JPH07505527A - ヒト樹状細胞のインビトロ発生およびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト樹状細胞のインビトロ発生およびそれらの用途本発明は、概して、ヒト樹状 細胞のインビトロ発生法、更に詳しくは、発生した細胞の治療および診断上の用 途に関する。

樹状細胞は、いくつかの免疫応答、例えば、ＭＨＣに制限されたＴ細胞の感作、 器官移植片の拒絶およびＴ細胞依存性抗体の形成を開始する働きをする抗原提示 細胞の系である。樹状細胞は、多数の非リンパ系組織において見出されるが、輸 入リンパまたは血流によってリンパ系器官のＴ細胞依存性区域へ移動することが できる。それらは皮膚において見出さね、その場合それらをランゲルハンス細胞 と称し、そして粘膜中にも存在する。それらは、それらが抗原を獲得することが できる末梢組織中の免疫系の見張り役である。これらの細胞はＣＤ４を発現する し、しかもＨＩＶによってインビトロで感染しうるので、それらはインビボでの ＨＩＶウィルスへの入り口を与えると考えられる。例えば、ナイト（Ｋｎ　ｉ　 ｇｈ　ｔ）ら、レイ７（Ｒａｃｚ）ら監修のｒＨＩＶおよび他のレトロウィルス 感染における補助細胞（Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ＨＩＶａｎｄ 　０ｔｈｅｒ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）Ｊ　（カージャ ー　（Ｋａ　ｒｇｅ　ｒ）　、バーゼル、１９９１）の１４５頁、ラムサウアー （Ｒａｍｓａｕｅｒ）ら、レイツら監修（上記に引用）の１５５頁。末梢血から のヒト樹状細胞の単離は最近になって達成されたばかりであり、しがち少数の細 胞しか発生させることができない。例えば、フロイデンタール（Ｆｒｅｕｄｅｎ ｔｈａｌ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８７巻、７６９８ 頁（１９９０）。多数のヒト樹状細胞のインビトロ発生は、インビトロのヒトナ イーブＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の感作、ＨＩＶ感染を妨げることができる物質 のスクリーニング、ヒトＴおよびＢ細胞で再構成された５ＣＩＤ−ｈｕマウスに おけるヒトＢ細胞の一次および二次インビボ応答の発生、並びに一層感受性の混 合リンパ球反応検定の組み立てに重要な利益を与えるであろう。

同種異系組織および器官の移植に対する主な障害は、移植片受容者による移植片 拒絶である。ドナー組織に対する受容者すなわち宿主の細胞性免疫反応は、拒絶 過程においである重要な役割を果たす。細胞性免疫反応には二つの重要な段階、 すなわち、（ｉ）宿主細胞が、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＭＣ）の関係に おいてドナー細胞を異物として認める場合の認識：および（ｉ　ｉ）宿主細胞が 異種細胞を攻撃することによって応答する場合の破壊がある。攻撃過程の一部努 として、多数の応答細胞が増殖され、そして細胞障害性、すなわち、適当な抗原 を示すドナー細胞を死滅させる能力を獲得する。したがって、細胞性免疫は、二 つの測定可能な機能、すなわち、増殖および細胞障害活性によって記載すること ができる。ドウベイ（Ｄｕｂｅｙ）ら、ローズ（Ｒｏｓｅ）ら監修の「臨床実験 免疫学入門（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ第３版（アメリカン・ソサイアティ・オブ・マイクロバ イオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ）、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８６）の１３１章を参照されたい。

細胞培養技術の開発は、インビボ免疫感作を模倣するインビトロの方法の確立を もたらし、したがってインビトロでの細胞性免疫を評価するための尺度が与えら れた。移植に関して特に有用であるのは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）または混 合リンパ球培養である。ＭＬＲは比較的簡単な検定法であるが、それには多数の 変法がある。典型的に、検定は、適当な培養系中の応答リンパ球と、照射などに よって増殖および／または転写機構が損傷された刺激リンパ球とを混合すること から成る。細胞を数日間培養した後、多数の種々の測定を行なって、刺激細胞に 対する応答細胞の反応性の程度、例えば、トリチウム化チミジンの取込み、芽細 胞の数、分裂細胞の数、サイトカイン生産等を定量することができる。検定にお いて他に変化するものとしては、応答および刺激細胞源、例えば、末梢血、牌臓 、リンパ節等：応答細胞が刺激細胞に関して同系か、同種異系かまたは異種であ るかどうか；刺激細胞を損傷させる方法、例えば、照射若しくはＤＮＡ合成阻害 斉ｊ（例えば、マイトマイシンＣ）による処理または類似のものがある。

