JP5792630B2 - Pan−dr結合ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
− X1がW、F、Y、H、D、E、N、Q、IおよびKからなる群から選択され;
− X2がF、N、YおよびWからなる群から選択され;
− X3がHおよびKからなる群から選択され;
− X4がA、DおよびEからなる群から選択され;
ただしここでオリゴペプチド配列がAKFVAAWTLKAAA(配列番号3)でないことが条件となっている、
単離ポリペプチドに関する。
別段の定義がない限り、本明細書中で使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明は、組換え遺伝学の分野における常用手技に依存するものである。本発明中で使用される一般的な方法を開示する基本的教書としては、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(第3版2001);Kriegler、Gene Transfer and Expression:ALaboratory Manual(1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら、編、1994))がある。
本発明は、pan−DR結合ペプチドである新しい部類のペプチドを提供し、その使用を提供する。本発明のペプチドは、数多くの異なるDR対立遺伝子の2つ以上を結合でき、こうしてさまざまな抗原/免疫原に対する免疫応答を増大させるのに用いられる。本発明のペプチドはさらに、例えば米国特許第5,736,142号(US5,736,142)で開示されているような公知のpan−DR結合ペプチドと比べて増強した免疫応答を惹起するのに用いられる。
を参照のこと。
本発明は、本明細書中で記述されている通りの本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12以上の異なるDR対立遺伝子によりコードされるMHC分子を結合できるオリゴペプチド配列を含み、ここでオリゴペプチド配列はAX1FVAAX2TLX3AX4A(配列番号1)を含み、式中X1はW、F、Y、H、D、E、N、Q、IおよびKからなる群から選択され;X2はF、N、YおよびWからなる群から選択され;X3はHおよびKからなる群から選択され;X4はA、DおよびEから選択される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12以上の異なるDR対立遺伝子によりコードされるMHC分子を結合できるオリゴペプチド配列を含み、ここでオリゴペプチド配列はAX1FVAAX2TLHAAA(配列番号2)を含み、式中X1はY、H、I、E、N、QおよびKからなる群から選択され;X2はF、N、YおよびWからなる群から選択される。本発明によると、オリゴペプチド配列はAKFVAAWTLKAAA(配列番号3)を含まない。一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71または配列番号72から選択されたオリゴペプチドの13アミノ酸C末端フラグメントを各々構成する1つ以上のアミノ酸配列をコードし、ポリヌクレオチドは、他のアミノ酸配列と融合して配列または切形を含むポリペプチドをコードしてよい。したがって、本発明の少なくとも1つのpan−DR結合オリゴペプチド配列を含めた2つ以上のCTLおよび/またはHTLオリゴペプチド配列を含む、本明細書中で開示されている通りのポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドが提供される。
以上で説明したように、本発明のpan−DRオリゴペプチドは、さまざまな抗原に対する細胞または体液性免疫応答を増強するために使用することができる。このような抗原に由来する抗原決定基または抗原自体は、本発明のpan−DR結合ペプチドと混和した形、またはそれに連結させた形で投与可能である。例えば、免疫応答を惹起するまたは増強するために、抗原決定基を本発明のヘルパーペプチドと連結または混合するか、またはそれと共に連続して投与することができる。本質的に、本発明のpan−DR結合オリゴペプチド配列と組合せた形でいかなる抗原でも使用することができる(例えば多糖類、タンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、リポ多糖類など)。タンパク質抗原は、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、蠕虫および他の寄生虫などの感染性因子から誘導されてよいが、或る種の疾病状態において過剰発現されているかまたはその他の形で不適当である抗原あるいは癌抗原などの疾病関連抗原であってもよい。国際公開第00/20027号(WO00/20027)に列挙されている癌抗原は全て、関連性あるタンパク質抗原であり、さらなる抗原は炎症に付随する抗原である(ここではTNFがその好例である)。本発明は、全てが本発明の一部を成している数多くのTNF構築物を開示しており、一般にこれらの構築物は全て、それらをコードする核酸フラグメント、核酸フラグメントを含むベクターおよび核酸フラグメントまたはベクターを含む宿主細胞(またはベクターで形質転換されている宿主細胞)と同様、本発明の一部を成すものである。
