PT633930E

PT633930E - Geracao in vitro de celulas dendriticas humanas e utilizacoes destas

Info

Publication number: PT633930E
Application number: PT93908477T
Authority: PT
Inventors: Jasques Banchereau; Christophe Caux
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 2000-09-29
Also published as: DE69328481D1; JPH07505527A; KR100223395B1; ES2145047T3; MX9301753A; NZ251585A; AU3155897A; DK0633930T3; EP0633930B1; CA2133316C; AU682466B2; GR3033761T3; JP3492361B2; WO1993020186A1; KR950700989A; ATE192189T1; EP0563485A1; AU3928993A; DE69328481T2; CA2133316A1

Description

é 33 330

DESCRIÇÃO

" GERAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS E UTILIZAÇÕES DESTAS ” O invento refere-se geralmente a um método in vitro para gerar células dendríticas humanas e, mais especificamente, a utilizações terapêuticas e de diagnóstico das células geradas.

As células dendríticas são um sistema de células de apresentação do antigénio que funcionam na iniciação de várias respostas imunitárias tais como a sensibilização de células T restringidas pelo MHC, a rejeição de transplantes de órgãos e a formação de anticorpos dependentes de células T. As células dendríticas encontram-se em muitos tecidos não linfáticos mas podem migrar através da linfa aferente ou da corrente sanguínea para as áreas dependentes de células T dos órgãos linfáticos. Estas encontram-se na pele, onde se chamam células de Langerhans e estão também presentes na mucosa. Representam as sentinelas do sistema imunitário nos tecidos periféricos onde podem adquirir antigénios. Como estas células expressam CD4 e podem ser infectadas in vitro com HIV, é provável que apresentem in vivo uma porta de entrada para o vírus HIV: p. ex. Knight et al., pág. 145 em Racz, et al., editores, "Accessory Cells in HIV and Other Retroviral Infections" (Karger, Basel, 1991); Ramsauer et al., pág. 155 em Racz, et al., editores (acima citado). O isolamento de células dendríticas humanas a partir de sangue periférico foi apenas recentemente alcançado e apenas podem ser gerados pequenos números, p. ex. Freudenthal et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 87, pág. 7698 (1990). A geração in vitro de grandes números de células dendríticas humanas apresentar-se-ia como uma -2- vantagem importante para iniciar in vitro células T ingénuas CD4 e CD8 humanas, para pesquisar agentes que possam interferir com a infecção por HIV, para gerar uma resposta primária e secundária in vivo das células B humanas em ratinhos SCID-hu reconstituídos com células B e T humanas e para construir um ensaio reaccional de linfócitos mistos mais sensível.

Um impedimento principal à transplantação de tecido e órgãos alogeneicos é a rejeição de enxertos pelo recipiente do transplante. A reacção imunitária mediada por células do recipiente, ou hospedeiro, ao tecido dador desempenha um papel importante no processo de rejeição. A resposta imunitária mediada por células tem duas fases importantes: (i) reconhecimento, quando as células hospedeiras reconhecem a célula dadora como estranha no contexto do complexo principal de histocompatibilidade (CPH) (MHC); e (ii) destruição, quando as células hospedeiras respondem atacando as células estranhas. Como parte do processo atacante, várias células de resposta sofrem proliferação e adquirem citotoxicidade - ou seja, a capacidade para matar células dadoras que apresentem os antigénios apropriados. Assim, a imunidade mediada por células pode ser descrita em termos de duas funções mensuráveis: proliferação e actividade citotóxica - ver Dubey et al., capítulo 131 em Rose et al, Editores, "Manual of Clinicai Laboratory Immunology", 3a edição (American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1986). O desenvolvimento das técnicas de cultura de células levou ao estabelecimento de métodos in vitro que imitam o processo de imunização in vivo, proporcionando assim medidas para a avaliação da imunidade mediada por células in vitro. De particular utilidade no que diz respeito à transplantação é a resposta linfocitária mista (RLM) (MLR) ou cultura linfocitária mista. A MLR é um ensaio relativamente simples, no entanto existe em muitas variantes. Tipicamente, o ensaio consiste na mistura de linfócitos de resposta num sistema -3- de cultura adequado com linfócitos estimuladores cuja maquinaria de proliferação e/ou transcrição foi inutilizada, p. ex. por irradiação. Após as células terem sido cultivadas durante vários dias, podem ser efectuadas várias medições diferentes para quantificar o grau de reactividade das células de resposta em relação às células estimuladoras, p. ex. absorção de timidina tritiada, número de células destruídas, número de células em divisão, produção de citocinas e semelhantes. Outras variáveis no ensaio incluem a origem das células de resposta e estimuladoras, p. ex. sangue periférico, baço, nódulos linfáticos, etc.; se as células de resposta são singeneicas, alogeneicas ou xenogeneicas em relação às células estimuladoras; o método de inutilização das células estimuladoras, por exemplo irradiação ou tratamento com um inibidor da síntese de ADN (p. ex. mitomicina C) ou semelhantes.