細胞性免疫反応性についての通常の検定としてのＭＬＲの欠点は感度である。

たとえ特定の読みを用いたとしても、しばしば、ＭＬＲにおいて強い効果を得る ことは難しい。刺激細胞集団中の抗原提示細胞は、応答細胞を刺激する原因とな っていると考えられるが；しかしながら、大部分の組織源のこのような細胞は数 が少なくおよび／または非能率的に刺激する種類から成る。ＭＬＲ検定の感度お よびそれゆえの有用性は、更に強力な刺激細胞集団の入手可能性によって大いに 向上させることができると考えられる。樹状細胞は、それらが強力な抗原提示細 胞として周知であることから、この機能に役立ちうると考えられる。例えば、ス タインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、９巻。

２７１〜２９６頁（１９９１）。残念ながら、現在のところ、それらを日常的Ｍ ＬＲに十分な量で得ることは極めて難しい。例えば、スタインマンら、ハーゼン バーク（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）ら監修の「細胞免疫学（ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ　２巻（ブラックウェル−サイエンティフィック・パブリ ケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ）、オックスフォード、１９８６）の４９章。

発明の概要 本発明は、ヒト樹状細胞のインビトロ発生法に関する。本発明は、更に、本発明 の方法によって生産されたヒト樹状細胞の単離された集団および、樹状細胞の純 粋な集団を刺激細胞として用いる改良されたＭＬＲ検定を含む該単離細胞の用途 を包含する。本発明の方法は、ＣＤ３４＋造血系前駆細胞を、腫瘍壊死因子α（ ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）の存在下または顆粒球− マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）の存在下で培養して本発明の ＣＤｌＬａ＋樹状細胞を生成する工程を含む。

本発明は、したがって、ヒト樹状細胞を含む細胞組成物の製造法であって、＋ ＣＤ３４　造血系細胞を、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−３でまたはＧＭ−ＣＳＦで処 理し；そして ＣＤ１．ａ抗原を発現する被処理ＣＤ３４　造血系細胞を単離する工程を含む上 記方法を提供する。

＋ 好ましくは、細胞ＣＤ３４　をＧＭ−Ｃ８Ｆの他にＴＮＦ−αで処理する。

本発明は、更に、インビトロ培養後にＣＤ１ａ抗原を発現するＣＤ３４＋造血系 細胞；および上記に定義の方法によって製造されたヒト樹状細胞を含む細胞組成 物を提供する。

樹状細胞は免疫学的応答を開始する。本発明による樹状細胞に関して本明細書中 に報告されたインビトロのデータは、これらの細胞が実験手段として有用であり 、更には、癌およびウィルス感染を含む養子免疫療法による種々の疾患のインビ ボ処置において用いることができるということを示している。

更に、本発明は、樹状細胞系を製造するためのまたは樹状細胞を誘導するための ＴＮＦ−αとＩＬ−３と一緒のまたはＧＭ−Ｃ８Ｆの使用、ＣＤ４　ヘルパーＴ 細胞を発生させるための樹状細胞の使用；養子免疫療法におけるＣＤ４　ヘルパ ーＴ細胞の使用；ヒト抗体産生用の５ＣＩＤ−ｈｕマウスの使用；並びに癌特異 的およびウィルス特異的ＣＤ８　細胞障害性Ｔ細胞を発生させるための謝状細胞 の使用、特に、エイズ（ＡＩＤＳ）ウィルスに対して特異的なＣＤ８　細胞障害 性Ｔ細胞を発生させるための樹状細胞の使用に関する。

本発明のもう一つの特徴は、 応答細胞試料を提供し； 刺激細胞が応答細胞に関して同種異系であるような、しかも刺激細胞が、（ａ） ＣＤ３４　造血系細胞をＴＮＦ−ａｔ６よびＩＬ−３でまたはＧＭ−Ｃ３Ｆで処 理し、そして（ｂ）ＣＤ１ａ抗原を発現する被処理ＣＤ３４　造血系細胞を単離 する工程を含む方法によって製造された樹状細胞から成るような不活イ」す激細 胞試料を提供し； 該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養し；そして該応答細胞の応答を測 定する工程を含む混合リンパ球反応を含む。