本発明のpan−DR結合ペプチドは、さまざまな形で少なくとも1つのさらなる抗原決定基に連結され得る。末端を介したまたはリジンのε−アミノ基を介したイオン相互作用が可能である。残基の側基と抗原決定基の間の水素結合も同様に可能である。その他の実施形態においては、pan−DR結合ペプチドと抗原決定基の間の立体構造相互作用が、安定した付着を発生させるかもしれない。
本発明のポリペプチド免疫原は、当業者にとっては公知のさまざまな方法を用いて、E.coliなどの発現宿主(または以上で論述した他の宿主細胞)から発現され、濃縮され、精製されてよく、代替的には、免疫原は液相または固相ペプチド合成により調製されてよい。精製されたポリペプチドまたはペプチド免疫原は、例えば免疫応答を刺激するかまたは増強し、任意には保護および/または治療的免疫応答を生成する目的で、個体の体内に投与するための医薬的に許容される賦形剤と共に調合可能である。「保護および/または治療的免疫応答」という語句は、何らかの形で疾病の症候、副作用または進行を防止するかまたは少なくとも部分的に阻み感染性因子を一掃する、例えば感染性因子から誘導された疾病関連抗原に対するCTLおよび/またはHTLおよび/または抗体応答を意味する。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫学的に有効な量の本発明のペプチドのうちの1つ以上と適切な薬学的担体とを含むワクチンの形に調合される。したがって、本発明のペプチドは、個別にかまたは単一組成物または多数の組成物のいずれかに組合わされた状態で投与可能である。
本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドおよびその医薬組成物およびワクチン組成物は、予防および/または治療目的で哺乳動物、特にヒトに対し投与可能である。本発明のポリペプチドは、病原体または癌関連または癌特異的生体分子(例えばタンパク質、炭水化物など)を含めた(ただしこれらに限定されない)抗原に対する免疫応答を惹起および/または増強するために使用可能である。本発明を用いて治療可能な疾病の例としては、さまざまな細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染および癌が含まれる。タンパク性抗原に関して以上で論述した通り、国際公開第00/20027号(WO00/20027)からの癌抗原に関連する癌も、関節リウマチおよび炎症性腸疾患などのさまざまな炎症性疾患と同様の疾病例である。
以下の実施例は、請求対象の発明を限定するためではなく、例証するために提供されるものである。
1)合成PADRE類似体のライブラリの調製ステップ;
2)優れたHLA結合特性について、1)に由来する類似体を検定し選択するステップ;
3)生体内原位置プロテアーゼ耐性について、2)で選択した類似体を検定し選択するステップ;
4)優れた免疫原特性について、3)で選択した類似体を検定し選択するステップ。
PADRE類似体のHLA−DR結合についての試験
標準的な固相ペプチド合成により、合計69個の異なるPADRE類似体(配列番号:4〜72)を合成した。これらのPADRE類似体は全て、N−からC−末端に向かって、2つのアラニン残基とそれに続く残基3〜15により構成され、これは(2つのアラニン残基が先行するPADREである配列番号4以外)配列番号3の類似体である。2つの追加のN末端アラニンを含み入れる理由は、PADRE類似体の免疫原特性が13C末端アミノ酸内に存在する一方で、単離ペプチドがプロテアーゼ耐性についての試験管内検定においてエンドプロテアーゼ耐性を示すことができるようになることを保証するためであった。
クラスIIMHC結合検定のための標準的な作業手順は、Sidneyら、(1998)、Current Protocols in Immunology、18.3.1−18.3.19、1998中に記載されている。簡潔に言うと、精製ヒトクラスII分子[5〜500nM]を、さまざまな未標識ペプチド結合阻害物質および1〜10nM125I−放射性標識プローブペプチドと共に48時間、プロテアーゼ阻害物質カクテルの存在下で5%のDMSを含むPBS中でインキュベートした。インキューベーション混合物中の最終的洗浄剤濃度は、0.05%NonidetP−40であった。pH4.5で実施したDR3およびpH5.0で実施したDRw53を除いて、検定をpH7.0で実施した。pHは、Setteら、(1992)、J Immunol、148:844−51で記述されている通りに調整した。
IC50値を介して表わされる結合親和性を、各ペプチドについて図1に列挙する。これらのIC50値に基づいて、類似体(38PADRE類似体)の画分が充分に優れたHLA結合能力(図1にボールド体と下線で示す)を示すという結論が下された。これらの優れた結合性を有するもののうち、当初10個を選択してプロテアーゼ耐性についてさらに試験した:配列番号;4、10、19、23、29、38、46、52、67および69。
選択されたPADRE類似体のプロテアーゼ耐性試験
選択された優れた結合性を有するPADRE類似体のプロテアーゼ耐性を試験するために、クローニング技術により、ヒトTNFα内のループ(ループEE)内にその配列を挿入した。修飾されたTNFα分子を発現するE.coli由来の無細胞タンパク質粗製抽出物を調製し、PADRE類似体配列内部のタンパク質分解分割を、SDS−PAGEとそれに続く免疫ブロット法によって分析した。
...PEGA−AKFVAAWTLKAAA−EAK... → PEG−A−KFVAAWTLKAAAEAK...
