CN101080487B - 成熟树突细胞组合物及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制备和使用用于增强免疫应答的免疫刺激细胞的方法。本发明提供一种制备成熟树突细胞(DC)的方法，所述方法包括以下的顺序步骤：(a)用含干扰素γ受体(IFN-γR)激动剂和/或肿瘤坏死因子α受体(TFN-αR)激动剂的第一信号向分离的不成熟树突细胞(iDC)传导信号，以生产已传导信号的树突细胞；和(b)用含有效量的CD40激动剂的第二瞬时信号向所述已传导信号的树突细胞传导信号，以生产CCR7+成熟树突细胞。本发明还提供通过本发明方法制备的树突细胞富集群。这种树突细胞具有增强的免疫刺激特性和增加的IL-12分泌和/或降低的IL-10分泌。CD40传导信号可通过一种或多种由编码CD40L的外源多核苷酸(例如mRNA或DNA)翻译的多肽、CD40受体的激动性抗体或CD40配体多肽启动。富集群可通过给予DC免疫原进一步修饰。DC将摄取和在其细胞表面上加工免疫原。

Description

成熟树突细胞组合物及其培养方法
            相关申请的交叉参考
本申请要求保护2004年10月7日提交的美国临时申请60/522,512的优先权，其内容具体通过引用结合到本文中。
                  发明领域
本发明涉及成熟树突细胞的产生及其在细胞治疗中的用途和驯化免疫效应细胞的用途。成熟树突细胞可由不成熟树突细胞产生。
                  发明背景
细胞治疗使用修饰的抗原提呈细胞(APC)或免疫效应细胞，以在患者中启动免疫应答。抗原提呈细胞是细胞治疗的核心，因为其启动免疫应答。实际上，它们是唯一能够诱导T淋巴细胞的初次免疫应答的细胞。
树突细胞(DC)是与获得性免疫相关的最有效APC。它们通过原初T细胞和B细胞协同启动免疫应答，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。DC以几种方式特化，以在体内激发辅助和杀伤T细胞。例如，位于外周组织的不成熟DC能够捕获抗原和产生免疫原性MHC-肽复合物。在成熟诱导性刺激物如炎性细胞因子的作用下，不成熟DC通过上调粘附和共刺激分子变成有效的T细胞刺激物。同时，它们迁移入次级淋巴器官，以选择和刺激稀有抗原特异性T细胞。但是，T细胞的有效刺激仅在DC成熟后发生，DC成熟是增加细胞表面上的MHC/肽复合物利用度的过程，该过程还增加引导响应T细胞效应子功能的共刺激分子的利用度。实际上，不成熟DC可能对抗肿瘤和其它免疫治疗有害，因为它们可诱导免疫耐受，而不是免疫刺激。
共刺激通常是T细胞必需的，以产生足以诱导克隆扩充的细胞因子水平。树突细胞的一个特征使其成为有效的抗原提呈细胞，该特征是其富集免疫应答的共刺激分子，例如T淋巴细胞上活化分子CD28的分子CD80和CD86。回过来，T-辅助细胞表达连接DC上CD40的CD40L。DC和T细胞之间的这些相互作用导致前者‘成熟化’，在后者中出现效应子功能。分子CD54或分子CD11a/CD18之类的粘附分子的表达有利于树突细胞和T细胞之间的协同作用。树突细胞的另一种特有特征是根据其分化期使用不同的功能。因此，抗原捕获及其转化是不成熟树突细胞的两个主要功能，而其提呈抗原以便刺激T细胞的能力随着树突细胞迁移入组织和淋巴神经节中而增加。这种功能性的改变对应着树突细胞的成熟。因此，不成熟树突细胞向成熟树突细胞的转变代表着免疫应答启动的基础步骤。传统上，通过监测此过程中DC上的表面标记变化跟踪此成熟。为树突细胞不同成熟期特征的一些较重要的细胞表面标记概述于下表I。但是，所述表面标记可根据成熟过程而改变。
                        表I
细胞类型          表面标记
造血干细胞        CD34+
单核细胞          CD14++、DR+、CD86+、CD16+/-、CD54+、CD40+
不成熟树突细胞    CD14+/-、CD16-、CD80+/-、CD83-、CD86+、
                  CD1a+、CD54+、DQ+、DR++
成熟树突细胞      CD14-、CD83++、CD86++、CD80++、DR+++、
                  DQ++、CD40++、CD54++、CD1a+/-
对于免疫治疗，目前成熟DC优于不成熟DC。只有完全成熟的DC子代才没有GM-CSF受体(GM-CSF-R)，并在去除/没有GM-CSF的情况下稳定保持成熟。另外，已经表明，成熟DC对在体外和体内诱导T细胞应答有优势。相反，据报道不成熟DC在体外(Jonuleit等(2000)Exp.Med.192：1213)以及体内(Dhodapkar等(2001)Exp.Med.193：233)通过诱导调节性T细胞诱导耐受。成熟树突细胞还在体外或体内有效摄取和提呈抗原至T淋巴细胞。由这些修饰的DC驯化的修饰性抗原提呈DC和/或T细胞具有许多应用，包括诊断、治疗、疫苗接种、研究、筛选和基因传递。
难以由外周血中分离成熟树突细胞，因为不足1％的白细胞属于该类型。成熟DC也难以由组织中提取。这种困难连同DC在细胞治疗中的潜在疗效，驱使研究和开发使用替代来源产生成熟树突细胞的新方法。已报道了几种由不成熟树突细胞生产成熟DC的方法。
例如，Jonuleit等(Eur J Immunol(1997)12：3135-3142)公开了通过在含细胞因子混合物(IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2)的培养基中培养使不成熟人DC成熟。
WO 95/28479公开了一种树突细胞制备方法：分离外周血细胞并富集CD34+血前体细胞，接着用造血生长因子和细胞因子的组合扩增。
欧洲专利出版物EP-A-0 922 758公开了从多能细胞来源不成熟树突细胞生产成熟树突细胞，所述多能细胞具有表达巨噬细胞或树突细胞特征的潜能。所述方法需要使不成熟树突细胞与包含IFN-γ的树突细胞成熟因子接触。
欧洲专利出版物EP-B-0 633930教导了人树突细胞的生产：首先将人CD34+造血细胞与(i)GM-CSF、(ii)TNF-α和IL-3或(iii)GM-CSF和TNF-α培养，以诱导CD1a+造血细胞形成。
专利公开号2004/0152191公开了通过使树突细胞与RU 41740接触使树突细胞成熟。
美国专利公开号2004/0146492教导了一种生产重组树突细胞的方法：转化造血干细胞，接着通过在含GM-CSF的培养基中培养将所述干细胞分化为树突细胞。
美国专利公开号2004/0038398公开了由哺乳动物外周血制备基本纯化的DC群和单核细胞的方法。骨髓细胞分离自哺乳动物，DC分离自该群，以产生分离的单核细胞亚群。然后通过用抗CD2抗体负选择以去除T细胞而富集DC。
尽管成熟DC有功能活性，并因此可用于诱导抗原特异性T细胞，但不是全部的成熟DC都最适于诱导这些反应。业已表明，某些成熟DC还可通过分泌IL-12刺激T辅助细胞。Macatonia等(1995)Immunol.154：5071；Ahuja等(1998)Immunol.161：868和Unintford等(1999)Immunol.97：588。还已经表明，IL-12在动物模型中增强针对抗原的抗原特异性CD8+T细胞应答。Schmidt等(1999)Immunol.163：2561。
Mosca等(2000)Blood 96：3499公开，和在仅含可溶性CD40L三聚体的培养基中培养相比，在同时含可溶性CD40L三聚体和IFNγ1b的AIM V培养基中培养DC导致IL-12表达增加。
Koya等(2003)J.Immunother.26(5)：451报道，在IFNγ存在下，通过用编码CD40配体的慢病毒载体转导不成熟DC可增强IL-12表达。90％以上的CD40L转导的DC在其细胞表面上表达CD83。不幸地是，慢病毒转导细胞不适于治疗用途，前病毒迁移入转导细胞基因组中可导致白血病。而且，CD40L持续表达可能对APC功能和生存力具有有害作用。
该工作补充了Mackey等(1998)J.Immunol.161：2094的较早前工作，Mackey等报道，在体内，DC需要经CD40成熟，以产生抗肿瘤免疫性。同样，Kuniyoshi，J.S.等(1999)Cell Immunol.193：48表明，用可溶性三聚化CD40配体加IFN-γ处理的DC刺激有效的T细胞增殖，诱导T细胞的抗原特异性裂解增强。Kalady，M.F.等(2004)J.Surg.Res.116：24报道，用编码黑素瘤抗原MART-1或流感病毒M1基质蛋白的mRNA转染人单核细胞源DC，使这些DC接触同时或序贯加入的不同成熟刺激物，这些DC在抗原提呈、IL-12分泌和在这些DC存在下产生的效应T细胞的免疫原性方面表现出可变性。最重要地是，该研究表明，应用由IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2组成的‘细胞因子混合物’，接着应用胞外可溶性CD40L蛋白，优于同时应用所有物质。但是，这些作者未研究在序贯方法中IFN-γ信号传导与瞬时CD40L信号传导的组合。此外，尽管在IFN-γ和CD40L相伴加入到培养基中时产生IL-12，但近来的先有技术表明，产生的DC实际上是免疫抑制的，而不是促炎作用(Hwu等(2000)J.Immunol.164：3596；Munn等(2002)297：1867；和Grohmann等(2003)Trends Immunol.24：242)，原因是诱导代谢色氨酸的酶，这导致响应T细胞饥饿，这些响应T细胞随后不能增殖。因此，现有文献提示，IFN-γ和CD40L组合不应增加免疫效力。本发明解决了久已感知的需求，提供改良的DC成熟方法和具有增强免疫效力的成熟DC。
                        发明概述
申请人已经发现，当用含干扰素γ受体(IFN-γR)激动剂的第一信号后接含CD40激动剂的第二信号序贯给不成熟树突细胞传导信号时，发生有效的免疫刺激。因此，本发明提供一种制备成熟树突细胞(DC)的方法，其包括以下的顺序步骤：(a)用含干扰素γ受体(IFN-γR)激动剂和任选TNF-αR激动剂的第一信号向分离的不成熟树突细胞(iDC)传导信号，以产生已传导信号的树突细胞；和(b)用含有效量的CD40激动剂的第二瞬时信号向所述已传导信号的树突细胞传导信号，以产生CCR7+成熟树突细胞。
在优选实施方案中，使不成熟DC与PGE2和任选的TNF-α进一步接触。在替代实施方案中，所述方法还包括使不成熟DC、已传导信号的DC和/或CCR7+成熟树突细胞与选自以下的化合物接触：半乳糖苷神经酰胺、糖基神经酰胺、呋喃半乳糖苷神经酰胺、吡喃阿拉伯糖基神经酰胺、α-C-半乳糖苷神经酰胺和α-S-半乳糖苷神经酰胺。优选所述化合物为半乳糖苷神经酰胺。最优选所述半乳糖苷神经酰胺为(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇(KRN7000)。
在本发明的另一个实施方案中，IFN-γR激动剂可由肿瘤坏死因子α受体(TNF-αR)激动剂替换。因此，本发明提供制备成熟树突细胞(DC)富集群的方法，其包括用含肿瘤坏死因子α受体(TNF-αR)激动剂的第一信号后接含CD40激动剂的第二信号向不成熟树突细胞序贯传导信号，由此制备成熟树突细胞富集群，其中所述传导信号处于没有有效量的IL-1β或IL-6的状态下。优选不成熟DC还与PGE2接触。
优选的IFN-γR激动剂是哺乳动物IFN-γ，优选人IFN-γ及其活性片段。优选的TNF-αR激动剂是哺乳动物TNF-α，优选人TNF-α及其活性片段。优选的CD40激动剂是哺乳动物CD40配体(CD40L)，优选人CD40L及其活性片段和变体，以及CD40受体的激动性抗体。可通过在培养基中提供传导信号激动剂、将激动剂导入到细胞中和/或编码激动性多肽的mRNA在树突细胞中翻译时开始传导信号。所述方法可在体内或活体外实施。然后，可将按照本发明方法活体外成熟的树突细胞给予受试者，以诱导或增强免疫应答。
可通过给予DC免疫原进一步修饰各种树突细胞。DC将摄取和加工免疫原，并将免疫原展示在其细胞表面上。免疫原可体内或活体外传递。可将成熟的培养DC给予受试者，以诱导或增强免疫应答。在再另一个实施方案中，荷载抗原的成熟DC用于驯化原初免疫效应细胞。
在另一方面，本发明提供一种含体外成熟的树突细胞的组合物，例如CD83+CCR7-成熟DC和CD83+CCR7+成熟DC。相比于不成熟树突细胞，本发明的成熟树突细胞表达水平增加的IL-12，和/或表达低于500pg IL-10/106树突细胞。本发明的组合物可通过给予受试者有效量的群而用于在所述受试者中产生免疫应答。
                        序列表简述
SEQ ID NO：1是人CD40L cDNA。核苷酸40-825代表编码区，包括ATG翻译起始密码子和TGA翻译终止密码子。
SEQ ID NO：2是全长人CD40L蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是人CD40 cDNA。核苷酸67-522代表编码区，包括ATG翻译起始密码子和TAG翻译终止密码子。
SEQ ID NO：4是人CD40(CD40L的受体)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是人IFN-γcDNA。核苷酸109-609代表编码区，包括ATG翻译起始密码子和翻译终止密码子。
SEQ ID NO：6是人IFN-γ的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是人TNF-αcDNA。核苷酸170-971代表编码区，包括ATG翻译起始密码子和TGA翻译终止密码子。
SEQ ID NO：8是人TNF-α的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是小鼠CD40L cDNA。核苷酸13-795代表编码区，包括ATG翻译起始密码子和TGA翻译终止密码子。
SEQ ID NO：10是全长小鼠CD40L蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是CD40L 5′引物。
SEQ ID NO：12是CD40L 3′引物。
SEQ ID NO：13是对应于优化的人CD40L mRNA的DNA序列。
SEQ ID NO：14是CD40受体3′UTR。
SEQ ID NO：15是人β-肌动蛋白3′UTR最后一个外显子的非翻译区。
SEQ ID NO：16是人β-肌动蛋白3′UTR的最小功能元件。
SEQ ID NO：17是猴轮状病毒基因6 3′UTR。
SEQ ID NO：18是猴轮状病毒基因6 3′UTR的最小功能元件。
SEQ ID NO：19是人Hsp70 5′UTR(HSPA1A)。
SEQ ID NO：20是小鼠VEGF 5′UTR。
SEQ ID NO：21是小鼠VEGF 5′UTR的最小功能元件。
SEQ ID NO：22是脾坏死病毒LTR RU5区。
SEQ ID NO：23是烟草蚀纹病毒5′前导序列。
SEQ ID NO：24-25是HLA-A201限制性MART-APL肽，分别为天然肽和PSA-1肽。
                     附图简述
图1表明，用IFN-γ然后用可溶性CD40L序贯成熟DC产生最佳的IL-12p70分泌。用细胞因子混合物、单独的可溶性CD40L或用可溶性CD40L加IFN-γ成熟DC。将不成熟DC与1000U/ml IFN-γ预温育18小时，接着加入可溶性CD40L再温育18小时，产生最大的IL-12p70释放。先加入可溶性CD40L接着加入IFN-γ由于具有最小的IL-12p70释放并伴有IL-10而被看作阴性信号。
图2表明，根据使用抗-CD40L(CD154)抗体的FACS分析判定，用编码CD40L并具有大于400个核苷酸聚腺苷酸尾的mRNA转染的HELA细胞表达细胞表面蛋白。
图3表明，CD40L mRNA转染细胞的IL-12p70分泌与转染有效负载的大小成比例。用CD40L mRNA滴定液转染DC，之后立即加入1000U/ml IFN-γ。诱导显著水平的IL-12p70释放需要至少4μgCD40L mRNA/106DC。
图4表明，需要至少100U/ml IFN-γ与CD40L mRNA有效负载协同诱导最大的IL-12p70分泌。以4μg CD40L mRNA/106细胞转染DC，立即与IFN-γ滴定液温育。24小时后检测培养上清液中的IL-12p70和IL-10。
图5A表明，CD40L/IFN-γ诱导的IL-12p70分泌在DC转染和IFN-γ存在下培养后约24小时发生。用4μg CD40L mRNA/106细胞转染DC，立即与1000U/ml IFN-γ一起培养。在指定时间由复制培养基中收集上清液，检测IL-12p70和IL-10含量。
图5B表明，向CD40L mRNA转染的DC中加入TNF-α导致产生IL-12p70，但表达水平低于用IFN-γ作为共成熟因子获得的水平。
图5C表明，和使用IFN-γ相比，使用TNF-α作为共成熟因子也导致IL-10水平提升。
图6A和6B表明，根据使用抗CD40L(CD154)抗体的FACS分析判定，用编码CD40L的mRNA转染的DC表现出细胞表达。在图6A中，以4μg CD40L mRNA/106细胞转染DC，并于不同时间点分析。大部分CD40L位于胞内区室中，以至4小时时间点时表面表达相当低为证。图6B表明显著的胞内表达明显，在60分钟时有27％的阳性DC，至3小时时增加至79％。
图6C显示了在用编码CD40L的mRNA转染DC后CD40L蛋白的瞬时表达。
图7表明，尽管存在过量的封闭抗CD40L抗体，但用CD40LmRNA转染并在IFN-γ存在下培养的DC分泌IL-12p70，CD40/CD40L相互作用在“胞内”区室中有效。用4μg CD40L mRNA转染DC，并在10或50μg/ml封闭抗CD40L抗体存在下立即与1000U/ml IFN-γ培养。IL-12p70释放仅降低50％，表明胞内传导信号为诱导IL-12p70的主要途径，而不是细胞至细胞传导信号。
图8表明，用CD40L mRNA转染并与IFN-γ共培养的DC需要存在PGE2，以能够进行趋化因子依赖性迁移。用CD40L mRNA滴定液转染DC，并立即与1000U/ml IFN-γ和1μg/ml PGE2温育。用eGFP转染并用含PGE2的细胞因子混合物成熟的DC代表阳性对照。在18小时的成熟之后，以“跨孔”迁移测定相对于淋巴结归巢趋化因子CCL19和21检测各个培养条件的DC。DC迁移与CD40L mRNA有效负载的大小成比例。
图9表明，当与“细胞因子混合物”存在下成熟的DC相比时，经CD40L mRNA转染并在IFN-γ和PGE2存在下培养而成熟的DC激发有效的T细胞“回忆应答”。以作为抗原有效负载的2μg流感病毒M1 mRNA/106细胞和4μg eGFP mRNA对照共转染DC，随后用细胞因子混合物成熟DC。或者，用作为抗原有效负载的2μg流感病毒M1 mRNA/106细胞和作为成熟有效负载的4μg CD40L mRNA共转染DC。后述的这些细胞立即在1000U/ml IFN-γ和1μg/ml PGE2中培养，以完成成熟过程。24小时后，在ELISpot检测中使用各个DC群募集抗流感病毒M1回忆应答，该应答根据分泌IFN-γ的响应T细胞的频率测定。通过在IFN-γ和PGE2存在下用CD40L mRNA转染成熟的DC激发更有效的抗流感病毒应答。
图10表明，与“细胞因子混合物”存在下成熟的DC相比，经CD40L mRNA转染并在IFN-γ和PGE2存在下培养成熟的DC激发有效的“初次T细胞应答”。用作为抗原有效负载的2μg MART-APLmRNA/106细胞转染DC，随后用细胞因子混合物成熟DC。或者，用作为抗原有效负载的2μg MART-APL mRNA/106细胞和作为成熟有效负载的4μg CD40L mRNA共转染DC。后述这些细胞立即在1000U/ml IFN-γ和1μg/ml PGE2中培养，以完成成熟过程。24小时后，通过在0.2U/ml IL-2存在下共培养自体原初CD8+T细胞7天，使用各个DC群产生针对MART-APL肽序列的T细胞应答，所述肽序列由转染的MART-APL mRNA有效负载产生。在此第一轮刺激后，收获T细胞，并以IL-2 ELISpot检测确认，用适当成熟的抗原载荷DC再刺激。通过在IFN-γ和PGE2存在下用CD40L mRNA转染成熟的DC激发更有效的抗MART-APL应答，该应答根据分泌IL-2的响应CD8+T细胞的频率测定。
