JP3492361B2 - ヒト樹状細胞のインビトロ発生およびそれらの用途 - Google Patents
ヒト樹状細胞のインビトロ発生およびそれらの用途Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、概して、ヒト樹状細胞のインビトロ発生
法、更に詳しくは、発生した細胞の治療および診断上の
用途に関する。
法、更に詳しくは、発生した細胞の治療および診断上の
用途に関する。
樹状細胞は、いくつかの免疫応答、例えば、MHCに制
限されたＴ細胞の感作、器官移植片の拒絶およびＴ細胞
依存性抗体の形成を開始する働きをする抗原提示細胞の
系である。樹状細胞は、多数の非リンパ系組織において
見出されるが、輸入リンパまたは血流によってリンパ系
器官のＴ細胞依存性区域へ移動することができる。それ
らは皮膚において見出され、その場合それらをランゲル
ハンス細胞と称し、そして粘膜中にも存在する。それら
は、それらが抗原を獲得することができる末梢組織中の
免疫系の見張り役である。これらの細胞はCD4を発現す
るし、しかもHIVによってインビトロで感染しうるの
で、それらはインビボでのHIVウイルスへの入り口を与
えると考えられる。例えば、ナイト（Knight）ら、レイ
ツ（Racz）ら監修の「HIVおよび他のレトロウイルス感
染における補助細胞（Accessory Cells in HIV and
Other Retroviral Infections）」（カージャー（K
arger）、バーゼル、1991）の145頁；ラムサウアー（Ra
msauer）ら、レイツら監修（上記に引用）の155頁。末
梢血からのヒト樹状細胞の単離は最近になって達成され
たばかりであり、しかも少数の細胞しか発生させること
ができない。例えば、フロイデンタール（Freudentha
l）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,87巻,7698頁（1990）。多
数のヒト樹状細胞のインビトロ発生は、インビトロのヒ
トナイーブCD4およびCD8T細胞の感作、HIV感染を妨げる
ことができる物質のスクリーニング、ヒトＴおよびＢ細
胞で再構成されたSCID−huマウスにおけるヒトＢ細胞の
一次および二次インビボ応答の発生、並びに一層感受性
の混合リンパ球反応検定の組み立てに重要な利益を与え
るであろう。
限されたＴ細胞の感作、器官移植片の拒絶およびＴ細胞
依存性抗体の形成を開始する働きをする抗原提示細胞の
系である。樹状細胞は、多数の非リンパ系組織において
見出されるが、輸入リンパまたは血流によってリンパ系
器官のＴ細胞依存性区域へ移動することができる。それ
らは皮膚において見出され、その場合それらをランゲル
ハンス細胞と称し、そして粘膜中にも存在する。それら
は、それらが抗原を獲得することができる末梢組織中の
免疫系の見張り役である。これらの細胞はCD4を発現す
るし、しかもHIVによってインビトロで感染しうるの
で、それらはインビボでのHIVウイルスへの入り口を与
えると考えられる。例えば、ナイト（Knight）ら、レイ
ツ（Racz）ら監修の「HIVおよび他のレトロウイルス感
染における補助細胞（Accessory Cells in HIV and
Other Retroviral Infections）」（カージャー（K
arger）、バーゼル、1991）の145頁；ラムサウアー（Ra
msauer）ら、レイツら監修（上記に引用）の155頁。末
梢血からのヒト樹状細胞の単離は最近になって達成され
たばかりであり、しかも少数の細胞しか発生させること
ができない。例えば、フロイデンタール（Freudentha
l）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,87巻,7698頁（1990）。多
数のヒト樹状細胞のインビトロ発生は、インビトロのヒ
トナイーブCD4およびCD8T細胞の感作、HIV感染を妨げる
ことができる物質のスクリーニング、ヒトＴおよびＢ細
胞で再構成されたSCID−huマウスにおけるヒトＢ細胞の
一次および二次インビボ応答の発生、並びに一層感受性
の混合リンパ球反応検定の組み立てに重要な利益を与え
るであろう。
同種異系組織および器官の移植に対する主な障害は、
移植片受容者による移植片拒絶である。ドナー組織に対
する受容者すなわち宿主の細胞性免疫反応は、拒絶過程
においてある重要な役割を果たす。細胞性免疫反応には
二つの重要な段階、すなわち、（ｉ）宿主細胞が、主要
細胞適合性遺伝子複合体（MHC）の関係においてドナー
細胞を異物として認める場合の認識；および（ii）宿主
細胞が異種細胞を攻撃することによって応答する場合の
破壊がある。攻撃過程の一部分として、多数の応答細胞
が増殖され、そして細胞障害性、すなわち、適当な抗原
を示すドナー細胞を死滅させる能力を獲得する。したが
って、細胞性免疫は、二つの測定可能な機能、すなわ
ち、増殖および細胞障害活性によって記載することがで
きる。ドゥベイ（Dubey）ら、ローズ（Rose）ら監修の
「臨床実験免疫学入門（Manual of Clinical Labora
tory Immunology）」第３版（アメリカン・ソサイアテ
ィ・オブ・マイクロバイオロジー（American Society
of Microbiology）、ワシントンD.C.、1986）の131
章を参照されたい。
移植片受容者による移植片拒絶である。ドナー組織に対
する受容者すなわち宿主の細胞性免疫反応は、拒絶過程
においてある重要な役割を果たす。細胞性免疫反応には
二つの重要な段階、すなわち、（ｉ）宿主細胞が、主要
細胞適合性遺伝子複合体（MHC）の関係においてドナー
細胞を異物として認める場合の認識；および（ii）宿主
細胞が異種細胞を攻撃することによって応答する場合の
破壊がある。攻撃過程の一部分として、多数の応答細胞
が増殖され、そして細胞障害性、すなわち、適当な抗原
を示すドナー細胞を死滅させる能力を獲得する。したが
って、細胞性免疫は、二つの測定可能な機能、すなわ
ち、増殖および細胞障害活性によって記載することがで
きる。ドゥベイ（Dubey）ら、ローズ（Rose）ら監修の
「臨床実験免疫学入門（Manual of Clinical Labora
tory Immunology）」第３版（アメリカン・ソサイアテ
ィ・オブ・マイクロバイオロジー（American Society
of Microbiology）、ワシントンD.C.、1986）の131
章を参照されたい。
細胞培養技術の開発は、インビボ免疫感作を模倣する
インビトロの方法の確立をもたらし、したがってインビ
トロでの細胞性免疫を評価するための尺度が与えられ
た。移植に関して特に有用であるのは、混合リンパ球反
応（MLR）または混合リンパ球培養である。MLRは比較的
簡単な検定法であるが、それには多数の変法がある。典
型的に、検定は、適当な培養系中の応答リンパ球と、照
射などによって増殖および／または転写機構が損傷され
た刺激リンパ球とを混合することから成る。細胞を数日
間培養した後、多数の種々の測定を行なって、刺激細胞
に対する応答細胞の反応性の程度、例えば、トリチウム
化チミジンの取込み、芽細胞の数、分裂細胞の数、サイ
トカイン生産等を定量することができる。検定において
他に変化するものとしては、応答および刺激細胞源、例
えば、末梢血、脾臓、リンパ節等；応答細胞が刺激細胞
に関して同系か、同種異系かまたは異種であるかどう
か；刺激細胞を損傷させる方法、例えば、照射若しくは
DNA合成阻害剤（例えば、マイトマイシンＣ）による処
