DE69430315T2

DE69430315T2 - Methoden zur (ex vivo) therapie mittels peptid - bestueckten antigen - praesentierenden zellen zur aktivierung von ctl

Info

Publication number: DE69430315T2
Application number: DE69430315T
Authority: DE
Inventors: Esteban Celis; Ralph Kubo; Horacio Serra; Van Tsai; Peggy Wentworth
Original assignee: Epimmune Inc
Current assignee: Epimmune Inc
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2014-08-02
Also published as: EP0726941B1; AU7478394A; EP0726941A4; WO1995004817A1; SG49113A1; US5846827A; CA2168950A1; EP0726941A1; DE69430315D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, um eine Reihe von pathologischen Zuständen, wie z. B. Viruserkrankungen und Krebs, durch ex vivo-Therapie zu verhindern oder zu behandeln. Insbesondere bietet die Erfindung Verfahren zum Induzieren zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) unter Verwendung Antigen-präsentierender Zellen (APC) mit einem Peptid der Wahl, das an bestimmte Haupthistokompatibilitäts-Komplex- (MHC-) Moleküle gebunden ist.
Zytotoxische T-Zellen oder CD8-Zellen, wie sie auch bekannt sind, stellen die wesentliche Verteidigungslinie gegen Virusinfektionen dar. CTLs erkennen und töten Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, in spezifischer Weise. Die T-Zellen-Rezeptoren auf der Oberfläche von CTLs können fremde Antigene nicht direkt erkennen. Im Gegensatz zu Antikörpern muss ein Antigen zuerst den T-Zellen-Rezeptoren präsentiert werden, damit Aktivierung eintreten kann.
Die Präsentation von Antigen an die T-Zellen erfolgt durch MHC-Moleküle. MHC bezieht sich auf einen großen Genort, der für eine umfangreiche Familie von Glykoproteinen kodiert, die eine wichtige Rolle in der Immunreaktion spielen. Die MHC-Gene, die auch als HLA- (Human-Leukozyten-Antigen-) Komplexe bezeichnet werden, liegen beim Menschen auf Chromosom 6. Die durch MHC-Gene kodierten Moleküle befinden sich auf Zelloberflächen und sind für die Erkennung von Gewebetransplantaten als "fremd" hauptverantwortlich.
MHC-Moleküle werden in Klasse I-, Klasse II- oder Klasse III-Moleküle eingeteilt. Klasse II-MHC-Moleküle werden hauptsächlich auf Zellen exprimiert, die an der Initiierung und Aufrechterhaltung von Immunreaktionen beteiligt sind, z. B. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Makrophagen usw. Klasse II-MHC-Moleküle werden von Helfer T-Lymphozyten erkannt und induzieren die Proliferation von Helfer T-Lymphozyten und die Amplifikation der Immunreaktion auf ein bestimmtes immunogenes Peptid, das präsentiert wird. Klasse I-MHC-Moleküle werden auf fast allen nukleierten Zellen exprimiert und von CTLs erkannt. T-Zellen, die hauptsächlich als Helferzellen dienen, exprimieren CD4 und sind vor allem auf Klasse II-Moleküle beschränkt, während CD8 exprimierende Zellen, die durch zytotoxische Effektorzellen repräsentiert werden, mit Klasse I-Molekülen in Wechselwirkung treten.
Ein CTL erkennt das Antigen in Form eines Peptidfragments, das an die MHC Klasse I- Moleküle und nicht an das intakte Fremdantigen selbst gebunden ist. Das Antigen muss normalerweise endogen von der Zelle synthetisiert werden, wobei ein Teil des Proteinantigens im Zytoplasma zu kleinen Peptidfragmenten abgebaut wird. Einige dieser kleinen Peptide translocieren in ein Prä-Golgi-Kompartiment und wechselwirken mit Klasse I-Schwerketten, um die richtige Faltung und Assoziation mit dem Untereinheit β2-Mikroglobulin zu erleichtern. Der Peptid-MHC-Klasse I-Komplex wird zwecks Expression und Potentialerkennung durch spezifische CTLs auf die Zelloberfläche geleitet. Untersuchungen der Kristallstruktur des Human-MHC Klasse I-Moleküls HLA-A2.1 zeigen, dass eine Peptid-Bindungsrille durch Falten der α1- und α2-Domänen der Klasse 1-Schwerkette entsteht (Bjorkman et al., Nature 329, 506 (1987)).
Viele Jahre lang hofften Immunologen, spezifische zytotoxische Zellen zu bilden, die auf Viren, Retroviren und Krebszellen abzielen. Eine mögliche Vorgangsweise ist die Immunisierung eines gesunden Individuums, das Isolieren der CTLs aus diesem Individuum und das Injizieren dieser Zellen in den kranken Menschen. Diese experimentelle Arbeitsvorschrift scheint in durch Inzucht gezüchteten Mäusestämmen zu funktionieren, konnte aber beim Menschen noch nicht erfolgreich eingesetzt werden. Damit diese Methode funktioniert, muss der MHC-Haplotyp des Donors identisch mit jenem des Rezipienten sein. Dies ist wichtig, da die CTLs des Rezipienten nur mit Peptiden in Wechselwirkung treten können, die an eines der drei bis sechs Klasse I-Moleküle im Individuum gebunden sind. Zweitens zeigen CTLs mit allen Klasse I-Molekülen, die sich von jenen unterscheiden, die im Individuum exprimiert werden, aus dem die CD8-Zellen stammen, eine heftige Reaktion - gleichgültig welche Peptide die Klasse I-Moleküle enthalten. Diese Reaktivität ist die zugrunde liegende Ursache für die Immunabstoßung transplantierter Organe.
Da es schwierig ist, zwei nicht verwandte Menschen mit genau denselben Klasse I-Molekülen zu identifizieren, wählen einige Therapien den nichtspezifischen Ansatz des "Auffrischens" bestehender CD8-Zellen durch in vitro-Inkubation derselben mit IL-2, einem Wachstumsfaktor für T-Zellen. Diese Arbeitsvorschrift (als LAK-Zelltherapie oder TIL-, d. h. Tumorinfiltrierende Lymphozyten-Therapie bekannt) ermöglicht nur die Expansion jener CTLs, die bereits aktiviert sind. Da das Immunsytem aus dem einen oder anderen Grund immer aktiv ist, sind die meisten der IL-2-stimulierten Zellen für die Bekämpfung der Krankheit irrelevant. Es wurde noch nicht dokumentiert, dass diese Art von Therapie irgendwelche Zellen mit der gewünschten Spezifität aktiviert. Die Vorteile der LAK-Zelltherapie sind bestenfalls zwiespältig und die Nebenwirkungen oft stark (Greenberg, P., "Adoptive T cell therapy of tumors: Mechanisms operative in the recognition and elimination of tumor cells", Advances in Immunology 49, 281 (1991); Melief, C., "Tumor eradication by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocytes", Adv. Cancer Research 58, 14, 34 (1992); S. Riddell, K. Watanabe, J. Goodrich, C., Li, M. Agha, P. Greenberg, "Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones", Science 257, 238 (1992))
Der bevorzugte Behandlungsansatz für Krankheiten wie Krebs, AIDS, Hepatitis und andere Infektionskrankheiten wäre die Aktivierung nur jener CTLs, die kranke Zellen erkennen. Obwohl verschiedene Verfahren für diese Erkrankungen zur Anwendung kamen, wurde nur über wenige erfolgreiche Versuche des Einsatzes zytotoxischer T-Zellen berichtet. Die ex vivo-Aktivierung von CTLs wäre das bevorzugte Mittel zur Behandlung der oben erwähnten Krankheiten. Allerdings gibt es bislang keine zuverlässigen Verfahren zur spezifischen Aktivierung mit diesen Krankheiten assoziierter CTLs. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit diesem und anderen Problemen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren zum in vitro-Aktivieren zytotoxischer T-Zellen (CD8- Zellen). Die Verfahren zum Aktivieren von CD8-Zellen umfassen: das Dissoziieren gebundener Peptide von Klasse I-MHC-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen unter Einsatz einer Behandlung mit schwacher Säure; das Assoziieren gewünschter immunogener Peptide mit dem Klasse I-MHC-Molekül auf der Antigen-präsentierenden Zelle; und das Inkubieren der Antigen-präsentierenden Zellen mit den zytotoxischen T-Zellen in Gegenwart eines Wachstumsfaktors, wodurch aktivierte zytotoxische T-Zellen produziert werden. Die Verfahren der Erfindung können leere MHC-Klasse I-Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen erzeugen und ihrerseits CTL induzieren und die Tötung von Klasse I-übereingestimmten Zellen bewirken.
Die Antigen-präsentierenden Zellen mit leeren MHC-Klasse I-Molekülen auf ihren Oberflächen können zytotoxische T-Zellen induzieren, die sich zur Behandlung von chronischen Infektionskrankheiten und Krebs eignen. Genauer gesagt bietet die Erfindung Verfahren zur Herstellung leerer MHC-Klasse I-Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen, zum Beladen dieser leeren MHC-Klasse I-Moleküle mit selektierten immunogenen Peptiden und zum Aktivieren zytotoxischer T-Zellen, die für das Abtöten spezifischer Antigenziele spezifisch sind. Die Erfindung eignet sich für unterschiedliche Therapien in der Krebsbehandlung, für bestimmte Immunerkrankungen und virale Krankheiten. Solche Verfahren können Folgendes umfassen: das Trennen aktivierter CTLs von den Antigen-präsentierenden Zellen mit dem MHC-Klasse I-Molekül auf der Oberfläche und das Suspendieren der aktivierten CTLs in einem akzeptablen Träger oder Exzipienten als pharmazeutische Zusammensetzung sowie die Verabreichung an einen Patienten, der an der Krankheit leidet.

KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 zeigt die Wirkung von β&sub2;-Mikroglobulin und exogenem 941-01 (Hbc 18-27) Peptid auf MHC-Klasse I-Moleküle aus säuregestrippten und beladenen PHA-Blasten.
Fig. 2 zeigt die CTL-Induktion mittels GC43 A2.1-Respondern und autologen säuregestrippten PBMCs oder PHA-Blasten, beladen mit dem 777.03 (Hbs 20-28); 924.07 (Hbc 18-27); 927.32 (Hbp 61-69) Peptidpool.
Fig. 3 veranschaulicht die CTL-Induktion mittels X351 oder X355 A2.1-Respondern und autologen säuregestrippten PBMCs oder PHA-Blasten als Stimulatoren nach Beladen mit dem 1044.04 (PAP 135-143); 1944.05 (PSA 166-175) 1044-056 (PSA 118-128) Peptidpool.
Fig. 4 zeigt die CTL-Induktion mittels GC49 A2.1-Respondern und autologen säuregestrippten PHA-Blasten als Stimulatoren nach Beladen mit 939.03 (PSA 49-57) Peptid.
Fig. 5 veranschaulicht CTL-Induktion unter Einsatz von GC66 A1-Respondern und autologen säuregestrippten PBMCs als Stimulatoren nach dem Beladen von Peptid 958.01 (MAGE 1: 161-169).
Fig. 6 zeigt CTL-Induktion mittels GC 30, HLA A1-Respondern und autologen, bei niedriger Temperatur inkubierten SAC-I-aktivierten PBMCs als Stimulatoren nach Beladen mit 1044.07 MAGE-3 (161-169) Peptiden.
Fig. 7 ist ein Vergleich unterschiedlicher Techniken zum Beladen von Peptiden auf SAC- I aktivierte PBMCs als APCs. Ein Pool von MAGE-3 HLA A1-Bindungspeptiden (1044.07: 161-167 und 1044.01: 8-17) wurde mit Donor GC 164 untersucht. 7A: Säurestrip; 7B: Niedertemperatur-Inkubation; 7C: Raumtemperatur, keine Vorinkubation oder Säurestrip nur mit 4-stündiger Peptidbeladung; 7D: Raumtemperatur, kein Säurestrip unter Zugabe von löslichem Peptid zur Kultur.
Fig. 8 zeigt das Ergebnis des CTL-Induktionsassays unter Verwendung selektierter MA- GE-Peptide.
Fig. 9 zeigt das Ergebnis des CTL-Induktionsassays unter Verwendung selektierter HIV- Peptide.
Fig. 10 zeigt das Ergebnis des CTL-Induktionsassays unter Verwendung selektierter HCV- Peptide.
Fig. 11 zeigt das Ergebnis des CTL-Induktionsassays unter Verwendung selektierter HBV- Peptide.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Der Ausdruck "Peptid" wird hierin austauschbar mit "Oligopeptid" verwendet, um eine Abfolge von Resten, typischerweise Aminosäuren, zu kennzeichnen, die typischerweise durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carbonylgruppen benachbarter Aminosäuren miteinander verknüpft sind.
Ein "immunogenes Peptid" ist ein Peptid, das ein Allel-spezifisches Motiv umfasst, sodass das Peptid das MHC-Allel bindet und eine CTL-Reaktion induzieren kann. Somit sind immunogene Peptide zur Bindung an ein geeignetes Klasse I-MHC-Molekül und zur Induktion einer zytotoxischen T-Zell-Reaktion gegen das Antigen fähig, von dem das immunogene Peptid abgeleitet ist.
Der Ausdruck "Rest" bezieht sich auf eine Aminosäure oder ein Aminosäure-Mimetikum, die bzw. das durch eine Amidbindung oder ein Amidbindungs-Mimetikum in ein Oligopeptid inkorporiert ist.
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Steigerung der Immunreaktion auf verschiedene Krankheiten unter Einsatz von ex vivo-Therapie. Die allgemeine Vorgangsweise der Erfindung umfasst die Isolierung einkerniger bzw. mononuklearer Peripherblutzellen (PBMCs) aus einem Patienten, das Laden eines gewünschten immunogenen Peptids in die Bindungstaschen von MHC-Klasse I-Molekülen auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), das Inkubieren der APCs mit Vorläufer-CTLs in der Probe zwecks Induktion der Proliferation von das Peptid erkennenden CTLs und die Verwendung der CTIs zur Identifikation antigener Epitope sowie durch Erhöhen ihrer Anzahl und Einführung der aktivierten CTLs in den Patienten.
Die Verfahren der Erfindung hängen teilweise von der Bestimmung von Epitopen ab, die von CTLs erkannt werden, die infizierte Zielzellen eliminieren können. Ein Ansatz zur Identifikation dieser Epitope ist die Identifikation Allel-spezifischer Peptidmotive, die mit einer bestimmten Krankheit für Human-Klasse I-MHC-Allelsubtypen assoziiert sind. Die MHC-Klasse f-Antigene werden durch HLA-A-, B- und C-Loci kodiert. HLA-A- und B-Antigene werden an der Zelloberfläche in etwa gleichen Dichten exprimiert, während die Expression von HLA-C signifikant geringer ist (etwa bis zum Zehnfachen geringer). Jeder dieser Loci besitzt eine Anzahl an Allelen. Es ist eine große Anzahl von Zellen mit definierten MHC-Molekülen, insbesondere MHC-Klasse I-Molekülen, bekannt und steht allgemein zur Verfügung. Diese Zellen können dazu dienen, bestimmte mit Zielerkrankungen assoziierte Allel-spezifische Motive zu identifizieren.
Die Allel-spezifischen Motive dienen dann dazu, T-Zell-Epitope aus jedem gewünschten Antigen zu definieren, insbesondere jene, die mit Viruserkrankungen oder Krebs assoziiert sind, wofür die Aminosäuresequenz der potenziellen Antigenziele bekannt ist. Dieser allgemeine Ansatz ist in den laufenden und gemeinsam übertragene US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/926.666 und 08/027.146 ausführlich beschrieben.
Potenzielle Epitope auf einigen Zielproteinen können auf diese Weise identifiziert werden. Beispiele für geeignete Antigene sind das Prostata-spezifische Antigen (PSA), Hepatitis B-Kern, Oberflächen- und Polymerase-Antigene (HBVc, HBVs, HBVp), Hepatitis C- Antigene, Epstein-Barr-Virus-Antigene, Melanom-Antigene (z. B. MAGE-1), Human-Immunschwäche-Virus- (HIV-) Antigene, Human-Papillomvirus- (HPV-) Antigene, Cytomegalievirus (CMV), Herpes simplex-Virus (HSV) und andere onkogene Produkte (c-ERb B&sub2;, CEA, p 53-Brust/Eierstock).
Diese Techniken umfassen typischerweise die Isolierung von Peptiden aus einem bestimmten MHC-Molekül und das Sequenzieren der Peptide zwecks Bestimmung des relevanten Motivs. Buus et al., Science 242, 1065 (1988), beschrieben als Erste ein Verfahren zur Säureelution gebundener Peptide aus MHC. Anschließend entwickelten Rammensee et al. (Falk et al., Nature 351, 290 (1991)) einen Ansatz zur Charakterisierung natürlich verarbeiteter, an Klasse I-Moleküle gebundener Peptide. Andere Forscher führten erfolgreich direkte Aminosäuresequenzierung der in größerem Mengen vorhandenen Peptide in verschiedenen HPLC-Fraktionen durch konventionelle, automatisierte Sequenzierung von aus B-Typ-Klasse I-Molekülen eluierten Peptiden (Jardetzky et al., Nature 353, 326 (1991)) und von A2.1-Typ durch Massenspektrometrie (Hunt et al., Science 225, 1261 (1992)) durch. Einen Überblick über die Charakterisierung natürlich verarbeiteter Peptide auf MHC-Klasse I-Molekülen gibt Rötzschke und Falk (Rötzschke und Falk, Immunol. Today 12, 447 (1991)).
Die Definition von für unterschiedliche Klasse I-Allele spezifischen Motiven ermöglicht die Identifikation potenzieller Peptidepitope aus einem antigenen Protein, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist. Typischerweise erfolgt die Identifikation potenzieller Peptidepitope anfänglich unter Verwendung eines Computers, um die Aminosäuresequenz eines gewünschten Antigens auf die Gegenwart von Motiven zu scannen. Die Epitop-Sequenzen werden dann synthetisiert. Die Fähigkeit, MHC-Klasse-Moleküle zu binden, wird in unterschiedlicher Weise gemessen, z. B. mittels gereinigter Klasse I-Moleküle und radioiodierter Peptide und/oder Zellen, die leere Klasse I-Moleküle exprimieren; dies erfolgt z. B. durch Immunfluoreszenzfärbung und Durchflussmikrofluorimetrie, Peptid-abhängige Klasse I-Assemblage-Assays und Hemmung von CTL-Erkennung durch Peptidkompetition. Andere in der Literatur beschriebene Alternativen sind die Hemmung der Antigen-Präsentation (Sette et al., J. Immunol. 141, 3893 (1991)), in vitro-Assemblierungs-Assays (Townsend et al., Cell 62, 285 (1990)) und FACS-basierte Assays mit mutierten Zellen, wie z. B. RMA. S (Melief et al., Eur.). Immunol. 21, 2963 (1991)).
Als Nächstes werden Peptide, die im MHC-Klasse I-Bindungsassay positiv getestet werden, auf die Fähigkeit der Peptide untersucht, spezifische primäre oder sekundäre CTL- Reaktionen in vitro zu induzieren. Beispielsweise können Antigen-präsentierende Zellen, die mit einem Peptid inkubiert wurden, auf die Fähigkeit untersucht werden, CTL- Reaktionen in Responder-Zellpopulationen zu induzieren. Für sekundäre Reaktionen können Antigen-präsentierende Zellen normalen wie z. B. mononukleare Peripherblutzellen oder Dendritenzellen sein (Inaba et al., J. Exp. Med. 166, 182 (1987); Boog, Eur. J. Immunol. 18, 219 (1988)).
Alternativ dazu werden Säugetier-Zelllinienmutanten, die in ihrer Fähigkeit defizient sind, Klasse I-Moleküle mit intern verarbeiteten Peptiden zu beladen, z. B. Mäuse-Zelllinien RMA-S (Kärre et al., Nature 319, 675 (1986); Ljunggren et al., Eur. J. Immunol. 21, 2963-2970 (1991)) und das somatische Human-T-Zell-Hybridom, T-2 (Crundolo et al., Nature 345, 449-452 (1990)), die mit den geeigneten Human-Klasse I-Genen transfiziert wurden, günstigerweise verwendet, um sie bei der Zugabe von Peptid auf die Fähigkeit des Peptids zu testen, primäre in vitro-CTL-Reaktionen zu induzieren. Diese leeren MHC-Zellen sind bevorzugt, eine primäre Reaktion zu induzieren, da die Dichte von MHC-Peptid-Komplexen auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle höher ist. Andere geeignete eukaryotische Zelllinien sind verschiedene Insekten-Zelllinien, wie z. B. Moskitolarven (ATCC Zelllinien CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586), Seidenraupe (ATTC CRL 8851), Heerwurm (ATCC CRL 1711), Motte (ATCC CCL 80) und Drosophila-Zelllinien, wie z. B. eine Schneider-Zeltlinie, die mit den geeigneten für Human-Klasse I-MHC-Allel kodierenden Genen und den Human-B&sub2;-Mikroglobulin-Genen transfiziert wurden.
Sobald das geeignete Epitop bestimmt ist, werden immunogene Peptide, umfassend das für die MHC-Bindung erforderliche Motiv und das durch CTL erkannte Epitop, synthetisiert. Die immunogenen Peptide können synthetisch oder durch DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt oder aus natürlichen Quellen, wie z. B. Vollviren oder Tumoren, isoliert werden. Fachleuten auf dem Gebiet ist klar, dass die immunogenen Peptide eine Vielzahl von Längen aufweisen können - sie liegen entweder in ihren neutralen (ungeladenen) Formen oder in Form von Salzen vor, und sie sind entweder frei von Modifikationen, wie z. B. Glykosylierung, Seitenketten-Oxidation oder Phosphorylierung, oder enthalten diese Modifikationen, sofern die Modifikation nicht die biologische Aktivität der hierin beschriebenen Polypeptide zerstört.
Günstigerweise ist das Peptid möglichst klein, während es im Wesentlichen die gesamte biologische Aktivität des großen Peptids beibehält. Es ist - sofern möglich - günstig, Peptide der Erfindung auf eine Länge von 9 oder 10 Aminosäureresten zu optimieren, was der Größe von endogen verarbeiteten viralen Peptiden oder Tumorzellpeptiden entspricht, die an MHC-Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche gebunden sind.
Peptide mit der gewünschten Aktivität können gegebenenfalls modifiziert werden, um bestimmte gewünschte Eigenschaften zu ergeben, z. B. verbesserte pharmakologische Eigenschaften, während im Wesentlichen die gesamte biologische Aktivität des unmodifizierten Peptids, das gewünschte MHC-Molekül zu binden und die geeignete T-Zelle zu aktivieren, erhöht oder zumindest beibehalten wird. Beispielsweise können die Peptide zahlreichen Änderungen unterzogen werden, z. B. Substitutionen (entweder konservativ oder nichtkonservativ), wobei solche Veränderungen bestimmte Vorteile während der Verwendung wie etwa verbesserte MHC-Bindung bieten können. Unter konservativen Substitutionen ist die Ersetzung eines Aminosäurerests durch einen anderen zu verstehen, der biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, z. B. die Ersetzung eines hydrophoben Rests durch einen anderen oder eines polaren Rests durch einen anderen. Die Substitutionen umfassen Kombinationen, wie z. B. Gly, Ala; Val, Ile, Leu, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr. Die Wirkung einzelner Aminosäuresubstitutionen kann auch mittels D-Aminosäuren untersucht werden. Solche Modifikationen können unter Anwendung allgemein bekannter Peptidsynthese-Verfahren erfolgen.
Die Peptide der Erfindung können auf unterschiedliche Weise hergestellt werden. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe können die Peptide in Lösung oder auf einem festen Träger gemäß herkömmlichen Techniken synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisierer sind im Handel erhältlich und können gemäß bekannten Arbeitsvorschriften eingesetzt werden. Siehe z. B. Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co. (1984), s.o.
Alternativ dazu kann DNA-Rekombinationstechnologie eingesetzt werden, worin eine Nucleotidsequenz, die für ein immunogenes Peptid von Interesse kodiert, in einen Expressionsvektor insertiert, in eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert und unter für die Expression geeigneten Bedingungen kultiviert wird. Diese Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt; siehe Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), welche Druckschrift hierin durch Verweis aufgenommen ist. Fusionsproteine, die ein oder mehrere Peptidsequenzen der Erfindung umfassen, können auch dazu dienen, das geeignete T-Zell-Epitop zu präsentieren.
Die immunogenen Peptide werden dann zum Aktivieren von CTL ex vivo herangezogen. Die ex vivo-Therapieverfahren der Erfindung und deren pharmazeutische Zusammensetzungen eignen sich zur Behandlung von Säugetieren, insbesondere Menschen, zur Behandlung und/oder Prävention von Virusinfektionen, Immunerkrankungen und Krebs. Beispiele für Krankheiten, die unter Anwendung der ex vivo-Therapieverfahren der Erfindung behandelt werden können, sind Prostatakrebs, Hepatitis B, Hepatitis C, AIDS, Nierenkarzinom, Zervikalkarzinom, Lymphom, CMV, spitzes Kondylom und Eierstockkrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs und HSV.
