子。
25．根据权利要求20-24中任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的脂质部分偶联至以交替的手性赖氨酸和丝氨酸的侧链，即D-氨基酸后接L-氨基酸且L-氨基酸后接D-氨基酸。
26．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其包括10-15个氨基酸且在其序列中包括具有“abcdefg”形式的重复“heptads”。
27．根据权利要求26的非树状肽载体，其中的重复“heptads”位于其内部序列，该序列位于相应于氨基酸2-5至n-(2-5)的片段，优选相应于氨基酸3至n-3的片段的肽载体片段中，其中的n为肽的氨基酸数目。
28．根据权利要求26-27中任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的占据“e”和“g”位置的赖氨酸残基与占据“b”、“c”和“f”位置的赖氨酸残基相比，侧链被正交保护。
29．根据权利要求26-28中任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的至少一个“f”位置被C所占据。
30．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其包括一个或更多个以下的肽部分：
1)[TKPR]N，其中的N优选为1-5(吞噬作用激素寡聚体)、胞壁酰二肽(N-乙酰胞壁酰L-丙氨酰D-异谷氨酰胺)或其变异体；
2)选自以下的T-细胞刺激肽，包括QYIKANSKFIGITE(破伤风类毒素830-843)和FNNFTVSFWLHRVKVSASHLE(破伤风类毒素947-967)、DQVHFQPLPPAVVKLSDALI(结核分支杆菌38 kD抗原350-369)、DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS(恶性疟原虫环子孢子蛋白378-398)、KLLSLIKGVIVHRLEGVE、麻疹病毒F-蛋白286-302、LDNIKGNVGKMEDYIKKNNK(恶性疟原虫MSP-1,260-279)、LQTMVKLFNRIK、NSVDDALINSTKIYSYFPSV、QYIKANSKFIGITELK和PGINGKAIHLVNNESS；
3)选自多T-细胞表位构建体的T-细胞刺激肽，其中的T-细胞表位成分以基本上线形的构建排列，包括嵌入的最小T-细胞表位肽片段，优选没有侧翼序列；
4)源自细胞因子的肽，包括
IFN-γ(1-39)HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG,
IFN-γ(95-133)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC,
TNF(70-80)PSTHVLITHTI，和
IL-1β(163-171)VQGEESNDK；
5)组合，包括其拷贝。
31．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，也包括至少一个PNA部分，所述的PNA包括通过杂交结合特异性DNA分子的单体序列。
32．根据权利要求1-30的非树状肽载体，其包括至少一个有功能的DNA-嵌入剂部分。
33．根据权利要求1-30的非树状肽载体，其包括至少一个DNA寡核苷酸部分。
34．根据权利要求33的非树状肽载体，其包括具有(5＇)PuPuCpGPyPy(3＇)序列的寡核苷酸作为DNA部分，其中的Pu为嘌呤碱基且Py为嘧啶碱基。
35．根据权利要求1-30的非树状肽载体，其包括聚阳离子部分，优选为聚赖氨酸部分，赖氨酸的数目优选从约10到约15。
36．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，该非树状肽载体取代固相到每克固相约0.001-5，优选如约0.01-1，更为优选约0.02-0.08，再更为优选约0.04-0.06，最为优选约0.05-0.1mmol。
37．根据前面任何一个权利要求的非树状肽载体，其中的从结合固相的接头上释放肽的化学处理与用于从该肽侧链预期的附着位点切割保护基的化学处理是正交的。
38．根据权利要求37的非树状肽载体，其中的肽经与水接触时释放肽的接头附着到固相上，优选为具有图4D中所示结构的羟基乙酸接头或经二酮哌嗪形成而释放肽的接头。
39．根据前面任一权利要求的非树状肽载体，其包括10-26个氨基酸并含有位于或靠近C-末端脂质部分，优选为棕榈酸或豆蔻酸，所述的肽不含有游离的和可接近侧链官能团但具有未保护的N-末端α-氨基。
40．根据权利要求1-2中任何一个权利要求的非树状肽载体，包括5-50个氨基酸，所述的肽包括在N-末端或靠近N-末端共价结合的脂质成分，优选为棕榈酸或豆蔻酸，所述的肽通过可由肼切割的接头而附着至所述的固相上以形成固相复合物。
41．根据权利要求30的非树状肽载体，其中的固相进一步以可选择性切割的接头以定义的比率衍生，所述的接头可与该非树状肽接头正交切割并设计为肽锚定部分。
42．根据前面任一权利要求的非树状肽载体，进一步包括具有特征性和可检测性光谱或放射特性如UV-吸收特性、可见吸收或荧光特性的物质。
43．根据前面任一权利要求的非分枝肽载体，其为非环状。
44．用于制备包括偶联至其上的免疫原性物质或免疫介质的非树状肽载体的方法，包括以下步骤：
1)通过化学固相合成在接头上合成在前面任一权利要求中定义的非树状肽载体，和