理または類似のものがある。
インビトロの方法の確立をもたらし、したがってインビ
トロでの細胞性免疫を評価するための尺度が与えられ
た。移植に関して特に有用であるのは、混合リンパ球反
応（MLR）または混合リンパ球培養である。MLRは比較的
簡単な検定法であるが、それには多数の変法がある。典
型的に、検定は、適当な培養系中の応答リンパ球と、照
射などによって増殖および／または転写機構が損傷され
た刺激リンパ球とを混合することから成る。細胞を数日
間培養した後、多数の種々の測定を行なって、刺激細胞
に対する応答細胞の反応性の程度、例えば、トリチウム
化チミジンの取込み、芽細胞の数、分裂細胞の数、サイ
トカイン生産等を定量することができる。検定において
他に変化するものとしては、応答および刺激細胞源、例
えば、末梢血、脾臓、リンパ節等；応答細胞が刺激細胞
に関して同系か、同種異系かまたは異種であるかどう
か；刺激細胞を損傷させる方法、例えば、照射若しくは
DNA合成阻害剤（例えば、マイトマイシンＣ）による処
理または類似のものがある。
細胞性免疫反応性についての通常の検定としてのMLR
の欠点は感度である。たとえ特定の読みを用いたとして
も、しばしば、MLRにおいて強い効果を得ることは難し
い。刺激細胞集団中の抗原提示細胞は、応答細胞を刺激
する原因となっていると考えられるが；しかしながら、
大部分の組織源のこのような細胞は数が少なくおよび／
または非能率的に刺激する種類から成る。MLR検定の感
度およびそれゆえの有用性は、更に強力な刺激細胞集団
の入手可能性によって大いに向上させることができると
考えられる。樹状細胞は、それらが強力な抗原提示細胞
として周知であることから、この機能に役立ちうると考
えられる。例えば、スタインマン（Steinman）、Ann.Re
v.Immunol.,9巻,271〜296頁（1991）。残念ながら、現
在のところ、それらを日常的MLRに十分な量で得ること
は極めて難しい。例えば、スタイマンら、ハーゼンバー
グ（Herzenberg）ら監修の「細胞免疫学（Cellular Im
munology）」２巻（ブラックウェル・サイエンティフィ
ック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific P
ublications）、オックスフォード、1986）の49章。
の欠点は感度である。たとえ特定の読みを用いたとして
も、しばしば、MLRにおいて強い効果を得ることは難し
い。刺激細胞集団中の抗原提示細胞は、応答細胞を刺激
する原因となっていると考えられるが；しかしながら、
大部分の組織源のこのような細胞は数が少なくおよび／
または非能率的に刺激する種類から成る。MLR検定の感
度およびそれゆえの有用性は、更に強力な刺激細胞集団
の入手可能性によって大いに向上させることができると
考えられる。樹状細胞は、それらが強力な抗原提示細胞
として周知であることから、この機能に役立ちうると考
えられる。例えば、スタインマン（Steinman）、Ann.Re
v.Immunol.,9巻,271〜296頁（1991）。残念ながら、現
在のところ、それらを日常的MLRに十分な量で得ること
は極めて難しい。例えば、スタイマンら、ハーゼンバー
グ（Herzenberg）ら監修の「細胞免疫学（Cellular Im
munology）」２巻（ブラックウェル・サイエンティフィ
ック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific P
ublications）、オックスフォード、1986）の49章。
発明の概要
本発明は、ヒト樹状細胞のインビトロ発生法に関す
る。本発明は、更に、本発明の方法によって生産された
ヒト樹状細胞の単離された集団および、樹状細胞の純粋
な集団を刺激細胞として用いる改良されたMLR検定を含
む該単離細胞の用途を包含する。本発明の方法は、CD34
+造血系前駆細胞を、主要壊死因子α（TNF−α）および
インターロイキン−３（IL−３）の存在下または顆粒球
−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）の存在
下で培養して本発明のCD1a+樹状細胞を生成する工程を
含む。
る。本発明は、更に、本発明の方法によって生産された
ヒト樹状細胞の単離された集団および、樹状細胞の純粋
な集団を刺激細胞として用いる改良されたMLR検定を含
む該単離細胞の用途を包含する。本発明の方法は、CD34
+造血系前駆細胞を、主要壊死因子α（TNF−α）および
インターロイキン−３（IL−３）の存在下または顆粒球
−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）の存在
下で培養して本発明のCD1a+樹状細胞を生成する工程を
含む。
本発明は、したがって、ヒト樹状細胞を含む細胞組成
物の製造法であって、 CD34+造血系細胞を、TNF−αおよびIL−３でまたはGM
−CSFで処理し；そして CD1a抗原を発現する被処理CD34+造血系細胞を単離す
る工程を含む上記方法を提供する。
物の製造法であって、 CD34+造血系細胞を、TNF−αおよびIL−３でまたはGM
−CSFで処理し；そして CD1a抗原を発現する被処理CD34+造血系細胞を単離す
る工程を含む上記方法を提供する。
好ましくは、細胞CD34+をGM−CSFの他にTNF−αで処
理する。
理する。
本発明は、更に、インビトロ培養後にCD1a抗原を発現
するCD34+造血系細胞；および上記に定義の方法によっ
て製造されたヒト樹状細胞を含む細胞組成物を提供す
る。
するCD34+造血系細胞；および上記に定義の方法によっ
て製造されたヒト樹状細胞を含む細胞組成物を提供す
る。
樹状細胞は免疫学的応答を開始する。本発明による樹
状細胞に関して本明細書中に報告されたインビトロのデ
ータは、これらの細胞が実験手段として有用であり、更
には、癌およびウイルス感染を含む養子免疫療法による
種々の疾患インビボ処置において用いることができると
いうことを示している。
状細胞に関して本明細書中に報告されたインビトロのデ
ータは、これらの細胞が実験手段として有用であり、更
には、癌およびウイルス感染を含む養子免疫療法による
種々の疾患インビボ処置において用いることができると
いうことを示している。
更に、本発明は、樹状細胞系を製造するためのまたは
樹状細胞を誘導するためのTNF−αとIL−３と一緒のま
たはGM−CSFの使用;CD4+ヘルパーＴ細胞を発生させるた
めの樹状細胞の使用；養子免疫療法におけるCD4+ヘルパ
ーＴ細胞の使用；ヒト抗体産生用のSCID−huマウスの使
用；並びに癌特異的およびウイルス特異的CD8+細胞障害
性Ｔ細胞を発生させるための樹状細胞の使用、特に、エ
イズ（AIDS）ウイルスに対して特異的なCD8+細胞障害性
Ｔ細胞を発生させるための樹状細胞の使用に関する。
樹状細胞を誘導するためのTNF−αとIL−３と一緒のま
たはGM−CSFの使用;CD4+ヘルパーＴ細胞を発生させるた
めの樹状細胞の使用；養子免疫療法におけるCD4+ヘルパ
ーＴ細胞の使用；ヒト抗体産生用のSCID−huマウスの使
用；並びに癌特異的およびウイルス特異的CD8+細胞障害
性Ｔ細胞を発生させるための樹状細胞の使用、特に、エ
イズ（AIDS）ウイルスに対して特異的なCD8+細胞障害性
Ｔ細胞を発生させるための樹状細胞の使用に関する。
本発明のもう一つの特徴は、
応答細胞試料を提供し；
刺激細胞が応答細胞に関して同種異系であるような、
しかも刺激細胞が、（ａ）CD34+造血系細胞をTNF−αお