图11表明，表达MART-APL mRNA的DC诱导细胞毒性T细胞。图11a表明，在加入可溶性干扰素-γ/PGE2的情况下，使用作为抗原来源的MART-APL mRNA和CD40L mRNA共转染成熟DC激发有效的CTL反应，而图11b表明，用MART-APL mRNA转染但用‘细胞因子混合物’成熟的DC不能激发有效的CTL反应。T2-PSA：用得自前列腺特异性抗原(PSA)的HLA-A2限制性肽脉冲的T2细胞，用作阴性对照靶。MART-T2：用其天然序列中的HLA-A2限制性MART表位脉冲的T2细胞。MART-APL-T2：用HLA-A2限制性MART表位脉冲的T2细胞，作为优选的‘改变肽配体’。
图12显示了跨孔检测中PME-CD40L成熟DC对淋巴结趋化因子CCL19和21的迁移能力。平行测试4个独立的健康供体，各个DC制备物都用1μg扩增的总RCC肿瘤RNA连同4μg CD40L RNA/106DC转染。迁移检测在用mRNA有效负载转染后24小时进行。
图13显示了对黑素瘤相关抗原MART-1的健康供体CTL反应的诱导。制备DC，使DC载荷MART-1RNA，经‘基于CD40L的方法’成熟DC，或使用PME-CD40L法制备DC。DC和纯化的CD8T细胞以1∶10比率共培养，在IL-2存在下经历3轮刺激。数据显示了使用一系列效应子-靶比率的MART-1肽脉冲T2靶细胞的51CR释放细胞毒性检测。
图14显示了对载荷总扩增RCC肿瘤RNA、PME-CD40L成熟的DC的全自体CTL反应的诱导。DC和纯化的CD8T细胞以1∶10比率共培养，在IL-2存在下经历3轮刺激。在最后一次刺激后5天，用总扩增RCC RNA、hTERT RNA、Survivin RNA、G250 RNA转染的DC或用eGFP RNA转染的阴性对照DC再刺激CD8T-细胞。通过细胞表面染色活化标记CD69并同时检测胞内IFN-γ和IL-2，由鉴别的响应T细胞得到数据。将胞内细胞因子反应再细分，以鉴别IFN-γ/IL-2双阳性(记忆细胞)中的IFN-γ单阳性(效应细胞)。
图15显示了KRN7000或溶媒脉冲的、MART-1RNA转染的、基于CD40L的方法成熟的DC扩增NKT-细胞(a)和MART-1反应性CTL(b)。数据清楚表明，据CD1d/KRN7000四聚体染色判定，KRN7000脉冲的DC可扩增NKT-细胞，据用MART-1/HLA-A2四聚体的四聚体染色判定，存在NKT-细胞扩增群可增加针对MART-1的初级CTL的伴随募集(concominant recuitment)。
图16显示了人(SEQ ID NO：1)和小鼠(SEQ ID NO：9)CD40LcDNA的比对。图16A、16B和16C代表SEQ ID NO：1和2比对的连续3页。
图17显示了人(SEQ ID NO：2)和小鼠(SEQ ID NO：10)CD40L蛋白的比对。
图18显示了mRNA转染DC的IL-12表达水平，所述mRNA使用mMessage mMachine T7 Ultra Kit(Ambion)以100μg规模(δX-E1)或1mg规模(δX-E2)的转录反应由pCR2.1 CD40L WTδX-E质粒转录。参比RNA由质粒pCR2.1 CD40L WT转录。转录的CD40L RNA通过使用polyA plus试剂盒(Epicentre)加入聚腺苷酸尾修饰。将RNA转染入DC中。在转染后约20小时，使用ELISA检测成熟DC上清液中的IL-12量。阴性：在未用任何CD40L RNA电穿孔的DC的上清液中检测的IL-12表达。
                实施本发明的方式
在整个本说明书中，通过标识引用参考各种出版物、专利和公开的专利说明书。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用具体地结合到本说明书中，以更完整地描述本发明所属领域的状态。
除非另有说明，否则本发明的实施使用属于本领域知识范围的常规分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学技术、细胞生物学技术、生物化学技术和免疫学技术。这些技术在文献中被充分阐述。这些方法描述于以下出版物中。参见例如Sambrook等，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel等编辑，(1987))；METHODS IN ENZYMOLOGY丛书(Academic Press，Inc.)；PCR：APRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等，IRL Press at OxfordUniversity Press(1991))；PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(MacPherson，Hames和Taylor编辑，(1995))；ANTIBODIES，ALABORATORY MANUAL(Harlow和Lane编辑，(1988))；USINGANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(Harlow和Lane编辑，(1999))；和ANIMAL CELL PATENT CULTURE(Freshney编辑，(1987))。
定义
除非正文另有明确说明，否则在说明书和权利要求中使用的单数形式“一个”和“一种”包括复数形式。例如，术语“一种细胞”包括大量细胞，包括其混合物。
本文使用的术语“包含”意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。“基本由……组成”当用于限定组合物和方法时，应指排除了对组合有任何重要意义的其它要素。因此，本文定义的基本由所述要素组成的组合物应不排除分离和纯化方法的痕量杂质和药物可接受的载体，例如磷酸缓冲盐水、防腐剂等。“由……组成”应指排除了超过痕量的其它成分要素和给予本发明组合物的基本方法步骤。由这些转变术语的每一个限定的实施方案都属于本发明的范围。
所有的数字表示，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是以0.1增量(+)或(-)变化的近似值。要理解的是，尽管不总是明确说明，但本文描述的试剂仅是例举，本领域知晓其等同物。
术语“抗原”在本领域被充分理解，其包括免疫原性物质，即免疫原。应当认识到，对于本发明中的应用设想使用任何抗原，因此抗原包括但不限于自身抗原(无论是正常的还是疾病相关的)、感染性抗原(例如微生物抗原、病毒抗原等)或一些其它外源抗原(例如食物成分、花粉等)。术语“抗原”或者“免疫原”适用于一种以上免疫原的统称，因此可同时调节针对多种免疫原的免疫应答。而且，所述术语包括任何免疫原或抗原的各种不同制剂。
“天然”或“野生型”抗原是分离自天然生物源的多肽、蛋白或含表位的片段，其在作为MHC/肽复合物提呈时可特异性结合受试者中的抗原受体，具体地说是T细胞抗原受体(TCR)。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”指与肿瘤相关的抗原。众所周知的TAA实例包括gp100、MART和MAGE。
术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”指细胞表面分子编码基因的复合物，所述细胞表面分子对抗原提呈至T细胞和快速移植排斥是必需的。在人中，MHC也称为“人白细胞抗原”或“HLA”复合物。由MHC编码的蛋白称为“MHC分子”，分类为I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括膜异二聚化蛋白，其由在MHC中编码的、与β2-微球蛋白非共价连接的α链组成。I类MHC分子由几乎所有具核细胞表达，已表明其起抗原提呈至CD8+T细胞的作用。人中的I类分子包括HLA-A、B和C。II类MHC分子也包括由非共价结合的α和β链组成的膜异二聚化蛋白。已知II类MHC分子在CD4+T细胞中有功能，在人中包括HLA-DP、-DQ和-DR。
术语“抗原提呈细胞(APC)”指一类能够以免疫系统特异性效应细胞可识别的肽-MHC复合物形式提呈一种或多种抗原的细胞，由此诱导针对所提呈的一种或多种抗原的有效细胞免疫应答。APC可为完整的全细胞，例如巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、活化T细胞和树突细胞；或者可为天然或合成的其它分子，例如与β2-微球蛋白复合的纯化MHC I类分子。尽管许多类型的细胞可提呈抗原至其细胞表面上供T细胞识别，但只有树突细胞具有以有效激活原初T细胞的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)反应的量提呈抗原的能力。
术语“树突细胞(DC)”指存在于各种淋巴组织和非淋巴组织中的形态学相似细胞类型的多样化群，Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271-296。树突细胞构成了生物中最有效和优选的APC。尽管树突细胞可由单核细胞分化，但它们具有不同表型。例如，特定分化标记CD14抗原在树突细胞细胞中不存在，但单核细胞具有该标记。另外，成熟树突细胞不是吞噬细胞，而单核细胞是强吞噬细胞。业已表明，成熟DC可提供T细胞活化和增殖必需的所有信号。
术语“免疫效应细胞”指能够结合抗原并介导免疫应答的细胞。这些细胞包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，例如CTL系、CTL克隆以及肿瘤、炎症或其它浸润液的CTL。
“原初”免疫效应细胞是从未接触能够活化该细胞的抗原的免疫效应细胞。原初免疫效应细胞的活化既需要肽：MHC复合物的识别，也需要专职APC同时传递共刺激信号，以便增殖和分化为具有抗原特异性臂的效应T细胞。
“免疫应答”广义地指淋巴细胞对外源物质的抗原特异性反应。任何可激发免疫应答的物质都被认为是“免疫原性的”，称为“免疫原”。所有免疫原都是抗原，但不是所有抗原都是免疫原性的。本发明的免疫应答可为体液介导的(经由抗体活性)或细胞介导的(经由T细胞活化)。
本文使用的术语“驯化的抗原特异性免疫效应细胞”是如上定义的免疫效应细胞，其预先已遭遇抗原。与其原初对应物相反，驯化的抗原特异性免疫效应细胞的活化不需要共刺激信号。肽：MHC复合物的识别就足够了。
“活化的”当用于指T细胞时，意味着所述细胞不再处于G0期，开始产生一种或多种细胞毒素、细胞因子和表征细胞类型的其它相关膜结合蛋白(例如CD8+或CD4+)，能够识别和结合在其表面上展示特定肽/MHC复合物的任意靶细胞，并释放其效应分子。
本文使用的术语“在受试者中诱导免疫应答”是本领域理解的术语，指在抗原(或表位)导入受试者后，可检测或测量的针对该抗原(或表位)的免疫应答比该抗原(或表位)导入受试者前的免疫应答(如果有的话)增加达至少约2倍，或至少约5倍，或至少约10倍，或至少约100倍，或至少约500倍，或至少约1000倍或以上。针对抗原(或表位)的免疫应答包括但不限于：产生抗原特异性(或表位特异性)抗体，以及产生在其表面上表达特异性结合抗原(或表位)的分子的免疫细胞。测定是否已诱导出针对给定抗原(或表位)的免疫应答的方法在本领域众所周知。例如，可使用任何本领域已知的各种免疫检测测定抗原特异性抗体，所述免疫检测包括但不限于ELISA，其中例如用可检测标记的第二抗体(例如酶标记的小鼠抗人Ig抗体)检测样品中抗体与固定化抗原(或表位)的结合。
“共刺激分子”参与在抗原提呈细胞和T细胞表面上表达的受体-配体对之间的相互作用。过去几年内积累的研究结果已令人信服地证实，静息T细胞需要至少两个信号诱导细胞因子基因表达和增殖(Schwartz，R.H.(1990)Science 248：1349-1356和Jenkins，M.K.(1992)Immunol.Today 13：69-73)。一个信号是赋予特异性的信号，可由TCR/CD3复合物与合适的MHC/肽复合物的相互作用产生。第二个信号不是抗原特异性的，称为“共刺激信号”。该信号最初定义为由巨噬细胞和树突细胞之类的骨髓衍生辅助细胞(所谓的“专职”APC)提供的活性。业已表明几种分子增强共刺激活性。这些分子是热稳定抗原(HSA)(Liu，Y.等(1992)3.Exp.Med.175：437-445)、硫酸软骨素修饰的MHC不变链(li-CS)(Naujokas，M.F.等(1993)Cell 74：257-268)、胞内粘附分子1(ICAM-1)(Van Seventer，G.A.(1990)].Immunol.144：4579-4586)、B7-1和B7-2/B70(Schwartz，R.H.(1992)Cell 71：1065-1068)。这些分子各自似乎通过与T细胞上的其关连配体相互作用帮助共刺激。共刺激分子在正常生理条件下介导必须的共刺激信号，以实现原初T细胞的完全活化。一个代表性受体-配体对是APC5表面上的B7共刺激分子家族及T细胞上的其反受体CD28或CTLA-4(Freeman等(1993)Science 262：909-911；Young等(1992).Clin.Invest.90：229和Nabavi等(1992)Nature 360：266-268)。其它重要的共刺激分子为CD40和CD54。术语“共刺激分子”包括任何单个分子或分子组合，其在与T细胞表面上与TCR结合的MHC/肽复合物一起起作用时提供共刺激作用，该共刺激作用实现了对结合肽的T细胞的活化。该术语因此包括B7或抗原提呈基质如APC上的其它共刺激分子、其片段(单独的、与其它分子复合的或为融合蛋白的一部分)，它们与MHC复合物一起结合关连配体，当T细胞表面上的TCR特异性结合肽时导致T细胞活化。尽管不总是明确说明，但期望在本发明精神和范围内使用与野生型或纯化共刺激分子具有相似生物活性的分子(例如重组生产的分子或其突变蛋白)。
本文使用的术语“细胞因子”指对细胞施加各种作用(例如诱导生长或增殖)的众多因子中的任一种。在实施本发明时可单独或组合使用的细胞因子的非限制性实例包括白介素-2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、G-CSF、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-1L(IL-11)、MIP-11、白细胞抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)和flt3配体。本发明的一个实施方案包括其中有效量的IL-1β和/或IL-6被排除在培养基之外的培养条件。细胞因子可由几个供应商处市售，这些供应商例如为Genzyme(Framingham，MA)、Genentech(South San Francisco，CA)、Amgen(Thousand Oaks，CA)、R&D Systems(Minneapolis，MN)和Immunex(Seattle，WA)。尽管不总是明确说明，但期望在本发明精神和范围内使用与野生型或纯化的细胞因子具有相似生物活性的分子(例如重组生产的分子或其突变蛋白)。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，指任意长度的聚合形式核苷酸。所述多核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核苷酸可具有任意三维结构，可实施已知或未知的任意功能。术语“多核苷酸”包括例如单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。除了天然核酸分子以外，本发明的核酸分子还可包括修饰的核酸分子。本文使用的mRNA指可在树突细胞中被翻译的RNA。这种mRNA通常加帽，具有核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码子。
术语“肽”在其广义上用于指两个或多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。所述亚单位可通过肽键连接。在另一个实施方案中，所述亚单位可通过其它键连接，例如酯键、醚键等。本文使用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸(包括甘氨酸以及D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链短的话，则3个或更多个氨基酸的肽通常叫做寡肽。如果肽链长的话，则该肽通常叫做多肽或蛋白。
术语“遗传修饰的”指包含和/或表达外源基因或核酸序列，其又修饰细胞或其子代的基因型或表型。换句话说，其指细胞内源核苷酸的任意添加、缺失或断裂。
本文使用的“表达”指多核苷酸转录为mRNA和mRNA翻译为肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸来源于合适真核宿主的基因组DNA，则表达可包括mRNA剪接。表达需要的调节元件包括结合RNA聚合酶的启动子序列和用于核糖体结合的转录起始序列。例如，细菌表达载体包括启动子如lac启动子，以及用于转录起始的Shine-Dalgarno序列和起始密码子AUG(Sambrook等(1989)，出处同上)。同样，真核表达载体包括用于RNA聚合酶II的异源或同源启动子、下游聚腺苷酸化信号、起始密码子AUG和用于脱离核糖体的终止密码子。这种载体可市售获得，或者可通过本领域已知方法(例如下文通常用于构建载体的方法)中描述的序列组装。
“在转录控制下”是本领域理解的术语，表示多核苷酸序列(通常为DNA序列)的转录依赖于其与有助于转录起始或启动转录的元件的有效连接。“有效连接的”指其中元件处于允许其有功能的排列方式的一种并列。
“基因传递载体”被定义为可将插入的多核苷酸携带入宿主细胞的任意分子。基因传递载体的实例为脂质体、生物可相容聚合物，包括天然聚合物和合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金属粒子；以及细菌或病毒，例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒；噬菌体；粘粒；质粒；真菌载体和本领域通常使用的其它重组载体，其已被描述为在各种真核和原核宿主中表达，可用于基因治疗以及简单蛋白表达。
本文使用的术语“基因传递”、“基因转移”、“转染”等是指将外源多核苷酸导入宿主细胞中，与用于导入的方法无关。转染指任意核酸传递入细胞内部。基因传递指可整合入宿主细胞基因组中的核酸传递，或可独立于宿主细胞基因组复制的核酸传递。基因传递或基因转移不是指将mRNA导入到细胞中。转染方法包括各种技术，例如电穿孔、蛋白型、脂质型和阳离子型核酸传递复合物、病毒载体、“基因枪”传递和本领域技术人员已知的各种其它技术。导入的多核苷酸可在宿主细胞中稳定保持，或可瞬时表达。在优选实施方案中，将mRNA导入到DC中并瞬时表达。稳定保持通常要求导入的多核苷酸或者含与宿主细胞相匹配的复制起点，或者整合入宿主细胞复制子中，所述宿主细胞复制子例如为染色体外复制子(例如质粒)或核染色体或线粒体染色体。如本领域所知和本文描述，许多载体能够介导基因向哺乳动物细胞的转移。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其含要体内、活体外或试管中导入宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、α病毒载体等。α病毒载体例如为塞姆利基森林病毒型载体和新培斯病毒型载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见Schlesinger和Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5：434-439和Zaks等(1999)Nat.Med.7：823-827。在基因转移由逆转录病毒载体介导的情况下，病毒构建物指含逆转录病毒基因组或其部分和治疗基因的多核苷酸。本文使用的“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同含义，指借助于进入细胞并将其基因组整合入宿主细胞基因组中的病毒，将基因或核酸序列稳定转移入宿主细胞中的方法。病毒可通过其正常的感染机制进入宿主细胞中，或被修饰，使得其结合不同的宿主细胞表面受体或配体，以进入细胞。本文使用的“逆转录病毒载体”指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸导入细胞中的病毒颗粒。
逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；但是，一旦病毒感染细胞，RNA就逆转录为DNA形式，其整合入感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式叫做前病毒。
在基因转移由DNA病毒载体(例如腺病毒(Ad)、假腺病毒或腺相关病毒(MV))介导的情况下，载体构建物指含病毒基因组或其部分和转基因的多核苷酸。腺病毒(Ad)是相对充分表征的同种病毒群，包括50个以上的血清型。(参见例如WO 95/27071)。Ad易于培养，不需要整合入宿主细胞基因组中。还已构建了重组Ad源载体，具体地说是降低了野生型病毒的重组和产生潜力的载体。(参见WO 95/00655和WO 95/11984)。野生型MV具有整合入宿主细胞基因组的高度感染性和特异性。(参见Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470和Lebkowski等(1988)Mol.Cell.Biol.8：3988-3996)。
含启动子和多核苷酸可有效连接其中的克隆位点两者的载体是本领域已知的。这种载体能体外或体内转录RNA，可由例如Stratagene(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)的来源市售。为了优化表达和/或体外转录，可能必须去除、添加或改变克隆的5′和/或3′非翻译部分，以消除外部的、潜在不合适的替代翻译起始密码子或可在转录或翻译水平上干扰或降低表达的其它序列。或者，可紧接着起始密码子的5′插入共有核糖体结合位点，以增强表达。
基因传递载体还包括几种非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物和靶病毒蛋白-DNA复合物。可在本发明方法中使用还含有靶向抗体或其片段的脂质体。为增强向细胞的传递，本发明的核酸或蛋白可缀合至结合细胞表面抗原的抗体或其结合片段，所述抗原例如TCR、CD3或CD4。
“杂交”指其中一个或多个多核苷酸反应以形成复合物的反应，所述复合物经核苷酸残基的碱基之间的氢键键合稳定。氢键键合可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任意其它序列特异性方式发生。所述复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的3条或更多条链、单条自杂交链或其任意组合。杂交反应可构成更大规模方法中的一个步骤，例如启动PCR反应或通过核酶酶裂解多核苷酸。
严格杂交条件如下：含目标核酸的滤膜于65℃在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA组成的缓冲液中进行8小时至过夜的预杂交。滤膜于65℃的优选杂交温度在预温育混合物中杂交48小时，所述预温育混合物含100μg/ml变性鲑精DNA和5-20×106cpm 32P-标记探针。随后，滤膜在含2×SSC、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中于37℃进行1小时的漂洗，接着在0.1×SSC中于50℃进行45分钟漂洗。在漂洗步骤后，可通过放射自显影检测杂交探针。这些方法在本领域众所周知，列举于Sambrook等，1989；和Ausubel等，1989。
与另一个序列具有一定百分率(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)指在比对时，在比较的这两个序列中该百分率的碱基(或氨基酸)相同。使用众所周知的BLAST比对程序和默认参数测定该比对和同源性或序列同一性百分率。替代程序是使用以下默认参数的BLASTN和BLASTP：遗传密码＝链；过滤器＝无；链＝双链；截断值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分类＝高分值；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详述可见于以下全球网地址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
术语“分离的”指由其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段一般天然结合的组分、细胞等分离。例如，就多核苷酸而言，分离的多核苷酸与一般在染色体中与其结合的5′和3′序列分离。对本领域技术人员显而易见的是，非天然多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不需要“分离”来辨别其与其天然对应物。另外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段可与其天然对应物区分，因为“浓缩的”每体积的分子浓度或数量大于其天然对应物，“分离的”每体积的分子浓度或数量少于其天然对应物。一级序列或其它特征例如糖基化模式与其天然对应物不同的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体或其片段不需要以其分离形式存在，因为其可通过一级序列或者其它特征如糖基化模式与其天然对应物区分。尽管未明确指出本文公开的各个发明，但要理解的是，本发明提供了下文公开的并处于合适条件下的各组合物的所有上述实施方案。因此，提供非天然多核苷酸，作为与分离的天然多核苷酸分开的实施方案。提供在细菌细胞中生产的蛋白，作为与由真核细胞分离的天然蛋白分开的实施方案，所述天然蛋白在所述真核细胞天然产生。如果哺乳动物细胞如树突细胞由其在生物中存在的解剖学部位取出，则其是分离的。
“宿主细胞”、“靶细胞”或“受体细胞”包括可为或已为载体接受者或掺入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白的任意单个细胞或细胞培养物。还期望包括单个细胞的子代，所述子代由于天然、偶然或有意的突变而(在形态学或基因组或总DNA互补物上)不必与原始亲本细胞完全相同。所述细胞可为原核或真核细胞，包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，例如鼠、大鼠、猿或人细胞。
“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人、家畜、竞技动物和宠物。
“对照”是为对比目的而在实验中使用的替代受试者或样品。对照可为“阳性”或“阴性”。例如，在实验目的是确定免疫应答与特定培养条件的关联的情况下，一般优选使用阳性对照和阴性对照。
所述“癌症”指表现出相对自主生长的细胞的异常存在，使得癌细胞具有特征为细胞增殖控制显著丧失的异常生长表型。癌细胞可为良性的或恶性的。在不同实施方案中，癌症侵袭膀胱、血、脑、乳房、结肠、消化道、肺、卵巢、胰腺、前列腺或皮肤的细胞。本文使用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括源自癌细胞祖先的任意细胞。这些细胞包括转移癌细胞以及源于癌细胞的体外培养物和细胞系。癌症包括但不限于实体瘤、液体瘤、血液恶性肿瘤、肾细胞癌、黑素瘤、乳癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫颈癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝细胞瘤、腺瘤、肉瘤、恶性肿瘤、母细胞瘤等。当指一般表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤可基于肿瘤团块检测；例如通过CAT扫描、磁共振成像(MRI)、X射线、超声或触诊之类的方法。单独的生物化学或免疫学观察结果可能不足以满足此定义。
术语“培养”指细胞的体外保持、分化和/或增殖或在合适的培养基中。所述“富集的”指组合物所包含细胞占总细胞的百分率大于所述细胞在生物中所存在组织中发现的占总细胞的百分率。例如，由本发明方法制备的CD83+CCR7-DC和CD83+CCR7+DC的富集培养物和制备物与其在生物中所存在组织(例如血液、皮肤、淋巴结等)中的百分率相比，以较高的总细胞百分率存在。
“组合物”指活性成分与另一种惰性(例如可检测物质或标记)或活性化合物或组合物(例如佐剂)的组合。
“药物组合物”包括活性成分与惰性或活性载体的组合，使得所述组合物适于试管内、体内或活体外的诊断或治疗用途。
本文使用的术语“药物可接受载体”包括任何标准药用载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水和乳浊液，例如油/水或水/油乳浊液，以及各种类型的润湿剂。所述组合物还可包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的实例参见Martin REMINGTON′S PHARM.SCL，第18版，(Mack Publ.Co.，Easton(1990))。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量，所述结果例如为增强的免疫应答、病症(疾病、感染等)的治疗、预防或改善。有效量可以一次或多次给予、施用或剂量来给予。合适的剂量根据体重、年龄、健康情况、待治疗的疾病或病症以及给予途径而有所变化。
本文使用的“传导信号”指使不成熟或成熟树突细胞与IFN-γ受体激动剂、TNF-α受体激动剂、CD40L多肽或其它CD40激动剂接触。在一个实施方案中，这种激动剂外部提供，(例如在细胞培养基中)。在另一个实施方案中，所述多肽激动剂通过用多肽编码核酸转染不成熟或成熟树突细胞提供。或者，核酸适体激动剂可在培养基中提供或通过转染提供。在通过用多肽编码核酸转染树突细胞提供多肽的情况下，在多肽编码mRNA的翻译时产生信号传导，而不是在用核酸转染时产生信号传导。在一个方面，本发明提供制备成熟树突细胞(DC)富集群的方法，所述富集群在体内和/或体外诱导有效的免疫刺激应答。本文使用的术语“成熟树突细胞”指和不成熟DC(iDC)相比表现出共刺激分子CD83的细胞表面表达提升的树突细胞。本发明的成熟DC既包括CD83+CCR7-DC，也包括CD83+CCR7+DC。第二信号CD40激动剂可给予不成熟CD83-CCR7-DC或给予CD83+CCR7-成熟DC。
文献(Schaft 2005，Bonehill 2004)提示，成熟后用抗原编码RNA电穿孔DC产生具有较大免疫应答激发效力的DC。因此，通过改变CD40L传导信号给CD83+CCR7-成熟DC(表型成熟后)的时间，开发改变‘基于CD40L的方法’的方法(CD83-iDC的序贯IFN-γ传导信号和CD40L传导信号)。在此实施方案中，首先通过向培养基中加入‘炎性介导物’IFN-γ和TNF-α以及任选的PGE2表型成熟DC，然后在约12-30小时(优选约18小时)后用CD40L mRNA和任选的抗原编码mRNA电穿孔。此新方法称为‘PME-CD40L’，即成熟后用CD40L电穿孔，以产生CD83+CCR7+成熟DC。在电穿孔后4小时收集细胞并配制为疫苗，所述细胞在体外实验中显示介导最大的免疫效力(参见实施例)。现在为进一步增强，可用NKT细胞的活化配体即α-半乳糖苷神经酰胺脉冲DC，以便为免疫应答募集此效应细胞群。NKT细胞表现出T辅助细胞和T-细胞毒性细胞两者的方面：NKT细胞可分泌IFN-γ，呈现CD40L，并可分泌颗粒酶B，后者在靶细胞中诱导凋亡。因此，NKT细胞募集可依靠另外的NKT细胞CD40L/DC-CD40相互作用导致DC功能增强，或通过分泌辅助细胞因子和/或促进对靶细胞的直接裂解作用增大细胞介导的免疫应答。
在序贯地用第一信号(IFN-γ受体激动剂和/或TNF-α受体激动剂)传导信号给iDC以及第二信号(CD40激动剂)传导信号给CD83-CCR7-iDC或CD83+CCR7-成熟DC后，产生的DC表现出(i)共刺激分子CD80、CD83和CD86的细胞表面表达提升，ii)为CCR7+，和iii)分泌IL-12p70多肽或蛋白，和/或分泌水平显著降低(0-500pg/106DC)的IL-10。在优选实施方案中，本发明的成熟CD83+CCR7+DC产生至少1000pg IL-12/106DC，优选至少2000、3000、4000、5000或6000pg IL-12/106DC，更优选至少7000、8000、9000或10,000pgIL-12/106DC，最优选至少12,000、15,000、17,000或20,000pg IL-12/106DC。IL-10和IL-12水平可通过培养上清液的ELSIA测定，培养上清液在由不成熟DC诱导DC成熟后达36小时时收集。Wierda等(2000)Blood 96：2917。Ajdary等(2000)Infection and Immunity 68：1760。
不成熟DC可由含DC前体细胞的合适组织源分离或制备，并体外分化，以产生不成熟DC。例如，合适的组织源可为以下的一种或多种：骨髓细胞、外周血祖细胞(PBPC)、外周血干细胞(PBSC)和脐血细胞。优选地，所述组织源为外周血单核细胞(PBMC)。组织源可为新鲜地或冷冻的。在另一方面，用促进非干细胞或祖细胞生长和分化的有效量生长因子预处理细胞或组织源，其随后更易于与目标细胞分离。这些方法是本领域已知的，简述于Romani等(1994)Exp.Med.180：83和Caux，C.等(1996)Exp.Med.184：695。在一方面，不成熟DC分离自外周血单核细胞(PBMC)。在一个优选实施方案中，在有或没有白介素4(IL-4)和/或IL-13的情况下用有效量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理PBMC，以使PBMC分化为不成熟DC。最优选在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC约4-7天，优选约5-6天，以产生不成熟DC。在优选实施方案中，第一信号在第4、5、6或7天给予，最优选在第5或6天给予。另外，在第一次和/或第二次传导信号时GM-CSF以及IL-4和/或IL-13可存在于培养基中。
为增加动物(包括人)中树突前体细胞的量，人们可用刺激血细胞生成的物质预处理受试者。这种物质包括但不限于G-CSF和GM-CSF。本领域技术人员可通过监测要给予造血因子的个体的细胞分化确定要给予的造血因子量。通常，例如G-CSF和GM-CSF的因子的剂量类似于由细胞毒性剂治疗康复的个体治疗使用的剂量。作为实例，GM-CSF或G-CSF可以标准剂量给予4-7天，之后去除源组织，以增加树突细胞前体的比例。美国专利第6,475,483号教导，5-13天内每天300μg的G-CSF剂量和4-19天内每天400μg的GM-CSF剂量产生显著收率的树突细胞。
本发明方法产生为有效免疫刺激剂的成熟CD83+CCR7+树突细胞富集群。具体地说，本发明提供一种制备成熟树突细胞(DC)的方法，其包括以下的顺序步骤：(a)用含干扰素γ受体(IFN-γR)激动剂和任选TNF-αR激动剂的第一信号传导信号给分离的不成熟树突细胞(iDC)，以产生IFN-γR激动剂已传导信号的树突细胞；和(b)用含有效量的CD40激动剂的第二瞬时信号传导信号给所述IFN-γR激动剂已传导信号的树突细胞，以产生CCR7+成熟树突细胞。本发明进一步提供CD83+CCR7-成熟DC和CD83+CCR7+成熟DC。在优选实施方案中，本发明的CD83+CCR7+成熟DC和/或CD83+CCR7-成熟DC瞬时表达CD40L多肽。优选地，CD40L主要位于胞内，而不在细胞表面上。最优选至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的CD40L多肽位于胞内。
在一个替代实施方案中，用有效量的TNF-α受体激动剂传导信号给成熟树突细胞，接着用CD40激动剂传导信号。因此，本发明提供一种制备成熟树突细胞(DC)的方法，其包括序贯地用含肿瘤坏死因子α受体(TNF-αR)激动剂的第一信号后接含CD40激动剂的第二信号传导信号给分离的不成熟树突细胞，其中所述传导信号处于没有有效量的IL-1β和/或IL-6的状态下。
对任一个实施方案(IFN-γR激动剂或TNF-αR激动剂作为第一信号)，CD40激动剂第二信号都可给予CD83-CCR7-iDC或给予CD83+CCR7-成熟DC。在一个优选实施方案中，不成熟DC和/或成熟DC与PGE2接触。优选细胞在其接受第一信号(IFN-γR激动剂或TNF-αR激动剂)大约相同的时间接触PGE2。在优选实施方案中，在树突细胞接受第一和第二信号时GM-CSF与IL-4或IL-13中的至少一种存在于培养基中。在再一个实施方案中，所述方法还包括使不成熟树突细胞、已传导信号的树突细胞和/或CCR7+树突细胞与NKT细胞配体接触，所述NKT细胞配体可活化CD1d-限制性的NKT细胞，并因此加强先天和过继免疫。在优选实施方案中，NKT细胞配体是选自以下的化合物：α-半乳糖苷神经酰胺、α-葡糖基神经酰胺、α-6-脱氧半乳糖苷神经酰胺、α-6-脱氧呋喃半乳糖苷神经酰胺、β-6-脱氧呋喃半乳糖苷神经酰胺、β-阿拉伯糖基神经酰胺、α-C-半乳糖苷神经酰胺和α-S-半乳糖苷神经酰胺。一个优选化合物是称为KRN7000((2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇)的α-半乳糖苷神经酰胺。
公开于日本专利3068910的Agelasphin是一类最初在海绵中发现的化合物，其具有α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)结构以及免疫刺激和抗肿瘤活性。KRN7000是Agelasphin的有效合成类似物，公开于U.S.5,767,092，其内容通过引用结合到本文中。其它有用的Agelasphin类似物公开于U.S.5,936,076，其内容通过引用结合到本文中。以下显示了KRN7000结构：
Figure G05833740420070405D000281
KRN7000的糖基神经酰胺类似物(例如α-半乳糖苷神经酰胺、α-葡糖基神经酰胺、α-6-脱氧半乳糖苷神经酰胺、α-6-脱氧呋喃半乳糖苷神经酰胺、β-6-脱氧呋喃半乳糖苷神经酰胺、β-阿拉伯糖基神经酰胺)公开于U.S.5,849,716，其内容通过引用结合到本文中。其内容通过引用结合到本文中的U.S.5,780,441公开了KRN7000的寡糖(二糖-、三糖-、四糖-五糖-)衍生物。使用KRN7000和相关类似物生产KRN7000抗原载荷DC和活化人NKT细胞的方法公开于U.S.Ser.No.09/721,768和U.S.6,531,453，其各自的内容均通过引用具体地结合到本文中。
其内容通过引用结合到本文中的U.S.5,936,076公开了由下式表示的α-半乳糖苷神经酰胺化合物：
Figure G05833740420070405D000282
其中脂肪酸链R代表：
Figure G05833740420070405D000283
其中R2代表H或OH，X表示0-26的整数，或R代表-(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3，
R1代表由以下(a)-(e)定义的取代基中的任一个：
(a)-CH2(CH2)YCH3
(b)-CH(OH)(CH2)YCH3
(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2
(d)-CH＝CH(CH2)YCH
(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3
其中Y表示5-17的整数。
内容通过引用结合到本文中的WO 03/105769、U.S.2004/0127429和Shimieg J.等，(2003)J.Exp.Med.198：1631-1641公开了α-C-糖脂的结构，其中α-糖基神经酰胺(例如α-半乳糖苷神经酰胺和α-葡糖基神经酰胺)糖苷键上的氧原子被碳原子代替。以下显示了代表性化合物的结构。
其内容通过引用结合到本文中的WO 03/016326公开了KRN7000类似物，其具有截短的神经酰胺，例如具有以下结构的“C4”或“OCH”：
其内容通过引用结合到本文中的U.S.6,635,622公开了α-C-、N或S-糖脂，其中半乳糖苷神经酰胺糖苷键上的氧原子被-(CH2)a-CH＝CH-(CH2)a′-、-(CH2)a-S(O)0-2-CH2-或-NHCH2-代替，其中a和a′均表示0-5的整数，a+a′为5或以下。
