ES2861199T3 - Composiciones de células dendríticas maduras y procedimientos para cultivar las mismas - Google Patents

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Abstract

Células dendríticas humanas maduras (CD) de CCR7+ maduradas in vitro obtenidas mediante un procedimiento que comprende los pasos secuenciales de: (a) señalización de células dendríticas inmaduras aisladas (CDi) in vitro con una primera señal que comprende IFN-γ, TNF-α y PGE2 para producir células dendríticas CD83+ maduras señalizadas, en el que dichas células dendríticas inmaduras se preparan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC); y (b) señalizar dichas células dendríticas maduras CD83+ in vitro con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad eficaz de CD40L para producir células dendríticas maduras CCR7+ CD83+, en el que dicha segunda señal se efectúa tras la traducción de un ARNm que codifica CD40L, y dichas células se transfectan con dicho ARNm usando electroporación, en el que la electroporación se inicia de 12 a 30 horas después del inicio de la señalización de las CD con IFN-γ y TNF-α, y en el que las CD se cargan con un antígeno por transfección con un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, dicha transfección también tiene lugar usando electroporación, y además en el que las CD producen al menos 1000 pg de IL-12 p70/106 CD y tienen la capacidad de migrar.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de células dendríticas maduras y procedimientos para cultivar las mismas
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional estadounidense 60/522,512, presentada el 7 de octubre de 2004,
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a la generación de células dendríticas maduras y su uso en terapia celular y para educar a las células efectoras inmunes. Las células dendríticas maduras se pueden generar a partir de células dendríticas inmaduras.
Antecedentes
La terapia celular utiliza células presentadoras de antígeno modificadas (APC) o células efectoras inmunes para iniciar una respuesta inmunitaria en un paciente. Las células presentadoras de antígenos son fundamentales para la terapia celular porque inician la respuesta inmunitaria. De hecho, son las únicas células capaces de inducir una respuesta inmunitaria primaria de los linfocitos T.
Las células dendríticas (CD) son las APC más potentes involucradas en la inmunidad adaptativa. Estas coordinan el inicio de las respuestas inmunitarias por parte de las células T y las células B naive e inducen respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicas de antígeno. Las CD están especializadas de varias formas para cebar células T colaboradoras y asesinas in vivo. Por ejemplo, las CD inmaduras que residen en tejidos periféricos están equipadas para capturar antígenos y producir complejos inmunogénicos de MHC-péptido. En respuesta a los estímulos que inducen la maduración, como las citocinas inflamatorias, las CD inmaduras se convierten en potentes estimuladores de células T al aumentar de modo regulado la adhesión y las moléculas coestimuladoras. Al mismo tiempo, migran a órganos linfoides secundarios para seleccionar y estimular células T específicas de antígeno raras. Sin embargo, la estimulación potente de las células T ocurre solo después de la maduración de las DC, un proceso que aumenta la disponibilidad de complejos MHC/péptido en la superficie celular, además de moléculas coestimuladoras, que dirigen la función efectora de las células T de respuesta. De hecho, las CD inmaduras pueden ser perjudiciales en inmunoterapias antitumorales y otras porque pueden inducir inmunotolerancia en lugar de inmunoestimulación.
La coestimulación es típicamente necesaria para que una célula T produzca niveles de citocina suficientes que induzcan la expansión clonal. Una característica de las células dendríticas que las convierte en potentes células presentadoras de antígenos es que son ricas en moléculas coestimuladoras de la respuesta inmune, como las moléculas CD80 y CD86, que activan la molécula CD28, en los linfocitos T. A cambio, las células T colaboradoras expresan CD40L, que liga CD40 en las CD. Estas interacciones mutuas entre las CD y las células T conducen a la "maduración" de las primeras y al desarrollo de la función efectora en las últimas. La expresión de moléculas de adhesión, como la molécula CD54 o la molécula CD11a/CD18, facilitan la cooperación entre las células dendríticas y las células T. Otra característica especial de las células dendríticas es el despliegue de diferentes funciones dependiendo de su etapa de diferenciación. Así, la captura del antígeno y su transformación son las dos funciones principales de la célula dendrítica inmadura, mientras que su capacidad de presentar el antígeno con el fin de estimular las células T aumenta a medida que las células dendríticas migran hacia los tejidos y los ganglios linfáticos. Este cambio de funcionalidad corresponde a una maduración de la célula dendrítica. Así, el paso de la célula dendrítica inmadura a la célula dendrítica madura representa un paso fundamental en el inicio de la respuesta inmune. Tradicionalmente, esta maduración fue seguida por el monitoreo del cambio de los marcadores de superficie en las CD durante este proceso. Algunos de los marcadores de superficie celular más importantes característicos de las diferentes etapas de maduración de las células dendríticas se resumen en la Tabla I, más adelante. Sin embargo, los marcadores de superficie pueden variar según el proceso de maduración.
Tabla I
Tipo de célula Marcadores de superficie
Células madre
hematopoyéticas CD34+
Monocitos CD14++, DR+, CD86+, CD16+/-, CD54+, CD40+
Célula dendrítica inmadura CD14+/-, CD16-, CD80+/-, CD83-, CD86+, CD1a+, CD54+, DQ+, DR++
Célula dendrítica madura CD14-, CD83++, CD86++, CD80++, DR+++, DQ++, CD40++, CD54++, CD1a +/Actualmente, para la inmunoterapia se prefieren las CD maduras a las CD inmaduras. Solo la progenie de DC completamente madura carece de receptor de GM-CSF (GM-CSF-R) y permanece establemente madura tras la eliminación/en ausencia de GM-CSF. Además, se ha demostrado que las CD maduras son superiores para inducir respuestas de células T in vitro e in vivo. Por el contrario, se informa que las CD inmaduras inducen tolerancia in vitro (Jonuleit et al. (2000) Exp. Med. 192:1213), como también in vivo (Dhodapkar et al. (2001) Exp. Med. 193:233) induciendo células T reguladoras. Las células dendríticas maduras también son útiles para absorber y presentar antígeno a los linfocitos T in vitro o in vivo. Las CD presentadoras de antígenos modificadas y/o las células T formadas a partir de estas CD modificadas tienen muchas aplicaciones, que incluyen diagnóstico, terapia, vacunación, investigación, cribado y administración de genes.
Es difícil aislar las células dendríticas maduras de la sangre periférica porque menos del 1% de los glóbulos blancos pertenecen a esta categoría. Las CD maduras también son difíciles de extraer de los tejidos. Esta dificultad, en combinación con el beneficio terapéutico potencial de las CD en la terapia celular, ha impulsado la investigación y el desarrollo hacia nuevos procedimientos para generar células dendríticas maduras utilizando fuentes alternativas. Se informa que varios procedimientos producen CD maduras a partir de células dendríticas inmaduras.
Por ejemplo, Jonuleit et al. (Eur J Immunol (1997) 12:3135-3142) divulgan la maduración de CD humanas inmaduras mediante cultivo en medio que contiene un cóctel de citocinas (IL-1p, TNF-a, IL-6 y PGE2).
El documento WO 95/28479 describe un procedimiento para preparar células dendríticas mediante el aislamiento de células de sangre periférica y el enriquecimiento de células precursoras de sangre CD34+, seguido de la expansión con una combinación de factores de crecimiento hematopoyéticos y citocinas.
La publicación de patente europea EP-A-0922758 divulga la producción de células dendríticas maduras a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de células pluripotenciales que tienen el potencial de expresar características de células dendríticas o de macrófagos. El procedimiento requiere poner en contacto las células dendríticas inmaduras con un factor de maduración de células dendríticas que contiene IFN-y.
La publicación de patente europea EP-B-0 633930 enseña la producción de células dendríticas humanas cultivando primero células hematopoyéticas CD34+ humanas (i) con GM-CSF, (ii) con TNF-a e IL-3, o (iii) con GM-CSF y TNF- a para inducir la formación de células hematopoyéticas CD1a+.
La publicación de patente No. 2004/0152191 divulga la maduración de células dendríticas poniéndolas en contacto con RU 41740.
La publicación de patente de EE.UU. No. 2004/0146492 enseña un procedimiento para producir células dendríticas recombinantes transformando células madre hematopoyéticas seguido de diferenciación de las células madre en células dendríticas mediante cultivo en medio que contiene GM-CSF.
La publicación de patente de EE.UU. No. 2004/0038398 divulga procedimientos para la preparación de poblaciones sustancialmente purificadas de CD y monocitos a partir de sangre periférica de mamíferos. Las células mieloides se aíslan del mamífero y las CD se separan de esta población para producir una subpoblación aislada de monocitos. Luego, las CD se enriquecen mediante selección negativa con anticuerpos anti-CD2 para eliminar las células T.
Aunque las CD maduras son funcionalmente competentes y, por lo tanto, son útiles para inducir células T específicas de antígeno, no todas las CD maduras están optimizadas para inducir estas respuestas. Se ha demostrado que algunas CD maduras también pueden estimular las células T colaboradoras secretando IL-12. Macatonia et al. (1995) Immunol.
154:507 1; Ahuja et al. (1998) Immunol. 161:868 and Unintford et al. (1999) Immunol. 97:588. También se ha demostrado que la IL-12 mejora la respuesta de las células CD8+ T específicas de antígeno al antígeno en un modelo animal. Schmidt et al. (1999) Immunol. 163:2561.
Mosca et al. (2000) Blood 96:3499, divulgan que el cultivo de CD en medio AIM V que contiene tanto el trímero de CD40L soluble, como el IFNY1b, da como resultado un aumento de la expresión de IL-12 en comparación con el cultivo en un medio que contiene sólo trímero de CD40L soluble.
Koya et al. (2003) J. Immunother. 26(5):451 informan que la expresión de IL-12 se puede potenciar transduciendo CD inmaduras, en presencia de IFNy, con un vector lentiviral que codifica el ligando CD40. Más del 90% de las CD transducidas con CD40L expresaron CD83 en su superficie celular. Desafortunadamente, las células lentivirales transducidas no son adecuadas para propósitos terapéuticos y la integración proviral en el genoma de la célula transducida puede resultar en leucemia. Además, la expresión persistente de CD40L puede tener efectos perjudiciales sobre la función y viabilidad de APC.
Este trabajo complementó el trabajo anterior de Mackey, et al. (1998) J. Immunol. 161:2094 que informaron que in vivo, las CD requieren maduración a través de CD40 para generar inmunidad antitumoral. Del mismo modo, Kuniyoshi, J.S. et al. (1999) Cell Immunol. 193:48 han demostrado que las CD tratadas con ligando CD40 trimérico soluble más IFN-y estimularon una potente proliferación de células T e indujeron células T con lisis aumentada específica de antígeno. Kalady, M.F. et al. (2004) J. Surg. Res. 116:24, informó que las CD derivadas de monocitos humanos transfectadas con ARNm que codifica el antígeno de melanoma MART-1 o la proteína de la matriz de la influenza M1 expuestas a diferentes estímulos de maduración añadidos simultánea o secuencialmente mostraron variabilidad en la presentación de antígenos, secreción de IL-12 e inmunogenicidad de las células T efectoras generadas en presencia de estas CD. Del modo más importante, este estudio mostró que la aplicación de un 'cóctel de citocinas' que consta de IL-1p, TNF-a, IL-6 y PGE2, seguido de proteína CD40L soluble extracelular fue superior a la aplicación de todos los agentes simultáneamente. Sin embargo, estos autores no estudiaron la combinación de señalización de IFN-y con señalización transitoria de CD40L en un proceso secuencial. Además, a pesar de la producción de IL-12 cuando se añaden concomitantemente IFN-y y CD40L al medio de cultivo, la técnica anterior reciente muestra que las CD resultantes son en realidad inmunosupresoras, en lugar de proinflamatorias (Hwu et al. (2000) J. Immunol. 164: 3596; Munn et al. (2002) 297:1867; and Grohmann et al. (2003) Trends Immunol. 24:242) debido a la inducción de una enzima que metaboliza el triptófano dando como resultado la inanición de las células T respondedoras que luego no proliferan. Por tanto, la literatura actual sugiere que la combinación de IFN-y y CD40L no debería aumentar la inmunopotencia. La presente invención aborda la necesidad sentida desde hace mucho tiempo de proporcionar procedimientos mejorados para la maduración de CD y CD maduras con inmunopotencia mejorada. Faries et al (2010) describen que la señalización del calcio inhibe la producción de IL-12 y activa CD83+ CD que inducen el desarrollo de células Th2.
Resumen de la invención
Las solicitantes han descubierto que se produce una potente inmunoestimulación cuando las células dendríticas inmaduras se señalan secuencialmente con una primera señal que comprende un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-yR) seguida de una segunda señal que comprende un agonista de CD40.
En un aspecto, la invención proporciona células dendríticas humanas maduras (CD) CCR7+ maduradas in vitro obtenidas mediante un procedimiento que comprende las etapas secuenciales de:
(a) señalización de células dendríticas inmaduras aisladas (iCD) in vitro con una primera señal que comprende IFN-y, TNF-a y PGE2 para producir células dendríticas CD83+ maduras señalizadas, en el que dichas células dendríticas inmaduras se preparan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC); y
(b) señalizar dichas células dendríticas maduras CD83+ in vitro con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad eficaz de CD40L para producir células dendríticas maduras CCR7+ CD83+, en el que dicha segunda señal se efectúa tras la traducción de un ARNm que codifica CD40L, y dichas células se transfectan con dicho ARNm usando electroporación, en donde la electroporación se inicia de 12 a 30 horas después del inicio de la señalización de las CD con IFN-y y TNF-a, y donde las CD se cargan con un antígeno por transfección con un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, y dicha transfección también tiene lugar usando electroporación y además, en el que las CD producen al menos 1000 pg de IL-12 p70/106 CD y tienen capacidad para migrar.
En una forma de realización, las etapas (a) y (b) del procedimiento comprenden además poner en contacto dichas células con GM-CSF y al menos una de IL-4 o IL-13.
En una forma de realización, dicha CD40L se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2;
b) un fragmento del polipéptido de la etapa (a) en el que dicho fragmento se une a CD40, o en el que CD40L es un polipéptido que tiene al menos un 77% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
i) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2; y
ii) un fragmento del polipéptido de (a) en el que dicho fragmento se une a CD40.
En una forma de realización, dicho ARNm codifica un polipéptido CD40L y comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido de SEQ ID NO:1;
b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 40 a 822 de SEQ ID NO: 1;
c) un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con cualquier polinucleótido de (a) o (b); y
d) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con cualquier polinucleótido de (a) a (c).
En una forma de realización, las CD maduras de CCR7+ secretan de 0 a 500 pg de IL-10 por 106 CD, y/o en el que las células dendríticas inmaduras se preparan poniendo en contacto dichas PBMC con GM-CSF en presencia de IL-4 y/o IL-13.
En una forma de realización, el antígeno se selecciona de patógenos, lisados de patógenos, extractos de patógenos, polipéptidos de patógenos, células cancerosas, lisados de células cancerosas, extractos de células cancerosas y polipéptidos específicos de células cancerosas.
En una forma de realización, el o los ARNm que codifica(n) el antígeno o los antígenos se introduce en dichas CD junto con el ARNm que codifica CD40L.
En una forma de realización, el IFN-y tiene la secuencia de SEQ ID NO:6 o comprende un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6.
En un aspecto, la invención proporciona una población enriquecida de CD maduras de la invención. En una forma de realización de los aspectos de la invención, dicha señalización se realiza en ausencia de una cantidad eficaz de IL-1p y/o IL-6.
En consecuencia, esta invención proporciona un procedimiento para preparar células dendríticas maduras (DC), que comprende las etapas secuenciales de: (a) señalizar células dendríticas inmaduras aisladas (iDC) con una primera señal que comprende un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-yR), y opcionalmente un agonista de TNF-aR, para producir células dendríticas señalizadas; y (b) señalizar dichas células dendríticas señalizadas con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad eficaz de un agonista de CD40 para producir células dendríticas maduras CCR7+.
En casos preferidos, las CD inmaduras se ponen en contacto adicionalmente con PGE2 y, opcionalmente, con TNF-a. En casos alternativos, el procedimiento comprende además poner en contacto las CD inmaduras, CD señalizadas y/o células dendríticas maduras CCR7+ con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: galactosilceramidas, glicosilceramidas, galactofuranosilceramidas, arabinopiranosilceramidas, a-C-galactosilceramidas y a-S-galactosilceramidas. Preferiblemente, el compuesto es una galactosilceramida. Lo más preferiblemente, la galactosilceramida es (2S, 3S, 4R)-1-O-(alfa-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilanino)-1,3,4-octadecanotriol (KRN7000).
En otro caso de la divulgación, el agonista de IFN-yR puede reemplazarse por un agonista del receptor del factor de necrosis tumoral alfa (TNFaR). Por tanto, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar una población enriquecida de células dendríticas maduras (CD), que comprende la señalización secuencial de células dendríticas inmaduras con una primera señal que comprende un agonista del receptor del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-aR) seguida de una segunda señal que comprende un agonista de CD40, preparando así una población enriquecida de células dendríticas maduras, en el que dicha señalización está en ausencia de una cantidad eficaz de IL-10 o IL-6. Preferiblemente, las CD inmaduras se ponen en contacto además con PGE2.
Los agonistas de IFN-yR preferidos son IFN-y de mamífero, preferiblemente IFN-y humano y fragmentos activos del mismo. Los agonistas de TNF-aR preferidos son TNF-a de mamífero, preferiblemente TNF-a humano y fragmentos activos del mismo. Los agonistas de CD40 preferidos son ligandos de c D40 de mamífero (CD40L), preferiblemente CD40L humano y fragmentos activos y variantes de los mismos, así como anticuerpos agonistas del receptor de CD40. La señalización puede iniciarse proporcionando el agonista de señalización en el medio de cultivo, la introducción del agonista en la célula y/o tras la traducción dentro de la célula dendrítica de un ARNm que codifica un polipéptido agonista. El procedimiento se puede practicar in vivo o ex vivo. Las células dendríticas maduradas ex vivo de acuerdo con los procedimientos de la invención pueden administrarse al sujeto para inducir o mejorar una respuesta inmune.
Cada una de las células dendríticas se puede modificar adicionalmente mediante la administración de un inmunógeno a las CD. La CD tomará y procesará el inmunógeno y lo mostrará en su superficie celular. El inmunógeno se puede administrar in vivo o ex vivo. Las CD cultivadas y maduradas se pueden administrar a un sujeto para inducir o mejorar una respuesta inmune. En otra forma de realización más, las CD maduras cargadas con antígeno se utilizan para educar a las células efectoras inmunes naive.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende células dendríticas maduradas in vitro, tales como CD maduras CD83+ CCR7' y CD maduras CD83+ CCR7+. Las células dendríticas maduras de la invención expresan niveles aumentados de IL-12 en comparación con las células dendríticas inmaduras y/o expresan menos de 500 pg de IL-10 por millón de células dendríticas. Las composiciones de la invención son útiles para generar una respuesta inmune en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de la población.