よびIL−３でまたはGM−CSFで処理し、そして（ｂ）CD1
a抗原を発現する被処理CD34+造血系細胞を単離する工程
を含む方法によって製造された樹状細胞から成るような
不活化刺激細胞試料を提供し； 該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養し；そ
して 該応答細胞の応答を測定する工程を含む混合リンパ球
反応を含む。
しかも刺激細胞が、（ａ）CD34+造血系細胞をTNF−αお
よびIL−３でまたはGM−CSFで処理し、そして（ｂ）CD1
a抗原を発現する被処理CD34+造血系細胞を単離する工程
を含む方法によって製造された樹状細胞から成るような
不活化刺激細胞試料を提供し； 該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養し；そ
して 該応答細胞の応答を測定する工程を含む混合リンパ球
反応を含む。
図面の簡単な説明
図１は、CD1a+細胞によるCD14の部分同時発現を示す
流動細胞計測法データを図示する。
流動細胞計測法データを図示する。
図２は、種々の培地条件下でのCD1a+細胞の成長速度
論に関するデータを図示する。
論に関するデータを図示する。
図３は、本発明の樹状細胞による刺激後のCD4+細胞の
増殖データを図示する。
増殖データを図示する。
図４は、同種異系CD4+T細胞増殖の刺激におけるCD1a+
細胞の作用を示すデータを図示する。
細胞の作用を示すデータを図示する。
図５は、本発明の樹状細胞による刺激後のCD4+および
CD8+T細胞の増殖データを図示する。
CD8+T細胞の増殖データを図示する。
発明の詳細な説明
本発明の重要な態様は、CD34+造血系細胞からの樹状
細胞の発生である。CD34+造血系前駆細胞は、骨髄など
の種々の組織源から得ることができるが、好ましくは、
臍帯血試料から以下のように得られる。すなわち、試料
からの軽密度単核細胞をフィコール・ハイパクー（Fico
ll−Hypaque）勾配分離によって単離し（ｄ＝1.077g/m
L）、そして例えば、１％w/v組織培養等級ウシ血清アル
ブミンを補足したRPMI 1640培地中において37℃で一晩
中インキュベーションすることによって付着細胞から除
去する。好ましくは、CD34抗原を有する細胞を、抗CD34
単クローン性抗体、例えば、イムノテク（Immunotech）
（マルセイユ、フランス）から入手可能なImu−133.3、
ベクトン・ディキンソン（Becton Dickinson）（マウ
ンテン・ビュー、カリフォルニア）から入手可能な抗My
10または類似のものを用いる間接免疫パニングによる正
の選択によって非付着単核部分から単離する。パニング
フラスコは以下のように調製される。すなわち、トリス
緩衝液（0.05モル/L、pH9.4）中で25μg/mLの濃度のヒ
ツジFab抗マウスIgGを、75cm2組織培養フラスコ中に分
配し（10mL）、４℃で１晩中被覆させる。別個に、（上
記で論及の付着細胞から除去された）軽密度単核細胞
を、２％熱失活プールヒトAB血清（HABS）を補足したRP
MI 1640中において細胞107個/mLで抗CD34抗体５μg/mL
と一緒に４℃で１時間インキュベートした。その後、細
胞を２％HABS含有冷培地中で洗浄し、そして細胞約5x10
7個を含む10mLを、上記のようにヒツジ抗マウスIgGを予
め被覆したフラスコに分配する。４℃で２時間インキュ
ベーション後、懸濁液中の非付着細胞（すなわち、CD34
除去部分）を静かにピペッティングし且つ培地で数回洗
浄することによって採取する。次に、付着「パニング済
み」細胞（すなわち、CD34豊富部分）を激しくピペッテ
ィングすることによって回収する。
細胞の発生である。CD34+造血系前駆細胞は、骨髄など
の種々の組織源から得ることができるが、好ましくは、
臍帯血試料から以下のように得られる。すなわち、試料
からの軽密度単核細胞をフィコール・ハイパクー（Fico
ll−Hypaque）勾配分離によって単離し（ｄ＝1.077g/m
L）、そして例えば、１％w/v組織培養等級ウシ血清アル
ブミンを補足したRPMI 1640培地中において37℃で一晩
中インキュベーションすることによって付着細胞から除
去する。好ましくは、CD34抗原を有する細胞を、抗CD34
単クローン性抗体、例えば、イムノテク（Immunotech）
（マルセイユ、フランス）から入手可能なImu−133.3、
ベクトン・ディキンソン（Becton Dickinson）（マウ
ンテン・ビュー、カリフォルニア）から入手可能な抗My
10または類似のものを用いる間接免疫パニングによる正
の選択によって非付着単核部分から単離する。パニング
フラスコは以下のように調製される。すなわち、トリス
緩衝液（0.05モル/L、pH9.4）中で25μg/mLの濃度のヒ
ツジFab抗マウスIgGを、75cm2組織培養フラスコ中に分
配し（10mL）、４℃で１晩中被覆させる。別個に、（上
記で論及の付着細胞から除去された）軽密度単核細胞
を、２％熱失活プールヒトAB血清（HABS）を補足したRP
MI 1640中において細胞107個/mLで抗CD34抗体５μg/mL
と一緒に４℃で１時間インキュベートした。その後、細
胞を２％HABS含有冷培地中で洗浄し、そして細胞約5x10
7個を含む10mLを、上記のようにヒツジ抗マウスIgGを予
め被覆したフラスコに分配する。４℃で２時間インキュ
ベーション後、懸濁液中の非付着細胞（すなわち、CD34
除去部分）を静かにピペッティングし且つ培地で数回洗
浄することによって採取する。次に、付着「パニング済
み」細胞（すなわち、CD34豊富部分）を激しくピペッテ
ィングすることによって回収する。
樹状細胞はCD34+細胞から、GM−CSFまたはTNF−αお
よびIL−３を含む培地中においてこれらを培養すること
によって得られる。好ましくは、樹状細胞はCD34+細胞
から、TNF−α並びにGM−CSFを含む培地中においてこれ
らを培養することによって得られる。本発明において用
いるのに適当なTNF−α、GM−CSFおよびIL−３は、例え
ば、ジェンザイム・コーポレーション（Genzyme Cor
p.）（ケンブリッジ、MA）から商業的に入手可能である
し、または組換え体発現システムによって、例えば、ク
ラーク（Clark）ら、米国特許第4,959,455号明細書（IL
−３）；クラークら、PCT出願第EP85/00326号明細書
（公開第WO86/00639号明細書）（GM−CSF）；およびマ
ーク（Mark）ら、米国特許第4,677,063号明細書（TNF−
α）に示されたように製造することができる。好ましく
は、IL−３およびGM−CSFは飽和濃度で用いられ；すな
わち、それらは、CD34+細胞上のIL−３およびGM−CSF受
容体全部が生物学的に活性なIL−３およびGM−CSF分子
で占有される濃度で用いられる。当然ながら、実際の濃
度は、用いられるIL−３およびGM−CSFの性質に依存し
うる。好ましくは、特異的活性を有するヒトIL−３を少
なくとも5x106U/mgで用い、そこにおいて活性の単位
は、液体培養中のヒト骨髄細胞によって取込まれた3H−
チミジンによって決定される半最大増殖活性に対応す
る。以下に記載の培養系において、飽和濃度は10ng/mL
（または50U/mL）であった。好ましくは、特異的活性を
有するヒトGM−CSFを少なくとも2x106U/mgで用い、そこ
において活性の単位は、IL−３に関して上記に定義の通
りである。以下に記載の培養システムにおいて、飽和濃
度は100ng/mL（または200U/mL）であった。好ましく