在优选实施方案中，IFN-γR激动剂是IFNγ或其生物活性片段。IFNγ优选为哺乳动物IFNγ，最优选为人IFNγ。人IFNγ的cDNA和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：5和6。IFNγ优选具有示于SEQ IDNO：6的序列或其片段。在一个实施方案中，IFN-γR包含与SEQ IDNO：6具有至少80％序列同一性的多肽。优选IFN-γR激动剂与SEQ IDNO：6具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。测试IFN-γR激动剂活性的方法是本领域技术人员已知的，下文描述了其中一些方法。通过将IFN-γR激动剂加入培养基或通过在树突细胞中表达IFN-γR激动剂，可传导信号给不成熟DC。在一个实施方案中，用编码IFN-γR激动剂的mRNA(例如SEQ ID NO：6)或其生物活性片段转染DC。然后传导信号应当在mRNA于树突细胞中翻译时发生。最优选将IFN-γR激动剂加入到含不成熟DC的培养基中。在一个优选实施方案中，所述培养基还包含PGE2和/或GM-CSF加上IL-4或IL-13。
IFN-γ受体具有两个亚单位：配体结合链(也称为α链)IFN-γR1和信号转导链(也称为β链或辅助因子1)IFN-γR2。这些蛋白由位于不同染色体上的单独基因(分别为IFNGR1和IFNGR2)编码。由于配体结合(或α)链与IFN-γ相互作用，其二聚化并变成与两条信号转导(或β)链结合。受体组装导致Janus激酶JAK1和JAK2活化以及IFN-γR1胞内结构域上的酪氨酸残基磷酸化。这导致STAT1(即‘转录的信号转导物和活化物’)募集和磷酸化，其形成同二聚体并转运至核，以活化大范围的IFN-γ响应性基因。在传导信号后，配体结合链内化并解离。所述链随后再循环至细胞表面。Bach等(1997)Ann.Rev.Immunol.15，563-591；和Lammas，Casanova和Kumararatne(2000)ClinExp Immunol 121，417-425。已使用多波长反常衍射法以2.9分辨率测定了人IFN-γ与IFN-γRα可溶性糖基化胞外部分(sIFN-γRα)的复合物的晶体结构。Thiel等Structure 8：927-936(2000)。
在一个测定中，INF-γ受体激动剂，例如IFN-γ，以时间和浓度依赖性方式降低人小肠上皮Caco-2细胞中的Na+-K+-ATP酶活性。Na+-K+-ATP酶活性可依据总ATP酶和乌本苷敏感ATP酶之间的差异测定。用IFN-γ处理明显增加总STAT1和磷酸STAT1的表达，这伴随着p38MAPK的活化。p38MAP激酶活性可通过使用p38MAP激酶检测试剂盒的蛋白质印迹分析。使用PhosphoPlus
Figure G05833740420070405D000311
Stati检测总STAT1蛋白水平和磷酸化STAT1蛋白水平。由IFN-γ运转的转导机制涉及PKC下游STAT1磷酸化和Raf-1、MEK、ERK2和p38MAPK途径的活化。参见Magro等，Br J Pharmacol高级在线出版物，2004年7月16日；doi：10.1038/sj.bjp.0705895，其内容通过引用结合到本文中。
为阐述目的，可通过使细胞分别与IFN-γ多肽和/或蛋白和/或TNF-α多肽或蛋白和/或CD40激动剂直接接触，提供用IFN-γ受体激动剂、TNF-α受体激动剂和/或CD40激动剂进行的传导信号。或者，用IFN-γR激动剂、TNF-αR激动剂或CD40激动剂向细胞传导信号可在编码所述多肽或蛋白的mRNA于树突细胞中翻译时发生。因此，传导信号在IFN-γR激动剂、TNF-αR激动剂和CD40激动剂多肽和/或蛋白表达时发生。
用于本发明方法的第二信号是采用CD40激动剂的瞬时信号。CD40激动剂多肽的持续表达，例如Koya等，出处同上所述的慢病毒载体组成型表达CD40L，不被看作是瞬时表达。如果含CD40激动剂的培养基由DC中去除，或者如果DC载荷编码CD40激动剂的mRNA，则可将信号看作瞬时的。如果用编码CD40激动剂的表达载体载荷/转染DC，则CD40激动剂信号也被看作是瞬时的，前提是以下的任一项：1)驱动CD40激动剂表达的启动子在DC中不是组成型的；或2)所述表达载体不整合入DC基因组中或不在DC中复制。
在优选实施方案中，CD40激动剂是CD40L多肽或CD40激动性抗体。一般来说，结合CD40的配体可用作CD40激动剂。申请人已证实，通过用CD40L mRNA转染不成熟或成熟DC给予细胞含CD40L的第二信号，随后产生诱导免疫刺激应答而不是免疫抑制的修饰DC。在一个实施方案中，在CD40L mRNA转染后和翻译前，立即将CD40L mRNA转染的树突细胞在含IFNγ(优选还有PGE2)的培养基中培养，以产生有效量的CD40L信号。在该实施方案中，尽管在用CD40L mRNA转染后加入IFNγ，但树突细胞在CD40L mRNA翻译时产生的信号之前接受IFNγ信号。因此，所述物质传递至细胞的顺序的重要性仅在于CD40L传导信号必须在IFN-γ传导信号之后发生。如下文更详细地描述，向DC传导信号可在体内或活体外发生，或者一个或多个步骤可在活体外发生，该方法的剩余步骤可在体内发生。
在一个实施方案中，CD40激动剂是结合CD40的适体。同样，IFN-γ和TNF-α可由具有相似生物活性的适体、抗体等取代。最优选CD40激动剂作为编码CD40L的mRNA传递。
本文使用的“CD40配体”(CD40L)应当包括特异性识别和活化CD40受体并活化其生物活性的任意多肽或蛋白。该术语包括跨膜和可溶形式的CD40L。在优选实施方案中，CD40激动剂是哺乳动物CD40L，优选人CD40L。人和小鼠cDNA和蛋白的比对分别示于图16和17。人CD40L cDNA和对应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。CD40L的可读框由SEQ ID NO.1的核苷酸40-822代表，而TGA终止密码子在位置823-825。在本发明方法中还使用截短的CD40L(SEQ ID NO：2的残基47-261，由SEQ ID NO：1的核苷酸残基178-825编码)和由SEQ ID NO：1的核苷酸43-825、SEQ ID NO：1的核苷酸181-825、SEQ ID NO：1的核苷酸193-825、SEQ ID NO：1的核苷酸376-825、SEQ ID NO：1的核苷酸379-825以及SEQ ID NO：1的核苷酸400-825编码的CD40L片段。在优选实施方案中，CD40L多肽选自：a)含SEQ ID NO：2的多肽；b)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基47-261的多肽；c)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基51-261的多肽；d)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基120-261的多肽；e)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基113-261的多肽；f)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基112-261的多肽；g)含SEQ ID NO：10的多肽；h)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-261的多肽；i)含SEQ D NO：2的氨基酸残基34-225的多肽；j)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基113-225的多肽；k)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基120-225的多肽；和l)(a)-(k)中任一项的多肽的片段，其中所述片段结合CD40。
CD40L多肽优选由含选自以下的多核苷酸的mRNA编码：a)SEQID NO：1的多核苷酸；b)含SEQ ID NO：1的核苷酸40-822的多核苷酸；c)含SEQ ID NO：1的核苷酸178-822的多核苷酸；d)含SEQ ID NO：1的核苷酸190-822的多核苷酸；e)含SEQ ID NO：1的核苷酸397-822的多核苷酸；f)含SEQ ID NO：1的核苷酸376-822的多核苷酸；g)SEQID NO：9的多核苷酸；h)SEQ ID NO：13的多核苷酸；i)与(a)-(h)中的任何多核苷酸具有至少80％序列同一性的多核苷酸；j)在严格条件下与(a)-(h)中的任何多核苷酸杂交的多核苷酸；和k)(a)-(j)的多核苷酸，其还包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17或18的核酸的3′非翻译序列和/或选自SEQ ID NO：19、20、21、22或23的核酸的5′非翻译序列。
或者，CD40L多肽为与选自以下的多肽具有至少77％序列同一性的多肽：a)含SEQ ID NO：2的多肽；b)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基47-261的多肽；c)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基51-261的多肽；d)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基120-261的多肽；e)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基113-261的多肽；f)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基112-261的多肽；g)含SEQ ID NO：10的多肽；h)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基35-261的多肽；i)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-225的多肽；j)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基113-225的多肽；k)含SEQ ID NO：2的氨基酸残基120-225的多肽；和l)(a)-(k)中任一项的多肽的片段，其中所述片段结合CD40。
CD40首先被表征为在B淋巴细胞上表达的受体。Schonbeck和Libby(2001)Cell Mol.Life Sci.58：4。后来发现B细胞CD40与在活化T细胞上表达的CD40L的衔接对T细胞依赖性的B细胞活化(即增殖、免疫球蛋白分泌和类别转换)是必须的。随后揭示，功能性CD40在B细胞以外的各种细胞类型上表达，包括造血祖细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、角质细胞、成纤维细胞和癌细胞。Schonbeck和Libby(2001)，出处同上。
CD40配体在1993年克隆，报道于Gauchat等(1993)FEBS Lett.315：259。Graf等将其作图至染色体Xq26.3-q27.1(Graf等(992)Eur.J.Immunol.22：3191-3194)。业已描述了细胞结合的、全长39kDa形式的CD40配体的较短可溶形式，其具有33和18kDa分子量。Graf等(1995)Eur.J.Immunol.25：1749；Ludewig等(1996)Eur.J.Immunol.26：3137；Wykes等(1998)Eur.J.Immunol.28：548。18kDa可溶形式经胞内蛋白酶剪切产生，其没有胞质尾、跨膜区和部分胞外结构域，但保留了保持CD40受体结合能力的CD40结合结构域，因此是CD40受体信号剂的实例。Graf等(1995)，出处同上。
美国专利第5,981,724号公开了编码人CD40配体(CD40L)的DNA序列以及载体和用于生产CD40L多肽的转化宿主细胞。美国专利第5,962,406号公开了编码可溶形式的人CD40L的DNA序列。
CD40L的哺乳动物同系物的代表性序列具有以下Genbank检索号：NM_204733(鸡(Gallus gallus))；DQ054533(绵羊(Ovis aries))；Z48469(牛(Bos taurus))；AY333790(狗(Canis familiaris))；豚尾猴(Macaca nemestrina))；AF344844(普通白耳狨猴(Callithrix jacchus))；AF34481(乌黑白眉猴(Cercicebus torquatus atys))；AF344860(夜猴(Aotus trivirgatus))；AF344859(猕猴(Macaca mulatta))；AF116582(挪威大鼠(Rattus nevegicus))；和AF079105(猫(Felus catus))。
CD40受体还可通过使用CD40激动剂抗体、其抗体片段、衍生物和变体活化。CD40激动剂抗体可由供应商处购买，例如Mabtech(Nacka，Sweden)。下文也提供了产生这些物质的实例和方法。文献还提供了CD40激动剂抗体和抗体片段的实例。参见例如Osada等(2002)25(2)：176和Ledbetter，J.A.等(1997)Crit.Reviews in Immunol.17：427。
如上所述，具有CD40L生物活性的物质可为由编码CD40L的外源多核苷酸(mRNA或DNA)翻译的多肽。例如，CD40L mRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列。或者，用有效量的CD40L蛋白和/或多肽(例如具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列的蛋白和/或多肽)向细胞传导信号。修饰的CD40L也可用于本发明方法。例如，CD40L包括已通过保守或非保守地添加、削减或置换任意数目的氨基酸改变的分子，前提是产生的蛋白结合DC表面上的CD40。“保守改变”是产生类似的电荷密度、亲水性或疏水性、大小和/或构型的替代氨基酸(例如Val替代Ile)的改变。相比之下，“非保守改变”是产生不同的电荷密度、亲水性或疏水性、大小和/或构型的替代氨基酸(例如Val替代Phe)的改变。产生这种修饰的方法在本领域众所周知，还可通过市售试剂盒和载体(例如可得自New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly，Mass.；Clontech，Palo Alto，Calif.)实现。
当所述物质作为编码所述物质的多核苷酸或基因传递时，可通过本领域已知的任意方法复制有效量的多核苷酸。PCR技术是一种复制DNA的方法，是美国专利第4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202号的主题，描述于PCR：THE POLYMERASE CHAINREACTION(Mullis等编辑，Birkhauser Press，Boston(1994))和其中提及的参考文献。下文提供了产生多核苷酸的其它方法。
在本发明的实施方案中，其中用TNF-α受体激动剂刺激不成熟树突细胞，接着用CD40激动剂刺激，在没有有效量的白介素1β(IL-1β)和/或白介素6(IL-6)的情况下实施所述方法。检测蛋白如IL-1β和IL-6的存在情况的方法是本领域已知的。
当所述方法的目标已满足时，本领域技术人员可通过由所述群中取样DC细胞或小群，测定表达CD40L mRNA和/或CD40L多肽的成熟DC的存在情况。在再一方面，本发明的成熟CD83+CCR7+DC表达白介素12(IL-12)p35蛋白。在又一方面，成熟CD83+CCR7+DC表达IL-12p70蛋白和/或表达有限的IL-10(不超过500pg/ml/106DC)。
所述方法的步骤可体内或活体外实施。当活体外实施时，所述方法可在开放型或封闭型系统中实施。培养和富集细胞群的方法和系统是本领域已知的。参见例如美国专利公开第2004/0072347号的实施例1和2。另参见美国专利公开第2003/0235908号，其描述了用于细胞扩增的封闭型系统。
在本发明的再一方面，通过增加将有效量的抗原传递至不成熟或成熟DC修改上述方法，其中所述抗原随后被成熟DC加工和提呈。因此，本发明方法还包括将一种或多种抗原或编码一种或多种抗原的多核苷酸导入到iDC、已传导信号的DC或CCR7+成熟DC中，以产生载荷抗原的CCR7+成熟DC。可在所述第一信号之前导入抗原或编码抗原的多核苷酸。或者，在所述第一信号之后和所述第二信号之前传递抗原或编码抗原的多核苷酸。在另一个实施方案中，在所述第二信号之后或基本与所述第二信号同时传递抗原或多核苷酸。
例如，抗原包括但不限于病原体、病原体裂解物、病原体提取物、病原体多肽、病毒颗粒、细菌、蛋白、多肽、癌细胞、癌细胞裂解物、癌细胞提取物、癌细胞特异性多肽。抗原可天然产生或重组产生。可使用下文简述的本领域已知方法将作为多肽、蛋白或作为核酸的免疫原传递给细胞。优选地，可将编码一种或多种抗原的一种或多种多核苷酸导入到iDC、已传导信号的DC或CCR7+成熟DC中。可通过本领域技术人员已知的方法将多核苷酸导入到DC中。在一个优选实施方案中，通过电穿孔导入多核苷酸。最优选所述多核苷酸为mRNA。在优选实施方案中，抗原或编码抗原的mRNA与编码CD40激动剂的mRNA一起或与CD40激动剂传导信号基本同时导入。
可通过使细胞与有效量的细胞因子或共刺激分子(例如GM-CSF、IL-4和PGE2)接触进一步修改所述方法。在其中用TNFαR激动剂向不成熟DC传导信号接着用CD40激动剂传导信号的实施方案中，有效量的IL-1β和/或IL-6明确地被排除在培养基外。
抗原可以其“天然”形式传递，即无人为干预涉及抗原制备或诱导抗原进入其与APC相遇的环境。或者或另外，抗原可包括粗制品，例如通常在常规微量过敏源注射剂(allergy shot)或在肿瘤裂解物中给予的粗制品类型。或者可大致纯化抗原，例如至少约90％纯。
当抗原为肽时，其例如可通过蛋白酶剪切分离蛋白产生。可利用任何各种裂解剂，包括但不限于胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。或者，肽可化学合成，优选在例如可由本领域获得的自动化合成仪上化学合成。另外，可使用重组技术产生编码目标肽的核酸并在期望条件下表达该肽。
或者，抗原可具有与任何天然化合物不同的结构。在本发明的某些实施方案中，抗原为“修饰的抗原”，即抗原具有与天然抗原基本相同的结构，但包含与天然化合物准确结构的一个或多个差异。例如，当天然抗原为蛋白或多肽抗原时，与该蛋白或多肽抗原相比，修饰的抗原应具有与天然抗原氨基酸序列不同的氨基酸序列，不同之处在于添加、置换或缺失一个或多个氨基酸，和/或应包括与天然抗原的对应氨基酸不同的一个或多个氨基酸，其不同之处在于添加、置换或缺失一个或多个共价连接至氨基酸的化学部分。在一个方面，天然和修饰的抗原共有至少一个有至少5个氨基酸的区，所述5个氨基酸至少约75％相同。本领域一般技术人员会认识到，在对比两个氨基酸序列以测定其同一性程度时，相同氨基酸段(即至少两个氨基酸的区域)之间的间隔不必总是被精确保持。天然和修饰的蛋白或多肽抗原可在至少一个有至少5个氨基酸的区的氨基酸序列中表现出至少约80％同一性，更可选85％、90％、95％或99％以上的同一性。通常其可用于更长的氨基酸序列区(例如10、20、50或100或更多个氨基酸)，以表现出指定的同一性程度。
在优选实施方案中，抗原作为编码该抗原的多核苷酸或基因传递，以便基因表达导致在受治疗个体(体内传递时)或细胞培养系统(体外传递时)中产生抗原。产生核酸(包括可表达基因)和将这种核酸导入表达系统(其中将产生可表达基因编码的任何蛋白)的技术是本领域已知的，简述于下文。优选将编码抗原的mRNA导入DC中。
在一个实施方案中，免疫原在所述第一信号之前传递，其中第一信号为IFNγR激动剂或TNF-αR。或者，免疫原在所述第一信号之后和所述第二信号之前给予，或者免疫原在所述第二信号之后传递。在另一个实施方案中，免疫原与所述第二信号基本同时传递。
在任意具体组合物或应用中使用的抗原量取决于具体抗原和其要应用的用途的性质，本领域技术人员易于知晓。
载荷抗原的树突细胞用于产生针对抗原的免疫应答。因此，在一方面，本发明提供一种在受试者中产生免疫应答的方法，其包括给予受试者有效量的载荷免疫原的CCR7+成熟DC。载荷DC可为受试者同种异体的，或为受试者自体的。