Uma desvantagem da MLR como ensaio de rotina para a reactividade imunitária mediada por células é a sensibilidade. Frequentemente, é difícil obter um efeito forte na MLR, qualquer que seja o tipo de leitura empregue. Crê-se que as células de apresentação do antigénio na população estimuladora sejam responsáveis pela estimulação das células de resposta; no entanto, na maioria das fontes de tecido tais células são poucas em número e/ou são de um tipo que não estimula eficientemente. A sensibilidade, daí a utilidade, do ensaio MLR poderia ser grandemente aumentada pela disponibilidade de populações de células estimuladoras mais potentes. As células dendríticas podiam servir esta função, uma vez que estas são bem conhecidas como potentes células de apresentação de antigénios, p. ex. Steinman, Ann. Rev. Immunol., Vol. 9, págs. 271-296 (1991). Infelizmente, é actualmente muito difícil obtê-las em quantidades suficientes para MLRs de rotina, p. ex. Steinman, et al., capítulo 49 em Herzenberg et al, Editores, "Cellular Immunology" Vol. 2 (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986). -4-

Em relação a isto, a EP 0455482 divulga uma população substancialmente pura de células humanas compreendendo células pluripotentes que expressam o antigénio CD34, mas às quais falta a expressão do antigénio CD38 e doutros antigénios associados a linhagens. No entanto, a produção de células dendríticas humanas não é divulgada.

De forma semelhante, um artigo com o título "Tumor Necrosis Factor-alpha Strongly Potentiates Interleukin-3 and Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor-Induced Proliferation of Human CD34+ Hematopoietic Progenitor Cells", por Caux, C. et al.\ Blood, Vol. 75, N° 12, (Junho 15), 1990, págs. 2292-2298, divulga a potenciação por TNF-α da proliferação de células CD34+ humanas através de IL-3 e GM-CSF. No entanto, a produção e recuperação de células dendríticas humanas CD la não é descrita ou sugerida.

Resumo do Invento O invento é dirigido a um método para geração in vitro de células dendríticas humanas. O invento inclui também populações isoladas de células dendríticas humanas produzidas pelo método do invento e aplicações das células isoladas, incluindo um ensaio MLR melhorado que emprega uma população pura de células dendríticas como células estimuladoras.

De acordo com o invento é proporcionado um processo para produção de células dendríticas humanas compreendendo os passos de: (a) cultura de células hematopoéticas CD34+ humanas (i) com GM-CSF, (ii) com TNF-α e IL-3, ou (iii) com GM-CSF e TNF-a, induzindo assim a formação de células dendríticas humanas a partir das referidas células hematopoéticas CD34+; e -5- (b) recuperação das referidas células dendríticas humanas a partir da referida cultura.

As células dendríticas iniciam respostas imunológicas. Os dados in vitro aqui relatados para as células dendríticas produzidas de acordo com o invento indicam que estas células são úteis como instrumentos de laboratório e podem também ter utilidade no tratamento in vivo de várias doenças através de imunoterapia adoptiva, incluindo cancro e infecções virais.