Breve descripción de la lista de secuencias
SEQ ID NO:1 es un ADNc de CD40L humano. Los nucleótidos 40 a 825 representan la región codificante, que incluye el codón de inicio de traducción ATG y el codón de parada de traducción TGA.
SEQ ID NO:2 es una secuencia de aminoácidos para la proteína CD40L humana de longitud completa.
SEQ ID NO:3 es un ADNc de CD40 humano. Los nucleótidos 67 a 522 representan la región codificante, que incluye el codón de inicio de la traducción ATG y el codón de parada de la traducción TAG.
SEQ ID NO:4 es una secuencia de aminoácidos para CD40 humano (el receptor para CD40L).
SEQ ID NO:5 es un ADNc de IFN-y humano. Los nucleótidos 109 a 609 representan la región codificante, que incluye el codón de inicio de la traducción ATG y el codón de parada de la traducción.
SEQ ID NO:6 es una secuencia de aminoácidos para IFN-y humano.
SEQ ID NO:7 es un ADNc de TNF-a humano. Los nucleótidos 170 a 971 representan la región codificante, que incluye el codón de inicio de traducción ATG y el codón de parada de traducción TGA.
SEQ ID NO:8 es una secuencia de aminoácidos para TNF-a humano.
SEQ ID NO:9 es un ADNc de CD40L de ratón. Los nucleótidos 13 a 795 representan la región codificante, incluyendo el codón de inicio de traducción ATG y el codón de parada de traducción TGA.
SEQ ID NO:10 es una secuencia de aminoácidos para la proteína CD40L de ratón de longitud completa.
SEQ ID NO:11 es un cebador CD40L 5'.
SEQ ID NO:12 es un cebador CD40L 3'.
SEQ ID NO:13 es la secuencia de ADN correspondiente a un ARNm de CD40L humano optimizado.
SEQ ID NO:14 es 3'UTR receptor de CD40.
SEQ ID NO:15 es la región no traducida del exón final de la beta-actina 3' UTR humana.
SEQ ID NO:16 es el elemento funcional mínimo de la beta-actina 3' UTR humana.
SEQ ID NO:17 es el rotavirus de simio Gen 63'UTR.
SEQ ID NO:18 es el elemento funcional mínimo del gen 63'UTR del rotavirus de simio.
SEQ ID NO:19 es la Hsp705'UTR humana (HSPA1A).
SEQ ID NO:20 es el VEGF 5'UTR de ratón.
SEQ ID NO:21 es el elemento funcional mínimo del VEGF 5'UTR de ratón.
SEQ ID NO:22 es la región LTR RU5 del virus de la necrosis del bazo.
SEQ ID NO:23 es la secuencia líder 5' del virus del grabado del tabaco.
SEQ ID NO:24-25 son un péptido MART-APL restringido por HLA-A201, péptido nativo y péptido PSA-1, respectivamente. Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra que la maduración secuencial de las CD con IFN-y luego CD40L soluble da como resultado una secreción óptima de IL-12p70. Las CD se maduraron con un cóctel de citocinas, CD40L soluble solo o con CD40L soluble más IFN-y. La preincubación de CD inmaduras con 1000 U/ml de IFN-y durante 18 horas, seguida de la adición de CD40L soluble durante 18 horas más, da como resultado la liberación máxima de IL-12p70. La aplicación de CD40L soluble primero, seguida de IFN-y se percibe como una señal negativa, con una liberación mínima de IL-12p70, acompañada de IL-10.
La Figura 2 muestra que las células HELA transfectadas con ARNm que codifica CD40L y que tienen una cola poliA de > 400 nucleótidos expresan la proteína de la superficie celular, como se define por análisis FACs con anticuerpo anti-CD40L (CD 154).
La Figura 3 muestra que la secreción de IL-12p70 a partir de células transfectadas con ARNm de CD40L es proporcional al tamaño de la carga útil de transfección. Las CD se transfectaron con una titulación de ARNm de CD44L seguida inmediatamente por la adición de 1000 U/ml de IFN-y. Se requieren al menos 4 pg por millón de CD de ARNm de CD40L para inducir niveles significativos de liberación de IL-12p70.
La Figura 4 muestra que se requieren al menos 100 U/ml de IFN-y para sinergizar con la carga útil de ARNm de CD40L para inducir la secreción máxima de IL-12p70. Las CD se transfectaron con 4 pg de ARNm de CD40L por millón de células y se incubaron inmediatamente con una titulación de IFN-y. Se midieron IL-12p70 e IL-10 en sobrenadantes de cultivo después de 24 horas.
La Figura 5A muestra que la secreción de IL-12p70 inducida por CD40L/IFN-y ocurre aproximadamente 24 horas después de la transfección de CD y el cultivo en presencia de IFN-y. Las CD se transfectaron con 4 pg de ARNm de CD40L por millón de células y se cultivaron inmediatamente con 1000 U/ml de IFN-y. Los sobrenadantes se recogieron de cultivos de réplica en los momentos designados y se analizaron para determinar el contenido de IL-12p70 e IL-10.
La Figura 5B muestra que la adición de TNF-a a CD transfectadas con ARNm de CD40L da como resultado la generación de IL-12p70, pero el nivel de expresión es menor que el alcanzado con IFN-y como agente de co-maduración.
La Figura 5C muestra que el uso de TNF-a como factor de co-maduración también da como resultado niveles elevados de IL-10 en comparación con el uso de IFN-y
Las Figuras 6A y 6B muestran que las DCS transfectadas con ARNm que codifica CD40L demuestran expresión celular como se define por análisis FACs con anticuerpo anti-CD40L (CD 154). En la Figura 6A, las CD se transfectaron con 4 |jg de ARNm de CD40L por millón de células y se analizaron en diversos puntos de tiempo. La mayoría de CD40L se localiza dentro de un compartimento intracelular, como lo demuestra un punto de tiempo de 4 horas en el que la expresión de la superficie es considerablemente menor. La Figura 6B muestra que la expresión intracelular significativa es evidente a los 60 minutos con un 27% de CD positivas y que aumenta al 79% a las 3 horas.
La Figura 6C muestra la expresión transitoria de la proteína CD40L después de la transfección de CD con ARNm que codifica CD40L.
La Figura 7 muestra que las CD transfectadas con ARNm de CD40L y cultivadas en presencia de IFN-y secretan IL-12p70 a pesar de la presencia de un exceso de anticuerpo anti-CD40L bloqueante, las interacciones CD40/CD40L operan dentro de un compartimento "intracelular". Las CD se transfectaron con 4 |jg de ARNm de CD40L y se cultivaron inmediatamente con 1000 U/ml de IFN-y en presencia de 10 o 50 g/ml de anticuerpo anti-CD40L bloqueante. La liberación de IL-12p70 se reduce solo en un 50%, lo que indica que la señalización intracelular, en lugar de la señalización de célula a célula, es la vía principal para la inducción de IL-12p70.
La Figura 8 muestra que las CD transfectadas con ARNm de CD40L y cocultivadas con IFN-y requieren la presencia de PGE2 para permitir la migración dependiente de quimiocinas. Las CD se transfectaron con una titulación de ARNm de CD40L y se incubaron inmediatamente con 1000 U/ml de IFN-y y 1 g/ml de PGE2. Las CD transfectadas con eGFP y maduradas con un cóctel de citocinas que contiene PGE2 representan un control positivo. Después de 18 horas de maduración, las CD de cada condición de cultivo se probaron en ensayos de migración "transwell" contra las quimiocinas autodirigidas de ganglios linfáticos, CCL19 y 21. La migración de CD fue proporcional al tamaño de la carga útil de ARNm de CD40L.
La Figura 9 muestra que las CD maduraron mediante transfección con ARNm de CD40L y se cultivaron en presencia de IFN-y y PGE2 invocan "respuestas de recuperación" de células T eficientes en comparación a CD maduradas en presencia del "cóctel de citocinas". Las CD se cotransfectaron con 2 jg de ARNm de gripe Ml por millón de células como carga útil de antígeno y 4 j g de ARNm de eGFP de control, y posteriormente se maduraron con un cóctel de citocinas. Alternativamente, las CD se cotransfectaron con 2 jg de ARNm de la gripe M1 por millón de células como carga útil de antígeno y 4 jg de ARNm de CD40L como carga útil de maduración. Estas últimas células se cultivaron inmediatamente en 1000 U/ml de IFN-y y 1 jg/m l de PGE2 para completar el proceso de maduración. Después de 24 horas, cada población de CD se usó en los ensayos ELISpot para reclutar respuestas de recuperación de Ml anti-gripe, tal como se determinan por la frecuencia de respuesta de las células T que secretan IFN-y. Las CD maduradas por transfección con ARNm de CD40L en presencia de IFN-y y PGE2 invocaron una respuesta antigripal más potente.
La Figura 10 muestra que las CD maduradas mediante transfección con ARNm de CD40L y cultivadas en presencia de IFN-y y PGE2 invocan "respuestas primarias de células T" eficientes en comparación con las CD maduradas en presencia del "cóctel de citocinas". Las CD se transfectaron con 2 jg de ARNm de MART-APL por millón de células como carga útil de antígeno y, posteriormente, se maduraron con un cóctel de citocinas. Alternativamente, las CD se cotransfectaron con 2 jg de ARNm de MART-APL por millón de células como carga útil de antígeno y 4 jg de ARNm de CD40L como carga útil de maduración. Estas últimas células se cultivaron inmediatamente en 1000 U/ml de IFN-y y 1 jg/m l de PGE2 para completar el proceso de maduración. Después de 24 horas, cada población de CD se utilizó para aumentar las respuestas de células T a las secuencias de péptidos MART-APL, generadas a partir de la carga útil de ARNm de MART-APL transfectado, mediante cocultivo de células T CD8+ autólogas naive durante 7 días en presencia de 0.2 U/ml de IL-2. Después de esta primera ronda de estimulación, las células T se recolectaron y se establecieron en ensayos ELISpot de IL-2, reestimuladas con las CD cargadas con antígeno maduradas apropiadamente. Las CD maduradas por transfección con ARNm de CD40L en presencia de IFN-y y PGE2 invocaron una respuesta anti-MART-APL más potente determinada por la frecuencia de células T CD8+ respondedoras que secretan IL-2.
La Figura 11 muestra la inducción de células T citotóxicas por CD que expresan ARNm de MART-APL. La Figura 11a muestra que la maduración de las CD usando cotransfección con ARNm de MART-APL como fuente de antígeno, y ARNm de CD40L, con la adición de interferón-Y soluble/PGE2 invoca una respuesta de CTL efectiva, mientras que la figura 11b muestra que las CD transfectadas con ARNr MART-APL, pero maduradas con un "cóctel de citocinas", no lo hace. T2-PSA: células T2 pulsadas con un péptido restringido a HLA-A2 de antígeno prostático específico (PSA) como diana de control negativo. MART-T2: células T2 pulsadas con el epítopo MART restringido a HLA-A2 en su secuencia nativa. MART-APL-T2: células T2 pulsadas con el epítopo MART restringido a HLA-A2 como el "ligando de péptido alterado" preferido.
La Figura 12 muestra la capacidad migratoria de las CD maduradas con PME-CD40L en ensayos transwell a las quimiocinas de los ganglios linfáticos, CCL19 y 21. Se probaron cuatro donantes sanos independientes en paralelo, y cada preparación de CD se transfectó con 1 jm de ARN tumoral de RCC total amplificado, junto con 4 jg de ARN de CD40L por millón de DC. Los ensayos de migración se establecieron 24 horas después de la transfección con las cargas útiles de ARNm.
La Figura 13 muestra la inducción de respuestas CTL de un donante sano al antígeno asociado a melanoma, MART-1. Las CD se prepararon y cargaron con ARN MART-1 y se maduraron mediante el 'proceso base CD40L' o las CD se prepararon usando el procedimiento PME-CD40L. Las CD y las células T CD8 purificadas se cocultivaron en una proporción 1:10, sometiéndose a tres rondas de estimulación en presencia de IL-2. Los datos muestran ensayos citotóxicos de liberación de 51CR utilizando células diana T2 pulsadas con péptido MART-1 en un intervalo de proporciones de efector-diana.
La Figura 14 muestra la inducción de una respuesta CTL completamente autóloga a las CD cargadas con ARN tumoral RCC amplificado total, CD maduradas con PME-CD40L. Las CD y las células T CD8 purificadas se cocultivaron en una proporción 1:10, sometiéndose a tres rondas de estimulación en presencia de IL-2. 5 días después de la última estimulación, las células T CD8 se reestimularon con CD transfectadas con: ARN de RCC amplificado total, ARN de hTERT, ARN de Survivina, ARN de G250 o CD de control negativo transfectadas con ARN de eGFP. Los datos se derivan de la identificación de células T respondedoras mediante tinción de la superficie celular para el marcador de activación, CD69, y detección simultánea de IFN-y e IL-2 intracelulares. Las respuestas de citocinas intracelulares se subdividieron para identificar IFN-y simple positivo (células efectoras) de IFN-y/IL-2 doble positivo (células de memoria).
La Figura 15 muestra la expansión de células NKT (a) y CTL reactivos a MART-1 (b) por CD40L transfectadas con ARN MART-1 en procedimiento de base maduradas CD pulsadas con KRN7000 o vehículo. Los datos muestran claramente que las CD pulsadas con KRN7000 pueden expandir las células NKT según lo definido por la tinción con tetrámero CD1d/KRN7000, y que la presencia de una población expandida de células NKT puede aumentar el reclutamiento concomitante de CTL primarios a MART-1, como se define por tinción de tetrámeros con tetrámeros MART-1/HLA-A2.
La Figura 16 muestra la alineación de los ADNc de CD40L humano (SEQ ID NO:1) y de ratón (SEQ ID NO:9). Las Figuras 16A, 16B y 16C representan 3 páginas consecutivas de la alineación de SEQ ID NO:1 y 2.
La Figura 17 muestra la alineación de las proteínas CD40L humana (SEQ ID NO:2) y de ratón (SEQ ID NO:10).
La Figura 18 muestra el nivel de expresión de IL-12 por CD transfectadas con ARNm transcrito del plásmido pCR2.1 CD40L WT Delta X-E en reacciones de transcripción a escala de 100 ug (Delta X-E1) o escala de 1 mg (Delta X-E2) usando mMessage mMachine T7Ultra Kit (Ambion). El ARN de referencia se transcribió a partir del plásmido pCR2.1 CD40L WT. Los ARN de CD40L transcritos se modificaron mediante la adición de una cola de poliA usando el kit polyA plus (Epicenter). Los ARN se transfectaron en DC. Aproximadamente 20 horas después de la transfección, se midió la cantidad de IL-12 en el sobrenadante de las CD maduradas usando Elisa. Negativo: medida de expresión de IL-12 en el sobrenadante de CD electroporadas sin ningún ARN de CD40L.
Modos de llevar a cabo la invención
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran dentro de las habilidades de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Estos procedimientos se describen en las siguientes publicaciones. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al. eds. (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (MacPherson, Hames and Taylor eds. (1995)); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1988)); USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999)); y ANIMAL CELL CULTURE (Freshney ed. (1987)).
Definiciones
Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluidas mezclas de las mismas.
Como se usa en este documento, el término "que comprende" pretende significar que las composiciones y procedimientos incluyen los elementos enumerados, pero sin excluir otros. "Que consiste esencialmente en" cuando se usa para definir composiciones y procedimientos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación. Por tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos definidos en el presente documento no excluiría trazas de contaminantes del procedimiento de aislamiento y purificación y vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina con pH regulado con fosfato, conservantes y similares. "Que consiste en" significará excluir más que oligoelementos de otros ingredientes y pasos sustanciales del procedimiento para administrar las composiciones de esta invención. Las formas de realización definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención.
Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, incluidos los intervalos, son aproximaciones que se varían (+) o (-) en incrementos de 0,1. Debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ejemplares y que se conocen equivalentes de los mismos en la técnica.
El término "antígeno" se comprende bien en la técnica e incluye sustancias que son inmunogénicas, es decir, inmunógenas. Se apreciará que el uso de cualquier antígeno está previsto para su uso en la presente invención y, por lo tanto, incluye, pero no se limita a, un autoantígeno (ya sea normal o relacionado con una enfermedad), un antígeno infeccioso (por ejemplo, un antígeno microbiano, antígeno viral, etc.), o algún otro antígeno extraño (por ejemplo, un componente alimenticio, polen, etc.). El término "antígeno" o, alternativamente, "inmunógeno" se aplica a colecciones de más de un inmunógeno, de modo que las respuestas inmunes a múltiples inmunógenos se pueden modular simultáneamente. Además, el término incluye cualquiera de una variedad de formulaciones diferentes de inmunógeno o antígeno.
Un antígeno "nativo" o "natural" o "de tipo silvestre" es un polipéptido, proteína o fragmento que contiene un epítopo, que ha sido aislado de una fuente biológica natural, y que puede unirse específicamente a un receptor de antígeno, cuando se presenta. como un MHC/péptido, en particular un receptor de antígeno de células T (TCR), en un sujeto.
El término "antígeno asociado a tumor" o "TAA" se refiere a un antígeno que está asociado con un tumor. Los ejemplos de TAA bien conocidos incluyen gp100, MART y MAGE.
Los términos "complejo principal de histocompatibilidad" o "MHC" se refieren a un complejo de genes que codifican moléculas de la superficie celular que se requieren para la presentación de antígenos a las células T y para el rechazo rápido del injerto. En los seres humanos, el MHC también se conoce como el "antígeno leucocitario humano" o el complejo "HLA". Las proteínas codificadas por el MHC se conocen como "moléculas MHC" y se clasifican en moléculas MHC de Clase I y Clase II. Las moléculas de MHC de clase I incluyen proteínas heterodiméricas de membrana formadas por una cadena a codificada en el MHC unida no covalentemente con la p2-microglobulina. Las moléculas de MHC de clase I son expresadas por casi todas las células nucleadas y se ha demostrado que funcionan en la presentación de antígenos a las células T CD8+. Las moléculas de clase I incluyen HLA-A, B y C en humanos. Las moléculas de MHC de clase II también incluyen proteínas heterodiméricas de membrana que consisten en cadenas a y asociadas no covalentemente. Se sabe que las moléculas MHC de clase II funcionan en las células T CD4+ y, en los seres humanos, incluyen HLA-DP, -DQ y -DR.
El término "células presentadoras de antígeno (APC)" se refiere a una clase de células capaces de presentar uno o más antígenos en forma de complejo péptido-MHC reconocible por células efectoras específicas del sistema inmunológico, y de ese modo inducir una respuesta inmunitaria celular eficaz contra el antígeno o antígenos que se presentan. Las APC pueden ser células completas intactas como macrófagos, células B, células endoteliales, células T activadas y células dendríticas; u otras moléculas, naturales o sintéticas, tales como moléculas MHC Clase I purificadas complejadas con p2-microglobulina. Si bien muchos tipos de células pueden presentar antígenos en su superficie celular para el reconocimiento de células T, solo las células dendríticas tienen la capacidad de presentar antígenos en una cantidad eficaz para activar células T naive para respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL).