本发明还提供刺激免疫效应细胞的方法，其包括在通过本发明方法生产的抗原载荷CCR7+成熟DC存在下培养所述细胞，以产生被刺激的免疫效应细胞。在另一个实施方案中，本发明提供在受试者中增强免疫性的方法，其包括给予受试者有效量的这种被刺激的免疫效应细胞。
在本发明的又一方面，将有效量的细胞因子和/或共刺激分子体外或体内传递至细胞或患者。这些物质可作为多肽、蛋白或作为其编码多核苷酸或基因传递。细胞因子、共刺激分子和趋化因子可作为不纯制品(例如表达细胞的内源或外源细胞因子基因的细胞分离物)或以“纯化的”形式提供。纯化制品优选至少约90％纯，或至少约95％纯，或再进一步至少约99％纯。或者，可提供编码细胞因子或诱导剂的基因，以便基因表达导致在待治疗个体或另一个表达系统(例如体外转录/翻译系统或宿主细胞)中产生细胞因子或诱导剂，由所述表达系统可获得表达的细胞因子或诱导剂，用于给予所述个体。
在细胞因子和抗原都要传递给个体的情况下，它们可一起或单独提供。当其作为多肽或蛋白传递时，它们可在相同的包囊装置中传递，或通过物理结合(例如共价键、氢键键合、疏水作用、范德华作用等)传递。在一个替代实施方案中，一起提供化合物，提供编码二者的基因。例如，编码二者的基因可作为相同核酸分子的一部分提供。在某些实施方案中，可制备该核酸分子，以便两种因子由单个连续多核苷酸表达为融合蛋白，在所述融合蛋白中细胞因子和抗原经肽键彼此共价连接。或者或另外，基因可连接至相同或等同的控制序列，以便在相同刺激物作用下两个基因在个体中表达。在不同条件下在不同宿主细胞中有活性的各种不同控制序列是本领域已知的。这些控制序列包括组成型控制序列、诱导型控制序列和阻抑型控制序列，可按照本发明使用，但是对其中基因表达时间需要额外控制的应用来说，特别优选诱导型或阻抑型序列。
本领域技术人员会认识到，给予细胞因子和/或抗原任选可与给予任意其它期望的免疫系统调节因子(例如佐剂或其它免疫调节化合物)组合。
抗原还可以编码抗原的多核苷酸或基因的形式传递。还可利用肽键将第一个多肽(例如第一个抗原)序列的一部分连接至第二个多肽(例如第二个抗原、信号序列、跨膜结构域、纯化处理等)序列的一部分来修饰抗原。本领域一般技术人员会认识到按照本发明使用的这种融合蛋白的多样性。重组技术还允许通过氨基酸序列的置换、缺失、添加或反转迅速修饰多肽或蛋白抗原的氨基酸序列。
在免疫原为抗原片段的情况下，其例如可通过蛋白酶剪切分离的蛋白产生。可使用任何各种裂解剂，包括但不限于胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。或者，肽可化学合成，优选在例如可由本领域获得的自动化合成仪上化学合成(参见例如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.，1984)。另外，可使用重组技术产生编码目标肽的核酸并在期望条件下(例如在宿主细胞中或在由其可易于纯化该肽的体外表达系统中)表达该肽。
在优选实施方案中，抗原来自癌细胞或病原体。优选地，肿瘤细胞为肾癌细胞、多发性骨髓瘤细胞或黑素瘤细胞。优选病原体为HIV和HCV。在优选实施方案中，抗原以分离自或源自肿瘤细胞或病原体的RNA形式传递至抗原提呈细胞。由任意细胞(例如肿瘤细胞或病原体细胞)提取的RNA的RT-PCR和体外转录的方法公开于共同待审的PCT/US05/32710和美国临时专利申请第60/525,076号，其内容通过引用结合到本文中。
按照本发明使用的抗原可为天然化合物，或者可具有与任意天然化合物不同的结构。在本发明的某些实施方案中，抗原是“修饰的抗原”，即所述抗原具有与天然抗原基本相同的结构，但包含与天然化合物准确结构的一个或多个差异。
本发明还提供通过本文描述的任何方法制备的成熟DC富集群。通过本发明方法制备的成熟DC具有增强的免疫刺激特征。在另一方面，本发明提供一种储存成熟DC富集群的方法，其包括使本发明的富集树突细胞群在合适的条件下与合适的冷冻防腐剂接触。
通过给予受试者有效量的富集细胞(例如DC、改良DC或驯化的免疫效应细胞)群，使用本文描述的组合物在所述受试者中产生免疫应答。所述细胞可为同种异体的或自体的。它们可给予受试者，以在受试者中产生或诱导免疫应答，包括给予受试者有效量的如上所述富集群。所述细胞可为同种异体的或自体的。它们还可在存在并消耗本发明成熟DC的情况下通过培养免疫效应细胞而用于驯化免疫效应细胞，例如T细胞。还可通过传递给受试者有效量的驯化效应细胞而使用这些细胞增强所述受试者中的免疫性。
产生和传递多核苷酸的方法
本发明的某些实施方案需要使用多核苷酸。它们可使用本领域已知的任意方法产生和复制，例如本领域技术人员可使用本文提供的序列和市售DNA合成仪复制DNA。或者，它们可如下获得：可通过提供多核苷酸的线性序列、合适的引物分子、例如酶的化学物质以及用于其复制的仪器，以正确的方向化学复制或连接核苷酸，以获得多核苷酸。在单独的实施方案中，这些多核苷酸进一步被分离。再进一步，本领域技术人员可将多核苷酸插入到合适的复制载体中，并将载体插入到适于复制和扩增的宿主细胞(原核细胞或真核细胞)中。如此扩增的DNA可通过本领域技术人员众所周知的方法由细胞中分离。本文进一步提供了通过此方法获得多核苷酸的方法以及如此获得的多核苷酸。
在一个实施方案中，所述物质(例如CD40L)作为mRNA传递。首先将DNA多核苷酸插入到合适的宿主细胞中，或优选通过体外转录，可获得RNA。可通过任意合适的方法，例如通过使用合适的基因传递载体(例如脂质体、质粒或载体)或通过电穿孔插入DNA。当细胞复制并将DNA转录为RNA时；随后可使用本领域技术人员众所周知的方法，例如在Sambrook等(1989)，出处同上中陈述的方法，分离RNA。例如，可使用各种裂解酶或化学溶液，按照在Sambrook等(1989)，出处同上中陈述的方法分离mRNA，或利用核酸结合树脂按照由生产商提供的附带说明提取mRNA。
在优选实施方案中，CD40L表达盒含适于体外转录的启动子，例如T7启动子或SP6启动子。优选为了翻译的稳定性和有效性优化体外转录的CD40L或CD40激动剂mRNA。例如，SEQ ID NO：13代表优化的CD40L mRNA，其中5′非翻译区中的ATG密码子已改变，以避免翻译的不正确起始。
mRNA稳定性和/或翻译效力还可通过在mRNA中包含3′UTR和/或5′UTR增加。3′UTR的优选实例包括人CD40、β-肌动蛋白和轮状病毒基因6的3′UTR。5′UTR的优选实例包括CD40L以及Hsp70、VEGF、脾坏死病毒RU5和烟草蚀纹病毒的5′UTR中的翻译增强子。
例如，CD40L表达一般部分受3′UTR介导的mRNA不稳定性调节，因此在现有CD40L mRNA不含大部分的CD40L 3′UTR。CD40L一般在DC中不表达。相反，CD40受体在DC中表达，在文献中没有证据表明其表达在转录后被调节，具体地说是在mRNA稳定性水平上被调节。在CD40L mRNA的3′末端或区域包含CD40受体3′UTR(SEQ ID NO：14或其活性片段)应产生与天然CD40信息相似的RNA 3′非翻译序列，没有赋予任何不需要的调节活性。
β-肌动蛋白是一种在人非肌肉细胞中丰量表达的基因。人β-肌动蛋白启动子已广泛用于驱动哺乳动物细胞系和转基因小鼠中的基因表达。业已表明，包含β-肌动蛋白3′UTR加上侧翼区进一步增加了含β-肌动蛋白启动子的基因表达构建物的mRNA累积水平。Qin和Gunning(1997)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 36，63-72页。SEQ ID NO：15代表人β-肌动蛋白3′UTR的最后一个外显子的非翻译区。SEQ ID NO：16显示了此3′UTR的最小区域。
猿轮状病毒基因6mRNA的3′UTR(SEQ ID NO：17)在其加帽的非聚腺苷酸化病毒转录物中起翻译增强子的功能。还已经表明，3′UTR在兔网织红细胞裂解物中增强异源报告基因mRNA的翻译。Yang等，2004 Archives of Virology 149：303-321。此3′UTR的最小功能元件示于SEQ ID NO：18。
已经表明，人hsp70基因的5′UTR(SEQ ID NO：19)在没有应激诱导的情况下增加报告基因mRNA的翻译，未显著影响信息稳定性。业已在众多人细胞系中证实了增强子功能。Vivinus等，2001 EuropeanJournal of Biochemistry 268：1908-1917。
小鼠VEGF 5′UTR(SEQ ID NO：20)增强单顺反子报告基因RNA的翻译，还具有IRES(内部核糖体进入位点)活性。其增强子活性业已在大鼠、仓鼠和人细胞系中证实。全长5′UTR为1014个核苷酸，但163个核苷酸的突变形式(SEQ ID NO：21)显示更有效。Stein等，1998Molecular and Cellular Biology 18：3112-3119。
脾坏死病毒(SNV)是禽类轮状病毒。病毒5′LTR的RU5区(SEQ IDNO：22)刺激人293细胞中的非病毒报告基因RNA的翻译效率。Roberts和Boris-Lawrie 2000 Journal of Virology 74：8111-8118。
烟草蚀纹病毒RNA的143个核苷酸的5′前导序列(SEQ ID NO：23)启动报告基因mRNA在植物和动物细胞系中的帽非依赖性翻译。尽管所述前导序列未进一步增强加帽转录物的翻译，但树突细胞中的帽非依赖性CD40L表达是对体外加帽的非常有吸引力的替代。Gallie等(1995)Gene 165：233-238。Niepel和Gallie(1999)Journal of Virology73：9080-9088。Gallie，Journal of Virology(2001)75：12141-12152。
可通过本领域已知的方法，包括但不限于磷酸钙沉淀、微注射或电穿孔，用核酸转染树突细胞。它们可单独加入，或与合适的载体组合加入，所述载体例如为药物可接受的载体，如磷酸缓冲盐水。或者或另外，可将核酸掺入到用于掺入细胞中的表达或插入载体中。含启动子和多核苷酸可有效连接入其中的克隆位点这二者的载体是本领域已知的。这种载体能够体外或体内转录RNA，并可由例如Stratagene(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)的来源市售。为了优化表达和/或体外转录，可能必须去除、加入或改变克隆的5′和/或3′非翻译部分，以消除额外的、潜在不适合的替代翻译起始密码子或可在转录或翻译水平上干扰或降低表达的其它序列。或者，可紧接着起始密码子的5′插入共有核糖体结合位点，以增强表达。载体的实例是病毒(例如杆状病毒和轮状病毒)、噬菌体、腺病毒、腺相关病毒、粘粒、质粒、真菌载体和本领域通常使用的其它重组载体，它们业已被描述用于在各种真核和原核宿主中表达，并可用于基因治疗以及简单蛋白表达。
在它们当中有某些非病毒载体，包括DNA/脂质体复合物和靶病毒蛋白DNA复合物。为增强向细胞的传递，本发明的核酸或蛋白可缀合至结合细胞表面抗原的抗体或其结合片段。也包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本发明方法。本发明还提供用于本文公开方法的靶向复合物。
可使用本领域已知的方法将多核苷酸插入到载体基因组中。例如，可在合适的条件下将插入片段和载体DNA与限制酶接触，以在每个分子上产生彼此可配对的互补末端，并用连接酶连接在一起。或者，可将合成的核酸接头连接至限制性多核苷酸的末端。这些合成接头包含对应于载体DNA中的特定限制位点的核酸序列。另外，可连接含终止密码子和合适的限制位点的寡核苷酸，用于插入到含例如部分或全部以下的载体中：选择标记基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染体的新霉素基因；用于高水平转录的人CMV立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的SV40的转录终止和RNA加工信号；SV40多瘤复制起点和用于正确的游离型载体复制的ColE1；可变的多克隆位点；以及用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6RNA启动子。其它方法是已知的，在本领域可获得。
蛋白和多肽的制备和分离
多肽和蛋白是本发明的各种方法的必需组分。可使用可市售的自动化肽合成仪，例如Perkin Elmer/Applied Biosystems，Inc.，430A或431A型，Foster City，CA，USA生产的自动化合成仪，通过化学合成获得蛋白和多肽。合成的蛋白或多肽可沉淀，并例如通过高效液相层析(HPLC)进一步纯化。或者，可使用下文描述的宿主细胞和载体系统通过本文所述的已知重组方法获得蛋白和多肽。
本领域技术人员熟知可对任意肽进行修饰，以提供具有改变特性的肽。本文使用的术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸(包括甘氨酸以及D和L光学异构体)、氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链短的话，则3个或更多个氨基酸的肽通常叫做寡肽。如果肽链长的话，则该肽通常叫做多肽或蛋白。可修饰用于本发明的肽以包含非天然氨基酸。因此，所述肽可包括D-氨基酸、D和L氨基酸的组合以及各种“设计”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸和N-α-甲基氨基酸等)，以将特定特性传送至肽。另外，通过在特定偶联步骤指定特定氨基酸，可产生具有α螺旋β转角、β折叠、γ-转角的肽和环状肽。在另一个实施方案中，选择赋予有用的化学和结构特性的肽亚单位。例如，含D-氨基酸的肽可在体内抗L-氨基酸特异性蛋白酶。可用以反方向排列的氨基酸合成具有D-氨基酸的修饰化合物，以产生为逆反式(retro-inverso)肽的本发明肽。另外，本发明设想制备具有更好的限定结构特性的肽，以及肽模拟物和肽模拟键(例如酯键)用于制备具有新特性的肽的用途。在另一个实施方案中，可产生掺入还原肽键的肽，所述还原肽键即R1-CH2NH-R2，其中R1和R2是氨基酸残基或序列。还原肽键可作为二肽亚单位导入。这种分子应抗肽键水解，例如蛋白酶活性。这种分子应提供具有独特功能和活性(例如由于抗代谢分解或蛋白酶活性而延长的体内半寿期)的肽。而且，众所周知，在某些系统中，随机肽显示出增强的功能活性(Hruby(1982)Life Sciences 31：189-199和Hraby等(1990)Biochem 3.268：249-262)；本发明提供一种生产随机肽的方法，该方法将随机序列掺入到所有其它位置。
分离干细胞的方法
本领域已知许多用于分离和扩增CD34+干细胞的方法，CD34+干细胞用于体外扩增和分化为树突细胞。参见例如U.S.5,199,942，其内容通过引用结合到本文中。以下的描述仅用于阐述目的，不以任何方式限制本发明的范围。
CD34+干细胞可由骨髓细胞分离，或通过用结合不需要的细胞(例如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)和GR-1)的抗体淘选骨髓细胞或其它来源分离。关于该方法的详述，参见Inaba等(1992)3.Exp.Med.176：1693-1702。人CD34+细胞可得自各种来源，包括脐血、骨髓移植物和动员后外周血。可通过抗体亲和方法实现CD34+细胞的纯化。参见例如Paczesny等(2004)3Exp Med.199：1503-11；Ho等(1995)Stem Cells 13(增刊3)：100-105；Brenner(1993)Journal ofHematotherapy 2：7-17；和Yu等(1995)PNAS 92：699-703。
干细胞分化为不成熟树突细胞
CD34+干细胞可通过与合适的细胞因子温育分化为树突细胞。Inaba等(1994)，出处同上描述了通过温育鼠干细胞和鼠GM-CSF而将鼠干细胞体外分化为树突细胞。简单地讲，将分离的干细胞在标准RPMI生长培养基中与1-200ng/ml鼠GM-CSF(优选约20ng/mlGM-CSF)温育。每隔一天约一次用新鲜培养基更换培养基。约培养5-7天后，大部分细胞为树突状，这通过表面标记的表达和形态学来评价。通过荧光活化细胞拣选(FACS)或其它标准方法分离树突细胞。
可通过培养鼠CD34+干细胞和鼠GM-CSF而将所述细胞分化为树突细胞。通常，培养物中的GM-CSF浓度为至少约0.2ng/ml，优选至少约1ng/ml。通常范围在约20ng/ml至200ng/ml之间。在许多优选实施方案中，剂量约100ng/ml。任选以类似于制备鼠DC的范围加入IL-4。
人CD34+造血干细胞优选通过与人GM-CSF和TNF-α培养体外分化。参见例如Szabolcs等(1995)154：5851-5861。人GM-CSF以相似范围使用，还可加入TNF-α，以利于分化。通常还以约相同范围加入TNF-α。任选地，以相似剂量范围加入SCF或其它增殖配体(例如Flt3)，以分化人DC。
对本领域技术人员显而易见的是，用于将干细胞和单核细胞分化为树突细胞的剂量范围近似。不同供应商和同一供应商的不同细胞因子批次在细胞因子活性上有变化。技术人员可容易地滴定使用的各种细胞因子，以测定任意具体细胞因子的优化剂量。
单核细胞分化为树突细胞
可通过在含GM-CSF和IL-4或GM-CSF和IL-13的培养基中培养，由外周血中时常出现但非增殖性的CD14+前体(单核细胞)产生DC(参见例如WO 97/29182)。该方法描述于Sallusto和Lanzavecchia(1994)J.Exp.Med.179：1109和Romani等(1994)J.Exp.Med.180：83。简单地讲，CD14+前体是大量的，以至于据报道用例如G-CSF(用于增加外周血中的CD34+细胞和更多的定型前体)的细胞因子预治疗患者在大多数情况下不是必须的(Romani等(1996)J.Immunol.Methods196：137)。另有报道指通过该方法产生的DC似乎相当均一，可以不成熟态或完全分化或成熟形式生产。已表明使用自体单核细胞条件培养基作为成熟刺激物有可能消除非人蛋白，如FCS(胎牛血清)，并完全和不可逆地获得成熟和稳定DC(Romani等(1996)Immunol.Methods 196：137；Bender等(1996)J.Immunol.Methods 196：121)。但是，与本发明相比，这些研究未产生具有增加的IL-12水平和/或降低的IL-10水平的成熟DC。
抗原载荷
树突细胞载荷抗原的方法是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，树突细胞在含抗原的培养基中培养。DC随后摄取和加工在细胞表面上与MHC分子结合的抗原。优选通过用编码抗原的核酸转染使DV载荷抗原。转染DC的方法是本领域技术人员已知的。
T细胞的分离和扩增
在本发明的某些方法中，T细胞分离自哺乳动物，以便其可由成熟的修饰DC在体外驯化(或活化)。在一种方法中，按照既有方法使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心由红细胞和嗜中性粒细胞中分离PBMC。用补加1％胎牛血清(FBS)的改良AIM-V(其由AIM-V(GIBCO)和2mM谷氨酰胺、10μg/ml硫酸庆大霉素、50μg/ml链霉素组成)清洗细胞。用偶合至柱或磁珠的合适单克隆抗体按照标准技术通过负或正选择富集T细胞。分析等份细胞的细胞表面表型，包括CD4、CD8、CD3和CD14。仅为了阐述目的，以约5×105细胞/ml AIM-V(如上所述改良，含5％FBS和100U/ml重组IL-2(rIL-2)(补加的AIM-V))的浓度清洗和重悬浮细胞。在细胞分离自HIV+患者的情况下，将25nM CD4-PE40(由连接至铜绿假单胞菌外毒素A的转运和ADP核糖基化结构域的HIV-1结合CD4结构域组成的重组蛋白)或与HIV选择性杂交的其它相似重组细胞毒性分子加入到细胞培养物中，用于剩余细胞的扩增，以选择性去除培养物中的HIV感染细胞。业已表明，CD4-PE40抑制HIV感染细胞培养物中的p24生产，选择性杀死HIV-1感染细胞。
为刺激增殖，可以10ng/ml的浓度加入OKT3单克隆抗体(OrthoDiagnostics)，以0.5ml/孔将细胞平板接种在24孔板中。约37℃的温度下细胞在具有5％CO2的湿润培养箱中培养48小时。由细胞中吸出培养基，1ml含载体的上清液(如下文所述)补加5μl/ml硫酸鱼精蛋白、100U/ml rIL-2、100U/ml青霉素、0.25μg/ml两性霉素B/ml和额外的100μg/ml链霉素(可加入25nM CD4-PE40)。
细胞分离和表征