Breve Descrição das Figuras O invento será agora descrito em maior detalhe com particular referência aos desenhos acompanhantes dos quais: A Figura 1 ilustra dados de citometria de fluxo mostrando a co-expressão parcial de CD 14 por células CDla+. A Figura 2 ilustra dados referentes à cinética de crescimento de células CDla+ sob várias condições de meio. A Figura 3 ilustra dados de proliferação de células CD4+ após estimulação por células dendríticas. A Figura 4 ilustra dados que mostram o efeito de células CDla+ na estimulação da proliferação alogeneica de células CD4+. A Figura 5 ilustra dados de proliferação de células T CD4+ e CD8+ após estimulação por células dendríticas. -6-

DESCRICÂO DETALHADA DO INVENTO

Um aspecto importante do invento é a geração de células dendríticas a partir de células hematopoéticas CD34+. As células progenitoras hematopoéticas CD34+ podem ser obtidas a partir de várias fontes de tecido, p. ex. medula óssea, mas são obtidas de preferência a partir de amostras de sangue do cordão umbilical tal como se segue: As células mononucleares de baixa densidade das amostras são isoladas através de separação por gradiente de Ficoll-Hypaque (d = 1,077 g/ml) e são retiradas as células adjacentes, p. ex. por incubação de um dia para o outro a 37°C em meio RPMI1640 suplementado com 1% p/v de albumina de soro bovino para cultura de tecidos. De preferência, as células que possuem o antigénio CD34 são isoladas a partir de ffacções mononucleares não aderentes através de selecção positiva por separação imunitária indirecta com peneira utilizando anticorpo monoclonal anti-CD34, p. t ex. Imu-133.3 disponível a partir de Immunotech (Marselha, França), anti-My 10 disponível a partir de Becton Dickinson (Mountain View, Califórnia) ou semelhantes. Os frascos de peneira são preparados tal como se segue: IgG Fab de ovelha anti-ratinho a uma concentração de 25 μg/ml em tampão Tris (0,05 mol/1, pH 9,4) é distribuído (10 ml) por frascos de cultura de tecidos de 75 cm para revestimento de um dia para o outro a 4°C. Separadamente, as células mononucleares de baixa densidade (sem células aderentes tal como acima discutido) são incubadas durante uma hora a 4°C com 5 pg/ml de anticorpo anti-CD34 a 107 células/ml em RPMI 1640 suplementado com 2% de soro AB humano reunido inactivado pelo calor (SABH) (HABS). Depois, as células são lavadas em meio frio contendo 2% de HABS e são distribuídos 10 ml contendo cerca de 5x107 células pelos frascos previamente revestidos com IgG de ovelha anti-ratinho, tal como acima descrito. Após uma incubação de duas horas a 4°C, as células não aderentes em suspensão (i.e. a fracção sem CD34) são colhidas por pipetagem suave e lavagem várias vezes com meio. As células "peneiradas" -7- aderentes (i.e. a fracção rica em CD34) são então recuperadas por pipetegem vigorosa.

As células dendríticas são obtidas a partir das células CD34+ cultivando estas em meio contendo GM-CSF ou TNF-α e IL-3. De preferência, as células dendríticas são obtidas a partir das células CD34+ cultivando estas em meio contendo TNF-α bem como GM-CSF. Os TNF-a, GM-CSF e IL-3 adequados para utilização no invento estão comercialmente disponíveis, p. ex. a partir de Genzyme Corp. (Cambridge, MA) ou podem ser produzidos através sistemas de expressão recombinantes: p. ex. tal como ensinado por Clark et al. na patente U.S. 4959455 (IL-3);Clark et al. no pedido PCT N° EP85/00326 (publ. n° W086/00639) (GM-CSF); e Mark et al. na patente U.S. 4677063 (TNF-α). De preferência, IL-3 e GM-CSF são utilizados a uma concentração saturante; ou seja, são utilizados a uma concentração à qual todos os receptores de IL-3 e GM-CSF nas células CD34+ estão ocupados por moléculas de IL-3 e GM-CSF biologicamente activas. Como é claro, a concentração real podè depender da qualidade do IL-3 e GM-CSF utilizados. De preferência, é empregue IL-3 humana possuindo uma actividade específica de pelo menos 5x106 U/mg, em que uma unidade de actividade corresponde à actividade proliferativa semi-máxima tal como determinada pela absorção de 3H-timidina pelas células da medula óssea humana em culturas líquidas. Nos sistemas de cultura abaixo descritos, a concentração saturante foi de 10 ng/ml (ou 50 U/ml). De preferência, é empregue GM-CSF humano possuindo uma actividade específica de pelo menos 2x106 U/mg, em que uma unidade de actividade é tal como acima definida para IL-3. Nos sistemas de cultura abaixo descritos, a concentração saturante foi de 100 ng/ml (ou 200 U/ml). De preferência, o TNF-α é utilizado a uma concentração no intervalo de 2 a 3 ng/ml ou 40-60 U/ml, sendo preferível a uma concentração de cerca de 2,5 ng/ml ou 50 U/ml. As unidades de TNF-α são definidas por Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 72, pág. 3666 (1975) e por Aggarwal et al., J. -8-