El término "células dendríticas (CD)" se refiere a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides, Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296. Las células dendríticas constituyen las APC más potentes y preferidas del organismo. Si bien las células dendríticas se pueden diferenciar de los monocitos, poseen fenotipos distintos. Por ejemplo, un marcador de diferenciación particular, el antígeno CD14, no se encuentra en las células dendríticas, pero lo poseen los monocitos. Además, las células dendríticas maduras no son fagocíticas, mientras que los monocitos son células fuertemente fagocitantes. Se ha mostrado que las CD maduras pueden proporcionar todas las señales necesarias para la activación y proliferación de las células T.
El término "células efectoras inmunes" se refiere a células capaces de unirse a un antígeno y que median una respuesta inmunitaria. Estas células incluyen, entre otras, células T, células B, monocitos, macrófagos, células NK y linfocitos T citotóxicos (CTL), por ejemplo, líneas CTL, clones CTL y CTL de tumores, inflamatorios u otros infiltrados:
La célula efectora inmunitaria "naive" es una célula efectora inmunitaria que nunca ha estado expuesta a un antígeno capaz de activar esa célula. La activación de células efectoras inunune naive requiere tanto el reconocimiento del complejo péptido: complejo MHC y la entrega simultánea de una señal coestimuladora por una APC profesional para proliferar y diferenciarse en células T efectoras armadas específicas de antígeno.
"Respuesta inmune" se refiere ampliamente a las respuestas específicas de antígeno de los linfocitos a sustancias extrañas. Cualquier sustancia que pueda provocar una respuesta inmune se dice que es "inmunogénica" y se denomina "inmunógeno". Todos los inmunógenos son antígenos, sin embargo, no todos los antígenos son inmunogénicos. Una respuesta inmune de esta invención puede ser humoral (a través de la actividad del anticuerpo) o mediada por células (a través de la activación de las células T).
Como se usa en el presente documento, el término "célula efectora inmunitaria específica de antígeno educada" es una célula efectora inmunitaria como se define anteriormente, que ha encontrado previamente un antígeno. En contraste con su contraparte naive, la activación de una célula efectora inmunitaria específica de antígeno educada no requiere una señal coestimuladora. El reconocimiento del complejo péptido: MHC es suficiente.
"Activado", cuando se usa en referencia a una célula T, implica que la célula ya no está en la fase G0 y comienza a producir una o más de las citotoxinas, citocinas y otras proteínas relacionadas asociadas a la membrana características del tipo de célula (por ejemplo, CD8+ o CD4+), y es capaz de reconocer y unirse a cualquier célula diana que muestre el complejo péptido/MHC particular en su superficie y liberar sus moléculas efectoras.
Como se usa en este documento, el término "que induce una respuesta inmune en un sujeto" es un término entendido en la técnica y se refiere a un aumento de al menos aproximadamente 2 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 5 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 10 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 100 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 500 veces, o alternativamente al menos aproximadamente 1000 veces o más en una respuesta inmune a un antígeno (o epítopo) que se puede detectar o medir, después introducir el antígeno (o epítopo) en el sujeto, en relación con la respuesta inmune (si la hubiera) antes de la introducción del antígeno (o epítopo) en el sujeto. Una respuesta inmune a un antígeno (o epítopo), incluye, entre otros, la producción de un anticuerpo específico de antígeno (o específico de epítopo) y la producción de una célula inmune que expresa en su superficie una molécula que se une específicamente a un antígeno (o epítopo). Los procedimientos para determinar si se ha inducido una respuesta inmune a un antígeno (o epítopo) dado son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo específico de antígeno se puede detectar usando cualquiera de una variedad de inmunoensayos conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, ELISA, en el que, por ejemplo, la unión de un anticuerpo en una muestra a un antígeno inmovilizado (o epítopo) se detecta con un segundo anticuerpo marcado de forma detectable (por ejemplo, anticuerpo Ig antihumano de ratón marcado con enzima).
Las "moléculas coestimuladoras" están implicadas en la interacción entre los pares receptor-ligando expresados en la superficie de las células presentadoras de antígenos y las células T. La investigación acumulada durante los últimos años ha demostrado de manera convincente que las células T en reposo requieren al menos dos señales para la inducción de la expresión y proliferación de genes de citocinas (Schwartz, R.H. (1990) Science 248: 1349-1356 y Jenkins, M.K. (1992) Immunol. Today 13:69-73). Una señal, la que confiere especificidad, puede producirse mediante la interacción del complejo TCR/CD3 con un complejo MHC/péptido apropiado. La segunda señal no es específica de antígeno y se denomina señal "coestimuladora". Esta señal se definió originalmente como una actividad proporcionada por células accesorias derivadas de la médula ósea, como macrófagos y células dendríticas, las denominadas APC "profesionales". Se ha demostrado que varias moléculas mejoran la actividad coestimuladora. Estos son antígenos termoestables (HSA) (Liu, Y. et al. (1992) 3. Exp. Med. 175:437-445), cadena invariante de MHC modificada con sulfato de condroitina (li-CS) (Naujokas, M.F. et al. (1993) Cell 74:257-268), molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1) (Van Seventer, G.A. (1990)]. Immunol. 144:4579-4586), B7-1, y B7-2/B70 (Schwartz, R.H. (1992) Cell 71:1065-1068). Cada una de estas moléculas parece ayudar a la coestimulación al interactuar con sus ligandos similares en las células T. Las moléculas coestimuladoras median la o las señales coestimuladoras, que son necesarias, en condiciones fisiológicas normales, para lograr la activación completa de las células T naive. Un par receptor-ligando ejemplar es la familia B7 de moléculas coestimuladoras en la superficie de APC5 y su contrarreceptor CD28 o CTLA-4 en las células T (Freeman, et al. (1993) Science 262:909-911; Young, et al. (1992)]. Clin. Invest. 90:229 y Nabavi, et al. (1992) Nature 360:266-268). Otras moléculas coestimuladoras importantes son CD40 y CD54. El término "molécula coestimuladora" abarca cualquier molécula individual o combinación de moléculas que, cuando actúan junto con un complejo MHC/péptido, se unen por un TCR en la superficie de una célula T, proporciona un efecto coestimulador que consigue la activación de la célula I que se une al péptido. Por tanto, el término abarca B7, u otra(s) molécula(s) coestimuladora(s) en una matriz presentadora de antígeno, como una APC, fragmentos de la misma (solos, en complejo con otra (s) molécula (s) o como parte de una proteína de fusión) que, juntos con el complejo MHC, se une a un ligando similar y da como resultado la activación de la célula T cuando el TCR en la superficie de la célula T se une específicamente al péptido.
Como se usa en el presente documento, el término "citocina" se refiere a cualquiera de los numerosos factores que ejercen una variedad de efectos sobre las células, por ejemplo, induciendo el crecimiento o la proliferación. Los ejemplos no limitantes de citocinas que pueden usarse solas o en combinación en la práctica de la presente invención incluyen, interleucina-2 (IL-2), factor de células madre (SCF), interleucina-3 (IL-3), interleucina- 6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12), G-CSF, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), interleucina-1 alfa (IL-1a), interleucina-1L (IL-11), MIP-11, factor inhibidor de la leucemia (LIF), ligando c-kit, trombopoyetina (TPO) y ligando flt3. Una forma de realización de la presente invención incluye condiciones de cultivo en las que se excluye del medio una cantidad eficaz de IL-1p y/o IL-6. Las citocinas están disponibles comercialmente de varios proveedores como, por ejemplo, Genzyme (Framingham, MA), Genentech (South San Francisco, CA), Amgen (Thousand Oaks, CA), R&D Systems (Minneapolis, MN) e Immunex (Seattle, WA).
Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente para referirse a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye, por ejemplo, moléculas monocatenarias, bicatenarias y de triple hélice, un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Además de una molécula de ácido nucleico nativa, una molécula de ácido nucleico de la presente invención también puede comprender moléculas de ácido nucleico modificadas. Como se usa en este documento, ARNm se refiere a un ARN que puede traducirse en una célula dendrítica.
Dichos ARNm normalmente están protegidos y tienen un sitio de unión al ribosoma (secuencia de Kozak) y un codón de iniciación de la traducción.
El término "péptido" se usa en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos o peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar unidas por enlaces peptídicos. En otra forma de realización, la subunidad puede estar unida por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y los isómeros ópticos D y L, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos se denomina comúnmente oligopéptido si la cadena del péptido es corta. Si la cadena peptídica es larga, el péptido se denomina comúnmente polipéptido o proteína.
El término "modificado genéticamente" significa que contiene y/o expresa un gen extraño o una secuencia de ácido nucleico que, a su vez, modifica el genotipo o fenotipo de la célula o su progenie. En otras palabras, se refiere a cualquier adición, deleción o alteración de los nucleótidos endógenos de una célula.
Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere a los procesos mediante los cuales los polinucleótidos se transcriben en ARNm y el ARNm se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico de un huésped eucariota apropiado, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm. Los elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen secuencias promotoras para unir la ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para la unión de ribosomas. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriana incluye un promotor tal como el promotor lac y para el inicio de la transcripción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio AUG (Sambrook et al. (1989), véase antes). De manera similar, un vector de expresión eucariota incluye un promotor heterólogo u homólogo para la ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación cadena abajo, el codón de inicio AUG y un codón de parada para el desprendimiento del ribosoma. Dichos vectores pueden obtenerse comercialmente o ensamblarse mediante las secuencias descritas en procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, los procedimientos que se describen a continuación para construir vectores en general.
"Bajo control transcripcional" es un término entendido en la técnica e indica que la transcripción de una secuencia de polinucleótidos, normalmente una secuencia de ADN, depende de que esté operativamente ligada a un elemento que contribuye al inicio de, o promueve, la transcripción. "Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los elementos están en una disposición que les permite funcionar.
Un "vehículo de administración de genes" se define como cualquier molécula que puede transportar polinucleótidos insertados al interior de una célula huésped. Ejemplos de vehículos de administración de genes son liposomas, polímeros biocompatibles, incluidos polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos; lipopolisacáridos; sobres virales artificiales; partículas de metal; y bacterias, o virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación usados típicamente en la técnica que se han descrito para expresión en una variedad de huéspedes eucariotas y procariotas, y que pueden usarse tanto para la terapia génica como para la expresión de proteínas simples.
"Administración de genes", "transferencia de genes", "transfección" y similares, como se usan en este documento, son términos que se refieren a la introducción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la introducción. La transfección se refiere a la administración de cualquier ácido nucleico al interior de una célula. La administración de genes se refiere a la administración de un ácido nucleico que puede integrarse en el genoma de la célula huésped o que puede replicarse independientemente del genoma de la célula huésped. La administración de genes o la transferencia de genes no se refieren a la introducción de un ARNm en una célula. Los procedimientos de transfección incluyen una variedad de técnicas tales como electroporación, complejos de administración de ácido nucleico basados en proteínas, basados en lípidos y basados en iones catiónicos, vectores virales, administración de "pistola de genes" y varias otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica. El polinucleótido introducido se puede mantener de forma estable en la célula huésped o se puede expresar de forma transitoria. En formas de realización preferidas, se introduce un ARNm en una CD y se expresa de forma transitoria. El mantenimiento estable normalmente requiere que el polinucleótido introducido contenga un origen de replicación compatible con la célula huésped o se integre en un replicón de la célula huésped como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Varios vectores son capaces de mediar en la transferencia de genes a células de mamíferos, como se conoce en la técnica y se describe en el presente documento.
Un "vector viral" se define como un virus o una partícula viral producidos de manera recombinante que comprenden un polinucleótido para ser administrado a una célula huésped, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores de alfavirus y similares. Vectores de alfavirus, como los vectores basados en virus de bosque de Semliki y los vectores basados en virus Sindbis también se han desarrollado para su uso en terapia génica e inmunoterapia. Véase, Schlesinger y Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 y Zaks et al. (1999) Nat. Med. 7:823-827. En aspectos en los que la transferencia génica está mediada por un vector retroviral, una construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo, y un gen terapéutico. Como se usa en este documento, "transferencia génica mediada por retrovirus" o "transducción retroviral" tiene el mismo significado y se refiere al procedimiento por el cual un gen o secuencias de ácido nucleico se transfieren de manera estable a la célula huésped en virtud de que el virus ingresa a la célula e integra su genoma al genoma de la célula huésped. El virus puede entrar en la célula huésped a través de su mecanismo normal de infección o modificarse de modo que se una a un ligando o receptor de superficie de la célula huésped diferente para entrar en la célula. Como se usa en este documento, "vector retroviral" se refiere a una partícula viral capaz de introducir ácido nucleico exógeno en una célula a través de un mecanismo de entrada viral o similar a un virus.
Los retrovirus llevan su información genética en forma de ARN; sin embargo, una vez que el virus infecta una célula, el ARN se transcribe de forma inversa a la forma de ADN que se integra al ADN genómico de la célula infectada. La forma de ADN integrada se llama provirus.
En aspectos en los que la transferencia génica está mediada por un vector viral de ADN, como un adenovirus (Ad), virus pseudo adenoviral o adeno-asociado (MV), la construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma viral o parte del mismo, y a un transgén. Los adenovirus (Ads) son un grupo de virus relativamente bien caracterizado y homogéneo, que incluye más de 50 serotipos. (Véase, por ejemplo, la publicación WO 95/27071). Los Ad son fáciles de desarrollar y no requieren integración al genoma de la célula huésped. También se han construido vectores derivados de Ad recombinantes, particularmente aquellos que reducen el potencial de recombinación y generación de virus de tipo silvestre. (Véanse las publicaciones WO 95/00655 y WO 95/11984). El MV de tipo silvestre tiene una alta infectividad y especificidad al integrarse al genoma de la célula huésped. (Véase, Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 y Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996).81:6466-6470 y Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996).
Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que se puede unir operativamente un polinucleótido son conocidos en la técnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y están disponibles comercialmente de fuentes como Stratagene (La Jolla, CA) y Promega Biotech (Madison, WI). Con el fin de optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser necesario eliminar, agregar o alterar las porciones 5' y/o 3' no traducidas de los clones para eliminar codones de inicio de la traducción alternativos potencialmente inapropiados adicionales u otras secuencias que pueden interferir con la expresión o reducirla, ya sea a nivel de transcripción o traducción. Alternativamente, se pueden insertar sitios de unión de ribosoma de consenso inmediatamente 5' del codón de inicio para mejorar la expresión.
Los vehículos de administración de genes también incluyen varios vectores no virales, que incluyen complejos de ADN /liposomas y complejos de proteína-ADN virales dirigidos. Los liposomas que también comprenden un anticuerpo de direccionamiento o un fragmento del mismo pueden usarse en los procedimientos de esta invención. Para mejorar la administración a una célula, los ácidos nucleicos o las proteínas de esta invención se pueden conjugar con anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a antígenos de la superficie celular, por ejemplo, TCR, CD3 o CD4.
"Hibridación" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede producirse mediante emparejamiento de bases Watson-Crick, unión de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura dúplex, tres o más hebras que forman un complejo multicatenario, una única hebra autohibridante o cualquier combinación de estos. Una reacción de hibridación puede constituir un paso en un procedimiento más extenso, como el inicio de una reacción de PCR o la escisión enzimática de un polinucleótido por una ribozima.
Las condiciones de hibridación estrictas son las siguientes: La prehibridación de los filtros que contienen un ácido nucleico de interés se lleva a cabo durante 8 horas hasta toda una noche a 65°C en un regulador de pH compuesto de 6xSSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), EDTA de 1 mM, Ficoll al 0.02%, BSA al 0,02% y 500 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65°C, la temperatura de hibridación preferida, en una mezcla de prehibridación que contiene 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20x106 cpm de sonda marcada con 32P. Posteriormente, se realizan lavados del filtro a 37°C durante 1 h en una solución que contiene 2xSSC, Ficoll al 0.01% y BSA al 0.01%, seguido de un lavado en 0.1xSSC a 50°C durante 45 min. Después de los pasos de lavado, las sondas hibridadas son detectables por autorradiografía. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se citan en Sambrook et al., 1989; y Ausubel et al., 1989.
Un polinucleótido o una región de polinucleótido (o un polipéptido o una región polipeptídica) tiene un cierto porcentaje (por ejemplo, 80%, 85%, 90% o 95%) de "identidad de secuencia" con otra secuencia significa que, cuando se alinea, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son iguales al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se determinan utilizando el programa de alineación BLAST bien conocido y los parámetros predeterminados. Los programas alternativos son BLASTN y BLASTP, que utilizan los siguientes parámetros predeterminados: Código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambos; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank CDS traducciones SwissProtein SPupdate PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
El término "aislado" significa separado de constituyentes, celulares y de otro tipo, con los que el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmentos de los mismos, están normalmente asociados en la naturaleza. Por ejemplo, con respecto a un polinucleótido, un polinucleótido aislado es uno que está separado de las secuencias 5' y 3' con las que normalmente está asociado en el cromosoma. Como es evidente para los expertos en la técnica, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento (s) del mismo que no se produce de forma natural no requiere "aislamiento" para distinguirlo de su homólogo de origen natural. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo "concentrados", "separados" o "diluidos" o fragmento(s) de los mismos puede distinguirse de su contraparte natural en que la concentración o el número de moléculas por volumen es mayor que "concentrado" o menos que "separado" que el de su contraparte natural. Un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento (s) de los mismos, que difiere de la contraparte natural en su secuencia primaria o, por ejemplo, por su patrón de glicosilación, no necesita estar presente en su forma aislada ya que es distinguible de su contraparte de origen natural por su secuencia primaria, o alternativamente, por otra característica tal como su patrón de glicosilación. Aunque no se indica explícitamente para cada una de las invenciones descritas en este documento, debe entenderse que en esta invención se proporcionan todas las formas de realización anteriores para cada una de las composiciones descritas más adelante y en las condiciones apropiadas. Por tanto, se proporciona un polinucleótido de origen no natural como una forma de realización separada del polinucleótido de origen natural aislado. Una proteína producida en una célula bacteriana se proporciona como una forma de realización separada de la proteína de origen natural aislada de una célula eucariota en la que se produce en la naturaleza. Una célula de mamífero, como una célula dendrítica, se aísla si se extrae del sitio anatómico del que se encuentra en un organismo.
"Célula huésped", "célula diana" o "célula receptora" pretenden incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda ser o haya sido receptora de vectores o la incorporación de moléculas de ácido nucleico, polinucleótidos y/o proteínas que sean exógenos. También se pretende incluir la progenie de una sola célula, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico o total) a la célula parental original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Las células pueden ser procarióticas o eucarióticas e incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, células de levadura, células animales y células de mamíferos, por ejemplo, de murino, ratas, simias o humanas.