在另一方面，细胞表面标记可用于分离实施本发明方法必需的细胞。例如，人干细胞通常表达CD34抗原，而DC表达MHC分子和共刺激分子(例如B7-1和B7-2)，没有粒细胞、NK细胞、B细胞和T细胞的特异性标记。表面标记的表达利于鉴别和纯化这些细胞。这些鉴别和分离方法包括FACS、柱层析、用磁珠淘选、蛋白质印迹、放射显影、电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析等，以及包括各种免疫学方法，例如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光检测等。关于免疫学和免疫检测方法的一般综述，参见Stites和Terr(编辑)1991 Basic and ClinicalImmunology(第7版)以及Paul，出处同上。关于如何制备抗体来选择抗原的论述，参见Harlow和Lane(1989)，出处同上。
细胞纯化过程中用于检测细胞的细胞分离或免疫检测可以几种组合中的任一种实施，所述组合例如综述于：Maggio(编辑)(1980)Enzyme Immunoassay CRC Press，Boca Raton，Fla.；Tijan(1985)“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，”Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Harlow和Lane，出处同上；Chan(编辑)(1987)Immunoassay：A Practical Guide Academic Press，Orlando，Fla.；Price和Newman(编辑)(1991)Principles and Practice of ImmunoassaysStockton Press，NY；和Ngo(编辑)(1988)Non-isotopic ImmunoassaysPlenum Press，NY。
可通过流式细胞术如FACS分析分离和表征细胞。各种各样的流式细胞术是已知的。关于荧光活化流式细胞术的一般概述参见例如Abbas等(1991)Cellular and Molecular immunology W.B.SaundersCompany，尤其是第3章，和Kuby(1992)Immunology W.H.Freemanand Company，尤其是第6章。FACS设备例如可得自BectonDickinson。
可用于标记细胞抗原的标记物包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白或其它聚合物，例如亲和基质、糖或脂质。检测通过任意已知方法进行，例如免疫印迹、蛋白质印迹分析、放射性或生物发光标记示踪、毛细管电泳或其它基于大小、电荷或亲和性示踪分子的方法。
抗体
该方法的某些方面需要使用抗体。此抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。其可为抗体衍生物或抗体变体。其可为嵌合、人源化或全人抗体。本领域技术人员可使用蛋白或多肽另外产生特异性结合受体的抗体。还可使用抗体的功能片段或衍生物，包括Fab、Fab′、Fab2、Fab′2和单链可变区。抗体可在细胞培养物、噬菌体或各种动物中产生，所述动物包括但不限于母牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、猩猩、猿等。只要所述片段或衍生物保留了蛋白或其片段的结合特异性，其就可使用。可通过在给定的一组条件下比较与适宜抗原的结合和与无关抗原或抗原混合物的结合，测试抗体的结合特异性。如果抗体与适宜抗原的结合是与无关抗原或抗原混合物的结合的至少2、5、7和优选10倍，则其被认为是特异性的。
制备此部分或完整人抗体的技术是本领域已知的，可使用任何这种技术。按照一个实施方案，在已工程改造以表达人重链和轻链抗体基因的转基因小鼠中产生全人抗体序列。已产生了这种转基因小鼠的多个品系，其可产生不同类型的抗体。可融合正生产目标抗体的转基因小鼠B细胞，以产生杂交瘤细胞系，用于连续生产目标抗体。参见例如Russel等(2000)Infection and Immunity 2000年4月：1820-1826；Gallo等(2000)European J.of Immun.30：534-540；Green(1999)J.of Immun.Methods 231：11-23；Yang等(1999A)J.of LeukocyteBiology 66：401-410；Yang(1999B)Cancer Research 59(6)：1236-1243；Jakobovits(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31：33-42；Green和Jakobovits(1998)Exp.Med.188(3)：483-495；Jakobovits(1998)Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4)：607-614；Tsuda等(1997)Genomics 42：413-421；Sherman-Gold(1997)Genetic Engineering News 17：14；Mendez等(1997)Nature Genetics 15：146-156；Jakobovits(1996)WEIR′SHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，THEINTEGRATED IMMUNE SYSTEM IV卷，194.1-194.7；Jakobovits(1995)Current Opinion in Biotechnology 6：561-566；Mendez等(1995)Genomics 26：294-307；Jakobovits(1994)Current Biology 4：761-763；Arbones等(1994)Immunity 1：247-260；Jakobovits(1993)Nature362：255-258；Jakobovits等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Kucherlapati等，美国专利第6,075,181号。
还可使用噬菌体展示技术制备抗体。这种技术可用于分离初始抗体或用于产生具有改变的特异性或亲和力特征的变体。方便的话还可使用单链Fv。如果有需要，其可由接种的转基因小鼠制备。
还可修饰本发明抗体，以产生嵌合抗体。嵌合抗体是其中抗体重链和轻链的各种结构域由一个以上物种的DNA编码的抗体。参见例如美国专利第4,816,567号。
术语“抗体变体”还包括“微型双功能抗体”，其是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段含重链可变结构域(VH)，其与相同多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接。参见例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。通过使用太短以至于不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，将结构域与另一条链的互补结构域强行配对，产生两个抗原结合位点。另参见Chen等的美国专利第6,632,926号，其公开了具有一个或多个插入到亲本抗体高变区中的氨基酸的抗体变体，其对靶抗原所具有的结合亲和性是亲本抗体对抗原的结合亲和性的至少约2倍强。该术语还包括对抗体或片段的线性多肽序列的翻译后修饰。术语“抗体变体”还包括“线性抗体”。制备此变体的方法是本领域已知的，描述于Zapata等(1995)Protein Eng.8(10)：1057-1062。简而言之，这些抗体包含一对串联的Fd节段(VH～CH1-VH-CH1)，其形成了一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性的或单特异性的。
检测核酸的方法
定量目标基因(例如CD40L和/或IL-12p35)表达的各种方法是已知的，包括但不限于杂交检测(RNA印迹分析)和PCR型杂交检测。在检测mRNA(例如IL-12p35mRNA或CD40L mRNA)水平改变时，可先提取样品中包含的核酸。例如，可按照Sambrook等(1989)，出处同上中陈述的方法，使用各种裂解酶或化学溶液分离mRNA，或者可通过市售可得的核酸结合树脂按照生产商提供的附带说明提取mRNA。然后，可通过分别使用核酸探针和/或引物的杂交(例如RNA印迹分析)和/或扩增方法，按照标准步骤检测提取核酸样品中包含的mRNA。
具有至少10个核苷酸并与待检测核酸具有序列互补性或同源性的核酸分子可用作诊断方法中的杂交探针或引物。本领域知晓特异性杂交不需要“优选匹配的”探针。通过置换、缺失或插入少量碱基获得的探针序列的微小变化不影响杂交特异性。一般来说，可承受多达20％的碱基对错配(最优比对时)。例如，用于检测CD40L mRNA的探针与在先前鉴别的序列(例如参见SEQ ID NO：1或3)中包含的类似大小同源区至少约80％相同。或者，在同源区比对后探针与对应基因序列至少85％相同，甚至至少90％相同。片段的总大小以及互补段的大小取决于特定核酸节段的预期用途或应用。基因的较小片段一般可用于杂交实施方案，其中互补区的长度可变化，例如在人们希望检测的互补序列的约10个至约100个核苷酸乃至全长之间。
在长度超过约10个核苷酸的段内具有互补序列的核苷酸探针增加杂合体的稳定性和选择性，由此提升获得的具体杂合分子的特异性。人们可设计具有基因互补段的核酸分子，所述基因互补段长度超过约25个核苷酸，甚至更优选超过约50个核苷酸，需要时甚至可更长。通过例如经化学方法直接合成、应用核酸再生技术(例如在美国专利第4,603,102号中描述的采用两个引发寡核苷酸的PCRTM技术)或将选定序列导入用于重组生产的重组载体中，可容易地制备这种片段。
在某些实施方案中，使用本发明的核酸序列与适于检测杂交并由此检测互补序列的工具(例如标记)的组合是有利的。各种合适的指示剂工具是本领域已知的，包括能够产生可检测信号的荧光、放射性、酶或其它配体，例如抗生物素蛋白/生物素。还可使用荧光标记或酶标记(例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶)代替放射性或其它不合环境需要的试剂。对酶标记而言，比色指示剂底物是已知的，其可用于提供对人眼或分光光度测定可见的工具，以鉴别与含互补核酸样品的特异性杂交。
杂交反应可在不同“严格性”条件下进行。相关条件包括温度、离子强度、温育时间、反应混合物中额外溶质(例如甲酰胺)的存在以及清洗方法。较高严格性条件是例如较高温度和较低钠离子浓度的条件，其要求杂交组分之间的最小互补性较高，以形成稳定杂交复合物。增加杂交反应严格性的条件广为人知，本领域已公开。参见Sambrook等(1989)，出处同上。人们还可使用定量PCR或高通量分析，例如在Velculescu等.(1995)Science 270：484-487中描述的基因表达系列分析(SAGE)，利用检测和定量mRNA水平或其表达。简单地说，所述方法包括由预期含转录物的细胞或组织样品分离多种mRNA。任选地，基因转录物可转变为cDNA。对基因转录物样品进行序列特异性分析和定量。将这些基因转录物序列丰度与包含患病和健康患者正常数据集的参比数据库序列丰度对比。患者患有与患者数据集最密切相关的疾病，并包含该疾病方面的转录物差示。
在某些方面，可能必须使用多核苷酸作为核苷酸探针或引物，用于扩增和检测基因或基因转录物。用于检测差异表达的mRNA的引物与基因或多核苷酸的类似大小同源区至少约80％相同。对于本发明用途，扩增指使用引物依赖性聚合酶的任意方法，所述引物依赖性聚合酶能够以合理的保真度复制靶序列。扩增可通过天然或重组DNA聚合酶进行，所述聚合酶例如为T7DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段以及逆转录酶。
PCR的一般方法教导于MacPherson等，PCR：A PRACTICALAPPROACH，(IRL Press at Oxford University Press(1991))。但是，用于各应用反应的PCR条件经实验确定。众多参数影响反应的成功。在这些参数中包括退火温度和时间、延伸时间、Mg2+ATP浓度、pH以及引物、模板和脱氧核糖核苷酸的相对浓度。
在扩增后，可通过琼脂糖凝胶电泳之后的溴化乙锭染色和紫外照射显现检测产生的DNA片段。可通过表明扩增的DNA片段具有预期大小、具有预期的限制消化模式和/或与正确克隆的DNA序列杂交，验证差异表达的目标基因的特异性扩增。其它检测基因表达的方法是本领域技术人员已知的。参见例如国际PCT申请号WO97/10365、美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934、5,405,783；5,412,087；5,445,934；5,578,832；5,631,734；和LABORATORYTECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY，24卷：Hybridization with Nucleic Acid Probes，Tijssen编辑，Elsevier，N.Y.(1993)。
检测和定量蛋白或多肽的方法
本领域可获得各种用于蛋白分析的技术，包括但不限于放射免疫检测、ELISA(酶联免疫放射测定)、“夹心”免疫检测、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定和PAGE-SDS。
活体外治疗
如上所述，本发明还提供活体外治疗方法，其使用通过本发明方法生产的树突细胞或驯化T细胞。例如，用免疫原转化的树突细胞可用于体外活化细胞毒性T细胞和辅助T细胞。或者，可将转化的树突细胞导入哺乳动物中，以体内活化T细胞。再进一步，可将体外驯化的T细胞导入到哺乳动物中，它们在哺乳动物中对携带抗原性肽的靶细胞有细胞毒性，所述抗原性肽对应于I类MHC分子上活化T细胞识别的肽。这些靶细胞通常为癌细胞或在其MHC I类分子表面上表达独特抗原性肽的感染细胞。
同样，在I类和II类MHC分子背景中含抗原性肽的本发明DC还可刺激识别MHC II类分子背景中的抗原性肽的辅助T细胞。辅助T细胞也刺激针对靶细胞的免疫应答。同细胞毒性T细胞一样，用重组DC在体外或体内刺激辅助T细胞。
可由要给予DC和/或活化T细胞的哺乳动物分离树突细胞和T细胞。或者，细胞可由供者同种异体提供，或储存在细胞库(例如血库)中。
体内治疗
本发明方法生产的T细胞或树突细胞可直接给予受试者，已产生对选定免疫原有活性的T细胞。可通过本领域已知方法给予，以成功地传递入细胞，最终与受试者的血液或组织细胞接触。
所述细胞经常与药物可接受载体一起以任意合适的方式给予。可获得将本发明上下文中的细胞给予受试者的合适方法，尽管可使用一种以上的途径给予特定细胞组合物，但特定途径经常可提供比另一途径更直接和更有效的反应。优选的给予途径包括但不限于皮内和静脉给予。
药物可接受载体部分由要给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法决定。因此，本发明药物组合物存在各种合适配方。最通常进行质量控制(微生物学、克隆发生检测、存活力检验)，将细胞再回注到受试者中，之前给予苯海拉明和氢化可的松。参见例如Korbling等(1986)Blood 67：529-532和Haas等(1990)Exp.Hematol.18：94-98。
制剂适合于胃肠外给予，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、结内和皮下途径给予，载体包括水性等渗无菌注射液，其可含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受者的血液等渗的溶质，以及包括水性和非水性无菌悬浮液，其可含悬浮剂、溶解剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。皮内和静脉给予是给予本发明DC或T细胞的优选方法。
给予受试者的细胞(例如活化T细胞或树突细胞)剂量为有效量，该量对在受试者中随时间进展获得预期有益的治疗反应有效，或有效抑制癌细胞生长，或有效抑制感染。
仅为了阐述目的，通过在灌输前获得和保存用于随后分析和对比的受试者血样，可实施所述方法。一般来说，在约60-120分钟内，将至少约104-106、通常1×108-1×1010的细胞静脉内或腹膜内输注入70kg患者中。一方面，通过静脉内输注给予。利用脉搏血氧仪密切监测生命特征和氧饱和。获得输注后5分钟和1小时的血样，保存用于分析。在1年周期内，约每月重复进行细胞再输注，总共10-12次治疗。在首次治疗后，可根据门诊病人情况凭临床医师意见进行输注。如果对门诊病人给予再输注，则在治疗后监测参与者至少4小时。
对于给予，可以一定速率给予本发明细胞，该速率由有效剂量、细胞类型的LD-50(或其它毒性检测结果)和各种浓度的细胞类型的副作用决定，受试者的重量和整体健康状况同样适用。给予可经单剂量或分剂量完成。本发明细胞可补充已知常规疗法针对病症的其它治疗，包括细胞毒性剂、核苷酸类似物和生物反应修饰剂。同样，生物反应修饰剂可选地加入到采用本发明DC或活化T细胞的治疗中。例如，任选将所述细胞与佐剂或细胞因子(例如GM-CSF、IL-12或IL-2)一起给予。
体外检测和试剂盒
本发明提供有商业价值的试剂盒，以实施本发明的成熟方法。在一方面，所述试剂盒包含IFNγ多肽或在体内或体外表达IFNγmRNA的表达盒，以及CD40L多肽，或表达在体内或体外表达CD40L的CD40L mRNA的表达盒。在另一方面，所述试剂盒包含TNFα多肽或在体内或体外表达TNFαmRNA的表达盒，以及CD40L多肽，或表达在体内或体外表达CD40L的CD40L mRNA的表达盒。所述试剂盒可进一步包含用于体外转录的RNA聚合酶。
评价免疫原性的方法
通过本发明方法生产的抗原提呈细胞或驯化T细胞的免疫原性可通过众所周知的方法测定，所述方法包括但不限于以下方法：
51 Cr-释放裂解检测。可比较抗原特异性T细胞对肽脉冲的51Cr-标记靶的裂解。随着时间变化，“更有活性的”组合物显示出的靶裂解更大。裂解动力学以及在固定时间点(例如4小时)的整体靶裂解可用于评价效力。Ware等(1983)3.Immunol.131：1312。
细胞因子释放检测。分析T细胞在接触修饰APC时所分泌细胞因子的类型和量，可检测功能活性。可通过ELISA或ELISPOT测定检测细胞因子，以确定细胞因子生产的速率和总量。Fujihashi等(1993)J.Immunol.Meth.160：181；Tanquay和Killion(1994)LymphokineCytokine Res.13：259。
体外T细胞驯化。可检测本发明组合物由正常供体或患者来源的PBMC激发反应性T细胞群的能力。在该系统中，可测试激发T细胞的裂解活性、细胞因子释放、多克隆性和对抗原表位的交叉反应性。Parkhurst等(1996)Immunol.157：2539。
转基因动物模型。可通过用本发明组合物接种HLA转基因小鼠并测定所诱导免疫应答的特性和程度，体内评价免疫原性。或者，hu-PBL-SCID小鼠模型允许通过人PBL的过继性转移在小鼠中重建人免疫系统。这些动物可用所述组合物接种，并如先前Shirai等(1995)J.Immunol.154：2733；Mosier等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2443所述分析其免疫应答。
增殖检测。T细胞在反应性组合物作用下增殖。可通过检测例如3H-胸苷吸收定量监测增殖。Caruso等(1997)Cytometry 27：71。
灵长类动物模型。非人灵长类动物(黑猩猩)模型系统可用于体内监测HLA限制性配体的免疫原性。业已表明，黑猩猩与人MHC分子共有重叠的MHC-配体特异性，因此允许人们测试HLA-限制性配体的相对体内免疫原性。Bertoni等(1998)Immunol.161：4447。
监测TCR信号转导事件。几个细胞内信号转导事件(例如磷酸化)通过MHC-配体复合物与成功的TCR衔接相关联。这些事件的定性和定量分析与组合物通过TCR衔接活化效应细胞的相对能力相关。Salazar等(2000)Tnt.J.Cancer 85：829；Isakov等(1995)J.Exp.Med.181：375。
按照以上描述，以下实施例拟阐述但不限制本发明的各个方面。
实验性实施例
试剂