Biol. Chem., Vol. 260, pág. 2345 (1985). As células podem ser co-cultivadas em meio padrão de cultura de tecidos com aditivos padrão, tais como RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino inactivado pelo calor, Hepes 10 mM, L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 5x10'5 M, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 mg/ml). De preferência, as células CD34+ são cultivadas na presença das citocinas durante de 8 a 12 dias.

As células dendríticas que se formam na cultura são isoladas por separação com peneira tal como acima descrito, com a excepção de que são empregues anticorpos anti-CDla e/ou anti-CD14 (estando ambos os anticorpos comercialmente disponíveis, p. ex. a partir de Becton-Dickinson). O método MLR compreende os seguintes passos: (1) proporcionar uma amostra de células de resposta; (2) proporcionar uma amostra de células estimuladoras inactivadas tal que as células estimuladoras sejam alogeneicas em relação às células de resposta e tal que as células estimuladoras consistam em células dendríticas produzidas pelo processo que compreende os passos de (a) tratar células hematopoéticas CD34+ com TNF-α e IL-3 ou com GM-CSF, e (b) isolar as células hematopoéticas CD34+ tratadas que expressem o antigénio CD la; (3) co-cultura das células de resposta e das células estimuladoras inactivadas; e (4) medir uma resposta das células de resposta.

De preferência, a amostra de células de resposta consiste em células T CD4+ a partir do sangue periférico de um doente o qual será o recipiente de um transplante. A obtenção de populações de células T emprega técnicas bem conhecidas na arte as quais são totalmente descritas por DiSabato et ai, eds., em Meth. in Enzymol., Vol. 108 (1984). Por exemplo, as células T CD4+ podem ser isoladas tal como se segue: primeiro são isoladas células mononucleares do sangue periférico e são-lhes retiradas as células aderentes; as células CD4+ são então purificadas retirando outros tipos celulares, por exemplo por depleção imunomagnética (p. ex. com Dynabeads, Dynal, Oslo, Noruega) ou semelhantes, utilizando uma mistura de anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis, p. ex. anti-CD14, anti-CD16, anti-CD20, anti-CD8, anti-CD40 (disponível a partir de Becton-Dickinson e/ou Ortho Diagnostic Systems, New Jersey). Populações de CD4+ com uma pureza superior a 95% são tipicamente alcançadas após dois ciclos de depleção imunomagnética.

As células estimuladoras utilizadas no procedimento aqui descrito são células dendríticas derivadas de células progenitoras hematopoéticas CD34+ obtidas de uma pessoa diferente da qual foram retiradas as células de resposta; ou seja, as células estimuladoras são alogeneicas em relação às células de resposta. Estas células são obtidas tal como acima descrito.

As células estimuladoras são inactivadas de forma a que ainda possam desempenhar a sua função estimuladora mas é inibida qualquer outra função que possa obscurecer a resposta medida a partir das células de resposta. Assim, a natureza da inactivação depende de algum modo da "leitura" do ensaio. De preferência, a leitura, ou resposta medida nas células de resposta, é a proliferação celular. Outras leituras podiam também incluir tais fenómenos como produção de citocinas, capacidade citolítica e semelhantes. De preferência, as células estimuladoras são tratadas de forma a serem incapazes de replicação, mas a sua maquinaria de processamento de antigénios permanece funcional. Isto é convenientemente alcançado irradiando as células, p. ex. com cerca de 1500 a 5000 R (radiação gama ou X), de preferência 3000 a 4000 R, antes de as misturar com as células de resposta.

De preferência, a proliferação das células de resposta é determinada pela absorção de timidina tritiada utilizando protocolos padrão. Por exemplo, são -10- adicionadas de 10 a 2,5x104 células estimuladoras a 2,4x104 células T CD34+ alogeneicas em placas de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços e são incubadas durante 4 dias no meio acima descrito. Após a incubação, as células são sujeitas a pulsos com 1 pCi de timidina tritiada durante 6 horas e são depois colhidas e medidas quanto à absorção de timidina tritiada, p. ex. por contagem de cintilação.