図面の簡単な説明 図１は、ＣＤ１ａ　細胞によるＣＤ１４の部分同時発現を示す流動細胞計測法デ ータを図示する。

図２は、種々の培地条件下でのＣＤ１ａ　細胞の成長速度論に関するデータを図 示する。

図３は、本発明の樹状細胞による刺激後のＣＤ４　細胞の増殖データを図示する 。

図４は、同種異系ＣＤ４　Ｔ細胞増殖の刺激におけるＣＤ１ａ　細胞の作用を示 すデータを図示する。

＋ 図５は、本発明の樹状細胞による刺激後のＣＤ４　およびＣＤ８”Ｔ細胞の増殖 データを図示する。

発明の詳細な説明 本発明の重要な態様は、ＣＤ３４　造血系細胞からの樹状細胞の発生である。

＋ ＣＤ３４　造血系前駆細胞は、骨髄などの種々の組織源から得ることができるが 、好ましくは、請帯血試料から以下のように得られる。すなわち、試料からの軽 密度単核細胞をフィコール・ハイパクー（Ｆｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾 配分離によって単離しくｄ＝１．．０７７ｇ／ｍＬ）、そして例えば、１％ｗ／ ｖ組織培養等級ウシ血清アルブミンを補足したＲＰＭＩ　１６４０培地中におい て３７℃で一晩中インキユベーションすることによって付着細胞から除去する。

好ましくは、ＣＤ３４抗原を有する細胞を、抗ＣＩ）３４単クロ一ン性抗体、例 えば、イムノチク（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）（マルセイユ、フランス）から入手 可能なＩｍｕ−１３３，３、ベクトン・ディキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｅｋｉ ｎｓｏｎ）（マウンテン・ビュー、カリフォルニア）から入手可能な抗ＭｙｌＯ または類似のものを用いる間接免疫パニングによる正の選択によって非付着単核 部分から単離する。パニングフラスコは以下のように調製される。すなわち、ト リス緩衝液（０，０５モル／Ｌ、ｐＨ９，４）中で２５μｇ／ｍＬの濃度のヒツ ジＦａｂ抗マウスＩｇＧを、７５０ｍ２組織培養フラスコ中に分配しく１０ｍＬ ）　、４℃で一晩中被覆させる。別個に、（上記で論及の付着細胞から除去され た）軽密度単核細胞を、２％熱失活プールヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）を補足した ＲＰＭＩ　１６４０中において細胞１０７個／ｍＬで抗ＣＤ３４抗体５μｇ／ｍ Ｌと一緒に４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を２％ＨＡＢＳ含有 冷培地中で洗浄し、そして細胞約５Ｘ１０７個を含む１０ｍＬを、上記のように ヒツジ抗マウスＩｇＧを予め被覆したフラスコに分配する。４℃で２時間インキ ュベーション後、懸濁液中の非付着細胞（すなわち、ＣＤ３４除去部分）を静か にピペッティングし且つ培地で数回洗浄することによって採取する。次に、付着 「パニング済み」細胞（すなわち、ＣＤ３４豊富部分）を激しくピペッティング することによって回収する。

＋ 樹状細胞はＣＤ３４　細胞から、ＧＭ−Ｃ３ＦまたはＴＮＦ−αおよびＩＬ−３ を含む培地中においてこれらを培養することによって得られる。好ましくは、樹 状細胞はＣＤ３４＋細胞から、ＴＮＦ−α並びにＧＭ−Ｃ８Ｆを含む培地中にお いてこれらを培養することによって得られる。本発明において用いるのに適当な ＴＮＦ−α、ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＩＬ−３は、例えば、ジエンザイム・コー承し −ション（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、）（ケンブリッジ、ＭＡ）から商業的に 入手可能であるし、または組換え体発現システムによって、例えば、クラーク（ Ｃ１ａ　ｒ　ｋ）ら、米国特許第４．９５９．４５５号明細書（ＩＬ−３）；ク ラークら、ＰＣＴ出願第ＥＰ８５１００３２６号明細書（公開東ＷＯ３６１００ ６３９号明細書）（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）；およびマーク（Ｍａｒｋ）ら、米国特許第 ４．６７７．０６３号明細書（ＴＮＦ−α）に示されたように製造することがで きる。好ましくは、ＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ８Ｆは飽和濃度で用いられ；すなわ ち、それらは、ＣＤ３４　細胞上のＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ８Ｆ受容体全部が生 物学的に活性なＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ８Ｆ分子で占有される濃度で用いられる 。

当然ながら、実際の濃度は、用いられるＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ８Ｆの性質に依 存しうる。好ましくは、特異的活性を有するヒトＩＬ−３を少なくとも５ｘ１０ ６Ｕ／ｍｇで用い、そこにおいて活性の単位は、液体培養中のヒト骨髄細胞によ って取込まれた３Ｈ−チミジンによって決定される半最大増殖活性に対応する。