Die Therapie sollte beim ersten Anzeichen viraler Infektion oder bei der Erkennung oder chirurgischen Entfernung von Tumoren bzw. kurz nach der Diagnose (im Fall akuter Infektion) einsetzen. Daran schließen sich Auffrischungen von CTL, zumindest bis Symptome im Wesentlichen abgeklungen sind oder noch länger. Bei chronischer Infektion sind möglicherweise Ladungsdosen und anschließende Auffrischungsdosen erforderlich.
Die Behandlung eines infizierten Individuums mit den Produkten der erfindungsgemäßen Verfahren kann die Auflösung der Infektion in akut infizierten Individuen beschleunigen. Für Individuen mit Anfälligkeit (Prädisposition) für die Entwicklung chronischer Infektion eignen sich Verfahren, die den Übergang von akuter zu chronischer Infektion verhindern. Wenn anfällige Individuen vor oder während der Infektion identifiziert werden, können die Zusammensetzungen auf sie abgezielt werden, sodass die Notwendigkeit der Verabreichung an eine größere Population weit weniger gegeben ist.
Die Produkte der erfindungsgemäßen Verfahren können auch zur Behandlung chronischer Infektion und zur Stimulation des Immunsystems zwecks Eliminierung virusinfizierter Zellen in Trägern herangezogen werden.
Ex vivo-CTL-Reaktionen auf einen bestimmten Erreger (Infektionserreger oder Tumorantigen) werden induziert, indem in Gewebekultur die CTL-Vorläuferzellen des Patienten (CTLp) gemeinsam mit einer Quelle Antigen-präsentierender Zellen (APC), beladen mit dem geeigneten immunogenen Peptid, inkubiert werden. Nach einer zweckmäßigen Inkubationszeit (typischerweise 3-12 Wochen), während der die CTLp aktiviert werden, zu Effektor-CTL reifen und expandieren, werden die Zellen wieder in den Patienten infundiert, wo sie ihre spezifische Zielzelle zerstören (eine infizierte Zelle oder eine Tumorzelle). Die Infusion der Zellen in den Patienten kann einen T-Zell-Wachstumsfaktor, wie z. B. Interleukin 2 (IL-2), enthalten. Um die in vitro-Bedingungen für die Erzeugung spezifischer zytotoxischer T-Zellen zu optimieren, wird die Kultur der Stimulatorzellen in einem geeigneten serumfreien Medium aufrechterhalten, das einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, wie z. B. IL-2, IL-4, IL-7 und IL-12, enthalten kann.
Peripherblutlymphozyten werden günstigerweise nach einfacher Venenpunktion oder Leukapherese normaler Spendern oder Patienten isoliert und als Responder-Zeliquellen von CTLp verwendet. In einer Ausführungsform - insbesondere geeignet für sekundäres CTL-Reaktionen - werden die geeigneten APC mit 10-100 pM Peptid in serumfreien Medium 4 Stunden lang unter geeigneten Kulturbedingungen inkubiert. Die Peptid-beladenen APC werden dann mit den Responder-Zellpopulationen in vitro 7-10 Tage lang unter optimierten Kulturbedingungen inkubiert. Für die primäre CTL-Induktion werden APC-exprimierende leere MHC verwendet, um naive CTLp zu stimulieren. In diesem Fall werden die CTLs häufiger (ein- bis zweimal) stimuliert.
Positive CTL-Aktivierung kann durch Untersuchen der Kulturen auf die Gegenwart von CTLs bestimmt werden, die radiomarkierte Zielzellen abtöten - sowohl spezifische Peptid-gepulste Ziele als auch Zielzellen, die eine endogen verarbeitete Form des relevanten Virus oder Tumorantigens, von dem die Peptidsequenz stammte, exprimieren.
Die Spezifizität und MHC-Restriktion der CTLs eines Patienten können durch einige auf dem Gebiet bekannte Verfahren ermittelt werden. Beispielsweise kann die CTL-Restriktion durch Testen hinsichtlich unterschiedlicher Peptid-beladener Zielzellen bestimmt werden, die Human-MHC-Klasse I-Allele exprimieren (geteilt mit dem HLA-Phenotyp der Donor-CTL). Die Peptide, die in MHC-Bindungsassays positiv testen und zu spezifischen CTL-Reaktionen führen, werden als immunogene Peptide identifiziert.
Wie oben erwähnt erfordert die Induktion von CTL in vitro die spezifische Erkennung von Peptiden, die an Allel-spezifische MHC-Klasse I-Moleküle auf APC gebunden sind. Die Anzahl spezifischer MHC/Peptid-Komplexe pro APC bestimmt die Stärke der Stimulation der CTL, insbesondere während der primären Immunreaktion. Während geringe Mengen an Peptid/MHC-Komplexen pro Zelle ausreichen, um eine Zelle anfällig gegenüber Lyse durch CTL zu machen oder um eine sekundäre CTL-Reaktion zu stimulieren, erfordert die erfolgreiche Aktivierung einer CTLp während der primären Rekation eine signifikant höhere Anzahl an MHC/Peptid-Komplexen.
Da Zelllinienmutanten, die leere MHC exprimieren, nicht für jedes Human-MHC-Allel existieren, ist es vorteilhaft, eine Technik zur Entfernung endogener MHC-assoziierter Peptide aus der Oberfläche von APC anzuwenden, gefolgt vom Beladen der resultierenden leeren MHC-Moleküle mit den immunogenen Peptiden von Interesse. Die Verwendung nicht-transformierter (nicht-tumorerzeugender), nicht-infizierter Zellen und vorzugsweise autologer Zellen von Patienten als APC ist für die Erstellung von CTL-Induktionsprotokollen für die Entwicklung von ex vivo-CTL-Therapien wünschenswert. Die Erfindung bietet neuartige Verfahren, die leere Klasse I-MHC erzeugen, die dann mit einem geeigneten immunogenen Peptid beladen werden können, indem die endogenen MHC-assoziierten Peptide von der Oberfläche von APC entfernt werden oder indem Niedertemperatur-Inkubation (37ºC → 26ºC) und anchließendes Beladen gewünschter Peptide erfolgt.
Ein stabiles MHC-Klasse I-Molekül ist ein trimerer Komplex, der aus den folgenden Elementen besteht: 1) einem Peptid von üblicherweise 8-10 Resten, 2) einer polymorphen Transmembran-Protein-Schwerkette, die die Peptid-Bindüngsstelle in ihrer α1- und α2- Domäne trägt, und 3) einer nicht-kovalent assoziierten nicht-polymorphen Leichtkette, β&sub2;-Mikroglublin. Die Entfernung der gebundenen Peptide und/oder das Dissoziieren des β&sub2;-Mikroglublins vom Komplex macht die MHC Klasse I-Moleküle nichtfunktionell und instabil, was zu einem raschen Abbau bei 37ºC führt. Fast alle aus PCMCs isolierten MHC-Klasse I-Moleküle besitzen an ihnen gebundene endogene Peptide. Daher besteht der erste Schritt zur Erzeugung von APC für die primäre CTL-Induktion darin, alle endogenen Peptide zu entfernen, die an MHC-Klasse I-Moleküle auf APC gebunden sind, ohne Abbau oder Zelltod vor der Zugabe exogener Peptide zu bewirken.
Zwei mögliche Arten der Erzeugung freier MHC-Klasse I-Moleküle sind die Senkung der Kulturtemperatur von 37ºC auf 26ºC über Nacht, damit MHC-Klasse I ohne Peptide exprimiert und die endogenen Peptide mittels Behandlung mit schwacher Säure aus der Zelle entfernt werden können. Die Behandlung mit schwacher Säure setzt zuvor gebundene Peptide in die leeren Klasse I-Moleküle frei. Die Niedertemperatur-Inkubation über Nacht bei 26ºC, die die Metabolismusrate der Zelle verlangsamen kann, erlaubt die Expression stabiler Klasse I-Moleküle, die dann wirkungsvoll exogene Peptide binden. Es ist auch wahrscheinlich, dass Zellen, die MHC-Moleküle nicht aktiv synthetisieren (z. B. ruhende PBMCs), keine großen Mengen leerer Oberflächen-MHC-Moleküle durch das Niedertemperatur-Verfahren erzeugen.
Die Extraktion der Peptide erfolgt durch Strippen mit starker Säure unter Einsatz von Trifluoressigsäure, pH 2, oder durch Säuredenaturation der Immunaffinitäts-gereinigten Klasse I-Peptid-Komplexe. Diese Verfahren eignen sich zur CTL-Induktion, da es wichtig ist, die endogenen Peptide zu entfernen, während die APC-Überlebensfähigkeit und ein optimaler metabolischer Zustand aufrechterhalten werden, der für die Antigen-Präsentation entscheidend ist. Lösungen von schwachen Säuren mit pH 3, wie z. B. Glycin oder Citratphosphatpuffer, dienten dazu, endogene Peptide und tumorassoziierte T-Zell-Epitope zu identifizieren (31. W. Storkus, H. Zeh, R. Salter und M. Motze, "Identification of T cell epitopes: Rapid isolation von class I-presented peptides from viable cells by mild acid elution"; 1993). Die Behandlung ist besonders wirkungsvoll, da nur die MHC-Klasse I-Moleküle destabilisiert und assoziierte Peptide freigesetzt werden, während andere Oberflächen-Antigene intakt bleiben, darunter MHC-Klasse II-Moleküle. (16. S. Suguwara, T. Abo und K. Kumagai, "A simple method to eliminate the antigenicity of surface II molecules from the membrane of viable cells by acid treatment at pH 3",). Immunol. Meth. 100, 83 (1987)). Vor allem übt die Behandlung von Zellen mit schwachen Säurelösungen keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Zellen oder ihren metabolischen Zustand aus. Die schwache Säurebehandlung erfolgt rasch, da das Strippen der endogenen Peptide innerhalb von 2 Minuten bei 4ºC eintritt und APCs nach dem Beladen der geeigneten Peptide funktionell sind. Diese Technik dient hierin dazu, Peptidspezifische APCs für die Erzeugung primärer Antigen-spezifischer CTLs herzustellen. Die resultierenden APCs können Peptidspezifische CTLs induzieren.
Typischerweise wird in einer primären Reaktion vor der Inkubation der APCs mit den zu aktivierenden CTLps eine Menge an antigenem Peptid den APCs oder Stimulator-Zellkultur zugegeben; die Menge reicht aus, um auf die Human-Klasse I-Moleküle geladen zu werden, die auf der Oberfläche der APCs zu exprimieren sind. In der Erfindung ist eine ausreichende Peptidmenge eine Menge, die es ermöglicht, dass etwa 200 oder mehr Peptid-beladene Human-Klasse I-MHC-Moleküle auf der Oberfläche jeder Stimulatorzelle exprimiert werden. Vorzugsweise werden die Stimulatorzellen mit 5-100 pg/ml Peptid inkubiert.
Ruhende oder Vorläufer-CTLs werden dann in Kultur mit den geeigneten APCs über einen Zeitraum inkubiert, der zur Aktivierung der CTLs ausreicht. Das Verhältnis zwischen Vorläufer-CTLs und APCs kann von Individuum zu Individuum variieren und von Variablen, wie z. B. der Eignung der Lymphozyten des Individuums für die Kulturbedingungen und der Beschaffenheit und dem Schweregrad des Krankheitszustands oder eines anderen Zustands, für den die hierin beschriebene Behandlung eingesetzt wird, abhängen. Vorzugsweise jedoch liegt das CTL-APC-Verhältnis (d. h. zwischen Responder und Stimulator) im Bereich von etwa 10 : 1 bis 100 : 1. Die CTL-APC-Kultur kann so lange wie notwendig aufrechterhalten werden, um eine therapeutisch nützliche oder wirkungsvolle CTL-Anzahl zu stimulieren.
Aktivierte CTLs können von APCs unter Anwendung einer Vielzahl bekannter Verfahren getrennt werden. Beispielsweise können für die APCs, die auf die Stimulatorzellen geladenen Peptide oder die CTLs (oder ein Segment davon) spezifische monoklonale Antikörper dazu dienen, ihren geeigneten komplementären Liganden zu binden. Antikörpermarkierte Zellen können dann durch ein geeignetes Mittel, z. B. durch allgemein bekannte Immunfällungs- oder Immungssay-Verfahren, aus dem Gemisch extrahiert werden.
Wirksame zytotoxische Mengen der aktivierten CTLs können zwischen in vitro- und in vivo-Anwendungen sowie hinsichtlich der Menge und Art von Zellen, die schließlich das Ziel dieser Killerzellen sind, variieren. Die Menge hängt auch vom Zustand des Patienten ab und sollte unter Berücksichtigung aller relevanter Faktoren durch den Praktiker bestimmt werden. Vorzugsweise werden aber etwa 1 · 10&sup6; bis etwa 1 · 10¹², noch bevorzugter etwa 1 · 10&sup8; bis etwa 1 · 10¹¹, am bevorzugtesten etwa 1 · 10&sup9; bis etwa 1 · 10¹&sup0;, aktivierte CTLs für erwachsene Menschen verwendet (im Vergleich zu etwa 5 · 10&sup6; bis 5 · 10&sup7; Zellen in Mäusen).
Wie oben besprochen können die aktivierten CTLs vor der Verabreichung der Zellen an das behandelte Individuum aus der Zellkultur gewonnen werden. Es ist allerdings zu beachten, dass im Gegensatz zu anderen aktuellen Behandlungsmodalitäten das vorliegende Verfahren ein Zellkultursystem vorsieht, das keine transformierten oder Tumorzellen enthält. Wenn daher keine vollständige Trennung der Antigen-präsentierenden Zellen und aktivierten CTLs erzielt wird, besteht keine inhärente Gefahr, die bekanntermaßen mit der Verabreichung einer kleinen Zahl an Stimulatorzellen einhergeht, während die Verabreichung tumorfördernder Säugetierzellen extrem risikoreich sein kann.
Eine Ausführungsform der Erfindung verwendet die APCs, die durch die in vitro-Techniken der vorliegenden Anmeldung zwecks in vivo-Therapie gegen CTL erzeugt werden. Die APCs sind hierin Patientenzellen (z. B. periphere Blutzellen), die ihrer natürlichen antigenen Peptiden entledigt und mit einem Peptid nach Wahl beladen sind, das an ein Toxin konjugiert ist (z. B. Ricin A-Kette oder Pseudomonas-Toxin). Die APCs werden dann wieder in den Patienten eingebracht, wo sie durch die endogenen CTLs gebunden sind, die für das antigene Peptid spezifisch sind. Das konjugierte Toxin töten aktivierte schädliche CTLs ab, d. h. jene, die Transplantatabstoßung nach der Bindung der APCs stimulieren. Eine solche gerichtete CTL-Abtötung eignet sich allgemein zur Behandlung von Gewebe-Transplantationsabstoßung und Autoimmun-Erkrankungen, die durch CTL mediiert werden. Das Behandlungsregime hängt von der jeweiligen zu behandelnden Störung und dem Urteil des behandelnden Arztes ab.
Verfahren zur Rückführung zellulärer Komponenten sind auf dem Gebiet bekannt; siehe z. B. die US-A-4.844.893 (Honsik et al.) und US-A-4.690.91 S (Rosenberg). Beispielsweise kommt die Verabreichung aktivierter CTLs durch intravenöse Infusion in Frage.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung.