PARTE EXPERIMENTAL

Os seguintes exemplos servem para ilustrar o presente invento. As linhas celulares, reagentes e suas concentrações, temperaturas e os valores de outras variáveis são apenas para exemplificar a aplicação do presente invento e não devem ser considerados como limitações deste.

Exemplo 1

Geração de Células Dendríticas Humanas

Após 12 dias de cultura em GM-CSF e TNF-α, as células geradas a partir de células percursoras hematopoéticas CD34+ de sangue do cordão foram processadas para medição por fluorescência a duas cores. Resumidamente, as células foram sequencialmente incubadas com anticorpos monoclonais não conjugados, imunoglobulina anti-ratinho conjugada com ficoeritrina (conjugada com PE (FE)), soro de ratinho normal e anticorpos monoclonais OKT6 (anti-CDla de Ortho) ou Leu-M3 (anti-CD14 de Becton-Dickinson), sendo os anticorpos monoclonais directamente marcados com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) (FITC). Tal como mostrado na Figura 1, a cultura de células CD34+ durante 12 dias na presença de GM-CSF e TNF-α permite o aparecimento de células monocíticas CD14+ que co-expressam o antigénio CD la. Adicionalmente, uma população de células CD14'CDla+ foi consistentemente observada a qual representava 30-90% da população CD la total (variação obtida a partir de 5 experiências). Na linhagem monocítica, a expressão do antigénio CD la está restrita às células de Langerhans. A Figura IA mostra a intensidade de fluorescência de duas cores do controlo do isotipo IgGrFITC versus controlo do isotipo IgG2a-PE. A Figura 1B mostra a intensidade de fluorescência de duas cores de OKT6-FITC (proporcional à expressão de CDla) versus Leu-M3-PE (proporcional à expressão de CD 14). Tal como mostrado na Figura 2, não foram detectadas células CDla+ no estabelecimento da cultura e o antigénio CDla pôde ser observado pela primeira vez após 4 dias de cultura na presença de TNF-α e a expressão aumentou até ao dia 20. Enquanto que foram observados menos de 5% de células CDla+ na presença de IL-3, foram detectados 5-15% de células CDla+ em GM-CSF. Foi detectada uma grande proporção de células CDla+ em IL-3 e TNF-a (10-25%) e principalmente em GM-CSF e TNF-a (20-60%) (variação de 5 experiências após 12 dias de cultura). Em termos de eficiência de crescimento, IL-3 mais TNF-α é 2-3 vezes mais potente que IL-3 sozinha e GM-CSF mais TNF-α é 3-4 vezes mais potente que GM-CSF sozinho (Figura 2). Assim, começando a partir de 105 células CD34+, após 12 dias em cultura, GM-CSF permitiu a geração de 1-3x106 células CDla+, enquanto que em IL-3 mais TNF-a e GM-CSF mais TNF-α foram recuperadas culturas de 2-3x106 células. Como GM-CSF mais TNF-α pareceu ser a combinação mais potente de factores para gerar células CDla+, todas as culturas para a caracterização dessas células continham GM-CSF mais TNF-α: a Figura 2 mostra a expansão de 105 células CD34+ (i) na presença de IL-3 (triângulos fechados), (ii) IL-3 e TNF-a (triângulos abertos), (iii) GM-CSF (quadrados fechados) e (iv) GM-CSF e TNF-a (quadrados abertos). As linhas fechadas indicam os número totais de células nas três experiências e as linhas a tracejado indicam a expressão do antigénio CDla. As Figuras 2A e 2B representam dados de dois conjuntos separados de experiências. A morfologia das células CDla+ geradas pelo método do invento foi estudada utilizando tanto microscopia óptica como electrónica. As células aderentes observadas em GM-CSF sozinho apresentam o aspecto clássico de macrófagos de forma regular, enquanto que as obtidas na presença de GM-CSF mais TNF-α têm um aspecto típico de células dendríticas com dendrites altamente ramificadas, núcleo lobulado e uma superfície com vilosidades e com projecções dendríticas. Algumas das células CDla+ (cerca de 1 em 5) possuem organitos com junção de membrana dupla, lembrando a estrutura dos grânulos de Birbeck. O fenótipo das células CDla+ geradas após 12 dias de cultura na presença de GM-CSF e TNF-α foi determinado por análise de fluorescência de duas cores. Dependendo da experiência, a percentagem de células CDla+ que co-expressam CD 14 variou entre 10 e 70%. Os resultados apresentados na Tabela I abaixo foram obtidos a partir de experiências nas quais menos de 15% das células CDla+ co-expressavam CD 14; assim, ambas as células CDla+ e células CD la' CD14+ foram caracterizadas. As células CDla+ co-expressavam CDlc, CD4 e CD40, mas não expressavam CDlb. Pelo contrário, as células CDla'CD14+ não expressavam CDlc e expressavam apenas de forma fraca CD4 e CD40. Verificou-se que ambas as células CDla+ e CD14+ possuíam FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) e CR3 (CDllb), enquanto que apenas as células CDla'CD14+ expressavam FcyRI (CD64) e CRI (CD35). As células CDla+ e CDla'CD14+ expressavam tanto LFAla (CDlla) como ΙΤΑΙβ (CD18), mas as células CDla+ exibiam maiores níveis de ICAM1 (CD54) que as células CDla'CD14+. As células CDla+ expressavam níveis muito elevados de HLA-DR (5-10 vezes mais que as células CD14+). Pelo contrário, as células CDla'CD14+ expressavam níveis elevados de HLA-DQ+. - 13-