は、TNF−αを２〜3ng/mLまたは40〜60U/mLの範囲の濃
度で、最も好ましくは、約2.5ng/mLまたは50U/mLの濃度
で用いる。TNF−αの単位は、カースウェル（Carswel
l）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,72巻,3666頁（1975）およ
びアガワル（Aggarwal）ら、J.Biol.Chem.,260巻,2345
頁（1985）で定義されている。細胞は、標準的な添加剤
を含む標準的な組織培地、例えば、10％（v/v）熱失活
ウシ胎児血清、10mMヘペス、2mM Ｌ−グルタミン、5x1
0-5M ２−メルカプトエタノール、ペニシリン（100U/m
L）およびストレプトマイシン（100mg/mL）を補足したR
PMI 1640中で同時培養することができる。好ましく
は、CD34+細胞はサイトカイン存在下において８〜12日
間培養される。
よびIL−３を含む培地中においてこれらを培養すること
によって得られる。好ましくは、樹状細胞はCD34+細胞
から、TNF−α並びにGM−CSFを含む培地中においてこれ
らを培養することによって得られる。本発明において用
いるのに適当なTNF−α、GM−CSFおよびIL−３は、例え
ば、ジェンザイム・コーポレーション（Genzyme Cor
p.）（ケンブリッジ、MA）から商業的に入手可能である
し、または組換え体発現システムによって、例えば、ク
ラーク（Clark）ら、米国特許第4,959,455号明細書（IL
−３）；クラークら、PCT出願第EP85/00326号明細書
（公開第WO86/00639号明細書）（GM−CSF）；およびマ
ーク（Mark）ら、米国特許第4,677,063号明細書（TNF−
α）に示されたように製造することができる。好ましく
は、IL−３およびGM−CSFは飽和濃度で用いられ；すな
わち、それらは、CD34+細胞上のIL−３およびGM−CSF受
容体全部が生物学的に活性なIL−３およびGM−CSF分子
で占有される濃度で用いられる。当然ながら、実際の濃
度は、用いられるIL−３およびGM−CSFの性質に依存し
うる。好ましくは、特異的活性を有するヒトIL−３を少
なくとも5x106U/mgで用い、そこにおいて活性の単位
は、液体培養中のヒト骨髄細胞によって取込まれた3H−
チミジンによって決定される半最大増殖活性に対応す
る。以下に記載の培養系において、飽和濃度は10ng/mL
（または50U/mL）であった。好ましくは、特異的活性を
有するヒトGM−CSFを少なくとも2x106U/mgで用い、そこ
において活性の単位は、IL−３に関して上記に定義の通
りである。以下に記載の培養システムにおいて、飽和濃
度は100ng/mL（または200U/mL）であった。好ましく
は、TNF−αを２〜3ng/mLまたは40〜60U/mLの範囲の濃
度で、最も好ましくは、約2.5ng/mLまたは50U/mLの濃度
で用いる。TNF−αの単位は、カースウェル（Carswel
l）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,72巻,3666頁（1975）およ
びアガワル（Aggarwal）ら、J.Biol.Chem.,260巻,2345
頁（1985）で定義されている。細胞は、標準的な添加剤
を含む標準的な組織培地、例えば、10％（v/v）熱失活
ウシ胎児血清、10mMヘペス、2mM Ｌ−グルタミン、5x1
0-5M ２−メルカプトエタノール、ペニシリン（100U/m
L）およびストレプトマイシン（100mg/mL）を補足したR
PMI 1640中で同時培養することができる。好ましく
は、CD34+細胞はサイトカイン存在下において８〜12日
間培養される。
培養中に生成する樹状細胞は、抗CD1aおよび／または
抗CD14抗体を用いる以外は（抗体は両方共、例えば、ベ
クトン・ディキンソンから商業的に入手可能）、上記の
ようにパニングによって単離される。
抗CD14抗体を用いる以外は（抗体は両方共、例えば、ベ
クトン・ディキンソンから商業的に入手可能）、上記の
ようにパニングによって単離される。
本発明のMLR法は、以下、すなわち、（１）応答細胞
試料を提供し；（２）刺激細胞が該応答細胞に関して同
種異系であるような、しかも刺激細胞が、（ａ）CD34+
造血系細胞をTNF−αおよびIL−３でまたはGM−CSFで処
理し、そして（ｂ）CD1a抗原を発現する被処理CD34+造
血系細胞を単離する工程を含む方法によって製造された
樹状細胞から成るような不活化刺激細胞試料を提供し；
（３）該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養
し；そして（４）該応答細胞の応答を測定する工程を含
む。
試料を提供し；（２）刺激細胞が該応答細胞に関して同
種異系であるような、しかも刺激細胞が、（ａ）CD34+
造血系細胞をTNF−αおよびIL−３でまたはGM−CSFで処
理し、そして（ｂ）CD1a抗原を発現する被処理CD34+造
血系細胞を単離する工程を含む方法によって製造された
樹状細胞から成るような不活化刺激細胞試料を提供し；
（３）該応答細胞および該不活化刺激細胞を同時培養
し；そして（４）該応答細胞の応答を測定する工程を含
む。
好ましくは、応答細胞試料は、移植片の受容者である
べき患者の末梢血からのCD4+T細胞から成る。Ｔ細胞集
団の入手は、ディサバト（DiSabato）ら監修、Meth.in
Enzymol.,108巻（1984）で十分に記載されている当該
技術分野において周知の技法を用いる。例えば、CD4+T
細胞は以下のように単離することができる。すなわち、
最初に単核細胞を末梢血から単離し且つ付着細胞から除
去し；次に、例えば、イムノマグネチック除去（例え
ば、ダイナビーズ（Dynabeads）、ダイナル（Dynal）、
オスロ、ノルウェイを用いる）または類似のものによ
り、商業的に入手可能な単クローン性抗体、例えば、抗
CD14、抗CD16、抗CD20、抗CD8、抗CD40（ベクトン・デ
ィキンソンおよび／またはオルト・ダイアグノスティッ
ク・システムズ（Ortho Diagnostic Systems）、ニュ
ージャージーから入手可能）の混合物を用いて他の細胞
種を除去することによってCD4+T細胞を精製する。95％
より高純度のCD4+集団は、典型的に、２回のイムノマグ
ネチック除去後に達成される。
べき患者の末梢血からのCD4+T細胞から成る。Ｔ細胞集
団の入手は、ディサバト（DiSabato）ら監修、Meth.in
Enzymol.,108巻（1984）で十分に記載されている当該
技術分野において周知の技法を用いる。例えば、CD4+T
細胞は以下のように単離することができる。すなわち、
最初に単核細胞を末梢血から単離し且つ付着細胞から除
去し；次に、例えば、イムノマグネチック除去（例え
ば、ダイナビーズ（Dynabeads）、ダイナル（Dynal）、
オスロ、ノルウェイを用いる）または類似のものによ
り、商業的に入手可能な単クローン性抗体、例えば、抗
CD14、抗CD16、抗CD20、抗CD8、抗CD40（ベクトン・デ
ィキンソンおよび／またはオルト・ダイアグノスティッ
ク・システムズ（Ortho Diagnostic Systems）、ニュ
ージャージーから入手可能）の混合物を用いて他の細胞
種を除去することによってCD4+T細胞を精製する。95％
より高純度のCD4+集団は、典型的に、２回のイムノマグ
ネチック除去後に達成される。
本発明の刺激細胞は、応答細胞を採取された人とは別