以下に記載の培養系において、飽和濃度はＬｏｎｇ／ｍＬ（または５０Ｕ／ｍＬ ）であった。好ましくは、特異的活性を有するヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを少なくとも２ ｘ１０６Ｕ／ｍｇで用い、そこにおいて活性の単位は、ＩＬ−３に関して上記に 定義の通りである。以下に記載の培養システムにおいて、飽和濃度は１１００ｎ ／ｍＬ（または２００　Ｕ／ｍ　Ｌ）であった。好ましくは、ＴＮＦ−ａを２〜 ３ｎｇ／ｍＬまたは４０〜６０Ｕ／ｍＬの範囲の濃度で、最も好ましくは、約２ ．５ｎｇ／ｍＬまたは５０Ｕ／ｍＬの濃度で用いる。ＴＮＦ−αの単位は、カー スウ細胞は、標準的な添加剤を含む標準的な組織培地、例えば、１０％（ｖ／ｖ ）熱失活ウシ胎児血清、１０ｍＭヘペス、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５ｘ１ｏ− ５Ｍ２−メルカプトエタノール、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプ トマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を補足したＲＰＭＩ　１６４０中で同時培養す ることができる。好ましくは、ＣＤ３４＋細胞はサイトカイン存在下において８ 〜１２日間培養される。

培養中に生成する樹状細胞は、抗ＣＤ１ａおよび／または抗ＣＤ１４抗体を用い る以外は（抗体は両方共、例えば、ベクトン・ディキンソンから商業的に入手可 能）、上記のようにパニングによって単離される。

本発明のＭＬＲ法は、以下、すなわち、（１）応答細胞試料を提供し；　（２） 刺激細胞が該応答細胞に関して同種異系であるような、しかも刺激細胞が、＋ （ａ）ＣＤ３４　造血系細胞をＴＮＦ−ａおよびＩＬ−３でまたはＧＭ−ＣＳ　 Ｆで処理し、そして（ｂ）ＣＤ１ａ抗原を発現する被処理ＣＤ３４＋造血系細胞 を単離する工程を含む方法によって製造された樹状細胞から成るような不活化刺 激細胞試料を提供し；　（３）該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養し ：そして（４）該応答細胞の応答を測定する工程を含む。

好ましくは、応答細胞試料は、移植片の受容者であるべき患者の末梢血からの＋ ＣＤ４　Ｔ細胞から成る。Ｔ細胞集団の入手は、ディサバト（ＤｉＳａｂａｔ。

）ら監修、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻（１９８４）で十分に 記載されている当該技術分野において周知の技法を用いる。例えば、ＣＤ４　Ｔ 細胞は以下のように単離することができる。すなわち、最初に単核細胞を末梢血 から単離し且つ付着細胞から除去し；次に、例えば、イムノマグネチック除去（ 例えば、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）、オス 口、ノルウェイを用いる）または類似のものにより、商業的に入手可能な単クロ ーン性抗体、例えば、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ８、抗ＣＤ ４０（ベクトン・ディキンソンおよび／またはオルト・ダイアグノスティック・ システムズ（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＝ニーシ ャーシーから入手可能）の混合物を用いて他の細胞種を除去することによってＣ ＋ Ｄ４　Ｔ細胞を精製する。９５％より高純度のＣＤ４＋集団は、典型的に、２回 のイムノマグネチック除去後に達成される。

本発明の刺激細胞は、応答細胞を採取された人とは別の人から得られたＣＤ３４ ＋造血系前駆細胞由来の樹状細胞であり；すなわち、刺激細胞は、応答細胞に関 して同種異系である。これらの細胞は前記のように得られる。

本発明の刺激細胞を不活化して、それらがそれらの刺激機能を依然として遂行し つるが、応答細胞から測定される応答を不明瞭にすることがあった何等かの他の 機能から阻害されるようにする。したがって、不活化の性状は、検定の「読み」 にある程度依存する。好ましくは、読み、すなわち応答細胞で測定される応答は 細胞増殖である。他の読みとしては、更に、サイトカイン生産、細胞溶解能等の ような現象を挙げることができる。好ましくは、刺激細胞を処理して、それらは 複製不能であるが、それらの抗原処理機構は依然として機能するようにする。

これは、便宜上、細胞を応答細胞と混合する前に、例えば、約１５００〜５００ ０Ｒ（ガンマ線またはＸ線）、好ましくは３０００〜４０００Ｒの照射によって 達成される。

を９６ウ工ル丸底組織培養プレート中の同種異系ＣＤ４　Ｔ細胞２．４ｘ１０４ 十 個に対して加え且つ前記の培地中で４日間インキュベートする。インキュベーシ ョン後、細胞をトリチウム化チミジン１μＣｉで６時間パルスした後、それらを 採取し且つトリチウム化チミジン取込みを、例えば、シンチージョン計数によっ て測定する。

実験 以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。細胞系、試薬およびそれらの濃 度、温度並びに他の変数値は、本発明の応用を単に例示するものであり、本発明 を制限するものと考えられるべきではない。