Un "sujeto" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, simios, humanos, animales de granja, animales deportivos y mascotas.
Un "control" es un sujeto alternativo o muestra utilizado en un experimento con fines comparativos. Un control puede ser "positivo" o "negativo". Por ejemplo, cuando el propósito del experimento es determinar una correlación de una respuesta inmune con una condición de cultivo particular, generalmente es preferible usar un control positivo y un control negativo.
Por "cáncer" se entiende la presencia anormal de células que exhiben un crecimiento relativamente autónomo, de modo que una célula cancerosa exhibe un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. Las células cancerosas pueden ser benignas o malignas. En diversas formas de realización, el cáncer afecta a células de la vejiga, sangre, cerebro, mama, colon, tracto digestivo, pulmón, ovarios, páncreas, próstata o piel. La definición de una célula cancerosa, como se usa en este documento, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino también cualquier célula derivada de un ancestro de la célula cancerosa. Esto incluye células cancerosas metastatizadas y cultivos in vitro y líneas celulares derivadas de células cancerosas. El cáncer incluye, entre otros, tumores sólidos, tumores líquidos, neoplasias hematológicas, cáncer de células renales, melanoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de vejiga, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, neuroblastoma, glioblastoma, retinoblastoma, leucemias, mielomas, linfomas, hepatomas, adenomas, sarcomas, carcinomas, blastomas, etc. Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer que normalmente se manifiesta como un tumor sólido, un tumor "clínicamente detectable" es aquel que es detectable sobre la base de la masa tumoral; por ejemplo, mediante procedimientos tales como tomografía computarizada, imágenes de resonancia magnética (MRI), rayos X, ultrasonido o palpación. Los hallazgos bioquímicos o inmunológicos por sí solos pueden ser insuficientes para cumplir con esta definición.
El término "cultivo" se refiere al mantenimiento, diferenciación y/o propagación in vitro de células o en medios adecuados. Por "enriquecido" se entiende una composición que comprende células presentes en un porcentaje mayor de células totales que las que se encuentran en los tejidos donde están presentes en un organismo. Por ejemplo, los cultivos enriquecidos y las preparaciones de CD de CD83+CCR7- y CD de CD83+CCR7+ elaboradas por los procedimientos de la invención están presentes en un porcentaje más alto de células totales en comparación con su porcentaje en los tejidos donde están presentes en un organismo (por ejemplo, sangre, piel, ganglios linfáticos, etc.).
Se pretende que una "composición" signifique una combinación de agente activo y otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente detectable o marcador) o activo, como un adyuvante.
Se pretende que una "composición farmacéutica" incluya la combinación de un agente activo con un vehículo, inerte o activo, lo que hace que la composición sea adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.
Como se usa en este documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como una solución salina de pH regulado con fosfato, agua y emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizantes y conservantes. Para ejemplos de vehículos, estabilizadores y adyuvantes, véase Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 18th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990)).
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, tales como una respuesta inmunitaria mejorada, tratamiento, prevención o mejora de una afección médica (enfermedad, infección, etc.). Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. Las dosis adecuadas variarán dependiendo del peso corporal, la edad, la salud, la enfermedad o afección a tratar y la vía de administración.
Como se usa en este documento, "señalización" significa poner en contacto una célula dendrítica inmadura o madura con un agonista del receptor de IFN-y, un agonista del receptor de TNF-a, un polipéptido de CD40L u otro agonista de CD40. En una forma de realización, dichos agonistas se proporcionan externamente (por ejemplo, en el medio de cultivo celular). En otra forma de realización, el agonista polipeptídico se proporciona mediante la transfección de una célula dendrítica inmadura o madura con un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Alternativamente, podría proporcionarse un agonista de aptámero de ácido nucleico en el medio o mediante transfección. En los casos en los que el polipéptido o polipéptidos se proporcionan transfectando una célula dendrítica con un ácido nucleico que codifica el polipéptido, la señalización se efectúa tras la traducción de un ARNm que codifica el polipéptido, en lugar de tras la transfección con el ácido nucleico. En un caso, esta divulgación proporciona procedimientos para preparar poblaciones enriquecidas de células dendríticas maduras (CD) que inducen potentes respuestas inmunoestimuladoras in vivo y/o in vitro. Como se usa en el presente documento, el término "células dendríticas maduras" significa células dendríticas que demuestran una expresión elevada en la superficie celular de la molécula coestimuladora CD83, en comparación con las CD inmaduras (CDi). Las CD maduras de la invención incluyen tanto CD de CD83+ CCR7- como CD de CD83+ CCR7+. La segunda señal, un agonista de CD40, puede administrarse a CDs de CD83- CCR7- inmaduras o CD de CD83+ CCR7- maduras.
La bibliografía (Schaft 2005, Bonehill 2004) sugiere que la electroporación posterior a la maduración de las CD con ARN que codifica antígenos dio como resultado CD con mayor potencia para invocar respuestas inmunes. Por lo tanto, se desarrollaron procedimientos para alterar el 'proceso base de CD40L' (señalización secuencial de IFN-y y señalización de CD40L de CDi de CD83), alterando la sincronización de la señalización de CD40L a CD maduras de CD83+ CCR7-(maduración post fenotípica). En esta realización, las CD se maduraron fenotípicamente en primer lugar mediante la adición de “mediadores inflamatorios", IFN-y y TNF-a, y opcionalmente PGE2, al medio de cultivo, y luego se sometieron a electroporación con ARNm de CD40L y, opcionalmente, ARNm que codifica antígenos aproximadamente 12-30 horas (preferiblemente alrededor de 18 horas) más tarde. Este nuevo procedimiento se denominó 'PME-CD40L', para electroporación de postmaduración con CD40L para producir CD maduras de CD83+ CCR7+. Se demostró que las células recolectadas 4 horas después de la electroporación y formuladas como una vacuna median la inmunopotencia máxima en ensayos in vitro (véanse los ejemplos). Como una mejora adicional más, las CD pueden pulsarse con un ligando de activación para células NKT, a saber, a-galactosilceramida, para reclutar esta población de células efectoras para la respuesta inmune. Las células NKT muestran facetas tanto de células T colaboradoras como de células T citotóxicas: las células NKT pueden secretar IFN-y, mostrar CD40L y pueden secretar granzima B, la última para inducir la apoptosis en las células diana. Por tanto, el reclutamiento de células NKT puede conducir a una función mejorada de las CD en virtud de interacciones adicionales CD40L/DC-CD40 de células NKT, o amplificar las respuestas inmunitarias mediadas por células secretando citocinas colaboradoras y/o contribuyendo a un efecto lítico directo sobre las células diana.
Después de la señalización secuencial con la primera señal (un agonista del receptor de IFN-y y/o un agonista del receptor de TNF-a) a las CDi, y la segunda señal (un agonista de CD40) a las CDi de CD83- CCR7- o a las CD maduras CD83+ CCR7', las CD resultantes demuestran (i) una expresión elevada en la superficie celular de las moléculas coestimuladoras CD80, CD83 y CD86, ii) son CCR7+, y iii) secretan polipéptido o proteína IL-12 p70 y/o secretan niveles significativamente reducidos (0 a 500 pg/por millón de CD) de IL-10. En formas de realización preferidas, las CD maduras CD83+ CCR7+ de la invención producen al menos 1000 pg de CD de IL-12/106, preferiblemente al menos 2000, 3000, 4000, 5000 o 6000 pg de CD de IL-12/106, más preferiblemente al menos 7000, 8000, 9000 o 10000 pg de CD de IL-12/106, y más preferiblemente al menos 12000, 15000, 17000 o 20000 pg de CD de IL-12/106. Los niveles de IL-10 e IL-12 pueden determinarse mediante ELISA de sobrenadantes de cultivo recogidos hasta 36 horas después de la inducción de la maduración de las CD de las CD inmaduras. Wierda et al. (2000) Blood 96:2917. Ajdary et al. (2000) Infection and Immunity 68:1760.
Las CD inmaduras pueden aislarse o prepararse a partir de una fuente de tejido adecuada que contenga células precursoras de CD y diferenciarse in vitro para producir CD inmaduras. Por ejemplo, una fuente de tejido adecuada puede ser una o más células de médula ósea, células progenitoras de sangre periférica (PBPC), células madre de sangre periférica (PBSC) y células de sangre de cordón. Preferiblemente, la fuente de tejido es una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). La fuente de tejido puede ser fresca o congelada. En otro aspecto, las células o la fuente de tejido se pretratan con una cantidad eficaz de un factor de crecimiento que promueve el crecimiento y la diferenciación de células no madre o progenitoras, que luego se separan más fácilmente de las células de interés. Estos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen brevemente en Romani, et al. (1994) Exp. Med. 180:83 y Caux, C. et al. (1996) Exp. Med. 184:695. En un aspecto, las CD inmaduras se aíslan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En una forma de realización preferida, las PBMC se tratan con una cantidad eficaz de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) en presencia o ausencia de interleucina 4 (1L-4) y/o IL-13, de modo que las PBMC se diferencian en CD inmaduras. Del modo más preferible, las PBMC se cultivan en presencia de GM-CSF e IL-4 durante aproximadamente 4-7 días, preferiblemente alrededor de 5-6 días, para producir CD inmaduras. En formas de realización preferidas, la primera señal se da el día 4, 5, 6 o 7, y del modo más preferible el día 5 o 6. Además, GM-CSF, así como IL-4 y/o IL-13 pueden estar presentes en el medio en el momento de la primera y/o segunda señalización.
Para aumentar el número de células precursoras dendríticas en animales, incluidos los seres humanos, se puede tratar previamente a los sujetos con sustancias que estimulan la hematopoyesis. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, G-CSF y GM-CSF. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad de factor hematopoyético a administrar controlando el diferencial celular de los individuos a los que se está administrando el factor. Normalmente, las dosis de factores tales como G-CSF y GM-CSF serán similares a la dosis utilizada para tratar a los individuos que se recuperan del tratamiento con agentes citotóxicos. Como ejemplo, GM-CSF o G-CSF pueden ser administradas durante 4 a 7 días en dosis estándar antes de la eliminación del tejido de origen para aumentar la proporción de precursores de células dendríticas. La patente de EE.UU. No. 6,475,483 enseña que dosis de G-CSF de 300 microgramos diarios durante 5 a 13 días y dosis de GM-CSF de 400 microgramos diarios durante 4 a 19 días dan como resultado rendimientos significativos de células dendríticas.
Los procedimientos de la invención producen una población enriquecida de células dendríticas CD83+ CCR7+ maduras que son potentes agentes inmunoestimuladores. Específicamente, la invención proporciona un procedimiento para preparar células dendríticas maduras (CD), que comprende las etapas secuenciales de: (a) señalizar células dendríticas inmaduras aisladas (CDi) con una primera señal que comprende un agonista del receptor de interferón gamma (IFN-yR), y opcionalmente un agonista de TNF-aR, para producir células dendríticas señaladas por agonista de IFN-yR; y (b) señalizar dichas células dendríticas señalizadas de agonista de IFN-yR con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad eficaz de un agonista de CD40 para producir células dendríticas maduras de CCR7+. La invención proporciona además CD maduras CD83+ CCR7- y CD maduras CD83+ CCR7+. En formas de realización preferidas, las CD maduras CD83+ CCR7+ y/o las CD maduras CD83+ CCR7' de la invención expresan transitoriamente el polipéptido CD40L. Preferiblemente, CD40L se localiza predominantemente a nivel intracelular, en lugar de en la superficie celular. Del modo más preferible, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% del polipéptido CD40L se localiza intracelularmente.
En una forma de realización alternativa, las células dendríticas inmaduras se señalan con una cantidad eficaz de un agonista del receptor de TNF-a seguido de la señalización con un agonista de CD40. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para preparar células dendríticas maduras (CD), que comprende la señalización secuencial de células dendríticas inmaduras aisladas con una primera señal que comprende un agonista del receptor alfa del factor de necrosis tumoral (TNF-aR) seguida de una segunda señal que comprende un agonista de CD40, en el que dicha señalización está en ausencia de una cantidad eficaz de IL-1 p y/o IL-6.
Para cualquier forma de realización (agonista de IFN-yR o agonista de TNF-aR como primera señal), la segunda señal de agonista de CD40 puede administrarse a CDi de CD83- CCR7', o CD CD83+ CCR7' maduras. En una forma de realización preferida, las CD inmaduras y/o las CD maduras se ponen en contacto con PGE2. Preferiblemente, las células se ponen en contacto con PGE2 aproximadamente al mismo tiempo que reciben la primera señal (un agonista de IFN-yR o agonista de TNF-aR). En formas de realización preferidas, GM-CSF y al menos uno de IL-4 o IL-13 están presentes en el medio en el momento en que las células dendríticas reciben la primera y segunda señales. En otras formas de realización, el procedimiento además comprende poner en contacto las células dendríticas inmaduras, las células dendríticas señalizadas y/o las células dendríticas CCR7+ con un ligando de células NKT que puede activar células NKT restringidas por CD1d y potenciar en consecuencia la inmunidad innata y adoptiva. En formas de realización preferidas, el ligando de células NKT es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: a-galactosilceramidas, a-glucosilceramidas, a-6-desoxigalactosilceramidas, a-6-desoxigalactofuranosilceramidas, (p-6-desoxigalactofuranosilceramidas, parabinosilceramidas) a-C-galactosilceramidas y a-S-galactosilceramidas. Un compuesto preferido es la agalactosilceramida conocida como KRN7000 ((2S, 3S, 4R)-1-O-(alfa-D-galactopiranosil)-2- (N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol).
Las agelasfinas, descritas en la patente JP 3068910, son una clase de compuestos descubiertos originalmente en una esponja marina que tienen una estructura de a-galactosilceramida (a-GalCer) y actividad inmunoestimulante y antitumoral. KRN7000 es un potente análogo sintético de agelasfinas, divulgado en el documento U.S. 5,767,092. Se divulgan análogos útiles adicionales de agelasfinas en el documento U.S. 5,936,076.
La estructura de KRN7000 se muestra a continuación:
Figure imgf000015_0001
Análogos de glicosilceramida de KRN7000 (por ejemplo, a-galactosilceramidas, a-glucosilceramidas, a-6-desoxigalactosilceramidas, a-6-desoxigalactofuranosilceramidas, p-6-desoxigalactofuranosilceramidas, parabinosilceramidas) se diulgan en los documentos U.S. 5,849,716; el documento U.S. 5,780,441 divulga derivados de oligosacáridos (di-, tri-, tetra-, penta-derivados) de KRN7000. Los procedimientos para usar KRN7000 y análogos relacionados para producir CD cargadas con antígeno KRN7000 y para activar células NKT humanas se divulgan en las publicaciones U.S. Ser No. 09/721,768 y U.S. 6,531,453.
El documento US 5,936,076 divulga compuestos de a-galactosilceramida representados por la siguiente fórmula:
Figure imgf000016_0001
donde la cadena de ácido graso, R representa:
Figure imgf000016_0002
donde R2 representa H u OH y X denota un número entero de 0-26 o R representa -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 y Ri representa cualquiera de los sustituyentes definidos por las siguientes fórmulas (a) - (e)
(a) -CH2(CH2)yCH3
(b) -CH(OH)(CH2)y CH3
(c) -CH(OH)(CH2)y CH(CH3)2
(d) -CH=CH(CH2)y CH
(e) -CH(OH)(CH2)y CH(CH3)CH2CH3
Donde Y denota un número entero de 5 a 17.
Las publicaciones WO 03/105769, U.S. 2004/0127429,
y Shimieg J. et al., (2003) J. Exp. Med. 198:1631-1641 divulgan la estructura de a-C-glicolípidos, donde el átomo de oxígeno en el enlace de glicósido de a-glicosilceramidas tales como a-galactosilceramida y a-glucosilceramidas se reemplaza por un átomo de carbono. La estructura de un compuesto representativo se muestra a continuación.
Figure imgf000016_0003
La publicación WO 03/016326 divulga análogos de KRN7000 con ceramida truncada tales como "C4" u "OCH" que tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000016_0004
El documento US 6,635,622 divulga a-C-, N, o S-Glicolípidos en los que el átomo de oxígeno en el enlace de glicósido de una galactosilceramida está reemplazado por -(CH2)a-CH=CH-(CH2)a-, -(CH2)a-S(O)0-2-CH2-, o -NHCH2-, en donde a y a' denotan cada uno un número entero de 0-5 y a a' es 5 o menos.
En formas de realización preferidas, el agonista de IFN-yR es IFNy o un fragmento biológicamente activo del mismo. Preferiblemente, el IFNy es un IFNy de mamífero, del modo más preferible un IFNy humano. El ADNc y la secuencia de aminoácidos del IFNy humano se muestran en las SEQ ID NO:5 y 6, respectivamente. Preferiblemente, el IFNy tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:6, o un fragmento de la misma. En una forma de realización, el IFN-yR comprende un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SESQ ID NO:6. Preferiblemente, el agonista de IFN-yR tiene al menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para probar la actividad de los agonistas de IFN-yR, y algunos de estos procedimientos se describen más adelante. Las CD inmaduras se pueden señalar añadiendo un agonista de IFN-yR al medio de cultivo o expresando el agonista de IFN-yR en la célula dendrítica. En una forma de realización, la CD se transfecta con un ARNm que codifica un agonista de IFN-yR, tal como SEQ ID NO:6, o un fragmento biológicamente activo del mismo. La señalización se produciría luego de la traducción del ARNm dentro de la célula dendrítica. Del modo más preferible, el agonista de IFN-yR se agrega al medio de cultivo que contiene CD inmaduras. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo comprende además PGE2 y/o GM-CSF más IL-4 o IL-13.
El receptor de IFN-y tiene dos subunidades: IFN-yR1, la cadena de unión al ligando (también conocida como cadena a) e IFN-yR2, la cadena de transducción de señales (también conocida como p cadena o factor accesorio 1). Estas proteínas están codificadas por genes separados (IFNGR1 e IFNGR2, respectivamente) que se encuentran en diferentes cromosomas. A medida que las cadenas de unión al ligando (o a) interactúan con el IFN-y, se dimerizan y se asocian con dos cadenas transductoras de señales (o p). El ensamblaje del receptor conduce a la activación de las quinasas Janus JAK1 y JAK2 y a la fosforilación de un residuo de tirosina en el dominio intracelular de IFN-yR1. Esto conduce al reclutamiento y fosforilación de STAT 1 (para 'transductores de señal y activadores de la transcripción'), que forma homodímeros y se transloca al núcleo para activar una amplia gama de genes que responden a IFN-y. Después de la señalización, las cadenas de unión al ligando se internalizan y se disocian. Luego, las cadenas se reciclan a la superficie celular. Bach et al. (1997) Ann. Rev. Immunol. 15, 563-591; and Lammas, Casanova and Kumararatne (2000) Clin Exp Immunol 121,417-425. La estructura cristalina del complejo de IFN-y humano con la parte extracelular glicosilada soluble de IFN-YRa (sIFN-YRa) se ha determinado a una resolución de 2.9 A utilizando procedimientos de difracción anómala de longitudes de onda múltiples. Thiel et al. Structure 8:927-936 (2000).