配列番号75−TNF37.87−「従来の」PADREを含む基準タンパク質:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAKFVAAWTLKAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
− ならびに、下線位置においてそれぞれ配列番号4、10、19、23、29、38、46、52、67および69の12のC末端アミノ酸残基を各々同じように有するTNFバリアントを含む9個のPADRE類似体すなわち:
配列番号76−TNF37.87−007配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAWFVAANTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号77−TNF37.87−016配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAFFVAANTLKADAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号78−TNF37.87−020配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAYFVAAFTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号79−TNF37.87−026配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAHFVAANTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号80−TNF37.87−035配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAHFVAAFTLKAEAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号81−TNF37.87−043配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEFVAAWTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号82−TNF37.87−049配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGANFVAAYTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号83−TNF37.87−064配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAQFVAANTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
配列番号84−TNF37.87−066配列:
MVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSSQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAIFVAAWTLHAAAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
鋳型として、TNF(Y87S)をコードする合成cDNAを使用した。PADREまたはPADRE類似体をコードするオリゴヌクレオチドを、PCRによりA185とE186の間で鋳型内に挿入した(上記参照)。結果として得たcDNAをpET28b+(Novagen)内にクローニングし、E.coli菌株HMS174へと形質転換させた。組換え発現のため、結果として得たE.coli菌株を発酵槽内において37℃にて合成培地中で培養した。組換え発現の誘発は、1mMのIPTGを添加することで開始し、温度を25℃まで低下させた。IPTG誘発から4、8または24時間後に培養を収穫した。Nielsenら、(2004)、J Biol.Chem.279:33593−33600中で記述されているようにTNFα特異的モノクローナル抗体を用いて親和性クロマトグラフィにより90%超の均質性までTNFαバリアントを精製した。精製したTNFαバリアントをMALDI−TOF質量分析法によって特徴づけしてそれらの同一性と無欠性を確認した。
試験すべきさまざまなTNF−αバリアントを発現するE.coli細胞培養のアリコート(1ml)を遠心分離(5000g/5分/5℃)し、培地を廃棄した。pH6.0で20mMのBis−Tris1ml中に細胞ペレットを再懸濁させた。超音波処理(各超音波処理ラウンド間で20秒間休止して、11μmの振幅で4×15秒)により、細胞破壊を達成した。結果として得た懸濁液を遠心分離し(20000g/30分/8℃)、上清(粗製抽出物)を新しい管に移した。次に、ブラッドフォードタンパク質分析(Biorad)を用いて、タンパク質含有量について粗製抽出物を分析した。4〜12%のNuPAGEゲル(Novex)上に等量のタンパク質を投入した。SDS−PAGEの後、セミドライブロット法によりニトロセルロース膜上にタンパク質を移した。免疫反応については、Tris50mM、NaCl150mM、EDTA5mM、Igepal0.1%、ゼラチン0.5%中で、ウサギTNFα抗血清(1時間;希釈度1:10,000)およびホースラディッシュペルオキシダーゼでコンシュゲートされた二次抗体(Dako P448)と共にインキューベーションを行なった。検出にはECLTM試薬(GE Healthcare)を用いた。