造血系前駆細胞から発生した細胞を二色蛍光測定用に処理した。簡単にいうと、 細胞を、非結合単クローン性抗体、フィコエリトリン結合（ＰＥ結合）抗マウス 免疫グロブリン、正常マウス血清および、フルオレセインイソチオシアネート（ ＦＩＴＣ）で直接的に標識された単クローン性抗体０ＫＴ６　（オルトからの抗 ＣＤ１ａ）またはＬｅｕ−Ｍ３（ベクトン・デイキンソンからの抗ＣＤ１４）と −緒に逐次的にインキュベートした。図１で示したように、ＣＤ３４　細胞をＧ Ｍ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αの存在下で１２日間培養することは、ＣＤ１ａ抗原 をは一貫して観察された。単球系統内でのＣＤ１ａ抗原の発現は、ランゲルノ１ ンス細胞に限定される。図１ａは、ＩｇＧ　−ＦＩＴＣ７ソタイブ対照対１　ｇ 　Ｇ　２８−ＰＥイソタイプ対照からの二色蛍光強度を示す。図ＩＢは、０ＫＴ ６−ＦＩＴＣ（ＣＤｌａ発現に比例する）対しｅｕ−Ｍ３−ＰＥ　（ＣＤ１４発 現に比例する）からの二色蛍光強度を示す。図２で示したように、ＣＤ１ａ　細 胞は培養の開始時に検出されなかったし、ＣＤ１ａ抗原はＴＮＦ−α存在下の４ 日間の培養後に始めて観察することができ、そして発現は２０日目止で増加した 。５％未満のＣＤ１ａ　細胞がＩＬ−３存在下で観察されたが、５〜１５％のＣ Ｄ１ａ　細胞はＧＭ−Ｃ３Ｆにおいて検出された。大部分のＣＤ１ａ　細胞はＩ Ｌ−３およびＴＮＦ−αにおいて（１０〜２５％）、主としてＧＭ−Ｃ８Ｆおよ びＴＮＦ−αにおいて（２０〜６０％）検出された（１２日間の培養後の５回の 実験の範囲）。増殖効率に関して、ＬＬ−３およびＴＮＦ−αはＩＬ−３のみよ りも２〜３倍ＴＮＦ−αにおいては細胞２〜３ｘ１０６個の培養物が回収された 。ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＴＮＦ−αは、ＣＤ１ａ　細胞を発生させるのに最も強力 な因子組合せであると考えられたので、これらの細胞の特性決定用の培養はいず れも、ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＴＮＦ−αを含んだ。図２は、（ｉ）ＩＬ−３（中実 三角）、（ｉｉ）ＩＬ−３およびＴＮＦ−α（中空三角）、（ｉ　ｉ　ｉ）ＧＭ −Ｃ８Ｆ　（中実四角）および（ｉｖ）ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−ａ（中空四 角）の存在下のＣＤ３４　細胞１０５個の増加を示す。実線は３回の実験におけ る全細胞数を示し、＋ 破線はＣＤ１ａ抗原の発現を示した。図２Ａおよび２Ｂは、２組の別個の実験に よるデータを示す。

本発明の方法によって発生したＣＤ１ａ　細胞の形態学を、光学顕微鏡および電 子顕微鏡両方を用いて研究した。ＧＭ−Ｃ８Ｆのみにおいて観察された付着細胞 は、規則的な形状のマクロファージの古典的様相を示すが、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよび ＴＮＦ−αの存在下で得られたものは、高度に分岐した樹状突起、小葉に分かれ た核および樹状突起のある絨毛表面を有する樹状細胞の典型的な様相を有する。

若干のＣＤ１ａ＋細胞（５個中約１個）は二重膜結合のある小器官を有し、バー ベック顆粒の構造を思い起こさせる。

ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αの存在下での１２日間培養後に発生したＣＤ１ａ ＋細胞の表現型は二色蛍光分析によって決定された。実験に応じて、ＣＤ１４を 同時発現するＣＤ１ａ　細胞の百分率は１０〜７０％に変化した。下記の表１細 胞はＣＤ１ｃを発現しなかったし、ＣＤ４およびＣＤ４０を僅かしか発現しなか った。ＣＤ１ａ　およびＣＤ１４　細胞は両方ともＦＣ７ＲＩ　Ｉ　（ＣＤ３２ ）、ＦＣγＲＩ　Ｉ　Ｉ　（ＣＤ１６）およびＣＲ３（ＣＤ１１ｂ）を有するこ とが分かったが、ＣＤ１ａ　ＣＤ１４　細胞だけがＦＣ７ＲＩ　（ＣＤ６４）お よびＣＲ１（ＣＤ　３５）を発現した。ＣＤ１．ａ　およびＣＤ１ａ　ＣＤ１４ 　細胞は、ＬＦＡｌ　ａ　（ＣＤＩ　１　ａ）およびＬＦΔ１β（ＣＤ１８）の 両方を発現したが、ＣＤ１ａ＋細胞はＣＤ１ａ　ＣＤ１４　細胞よりも高濃度の ＩＣＡＭＩ　（ＣＤ５４）を示した。ＣＤ１ａ　細胞は極めて高濃度のＨＬＡ− ＤＲを発現した（ＣＤ１４“細胞よりも５〜１０倍大きい）。対照的に、ＣＤ１ ａ　ＣＤ１．４＋細胞は高濃度のＨＬＡ−ＤＱ　を発現した。