En un ensayo, los agonistas del receptor INF-y, tales como IFN-y, disminuyen la actividad de Na+-K+-ATPasa de una manera dependiente del tiempo y de la concentración en las células Caco-2 del epitelio intestinal humano. La actividad Na+-K+-ATPasa se puede determinar como la diferencia entre ATPasa total y sensible a ouabaína. El tratamiento con IFN-y aumenta notablemente la expresión de fosfo-STAT1 y total, lo que se acompaña de la activación de p38 MAPK. La actividad de la p38 MAP quinasa se puede analizar mediante transferencia Western usando el kit de ensayo de p38MAP quinasa. Niveles de proteína STAT1 fosforilada y total se detectaron usando PhosphoPlus® Stati. Los mecanismos de transducción puestos en movimiento por IFN-y implican la activación de la fosforilación de STAT1 cadena abajo de PKC y las vías Raf-1, MEK, ERK2 y p38 MAPK. Véase Magro et al., Br J Pharmacol advance online publication, 26 de julio de 2004; doi:10.1038/sj.bjp.0705895.
Con fines ilustrativos, se puede proporcionar señalización con agonistas del receptor de IFN-y, agonistas del receptor de TNF-a y/o agonistas de CD40 al poner en contacto una célula directamente con proteínas y/o polipéptidos de IFN-y y/o proteínas o polipéptidos de TNF-a y/o agonistas de CD40, respectivamente. Alternativamente, la señalización de una célula con agonistas de IFN-yR, agonistas de TNF- aR o agonistas de CD40 puede ocurrir tras la traducción del ARNm que codifica dichos polipéptidos o proteínas dentro de la célula dendrítica. Por tanto, la señalización se produce tras la expresión de polipéptidos y/o proteínas de agonistas de IFN-yR, agonistas de TNF- aR y agonistas de CD40.
La segunda señal utilizada en los procedimientos de la invención es una señal transitoria con un agonista de CD40. La expresión persistente de un polipéptido agonista de CD40, tal como la expresión constitutiva de CD40L a partir de un vector lentiviral como se describe por Koya et al., véase antes, no se considera expresión transitoria. La señal puede considerarse transitoria si el medio que contiene un agonista de CD40 se elimina de las CD, o si las CD están cargadas con un ARNm que codifica un agonista de CD40. La señal del agonista de CD40 también se puede considerar transitoria si las CD se cargan/transfectan con un vector de expresión que codifica un agonista de CD40, siempre que: 1) el promotor que impulsa la expresión del agonista de CD40 no sea constitutivo en las CD, o 2) el vector de expresión no se integra en el genoma de las CD ni se replica en las DC.
En formas de realización preferidas, el agonista de CD40 es un polipéptido de CD40L o un anticuerpo agonista de CD40. En general, los ligandos que se unen a CD40 pueden actuar como agonistas de CD40. Los solicitantes han demostrado que la administración de una segunda señal que comprende CD40L a las células mediante la transfección de CD inmaduras o maduras con ARNm de CD40L produce CD modificadas posteriormente que inducen respuestas inmunoestimuladoras en lugar de inmunosupresoras. En una forma de realización, las células dendríticas transfectadas con ARNm CD40L se cultivan en medio que contiene IFNy (y preferentemente también PGE2) inmediatamente después de la transfección y antes de la traducción del ARNm CD40L para producir una cantidad eficaz de una señal de CD40L. En esta forma de realización, aunque se añade IFNy después de la transfección con ARNm de CD40L, las células dendríticas reciben la señal de IFNy antes de la señal resultante de la traducción del ARNm de CD40L. Por tanto, el orden en el que se administran los agentes a las células es importante sólo porque la señalización de CD40L debe producirse después de la señalización de IFN-y. Como se describe con más detalle a continuación, la señalización de las CD puede ocurrir in vivo o ex vivo, o alternativamente uno o más conjuntos pueden ocurrir ex vivo y los pasos restantes del procedimiento pueden ocurrir in vivo.
En una divulgación, el agonista de CD40 es un aptámero que se une a CD40. De manera similar, el IFN-y y el TNF-a podrían reemplazarse por aptámeros, anticuerpos y similares, que tienen una actividad biológica similar. Del modo más preferible, el agonista de CD40 se administra como ARNm que codifica CD40L.
Como se usa en el presente documento, "ligando CD40" (CD40L) abarcará cualquier polipéptido o proteína que específicamente reconozca y active el receptor CD40 y active su actividad biológica. El término incluye formas transmembrana y solubles de CD40L. En formas de realización preferidas, el agonista de CD40 es un CD40L de mamífero, preferiblemente un CD40L humano. Las alineaciones de los ADNc y proteínas humanos y de ratón se muestran en las Figuras 16 y 17, respectivamente. Un ADNc de CD40L humano y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestran en SEQ ID NOS:1 y 2, respectivamente. El marco de lectura abierto para CD40L está representado por los nucleótidos 40 a 822 de SEQ ID NO.1, mientras que el codón de parada TGA está en la posición 823 a 825. También son útiles en los procedimientos de la invención Las CD40L truncados (residuos 47 a 261 de SEQ ID NO:2, codificados por los residuos de nucleótidos 178 a 825 de SEQ ID NO:1) y fragmentos de CD40L codificados por nucleótidos 43 a 825 de SEQ ID NO:1, 181 a 825 de SEQ ID NO:1, 193 a 825 de SEQ ID NO:1, 376 a 825 de SEQ ID NO:1, 379 a 825 de SEQ ID NO:1 y 400 a 825 de SEQ ID NO:1. En formas de realización preferidas, el polipéptido CD40L se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2; b) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 47 a 261 de SEQ ID n O:2; c) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 51 a 261 de SEQ ID NO:2; d) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 120 a 261 de SEQ ID NO:2; e) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 113 a 261 de SEQ ID NO:2; f) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 112 a 261 de SEQ ID NO:2; g) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:10; h) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 35 a 261 de SEQ ID NO:2; i) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 34 a 225 de SEQ ID NO:2; j) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 113 a 225 de SEQ ID NO:2; k) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 120 a 225 de SEQ ID NO:2; y l) un fragmento del polipéptido de cualquiera de (a) a (k), en el que dicho fragmento se une a CD40.
Preferiblemente, el polipéptido CD40L está codificado por un ARNm que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido de SEQ lD NO:1; b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 40 a 822 de SEQ ID NO:1; c) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 178 a 822 de SEQ ID NO:1; d) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 190 a 822 de SEQ ID NO:1; e) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 397 a 822 de SEQ ID NO:1; f) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 376 a 822 de SEQ ID NO:1; g) un polinucleótido de SEQ ID NO:9; h) un polinucleótido de SEQ ID NO:13; i) un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con cualquier polinucleótido de (a) a (h); j) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con cualquier polinucleótido de (a) a (h); y k) un polinucleótido de (a) a (j), que comprende además una secuencia no traducida 3' seleccionada del grupo que consiste en los ácidos nucleicos de SEQ ID NO:14, 15, 16, 17 o 18, y/o un 5' secuencia no traducida seleccionada del grupo que consiste en los ácidos nucleicos de SEQ ID NO:19, 20, 21, 22 o 23.
Alternativamente, el polipéptido CD40L es un polipéptido que tiene al menos un 77% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2; b) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 47 a 261 de SEQ ID NO:2; c) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 51 a 261 de SEQ ID NO:2; d) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 120 a 261 de SEQ ID NO:2; e) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 113 a 261 de SEQ ID NO:2; f) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 112 a 261 de SEQ ID NO:2; g) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:10; h) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 35 a 261 de SEQ ID NO:2; i) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 34 a 225 de SEQ ID NO:2; j) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 113 a 225 de SEQ ID NO:2; k) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 120 a 225 de SEQ ID NO:2; y l) un fragmento del polipéptido de cualquiera de (a) a (k), en el que dicho fragmento se une a CD40.
El CD40 se caracterizó por primera vez como un receptor expresado en linfocitos B. Schonbeck y Libby (2001) Cell Mol. Life Sci. 58:4. Más tarde se descubrió que la participación de las células B CD40 con CD40L expresado en células T activadas es esencial para la activación de células B dependientes de células T (es decir, proliferación, secreción de inmunoglobulinas y cambio de clase). Posteriormente se reveló que el CD40 funcional se expresa en una variedad de tipos de células distintas de las células B, incluidas las células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos T, basófilos, eosinófilos, monocitos / macrófagos, células dendríticas, células epiteliales, células endoteliales, células de músculo liso, queratinocitos, fibroblastos y carcinomas. Schonbeck and Libby (2001), véase antes.
El ligando CD40 se clonó en 1993 y fue informado por Gauchat, et al. (1993) FEBS Lett. 315:259. Graf et al. lo mapearon al cromosoma Xq26.3-q27.1 (Graf, et al. (992) Eur. J. Immunol. 22: 3191-3194). Se han descrito formas solubles más cortas de la forma del ligando CD40 de 39 kDa de longitud completa, asociada a células, con pesos moleculares de 33 y 18 kDa. Graf, et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 1749; Ludewig, et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26: 3137; Wykes, et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:548. La forma soluble de 18 kDa generada mediante escisión proteolítica intracelular, que carece de la cola citoplasmática, la región transmembrana y partes del dominio extracelular, pero conserva el dominio de unión a CD40, conserva la capacidad de unirse al receptor de CD40 y, por lo tanto, es un ejemplo de un agente de señalización del receptor de CD40. Graf, et al. (1995), véase antes.
La patente de EE.UU. No. 5,981,724 divulga secuencias de ADN que codifican el ligando CD40 humano (CD40L) así como vectores y células huéspedes transformadas con el fin de producir polipéptidos CD40L. La patente de EE.UU. No.
5,962,406 divulga secuencias de ADN que codifican formas solubles de CD40L humano.
Las secuencias ejemplares de mamíferos homólogos de CD40L tienen los siguientes números de acceso a Genbank: NM_204733 (Gallus gallus (pollo)); DQ054533 (Ovis aries (oveja)); Z48469 (Bos taurus (vaca)); AY333790 (Canis familiaris (perro)); Macaca nemestrina (macaco de cola de cerdo)); AF344844 (Callithrix jacchus (tití de orejas empenachadas blancas)); AF34481 (Cercicebus torquatus atys (mangabeye gris)); AF344860 (Aotus trivirgatus (douroucouli)); AF344859 Macaca mulatta (mono rhesus)); AF116582 (Rattus nevegicus (rata de Noruega)); y AF079105 (Felus catus (gato)).
El receptor de CD40 también se puede activar mediante el uso de anticuerpos agonistas de CD40, fragmentos de anticuerpos, derivados y variantes de los mismos. Los anticuerpos agonistas de CD40 pueden adquirirse de proveedores comerciales como Mabtech (Nacka, Suecia). También se proporcionan más adelante ejemplos y procedimientos para generar estos agentes. La bibliografía también proporciona ejemplos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos agonistas de CD40. Véase, por ejemplo, Osada, et al. (2002) 25(2):176 and Ledbetter, J.A. et al. (1997) Crit. Reviews in Immunol. 17:427.
Como se indicó anteriormente, el agente que tiene la actividad biológica de CD40L puede ser un polipéptido traducido de un polinucleótido exógeno (ARNm o ADN) que codifica CD40L. Por ejemplo, el ARNm de CD40L tiene la secuencia de SEQ ID NO.: 1 o SEQ ID NO.:3. Alternativamente, las células se señalan con una cantidad eficaz de proteína y/o polipéptido CD40L, por ejemplo, las que tienen la secuencia de SEQ ID NO.: 2 o SEQ ID NO.:4. También se puede usar CD40L modificado en los procedimientos de esta invención. Por ejemplo, CD40L incluye aquellas moléculas que se han alterado mediante la adición, sustracción o sustitución, ya sea de forma conservadora o no conservadora, de cualquier número de aminoácidos, siempre que la proteína resultante se una a CD40 en la superficie de DC. Una "alteración conservadora" es aquella que da como resultado un aminoácido alternativo de densidad de carga, hidrofilicidad o hidrofobicidad, tamaño y/o configuraciones similares (por ejemplo, Val for Ile). En comparación, una "alteración no conservadora" es aquella que da como resultado un aminoácido alternativo de diferente densidad de carga, hidrofilicidad o hidrofobicidad, tamaño y/o configuración (por ejemplo, Val for Phe). Los medios para realizar tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y también se pueden lograr mediante kits y vectores disponibles comercialmente (por ejemplo, los disponibles en New England Biolabs, Inc., Beverly, Mass.; Clontech, Palo Alto, Calif.).
Cuando los agentes se administran como polinucleótidos o genes que codifican los agentes, se puede replicar una cantidad eficaz del polinucleótido mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. La tecnología de PCR es un medio para replicar el ADN y es el tema de las patentes de Estados Unidos Nos. 4,683,195; 4,800,159; 4,754,065; y 4,683,202 y se describe en PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION (Mullis et al. eds, Birkhauser Press, Boston (1994)) y las referencias citadas en el mismo. Más adelante se proporcionan procedimientos adicionales para generar polinucleótidos.
En formas de realización de la invención, en las que se estimulan células dendríticas inmaduras con un agonista del receptor de TNF-a, seguido de estimulación con un agonista de CD40, el procedimiento se realiza en ausencia de una cantidad eficaz de interleucina 1-beta (IL-1p) yo interleucina 6 (IL-6). Los procedimientos para detectar la presencia de proteínas tales como IL-1p e IL-6 se conocen en la técnica.
Un experto en la técnica puede determinar cuándo se ha cumplido el objeto del procedimiento muestreando una célula o una pequeña población de CD de la población para detectar la presencia de CD maduras que expresan ARNm de CD40L y/o polipéptido de CD40L. En un aspecto adicional, las CD maduras de CD83+ CCR7+ de la invención expresan la proteína p35 de interleucina 12 (IL-12). En un aspecto adicional, las CD maduras de CD83+ CCR7+ expresan la proteína IL-12p70 y/o expresan IL-10 limitada (no más de 500 pg/ml/106 CD).
Los pasos del procedimiento se pueden practicar in vivo o ex vivo. Cuando se practica ex vivo, el procedimiento se puede practicar en un sistema abierto o cerrado. Se conocen en la técnica procedimientos y sistemas para cultivar y enriquecer poblaciones de células. Véanse los ejemplos 1 y 2 de la publicación de patente de EE.UU. No. 2004/0072347. Véase también la publicación de patente de Ee .UU. No. 2003/0235908, que describe sistemas cerrados para expansión celular.
En un aspecto adicional de esta invención, el procedimiento anterior se modifica mediante la adición de administrar a las CD maduras o inmaduras una cantidad eficaz de un antígeno que luego será tratado y presentado por las CD maduras. Por tanto, los procedimientos de la invención comprenden además introducir en CDi, CD señalizadas o CD maduras de CCR7+ uno o más antígenos o polinucleótidos que codifican uno o más antígenos para producir CD maduras de CCR7+ cargadas con antígeno. El antígeno o polinucleótido que codifica el antígeno puede introducirse antes de dicha primera señal. Alternativamente, el antígeno o el polinucleótido que codifica el antígeno se administra después de dicha primera señal y antes de dicha segunda señal. En otra forma de realización, el antígeno o polinucleótido se administra después de dicha segunda señal o sustancialmente al mismo tiempo que dicha segunda señal.
Por ejemplo, los antígenos incluyen, pero no se limitan a, patógenos, lisados de patógenos, extractos de patógenos, polipéptidos de patógenos, partículas virales, bacterias, proteínas, polipéptidos, células cancerosas, lisados de células cancerosas, extractos de células cancerosas, polipéptidos específicos de células cancerosas. Los antígenos pueden producirse de forma natural o recombinante. Los inmunógenos pueden administrarse a las células como polipéptidos, proteínas o como ácidos nucleicos usando procedimientos conocidos en la técnica que se describen brevemente más adelante. Preferiblemente, uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígenos se introducen en las CDi, CD señalizadas o CD maduras de CCR7+. El polinucleótido se puede introducir en las CD mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En una forma de realización preferida, el polinucleótido se introduce mediante electroporación. Del modo más preferible, el polinucleótido es un ARNm. En formas de realización preferidas, el antígeno o el ARNm que codifica el antígeno se introduce junto con un ARNm que codifica un agonista de CD40 o sustancialmente al mismo tiempo que la señalización del agonista de CD40.
Los procedimientos pueden modificarse aún más poniendo en contacto la célula con una cantidad eficaz de una citocina o molécula coestimuladora, por ejemplo, GM-CSF, IL-4 y PGE2. En formas de realización en las que las CD inmaduras se señalizan con un agonista de TNFaR seguido de señalización con agonista de CD40, las cantidades eficaces de IL-1 p y/o IL-6 se excluyen específicamente del cultivo.
El antígeno puede administrarse en su forma "natural", ya que no intervino ninguna intervención humana en la preparación del antígeno o en su inducción para pasar al entorno en el que se encuentra con la APC. Alternativa o adicionalmente, el antígeno puede comprender una preparación cruda, por ejemplo, del tipo que se administra habitualmente en una inyección antialérgica convencional o en un lisado tumoral. Alternativamente, el antígeno puede purificarse sustancialmente, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90% de pureza.
Cuando el antígeno es un péptido, puede generarse, por ejemplo, mediante escisión proteolítica de proteínas aisladas. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de agentes de escisión, incluidos, entre otros, pepsina, bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, etc. Alternativamente, los péptidos se pueden sintetizar químicamente, preferiblemente en un sintetizador automático tal como está disponible en la técnica. Además, se pueden emplear técnicas recombinantes para crear un ácido nucleico que codifique el péptido de interés y para expresar ese péptido en las condiciones deseadas.