TABELAI

Fenótipo das Células Dendríticas Produzidas de Acordo com o Invento

Antigénio Anticorpo Reactividade com células CDla Reactividade com células CD 14 Fontes do Anticorpo (1) CDla OKT6, IOTóa, ++ - Ort, Hy8, T6, DMC1, L544 Imu, Cou CDlb IOTób - - Imu CDlc IOTóc + - Imu CD14 Leu-M3 +/- +++ BD CD4 IOT4 ++ +/- Imu CD40 Mab 89 ++ EP CD16 Leullb + + BD CD32 2E1 +/- +/- Imu CD64 197 - + Med CD21 CR2 - - BD CDllb IOM1 ++ ++ Imu CD35 IOT17 - ++ Imu CD54 84H10 +++ + Imu CDlla SPVL7 ++ ++ Hy2 CD18 BL5 ++ ++ Imu HLA-DR L243 ++++ ++ BD HLA-DQ SPVL3 +++ + Imu 1

Os anticorpos foram obtidos de fontes tal como se segue: Ort = Ortho Diagnostic Systems; Imu = Immunotech; Cou = Coulter (Hialeah, FL); BD = Becton-Dickinson; Med = Medarex Inc. (Lebanon, NH); Hy2 = Hybridoma, Vol. 2, pág. 423 (1983); Hy8 = Hybridoma, Vol. 8, pág. 199 (1989); EP = Ped. Pat. Eur. 89403491.7 - 14-

Exemplo 2

Proliferação de Células T CD4+ após Estimulação por Células Dendríticas

As células CD34+ foram cultivadas durante 12 dias de acordo com o invento, após o que foram irradiadas com 4000 Rads para formar células estimuladoras para a experiência. Foram semeadas de 10 a (2,4xl04) células estimuladoras para 2,5xl04 células T CD4+ de repouso ou outras células de resposta em placas de cultura de tecidos de microteste de fundo redondo em meio suplementado com 10% de soro AB+ humano, tal como abaixo descrito.

As células dendríticas foram ensaiadas quanto à sua capacidade para induzirem células T CD4+ alogeneicas de repouso (como células de resposta) a proliferarem. Tal como mostrado na Figura 3A, as células cultivadas na presença de IL-3 sozinha (triângulos fechados) induziram a proliferação marginal de células T CD4+ alogeneicas. Pelo contrário, as células cultivadas na presença de GM-CSF sozinho (quadrados fechados), na presença de IL-3 mais TNF-α (triângulos abertos) e na presença de GM-CSF mais TNF-α (quadrados abertos), induziram uma forte proliferação de células T CD4+ alogeneicas. Dependendo das condições de cultura das células progenitoras CD34+, a proliferação óptima das células T CD34+ foi observada para diferentes valores da razão (células estimuladoras)/(células T CD34+ alogeneicas). Em comparação com valores de controlo (células T CD34+ sem células estimuladoras), foi observado um aumento de 50 vezes na absorção de timidina tritiada pelas células T CD34+ numa proporção de 1:3,8 (variação 1:3 a 1:25), 1:12,5 (variação 1:10 a 1:35) e 1:360 (variação 1:100 a 1:400) para células cultivadas na presença de GM-CSF sozinho, IL-3 mais TNF-α e GM-CSF mais TNF-α respectivamente (variações obtidas a partir de 5 experiências). - 15-