の人から得られたCD34+造血系前駆細胞由来の樹状細胞
であり；すなわち、刺激細胞は、応答細胞に関して同種
異系である。これらの細胞は前記のように得られる。
の人から得られたCD34+造血系前駆細胞由来の樹状細胞
であり；すなわち、刺激細胞は、応答細胞に関して同種
異系である。これらの細胞は前記のように得られる。
本発明の刺激細胞を不活化して、それらがそれらの刺
激機能を依然として遂行しうるが、応答細胞から測定さ
れる応答を不明瞭にすることがあった何等かの他の機能
から阻害されるようにする。したがって、不活化の性状
は、検定の「読み」にある程度依存する。好ましくは、
読み、すなわち応答細胞で測定される応答は細胞増殖で
ある。他の読みとしては、更に、サイトカイン生産、細
胞溶解能等のような現象を挙げることができる。好まし
くは、刺激細胞を処理して、それらは複製不能である
が、それらの抗原処理機構は依然として機能するように
する。これは、便宜上、細胞を応答細胞と混合する前
に、例えば、約1500〜5000R（ガンマ線またはＸ線）、
好ましくは3000〜4000Rの照射によって達成される。
激機能を依然として遂行しうるが、応答細胞から測定さ
れる応答を不明瞭にすることがあった何等かの他の機能
から阻害されるようにする。したがって、不活化の性状
は、検定の「読み」にある程度依存する。好ましくは、
読み、すなわち応答細胞で測定される応答は細胞増殖で
ある。他の読みとしては、更に、サイトカイン生産、細
胞溶解能等のような現象を挙げることができる。好まし
くは、刺激細胞を処理して、それらは複製不能である
が、それらの抗原処理機構は依然として機能するように
する。これは、便宜上、細胞を応答細胞と混合する前
に、例えば、約1500〜5000R（ガンマ線またはＸ線）、
好ましくは3000〜4000Rの照射によって達成される。
好ましくは、応答細胞の増殖は、標準的なプロトコル
を用いてトリチウム化チミジンの取込みによって決定さ
れる。例えば、刺激細胞10〜2.5x104個を96ウェル丸底
組織培養プレート中の同種異系CD4+T細胞2.4x104個に対
して加え且つ前記の培地中で４日間インキュベートす
る。インキュベーション後、細胞をトリチウム化チミジ
ン１μCiで６時間パルスした後、それらを採取し且つト
リチウム化チミジン取込みを、例えば、シンチーション
計数によって測定する。
を用いてトリチウム化チミジンの取込みによって決定さ
れる。例えば、刺激細胞10〜2.5x104個を96ウェル丸底
組織培養プレート中の同種異系CD4+T細胞2.4x104個に対
して加え且つ前記の培地中で４日間インキュベートす
る。インキュベーション後、細胞をトリチウム化チミジ
ン１μCiで６時間パルスした後、それらを採取し且つト
リチウム化チミジン取込みを、例えば、シンチーション
計数によって測定する。
実験
以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。細胞
系、試薬およびそれらの濃度、温度並びに他の変数値
は、本発明の応用を単に例示するものであり、本発明を
制限するものと考えられるべきではない。
系、試薬およびそれらの濃度、温度並びに他の変数値
は、本発明の応用を単に例示するものであり、本発明を
制限するものと考えられるべきではない。
実施例１
ヒト樹状細胞の発生
GM−CSFおよびTNF−αにおける12日間の培養後、CD34
+臍帯血造血系前駆細胞から発生した細胞を二色蛍光測
定用に処理した。簡単にいうと、細胞を、非結合単クロ
ーン性抗体、フィコエリトリン結合（PE結合）抗マウス
免疫グロブリン、正常マウス血清および、フルオレセイ
ンイソチオシアネート（FITC）で直接的に標識された単
クローン性抗体OKT6（オルトからの抗CD1a）またはLeu
−M3（ベクトン・ディキンソンからの抗CD14）と一緒に
逐次的にインキュベートした。図１で示したように、CD
34+細胞をGM−CSFおよびTNF−αの存在下で12日間培養
することは、CD1a抗原を同時発現するCD14+単球細胞の
出現を可能にする。更に、全CD1a集団の30〜90％（５回
の実験からの範囲）であるCD14-CD1a+細胞の集団は一貫
して観察された。単球系統内でのCD1a抗原の発現は、ラ
ンゲルハンス細胞に限定される。図1aは、IgG1−FITCイ
ソタイプ対称対IgG2a−PEイソタイプ対照からの二色蛍
光強度を示す。図1Bは、OKT6−FITC（CD1a発現に比例す
る）対Leu−M3−PE（CD14発現に比例する）からの二色
蛍光強度を示す。図２で示したように、CD1a+細胞は培
養の開始時に検出されなかったし、CD1a抗原はTNF−α
存在下の４日間の培養後に始めて観察することができ、
そして発現は20日目まで増加した。５％未満のCD1a+細
胞がIL−３存在下で観察されたが、５〜15％のCD1a+細
胞はGM−CSFにおいて検出された。大部分のCD1a+細胞は
IL−３およびTNF−αにおいて（10〜25％）、主としてG
M−CSFおよびTNF−αにおいて（20〜60％）検出された
（12日間の培養後の５回の実験の範囲）。増殖効率に関
して、IL−３およびTNF−αはIL−３のみよりも２〜３
倍大きい効力があり、しかもGM−CSFおよびTNF−αはGM
−CSFのみよりも３〜４倍大きい効力がある（図２）。
したがって、CD34+細胞105個から開始すると、培養にお
いて12日後にGM−CSFはCD1a+細胞を１〜3x106個発生さ
せたが、IL−３およびTNF−αと、GM−CSFおよびTNF−
αにおいては細胞２〜3x106個の培養物が回収された。G
M−CSFおよびTNF−αは、CD1a+細胞を発生させるのに最
も強力な因子組合せであると考えられたので、これらの
細胞の特性決定用の培養はいずれも、GM−CSFおよびTNF
−αを含んだ。図２は、（ｉ）IL−３（中実三角）、
（ii）IL−３およびTNF−α（中空三角）、（iii）GM−
CSF（中実四角）および（iv）GM−CSFおよびTNF−α
（中空四角）の存在下のCD34+細胞105個の増加を示す。
実線は３回の実験における全細胞数を示し、破線はCD1a
抗原の発現を示した。図2Aおよび2Bは、２組の別個の実
験によるデータを示す。
+臍帯血造血系前駆細胞から発生した細胞を二色蛍光測
定用に処理した。簡単にいうと、細胞を、非結合単クロ
ーン性抗体、フィコエリトリン結合（PE結合）抗マウス
免疫グロブリン、正常マウス血清および、フルオレセイ
ンイソチオシアネート（FITC）で直接的に標識された単
クローン性抗体OKT6（オルトからの抗CD1a）またはLeu
−M3（ベクトン・ディキンソンからの抗CD14）と一緒に
逐次的にインキュベートした。図１で示したように、CD
34+細胞をGM−CSFおよびTNF−αの存在下で12日間培養
することは、CD1a抗原を同時発現するCD14+単球細胞の
出現を可能にする。更に、全CD1a集団の30〜90％（５回
の実験からの範囲）であるCD14-CD1a+細胞の集団は一貫
して観察された。単球系統内でのCD1a抗原の発現は、ラ
ンゲルハンス細胞に限定される。図1aは、IgG1−FITCイ
ソタイプ対称対IgG2a−PEイソタイプ対照からの二色蛍
光強度を示す。図1Bは、OKT6−FITC（CD1a発現に比例す
る）対Leu−M3−PE（CD14発現に比例する）からの二色
蛍光強度を示す。図２で示したように、CD1a+細胞は培
養の開始時に検出されなかったし、CD1a抗原はTNF−α
存在下の４日間の培養後に始めて観察することができ、
そして発現は20日目まで増加した。５％未満のCD1a+細