１抗体は以下の源から得られた。０ｒｔ＝オルト・ダイアグノスティック・シス テムズ；Ｉｍｕ＝イムノチク；Ｃｏｕ＝ｒ−ルター（Ｃｏｕ　ｌ　ｔ　ｅ　ｒ） 　（／＼イアリーア、ＦＬ）；　ＢＤ＝ベクトン・デイキンソン；Ｍｅｄ−メダ レクス・インコーホレーテッド（Ｍｅｄａｒｅｘ　Ｉｎｃ、）　（レバノン、Ｎ Ｈ）；ＨＹ２＝Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２巻、４２３頁（１９８３）；Ｈｙｓ＝Ｈ ｙｂｒｉｄｏｍａ、８巻、１９９頁（１９８９）；ＥＰ＝欧州特許出願第８９４ ０３４９１．７号明細書。

実施例２ ＋ ＣＤ３４　細胞を本発明にしたがって１２時間培養した後、それらに４０００ラ ドを照射して、実験用の刺激細胞を生成した３、刺激細胞１０〜２．４ｘ１０４ 個を、以下に記載したように、丸底マイクロテスト組織培養プレート中において ＋　＋ １０％ヒトＡＢ　血清を補足した培地中の休止ＣＤ４　Ｔ細胞または他の応答細 胞２．５ｘｌＯ４個に対して播種した。

本発明の樹状細胞の、休止同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞を（応答細胞として）増殖さ せる能力を検定した。図３Ａで示したように、ＩＬ−３のみの存在下（中実玉子 角）で培養された細胞は、最低の同種異系ＣＤ４　Ｔ細胞増殖を誘導した。対照 的に、ＧＭ−Ｃ８Ｆのみの存在下（中実四角）、ＩＬ−３およびＴＮＦ−αの存 在下（中空三角）並びにＧＭ−Ｃ８ＦおよびＴＮＦ−αの存在下（中空四角）で 培養された細胞は、同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞の激しい増殖を誘導した。ＣＤ３４ ＋ “前駆細胞の培養条件に応じて、ＣＤ３４　Ｔ細胞の最適増殖は、異なる値の比 率（刺激細胞）／（同種異系ＣＤ３４＋Ｔ細胞）に対して観察された。対照値（ ＋　＋ 刺激細胞不含ＣＤ３４　Ｔ細胞）との比較において、ＣＤ４　Ｔ細胞によるトリ チウム化チミジン取込みの５０倍の増加は、ＧＭ−Ｃ３Ｆのみ、ＩＬ−３および ＴＮＦ−α、並びにＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αのそれぞれの存在下で培養さ れた細胞に関して１：３．８（１：３〜１：２５の範囲）、１：１２．５　ｃｉ ：１０〜１：３５の範囲）および１　：　３６０　（１：　１００〜１　：　４ ００の範囲）の比率で観察された（５回の実験の範囲）。

＋ 図３Ｂで図示した実験において、ＣＤ３４　細胞を全部の実験に関してＧＭ−Ｃ ８ＦおよびＴＮＦ−αの存在下で培養し、そして応答細胞は成人末梢血（中空十 四角）、謄帯血（中空および中実三角）および同系謄帯血ＣＤ４　Ｔ細胞（中実 四角）であった。図３Ｂは、謄帯血由来かまたは成人末梢血由来の同種異系ＣＤ ４＋Ｔ細胞が同様に刺激されたこと、および同系ＣＤ４＋Ｔ細胞がはるかに低い 程度に刺激されたこと（同種異系細胞より２０倍低い応答）を示す。

ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αの存在下の１２日間の培養後に、ＣＤ１ａ＋細胞 がイムノマグネチック除去によって除かれた場合（図４）、誘導能力の激しい＋ 　＋ 減損が観察された。ＣＤ４　Ｔ細胞増殖の５０倍の増加は、ＣＤ１ａ　細胞が除 去された前後に、それぞれ１：２００（３回の実験の１＋２００〜１：４００の 範囲）および１：８（３回の実験の１：８〜１：４０の範囲）の比率（刺激細胞 子 ）／（同種異系ＣＤ４　Ｔ細胞）に対して観察された。照射後、以下、すなわち ＋ 、全集団（中実四角）、ＣＤ１ａ　細胞が除去によって除かれた集団（中空四角 ）および、抗ＩｇＧ１イソタイプ抗体を用いて除去が行なわれた対照集団（中空 三角）を刺激細胞として用いた。