Alternativamente, el antígeno puede tener una estructura que sea distinta de cualquier compuesto de origen natural. En ciertas formas de realización de la invención, el antígeno es un "antígeno modificado" en el sentido de que el antígeno tiene una estructura que es sustancialmente idéntica a la de un antígeno natural, pero que incluye una o más desviaciones de la estructura precisa del compuesto natural. Por ejemplo, cuando el antígeno natural es una proteína o un antígeno polipeptídico, un antígeno modificado en comparación con esa proteína o antígeno polipeptídico tendría una secuencia de aminoácidos que difiere de la del antígeno natural en la adición, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos, y/o incluiría uno o más aminoácidos que difieren del aminoácido correspondiente en el antígeno natural por la adición, sustitución o deleción de uno o más residuos químicos unidos covalentemente al amino ácido. En un aspecto, los antígenos naturales y modificados comparten al menos una región de al menos 5 aminoácidos que son al menos aproximadamente idénticos en un 75%. Los expertos en la técnica apreciarán que, al comparar dos secuencias de aminoácidos para determinar el grado de su identidad, el espaciado entre tramos (es decir, regiones de al menos dos) de aminoácidos idénticos no siempre tienen que conservarse con precisión. Los antígenos de proteínas o polipéptidos de origen natural y modificados pueden mostrar al menos aproximadamente 80% de identidad, más alternativamente 85%, 90%, 95% o más del 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos para al menos una región de al menos 5 aminoácidos. A menudo, puede ser útil para una región mucho más larga (por ejemplo, 10, 20, 50 o 100 o más aminoácidos) de la secuencia de aminoácidos para mostrar el grado de identidad designado.
En formas de realización preferidas, el antígeno se administra como un polinucleótido o gen que codifica el antígeno, de modo que la expresión del gen da como resultado la producción de antígeno en el individuo que se está tratando (cuando se administra in vivo) o en el sistema de cultivo celular (cuando se administra in vitro). Las técnicas para generar ácidos nucleicos que incluyen un gen expresable y para introducir dichos ácidos nucleicos en un sistema de expresión en el que se producirá cualquier proteína codificada por el gen expresable se conocen en la técnica y se describen brevemente más adelante. Preferiblemente, en las DC se introduce un ARNm que codifica el antígeno.
En una forma de realización, el inmunógeno se administra antes de dicha primera señal, en la que la primera señal es un agonista de IFNyR o TNF-aR. Alternativamente, el inmunógeno se administra después de dicha primera señal y antes de dicha segunda señal, o el inmunógeno se administra después de dicha segunda señal. En otra forma de realización, el inmunógeno se administra sustancialmente al mismo tiempo que dicha segunda señal.
La cantidad de antígeno a emplear en cualquier composición o aplicación particular dependerá de la naturaleza del antígeno particular y de la aplicación para la que se usa, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica.
Las células dendríticas cargadas con antígeno son útiles para generar una respuesta inmune al (los) antígeno (s). Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para generar una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de CD maduras de CCR7+ cargadas con inimunogen. Las CD cargadas pueden ser alogénicas o autólogas del sujeto.
La divulgación proporciona además un procedimiento para estimular células efectoras inmunes, que comprende cultivar dichas células en presencia de CD maduras CCR7+ cargadas con antígeno producidas por los procedimientos de la invención para producir células efectoras inmunes estimuladas. En otra forma de realización, la invención proporciona un procedimiento para mejorar la inmunidad en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de dichas células efectoras, inmunes, estimuladas.
En un aspecto adicional de esta invención, se administra una cantidad eficaz de una citocina y/o molécula coestimuladora a las células o al paciente, in vitro o in vivo. Estos agentes pueden administrarse como polipéptidos, proteínas o, alternativamente, como polinucleótidos o genes que los codifican. Las citocinas, moléculas coestimuladoras y quimiocinas pueden proporcionarse como preparaciones impuras (por ejemplo, aislados de células que expresan un gen de citocina, endógeno o exógeno a la célula) o en forma "purificada". Las preparaciones purificadas son preferiblemente al menos aproximadamente un 90% de pureza, o alternativamente, al menos aproximadamente un 95% de pureza, o aún más, al menos aproximadamente un 99% de pureza. Alternativamente, se pueden proporcionar genes que codifican las citocinas o agentes inductores, de modo que la expresión génica dé como resultado la producción de citocinas o agentes inductores, ya sea en el individuo que está siendo tratado o en otro sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de transcripción / traducción in vitro o una célula huésped) a partir de la cual se puede obtener la citocina expresada o el agente inductor para su administración al individuo.
Cuando tanto la citocina como el antígeno deben administrarse a un individuo, pueden proporcionarse juntos o por separado. Cuando se administran como polipéptidos o proteínas, se pueden administrar en un dispositivo de encapsulación común o mediante asociación física como enlace covalente, enlace de hidrógeno, interacción hidrofóbica, interacción de van der Waals, etc. En una forma de realización alternativa, los compuestos se proporcionan juntos, se proporcionan genes que codifican ambos. Por ejemplo, se pueden proporcionar genes para ambos como parte de la misma molécula de ácido nucleico. En algunas formas de realización, esta molécula de ácido nucleico se puede preparar de modo que ambos factores se expresen a partir de un único polinucleótido contiguo, como una proteína de fusión en la que la citocina y el antígeno se unen covalentemente entre sí mediante un enlace peptídico. Alternativa o adicionalmente, los genes pueden unirse a las mismas secuencias de control o equivalentes, de modo que ambos genes se expresen dentro del individuo en respuesta a los mismos estímulos. Se conoce en la técnica una amplia variedad de diferentes secuencias de control, activas en diferentes células huésped en diferentes condiciones. Estas secuencias de control, incluidas las secuencias de control constitutivas, las secuencias de control inducibles y las secuencias de control reprimibles, se pueden usar de acuerdo con la presente invención, aunque las secuencias inducibles o reprimibles son particularmente preferidas para aplicaciones en las que se desea un control adicional sobre el momento de la expresión génica.
Los expertos en la técnica apreciarán que la administración de citocinas y/o antígenos puede combinarse opcionalmente con la administración de cualquier otro factor modulador del sistema inmunológico deseado, tal como, por ejemplo, un adyuvante u otro compuesto inmunomodulador.
Los antígenos también se pueden administrar en forma de polinucleótidos o genes que codifican los antígenos. Los antígenos también se pueden modificar uniendo una parte de la secuencia de un primer polipéptido (por ejemplo, un primer antígeno) a una parte de la secuencia de un segundo polipéptido (por ejemplo, un segundo antígeno, una secuencia señal, un dominio de transmembrana, un asa de purificación, etc.) por medio de un enlace peptídico. Los expertos en la técnica apreciarán la diversidad de tales proteínas de fusión para su uso de acuerdo con la presente invención. Las técnicas recombinantes permiten además la fácil modificación de la secuencia de aminoácidos de antígenos de polipéptidos o proteínas, mediante sustitución, deleción, adición o inversión de secuencias de aminoácidos.
Cuando el inmunógeno es un fragmento de un antígeno, puede generarse, por ejemplo, mediante escisión proteolítica de proteínas aisladas. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de agentes de escisión, incluidos, entre otros, pepsina, bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, etc. Alternativamente, los péptidos pueden sintetizarse químicamente, preferiblemente en un sintetizador automático tal como está disponible en la técnica (véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co., 1984. Además, se pueden emplear técnicas recombinantes para crear un ácido nucleico que codifique el péptido de interés y para expresar ese péptido en las condiciones deseadas (por ejemplo, en una célula huésped o un sistema de expresión in vitro a partir del cual se puede purificar fácilmente).
En formas de realización preferidas, el antígeno es de una célula cancerosa o un patógeno. Preferiblemente, la célula neoplásica es una célula de cáncer renal, una célula de mieloma múltiple o una célula de melanoma. Los patógenos preferidos son VIH y VHC. En formas de realización preferidas, el antígeno se administra a la célula presentadora de antígeno en forma de ARN aislado o derivado de una célula neoplásica o un patógeno. Los procedimientos para RT-PCR de ARN extraído de cualquier célula (por ejemplo, una célula neoplásica o una célula patógena) y la transcripción in vitro se divulgan en la solicitud de patente PCT/US05/32710 en trámite junto con la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. 60/525,076.
El antígeno empleado de acuerdo con la presente invención puede ser un compuesto de origen natural o alternativamente puede tener una estructura que sea distinta de cualquier compuesto de origen natural. En ciertas formas de realización de la invención, el antígeno es un "antígeno modificado" en el sentido de que el antígeno tiene una estructura que es sustancialmente idéntica a la de un antígeno natural, pero que incluye una o más desviaciones de la estructura precisa del compuesto de origen natural.
Esta divulgación también proporciona las poblaciones enriquecidas de CD maduras preparadas mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Las CD maduras preparadas mediante los procedimientos de la invención tienen características inmunoestimuladoras mejoradas. En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para almacenar una población enriquecida de CD maduras, que comprende poner en contacto una población de células dendríticas enriquecidas de la invención con un crioconservante adecuado en condiciones adecuadas.
Las composiciones descritas en el presente documento son útiles para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de la población enriquecida de células, por ejemplo, CD, CD modificadas o células efectoras inmunitarias educadas. Las células pueden ser alogénicas o autólogas. Se pueden administrar a un sujeto para generar o inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de las poblaciones enriquecidas como se describe anteriormente. Las células pueden ser alogénicas o autólogas del sujeto. También se pueden usar para educar a las células efectoras inmunes tales como las células T cultivando la célula efectora inmunitaria en presencia y a expensas de una CD madura de esta invención. Las células efectoras educadas también se pueden usar para mejorar la inmunidad en un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de estas células.
Procedimientos para generar y administrar polinucleótidos
Ciertas formas de realización de esta invención requieren el uso de polinucleótidos. Estos se pueden generar y replicar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica; por ejemplo, un experto en la técnica puede usar las secuencias proporcionadas en este documento y un sintetizador de ADN comercial para replicar el ADN. Alternativamente, se pueden obtener proporcionando la secuencia lineal del polinucleótido, moléculas cebadoras apropiadas, productos químicos tales como enzimas e instrucciones para su replicación y replicando químicamente o enlazando los nucleótidos en la orientación adecuada para obtener los polinucleótidos. En una forma de realización separada, estos polinucleótidos son aislados, además. Además, un experto en la técnica puede insertar el polinucleótido en un vector de replicación adecuado e insertar el vector en una célula huésped adecuada (procariota o eucariota) para replicación y amplificación. El ADN así amplificado puede aislarse de la célula mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. En el presente documento se proporciona además un procedimiento para obtener polinucleótidos mediante este método, así como los polinucleótidos así obtenidos.
En una forma de realización, el agente (por ejemplo, CD40L) se administra como ARNm. El ARN se puede obtener insertando primero un polinucleótido de a Dn en una célula huésped adecuada o, preferiblemente, mediante transcripción in vitro. El ADN puede insertarse mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, mediante el uso de un vehículo de administración de genes apropiado (por ejemplo, liposoma, plásmido o vector) o mediante electroporación. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en a RN; el ARN puede aislarse luego usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se expone en Sambrook et al. (1989), véase antes. Por ejemplo, el ARNm se puede aislar usando diversas enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook, et al. (1989), véase antes, o extraídas con resinas de unión a ácido nucleico siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes.
En formas de realización preferidas, el casete de expresión de CD40L contiene un promotor adecuado para la transcripción in vitro, como el promotor T7 o el promotor SP6. Preferiblemente, el ARNm del agonista de CD40L o CD40 transcrito in vitro se optimiza para la estabilidad y eficacia de la traducción. Por ejemplo, SEQ ID NO:13 representa un ARNm de CD40L optimizado, en el que los codones ATG en la región no traducida 5' se han alterado para evitar el inicio incorrecto de la traducción.
La estabilidad del ARNm y/o la eficacia de traducción también se pueden incrementar incluyendo 3'UTR y/o 5'UTR en el ARNm. Los ejemplos preferidos de 3'UTR incluyen los de CD40 humano, p-actina y gen 6 de rotavirus. Los ejemplos preferidos de 5'u Tr incluyen CD40L y los potenciadores de traducción en 5'UTR de Hsp70, VEGF, virus de necrosis del bazo RU5 y virus del grabado del tabaco.
Por ejemplo, la expresión de CD40L normalmente está regulada en parte por la inestabilidad del ARNm mediada por 3'Ut R y, por lo tanto, una gran parte de 3'UTR de CD40L no está incluida en el ARNm actual de CD40L. Cd 40L normalmente no se expresa en CD. Por el contrario, el receptor de CD40 se expresa en CD y no hay evidencia en la bibliografía que indique que su expresión esté regulada postranscripcionalmente, particularmente al nivel de estabilidad del ARNm. Incluyendo la 3'UTR de CD40 receptor (SEQ ID NO:14, o un fragmento activo del mismo) en el extremo 3' o región del ARNm de CD40L daría la secuencia no traducida de ARN 3' similar a los mensajes de CD40 de origen natural sin impartir ninguna actividad reguladora no deseada.
La beta-actina es un gen que se expresa abundantemente en células humanas no musculares. El promotor de beta-actina humana se ha utilizado ampliamente para impulsar la expresión génica en líneas celulares de mamíferos y ratones transgénicos. Se ha demostrado que la inclusión de la beta-actina 3'UTR más la región flanqueante aumenta aún más el nivel de acumulación de ARNm a partir de constructos de expresión génica que contienen el promotor de beta-actina.
Qin y Gunning (1997) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 36 pp. 63-72. SEQ ID NO:15 representa la región no traducida del exón final de la beta-actina 3 'UTR humana. En SEQ ID NO:16 se muestra la región mínima de esta 3'UTR.
La 3'UTR del ARNm del gen 6 del rotavirus de simio (SEQ ID NO:17) funciona como un potenciador de la traducción en su transcrito viral no poliadenilado protegido. También se ha demostrado que la 3'UTR mejora la traducción de un ARNm informador heterólogo en lisados de reticulocitos de conejo. Yang et. al., 2004 Archives of Virology 149:303-321. El elemento funcional mínimo de esta 3'UTR se muestra en s Eq ID NO:18.
Se ha demostrado que la 5 'UTR del gen hsp70 humano (SEQ ID NO:19) aumenta la traducción de los ARNm informadores en ausencia de inducción de estrés y sin influir drásticamente en la estabilidad del mensaje. Se ha demostrado la función potenciadora en varias líneas celulares humanas. Vivinus, et al., 2001 European Journal of Biochemistry 268:1908-1917.
La 5' UTR de VEGF (SEQ ID NO:20) de ratón mejora la traducción de un ARN informador monocistrónico y también tiene actividad IRES (sitio de entrada de ribosoma interno). Su actividad potenciadora se ha demostrado en líneas celulares de rata, hámster y humano. La 5'UTR de longitud completa es de 1014 nucleótidos, pero se demostró que una versión mutante de 163 nucleótidos (SEQ ID NO:21) es más activa. Stein et al., 1998 Molecular and Cellular Biology 18:3112-3119.
El virus de la necrosis del bazo (SNV) es un retrovirus aviar. La región RU5 de la LTR 5' viral (SEQ ID NO:22) estimula la eficiencia de traducción de un ARN informador no viral en células 293 humanas. Roberts y Boris-Lawrie 2000 Journal of Virology 74:8111-8118.
El líder 5' de 143 nucleótidos del ARN del virus del grabado del tabaco (SEQ ID NO:23) promueve la traducción independiente del protector de los ARNm informadores en líneas celulares de plantas y animales. Aunque la secuencia líder no mejora aún más la traducción de las transcripciones protegidas, la expresión de CD40L independiente del protector en células dendríticas es una alternativa muy atractiva a la protección in vitro. Gallie et al. (1995) Gene 165:233-238. Niepel y Gallie (1999) Journal of Virology 73:9080-9088. Gallie, Journal of Virology (2001) 75:12141-12152.
Las células dendríticas se pueden transfectar con ácidos nucleicos mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, precipitación con fosfato cálcico, microinyección o electroporación. Pueden añadirse solos o en combinación con un vehículo adecuado, por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina de pH regulado con fosfato. Alternativa o adicionalmente, el ácido nucleico puede incorporarse en un vector de expresión o inserción para su incorporación a las células. Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que se puede unir operativamente un polinucleótido son conocidos en la técnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y se encuentran disponibles comercialmente de fuentes como Stratagene (La Jolla, CA) and Promega Biotech (Madison, WI). Con el fin de optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser necesario eliminar, agregar o alterar las porciones 5' y/o 3' no traducidas de los clones para eliminar codones de iniciación de la traducción alternativos adicionales, potencialmente inapropiados u otras secuencias que puedan interferir con o reducir la expresión, ya sea a nivel de transcripción o traducción. Alternativamente, se pueden insertar sitios de unión de ribosoma consenso inmediatamente 5' del codón de inicio para mejorar la expresión. Ejemplos de vectores son virus, tales como baculovirus y retrovirus, bacteriófagos, adenovirus, virus adeno-asociados, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación usados típicamente en la técnica que se han descrito para expresión en una variedad de huéspedes eucariotas y procariotas, y pueden usarse para terapia génica, así como para la expresión de proteínas simples.
Entre estos se encuentran diversos vectores no virales, que incluyen complejos de ADN/liposomas y complejos de ADN de proteínas virales dirigidas. Para mejorar la administración a una célula, el ácido nucleico o las proteínas de esta invención se pueden conjugar con anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a antígenos de la superficie celular. Los liposomas que también comprenden un anticuerpo de direccionamiento o un fragmento del mismo pueden usarse en los procedimientos de esta invención. Esta invención también proporciona los complejos de direccionamiento para su uso en los procedimientos descritos en este documento.
Los polinucleótidos se insertan en genomas de vector usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ADN del inserto y del vector se puede poner en contacto, en condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios en cada molécula que puedan emparejarse entre sí y unirse con una ligasa. Alternativamente, los enlazadores de ácido nucleico sintéticos pueden ligarse a los extremos del polinucleótido restringido. Estos enlazadores sintéticos contienen secuencias de ácido nucleico que corresponden a un sitio de restricción particular en el ADN del vector. Además, un oligonucleótido que contiene un codón de terminación y un sitio de restricción apropiado puede ligarse para su inserción en un vector que contiene, por ejemplo, algunos o todos los siguientes: un gen marcador seleccionable, tal como el gen de neomicina para la selección de transfectantes estables o transitorios en células de mamífero; secuencias potenciadoras/promotoras del gen temprano inmediato del CMV humano para niveles elevados de transcripción; terminación de la transcripción y señales de procesamiento de ARN de SV40 para la estabilidad del ARNm; orígenes de replicación del polioma SV40 y ColEl para la replicación episomal adecuada; múltiples sitios de clonación versátiles; y promotores de ARN de T7 y SP6 para la transcripción in vitro de ARN sentido y antisentido. En la técnica se conocen y están disponibles otros recursos.
Preparación y aislamiento de proteínas y polipéptidos
Los polipéptidos y proteínas son componentes necesarios de diversos procedimientos de esta invención. Las proteínas y polipéptidos se pueden obtener mediante síntesis química usando un sintetizador de péptidos automatizado disponible comercialmente, como los fabricados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Model 430A or 431A, Foster City, CA, EE. UU. La proteína o el polipéptido sintetizados pueden precipitarse y purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Alternativamente, las proteínas y polipéptidos pueden obtenerse mediante procedimientos recombinantes conocidos como se describen en este documento usando la célula huésped y los sistemas de vector descritos más adelante.