Na Experiência ilustrada na Figura 3B, as células CD34+ foram cultivadas na presença de GM-CSF e TNF-α para todas as experiências e as células de resposta eram células T CD4+ de sangue periférico de adulto (quadrados abertos), de sangue do cordão (triângulos abertos e fechados) e de sangue do cordão singeneico (quadrados fechados). A Figura 3B mostra que as células T CD4+ alogeneicas derivadas de sangue do cordão ou de sangue periférico de adulto foram igualmente estimuladas e que as células T CD4+ singeneicas foram estimuladas numa extensão muito menor (resposta 20 vezes mais fraca que nas células alogeneicas).

Quando, após 12 dias de cultura na presença de GM-CSF e TNF-a, as células CDla+ foram removidas por depleção imunomagnética (Figura 4), foi observada uma forte perda de capacidade de indução. Foi observado um aumento de 50 vezes na proliferação de células T CD4+ para uma razão (células estimuladoras)/(células T CD4+ alogeneicas) de 1:200 (variação de 3 experiências 1:200 a 1:400) e 1:8 (variação de 3 experiências 1:8 a 1:40) antes e após as células CDla+ terem sido removidas, respectivamente. Após irradiação, foram utilizadas as seguintes células como estimuladoras: população total (quadrados fechados), população da qual foram removidas por depleção as células CDla+ (quadrados abertos) e população de controlo na qual a depleção foi efectuada com um anticorpo anti-isotipo IgGi (triângulos abertos).

Exemplo 3

Geração de Células T CD8 Citotóxicas Específicas de Cancro para Imunoterapia Adoptiva

As células CD34+ são isoladas a partir do sangue periférico de um doente com cancro e cultivadas na presença de GM-CSF e TNF-α, tal como - 16- acima descrito. As células CD8 do sangue periférico são criopreservadas. Uma vez geradas células dendríticas, as células T CD8 são descongeladas e misturadas com as células cancerígenas do doente. Após sensibilização, as células T CD8 são expandidas na presença de IL-2, p. ex. tal como descrito por Rosenberg, patente U.S. 4690915. As células totais são re-infundidas no doente desde que apresentem actividade citotóxica específica para o tumor. As células tumorais podem ser substituídas por antigénios tumorais específicos, p. ex. van der Bruggen et ai, Science, Vol. 254, pág. 1643 (1991).

As células dendríticas geradas na presença de GM-CSF e TNF-a são fortes estimuladores da proliferação de células T CD8+ alogeneicas de repouso

As células dendríticas geradas a partir de progenitores CD34+ de sangue do cordão foram cultivadas durante 12 dias e irradiadas (4000 Rads) e foram depois utilizadas como células estimuladoras para células T CD4+ e CD8+. Foram semeadas de 10 a 2,5xl03 células estimuladoras para 2xl04 células T de repouso, em placas de cultura de tecidos de microteste de fundo redondo, em meio suplementado com 10% de soro AB+ humano, com ou sem 20 U/ml de IL-2. Após 5 dias de incubação, as células foram sujeitas a pulsos com 1 pCi de 3H-timidina durante 8 horas, colhidas e contadas. Os testes foram efectuados em triplicado e os resultados foram expressos como contagens médias por minuto. A adição de IL-2 ao meio no qual as células T CD4+ e CD8+ foram cultivadas estimulou de facto a proliferação das células T CD4+ e CD8+, tal como mostrado pelas suas absorções de 3H-timidina. Tal como mostrado na Figura 5, as células CD8+ cultivadas apenas na presença de meio (quadrados abertos) mostraram muito pouca proliferação enquanto que as células CD8+ cultivadas na - 17- presença de IL-2 (quadrados fechados) mostraram muito mais proliferação; para além disso, as células CD4+ cultivadas apenas na presença de meio (círculos abertos) mostraram pouca proliferação enquanto que as células CD4+ cultivadas na presença de IL-2 (círculos fechados) mostraram consideravelmente mais proliferação.