被験TNFバリアントのうち、3つ(配列番号78、79および84)はプロテアーゼ検定においてプロテアーゼ耐性があることが示され(データ示さず)、これらのTNFバリアントが、PADRE類似体配列の内部でのタンパク質分解分割に対する感受性をもたないということを証明した。
選択されたPADRE類似体の免疫原性試験
実施例2内で同定した3つのプロテアーゼ耐性PADRE類似体をその免疫原特性について試験した。1本の実験ライン上で、ヒトのドナー由来のPBMC(末梢血単核細胞)内および2つのマウス株(DR4およびbxd)内で遊離ペプチドとしてペプチドを試験した。第2の実験ライン内では、実施例2で同定したプロテアーゼ耐性TNFバリアントに関連して、PADRE類似体を試験した。
ヒトPBMC(末梢血単核細胞)を、配列番号23、29および69の13アミノ酸残基と同一の配列をもつペプチドで刺激した(以下では、これら3つの13量体をそれぞれPADRE.Y2.F7.H10、PADRE.H2.N7.H10およびPADRE.12.H10と呼ぶ)。1日目および4日目に、IL−2を添加した。7日目に、he細胞の一部分を取り出してINF−γELI−POT検定に付した。残りの細胞を再刺激した。8日目および11日目に、IL−2を添加した。14日目にCD4細胞を精製し、INF−γELISPOT検定において試験した。
HLA−DR4遺伝子導入マウスとbxdマウス株の各々の3匹の個体からなるグループを、CFA中の20μg(6μlの20mg/mlペプチドおよび294μlのPBS1×+300μlのCFA)または2μg(6μlの2mg/mlペプチド+294μlのPBS1×+300μlのCFA)のペプチドを用いて尾の付け根で免疫付与した。10〜14日後に、脾臓を収穫し、CD4細胞を精製し、INF−γELISPOT検定(McKinneyら、(2004)、J Immunol 173、1941−50に記載の通り)で試験した。被験ペプチドは、ヒトPBMCで試験されたものと同一であった。
3匹のHLA−DR4遺伝子導入マウスからなるグループを、マウス一匹あたり100μlの完全フロインドアジュバント(CFA)中10μgのTNF由来の抗原を用いて、尾の付け根で免疫付与した。最初の免疫付与から14日目に、100μlのIFA(不完全フロインドアジュバント)中の同じ用量の抗原を用いて、動物に追加免疫を付与した。TNFα特異的抗体力価を決定するため、各々の免疫付与から14日後に、血清を収集した。その後動物を屠殺して、INF−γELISPOT検定に付した。
直接ELISAを用いて、TNFα特異的抗体力価を決定した。96ウェル平板(Maxisorb、Nunc)を組換えTNFαバリアントTNFY87S(pH9.6で炭酸緩衝液中5μg/ml、100μl/ウェル、4℃で一晩)を用いてコーティングした。その後平板を3回洗浄し、37℃で2時間200μl/ウェルのブロッキング緩衝液(1%のウシ血清アルブミンおよび0.05%のTween20を含むリン酸緩衝生理食塩水)を用いてインキュベートした。平板を3回洗浄し、ヒトTNFαバリアントで免疫付与したマウス由来のプールされた血清を、合計100μl/ウェルのブロッキング緩衝液中での1/10希釈ステップ(出発希釈度1/1000)を用いて、6ステップで滴定した。全ての試料をデュプリケートで滴定した。血清と対照を2時間37℃でインキュベートした。平板を3回洗浄し、100μlのビオチニル化ヤギ抗マウスIgG(ブロッキング緩衝液中で1/10000希釈)を各ウェルに移し、37℃で1時間インキュベートした。最後に、平板を3回洗浄し、100μl/ウェルのアビジン−ペルオキシダーゼ複合体(Vectastain Elite Vector PK−6100)を用いて室温で45分間インキュベートした。平板を再び洗浄し、TMBSを用いて現像した。10〜20分後、100μlの4NのH2SO4で反応を停止させ、ELISA読取り装置を用いてA450値を決定した。0.5のA450値を生成する抗血清希釈度として抗体力価を定義づけた。
ヒトPBMC中のペプチドの試験から得られた結果は、PADRE.Y2.F7.H10およびPADRE.I2.H10が、配列番号3に比べ7日目と14日目の両日にINF−γELISPOT検定においてより優れた免疫応答を提供し、一方PADRE.H2.N7.H10は、配列番号3と同じ規模の免疫応答を提供したことを明らかにした。
INF−γELISPOTにより測定されたHLADR4遺伝子導入マウスにおけるHTL誘発は、全てのTNFα−バリアントが、TNFα内に導入されたPADRE類似体に対するHTLを誘発したこと、そしてこの点においてPADRE.Y2.F7.H10およびPADRE.I2.H10がPADREよりも優れていたこと(ここでPADRE.H2.N7.H10はPADREとほぼ同じHTL誘発を提供した)を明らかにした。さらに全てのバリアントは、野生型TNFαにより誘発されたものよりも著しく高い抗体力価を提供し、PADRE.Y2.F7.H10およびPADRE.I2.H10を含むバリアントは、PADREに比べ優れており、ここでもまた、PADRE.H2.N7.H10はPADREに匹敵する免疫応答を提供した。実際、抗体力価とHTL誘発を相関させた場合、明らかに線形相関が存在していた。