Beispiel 1

Ex vivo-Induktion zytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs)

Mononukleare Peripherblutzellen (PBMCs) werden aus einem Patienten des HLA-Typs entweder durch Venenpunktion oder Leukapherese (je nach Anfangsmenge an erforderlichen CTLp) isoliert und mittels Picoll-Paque (Pharmacia) durch Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Typischerweise kann 1 Million PBMCs pro ml Peripherblut erhalten werden; alternativ dazu kann ein typisches Leukapherese-Verfahren bis zu 1-10 · 10¹&sup0; PBMC liefern.
Die isolierten und gereinigten PBMCs werden mit einer geeigneten Anzahl an APCs, die leere MHC-Moleküle exprimieren und zuvor mit einer geeigneten Menge an synthetischem Peptid (umfassend das HLA-Bindungsmotiv und die Sequenz des in Frage kommenden Antigens) inkubiert ("gepulst") wurden, co-kultiviert. PBMCs werden üblicherweise mit 1-3 · 10&sup6; Zellen/ml in Kulturmedium, wie z. B. RPMI-1640 (mit autologem Serum oder Plasma) oder dem serumfreien Medium AIM-V (Gibco), inkubiert.
APCs werden üblicherweise in Konzentrationen von 1 · 10&sup4; bis 1 · 10&sup6; Zellen/ml verwendet, je nach Art der eingesetzten Zellen. Mögliche APC-Quellen sind: autologe PBMCs, SAC-I-aktivierte PBMCs, PHA-Blasten; autologe Dendritenzellen (DC), die aus PBMCs isoliert und gemäß einem beschriebenen Verfahren gereinigt werden (Inaba et al., J. Exp. Med. 166, 182 (1987)); sowie gentechnisch erzeugte Säugetierzellmutanten, wie z. B. die Mäuse-RMA-S-Zelllinie oder die Human-T2-Zelllinie, transfiziert mit den geeigneten MHC-Genen, die "leere" HLA-Moleküle exprimieren, die gegenüber der allelen HLA-Form des Patienten syngen sind. APCs mit leeren HLA-Molekülen können CTL-Reaktionen ausgezeichnet induzieren, möglicherweise, weil sich das Peptid leichter mit leeren MHC-Molekülen assoziieren kann als mit MHC-Molekülen, die durch andere Peptide besetzt sind (DeBruijn et al., Eur. J. Immunol. 21, 2963-2970 (1991)).
Die APCs werden einer geeigneten Dosis γ-Strahlen ausgesetzt (z. B. unter Verwendung von radioaktivem Cäsium oder Kobalt), um ihre Proliferation zu verhindern und die Expansion der CTLp zu vereinfachen.
Die Mischkulturen, die PBMCs, APCs und Peptid enthalten, werden in einem geeigneten Kulturgefäß, wie z. B. Kunststoff-T-Kolben, gasdurchlässigen Kunststoffbeuteln oder Rollflaschen bei 37ºC in einem Inkubator mit feuchter Luft und CO&sub2; gehalten. Nach der Aktivierungsphase der Kultur, die üblicherweise während der ersten 3-5 Tage eintritt, können die resultierenden Effektor-CTLs durch Zugabe rekombinanter Wachstumsfaktoren wie IL-2, 1L-4 oder IL-7 zu den Kulturen weiter expandiert werden. Eine Expansionskultur kann je nach Anzahl der für einen bestimmten Patienten erforderlichen Effektor-CTLs weitere 5-12 Tage lang gehalten werden. Außerdem können Expansionskulturen unter Verwendung künstlicher Hohlfaser-Kapillarsysteme (Cellco) gebildet werden, in denen eine größere Anzahl an Zellen (bis zu 1 · 10¹¹) gehalten werde kann. Um die für die Behandlung erforderliche Anzahl an Zellen zu erreichen, ist es unter Umständen erforderlich, die Kulturen zwei- bis viermal mit bestrahlten, autologen, Peptid-gepulsten anhaftenden PBMCs zu restimulieren.
Bevor die Zellen in den Patienten infundiert werden, werden sie auf Aktivität, Viabilität, Toxizität und Sterilität getestet. Die zytotoxische Aktivität der resultierenden CTLs kann durch einen herkömmlichen &sup5;¹Cr-Freisetzungsassay (W. E. Biddison, "Current Protocols in Immunology" p7, 17.1-7.17.5,). Coligan et al. (Hrsg.),). Wiley and Sons, New York, 1991) unter Einsatz von Zielzellen, die das geeignete HLA-Molekül exprimieren, in Gegenwart und Abwesenheit des immunogenen Peptids bestimmt werden. Die Viabilität wird durch Ausschluss von Trypanblau-Farbstoff durch lebende Zellen ermittelt. Zellen werden durch konventionelle Techniken auf Gegenwart von Endotoxin untersucht. Schließlich wird die Gegenwart bakterieller oder fungaler Kontamination durch zweckgemäße mikrobiologische Verfahren (Schokolade-Agar usw.) bestimmt. Sobald die Zeilen alle Qualitätskontroll- und Sicherheitstests bestanden haben, werden sie gewaschen und in die geeignete Infusionslösung (Ringer/Glucoselactat/Human-Serumalbumin) gefüllt, die einen T-Zell-Wachstumsfaktor wie z. B. IL-2 enthalten kann, und intravenös in den Patienten infundiert.