2)直接在非树状肽载体上合成免疫原性物质和/或免疫介质，和
3)从固相切割非树状肽载体。
45．根据权利要求44的方法，其中的步骤2)进一步包括通过其中可衍生的基团而向该肽的共价附着其它部分。
46．权利要求1-43中任一权利要求定义的非树状肽载体固相复合物作为化学衍生物制备的支架的应用，其特征在于附着位点共价附着分子，该分子选自多肽、碳水化合物、半抗原、糖肽、脂肽、DNA、RNA、PNA、蛋白和糖蛋白及其组合。
47．权利要求1-46中任一权利要求定义的非树状肽载体固相复合物作为用于逐步的基于Fmoc-或Boc的肽部分固相-肽合成支架的应用，此肽部分在结合固相非树状肽的附着位点上具有定义的序列。
48．权利要求1-43中任一权利要求定义的非树状肽载体作为用于掺入到免疫刺激复合物(Iscom)从而得到非树状肽载体-Iscom复合物的支架肽的应用。
49．权利要求48的非树状肽载体-Iscom复合物用于在水溶液中通过本领域已知的交联肽至蛋白的方法化学偶联抗原物质的应用。
50．权利要求1-43中任一权利要求定义的非树状肽载体，其通过一个或更多个具有纤连蛋白样、层粘连蛋白样或玻连蛋白样结合活性的肽衍生。
51．根据权利要求50衍生的非树状肽载体，其中的具有纤连蛋白样、层粘连蛋白样或玻连蛋白样结合活性的肽在其序列中包括RGD、GACRGDCLGA、GRGDSP、CRGDCL、CRGDCA、CVLNGRME、NGRAHA、DGRAHA、ALNGREESP、YIGSR、RLDS、或其变异体。
52．根据权利要求50-51中任一权利要求衍生的非树状肽载体在促进细胞附着至塑料表面中的应用，包括在附着细胞之前以衍生的非树状肽载体包被塑料表面。
53．根据权利要求50-52衍生的非树状肽载体在抑制肿瘤生长和转移中的应用。
54．根据权利要求50-53中任一权利要求衍生的非树状肽载体在通过包被肽至损伤的组织而促进伤口愈合中的应用。
55．根据权利要求1-43中任一权利要求所定义的衍生的非树状肽载体在筛选特异性结合寡核糖核苷酸中的应用。
56．用于检测分子或物质的诊断组分，包括权利要求1-43中任一权利要求所定义的衍生的非树状肽载体，其中的诊断试剂被结合。
57．根据权利要求56的诊断组分，其中的诊断试剂为抗原或抗体。
58．根据权利要求56-57中任一权利要求的诊断组分，用于检测一种分子，其为寡核糖核苷酸分子。
59．根据权利要求56-58中任一权利要求的诊断组分，其中的诊断组分包括至少两种不同的能够检测相同或不同分子诊断试剂。
60．根据权利要求56-59中任一权利要求的诊断组分，其中的诊断试齐是一种分子，选自多肽；脂多肽；糖多肽；磷脂；碳水化合物；脂多糖；核苷酸序列如DNA或RNA序列；PNA；或其任何组合或修饰。
61．根据权利要求56-60中任一权利要求的诊断组分，其中的诊断剂的量对于其与待测分子和该诊断剂能结合的分子间发生可检测的反应是有效的。
62．根据权利要求56-61中任一权利要求的诊断组分对于检测分子的应用，其中的诊断组合物通过将其与所述分子孵育对诊断组合物足够的时间从而与受试对象反应并形成复合物且通过将所述的复合物用于检测剂而检测结合分子的存在。
63．根据权利要求62的应用，其用于检测来自妊娠、疾病如传染病、自身免疫疾病、癌症或任何其它其中的指示分子是已知的疾病的分子或其指示性分子。
64．根据权利要求62-63的任一权利要求的应用，其用于检测来自组织或组织提取物、细胞培养物或哺乳动物包括人类样品中的分子。
65．根据权利要求64的应用，其中的样品来自如活检的组织、或组织提取物、细胞或所述哺乳动物的细胞培养物。
66．诊断哺乳动物包括人类疾病或妊娠的方法，包括至哺乳动物中根据权利要求56-61的任一权利要求的诊断组分，该诊断剂在体内检测来自所述哺乳动物疾病或妊娠的分子或其指示性分子。
67．诊断哺乳动物包括人类疾病或妊娠的方法，包括在获自所述哺乳动物的样品中孵育根据权利要求56-61的任一权利要求的诊断组分，该诊断剂检测来自所述哺乳动物疾病或妊娠的或其指示性的并存在于样品中的分子。
68．根据权利要求66或67的方法，用于检测来自传染病、自身免疫疾病、癌症等的分子或其指示性分子。
69．根据权利要求66或67中任一权利要求的方法，用于检测存在于来自如活检的组织、或组织提取物、细胞或所述哺乳动物的细胞培养物样品中的分子。
70．根据权利要求69的方法，其中的样品来自血清、血浆、全血、脑脊液、精液或阴道液、唾液、渗出物、尿液、粪便等。
71．一种诊断试剂盒，包括据权利要求56-61的任一权利要求诊断组分。
72．包括其上至少结合一种免疫原性试剂或介质的权利要求1-43中任一权利要求所定义非树状肽载体的疫苗组分。
73．根据权利要求72的疫苗组分，其中的免疫原性试剂为多肽，糖肽，脂肽，磷脂，多糖，脂多糖，碳水化合物，核苷酸序列，PNA；或其任何组合或修饰。
74．根据权利要求72-73中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂或介质为肽的混合物。
75．根据权利要求72-74中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂或介质能够影响暴露至该疫苗组分的免疫系统的免疫原性效应或反应。
76．根据权利要求76的疫苗组分，其中的免疫介质为吞噬作用激素、细胞因子、粘附分子或其一部分或其修饰形式。
77．根据权利要求72-74中任一权利要求的疫苗组分，其中的疫苗组分附着到第二种载体上，如免疫刺激复合物(Iscom)、脂质体或免疫微粒上，任选与介质或其具有介质活性的一部分联合并附着到第二种载体上。