Exemplo 4

Geração de Respostas de Anticorpo Primárias e Secundárias em Ratinhos SCID-hu

Ratinhos SCID-hu permitiram que respostas secundárias reunissem novamente os antigénios mas não permitiram o estabelecimento de respostas primárias: p. ex. Moller, The SCID-hu Mouse, Vol. 124 (Munksgaard, Copenhaga, 1991); Duchosal et al, Nature, Vol. 355, pág. 258 (1992); e Mosier et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., Vol. 152, pág. 195 (1989). Acredita-se que isto se deve a uma falta de reconstituição do banco de células dendríticas. Como as células dendríticas sujeitas a pulsos de antigénios podem induzir eficientemente uma resposta de anticorpo in vivo, p. ex. Somasse et al., J. Exp. Med., Vol. 175, pág. 15 (1992), são reconstituídos ratinhos SCID-hu com as células dendríticas geradas in vitro a partir das células CD34 do dador de células humanas ou de outro dador que partilhe um MHC compatível. As células dendríticas são sujeitas a pulsos com o antigénio apropriado antes da injecção. Assim que o ratinho apresente anticorpo para o antigénio, as células B são isoladas do sangue e doutros órgãos reconstituídos e imortalizadas, p. ex. por cultura no sistema CD40 na presença do vírus de Epstein-Barr tal como ensinado por Banchereau et al., Science, Vol. 251, pág. 70 (1991). -18-

Exemplo 5

Tratamento de SIDA por Imunoterapia Adoptiva com Células Dendríticas Geradas In Vitro

As células dendríticas são infectadas por HIV in vitro e o HIV encontra-se em gemulação na superfície das células após 3-5 dias em cultura com HIV: p. ex. Patterson, J. Gen. Virol., Vol. 68, págs. 1177-1181 (1987); Macatonia et al, Immunology, Vol. 71, págs. 38-45 (1990); e Knight et al., Immunol. Lett., Vol. 19, págs. 177-182 (1988). As provas para a infecção in vivo de células dendríticas por HIV vem da descrição da infecção das células de Langerhans da pele e redução da quantidade de moléculas do MHC de classe II em células da pele: p. ex. Tschachler et al, J. Invest. Dermatol, Vol. 88, págs. 233-237 (1987); e Belsito et al., N. Engl. J. Med., Vol. 310, págs. 1279-1282 (1984). Para além disso, 3-21% das células dendríticas do sangue de doentes com HIV contêm HIV, com um nível de infecção duas ordens de grandeza superior ao observado noutros tipos celulares: Macatonia et al., Immunology, Vol. 71, págs. 38-45 (1990). A infecção de células dendríticas pelo vírus bloqueia a sua capacidade para apresentar o antigénio às células T e inibe assim o recrutamento/proliferação das células T o qual é necessário para uma resposta imunitária bem sucedida.

As células CD34+ de doentes com HIV são utilizadas para gerar células dendríticas de acordo com o invento. As células dendríticas são então incubadas com antigénios seleccionados e re-infundidas no doente com HIV.

Lisboa, 28 de Junho de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficiai da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

-1 - REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a geração in vitro de células dendríticas humanas compreendendo os passos de : (a) cultura de células hematopoéticas CD34+ humanas (i) com GM-CSF, (ii) com TNF-α e IL-3 ou (iii) com GM-CSF e TNF-a, induzindo assim a formação de células dendríticas humanas CDla+ a partir das referidas células hematopoéticas CD34+; e (b) recuperação das referidas células dendríticas humanas CDla+ a partir da referida cultura.
2. Processo da reivindicação 1, em que as células CD34+ são cultivadas na presença de GM-CSF.
3. Processo da reivindicação 1, em que as células CD34+ são cultivadas na presença de GM-CSF e TNF-a.
4. Processo da reivindicação 1, em que as células CD34+ são cultivadas na presença de TNF-α e IL-3.
5. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que as células dendríticas recuperadas são sujeitas a pulsos com antigénio.
6. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que as células CD34+ são obtidas a partir de um doente com HIV.

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA Lisboa, 28 de Junho de 2000