Beispiel 2

Herstellung wirksamer, HLA-Allel-spezifischer, Antigen-präsentierender Zellen durch Säurestripping und anschließende Peptidbeladung

Dieses Beispiel veranschaulicht die Durchführung von Niedertemperatur-Inkubation und Säurestripping zur Erzeugung leerer MHC-Klasse 1-Moleküle, damit das Peptid-Beladungsverfahren wirksame, HLA-Allel-spezifische, Antigen-präsentierende Zellen (APCs) für die Verwendung in diagnostischen oder ex vivo-Therapieanwendungen liefern kann. Die APCs dienten in diesem Beispiel dazu, zytotoxische Vorläufer-T-Lymphozyten für die Entwicklung Antigen-spezifischer zytotoxischer Zellen zu sensibilisieren. Dies erfolgte entweder mit Staphylococcus aureus cowan I SAC I-aktivierten PBMCs, Phytohämagglutinin- (PHA-) T-Zell-Blasten oder PBMCs als APCs in den HLA-A2.1- und HLA- 1A-Sytemen. Die Ergebnisse sind auch auf andere APCs und die anderen MHC-Allele anwendbar.
Kulturmedium: PHA-Blasten und CTL-Induktionen erfolgten in RPMI 1640 + Hepes + Glutamin (Gibco), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (Irvine Scientific), 50 ug/ml Gentamicin (Gibco) und 5% wärmeinaktiviertem gepooltem Typ AB-Serum (Gemini Bioproducts) (RPMI/5% HS). EBV-transformierte Lymphoblastoid-Zelllinien (LCL) wurden in RPMI 1640 + Hepes + Glutamin (BioWhittaker), ergänzt mit L-Glutamin und Gentamicin wie oben, und 10% wäreminaktiviertem Rinderfötenserum (Irvine Scientific) (RPMI/ 10% FCS) gehalten. Chrom-Freisetzungsassays erfolgten in RMPI/10% FCS.
Cytokine: Rekombinantes Human-Interleukin-2 (rIL-2) (Sandoz) wurde in einer Endkonzentration von 10 U/ml verwendet. Rekombinantes Human-Interleukin-7 (rIL-7) (Genzyme) wurde in einer Endkonzentration von 10 ng/ml verwendet.
Kultivierte Zellliniien: JY, eine HLA A2.1 exprimierende Human-EBV-transformierte B- Zelllinie wurde in RPMI/10% FCS gezüchtet. K562, eine NK-Zellen-sensitive Erythroblastomlinie, wurde in EPMI/10% FCS gezüchtet. K562 diente zur Reduktion von Hintergrundabtötung durch NK- und LAK-Zellen in den Chrom-Freisetzungsassays.
Peptide: Die in diesen Studien verwendeten immunogenen Peptide wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von Motiven für HLA-Allele für spezifische Ziel-Antigene synthetisiert; dies ist ausführlich in den laufenden und gemeinsam übertragenen US- Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/926.666 und 08/027.146 beschrieben, und ihre Sequenzen sind aus Tabelle 1 ersichtlich. Peptide wurden routinemäßig in 100 DMSO bei 20 mg/ml gelöst, aliquotiert und bei -20ºC gelagert.
Isolierung mononuklearer Peripherblutzellen (PBMCs): Vollblut wurde in Heparin (10 U/ml) enthaltenden Spritzen entnommen und in konischen 50 cm³-Zentrifugenröhrchen (Falcon) bei 1600 U/min (Beckman GS-6KR) 15 min lang zentrifugiert. Die Plasmaschicht wurde dann entfernt und 10 ml der gelbbraunen Oberschicht mit einer 10 ml-Pipette mittels kreisrunder Bewegung gesammelt. Die gelbbraune Oberschicht wurde gründlich vermischt und mit demselben Volumen an serumfreiem RPMI 1640 verdünnt. Die verdünnte gelbbraune Oberschicht wurde dann in einem konischen 50 cm³-Röhrchen auf 20 ml Ficoll-Paque (Pharmacia) aufgebracht und 400 · g 20 min lang bei Raumtemperatur gebremst zentrifugiert. Die die PBMCs enthaltende Grenzfläche wurde mittels einer Übertragungspipette (zwei Grenzflächen pro 50 cm³-Röhrchen) gesammelt und dreimal mit 50 ml serumfreien RPMI (1700, 1500 und 1300 UI min. 10 min lang) gewaschen.
Gefrieren und Auftauen von PBMCs: PBMCs wurden mit 30 · 10&sup6; Zellen/ml 90% FCS + 10% DMSO (Sigma) in 1 ml-Aliquoten mittels Niedertemperatur-Röhrchen (Nalge) gefroren. Diese wurden in Cryo 1ºC-Gefrierbehälter (Nalge) mit Isopropanol (Fisher) gestellt und 4 h lang (Mininum) bis über Nacht (Maxmimum) bei -70ºC gelagert. Isopropanol wurde nach 5 Einsätzen ausgetauscht. Die Niedertemperatur-Röhrchen wurden zwecks langfristiger Lagerung in flüssigen Stickstoff übertragen. PBMCs wurden durch fortlaufendes Schütteln in einem 37ºC-Wasserbad aufgetaut, bis der fetzte Kristall fast aufgetaut war. Zellen wurden sofort in serumfreiem RPMI-Medium mit DNAse 30 ug/ml verdünnt (zwecks Vermeidung des Klumpens durch tote Zellen; Calbiochem) und zweimal gewaschen.
Herstellung von Responder-Zellpopulation mit abgereicherter Menge an CD4+T-Zellen: CD4+ Lymphozyten-Abreicherung erfolgte mittels Antikörper-beschichteter Kolben: MicroCELLector T-150-Kolben für die Selektion von CD4+-Zellen (Applied Immune Sciences) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 25 ml PBS CMF (Calcium- Magnesium-frei) + 1 mM EDTA (Sigma) durch Wirbeln der Kolben 30 s fang und anschließende einstündige Inkubation bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche gewaschen. Puffer wurde abgesaugt, und die Kolben wurden weitere zwei Male durch 30 s lang dauerndes Schütteln der Kolben und unter Beibehaltung der Abdeckung der Bindeoberfläche gewaschen. Jedem gewaschenen Kolben wurden 25 ml Kulturmedium zugegeben und das Gemisch 20 min lang bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche inkubiert. Medium wurde im Kolben gelassen, bis es bereit war, die Zellen aufzunehmen. PBMCs wurden in Kulturmedium mit 30 ug/ml DNAse aufgetaut und zweimal gewaschen. Für einen Kolben wurden maximal 12 · 10&sup7; Zellen in 25 ml-Kulturmedium resuspendiert. Kulturmedium wurde aus dem Kolben gesaugt und die Zellsuspension anschließend vorsichtig dem MicroCELLector zugegeben. Die Zellen enthaltende Kolben wurden 1 h lang bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde der Kolben vorsichtig 10 s lang von Seite zu Seite geschwenkt, um nicht-adhäsive Zellen zu resuspendieren. Nichtadhäsive, um CD4+ T- Zellen abgereicherte Zellen wurden geerntet und Kolben zweimal mit PBS-CMF gewaschen, um die nicht-adhäsiven Zellen zu sammeln. Die geernteten, um CD4+ T-Zellen abgereicherten Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und in Kulturmedium resuspendiert.
Erzeugung von PHA-Blasten: PBMCs wurden unter Anwendung der Standard-Ficoll-Paque-Arbeitsvorschrift isoliert. Gefrorene Zellen wurden zweimal vor der Verwendung gewaschen. Zellen wurden in 2 · 10&sup6;/ml in RPMI/5% HS mit 1 ug/ml PHA (Wellcome) und 10 U/ml rIL-2 kultiviert. PHA-Blasten wurden in 10 U/ml rIL-2 enthaltendem Kulturmedium gegebenenfalls unter erneuter Zufuhr und Aufteilung gehalten. PHA-Blasten wurden am Tag 6 der Kultivierung als APCs verwendet. Die Erzeugung leerer Klasse 1- Moleküle und die Peptidbeladung erfolgte durch Säurestripping unter Verwendung von PBMCs als APCs.
Säurestripping/Peptidbeladung auf PBMCs und PHA-Blasten: PBMCs wurden unter Anwendung der Ficoll-Paque-Arbeitsvorschrift isoliert. Bei Verwendung gefrorener Zellen wurden PBMCs zweimal vor der Verwendung gewaschen. PHA-Blasten wurden wie oben hergestellt und zweimal vor der Verwendung gewaschen. Sobald die Zellen hergestellt waren, wurden sie einmal in kaltem sterilem 0,9 % NaCl (J. T. Baker) + 1% BSA gewaschen. In einem konischen 50 cm³-Zentrifugenröhrchen wurden die Zellen zu 10&sup7;/ ml in kaltem sterilem Citratphosphat-Puffer resuspendiert (0,13 M Citronensäure (J. T. Baker), 0,06 M Natriumphosphat, einbasig (Sigma), pH 3, 1% BSA, 3 ug/ml β&sub2;-Microglobulin (Scripps Labs)) und 2 min lang auf Eis inkubiert. Sofort wurden 5 Volumina kalter steriler Neutralisierungspuffer Nr. 1 (0,15 M Natriumsphosphat, einbasig, pH 7,5, 1% BSA, 3 ug/ml β&sub2;-Microglobulin, 10 ug/ml Peptid) zugegeben und die Zellen bei 1500 U/min 5 min lang bei 4ºC pelletiert. Die Zellen wurden in 1 Volumen kaltem sterilem Neutralisierungspuffer Nr. 2 (PBS CMF, 1% BSA, 30 ug/ml DNAse, 3 ug/ml β&sub2;-Microglobulin, 40 ug/ml Peptid) resuspendiert und 4 h lang bei 20ºC inkubiert. Die Zellen wurden mit Kulturmedium auf etwa 5 · 10&sup6;/ml verdünnt und mit 6000 rad bestrahlt. Die Zellen wurden bei 1500 U/min zentrifugiert, 5 min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und in Kulturmedium resuspendiert. Die säuregestrippten/peptidbeladenen Zellen wurden sofort in den CTL-Induktionskulturen (unten) verwendet.
Bindungsassays unter Einsatz intakter Zellen und von radiomarkiertem Peptid: JY-Zellen wurden entweder säuregestrippt (d. h. mit Citratphosphat-Puffer und Neutralisierungspuffer Nr. 1 wie oben behandelt) oder bei reduzierter Temperatur inkubiert. JY-Vergleichszellen wurden unbehandelt in Gewebekulturmedium belassen. Nach der Behandlung wurden beide Zellpopulationen zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen und mit ¹²&sup5;I-radiomarkiertem 941.01 (HBc 18-27) Peptid (herkömmliche Chloramin T-lodierung) beladen. Zur Bestimmung der Bindungsspezifität wurden 2 · 10&sup6; Zellen in 200 ul Neutralisierungspuffer Nr. 2 (s.o.), umfassend ¹²&sup5;1-941.01 (10&sup5; cpms) +/- 100 ul unmarkiertes 941.01, resuspendiert. Die Zellen wurden 4 h lang bei 20ºC inkubiert und zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen, um freies Peptid zu entfernen. Die Zellen wurden in 200 ul serumfreiem RPMI resuspendiert. In einem Mikrozentrifugenröhrchen wurde die Zellsuspension auf 800 ul FCS aufgebracht und 5 s lang durch Zentrifugation pelletiert. Überstände wurden abgesaugt und die im Pellet verbleibende Radioaktivität gemessen (automatischer Gammazähler von Micromedic, 1 min pro Röhrchen).