ＣＤ３４＋細胞を癌患者の末梢血から単離し且つ前記のようにＧＭ−Ｃ３Ｆおよ びＴＮＦ−αの存在下で増殖させる。末梢血ＣＤ８細胞を冷凍保存する。樹状細 胞がいったん発生したら、ＣＤ８Ｔ細胞を解Ｗ＋フ且つ患者の癌細胞と混合する 。感作後、例えば、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、米国特許第４，６ ９０．９１５号明細書に記載されたように、ＣＤ８Ｔ細胞をＩＬ−２存在下で増 加させる。全細胞を、それらが腫瘍特異的細胞障害活性を示すという条件で患者 に再注入する。腫瘍細胞は、特異的腫瘍抗原で置換されることができる。例えば １フアン０デア０プルジエン（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｒｕｇｇｅｎ）ら、ＣＤ３４ ＋謄帯血前駆細胞から発生した樹状細胞は、１２日間培養され且つ照射（４００ ０ラド）された後、休止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する刺激細胞として 用いられた。刺激細胞１０〜２．５ｘｌＯ３個を、丸底マイ知テスト組織培養プ レート中において、１０％ヒトＡＢ＋血清を補足した、２００／ｍ１のＩＬ−２ 含有または不含培地中の休止Ｔ細胞２ｘｌＯ４個に対して播種した。５日間のイ ンキュベーション後、細胞を３Ｈ−チミジン１μＣｉで８時間パルスし、採取し そして計数した。試験は三重反復で行ない、そして結果を１分間当たりの平均数 として表わした。

ＣＤ４　およびＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した培地に対してＩＬ−２を加えること十 は、実際に、それらの３Ｈ−チミジン取込みによって示されるように、ＣＤ４＋ およびＣＤ８　Ｔ細胞の増殖を刺激した。図５で示したように、培地のみの存在 下（中空四角）で培養されたＣＤ８　細胞は極めて少ない増殖を示したが、ＴＬ ＋ 殖を示さなかったが、ＩＬ−２の存在下（中実丸）で培養されたＣＤ４　細胞は かなり多い増殖を示した。

５ＣＩＤ−ｈｕマウスは、二次応答で抗原を呼び戻すことを可能にしたが、−次 応答の確立はできなかった。例えば、モラー（Ｍｏ　ｌ　ｌ　ｅ　ｒ）　、Ｔｈ 、ｅ、５ＣＩＤ−ｈｕ　Ｍｏｕｓｅ、１２４巻仏ンクスガード（Ｍｕｎｋ、ｓｇ ｇａｒｄ）、コペンハーゲン、１９９１）；デュコサル（Ｄｕｃｈｏｓａｌ）ら 、１９５頁（１９８９）。これは樹状細胞プールが再構成されなかったことに依 ると考えられる。抗原でパルスされた樹状細胞はインビボで抗体応答を効率よく 誘導することができるので（例えば、ソーナス（Ｓｏｒｎａｓｓｅ）ら、エエＥ ｘｐ、Ｍｅｄ、、１．７５巻、１５頁（１９９２））、ヒト細胞のドナーのＣＤ ３４細胞からまたは適合性ＭＨＣを共有する別のドナーからインビトロで発生し た樹状細胞を用いて５ＣＩＤ−ｈｕマウスを再構成する。樹状細胞は、注入前に 適当な抗原でパルスされる。マウスがいったん抗原に対して抗体を示したら、Ｂ 細胞を血液および他の再構成された器官から単離し、そして例えば、バンチエル −（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２５１巻、７０頁（１９９１ ）で示されたようにエプスタイン・バールウィルス存在下のＣＤ４０系において 培養することによって不死化させる。

実施例５ インビトロで発生した樹状細胞を用いる養子免疫療法によるエイズの治療樹状細 胞をインビトロにおいてＨＩＶで感染させ、そしてＨＩＶは、ＨＩＶを用いる培 養において３〜５日後に、細胞表面から出芽するのが見出される。例えば、バダ ーリン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６８巻。

１１７７−１１８１頁（１９８７）；ｖカドニア（Ｍａｃａｔｏｎｊａ）ら、」 旦匹ジ旦Ｂユ旦又ヱ、７１巻、３８〜４５頁（１９８９）　；およびナイト（Ｋ ｎ　ｉ　ｇｈ　ｔ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｌｅｔｔ、、１９巻、１７７〜］−８ ２頁（１９８８）。ＨＩＶによる樹状細胞のインビボ感染の証拠は、皮膚のラン ゲルハンス細胞の感染および皮膚の細胞中のＭＨＣクラスＩＩ分子の量の減少を 説明巻、１２７９〜１２８２頁（１９８４）。更に、ＨＩＶ患者からの血中樹状 細胞の３〜２１％が、他の細胞種において見られるよりも２桁大きい感染濃度の ＨＩＶを含む。マカトニアら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｙ、７１巻、３８〜４５頁（ １９９０）。ウィルスによる樹状細胞の感染は、Ｔ細胞に対して抗原を与えるそ れらの能力を阻止し、したがって、成功した免疫応答に不可欠であるＴ細胞の補 充／増殖を阻害する。