胞がIL−３存在下で観察されたが、５〜15％のCD1a+細
胞はGM−CSFにおいて検出された。大部分のCD1a+細胞は
IL−３およびTNF−αにおいて（10〜25％）、主としてG
M−CSFおよびTNF−αにおいて（20〜60％）検出された
（12日間の培養後の５回の実験の範囲）。増殖効率に関
して、IL−３およびTNF−αはIL−３のみよりも２〜３
倍大きい効力があり、しかもGM−CSFおよびTNF−αはGM
−CSFのみよりも３〜４倍大きい効力がある（図２）。
したがって、CD34+細胞105個から開始すると、培養にお
いて12日後にGM−CSFはCD1a+細胞を１〜3x106個発生さ
せたが、IL−３およびTNF−αと、GM−CSFおよびTNF−
αにおいては細胞２〜3x106個の培養物が回収された。G
M−CSFおよびTNF−αは、CD1a+細胞を発生させるのに最
も強力な因子組合せであると考えられたので、これらの
細胞の特性決定用の培養はいずれも、GM−CSFおよびTNF
−αを含んだ。図２は、（ｉ）IL−３（中実三角）、
（ii）IL−３およびTNF−α（中空三角）、（iii）GM−
CSF（中実四角）および（iv）GM−CSFおよびTNF−α
（中空四角）の存在下のCD34+細胞105個の増加を示す。
実線は３回の実験における全細胞数を示し、破線はCD1a
抗原の発現を示した。図2Aおよび2Bは、２組の別個の実
験によるデータを示す。
本発明の方法によって発生したCD1a+細胞の形態学
を、光学顕微鏡および電子顕微鏡両方を用いて研究し
た。GM−CSFのみにおいて観察された付着細胞は、規則
的な形状のマクロファージの古典的様相を示すが、GM−
CSFおよびTNF−αの存在下で得られたものは、高度に分
岐した樹状突起、小葉に分かれた核および樹状突起のあ
る絨毛表面を有する樹状細胞の典型的な様相を有する。
若干のCD1a+細胞（５個中約１個）は二重膜結合のある
小器官を有し、バーベック顆粒の構造を思い起こさせ
る。
を、光学顕微鏡および電子顕微鏡両方を用いて研究し
た。GM−CSFのみにおいて観察された付着細胞は、規則
的な形状のマクロファージの古典的様相を示すが、GM−
CSFおよびTNF−αの存在下で得られたものは、高度に分
岐した樹状突起、小葉に分かれた核および樹状突起のあ
る絨毛表面を有する樹状細胞の典型的な様相を有する。
若干のCD1a+細胞（５個中約１個）は二重膜結合のある
小器官を有し、バーベック顆粒の構造を思い起こさせ
る。
GM−CSFおよびTNF−αの存在下での12日間培養後に発
生したCD1a+細胞の表現型は二色蛍光分析によって決定
された。実験に応じて、CD14を同時発現するCD1a+細胞
の百分率は10〜70％に変化した。下記の表Ｉで示した結
果は、15％未満のCD1a+細胞がCD14を同時発現した実験
から得られており；このようにしてCD1a+細胞およびCD1
a-CD14+細胞の両方を特性決定した。CD1a+細胞はCD1c、
CD4およびCD40を同時発現したが、CD1bを発現しなかっ
た。対照的に、CD1a-CD14+細胞はCD1cを発現しなかった
し、CD4およびCD40を僅かしか発現しなかった。CD1a+お
よびCD14+細胞は両方ともFCγR II（CD32）、FCγR III
（CD16）およびCR3（CD11b）を有することが分かった
が、CD1a-CD14+細胞だけがFCγR I（CD64）およびCR1
（CD35）を発現した。CD1a+およびCD1a-CD14+細胞は、L
FA1α（CD11a）およびLFA1β（CD18）の両方を発現した
が、CD1a+細胞はCD1a+CD14+細胞よりも高濃度のICAM1
（CD54）を示した。CD1a+細胞は極めて高濃度のHLA−DR
を発現した（CD14+細胞よりも５〜10倍大きい）。対照
的に、CD1a-CD14+細胞は高濃度のHLA−DQ+を発現した。
生したCD1a+細胞の表現型は二色蛍光分析によって決定
された。実験に応じて、CD14を同時発現するCD1a+細胞
の百分率は10〜70％に変化した。下記の表Ｉで示した結
果は、15％未満のCD1a+細胞がCD14を同時発現した実験
から得られており；このようにしてCD1a+細胞およびCD1
a-CD14+細胞の両方を特性決定した。CD1a+細胞はCD1c、
CD4およびCD40を同時発現したが、CD1bを発現しなかっ
た。対照的に、CD1a-CD14+細胞はCD1cを発現しなかった
し、CD4およびCD40を僅かしか発現しなかった。CD1a+お
よびCD14+細胞は両方ともFCγR II（CD32）、FCγR III
（CD16）およびCR3（CD11b）を有することが分かった
が、CD1a-CD14+細胞だけがFCγR I（CD64）およびCR1
（CD35）を発現した。CD1a+およびCD1a-CD14+細胞は、L
FA1α（CD11a）およびLFA1β（CD18）の両方を発現した
が、CD1a+細胞はCD1a+CD14+細胞よりも高濃度のICAM1
（CD54）を示した。CD1a+細胞は極めて高濃度のHLA−DR
を発現した（CD14+細胞よりも５〜10倍大きい）。対照
的に、CD1a-CD14+細胞は高濃度のHLA−DQ+を発現した。
実施例２
樹状細胞による刺激後のCD4+T細胞の増殖
CD34+細胞を本発明にしたがって12時間培養した後、
それらに4000ラドを照射して、実験用の刺激細胞を生成
した。刺激細胞10〜2.4x104個を、以下に記載したよう
に、丸底マイクロテスト組織培養プレート中において10
％ヒトAB+血清を補足した培地中の休止CD4+T細胞または
他の応答細胞2.5x104個に対して播種した。
それらに4000ラドを照射して、実験用の刺激細胞を生成
した。刺激細胞10〜2.4x104個を、以下に記載したよう
に、丸底マイクロテスト組織培養プレート中において10
％ヒトAB+血清を補足した培地中の休止CD4+T細胞または
他の応答細胞2.5x104個に対して播種した。
本発明の樹状細胞の、休止同種異系CD4+T細胞を（応
答細胞として）増殖させる能力を検定した。図3Aで示し
たように、IL−３のみの存在下（中実三角）で培養され
た細胞は、最低の同種異系CD4+T細胞増殖を誘導した。
対照的に、GM−CSFのみの存在下（中実四角）、IL−３
およびTNF−αの存在下（中空三角）並びにGM−CSFおよ
びTNF−αの存在下（中空四角）で培養された細胞は、
同種異系CD4+T細胞の激しい増殖を誘導した。CD34+前駆
細胞の培養条件に応じて、CD34+T細胞の最適増殖は、異
なる値の比率（刺激細胞）／（同種異系CD34+T細胞）に
対して観察された。対照値（刺激細胞不含CD34+T細胞）
との比較において、CD4+T細胞によるトリチウム化チミ
ジン取込みの50倍の増加は、GM−CSFのみ、IL−３およ
びTNF−α、並びにGM−CSFおよびTNF−αのそれぞれの
存在下で培養された細胞に関して1:3.8（1:3〜1:25の範
囲）、1:12.5（1:10〜1:35の範囲）および1:360（1:100
〜1:400の範囲）の比率で観察された（５回の実験の範
囲）。
答細胞として）増殖させる能力を検定した。図3Aで示し
たように、IL−３のみの存在下（中実三角）で培養され
た細胞は、最低の同種異系CD4+T細胞増殖を誘導した。
対照的に、GM−CSFのみの存在下（中実四角）、IL−３
およびTNF−αの存在下（中空三角）並びにGM−CSFおよ
びTNF−αの存在下（中空四角）で培養された細胞は、
同種異系CD4+T細胞の激しい増殖を誘導した。CD34+前駆