Histopaque 1077和Tween 20购自Sigma(St Louis，MO)。PBS和X-VIVO 15购自Cambrex(East Rutherford，Ni)。AIM-V培养基、Iscove改良Dulbecco培养基和RPMI 1640培养基连同锥虫蓝和胎牛血清(FBS)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。Viaspan购自Dupont Pharma Labs(Wilmington，DE)。GM-CSF、IL-4、TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ均购自R&D Sytems(Minneapolis，MN)。PGE2购自Cayman Chemicals(Ann Arbor，CA)。可溶性CD40L购自Alexis Biochemicals(San DiegoCA)。人AB血清购自Valley Biochemical(Winchester，VA)。
趋化因子CCL19和CCL21购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。表型抗体(HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14和阴性同种型对照)、ELISpot抗体对(IFN-γ和IL-2)、ELISA对(IL-12和IL-10)以及链霉抗生物素蛋白-HRP连同BD Opt EIA试剂组B pH 9.5均购自BD Pharmingen(San Diego，CA)。AEC过氧化物酶底物购自Vector labs(Vector Labs，Burlingame，CA)。封闭抗CD40L抗体购自eBioscience。CD1d/α半乳糖苷神经酰胺(KRN7000)四聚体和天然KRN7000由Kirin Brewery，Pharamaceuticals Division，Tokyo，Japan惠赠。MART-1/HLA-A201四聚体购自Beckman-Coulter(Miami，FL)。
DC产生
人PBMC分离自Life Blood(Memphis，Tennessee)提供的健康志愿者白细胞去除收集物。PBMC通过Ficoll-Histopaque密度离心制备，用PBS于室温清洗4次。将2×108PBMC重悬浮在30ml AIM-V培养基中，并使其于37℃粘附至150cm3塑料烧瓶2小时。去除非粘附细胞，剩余细胞在补加GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)的X-VIVO 15培养基中于37℃、5％CO2下培养5-6天。
CD40L的克隆
用RPMI中的PMA刺激T细胞1小时。收获细胞，并用PBS清洗1次。使用QIAGEN RNeasy方法提取总RNA。使用Gene AmpGold试剂盒(Applied Bioscience)，使用高保真性Advantage Polymerase(Clontech)，将1μg活化T细胞的总RNA加入一管RT-PCR反应物中。CD40L序列的基因特异性引物对应于CD40L序列的碱基47和859，CD40L 5′引物：5′-GCATCATCGAAACATACAACC-S′(SEQ IDNO.11)和CD403′引物：5′-GTATTATGAAGACTCCCAGCG-S′(SEQID NO.12)。纯化PCR片段，并使用T4DNA连接酶(Invitrogen)将其亚克隆入pCR2.1载体中。CD40L可读框的序列分析以及和GenBank共有序列的比对揭示存在两个突变。一个突变是保守的，不产生氨基酸变化。另一个置换产生功能性氨基酸变化Asn-Ser。进行定点诱变，以将非保守氨基酸变化修正回天冬酰胺。简单地讲，在使用定制的5′磷酸化和HPLC纯化引物(QIAGEN)、PFU Ultra酶并伴有10×PCR缓冲液(Stratagene)和dNTPS(Clontech)的定点诱变中使用10-40ng CD40L PCR2.1质粒。在PCR反应后，加入Dpn I限制酶(Promega)，于37℃温育1小时，以消化去除亲本模板。然后将5μl该反应物转化入Oneshot MACH T1R感受态细胞(Invitrogen)中，并接种在新鲜制备的含氨苄青霉素的LB平板上。选择6个克隆，在含氨苄青霉素的LB中以3ml培养物过夜培养。使用质粒Miniprep(QIAGEN)分离DNA。将各个克隆的等份纯化DNA送至北卡大学(UNC)测序实验室，使用M13F和M13R引物(Invitrogen)对CD40L可读框进行序列分析。然后使用DNASTAR Seqman分析软件将所有克隆与CD40L的共有GenBank序列比对。选择含正确诱变碱基的克隆#2(重命名为CD40LWT PCR 2.1)。
转染DC的mRNA的产生
使用Spe1限制酶线性化CD40L WT PCR 2.1质粒，通过苯酚/氯仿提取接着乙醇沉淀纯化。将线性模板再溶解在水中，并使用mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒(Ambion)按照生产商的指引在体外转录。保留等份RNA用于最终分析，然后继续聚腺苷酸化反应。使用RNeasy柱(QIAGEN)按照RNA净化方法纯化聚腺苷酸化RNA。RNA在水中洗脱，并以个体大小等份储存于-150℃以下。使用RNABioanalyzer 2100对比分析非聚腺苷酸化RNA和终产物确定PolyA尾长度。
DC电穿孔
在电穿孔前，收获DC，以PBS清洗，然后以4×107/ml的0.5ml溶液或2.5×107/ml的0.2ml溶液重悬浮在冰冷的Viaspan
Figure G05833740420070405D000601
(BarrLaboratories)中，并置于冰上。DC与mRNA(1或2μg编码抗原的mRNA/106和4μg CD40L mRNA/106)混合，并置于4mm间隔的电穿孔槽中，使用Biorad设备电穿孔。在电穿孔后立即以X-VIVO 15培养基清洗DC，最后以1×106/ml重悬浮在补加GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)的X-VIVO 15中，并于37℃在低粘附6孔平板(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ)中培养4或24小时。此时还加入下文所述的额外成熟刺激物。
DC成熟-基于CD40L的方法
在电穿孔后，用IFN-γ(1000U/ml)或TNF-α(10ng/ml)或IFN-γ与PGE2(1μg/ml)的组合处理用CD40L mRNA转染的DC。比较起来，用不同抗原编码mRNA转染不成熟DC，然后用包含TNF-α(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-6(100ng/ml)和PGE2(1μg/ml)或可溶性CD40L(200ng/ml)加增强剂(1μg/ml)连同同时或顺序加入的1000U/ml IFN-γ的“细胞因子混合物”处理。
DC成熟-PME-CD40L法
在培养第5天用TNF-α(10ng/ml)、IFN-γ(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml)表型成熟不成熟DC。在第6天，收获DC，如上所述用抗原和CD40L mRNA电穿孔，在含800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4的X-VIVO 15培养基中培养4小时，然后收获或配制用于疫苗生产。
采用与α-半乳糖苷神经酰胺(KRN7000)组合的基于CD40L的方法的DC成熟
在电穿孔后，立即将与500U/ml IFN-γ和1μg/ml PGE2组合的100ng/ml KRN7000脉冲到基于CD40L的方法处理的DC上，培养24小时。
DC的流式细胞术分析
收获106DC，重悬浮在冰冷的PBS/1％FCS中。将对MHC分子(HLA-ABC、HLA-DR)、共刺激分子(CD80、CD86)、成熟标记(CD83)和单核细胞标记(CD14)特异性的藻红蛋白(PE)或FITC缀合抗体与96孔板(BD Biosciences)中的1×105DC/孔混合，于4℃温育至少15分钟。同种型匹配的抗体用作对照。在彻底清洗后，使用CellQuest软件(BD Biosciences)用FACScalibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行荧光分析。
如下测定CD40L的胞内表达：在用CD40L mRNA转染后的不同时间点收获2×105DC或HeLa细胞，于4℃将其重悬浮在250μLCytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)中达至少10分钟至2小时。用2ml染色缓冲液(PBS、BSA、NaN3和EDTA)清洗细胞两次，重悬浮在0.5ml染色缓冲液中，并于4℃过夜储存。将细胞在2.0mlPerm/Wash溶液(BD Biosciences)中重悬浮15分钟，离心，重悬浮在100μl Perm/Wash溶液中。将20μL小鼠抗人CD40L PE和抗人CD40APC(BD Biosciences)或小鼠IgG1 PE和IgG1 APC(BD Biosciences)加入在各个时间点收集并透化的各个DC制备物中，在黑暗中于4℃温育30分钟。用1ml Perm/Wash溶液清洗细胞两次，重悬浮在染色缓冲液中，然后进行流式细胞仪分析。
如下进行胞内细胞因子染色(ICS)：在第19天由共培养物中取出1×106/ml接触过抗原的CD8+T细胞，用具有PME DC靶(RCC、生存蛋白、G250、hTERT或eGFP)的200μl R10培养基于37℃、5％CO2下再刺激1小时，然后以1μl/ml加入布雷菲德菌素A(BD GolgiPlug，目录号555029)。细胞于37℃再温育16小时。清洗细胞，重悬浮在具有5μl CD8/CP-cy5.5(BD 341051)的150μl FACS缓冲液中，于4℃温育。30分钟后，清洗细胞两次，重悬浮在2％多聚甲醛(PFA)中。随后在10分钟后清洗细胞，然后在0.1％皂苷中于室温(RT)透化10分钟，然后与2μl封闭抗体纯小鼠IgG1(BD 349040)温育。在于室温温育10分钟后，将0.5μl IFN-γ-APC(BD 554681)、10μl IL-2-FITC(BD554702)和10μl CD69-PE(BD 555531)抗体加入到各个样品试管中。样品在黑暗中于室温温育30分钟。在用0.1％皂苷最终清洗后将细胞重悬浮在2％PFA中。通过FACS流式细胞仪进行分析，收集100,000个事件。
当在HeLa细胞中由mRNA表达时的CD40L功能分析
HeLa细胞在10％FBS/DMEM中培养，然后收获，并在具有GFP和CD40L RNA(各20μg/5×106细胞)的4mm槽中电穿孔。转染后回收率约为70％，将细胞平板接种在6孔皿中，使其过夜培养。在过夜温育后，通过刮擦收集转染的HELA细胞，并用小鼠IgG1-PE或抗人CD40L-PE(均得自BD Biosciences，San Diego，CA)染色，以观察CD40L的细胞表面表达。用10μg/ml抗体的1％FBS/PBS溶液于4℃染色2×105细胞/管30分钟。使用FACScaliber流式细胞仪和Cellquest软件(BD Biosciences)分析细胞。为分析表达CD40L的HeLa细胞的功能，将1×106不成熟树突细胞与1×106HeLa细胞的5％huAB血清/RPMI(补加1000U/ml IFN-γ(R&D Systems，Minneapolis，MN))溶液在6孔皿(2ml总体积)中过夜共培养。在匹配孔中包含10μg/ml的封闭CD40L单克隆抗体(得自eBioscience的24-31)，以证实刺激树突细胞必需蛋白的细胞表面表达。在18-24小时后收获培养上清液，通过ELISA(BD Biosciences)分析细胞因子IL-10和IL-12的表达。
迁移检测
以通过24孔跨孔小室(corning Costar，Acton，MA)中的8mm孔径聚碳酸酯滤膜的迁移检测DC趋化性。将在含3-300ng/ml CCL19、5-250ng/ml CCL21的Iscoves改良Dulbecco培养基溶液或AIM-V培养基溶液、二者的组合或单独培养基中的5％人AB血清加入到下室。将1-5×105DC的0.1ml溶液加入到上室，于37℃温育2-3小时。下室收集入5ml管(BD Biosciences)中，并重悬浮在0.1ml PBS中，使用锥虫蓝进行活细胞计数。
ELISpot
用5μg/mL单克隆抗IFN-γ或抗IL-2捕获抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)包被PVDF膜ELISpot板(Millipore，Ballerica，MA)，于4℃温育24小时。在温育后，用PBS/0.05％Tween 20清洗板，用5％人AB血清/RPMI 1640培养基封闭1小时。以1×105细胞/孔平板接种PBMC、T细胞或CD8富集T细胞，mRNA转染，抗原载荷DC靶为1×104细胞/孔，达到10∶1效应子∶靶比率，于37℃、5％CO2下温育至少16小时。
在温育后，将平板清洗6次，以1μg/ml将抗IFN-γ检测抗体(BDPharmingen)或抗IL-2检测抗体(BD Pharmingen)加入到合适平板中达2小时。再进行6次清洗后，向每个孔加入链霉抗生物素蛋白-HRP(BDPharmingen)达1小时。最后，在又一个清洗循环后，用AEC过氧化物酶底物进行5-15分钟的显色，并用水终止。风干板，然后在CTL免疫印迹平板读数器(CTL，Cleveland，OH)上分析。
ELISA
所述方法由BD Pharmingen针对IL-12和IL-10ELISA对(BDPharmingen)设计，使用BD Opt EIA试剂组B pH 9.5。简单地讲，用抗IL-12p70或抗IL-10ELISA捕获抗体的包被缓冲液于4℃包被ELISA平板(BD Biosciences)24小时。用200μl/孔的10％FCS/PBS对平板进行1小时的封闭，然后以100μl/孔双份加入标准品(BDPharmingen)和上清液样品，于室温温育2小时。清洗平板，加入抗细胞因子检测抗体，温育1小时，清洗平板，用100μl链霉抗生物素-HRP替换溶液，再于室温温育1小时。再清洗平板，施加显色底物达10-20分钟，之后用终止溶液停止显色。使用Bio-Tek仪器ELx800平板读数器和KC初级软件(Winooski，VT)进行平板分析。结果显示为pg数/ml/106DC。因为检测设置得使1ml相当于106DC，所以结果还可表示为pg数/106DC。例如，3000pg/ml/106DC等于3000pg/106DC。
CTL诱导
用mRNA转染的成熟树突细胞与CD8纯化的T细胞共培养。所有的共培养都在R-10培养基(10％FBS，补加10mM HEPES pH7.4、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必须氨基酸、2mM谷氨酸钠、55μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640)中进行。所有细胞培养试剂都得自Invitrogen(Carlsbad，CA)。使用CD8+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)由从单核细胞粘附步骤收获的非粘附细胞中纯化CD8+细胞。以10∶1CD8+∶DC混合CD8+细胞和如上所述制备的树突细胞。最初7天，细胞在补加0.2U/ml IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)的培养基中生长，然后以1ml(1×106CD8+细胞)/孔等分入24孔组织培养皿中。在此最初7天温育后，收获CD8+细胞，计数，以10∶1与新鲜DC刺激物在补加5U/ml IL-2的培养基中再培养。再将细胞培养1周，然后用新鲜DC和20U/ml IL-2再刺激。在第三次刺激后的3或7天进行CTL检测。
CTL检测
通过用10μg/ml HLA-A201限制性MART-APL肽(LAGIGILTV；SEQ ID NO：24)或天然肽(AAGIGILTV；SEQ ID NO：25)或PSA-1肽(FLTPKKLQCV；SEQ ID NO：26)在FBS/RPMI培养基中过夜温育，预先脉冲T2细胞，清洗，然后用作CTL靶。如上所述用GFP mRNA、MART-1 APL mRNA、Flu-M1 mRNA转染树突细胞靶，并在未成熟状态下过夜温育。脉冲的T2细胞与100μCi Na51Cr(Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences，Inc.，Boston，MA)于37℃温育90分钟。洗除过量的51Cr，将5000个标记靶与不同E∶T比率的CD8+细胞温育4小时。通过以25,000细胞/孔加入未脉冲的T2细胞减少非特异性裂解。通过闪烁计数检测上清液中51Cr释放。通过向所述靶加入1％Triton X-100计算总释放，同时通过加入单独的培养基计算自发释放。使用公式(样品释放cpm-自发释放cpm)/(总释放cpm-自发释放cpm)计算裂解百分率。
使用KRN7000脉冲的、基于CD40L的方法成熟的DC诱导MART-1特异性CTL
如上所述使用‘基于CD40L的方法’产生DC，并载荷编码MART-1的mRNA。在电穿孔后，将DC与KRN7000、IFN-γ和PGE2温育。在20U/ml IL-2存在下以1∶10比率共培养DC和PBMC。在相同条件下再刺激PBMC三次，通过用MART-1/A2四聚体染色测定CTL诱导的频率，使用KRN7000/CD1d四聚体通过FACS计算NKT细胞的扩增。
实验性实施例的结果
用干扰素-γ和CD40L序贯成熟优化IL-12p70分泌
通过在包含GM-CSF和IL-4的X-VTVO 15培养基中培养粘附细胞PBMC 6天制备不成熟DC。在第6天回收DC，以2μg eGFP编码mRNA/106DC电穿孔，用“细胞因子混合物”成熟36小时。或者，通过在同时或序贯施加的IFN-γ和可溶性CD40L存在下培养DC实现成熟。监测DC的共刺激分子表达的增加，但最重要的是监测IL-12p70相对于IL-10的分泌。图1表明，在36小时的培养周期内，相比于IL-12p70，用细胞因子混合物成熟的DC分泌过量的IL-10进入培养上清液中。相比之下，同时用可溶性CD40L加IFN-γ成熟的DC分泌过量的IL-12p70。但是，序贯施加IFN-γ达18小时后将可溶性CD40L直接加入培养物中以及再18小时的培养期产生显著增强水平的IL-12p70分泌。出乎意料的是，施加可溶性CD40L后施加IFN-γ阻止IL-12p70显著分泌。总之，序贯传递先天刺激物以“激发”DC成熟(IFN-γ)，之后由可溶性CD40L替代传递的T辅助细胞信号，优化DC成熟的IL-12p70分泌。
用CD40L编码mRNA转染的HeLa细胞和不成熟DC共培养导致诱导DC来源的IL-12p70
图2表明，经抗CD40L抗体和流式细胞术确定，用CD40L编码mRNA转染的HeLa细胞在培养24小时后产生显著的CD40L蛋白的细胞表面表达。CD40L mRNA转染的HeLa细胞与不成熟DC在1000U/ml IFN-γ存在下共培养。表II表明，用延长的poly-A尾(＞400个‘A’)转染的HeLa细胞在与不成熟DC培养时，在18个小时的培养期内能够诱导显著的IL-12p70分泌。重要的是，包含封闭抗CD40L抗体阻止IL-12p70分泌，证实了转染mRNA序列编码蛋白的身份和功能重要性。
                    表II
在IFN-γ存在下，CD40L编码mRNA转染的HeLa细胞在与不成熟DC共培养时，导致IL-12p70分泌。在培养物中包含‘封闭’抗CD40L抗体阻止IL-12p70的诱导。
  不成熟DCIL-12p70(pg/ml)   “混合物”成熟和再活化的DCIL-12p70(pg/ml)
 单独的DC   -   4.9
 (a)HeLa/＞400polyA+IFN-γ   372   26.3
 (b)HeLa/＞400polyA+IFN-γ+24-31 - 2.5
(a)用4μg具有超过400个核苷酸的poly-A尾的CD40L mRNA转染HeLa细胞，在IFN-γ存在下与DC温育。
(b)同(a)，但存在封闭抗CD40L抗体(24-31)。
用CD40L mRNA转染并在IFN-γ存在下培养的树突细胞分泌IL-12p70