Bindung radiomarkierter Peptide an leere MHC-Moleküle: Um die Wirksamkeit der Peptidbeladung unter Anwendung der Niedertemperatur-Inkubation oder der Säurestripping-Peptidbeladungs-Arbeitsvorschrift zu bestimmen wurden JY-Zellen (eine HLA-A2. 1 EBV-transformierte B-Zelllinie) bei 26ºC über Nacht präinkubiert oder säuregestrippt, um die endogenen MHC-assoziierten Peptide zu entfernen; die Beladung von exogenem Peptid wurde unter Einsatz eines ¹²&sup5;I-radiomarkierten HLA-A2.1-Bindungspeptids bestimmt. Die Spezifität dieser Reaktion wurde durch Messen der Inhibition markierter Peptidbindung unter Verwendung eines kalten Peptids der gleichen Sequenz ermittelt. Die aus Tabelle 2 ersichtlichen Ergebnisse zeigen, dass die Säurebehandlung der Zellen die Menge an markierter Peptidbindung an die JY-Zellen signifikant (etwa um das Zehnfache) erhöhte. Außerdem wurde die Bindung von markiertem Peptid durch die Zugabe des kalten Peptids vollständig blockiert, was auf spezifische Bindung hindeutet (Daten nicht dargestellt).
FACS-Analyse: Etwa 10&sup6; Zellen wurden für jeden zu untersuchenden Antikörper verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit PBS CMF + 0,1% BSA gewaschen. Jeder Probe wurden 100 ul PBS CMF + 0,1% BSA + primärer Antikörper bei 2 ug/ml (BB7.2, ATCC) oder (9.12.1, INSERM-CNRS, Marseille, Frankreich) oder (LB3.1, Children's Hospital, Pittsburgh, USA) zugegeben. Ein negativer Vergleich war immer enthalten. Die Zellen wurden 20 min lang auf Eis inkubiert und zweimal mit PBS CMF + 0,1% BSA gewaschen. Die Zellen wurden in 100 ul Anti-Mäuse-IgG-FITC-Konjugat (Sigma), 1 : 50 in PBS CMF + 0,1% BSA verdünnt, resuspendiert und 20 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS CMF + 0,1% BSA gewaschen und in PBS zwecks FACScan-Analyse (Becton Dickinson) resuspendiert. Wenn es notwendig war, die Analyse auf nachfolgende Tage zu verschieben, wurden die Zellen mit PBS/1 % Paraformaldehyd (Fisher) fixiert und innerhalb einer Woche analysiert.
Messungen mittels FACS-Analyse: PHA-induzierte T-Zell-Blasten wurden gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren säuregestrippdpeptidbeladen. Die resultierenden Zellen wurden zwecks FACS-Analyse unter Einsatz monoklonaler Anti-HLA-A2- (BB7.2) und Anti-HLA-α-kettenspezifischer (9.12.1) Antikörper eingefärbt. Vergleiche für dieses Experiment enthielten die gleiche Zellpopulation, die nicht bei pH 3, sondern mit PBS-Puffer bei pH 7,2 behandelt wurde, und mit Citratphosphat-Puffer behandelte Zellen (zwecks Strippen von MHC), die aber in Abwesenheit von β&sub2;-Microglobulin und Peptid neutralisiert wurden. Die aus Fig. 1 ersichtlichen Ergebnisse zeigen auf, dass die Behandlung dieser Zellen mit dem Citratphosphat-Puffer (pH 3) die Reaktivität der Zellen gegenüber beiden Anti-HLA-Klasse I-Antikörpern alleine (Anti-HLA-A2- und α-Kettenspezifisch), aber nicht gegenüber für Klasse II-MHC-Moleküle spezifischem monoklonalem Antikörper (Anti-HLA-DR) signifikant (um das Zehnfache) reduzierte. Vor allem führte die Neutralisierung der säuregestrippten Zellen in Gegenwart von β&sub2;-Microglobulin und Peptid zur Erhaltung einer beträchtlichen Anzahl an Klasse I-MHC-Antikörperreaktiven Stellen, wobei nur eine 2,5 fache Abnahme der Fluoreszenzintensität eintrat. Die säurebehandelten Zellen blieben lebensfähig (gemessen durch Trypanblau-Ausschluss und Vorwärts/Seitwärts-FACS-Streuanalyse). Ähnliche Ergebnisse wurden unter Einsatz EBV-transformierter B-Zelllinien, frischer (oder gefrorener) PBMCs oder anderer Peptide, die sich entweder an HLA-A2.1 oder HLA-A1 binden, erhalten (Daten nicht dargestellt).
Induktion primärer CTLs mittels säuregestrippter/peptidbeladener autologer PBMCs und PHA-Blasten als Stimulatoren: Säurestripping/Peptidbeladung von PBMCs und PHA- Blasten erfolgte wie oben. Während der vierstündigen Inkubation von Stimulatorzellen mit Peptid wurde die Responder-Zellpopulation gebildet: Responder waren CD4+ T- Zellen abgereicherte PBMCs (s.o.). Responderzellen wurden in Kulturmedium bei 3 · 10&sup6;/ml resuspendiert und 1 ml der Responder-Zellsuspension in jeden Napfeiner 24- Napf-Gewebekulturplatte gefüllt (Falcon, Becton Dickinson). Die Platten wurden bei 37ºC, 5% CO&sub2; in den Inkubator gestellt, bis die Stimulatorpopulation bereit war. Die bestrahlten Stimulator-APCs wurden in 20 ng/ml rIL-7 enthaltendem Kulturmedium bei 10&sup6;/ml für PBMCs oder bei 3 · 10&sup5;/ml für die PHA-Blasten resuspendiert und 1 ml Stimulator-Zellsuspension pro Napf den die Responder enthaltenden Platten zugegeben. Am Tag 7 nach der Induktion wurde 200 ng/ml rIL-7 enthaltendes Kulturmedium jedem Napf zugesetzt (10 ng/ml rIL-7 Endwert). Am Tag 10 nach der Induktion wurden 100 ul Kulturmedium mit 200 U/ml rIL-2 jedem Napf zugegeben (10 U/ml rIL-2 Endwert).
Antigen-Restimulation von CTLs: Am Tag 12-14 nach der Induktion wurden die primären CTLs mit Peptid unter Einsatz autologer, adhäsiver APCs restimuliert. Autologe PBMCs wurden wie oben aufgetaut und gewaschen. Die Zellen wurden mit 6000 rad bestrahlt. Die Zellen wurden in Kulturmedium bei 4 · 10&sup6; resuspendiert und 1 ml Zellsuspension jedem Napfeiner 24-Napf-Gewebekulturplatte zugesetzt und 2 h lang bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Nichtadhäsive Zellen wurden durch dreimaliges Waschen jedes Napfes mit serumfreien RPMI entfernt. Nach diesem Schritt wurde ein 0,5 ml-Kulturmedium mit 3 ug/ml β&sub2;-Microglobulin und 20 ug/ml Vollpeptid jedem Napf zugegeben. APCs wurden 2 h lang bei 37ºC unter 5% CO&sub2; mit dem Peptid und β&sub2;-Microglobulin inkubiert. Die Näpfe wurden abgesaugt und 1 ml Responderzellen bei 1,5 · 10&sup6;/ml in Kulturmedium jedem Napf zugegeben. Nach 2 Tagen wurde 1 m) Kulturmedium mit 20 U/ml rIL-2 jedem Napf zugegeben. Die Kulturen wurden anschließend alle 3 Tage mit 10 U/ml rIL-2 (Endwert) ergänzt.
Zytotoxizitäts-Chromfreisetzungs-Assay: 7 Tage nach Restimulation primärer Induktion wurde die zytotoxische Aktivität der Kulturen bewertet.
a. Herstellung von Effektorzellen: Die Responder wurden mit 10&sup7;/ml in RPMI/10% FCS zentrifugiert und resuspendiert. Dreifach-Reihenverdünnungen von Effektoren erfolgten, um Effektor-Ziel-Verhältnisse von 100 : 1, 33 : 1, 11 : 1 und 3 : 1 zu ergeben. Effektorzellen wurden mit 100 ul/Napfauf 96-Napf-U-Boden-Clusterplatten (Costar) in Doppelansätzen aliquotiert.
b. Herstellung von Zielzellen: Etwa 16-20 h vor dem Assay wurden Zielzellen mit 3 · 10&sup5;/ml in RPMI/10% FCS in Gegenwart oder Abwesenheit von 3 ug/ml β&sub2;-Microglobulin und 10 ug/ml Vollpeptid resuspendiert. Nach der Präinkubation wurden die Zielzellen zentrifugiert und Pellets in 200 ul (300 uCi) Natrium (&sup5;¹Cr) Chromat (NEN) resuspendiert. Die Zellen wurden 1 h lang bei 37ºC unter Schütteln inkubiert. Markierte Zielzellen wurden dreimal mit RPMI/10% FCS gewaschen.
c. Assayvorbereitungen: Die Konzentration der Zielzellen wurde in RPMI/10% FCS auf 10&sup5;/ml eingestellt, und es wurden jedem Responder enthaltenden Napf 100 ul-Aliquoten zugesetzt. K562-Zellen (kalte Ziele zwecks Blockieren von NK und LAK-Aktivität) wurden gewaschen und mit 10&sup7;/ml in RPMI/10% FCS resuspendiert. Pro Napf wurden 20 ul Aliquot zugegeben, wodurch sich ein Verhältnis zwischen kaltem K562-Ziel und markiertem Ziel von 20 : 1 ergab. Zur Bestimmung der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung wurden 100 ul/Napf RPMI/10% FCS 100 ul/Napf markierten Zielzellen und 20 ul/Napf K562 zugegeben. Für die maximale &sup5;¹Cr-Freisetzung wurden 100 ul 1% Triton X-100 (Sigma) in PBS CMF 100 ul/Napf markierten Zielzellen und 20 ul/Napf K562 zugegeben. Die Platten wurden 2 min lang bei 1200 U/min zentrifugiert, um die Bildung von Zellkonjugat zu beschleunigen. Die Assays wurden 5 h lang bei 37ºC, 5% CO&sub2; inkubiert. Sie wurden durch fünfminütiges Zentrifugieren von Platten bei 1200 U/min und Sammeln von 100 ul/Napf Überstand geerntet. Es wurden herkömmliche Gammazählungs-Techniken dazu angewendet, die spezifische prozentuelle Lyse zu erhalten (automatischer Gammazähler von Micromedic, 0,5 min pro Röhrchen). Die spezifische prozentuelle Lyse wurde anhand der folgenden Formel bestimmt: cpm experimentelle Freisetzung - cpm spontane Freisetzung/cpm maximale Freisetzung - cpm spontane Freisetzung · 100.
In vitro-Induktion primärer Antigen-spezifischer CTL mittels säuregestrippter/peptidbeladener APCs: Zusätzliche wesentliche Parameter für die Induktion primärer CTLs sind: 1) Anreicherung von CD8+ T-Zellen in der Responder-Zellpopulation (durch Abreicherung von CD4+ T-Zellen), 2) Zugabe von rIL-7 zu CTL-Induktionskulturen ab Tag 0 und 3) Restimulation der Kulturen mit Antigen am Tag 12-14 mittels autologer, adhäsiver, Peptid-gepulster Zellen. Die in den Fig. 2, 3 und 5 gezeigten Ergebnisse stimmen mit den unter Verwendung von PBMCs als APCs durchgeführten Experimenten überein. Die Ergebnisse aus Fig. 4 zeigen Ergebnisse, die unter Einsatz PHA-induzierter T-Zell-Blasten als APCs erhalten wurden. Fig. 7 ist ein Vergleich des Säurestripping-Beladens (Fig. 7) mit der Niedertemperatur-Inkubationstechnik (Fig. 7b).