細胞の培養条件に応じて、CD34+T細胞の最適増殖は、異
なる値の比率（刺激細胞）／（同種異系CD34+T細胞）に
対して観察された。対照値（刺激細胞不含CD34+T細胞）
との比較において、CD4+T細胞によるトリチウム化チミ
ジン取込みの50倍の増加は、GM−CSFのみ、IL−３およ
びTNF−α、並びにGM−CSFおよびTNF−αのそれぞれの
存在下で培養された細胞に関して1:3.8（1:3〜1:25の範
囲）、1:12.5（1:10〜1:35の範囲）および1:360（1:100
〜1:400の範囲）の比率で観察された（５回の実験の範
囲）。
図3Bで図示した実験において、CD34+細胞を全部の実
験に関してGM−CSFおよびTNF−αの存在下で培養し、そ
して応答細胞は成人末梢血（中空四角）、臍帯血（中空
および中実三角）および同系臍帯血CD4+T細胞（中実四
角）であった。図3Bは、臍帯血由来かまたは成人末梢血
由来の同種異系CD4+T細胞が同様に刺激されたこと、お
よび同系CD4+T細胞がはるかに低い程度に刺激されたこ
と（同種異系細胞より20倍低い応答）を示す。
験に関してGM−CSFおよびTNF−αの存在下で培養し、そ
して応答細胞は成人末梢血（中空四角）、臍帯血（中空
および中実三角）および同系臍帯血CD4+T細胞（中実四
角）であった。図3Bは、臍帯血由来かまたは成人末梢血
由来の同種異系CD4+T細胞が同様に刺激されたこと、お
よび同系CD4+T細胞がはるかに低い程度に刺激されたこ
と（同種異系細胞より20倍低い応答）を示す。
GM−CSFおよびTNF−αの存在下の12日間の培養後に、
CD1a+細胞がイムノマグネチック除去によって除かれた
場合（図４）、誘導能力の激しい減損が観察された。CD
4+T細胞増殖の50倍の増加は、CD1a+細胞が除去された前
後に、それぞれ1:200（３回の実験の1:200〜1:400の範
囲）および1:8（３回の実験の1:8〜1:40の範囲）の比率
（刺激細胞）／（同種異系CD4+T細胞）に対して観察さ
れた。照射後、以下、すなわち、全集団（中実四角）、
CD1a+細胞が除去によって除かれた集団（中空四角）お
よび、抗IgG1イソタイプ抗体を用いて除去が行なわれた
対照集団（中空三角）を刺激細胞として用いた。
CD1a+細胞がイムノマグネチック除去によって除かれた
場合（図４）、誘導能力の激しい減損が観察された。CD
4+T細胞増殖の50倍の増加は、CD1a+細胞が除去された前
後に、それぞれ1:200（３回の実験の1:200〜1:400の範
囲）および1:8（３回の実験の1:8〜1:40の範囲）の比率
（刺激細胞）／（同種異系CD4+T細胞）に対して観察さ
れた。照射後、以下、すなわち、全集団（中実四角）、
CD1a+細胞が除去によって除かれた集団（中空四角）お
よび、抗IgG1イソタイプ抗体を用いて除去が行なわれた
対照集団（中空三角）を刺激細胞として用いた。
実施例３
養子免疫療法用の癌特異的CD8細胞障害性Ｔ細胞の発生
CD34+細胞を癌患者の末梢血から単離し且つ前記のよ
うにGM−CSFおよびTNF−αの存在下で増殖させる。末梢
血CD8細胞を冷凍保存する。樹状細胞がいったん発生し
たら、CD8T細胞を解凍し且つ患者の癌細胞と混合する。
感作後、例えば、ローゼンバーグ（Rosenberg）、米国
特許第4,690,915号明細書に記載されたように、CD8T細
胞をIL−２存在下で増加させる。全細胞を、それらが腫
瘍特異的細胞障害活性を示すという条件で患者に再注入
する。腫瘍細胞は、特異的腫瘍抗原で置換されることが
できる。例えば、ファン・デア・ブルジェン（van der
Bruggen）ら、Science,254巻,1643頁（1991）。
うにGM−CSFおよびTNF−αの存在下で増殖させる。末梢
血CD8細胞を冷凍保存する。樹状細胞がいったん発生し
たら、CD8T細胞を解凍し且つ患者の癌細胞と混合する。
感作後、例えば、ローゼンバーグ（Rosenberg）、米国
特許第4,690,915号明細書に記載されたように、CD8T細
胞をIL−２存在下で増加させる。全細胞を、それらが腫
瘍特異的細胞障害活性を示すという条件で患者に再注入
する。腫瘍細胞は、特異的腫瘍抗原で置換されることが
できる。例えば、ファン・デア・ブルジェン（van der
Bruggen）ら、Science,254巻,1643頁（1991）。
GM−CSFおよびTNF−αの存在下で発生した樹状細胞は、
休止同種異系CD8+T細胞増殖の強力な刺激剤である CD34+臍帯血前駆細胞から発生した樹状細胞は、12日
間培養され且つ照射（4000ラド）された後、休止CD4+お
よびCD8+T細胞に対する刺激細胞として用いられた。刺
激細胞10〜2.5x103個を、丸底マイクロテスト組織培養
プレート中において、10％ヒトAB+血清を補足した、20U
/mlのIL−２含有または不含培地中の休止Ｔ細胞2x104個
に対して播種した。５日間のインキュベーション後、細
胞を3H−チミジン１μCiで８時間パルスし、採取しそし
て計数した。試験は三重反復で行ない、そして結果を１
分間当たりの平均数として表わした。
休止同種異系CD8+T細胞増殖の強力な刺激剤である CD34+臍帯血前駆細胞から発生した樹状細胞は、12日
間培養され且つ照射（4000ラド）された後、休止CD4+お
よびCD8+T細胞に対する刺激細胞として用いられた。刺
激細胞10〜2.5x103個を、丸底マイクロテスト組織培養
プレート中において、10％ヒトAB+血清を補足した、20U
/mlのIL−２含有または不含培地中の休止Ｔ細胞2x104個
に対して播種した。５日間のインキュベーション後、細
胞を3H−チミジン１μCiで８時間パルスし、採取しそし
て計数した。試験は三重反復で行ない、そして結果を１
分間当たりの平均数として表わした。
CD4+およびCD8+T細胞を培養した培地に対してIL−２
を加えることは、実際に、それらの3H−チミジン取込み
によって示されるように、CD4+およびCD8+T細胞の増殖
を刺激した。図５で示したように、培地のみの存在下
（中空四角）で培養されたCD8+細胞は極めて少ない増殖
を示したが、IL−２の存在下（中実四角）で培養された
CD8+細胞は、はるかに多い増殖を示し；更に、培地のみ
の存在下（中空丸）で培養されたCD4+細胞はほとんど増
殖を示さなかったが、IL−２の存在下（中実丸）で培養
されたCD4+細胞はかなり多い増殖を示した。
を加えることは、実際に、それらの3H−チミジン取込み
によって示されるように、CD4+およびCD8+T細胞の増殖
を刺激した。図５で示したように、培地のみの存在下
（中空四角）で培養されたCD8+細胞は極めて少ない増殖
を示したが、IL−２の存在下（中実四角）で培養された
CD8+細胞は、はるかに多い増殖を示し；更に、培地のみ
の存在下（中空丸）で培養されたCD4+細胞はほとんど増
殖を示さなかったが、IL−２の存在下（中実丸）で培養
されたCD4+細胞はかなり多い増殖を示した。
実施例４
SCID−huマウスにおける一次および二次抗体応答の発生
SCID−huマウスは、二次応答で抗原を呼び戻すことを
可能にしたが、一次応答の確立はできなかった。例え
ば、モラー（Moller）、The SCID−hu Mouse,124巻
（ムンクスガード（Munksggard）、コペンハーゲン、19
91）；デュコサル（Duchosal）ら、Nature,355巻,258頁
（1992）；およびモシア（Mosier）ら、Curr.Top.Micro
biol.Immunol.,152巻,195頁（1989）。これは樹状細胞
プールが再構成されなかったことに依ると考えられる。