8個のさらなるPADRE類似体の選択および試験
panDR結合性でプロテアーゼ耐性を有する免疫原性PADRE類似体PADRE.Y2.F7.H10、PADRE.H2.N7.H10およびPADRE.I2.H10の同定に基づいて、実施例1において優れた結合性を有するものとして同定されたさらなるPADRE類似体を試験することが決定された。被験ペプチドは、配列番号15(PADRE.F2.N7.H10)、21(PADRE.Y2.H10)、24(PADRE.Y2.N7.H10)、26(PADRE.H2.H10)、47(PADRE.E2.Y7.H10)、54(PADRE.N2.N7.H10)、66(PADRE.Q2.F7.H10)、および72(PADRE.I2.N7.H10)からの13C末端アミノ酸残基を有するペプチドであった。
上述の実施例は、プロテアーゼ耐性および/または免疫原性の観点から見て改善された特性を有する数多くのPADRE類似体の存在を実証した。配列番号3内で入念に修飾を行なうことで、組換え発現された場合および生体内免疫原として使用された場合の両方において、PADREよりも安定した免疫原が提供される、ということが実証されている。
Claims (21)
- 100nM未満のIC50値を有する少なくとも3つの異なるHLA−DR対立遺伝子によりコードされるMHCクラスII分子を結合できるオリゴペプチド配列を含む単離ポリペプチドであって、オリゴペプチド配列がAX1FVAAX2TLX3AX4A(配列番号1)を含み、
− X1がYおよびIからなる群から選択され;
− X2がF、N、YおよびWからなる群から選択され;
− X3がHであり;
− X4がAであり;
ここで前記オリゴペプチド配列が配列番号3と比較して、改善されたプロテアーゼ耐性および/または免疫原性を示す、単離ポリペプチド。 - 前記オリゴペプチドが配列番号23、69および72からなる群から選択されたオリゴペプチド中の13個のアミノ酸残基C末端フラグメントと同一のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドがオリゴペプチドに加えて未変性ポリペプチド配列の大部分を含んでいる、請求項1または2に記載の単離ポリペプチド。
- 前記未変性ポリペプチド配列がヒトTNFα由来のものである、請求項3に記載の単離ポリペプチド。
- 前記オリゴペプチドに加えて、少なくとも1つの抗原由来の複数のエピトープを含む、請求項1または2に記載の単離ポリペプチド。
- 前記複数のエピトープが、複数のCTLエピトープ、複数のB−細胞エピトープ、複数のTヘルパーリンパ球エピトープ、複数のCTLおよびB細胞エピトープ、複数のCTLおよびTヘルパーリンパ球エピトープ、複数のB細胞およびTヘルパーリンパ球エピトープおよび複数のB細胞、CTLおよびTヘルパーリンパ球エピトープから選択されている、請求項5に記載の単離ポリペプチド。
- 前記エピトープが1つの単一抗原タンパク質に由来するものであるか、あるいは同じ種に任意に由来する少なくとも2つの異なる抗原タンパク質に由来するものである、請求項5または6に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが100個以下のアミノ酸を有する、請求項1、2および5〜7のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、MHC分子を結合できるオリゴペプチド配列と重複しない第2のオリゴペプチド配列を含む、請求項1または3または5〜8に記載の単離ポリペプチド。
- 前記第2のオリゴペプチド配列がCTL配列またはB細胞エピトープを含む、請求項9に記載の単離ポリペプチド。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに対して作動的に連結されたプロモータを含む核酸を含む単離ベクター。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに対して作動的に連結されたプロモータを含む核酸を含む細胞。
- 単離細胞である、請求項13に記載の細胞。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチドと抗原を含む組成物。
- 前記抗原が第2のポリペプチドまたは非タンパク性抗原である、請求項15に記載の組成物。
- 前記抗原が炭水化物である、請求項16に記載の組成物。
- さらに生理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態における、請求項15〜17のいずれか一項に記載の組成物。
- 医薬として用いられる、請求項12に記載のベクター。
- 有効量の請求項11に記載のポリヌクレオチドをヒト以外の動物に対して投与することを含む、免疫応答を刺激する方法。
- 医薬として用いられる、請求項13に記載の細胞。
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