Beispiel 3

Screening von Peptiden zur Identifikation con CTL-Epitopen

Um CTL-Epitope zu identifizieren, wurden CTLs durch SAC-I-aktivierte PBMCs als APCs stimuliert. Niedere Temperaturen verstärkten die Expression leerer MHC, wodurch die Beladung von antigenem Peptid und die Erzeugung SAC-I-aktivierter PBMC-APCs ermöglicht wurde. Dieses Verfahren stellte eine Alternative zu den oben beschriebenen Verfahren für die Erzeugung von APCs dar, die zur Stimulation von CTLs dienen. Dieses Beispiel ist auch eine Alternative zur Stimulation von CTLs durch APCs.
Vollkulturmedium: Das in dieser Studie verwendete Gewebekulturmedium bestand aus RPMI 1640 mit Hepes und L-Glutamin (Gibco, Biowhittaker), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin (Irvine Scientific), 0,5 mM Natriumpyruvat (Gibco), 100 U/100 ug/ml Penicillin/Streptomycin (Irvine) und 5% wärmeinaktiviertem Humanserum Typ AB (RPMI/5% HS; Gemini Bioproducts). Das beim Wacshtum EBV-transformierter Linien verwendete Kulturmedium enthielt 10% wärmeinaktiviertes Kalbsfötenserum (RPMI/10% FCS, Irvine) anstelle von Humanserum.
Cytokine: Rekombinantes Human-Interleukin-2 (rIL-2) und Interleukin-4 (rIL-4) stammten von Sandoz und wurden in einer Endkonzentration von 10 U/ml bzw. 10 ng/ml verwendet. Human-Interferon-γ (IFN-γ) und rekombinanres Human-Interleukin-7 (rIL-7) stammten von Genzyme und wurden bei 20 U/ml bzw. 10 ng/ml verwendet.
Peptide: Peptide wurden wie oben synthetisiert und sind aus Tabelle 1 ersichtlich. Die Peptide wurden routinemäßig in 100% DMSO bei 20 mg/ml gelöst, aliquotiert und bis zur Verwendung bei -70ºC gelagert.
Zelllinien: JY, Steinlein, EHM, BVR und KT3 sind homozygote EBV-transformierte Human-B-Zelllinien, die HLA A2.1, A&sub1;, A&sub3;, A&sub1;&sub1; bzw. A&sub2;&sub4; exprimieren. Sie werden in RPMI/ 10% FCS gezüchtet und werden als Ziele in den CTL-Assays verwendet. K562, eine NK-Zellen-sensitive und in RPMI/10% FCS gezüchtete Erythrobastom-Linie, diente zur Reduktion von Hintergrundabtötung in den CTL-Assays. Melanom-HLA A1 + -Zelllinien, die entweder das MAGE-Antigen, mel 397 und mel 938 exprimieren oder die nicht das MAGE-Antigen, mel 888 exprimieren, wurden auch in RPMI/10% FCS gezüchtet.
Isolierung von PBMCs: Vollblut wurde in Heparin enthaltenden Spritzen gesammelt und in 50 cm³-Zentrifugenröhrchen bei 1600 U/min (Beckman GS-6KR) 15 min lang zentrifugiert. Die Plasmaschicht wurde dann entfernt und 10 ml der gelbbraunen Oberschicht mit einer 10 ml-Pipette mittels kreisrunder Bewegung gesammelt. Die gelbbraune Oberschicht wurde gründlich vermischt und mit demselben Volumen an serumfreiem RPMI 1640 verdünnt. Die gelbbraune Oberschicht (30 ml) wurde dann auf 20 ml Ficoll-Paque (Pharmacia) aufgebracht und bei 1850 U/min (400 · g) 20 min lang bei 25ºC ungebremst zentrifugiert. Die die PBMCs enthaltende Grenzfläche wurde mittels einer Übertragungspipette (zwei Grenzflächen pro 50 cm³-Röhrchen) gesammelt und dreimal mit 50 ml serumfreien RPMI (1700, 1500 und 1300 U/min. 10 min lang) gewaschen. Die Zellen wurden in 10-20 ml Kulturmedium resuspendiert, gezählt und auf die geeignete Konzentration eingestellt.
Gefrieren von PBMCs: 30 Millionen Zellen/Röhrchen (90% FCS/10% DMSO; Sigma) wurden in einen Nalgene Cryo 1ºC-Gefrierbehälter eingefüllt, der Isopropanol (Fisher) enthielt und 4 h lang (Mininum) bis über Nacht (Maximum) bei -70ºC gelagert wurde. Isopropanol wurde alle 5 Mal ausgetauscht. Die Röhrchen wurden zwecks langfristiger Lagerung auf flüssigen Stickstoff übertragen. Zum Auftauen werden PBMCs fortlaufend in einem 37ºC Wasserbad geschüttelt, bis der letzte Kristall fast aufgetaut war (man ließ die Röhrchen nie im Wasserbad oder bei Raumtemperatur stehen). Die Zellen wurden in serumfreiem RPMI verdünnt, das 30 ug/ml DNAase enthielt, um Verklumpen durch DNA toter Zellen zu vermeiden, und zweimal gewaschen:

Induktion primärer CTLs mittels SAC-I-aktivierter PBMCs als APCs:

a. Herstellung SAC-1-aktivierter PBMCs als APCs: PBMCs wurden unter Anwendung der herkömmlichen Ficoll-Paque-Arbeitsvorschrift gereinigt und bei 1 · 10&sup6;/ml in RPMI/5% FCS, umfassend 0,005% Pansorbin-Zellen (SAC-I-Zellen, die Protein A exprimieren; Calbiochem), 20 ug/ml Immunoperlen (Kaninchen-Anti-Human-IgM; Biorad) und 20 ng/ml Human-rIL-4, resuspendiert. 2 ml Zellen pro Napf wurden auf einer 24-Napf-Platte (Falcon, Becton Dickinson) ausplattiert und bei 37ºC kultiviert. Nach 3 Tagen wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden dreimal gewaschen, gefolgt von der Zugabe von RPMI/10% HS. Die Zellen wurden nach dem Kultivieren weitere 2 Tage lang in RPMI/10% HS verwendet.
b. Expression leerer Klasse I-Moleküle auf der Oberfläche von APCs und Peptidbeladung von APCs:

1. Niedertemperatur-Inkubation

a. Expression leerer MHC in APCs: Die APCs wurden auf eine Konzentration von 2 · 10&sup6;/ml in Vollkulturmedium eingestellt, das 10 ng/ml rIL-4, 20 U/ml Human-IFN-γ und 3 pg/ml β&sub2;-Microglobulin (β&sub2;m; Scripps Lab) enthielt. Die Zellen wurden danach über Nacht bei 26ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; inkubiert. Es ist zu beachten, dass diese Zellen nur eine Fraktion von Klasse I-Molekülen im leeren Zustand (-10%) exprimieren.
b. Peptibeladung von APC-Stimulatorzellen: Leere Klasse I exprimierende APCs wurden ein- bis zweimal mit serumfreien RPMI (+ L-Glutamin und Hepes) gewaschen und mit 1 · 10&sup7; in serumfreien RPMI resuspendiert, umfassend insgesamt 50 ug/ml des Peptidpools (d. h. 16,7 ug/ml jedes Peptids in einem Pool von 3; 25 ug/ml jedes Peptids in einem Pool von 2; 50 ug/ml des individuellen Peptids), 30 ug/m) DNAse und 3 ug/ml β&sub2; m. Nach 4 h Inkubation bei 20ºC wurden die Zellen bei 6100 rad bestrahlt (5 · 10&sup6;/ml; 25 Millionen Zellen/Röhrchen), gewaschen und zwecks Zugabe zur Induktionskultur auf die geeignete Konzentration eingestellt (siehe unten).
2. Säurestrippen: Diente als alternatives Verfahren zur Erzeugung leerer MHC auf der Oberfläche der APCs. Die SAC-I-aktivierten PBMCs wurden einmal in kaltem, 1 BSA enthaltendem 0,9% Natriumchlorid (LT. Baker) gewaschen. Die Zellen wurden bei 10&sup7;/ml in kaltem Citratphosphat-Puffer resuspendiert (0,13 M Citronensäure (J. T. Baker), 0,06 M Natriumphosphat, einbasig (Sigma), pH 3), umfassend 1% BSA und 3 ug/ml β&sub2;m, und auf Eis inkubiert. Nach 2 min wurden 5 Volumina kalter 0,15 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, umfassend 1% BSA, 3 ug/ml β&sub2; m und 10 ug/ml Peptid (Neutralisierungspuffer Nr. 1), zugegeben und die Zellen bei 1500 U/min 5 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml kalter PBS, umfassend 1% BSA, 30 ug/ml DNAse, 3 ug/ml βsm und 50 ug/ml Peptid (Neutralisierungspuffer Nr. 2), resuspendiert und 4 h lang bei 20ºC inkubiert. Wie oben wurden die Zellen im anschluss an die vierstündige Inkubation bei 20ºC bei 6100 rad bestrahlt (5 · 10&sup6;/ml; 25 Millionen Zellen/Röhrchen), gewaschen und dann zwecks Zugabe zur Induktionskultur auf die entsprechende Konzentration eingestellt (siehe unten).
c. Herstellung der um CD4+ abgereicherten PBMC-Responder-Zellpopulation (Abreicherung von Lymphozyten-Subpopulationen mittels AlS-Kolben): AIS MicroCellector T- 150-Kolben (spezifisch für die Abreicherung von CD4+ T-Zellen, Menlo Park, CA, USA) wurden durch Zugabe von 25 ml PBS/l mM EDTA, 30 s dauerndes Wirbeln, sodass alle Oberflächen befeuchtet waren, und anschließendes einstündiges Inkubieren mit der Bindeoberfäche hinunter auf Raumtemperatur geprimt. Nach dieser Inkubation wurden die Koben 30 s lang kräftig geschüttelt, einmal mit PBS/EDTA gewaschen, weitere 2 Male mit PBS gewaschen und dann mit 25 ml Kulturmedium 15 in lang inkubiert. PBMCs wurden in serumfreiem RPMI (+ L-Glutamin + Hepes), das 30 ug/ml DNAse enthielt, aufgetaut, einmal gewaschen und 15 min lang in Kulturmedium inkubiert. Nach der Absaugung von Kulturmedium aus den Kolben wurden bis zu 180 Millionen PBMCs 25 ml 30 ug/ml DNAse enthaltendem Kulturmedium zugesetzt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Kolben vorsichtig 10 s lang geschüttelt, um die nicht-adhäsiven Zellen zu resuspendieren. Die CD8+ T-Zellen enthaltende nicht-adhäsive Zellsuspension wurde gesammelt, und die Kolben wurden zweimal mit PBS gewaschen. Die um CD4+ T-Zellen abgereicherten PBMCs wurden zentrifugiert und zwecks Zugabe zur Induktionskultur gezählt. Der CD4+ und CD8+ Phenotyp der CD4+ abgereicherten Zellpopulation wurde durch FACS-Analyse bestimmt (siehe unten). Im Allgemeinen führte diese Technik zu einer zweifachen Anreicherung für CD8+ T-Zellen, wobei durchschnittlich etwa 40-50% CD8+ T-Zellen und 15-20% CD4+ T-Zellen nach Abreicherung von CD4+ T-Zellen verbleiben. Die Abreicherung von CD4+ T-Zellen kann auch unter Einsatz von Antikörper und Komplementverfahren oder Antikörper-beschichteten Magnetperlen (Dynabeads) erfolgen. Die Abreicherung von CD4+ T-Zellen reicherte CTLp an und entfernte Zellen, die um Zellnährstoffe konkurrierten.
d. Induktion primärer CTLs: Während der vierstündigen Peptidbeladung der Stimulator- APCs wurden um CD4+ abgereicherte und als Responder-Population zu verwendende PBMCs unter Einsatz von AIS-Kolben zwecks Selektion von CD8+ T-Zellen durch Abreicherung von CD4+ T-Zellen (s.o.) hergestellt. Die Responderzellen wurden mit 3 · 10&sup6;/ml in einem 1 ml-Volumen (24-Napf-Platte) ausplattiert und bei 37ºC gelagert, bis die peptidbeladenen Stimulator-APCs gebildet waren. Die bestrahlten peptidbeladenen APCs wurden einmal in serumfreien RPMI (+ L-Glutamin und Hepes) gewaschen, in Vollmedium auf die geeignete Konzentration eingestellt und auf einer 24-Napf-Platte mit 1 ml/Platte ausplattiert. Für PBMCs und SAC-I-aktivierte PBMCs als APCs wurden 1 · 10&sup6; Stimulatorzellen (1 ml Volumen) in die Responderzellen enthaltenden Näpfen ausplattiert; für PHA-Blasten als APCs wurde 1 ml 3 · 10&sup5;/ml Stimulatorzellen in jedem Napfausplattiert. Eine Endkonkzentration von 10 ng/ml rIL-7 (2 ml Gesamtvolumen) wurde zugegeben. Am Tag 7 wurden weitere 10 ug/ml rIL-7 der Kultur zugesetzt und 10 U/ml rIL-2 alle 3 Tage danach zugegeben. Am Tag 12 wurden die Kulturen mit Peptidgepulsten adhäsiven Zellen restimuliert und 7 Tage später (siehe unten) auf zytolytische Aktivität getestet.