在与GM-CSF和IL-4培养6天后收获不成熟DC，用CD40LmRNA(400-polyA)滴定液转染，立即在1000U/ml IFN-γ存在下培养。图3表明，在培养18小时后收集的上清液包含超过IL-10的过量IL-12p70，最适细胞因子分泌需要至少4μg CD40L mRNA/106DC。增加CD40L mRNA有效载荷至4μg/106DC以上导致成熟后的DC收率显著下降(未列出数据)。在一个平行实验中，用4μg CD40LmRNA/106细胞转染不成熟DC，立即将IFN-γ滴定液施加于培养物。图4表明，需要至少100U/ml IFN-γ支持IL-12p70的最适诱导。图5a表明，IL-12p70在转染并与IFN-γ共培养后6-8小时呈现可检测的水平，在20-24小时之间记录到培养上清液中的最优累积。相比之下，10ng/ml TNF-α代替IFN-γ也支持IL-12生产，但水平下降(图5b)。而且，IFN-γ相伴地导致IL-10生产水平低于TNF-α所获水平(图5c)。
与细胞-细胞相互作用相反，CD40L mRNA转染的DC诱导IL-12p70依赖于“胞内信号传导”
图2表明，由mRNA翻译的CD40L蛋白可在转染细胞的细胞表面上表达，所述蛋白由于其与其DC上对应物(即CD40)的相互作用而保持适宜地向DC发出IL-12p70分泌信号的能力。为测定CD40L在转染DC中的细胞分布并证实其功能同一性，在转染后的不同时间点收集DC，测定细胞表面上或胞内区室中的CD40L存在情况。图6a和6b表明，大部分CD40L位于胞内区室中，直至转染后60分钟才出现显著蛋白表达(27％DC CD40L阳性)。因此，尽管IFN-γ在转染后立即施加，但成熟事件的传递是有序的，IFN-γ信号在CD40L信号前。如图1所示，用IFN-γ和CD40L序贯成熟DC最适于IL-12p70分泌。另外，图7表明，CD40L转染和IFN-γ处理的DC当在转染后于过量封闭抗CD40L抗体存在下培养18小时时，仍分泌显著水平的IL-12p70。该数据表明，CD40L/CD40相互作用对在该系统中产生IL-12p70是必需的，可在胞内区室中发生。
CD40L阳性细胞随时间进展的出现频率
不成熟DC以4μg CD40L mRNA/106DC转染，并用1000U/mlIFN-γ共成熟。或者，作为CD40L染色的阴性对照，用‘细胞因子混合物’成熟不成熟DC。表达的最大频率在用CD40L RNA转染后3-4小时左右获得(参见图6b)，尽管在细胞固定和透化时80％DC表达CD40L，但细胞表面染色仅检测到约15％的DC(图6c)。该数据表明，大量的CD40L蛋白保留在DC中，而不是表达在细胞表面。CD40L蛋白被瞬时表达，大部分DC在转染后26小时变成CD40L阴性的。当与仅接受‘细胞因子’混合物的DC相比时，CD40L编码mRNA转染DC不改变CD40L的关连受体分子CD40的表达。
在用CD40L和IFN-γ成熟时需要PGE2诱导DC迁移
除了分泌IL-12p70并具有成熟表型(通常定义为细胞表达水平提高的共刺激分子，如CD80、CD83和CD86(参见表III))的能力以外，如果DC将能够在体内归巢至淋巴结，则其还必须表现出迁移能力。几个研究已表明，PGE2激发成熟DC迁移(Luft等(2002)Blood 100：1362，Scandella等(2002)Blood 100：1354)。图8表明，除了IFN-γ以外还包含1μg/ml PGE2能使成熟DC迁移，该迁移能力的获得与CD40L mRNA有效负载成比例。因此，CD40L不仅有助于成熟DC表型和显性IL-12p70谱(参见表II)，而且有助于激发迁移。相比之下，用CD40L mRNA转染并在存在IFN-γ但无PGE2的情况下培养成熟的DC不能迁移(未列出数据)，尽管其表现出趋化因子受体CCR7的显著细胞表面表达。
                        表III
DC的表型分析和分泌性细胞因子谱，所述DC经历了由‘细胞因子混合物’或CD40L加IFN-γ和PGE2诱导的成熟
  不成熟DC   (a)Flu/eGFPmRNA   (b)Mart-APLmRNA   (c)Flu/CD40LmRNA   (d)Mart-APL/CD40L mRNA
  DC标记   细胞因子混合物   细胞因子混合物   IFN-γ/PGE2   IFN-γ/PGE2
  HLA-ABC   99.7％   98.6％   99.5％   99.9％   99.9％
  HLA-DR   95.0％   99.6％   99.7％   99.8％   99.5％
  CD83   23.2％   98.3％   99.2％   99.6％   99.3％
  CD14   0.3％   1.7％   2.9％   3.2％   4.9％
  CD56   2.8％   3.3％   3.2％   2.8％   2.1％
  CD19   1.8％   1.1％   2.1％   3.2％   3.2％
  CD3   2.8％   2.4％   3.1％   2.8％   3.1％
  CD86   59.3％   99.7％   100.0％   100.0％   100.0％
  CD80   28.8％   99.0％   99.5％   99.2％   99.5％
  CD1a   51.6％   49.1％   52.2％   48.6％   49.9％
  CD209   95.8％   95.5％   96.1％   96.4％   95.9％
  CCR7   3.2％   47.4％   35.5％   35.4％   36.2％
  (e)IL-12(pg/ml)   N/A   27.5   59.0   1456.3   1350.0
  (f)IL-10(pg/ml)   N/A   948.4   810.0   187.7   165.5
由粘附单核细胞制备DC，在GM-CSF/IL-4中培养6天。在收获时，用不同mRNA有效负载转染DC，并再进行24小时的成熟。再收获DC，染色细胞的各种细胞表面标记，特别是与功能(即共刺激和迁移)增强相关的标记。收集成熟培养物上清液，并进行IL-12p70和IL-10细胞因子分析。
(a)除了4μg/106细胞的eGFP mRNA以外，还用流感病毒mRNA作为编码抗原的有效负载，以2μg/106细胞转染DC。eGFP mRNA允许通过FACS证实转染，在替代方法中用作4μg CD40L mRNA成熟有效负载/106细胞的代用对照。这些流感病毒/eGFP转染的DC在“细胞因子混合物”存在下成熟。
(b)用MART-APL mRNA作为抗原编码有效负载，以2μg/106细胞转染DC，并用“细胞因子混合物”进行成熟。
(c)用作为抗原编码有效负载的2μg流感病毒mRNA/106细胞连同作为成熟有效负载的4μg CD40L mRNA/106细胞转染DC。如在材料和方法中所述，将这些细胞立即置于具有IFN-γ和PGE2的培养物中。
(d)用作为抗原编码有效负载的2μg MART-APL连同作为成熟有效负载的4μg CD40L mRNA/106细胞转染DC。如在材料和方法中所述，将这些细胞立即置于具有IFN-γ和PGE2的培养物中。
(e)经历成熟的DC的IL-12p70分泌。
(f)经历成熟的DC的IL-10分泌。
经用CD40L mRNA和TFN-γ/PGE2转染序贯成熟的DC激发有效的T细胞回忆应答
为测定经CD40L mRNA转染和IFN-γ/PGE2成熟的DC的“免疫效力”，除CD40L mRNA和IFN-γ/PGE2培养环境以外，还用2μg编码流感病毒基质蛋白的mRNA/106细胞共转染DC。转染后18小时，收获DC，清洗，并与自体T细胞在IFN-γELISpot检测中共培养。图9表明，经流感病毒特异性IFN-γ印迹在检测中的出现频率确定，相比于用流感病毒mRNA转染并用‘细胞因子混合物’成熟的DC，经CD40L/IFN-γ/PGE2成熟的DC表现出增加的免疫效力。
用CD40L mRNA和TFN-γ/PGE2转染序贯成熟的DC激发初次应答
例如在图9中描述的回忆应答基本不依赖于表达优化共刺激分子并支持细胞因子环境的DC的存在。因此，测试DC其激发针对黑素瘤相关抗原MART-1的初次免疫应答的能力，许多健康供体保留了对MART-1的高原初T细胞前体频率。由于优选使用HLA-A201供体，所以用编码MART-1的mRNA转染DC，其中A2限制性决定蔟通过位点特异性诱变突变mRNA序列来优化，使得27位的丙氨酸被亮氨酸取代，本文称为MART-APL(Valmori，D等(1998)J.Immunol.160：1750)。用2μg MART-APL mRNA和4μg CD40L mRNA共转染DC，立即用IFN-γ/PGE2脉冲18小时，将该DC与仅载荷MART-APL并用“细胞因子混合物”过夜成熟的DC对比。将抗原载荷和成熟DC加入至纯化的自体CD8+T细胞，在0.2U/ml的人IL-2存在下培养7天。在此阶段之后，回收T细胞，在合适时于IL-2ELISpot检测中与第二轮抗原载荷DC刺激物共培养。图10表明，在经CD40L和IFN-γ/PGE2成熟的DC存在下，培养的CD8+T细胞在针对优化的MART-APL表位的特异性应答中导致能够分泌IL-2的T细胞高度显著地增加，所述MART-APL表位原本在MART-APL mRNA序列中编码。总之，接触经IFN-γ/PGE2和CD40L的序贯成熟的DC在产生初次免疫应答方面明显比用目前认可的标准“细胞因子混合物”成熟的DC更有效。而且，图11表明，以‘细胞因子混合物’成熟的MART-APL载荷DC产生的CTL不能介导针对T2细胞的CD4非依赖性、CD8介导的细胞毒性，其中所述T2细胞用合适的HLA-A2限制性MART-APL肽脉冲(图11b)。相比之下，在CD40L/IFN-γ/PGE2成熟的DC上产生的CTL活性完全，杀死MART-APL肽脉冲的T2靶(图11a)。
在PME-CD40L法下成熟的不成熟DC的表型分析
用本文描述的PME-CD40L法在第5天成熟DC。具体地说，在培养基GM-CSF和IL-4中培养单核细胞5天，以产生不成熟CD83-DC。在第5天，用含TNFα、IFNγ和PGE2(TIP)的培养基供应不成熟DC。在第6天，测定TIP后表型(参见表IV)。如表IV所示，大部分细胞为CD80、CD83、CD86和CD209阳性。这些DC还为CCR7阴性(未列出数据)。小部分CD14+细胞代表未分化为树突细胞的单核细胞。在第6天，用由扩增肾细胞癌RNA制备的1μg mRNA和4μgCD40L mRNA/106细胞共转染(经电穿孔)CD83+CCR7-DC。在转染后4小时检测CD40L表达。在转染后4小时将细胞冷冻保存在液氮中。在融化后和融化后24小时立即检测融化后的回收率和存活率。由其可见，在融化后24小时，大部分DC变成CCR7+。CCR7+DC对CD80、CD83和CD86也是阳性的。3次单独实验的结果示于表IV。
                    表IV
Figure G05833740420070405D000731
经PME-CD40L法成熟的DC在淋巴结归巢趋化因子CCL19和21
作用下高度迁移
在用总扩增的RCC RNA和CD40L RNA共转染后24小时，检测PME-CD40L成熟的DC在趋化因子CCL19和21作用下的迁移。图12表明，在使用4个独立供体的情况下，PME-CD40L成熟的DC高度迁移，与用PME-CD40L法电穿孔后24小时获得的非常高水平的CCR7表达一致(参见表IV)。
经PME-CD40L法成熟的DC显示出的免疫效力显著强于用‘基于CD40L的方法’成熟的DC
尽管‘基于CD40L的方法’诱导初次免疫应答，但在使用MART抗原模型系统的情况下，‘成熟后电穿孔-CD40L’法(该方法首先用TNF-α、IFN-γ和PGE2成熟DC，然后用CD40L加抗原编码mRNA电穿孔)导致CTL活性显著提升(图13)。另外，使用来源于肾细胞癌患者的全自体材料测试PME-CD40L法对IFN-γ和IL-2应答的诱导：如上所述制备用于PME-CD40L法的患者DC，用自体总扩增的RCC肿瘤RNA电穿孔。将抗原载荷DC与自体患者CD8T细胞培养，通过胞内细胞因子染色研究在激发DC以及肿瘤相关抗原、hTERT、生存蛋白和RCC特异性抗原、G250转染的各DC作用下产生的响应CTL。eGFP编码mRNA转染的DC用作阴性对照刺激剂。图14表明，患者T细胞响应于总扩增的RCC RNA载荷DC，还响应于3种肿瘤相关抗原，IFN-γ和IL-2频率均高于eGFP mRNA转染的阴性对照诱导的频率。(对eGFP的应答由对各RCC相关DC靶的总应答中扣除)。
‘基于CD40L的方法’成熟并用KRN7000脉冲的DC可募集增强初始CTL诱导的NKT细胞
经CD1d/KRN7000四聚体染色确定(图15a)，相比于用载体代替KRN7000脉冲的相同成熟RNA载荷DC，用KRN7000脉冲载荷MART-1mRNA、基于CD40L的方法成熟的DC增加PBMC培养物中的NKT细胞频率。使用用于应答CTL(MART-1/HLA-A2)的四聚体分析，脉冲至MART-1mRNA转染DC上的KRN7000的存在显著增加MART反应性T细胞的频率(图15b)。因此，NKT细胞在PBMC培养物中的扩增提供了放大回路(amplication loop)，其可能通过源于NKT细胞的‘辅助’实现，可支持初始CD8CTL发展。
CD40L mRNA的优化
由质粒模板pCR2.1CD40L WT转录CD40L RNA，其用于证实优选成熟途径的原始DC实验。优选的CD40L RNA包含ARCA帽类似物和polyA尾。通过去除位于起始密码子ATG密码子5′的XbaI-EcoRV片段修饰质粒pCR2.1CD40L WT。片段含32个核苷酸的载体序列，含3个隐蔽的潜在起始密码子ATG密码子。该修饰的合理性在于这些额外的ATG可通过与正确的CD40L翻译起始位点竞争干扰CD40L翻译的有效起始。CD40L的编码序列仍未受这些修饰感染。根据IL-12表达诱导的检测，由这些修饰的质粒模板转录的CD40L RNA在两个独立DC转染实验中表现得好于现有CD40L参比标准。修饰的质粒称为pCR2.1CD40L WTδX-E。
另外，我们希望测定通过将CD40L 5′非翻译区直接置于CD40L起始密码子上游是否可进一步优化CD40L RNA的表达。通过将39bp的CD40L 5′非翻译序列直接定位于CD40L翻译起始位点上游，进一步修饰pCR2.1CD40L WTδX-E质粒。由该质粒转录的RNA没有像由CD40L WTδX-E转录的RNA一样好的表现，而是表现得类似于由pCR2.1CD40L WT转录的现有CD40L(图18)。因此，pCR2.1CD40LWTδX-E质粒是优选质粒。对应于由pCR2.1CD40L WTδX-E质粒转录的CD40L RNA的DNA序列示于SEQ ID NO：11。ATG起始密码子于41位开始。
Figure IYZ000001843470600011
Figure IYZ000001843470600021
Figure IYZ000001843470600031
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Figure IYZ000001843470600231

Claims (33)

1.一种制备成熟树突细胞的方法，所述方法包括以下的顺序步骤：
(a)在TNF-αR激动剂存在下用含干扰素γ受体(IFN-γR)激动剂的第一信号向分离的不成熟树突细胞传导信号，以产生CD83+成熟的树突细胞；和
(b)用含有效量的CD40激动剂的第二瞬时信号向所述CD83+成熟的树突细胞传导信号，以产生CD83+CCR7+成熟树突细胞；其中，在起始所述第一信号后约12-30小时通过电穿孔用CD40L mRNA转染所述树突细胞给予所述第二瞬时信号。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括使所述不成熟树突细胞或所述已传导信号的树突细胞与PGE2接触。
3.权利要求1的方法，其中所述(a)和(b)步骤还包括使所述细胞与GM-CSF和IL-4或IL-13中的至少一种接触。
4.权利要求1的方法，其中所述CD40L mRNA编码含SEQ IDNO：2的多肽。
5.权利要求1的方法，其中所述CD40L mRNA编码含SEQ IDNO：10的多肽。
6.权利要求1的方法，其中所述mRNA编码CD40L多肽，并包含选自以下的多核苷酸：
a)SEQ ID NO：1的多核苷酸；
b)含SEQ ID NO：1的核苷酸40-822的多核苷酸；
c)SEQ ID NO：9的多核苷酸；
d)SEQ ID NO：13的多核苷酸；
e)多核苷酸(a)、(b)、(c)或(d)，其还包含选自SEQ ID NO：14、15、16、17或18的核酸的3′非翻译序列和/或选自SEQ ID NO：19、20、21、22或23的核酸的5′非翻译序列。
7.权利要求1的方法，其中所述CCR7+成熟树突细胞分泌0-500pg IL-10/106树突细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述CCR7+成熟树突细胞分泌IL-12p70蛋白。
9.权利要求1的方法，其中所述不成熟树突细胞由外周血单核细胞制备。
10.权利要求9的方法，其中在IL-4和/或IL-13存在下通过使所述外周血单核细胞与GM-CSF接触制备所述不成熟树突细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述IFN-γR激动剂是IFN-γ。
12.权利要求11的方法，其中所述IFN-γ具有SEQ ID NO：6的序列。
13.权利要求1的方法，所述方法还包括将一种或多种抗原或编码一种或多种抗原的多核苷酸导入所述不成熟树突细胞、已传导信号的树突细胞或CCR7+成熟树突细胞中，以产生载荷抗原的CCR7+成熟树突细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述抗原选自：病原体、病原体裂解物、病原体提取物、病原体多肽、癌细胞、癌细胞裂解物、癌细胞提取物、癌细胞特异性多肽。
15.权利要求13的方法，其中将编码所述抗原的多核苷酸导入到所述不成熟树突细胞、已传导信号的树突细胞或CCR7+成熟树突细胞中。
16.权利要求15的方法，其中所述多核苷酸通过电穿孔导入。
17.权利要求15的方法，其中所述多核苷酸为mRNA。
18.权利要求15的方法，其中所述编码抗原的mRNA与编码CD40激动剂的mRNA一起导入。
19.权利要求13的方法，其中所述抗原或多核苷酸在所述第一信号之前导入。
20.权利要求13的方法，其中所述抗原或多核苷酸在所述第一信号之后和所述第二信号之前传递。
21.权利要求13的方法，其中所述抗原或多核苷酸在所述第二信号之后传递。
22.权利要求13的方法，其中所述抗原或多核苷酸基本与所述第二信号同时传递。
23.一种刺激免疫效应细胞的方法，所述方法包括在通过权利要求13的方法生产的抗原载荷CCR7+成熟树突细胞存在下培养所述细胞，以生产受刺激免疫效应细胞。
24.权利要求1的方法，其中所述第二瞬时信号传递至成熟CD83+CCR7-树突细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述IFN-γR激动剂是IFN-γ。
26.权利要求24的方法，其中所述第二瞬时信号在编码CD40激动剂的mRNA于所述成熟CD83+CCR7-树突细胞中翻译时发出。
27.权利要求1的方法，所述方法还包括使所述不成熟树突细胞、所述已传导信号的树突细胞或所述CCR7+树突细胞与NKT细胞配体接触。
28.权利要求27的方法，其中所述NKT细胞配体是选自以下的化合物：α-半乳糖苷神经酰胺、α-葡糖基神经酰胺、α-6-脱氧半乳糖苷神经酰胺、α-6-脱氧呋喃半乳糖苷神经酰胺、β-6-脱氧呋喃半乳糖苷神经酰胺、β-阿拉伯糖基神经酰胺、α-C-半乳糖苷神经酰胺和α-S-半乳糖苷神经酰胺。
29.权利要求28的方法，其中所述化合物是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇(KRN7000)。
30.权利要求27的方法，其中所述CCR7+树突细胞与所述NKT细胞配体接触。
31.权利要求27的方法，其中所述不成熟树突细胞与所述NKT细胞配体接触。
32.权利要求27的方法，其中所述已传导信号的树突细胞与所述NKT细胞配体接触。
33.一种CCR7+成熟树突细胞，所述树突细胞通过权利要求1的方法制备。
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