＋ ＨＩＶ患者のＣＤ３４　細胞を用いて、本発明による樹状細胞を発生させる。

次に、樹状細胞を選択された抗原と一緒にインキュベートし、そしてＨＩＶ患者 に再注入する。

ＦＩＧＵＲＥ　ＩＢ ＣＤ１　ａ ＦＩＧＵＲＥ２Ａ 培養日数 ＦＩＧＵＲＥ　２Ｂ 培養日数 刺激細胞数／ウェル 刺激細胞数／ウェル 刺激細胞数／ウェル ＦＩＧＵＲＥ　５ 刺激細胞数／ウェル −Ｏ−ＣＤ４＋培地 一番一　ＣＤ４　＋　ＩＬ−２ 一ロー　ＣＤ８＋培地 一番一　ＣＤ８　＋　ＩＬ−２ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　６年　９月３０日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト樹状細胞を含む細胞組成物の製造法であって、ＣＤ３４＋造血系細胞を 、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−３でまたはＧＭ−ＣＳＦで処理し；そして ＣＤ１ａ抗原を発現する被処理ＣＤ３４＋造血系細胞を単離する工程を含む上記 方法。
2. ２．前記ＣＤ３４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦの他にＴＮＦ−αで処理する請求項１に 記載の方法。
3. ３．インビトロ培養後にＣＤ１ａ抗原を発現するＣＤ３４＋造血系細胞。
4. ４．細胞組成物であって、 ＣＤ３４＋造血系細胞を、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−３でまたはＧＭ−ＣＳＦで処 理し；そして ＣＤ１ａ抗原を発現する被処理ＣＤ３４＋造血系細胞を単離する工程を含む方法 によって製造されたヒト樹状細胞を含む上記細胞組成物。
5. ５．前記ＣＤ３４＋細胞がＧＭ−ＣＳＦの他にＴＮＦ−αで処理されている請求 項４に記載の細胞組成物。
6. ６．樹状細胞系を製造するためのＴＮＦ−αとＩＬ−３と一緒のまたはＧＭ−Ｃ ＳＦの使用。
7. ７．樹状細胞を誘導するためのＴＮＦ−αとＩＬ−３と一緒のまたはＧＭ−ＣＳ Ｆの使用。
8. ８．ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を発生させるための樹状細胞の使用。
9. ９．養子免疫療法におけるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の使用。
10. １０．癌特異的およびウイルス特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を発生させるた めの樹状細胞の使用。
11. １１．エイズウイルスに対して特異的なＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を発生させる ための樹状細胞の使用。
12. １２．混合リンパ球反応であって、 応答細胞試料を提供し； 刺激細胞が該応答細胞に関して同種異系であるような、しかも刺激細胞が、（ａ ）ＣＤ３４＋造血系細胞をＴＮＦ−αおよびＩＬ−３でまたはＧＭ−ＣＳＦで処 理し、そして（ｂ）ＣＤ１ａ抗原を発現する被処理ＣＤ３４＋造血系細胞を単離 する工程を含む方法によって製造された樹状細胞から成るような不活化刺激細胞 試料を提供し； 該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養し；そして該応答細胞の応答を測 定する工程を含む上記混合リンパ球反応。
13. １３．前記ＣＤ３４＋細胞をＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦで処理する請求項１ ２に記載の方法。
14. １４．前記応答細胞の前記応答が増殖である請求項１２に記載の方法。
15. １５．ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを飽和濃度で用いる請求項１２に記載の方法 。
16. １６．ＴＮＦ−αを２〜３ｎｇ／ｍＬまたは４０〜６０Ｕ／ｍＬの範囲の濃度で 用いる請求項１２に記載の方法。
17. １７．ＴＮＦ−αを約２．５ｎｇ／ｍＬまたは５０Ｕ／ｍＬの濃度で用いる請求 項１２に記載の方法。
18. １８．癌に罹患している患者の治療法であって、該患者に対して請求項３に記載 の細胞を投与することを含む上記方法。
19. １９．ウイルス感染に罹患している患者の治療法であって、該患者に対して請求 項３に記載の細胞を投与することを含む上記方法。
20. ２０．細胞が患者由来である請求項１８または請求項１９に記載の方法。