78．包括至少一种根据权利要求72-77中任一权利要求疫苗组分的疫苗组合物。
79．根据权利要求78的疫苗组合物，其包括有效量的疫苗组分以赋予哺乳动物对一种或更多种感染增强的抗性，该组合物任选进一步包括药物上可接受的载体、赋形剂、增强剂或佐剂或其混合物。
80．免疫哺乳动物包括人类抵抗疾病的方法，其包括施用至哺乳动物免疫原性有效量的根据权利要求78或79的疫苗组合物。
81．根据权利要求80免疫哺乳动物包括人的方法，其包括经以下途径施用疫苗组合物，包括口腔、鼻、直肠、皮下、皮内、或肌肉内或在任何的粘膜表面。
82．包括权利要求1-43中任一权利要求定义的其上附着有至少一种治疗或预防试剂的非树状肽载体的治疗组分。
83．根据权利要求82的治疗组分，其中的治疗或预防试剂为多肽，糖肽，脂肽，磷脂，多糖，脂多糖，碳水化合物，核苷酸序列，PNA；或其任何组合或修饰形式。
84．根据权利要求82-83中任一权利要求的治疗组分，其进一步包括至少一种能够控制或增强连接到载体上治疗或预防试剂效应的介质。
85．根据权利要求84的治疗组分，其中的介质为吞噬作用激素、包括细胞因子的免疫调节剂、粘附分子或其一部分或其修饰形式。
86．根据权利要求82-85中任一权利要求的治疗组分，其中的治疗组分附着到第二种载体上，如免疫刺激复合物(Iscom)、脂质体或免疫微粒上，任选与介质或其具有介质活性的一部分联合并附着到第二种载体上。
87．根据权利要求82-86中任一权利要求的治疗组分，其进一步包括能够结合存在于哺乳动物中特定位置靶物质的靶分子从而介导该治疗组分至其发挥效应的所述特定位置。
88．根据权利要求87的治疗组分，其中的靶分子为抗体。
89．根据权利要求87-88中任一权利要求的治疗组分，其能够预防，包括预防复发，或治疗疾病或能够预防或终止妊娠。
90．包括权利要求82-89中任一权利要求的治疗组分再任选具有药物上可接受的载体的药物组合物。
91．根据权利要求90用于治疗或预防疾病，如传染病、癌症或自身免疫疾病的药物组合物。
92．用于制备药物组合物的根据权利要求82-89中任一权利要求的治疗组分的应用。
93．治疗和/或预防疾病的方法，包括施用给需要的病人治疗或预防上有效量的根据权利要求90-91中任一权利要求的治疗组合物。
94．根据权利要求82-89中任一权利要求的治疗组分在制备药物组合物中的应用。
95．用于检测分子或物质的检测组分，该组分包括在权利要求1-43中任一权利要求中定义的且有检测试剂连接其上的非树状肽载体。
96．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂为HIV-1 gp120的肽aa 152-176，具有下面的氨基酸序列：GEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFF。
97．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂或介质为HIV-gp41的肽，其包括下面的氨基酸序列：LERLLL。
98．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂为YDQLVTRVVTHEMAHA。
99．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂为EAEEAARLQA。
100．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫介质为IFN-γ(1-39)HGTVIESLESNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG。
101．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫介质为IFN-γ(95-133)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC。
102．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫介质为TNF生物活性序列(TNF70-80)：
Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Ile-Thr-His-Thr-Ile。
103．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫介质为吞噬作用激素肽TKPR或其寡聚体。
104．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫介质为IL-1β生物活性序列：VQGEESNDK/Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys。
105．根据权利要求72-79中任一权利要求的疫苗组分，其中的免疫原性试剂为EBA 175-肽：TLTKEYEDIVLKSHMNRESDD。
106．根据权利要求82-94中任一权利要求的治疗组分，其中的治疗试剂为KNGMLKGDKVS。
107．根据权利要求82-94中任一权利要求的治疗组分，其中的治疗试剂为CKNKEKKC。
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