抗原でパルスされた樹状細胞はインビボで抗体応答を効
率よく誘導することができるので（例えば、ソーナス
（Sornasse）ら、J.Exp.Med.,175巻,15頁（1992））、
ヒト細胞のドナーのCD34細胞からまたは適合性MHCを共
有する別のドナーからインビトロで発生した樹状細胞を
用いてSCID−huマウスを再構成する。樹状細胞は、注入
前に適当な抗原でパルスされる。マウスがいったん抗原
に対して抗体を示したら、Ｂ細胞を血液および他の再構
成された器官から単離し、そして例えば、バンチェルー
（Banchereau）ら、Science,251巻,70頁（1991）で示さ
れたようにエプスタイン・バールウイルス存在下のCD40
系において培養することによって不死化させる。
可能にしたが、一次応答の確立はできなかった。例え
ば、モラー（Moller）、The SCID−hu Mouse,124巻
（ムンクスガード（Munksggard）、コペンハーゲン、19
91）；デュコサル（Duchosal）ら、Nature,355巻,258頁
（1992）；およびモシア（Mosier）ら、Curr.Top.Micro
biol.Immunol.,152巻,195頁（1989）。これは樹状細胞
プールが再構成されなかったことに依ると考えられる。
抗原でパルスされた樹状細胞はインビボで抗体応答を効
率よく誘導することができるので（例えば、ソーナス
（Sornasse）ら、J.Exp.Med.,175巻,15頁（1992））、
ヒト細胞のドナーのCD34細胞からまたは適合性MHCを共
有する別のドナーからインビトロで発生した樹状細胞を
用いてSCID−huマウスを再構成する。樹状細胞は、注入
前に適当な抗原でパルスされる。マウスがいったん抗原
に対して抗体を示したら、Ｂ細胞を血液および他の再構
成された器官から単離し、そして例えば、バンチェルー
（Banchereau）ら、Science,251巻,70頁（1991）で示さ
れたようにエプスタイン・バールウイルス存在下のCD40
系において培養することによって不死化させる。
実施例５
インビトロで発生した樹状細胞を用いる養子免疫療法に
よるエイズの治療 樹状細胞をインビトロにおいてHIVで感染させ、そし
てHIVは、HIVを用いる培養において３〜５日後に、細胞
表面から出芽するのが見出される。例えば、パターソン
（Patterson）、J.Gen.Virol.,68巻,1177〜1181頁（198
7）；マカトニア（Macatonia）ら、Immunology,71巻,38
〜45頁（1989）；およびナイト（Knight）ら、Immunol.
Lett.,19巻,177〜182頁（1988）。HIVによる樹状細胞の
インビボ感染の証拠は、皮膚のランゲルハンス細胞の感
染および皮膚の細胞中のMHCクラスII分子の量の減少を
説明することから得られる。例えば、チャクラー（Tsch
achler）ら、J.Invest.Dermatol.,88巻,233〜237頁（19
87）；およびベルサイト（Belsite）ら、N.Engl.J.Me
d.,310巻,1279〜1282頁（1984）。更に、HIV患者からの
血中樹状細胞の３〜21％が、他の細胞種において見られ
るよりも２桁大きい感染濃度のHIVを含む。マカトニア
ら、Immunology,71巻,38〜45頁（1990）。ウイルスによ
る樹状細胞の感染は、Ｔ細胞に対して抗原を与えるそれ
らの能力を阻止し、したがって、成功した免疫応答に不
可欠であるＴ細胞の補充／増殖を阻害する。
よるエイズの治療 樹状細胞をインビトロにおいてHIVで感染させ、そし
てHIVは、HIVを用いる培養において３〜５日後に、細胞
表面から出芽するのが見出される。例えば、パターソン
（Patterson）、J.Gen.Virol.,68巻,1177〜1181頁（198
7）；マカトニア（Macatonia）ら、Immunology,71巻,38
〜45頁（1989）；およびナイト（Knight）ら、Immunol.
Lett.,19巻,177〜182頁（1988）。HIVによる樹状細胞の
インビボ感染の証拠は、皮膚のランゲルハンス細胞の感
染および皮膚の細胞中のMHCクラスII分子の量の減少を
説明することから得られる。例えば、チャクラー（Tsch
achler）ら、J.Invest.Dermatol.,88巻,233〜237頁（19
87）；およびベルサイト（Belsite）ら、N.Engl.J.Me
d.,310巻,1279〜1282頁（1984）。更に、HIV患者からの
血中樹状細胞の３〜21％が、他の細胞種において見られ
るよりも２桁大きい感染濃度のHIVを含む。マカトニア
ら、Immunology,71巻,38〜45頁（1990）。ウイルスによ
る樹状細胞の感染は、Ｔ細胞に対して抗原を与えるそれ
らの能力を阻止し、したがって、成功した免疫応答に不
可欠であるＴ細胞の補充／増殖を阻害する。
HIV患者のCD34+細胞を用いて、本発明による樹状細胞
を発生させる。次に、樹状細胞を選択された抗原と一緒
にインキュベートし、そしてHIV患者に再注入する。
を発生させる。次に、樹状細胞を選択された抗原と一緒
にインキュベートし、そしてHIV患者に再注入する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏ
ｌ．20，ｐｐ．1265−1272（1990)
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎ
ｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．97，Ｎｏ．３，ｐ
ｐ．524−528（1991)
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．175,
Ｎｏ．２，ｐｐ．609−612（1992)
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．74,
ｐｐ．399−406（1991)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 5/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】ヒト樹状細胞を含む細胞組成物の製造法で
あって、 CD34+造血系細胞をTNF−αとIL−３とでまたはGM−CSF
で処理する工程；および CD1a抗原を発現する該処理されたCD34+造血系細胞を単
離する工程を含む方法。 - 【請求項２】前記CD34+細胞をGM−CSFの他にTNF−αで
処理する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の方法であって、該
単離された樹状細胞が抗原でパルスされる方法。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法
であって、該CD34+細胞がHIV患者から得られるものであ
る方法。
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| DE4412794A1 (de) * | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
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-
1992
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