Arbeitsvorschrift zur Restimulation primärer CTLs unter Einsatz autologer adhäsiver APCs:

Autologe PBMCs wurden in serumfreies, 30 ug/ml DNAse enthaltendes RPMI (+ L-Glutamin und Hepes) getaut, zweimal gewaschen und auf 5 · 10&sup6;/ml in DNAse enthaltendes Kulturmedium eingestellt. PBMCs (25 Millionen Zellen/Röhrchen in 5 ml) wurden mit 6100 rad bestrahlt. Nach einem Waschgang wurden die PBMCs in Kulturmedium resuspendiert und auf 4 · 10&sup6;/ml eingestellt; 1 ml bestrahlte PBMCs wurde pro Napf einer 24-Napf-Platte zugegeben. Die PBMCs wurden 2 h lang bei 37ºC inkubiert, dreimal zur Entfernung nicht-adhäsiver Zellen gewaschen und in Medium kultiviert, umfassend 20 ug/ml Vollpeptid und 3 ug/ml β&sub2; m, zugegeben einem 0,5 ml Volumen, und 2 h lang bei 37ºC erneut inkubiert. Das Peptid wurde abgesaugt, und 1,5 · 10&sup6; in Kulturmedium resuspendierte Responderzellen wurden einem 1 ml-Volumen zugesetzt. Nach 2 Tagen wurde 1 ml 20 U/ml rIL-2 enthaltendes Kulturmedium zugegeben.

FACS-Analyse:

1 Million Zellen/Röhrchen wurden zentrifugiert, in 100 ul/Röhrchen PBS/0,1% BSA/ 0,0,2% Natriumazid (Sigma) plus 10 ul/Röhrchen direkt konjugiertem Antikörper (Becton Dickinson) resuspendiert und auf Eis 15-20 min lang inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS/0,1% BSA/0,02% Natriumazid gewaschen und in PBS resuspendiert, um eine Analyse auf FACScan (Becton Dickinson) vorzunehmen. Wenn es nicht möglich war, die Proben innerhalb von 1-2 Tagen zu analysieren, wurden die Zellen mit 1% Paraformaldehyd (Fisher) enthaltender PBS fixiert und innerhalb einer Woche analysiert.

Zytotoxizitätsassay:

a. Herstellung von Zielzellen: Etwa 16-20 Stunden vor dem CTL-Asssay wurden Zielzellen (nach Klasse I übereingestimmte EBV-transformierte Linien) einmal gewaschen und in 10 ml Volumen zu 3 · 10&sup5;/ml in RPMI/5% FCS in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 ug/ml Vollpeptid resuspendiert.
b. Markieren von Zielzellen: Zielzellen wurden in 200 ul/Röhrchen Natrium &sup5;¹Cr-Chromat (NEN) zentrifugiert und resuspendiert und dann 1 h lang auf einer Schüttelvorrichtung bei 37ºC inkubiert. Ziele wurden dreimal (10 ml/Waschung) mit RPMI/10% FCS gewaschen und in 10 ml resuspendiert (um die Wirksamkeit des Markierens zu ermitteln, wurden 50 ul/Ziel auf einem automatischen Gammazähler von Micromedic gezählt).
c. CTL-Assay: Zielzellen wurden auf 2 · 10&sup5;/ml eingestellt und 50 jA der Zellkultur jedem Napfeiner 96-Napf-U-Boden-Platte (Costar Corp.) zugegeben, sodass eine Endkonzentration von 1 · 10&sup4;/Napferreicht wurde. K562-Zellen wurden einmal gewaschen, mit 4 · 10&sup6;/ml resuspendiert und 50 ul/Napf bis zu einer Endkonzentration von 2 · 10&sup5;/ Napf zugegeben (Verhältnis zwischen kaltem K562 und Ziel 20 : 1). Responderzellen wurden einmal gewaschen und bei 9 · 10&sup6;/ml resuspendiert; Dreifach-Reihenverdünnungen erfolgten für Effektor-Ziel-Verhältnisse von 90 : 1, 30 : 1, 10 : 1 und 3 : 1. Responderzellen wurden in einem Volumen von 100 ul jeweils zwei Näpfen zugesetzt. Für die spontane Freisetzung wurden 50 ul/Napf markierte Zielzellen, 50 ul/Napf K562 und 100 ul/Napf Medium zugegeben. Für die maximale Freisetzung wurden 50 ul/Napf Ziel, 50 ul/Napf K562 und 100 ul/Napf 0,1% Triton-X100 (Sigma) zugegeben. Die Platten wurden 5 min lang bei 1200 U/min zentrifugiert. Nach fünfstündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Platten weitere 5 min lang bei 1200 U/min zentrifugiert und 100 ul/Napf Überstand gesammelt. Herkömmliche Gammazählungs-Techniken (automatischer Gammazähler von Micromedic; 0,5 min/Röhrchen) dienten dazu, die spezifische prozentuelle Lyse gemäß folgender Formel zu ermitteln: % spezifische Lyse = cpm experimentelle Freisetzung - cpm spontane Freisetzung/cpm maximale Freisetzung - cpm spontane Freisetzung · 100. Ein Zytotoxizitätsassay (CTL-Assay) galt als positiv, wenn die Lyse durch CTL von Zielen (sensibilisiert mit einem spezifischen Peptid bei den zwei höchsten Effektor-Ziel- (E:T-) Verhältnissen) 15% über der Lyse von Vergleichszielen lag (d. h. Zielzellen ohne Peptid). Ein CTL-Assay galt als "Borderline", wenn die Lyse durch CTL von Zielen (sensibilisiert mit einem spezilichen Peptid bei den höchsten zwei E: T-Verhältnissen) 6% über der Lyse von Vergleichszielen lag (d. h. Zielzellen ohne Peptid).
d. Ergebnisse: Von den Peptiden, die sich an die angegebenen Allele banden, induzierten 12 der 60 MAGE-Peptide, 13 der 53 HIV-Peptide, 3 der 25 HCV-Peptide und 7 der 28 HBV-Peptide, die bislang getestet wurden, primäre CTLs in vitro. Repräsentative Graphen der CTL-Reaktionen auf verschiedene immunogene Peptide sind für MAGE (Fig. 8), HIV (Fig. 9), HCV (Fig. 10) und HBV (Fig. 11) dargestellt. Die CTL-Induktionsdaten sind in Tabelle 3 zusammengefasst, die jene immunogenen Peptide auflistet, die sich an jeweilige MHCs binden und primäre CTLs in vitro induzieren. Zu sehen ist die Sequenz des Peptids, das korrespondierende Antigen und das HLA-Allel, an das es sich bindet. Die Ergebnisse von Fig. 6 veranschaulichen die Lyse von Peptid-sensibilisierten Zielen und endogenen Zielen nach Stimulation mit SACI-aktivierten PBMCs (beladen mit dem immunogenen Peptid MAGE-3 1044.07 mittels Niedertemperatur-Inkubation). Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3

Claims

1. Verfahren zum Aktivieren zytotoxischer T-Zellen in vitro, umfassend:

das Dissoziieren gebundener Peptide von Klasse I-MHC-Molekülen auf Antigen- präsentierenden Zellen unter Einsatz einer Behandlung mit schwacher Säure;

das Assoziieren gewünschter immunogener Peptide mit den Klasse I-MHC-Molekülen auf den Antigen-präsentierenden Zellen; und

das Inkubieren der Antigen-präsentierenden Zellen mit den zytotoxischen T-Zellen in Gegenwart eines Wachstumsfaktors, wodurch aktivierte zytotoxische T-Zellen erzeugt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Dissoziierens gebundener Peptide durchgeführt wird, indem die Antigen-präsentierenden Zellen in einer Glycin- oder Citrat-Phosphat-Pufferlösung bei pH 3 inkubiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Schritt des Assoziierens gewünschter immunogener Peptide mit den MHC-Molekülen durchgeführt wird, indem die Antigen-präsentierenden Zellen mit etwa 10 bis 50 ug/ml an immunogenem Peptid inkubiert werden.

4. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Schritt des Inkubierens der Antigen-präsentierenden Zellen mit den zytotoxischen T-Zellen über einen Zeitraum von etwa 7 bis etwa 10 Tage erfolgt.

5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Antigen-präsentierenden Zellen von einem Patienten isolierte, einkernige periphere Blutzellen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die einkernigen peripheren Blutzellen SAC-I- aktiviert sind.

7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Wachstumsfaktor IL-7 ist und der Wachstumsfaktor zu Beginn des Inkubationsschritts und 7 Tage nach dem Beginn des Inkubationsschritts zugegeben wird.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Wachstumsfaktor IL-2 ist und der Wachstumsfaktor 7 Tage nach dem Beginn des Inkubationsschritts zugegeben wird.

9. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass die aktivierten zytotoxischen T-Zellen, die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich sind, mit einem annehmbaren Träger in Kontakt gebracht werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die aktivierten zytotoxischen T-Zellen von den Antigen-präsentierenden Zellen getrennt werden, bevor die aktivierten zytotoxischen T-Zellen mit einem annehmbaren Träger in Kontakt gebracht werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, AIDS, Hepatitis, bakterieller Infektion, Pilzinfektion, Malaria oder Tuberkulose bestimmt ist.

12. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum spezifischen Abtöten von Zielzellen bei einem Menschen, umfassend:

nachdem von einem Patienten eine flüssige Probe erhalten worden ist, die zytotoxische Zellen enthält;

das In-Kontakt-Bringen der zytotoxischen T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen, worin die Antigen-präsentierenden Zellen durch folgende Schritte hergestellt sind:

(a) das Dissoziieren gebundener Peptide von Klasse I-MHC-Molekülen auf die Antigen-präsentierenden Zellen unter Einsatz einer Behandlung mit schwacher Säure;

(b) das Assoziieren gewünschter immunogener Peptide mit den Klasse I-MHC- Molekülen auf den Antigen-präsentierenden Zellen;

das In-Kontakt-Bringen der aktivierten zytotoxischen T-Zellen mit einem annehmbaren Träger, wodurch eine pharmazeutische Zusammensetzung gebildet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, weiters umfassend den Schritt des Dissoziierens gebundener Peptide von den Antigen-präsentierenden Zellen durch Inkubieren der Antigen-präsentierenden Zellen in einer Glycin- oder Citrat-Phosphat-Pufferlösung bei pH 3.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, weiters umfassend den Schritt des Assoziierens gewünschter immunogener Peptide mit den MHC-Molekülen auf den Antigen- präsentierenden Zellen durch Inkubieren der Antigen-präsentierenden Zellen mit etwa 10 bis 50 ug/ml an immunogenem Peptid.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin die Antigen-präsentierenden Zellen von einem Patienten isolierte, einkernige periphere Blutzellen sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, worin der Schritt des Inkubierens der Antigen-präsentierenden Zellen mit den zytotoxischen T-Zellen über einen Zeitraum von etwa 7 bis etwa 10 Tage erfolgt.