Los expertos en la técnica saben bien que se pueden realizar modificaciones en cualquier péptido para proporcionarle propiedades modificadas. Como se usa en este documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y los isómeros ópticos D y L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos se denomina comúnmente oligopéptido si la cadena del péptido es corta. Si la cadena peptídica es larga, el péptido se denomina comúnmente polipéptido o proteína. Los péptidos para usar en esta invención pueden modificarse para incluir aminoácidos no naturales. Por lo tanto, los péptidos pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D- y L-aminoácidos y diversos aminoácidos de "diseñador" (por ejemplo, p-metilaminoácidos, C-a-metilaminoácidos, y N-a-metilaminoácidos, etc.) para transmitir propiedades especiales a los péptidos. Además, mediante la asignación de aminoácidos específicos en etapas de acoplamiento específicas, se pueden generar péptidos con hélices a, giros p, láminas p, giros y y péptidos cíclicos. En una forma de realización adicional, se elegirán subunidades de péptidos que confieran propiedades químicas y estructurales útiles. Por ejemplo, péptidos que comprenden los D-aminoácidos pueden ser resistentes a las proteasas específicas de L-aminoácidos in vivo. Los compuestos modificados con D-aminoácidos se pueden sintetizar con los aminoácidos alineados en orden inverso para producir los péptidos de la invención como péptidos retroinversos. Además, la presente invención contempla la preparación de péptidos que tienen propiedades estructurales mejor definidas y el uso de peptidomiméticos y enlaces peptidomiméticos, tales como enlaces de éster, para preparar péptidos con nuevas propiedades. En otra forma de realización, se puede generar un péptido que incorpore un enlace peptídico reducido, es decir, R1-CH2NH-R2, donde Ri y R2 son residuos o secuencias de aminoácidos. Puede introducirse un enlace peptídico reducido como una subunidad de dipéptido. Tal molécula sería resistente a la hidrólisis de enlaces peptídicos, por ejemplo, actividad de proteasa. Tales moléculas proporcionarían péptidos con función y actividad únicas, como vidas medias prolongadas in vivo debido a la resistencia a la degradación metabólica o la actividad de proteasa. Además, es bien sabido que en ciertos sistemas los péptidos restringidos muestran una actividad funcional mejorada (Hruby (1982) Life Sciences 31:189-199 y Hruby et al. (1990) Biochem 3. 268:249-262); la presente invención proporciona un procedimiento para producir un péptido restringido que incorpora secuencias aleatorias en todas las demás posiciones.
Procedimientos para aislar células madre
Se conocen muchos procedimientos en la técnica para el aislamiento y expansión de células madre CD34+ para la expansión a, y diferenciación en, células dendríticas in vitro. Véase, por ejemplo, la publicación U.S. 5,199,942. Las siguientes descripciones tienen el propósito de ilustrar únicamente y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
Las células madre CD34+ se pueden aislar de las células de la médula ósea o mediante el cribado de las células de la médula ósea u otras fuentes con anticuerpos que se unen a células no deseadas, como CD4+ y CD8+ (células T), CD45+ (células panB) y GR-1. Para una descripción detallada de este protocolo, véase Inaba, et al. (1992) 3. Exp. Med. 176:1693-1702. Las células CD34+ humanas se pueden obtener de una variedad de fuentes, que incluyen sangre de cordón, explantes de médula ósea y sangre periférica movilizada. La purificación de células CD34+ se puede lograr mediante procedimientos de afinidad de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Paczesny et al. (2004) 3 Exp Med. 199: 1503-11; Ho, et al. (1995) Stem Cells 13 (suppl. 3):100-105; Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2:7-17; y Yu, et al. (1995) PNAS 92:699-703.
Diferenciación de células madre en células dendríticas inmaduras
Las células madre CD34+ se pueden diferenciar en células dendríticas incubando las células con las citocinas apropiadas. Inaba et al. (1994), véase antes, describieron la diferenciación in vitro de células madre de murino en células dendríticas incubando las células madre con GM-CSF de murino. En resumen, las células madre aisladas se incuban con entre 1 y 200 ng/ml de GM-CSF de murino, y preferiblemente con aproximadamente 20 ng/ml de GM-CSF en medio de crecimiento RPMI estándar. Los medios se cambian con medios recién preparados aproximadamente una vez cada dos días. Después de aproximadamente 5-7 días en cultivo, un gran porcentaje de células son dendríticas, según se evalúa mediante la expresión de marcadores de superficie y morfología. Las células dendríticas se aíslan mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o mediante otros procedimientos estándar.
Las células madre CD34+ de murino se pueden diferenciar en células dendríticas cultivando las células con GM-CSF de murino. Típicamente, la concentración de GM-CSF en cultivo es de al menos aproximadamente 0.2 ng/ml, y preferiblemente de al menos aproximadamente 1 ng/ml. A menudo, el intervalo estará entre aproximadamente 20 ng/ml y 200 ng/ml. En muchas formas de realización preferidas, la dosis será de aproximadamente 100 ng/ml. La IL-4 se añade opcionalmente en intervalos similares para producir CD de murino.
Las células madre hematopoyéticas CD34+ humanas se diferencian preferiblemente in vitro cultivando las células con GM-CSF y TNF-a humanos. Véase, por ejemplo, Szabolcs, et al. (1995) 154:5851-5861. El GM-CSF humano se usa en intervalos similares y también se puede agregar TNF-a para facilitar la diferenciación. El TNF-a también se agrega típicamente en aproximadamente los mismos intervalos. Opcionalmente, se añade SCF u otro ligando de proliferación (por ejemplo, Flt3) en intervalos de dosis similares para diferenciar las CD humanas.
Como es evidente para los expertos en la técnica, los intervalos de dosis para diferenciar las células madre y los monocitos en células dendríticas son aproximados. Diferentes proveedores y diferentes lotes de citocinas del mismo proveedor varían en la actividad de la citocina. Un experto puede valorar fácilmente cada citocina que se usa para determinar la dosis óptima para cualquier citocina en particular.
Diferenciación de monocitos en células dendríticas
Se pueden generar CD a partir de precursores CD14+ frecuentes, pero no proliferantes (monocitos) en sangre periférica mediante cultivo en medio que contenga GM-CSF e IL-4 o GM-CSF e iL-13 (véase, por ejemplo, la publicación WO 97/29182). Este procedimiento se describe en Sallusto y Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179:1109 y Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83. Brevemente, los precursores de CD14+ son abundantes, por lo que se informa que el pretratamiento de pacientes con citocinas como G-CSF (usado para aumentar las células CD34+ y precursores más comprometidos en sangre periférica) es innecesario en la mayoría de los casos (Romani et al. (1996) J. Immunol. Methods 196:137). Otros han informado que las CD generadas mediante esta estrategia parecen bastante homogéneas y pueden producirse en un estado inmaduro o completamente diferenciadas o maduras. Se demostró que es posible evitar proteínas no humanas como el FCS (suero de ternero fetal) y obtener CD completamente e irreversiblemente maduras y estables mediante el uso de medio condicionado de monocitos autólogos como estímulo de maduración (Romani et al. (1996) Immunol. Methods 196:137; Bender et al. (1996) J. Immunol. Methods 196:121). Sin embargo, en contraste con la presente invención, estos estudios no dieron como resultado CD maduras que tuvieran niveles aumentados de IL-12 y/o niveles disminuidos de IL-10.
Carga de antígenos
Los expertos en la técnica conocen procedimientos para cargar células dendríticas con antígenos. En una forma de realización, las células dendríticas se cultivan en un medio que contiene el antígeno. Las CD luego toman y tratan el antígeno en la superficie celular en asociación con moléculas de MHC. Preferiblemente, las CD se cargan con antígeno mediante transfección con un ácido nucleico que codifica el antígeno. Los expertos en la técnica conocen procedimientos de transfección de DC.
Aislamiento y expansión de linfocitos T
En algunos procedimientos de esta divulgación, los linfocitos T se aíslan de mamíferos para que puedan ser educados (o activados) por las CD maduras modificadas in vitro. En un procedimiento, la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque se usa para separar PBMC de glóbulos rojos y neutrófilos de acuerdo con procedimientos establecidos. Las células se lavan con AIM-V modificado (que consiste en AIM-V (GIBCO) con glutamina de 2 mM, sulfato de gentamicina de 10 pg/ml, estreptomicina de 50 pg/ml) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 1%. Las células T se enriquecen mediante selección negativa o positiva con anticuerpos monoclonales apropiados acoplados a columnas o perlas magnéticas de acuerdo con técnicas estándar. Se analiza una alícuota de células para determinar el fenotipo de la superficie celular que incluye CD4, CD8, CD3 y CD14. Solo con fines ilustrativos, las células se lavan y se resuspenden a una concentración de aproximadamente 5 x 105 células por ml de AIM-V modificado como anteriormente y que contiene FBS al 5% y 100 U/ml de IL-2 recombinante (rIL-2) (suplementado con AIM-V). Cuando las células se aíslan de un paciente con VIH+, CD4-PE40 de 25 nM (una proteína recombinante que consta del dominio CD4 de unión al VIH-1 unido a la translocación y dominios de ADP-ribosilación de Pseudomonas aeruginosa de exotoxina A), u otra molécula citotóxica recombinante similar que hibrida selectivamente a VIH se agrega a los cultivos celulares para el resto de la expansión celular para eliminar selectivamente las células infectadas por el VIH del cultivo. Se ha demostrado que CD4-PE40 inhibe la producción de p24 en cultivos de células infectadas por VIH y mata selectivamente las células infectadas por VIH-1.
Para estimular la proliferación, se puede añadir el anticuerpo monoclonal OKT3 (Ortho Diagnostics) a una concentración de 10 ng/ml y las células se cultivan en placas de 24 pocillos con 0.5 ml por pocillo. Las células se cultivan a una temperatura de aproximadamente 37°C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% durante 48 horas. Se aspira el medio de las células y 1 ml de sobrenadante que contiene vector (descrito más adelante) suplementado con 5 pl/ml de sulfato de protamina, 100 U/ml de rIL-2, 100 U/ml de penicilina, 0.25 pg/ml de anfotericina B/ml y 100 pg/ml adicionales de estreptomicina (se puede añadir 25 nM de CD4-PE40).
Aislamiento y caracterización celular
En otro aspecto, se pueden usar marcadores de superficie celular para aislar las células necesarias para practicar el procedimiento de esta divulgación. Por ejemplo, las células madre humanas expresan típicamente el antígeno CD34, mientras que las CD expresan moléculas de MHC y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, B7-1 y B7-2), una falta de marcadores específicos para granulocitos, células NK, células B y células T. La expresión de marcadores de superficie facilita la identificación y purificación de estas células. Estos procedimientos de identificación y aislamiento incluyen FACS, cromatografía en columna, cribado con perlas magnéticas, transferencias Western, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión y similares, y diversos procedimientos inmunológicos tales como reacciones de precipitina en gel o fluido, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia y similares. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos e inmunoensayos en general, véase Stites y Terr (eds.) 1991 Basic and Clinical Immunology (7th ed.) y Paul, véase antes. Para una discusión sobre cómo producir anticuerpos contra antígenos seleccionados, véase Harlow y Lane (1989); véase antes.
El aislamiento celular o los inmunoensayos para la detección de células durante la purificación celular se pueden realizar en cualquiera de varias configuraciones, por ejemplo, las revisadas en Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Fla.; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; Harlow y Lane, véase antes; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, F1a.; Price y Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY.
Las células se pueden aislar y caracterizar mediante procedimientos de citometría de flujo como el análisis FACS. Se conoce una amplia variedad de procedimientos de citometría de flujo. Para una reseña general de la citometría de flujo activada por fluorescencia, véase, por ejemplo, Abbas et al. (1991) Cellular and Molecular immunology W.B. Saunders Company, particularmente el capítulo 3, y Kuby (1992) Immunology W.H. Freeman and Company, particularmente el capítulo 6. Las máquinas de FACS están disponibles, por ejemplo, en Becton Dickinson.
Los agentes de etiquetado que se pueden usar para etiquetar el antígeno celular incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, proteínas u otros polímeros tales como matrices de afinidad, carbohidratos o lípidos. La detección se realiza mediante cualquier procedimiento conocido, como inmunotransferencia, análisis de transferencia Western, seguimiento de marcadores radiactivos o bioluminiscentes, electroforesis capilar u otros procedimientos que rastrean una molécula en función del tamaño, la carga o la afinidad.
Anticuerpos
Ciertos aspectos de este procedimiento requieren el uso de anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Pueden ser derivados de anticuerpos o variantes de anticuerpos. Pueden ser quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Usando una proteína o un polipéptido, un experto en la técnica puede generar adicionalmente anticuerpos que se unen específicamente al receptor. También se puede usar un fragmento funcional o derivado de un anticuerpo que incluye Fab, Fab', Fab2, Fab'2 y regiones variables de cadena sencilla. Los anticuerpos se pueden producir en cultivo celular, en fagos o en diversos animales, incluidos, entre otros, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios, etc. Estos pueden usarse siempre que el fragmento o derivado conserve la especificidad de unión por la proteína o fragmento de la misma. Los anticuerpos pueden ensayarse para determinar la especificidad de la unión comparando la unión al antígeno apropiado con la unión al antígeno irrelevante o la mezcla de antígenos en un conjunto de condiciones dado. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferiblemente 10 veces más que al antígeno irrelevante o la mezcla de antígenos, entonces se considera que es específico.
En la tecnología se conocen técnicas para fabricar tales anticuerpos de parcial a completamente humanos y se puede usar cualquiera de tales técnicas. Según una forma de realización, las secuencias de anticuerpos completamente humanos se preparan en un ratón transgénico que ha sido diseñado para expresar genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada humana. Se han elaborado múltiples cepas de tales ratones transgénicos que pueden producir diferentes clases de anticuerpos. Las células B de ratones transgénicos que están produciendo un anticuerpo deseable pueden fusionarse para formar líneas de células de hibridoma para la producción continua del anticuerpo deseado. Véase, por ejemplo, Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000: 1820-1826; Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23; Yang et al. (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6):1236-1243; Jakobovits (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42; Green y Jakobovits (1998) Exp. Med. 188(3):483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614; Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421; Sherman-Gold (1997). Genetic Engineering News 17:14; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Jakobovits (1996) WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, THE INTEGRATED IMMUNE SYSTEM VOL. IV, 194.1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566; Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4:761-763; Arbones et al. (1994) Immunity 1:247-260; Jakobovits (1993) Nature 362:255-258; Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Kucherlapati, et al. patente estadounidense No. 6,075,181.
También se pueden preparar anticuerpos usando técnicas de visualización de fagos. Dichas técnicas pueden usarse para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez modificadas. También se puede utilizar Fv de cadena única si es conveniente. Se pueden fabricar a partir de ratones transgénicos vacunados, si se desea.
Los anticuerpos de esta invención también se pueden modificar para crear anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos quiméricos son aquellos en los que los diversos dominios de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos están codificados por ADN de más de una especie. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No.: 4,816,567.
El término "variante de anticuerpo" también incluye "diacuerpos" que son pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, en los que los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH VL). Véanse, por ejemplo, las publicaciones EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448. Mediante el uso de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno. Véase también la patente de EE.UU. No. 6,632,926 de Chen et al. que describe variantes de anticuerpos que tienen uno o más aminoácidos insertados en una región hipervariable del anticuerpo original y una afinidad de unión por un antígeno diana que es al menos aproximadamente dos veces más fuerte que la afinidad de unión del anticuerpo original por el antígeno. El término también incluye la modificación pos-traduccional de la secuencia polipeptídica lineal del anticuerpo o fragmento. El término "variante de anticuerpo" incluye además "anticuerpos lineales". El procedimiento para preparar tales variantes se conoce en la técnica y se describe en Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH ~CH 1-VH -CH1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Procedimientos para detectar ácidos nucleicos
Se conocen diversos procedimientos para cuantificar la expresión de un gen de interés (por ejemplo, CD40L y/o IL-12p35) e incluyen, entre otros, ensayos de hibridación (análisis de transferencia Northern) y ensayos de hibridación basados en PCR. Al analizar una alteración en el nivel de ARNm, como ARNm de IL-12 p35 o ARNm de CD40L, se puede extraer primero el ácido nucleico contenido en una muestra. Por ejemplo, el ARNm se puede aislar usando diversas enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook et al. (1989), véase antes, o extraerse con resinas de unión a ácidos nucleicos disponibles comercialmente siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes. El ARNm contenido en la muestra de ácido nucleico extraída puede detectarse luego mediante hibridación (por ejemplo, análisis de transferencia Northern) y/o procedimientos de amplificación usando sondas de ácido nucleico y/o cebadores, respectivamente, de acuerdo con procedimientos estándar.
Las moléculas de ácido nucleico que tienen al menos 10 nucleótidos y que presentan complementariedad u homología de secuencia con el ácido nucleico a detectar pueden usarse como sondas de hibridación o cebadores en los procedimientos de diagnóstico. Se sabe en la técnica que no se necesita una sonda "perfectamente emparejada" para una hibridación específica. Los cambios menores en la secuencia de la sonda logrados por sustitución, deleción o inserción de un pequeño número de bases no afectan la especificidad de la hibridación. En general, se puede tolerar hasta un 20% de disparidad de pares de bases (cuando está alineado de manera óptima). Por ejemplo, una sonda útil para detectar ARNm de CD40L es al menos aproximadamente un 80% idéntica a la región homóloga de tamaño comparable contenida en una secuencia previamente identificada, por ejemplo, ver SEQ ID NOS: 1 o 3. Alternativamente, la sonda es al menos un 85% o incluso al menos un 90% idéntica a la secuencia del gen correspondiente después del alineamiento de la región homóloga. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño de los tramos complementarios, dependerá del uso o aplicación pretendidos del segmento de ácido nucleico particular. Los fragmentos más pequeños del gen generalmente encontrarán uso en formas de realización de hibridación, en las que la longitud de la región complementaria puede variar, tal como entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 nucleótidos, o incluso la longitud completa según las secuencias complementarias que se desean detectar.
Las sondas de nucleótidos que tienen secuencias complementarias por tramos superiores a aproximadamente 10 nucleótidos de longitud aumentarán la estabilidad y la selectividad del híbrido y, por lo tanto, mejorarán la especificidad de las moléculas híbridas particulares que se han obtenido. Se pueden diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan tramos complementarios de genes de más de aproximadamente 25 e incluso más preferiblemente más de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, o incluso más largos cuando se desee. Dichos fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, mediante la aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, como la tecnología PCRTM con dos oligonucleótidos cebadores como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4,603,102 o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante.
En determinadas formas de realización, será ventajoso emplear secuencias de ácido nucleico de la presente invención en combinación con un medio apropiado, como una etiqueta, para detectar la hibridación y, por tanto, las secuencias complementarias. Se conoce en la técnica una amplia variedad de medios indicadores apropiados, incluidos ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros, tales como avidina / biotina, que son capaces de dar una señal detectable. También se puede utilizar una etiqueta fluorescente o un marcador enzimático, como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos indeseables en el ambiente. En el caso de los marcadores enzimáticos, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que pueden emplearse para proporcionar un medio visible para el ojo humano o de modo espectrofotométrico para identificar la hibridación específica con muestras complementarias que contienen ácido nucleico.
Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones relevantes incluyen la temperatura, la fuerza iónica, el tiempo de incubación, la presencia de solutos adicionales en la mezcla de reacción, como la formamida, y el procedimiento de lavado. Las condiciones de mayor rigurosidad son aquellas condiciones, como una temperatura más alta y una concentración más baja de iones de sodio, que requieren una mayor complementariedad mínima entre elementos hibridantes para que se forme un complejo de hibridación estable. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica. Véase Sambrook, et al. (1989), anteriormente. También se puede utilizar la detección y cuantificación del nivel de ARNm o su expresión mediante PCR cuantitativa o análisis de alto rendimiento, como el análisis en serie de expresión génica (SAGE) como se describe en Velculescu et al. (1995) Science 270:484-487. Brevemente, el procedimiento comprende aislar múltiples ARNm de muestras de células o tejidos de los que se sospecha que contienen el transcrito. Opcionalmente, las transcripciones de genes se pueden convertir en ADNc. Una muestra de las transcripciones de genes se somete a un análisis específico de secuencia y se cuantifica. Estas abundancias de secuencias de transcripción de genes se comparan con las abundancias de secuencias de bases de datos de referencia que incluyen conjuntos de datos normales para pacientes enfermos y sanos. El paciente tiene la enfermedad o enfermedades con las que el conjunto de datos del paciente se correlaciona más estrechamente y, para esta aplicación, incluye el diferencial de la transcripción.
En ciertos aspectos, puede ser necesario utilizar polinucleótidos como sondas de nucleótidos o cebadores para la amplificación y detección de genes o transcripciones de genes. Un cebador útil para detectar ARN expresado diferencialmente es al menos aproximadamente un 80% idéntico a la región homóloga de tamaño comparable de un gen o polinucleótido. Para el propósito de esta invención, amplificación significa cualquier procedimiento que emplee una polimerasa dependiente de cebador capaz de replicar una secuencia diana con una fidelidad razonable. La amplificación puede llevarse a cabo mediante polimerasas de ADN naturales o recombinantes tales como polimerasa de a Dn de T7, fragmento polimerasa de ADN de E. coli de Klenow y transcriptasa inversa.
Los procedimientos generales para la PCR se enseñan en MacPherson et al., PCR: A PRACTICAL APPROACH, (IRL Press at Oxford University Press (1991)). Sin embargo, las condiciones de PCR utilizadas para cada reacción de aplicación se determinan empíricamente. Varios parámetros influyen en el éxito de una reacción. Entre ellos se encuentran la temperatura y el tiempo de hibridación, el tiempo de extensión, la concentración de Mg2+ ATP, el pH y la concentración relativa de cebadores, plantillas y desoxirribonucleótidos.
Después de la amplificación, los fragmentos de ADN resultantes pueden detectarse mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de visualización con tinción con bromuro de etidio e iluminación ultravioleta. Puede verificarse una amplificación específica de genes de interés expresados diferencialmente demostrando que el fragmento de ADN amplificado tiene el tamaño predicho, exhibe el patrón de digestión de restricción predicado y/o se hibrida con la secuencia correcta de ADN clonado. Los expertos en la técnica conocen otros procedimientos para detectar la expresión génica. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional de PCI No. WO 97/10365, las patentes estadounidenses números 5,405,783, 5,412,087 y 5,445,934, 5,405,783; 5,412,087; 5,445,934; 5,578,832; 5,631,734; y LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
Procedimientos para detectar y cuantificar proteínas o polipéptidos
Hay una variedad de técnicas disponibles en la técnica para el análisis de proteínas e incluyen, pero no se limitan a, radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunorradiométricos ligados a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos in situ (utilizando, por ejemplo, oro coloidal, etiquetas de enzimas o radioisótopos), análisis de transferencia Western, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de inmunofluorescencia y PAGE-SDS.
Terapia ex vivo
Como se indicó anteriormente, esta invención también proporciona procedimientos terapéuticos ex vivo que utilizan células dendríticas o células T educadas producidas por los procedimientos de esta invención. Por ejemplo, las células dendríticas se transforman con un inmunógeno que puede usarse para activar células T citotóxicas y colaboradoras in vitro. Alternativamente, las células dendríticas transformadas se introducen en un mamífero para activar las células T in vivo. Además, las células T educadas in vitro pueden introducirse en un mamífero en el que son citotóxicas contra las células diana que portan péptidos antigénicos correspondientes a aquellos que las células T se activan para reconocer en las moléculas del MHC de clase I. Estas células diana son típicamente células cancerosas o células infectadas que expresan péptidos antigénicos únicos en sus superficies de MHC de clase I.
De manera similar, las células T colaboradoras, que reconocen péptidos antigénicos en el contexto del MHC de clase II, también pueden ser estimuladas por las CD de la invención, que comprenden péptidos antigénicos tanto en el contexto del MHC de clase I y de clase II. Las células T colaboradoras también estimulan una respuesta inmunitaria contra una célula diana. Al igual que con las células T citotóxicas, las células T colaboradoras se estimulan con las CD recombinantes in vitro o in vivo.
Las células dendríticas y las células T se pueden aislar del mamífero al que se van a administrar las CD y/o las células T activadas. Alternativamente, las células pueden proporcionarse alogénicas de un donante o almacenarse en un banco de células (por ejemplo, un banco de sangre).
Terapia in vivo
Las células T o células dendríticas producidas por los procedimientos de esta divulgación pueden administrarse directamente al sujeto para producir células T activas contra un inmunógeno seleccionado. La administración puede realizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica para poner en máximo contacto con éxito una célula con las células sanguíneas o tisulares de un sujeto.
Las células se administran de cualquier manera adecuada, a menudo con vehículos farmacéuticamente aceptables. Se encuentran disponibles procedimientos adecuados para administrar a un sujeto células en el contexto de la presente invención y, aunque se puede usar más de una ruta para administrar una composición celular particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Las vías de administración preferidas incluyen, pero no se limitan a, administración intradérmica e intravenosa.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el procedimiento particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención. del modo más típico, se realizan controles de calidad (microbiología, ensayos clonogénicos, pruebas de viabilidad) y las células se reinfunden al sujeto, precedido por la administración de difenhidramina e hidrocortisona. Véase, por ejemplo, Korbling et al. (1986) Blood 67:529-532 y Haas et al. (1990) Exp. Hematol. 18:94-98.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tales como, por ejemplo, por vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intranodal y subcutánea, y los vehículos, incluyen soluciones inyectables estériles isotónicas acuosas, que pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacteriostáticos. y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor destinado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. La administración intradérmica e intravenosa es el procedimiento de administración preferido para las CD o las células T de la invención.
La dosis de células (por ejemplo, células T activadas o células dendríticas) administrada a un sujeto está en una cantidad eficaz, eficaz para lograr la respuesta terapéutica beneficiosa deseada en el sujeto a lo largo del tiempo, o para inhibir el crecimiento de células cancerosas o para inhibir infección.
Sólo con fines ilustrativos, el procedimiento puede practicarse obteniendo y guardando muestras de sangre del sujeto antes de la infusión para análisis y comparación posteriores. Generalmente, se infunden por vía intravenosa o intraperitoneal al menos aproximadamente 104 a 106 y típicamente, entre 1 X 108 y 1 X 1010 células en un paciente de 70 kg durante aproximadamente 60-120 minutos. En un aspecto, la administración es por infusión intravenosa. Los signos vitales y la saturación de oxígeno mediante pulsioximetría se controlan de cerca. Las muestras de sangre se obtienen 5 minutos y 1 hora después de la infusión y se guardan para su análisis. Las reinfusiones de células se repiten aproximadamente cada mes durante un total de 10-12 tratamientos en un período de un año. Después del primer tratamiento, las infusiones se pueden realizar de forma ambulatoria a criterio del médico. Si la reinfusión se administra de forma ambulatoria, el participante es monitoreado durante al menos 4 horas después de la terapia.
Para la administración, las células de la presente invención se pueden administrar a una velocidad determinada por la dosis efectiva, la LD-50 (u otra medida de toxicidad) del tipo de célula y los efectos secundarios del tipo de célula a diversas concentraciones, según como se aplique a la masa y la salud general del sujeto. La administración se puede realizar mediante dosis únicas o divididas. Las células de esta invención pueden complementar otros tratamientos para una afección mediante una terapia convencional conocida, que incluye agentes citotóxicos, análogos de nucleótidos y modificadores de la respuesta biológica. De manera similar, opcionalmente se añaden modificadores de la respuesta biológica para el tratamiento por las CD o las células T activadas de la invención. Por ejemplo, las células se administran opcionalmente con un adyuvante o citocina como GMCSF, IL-12 o IL-2.
Ensayos y kits in vitro
La presente divulgación proporciona kits comercialmente valiosos para practicar los procedimientos de maduración de la invención. En un aspecto, el kit comprende polipéptido de IFNy, o un casete de expresión para expresar ARNm de IFNy in vivo o in vitro, y polipéptido CD40L, o un casete de expresión para expresar ARNm de CD40L in vivo o expresión in vitro de CD40L. En otro aspecto, el kit comprende polipéptido de TNFa, o un casete de expresión para expresar ARNm de TNFa in vivo o in vitro, y polipéptido CD40L, o un casete de expresión para expresar ARNm de CD40L in vivo o expresión in vitro de CD40L. Los kits pueden comprender además una polimerasa de ARN para la transcripción in vitro.
Procedimientos para evaluar la inmunogenicidad
La inmunogenicidad de las células presentadoras de antígeno o las células T educadas producidas por los procedimientos de la invención pueden determinarse mediante metodologías bien conocidas que incluyen, pero no se limitan a las siguientes:
Ensayo de lisis de liberación de 51Cr. Se puede comparar la lisis de dianas etiquetadas con 51Cr pulsadas con péptidos por células T específicas de antígeno. Las composiciones "más activas" mostrarán una mayor lisis de las dianas en función del tiempo. La cinética de la lisis, así como la lisis global de la diana en un punto de tiempo fijo (por ejemplo, 4 horas) pueden usarse para evaluar el rendimiento. Ware et al. (1983) 3. Immunol. 131:1312.
Ensayo de liberación de citocinas. El análisis de los tipos y cantidades de citocinas secretadas por las células T al ponerse en contacto con las APC modificadas puede ser una medida de la actividad funcional. Las citocinas se pueden medir mediante ensayos ELISA o ELISPOT para determinar la tasa y la cantidad total de producción de citocinas. Fujihashi et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanquay y Killion (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259.
Educación de células T in vitro. Las composiciones de la invención se pueden ensayar para determinar la capacidad de provocar poblaciones de células T reactivas de un donante normal o PBMC derivadas del paciente. En este sistema, las células T provocadas se pueden ensayar para determinar la actividad lítica, liberación de citocinas, policlonalidad y reactividad cruzada al epítopo antigénico. Parkhurst et al. (1996) Immunol. 157:2539.
Modelos animales transgénicos. La inmunogenicidad se puede evaluar in vivo vacunando ratones transgénicos HLA con las composiciones de la invención y determinando la naturaleza y magnitud de la respuesta inmune inducida. Alternativamente, el modelo de ratón hu-PBL-SCID permite la reconstitución de un sistema inmunológico humano en un ratón mediante transferencia adoptiva de PBL humano. Estos animales pueden vacunarse con las composiciones y analizarse para determinar la respuesta inmune como se mencionó anteriormente en Shirai et al. (1995) J. Immunol.
154:2733; Mosier et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2443.
Ensayos de proliferación. Las células T proliferarán en respuesta a las composiciones reactivas. La proliferación se puede controlar cuantitativamente midiendo, por ejemplo, la captación de 3H-timidina. Caruso et al. (1997) Cytometry 27:71.
Modelos de primates. Se puede utilizar un sistema modelo de primates no humanos (chimpancés) para monitorizar las inmunogenicidades in vivo de ligandos restringidos por HLA. Se ha demostrado que los chimpancés comparten especificidades de ligando de MHC superpuestas con moléculas de MHC humanas, lo que permite ensayar ligandos restringidos por HLA para determinar la inmunogenicidad relativa in vivo. Bertoni et al. (1998) Immunol. 161:4447.
Monitoreo de eventos de transducción de señales TCR. Diversos eventos de transducción de señales intracelulares (por ejemplo, fosforilación) están asociados con la participación exitosa de TCR mediante complejos MHC-ligando. El análisis cualitativo y cuantitativo de estos eventos se ha correlacionado con las capacidades relativas de las composiciones para activar las células efectoras a través de la participación de TCR. Salazar et al. (2000) Tnt. J. Cancer 85:829; Isakov et al. (1995) J. Exp. Med. 181:375).
De acuerdo con la descripción anterior, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, los diversos aspectos de esta invención.
Ejemplos experimentales
Reactivos
Histopaque 1077 y Tween 20 se adquirieron en Sigma (St Louis, MO). PBS y X-VIVO 15 se adquirieron en Cambrex (East Rutherford, Ni). El medio AIM-V, el medio de Dulbecco modificado de Iscove y el medio RPMI 1640 junto con azul tripán y suero bovino fetal (FBS) se adquirieron en Invitrogen (Carlsbad, CA). Viaspan se adquirió en Dupont Pharma Labs (Wilmington, DE). g M-CSF, IL-4, TNF-a, IL-1p, IL-6 e IFN-y se adquirieron todos en R&D Sytems (Minneapolis, MN). PGE2 se adquirió en Cayman Chemicals (Ann Arbor, CA). Se adquirió CD40L soluble en Alexis Biochemicals (San Diego CA). El suero AB humano se adquirió en Valley Biochemical (Winchester, VA).
Las quimiocinas CCL19 y CCL21 se adquirieron en Peprotech (Rocky Hill, NJ). Anticuerpos de fenotipado (HLA-ABC, HLA-DR, CD80, CD86, Cd 83, CD14 y controles de isotipo negativos), pares de anticuerpos ELISpot (If N-y e IL-2) conjuntos de ELISA (IL-12 e IL-10) y la estreptavidina-HRP se adquirieron todos en BD Pharmingen (San Diego, CA) junto con el conjunto de reactivos BD Opt EIA B, pH9.5. El sustrato de peroxidasa AEC se adquirió en Vector labs. (Vector Labs, Burlingame, CA). El anticuerpo anti-CD40L bloqueante se adquirió en eBioscience. El tetrámero CD1d/agalactosilceramida (KRN7000) y el KRN7000 nativo fueron amables obsequios de Kirin Brewery, Pharamaceuticals Division, Tokio, Japón. Los tetrámeros MART-1/HLA-A201 se adquirieron en Beckman-Coulter (Miami, FL).
Generación de CD
Se aislaron PBMC humanos de las colecciones de leucaféresis de voluntarios sanos proporcionados por Life Blood (Memphis, Tennessee). Las PBMC se prepararon mediante centrifugación de densidad Ficoll-Histopaque y se lavaron cuatro veces en PBS a temperatura ambiente. Se resuspendieron 2 x 108 PBMC en 30 ml de medio AIM-V y se dejaron adherir a matraces de plástico de 150 cm3 durante 2 horas a 37°C. Las células no adherentes se eliminaron y las células restantes se cultivaron en medio X-VIVO 15, suplementado con GM-CSF (1000 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml), durante 5-6 días a 37°C, CO2 al 5 %.
Clonación de CD40L
Las células T se estimularon con PMA en RPMI durante 1 hora. Las células se recolectaron y lavaron con PBS una vez. El ARN total se extrajo mediante el procedimiento QIAGEN RNeasy. Se tomó un microgramo de ARN total de células T activadas en un tubo de reacción de RT-PCR usando el kit Gene Amp Gold (Applied Bioscience) usando una polimerasa Advantage de alta fidelidad (Clontech). Los cebadores específicos de genes para la secuencia CD40L corresponden a las bases 47 y 859 de la secuencia de CD40L cebador 5' de CD40L: 5'-GCATCATCGAAACATACAACC-3' (SEQ ID NO. 11) y 3' cebador de CD40: 5'-GTATTATGAAGACTCCCAGCG-3' (SEQ ID NO. 12). El fragmento de PCR se purificó y subclonó en el vector pCR2.1 usando ligasa de ADN de T4 (Invitrogen). El análisis de secuencia del marco de lectura abierto de CD40L y la alineación con una secuencia de consenso de GenBank revelaron la presencia de dos mutaciones. Una mutación fue conservadora y no dio lugar a cambios de aminoácidos. Otra sustitución dio como resultado un cambio funcional de aminoácido Asn-Ser. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio para corregir el cambio de aminoácido no conservador de vuelta a asparagina. En resumen, se usaron 10-40 ng de ADN plasmídico de CD40L PCR2.1 en mutagénesis dirigida al sitio usando cebadores personalizados 5' fosforilados y purificados por HPLC (QIAGEN), enzima PFU Ultra con regulador de pH de PCR 10X (Stratagene) y dNTPS (Clontech) siguiente a la reacción de PCR, se añadió enzima de restricción Dpn I (Promega) y se incubó durante 1 hora a 37°C para digerir la plantilla parental. A continuación, se transformaron cinco microlitros de esta reacción en células competentes Oneshot MACH T1R (Invitrogen) y se colocaron en placas LB que contenían ampicilina recién preparada. Se seleccionaron seis colonias y se cultivaron como cultivos de 3 ml durante la noche en LB que contenía ampicilina. El ADN se aisló usando plásmido miniprep (QIAGEN). Se entregó una alícuota de ADN purificado para cada clon a la instalación de secuenciación de la Universidad de Carolina del Norte (UNC) para el análisis de secuencia del marco de lectura abierto de CD40L utilizando cebadores M13F y M13R (Invitrogen). A continuación, todos los clones se alinearon con una secuencia GenBank de consenso para CD40L usando el software de análisis DNASTAR Seqman. Se seleccionó el clon #2 (renombrado CD40L WT PCR 2.1) por contener las bases mutagenizadas correctas.
Generación de ARNm para la transfección de CD
El plásmido CD40L WT PCR 2.1 se linealizó usando enzima de restricción Spel y se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo seguido de precipitación con etanol. La plantilla lineal se reconstituyó en agua y se transcribió in vitro usando kits mMessage mMachine T7 Ultra (Ambion) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se guardó una alícuota de ARN para el análisis final antes de proceder a la reacción de poliadenilación. El ARN poliadenilado se purificó usando una columna RNeasy (QIAGEN) siguiendo el protocolo para la limpieza del ARN. El ARN se eluyó en agua y se almacenó en alícuotas de tamaño individual por debajo de -150°C. La longitud de la cola de PolyA se determinó mediante el análisis comparativo del ARN no poliadenilado y el producto final usando ARN Bioanalyzer 2100.
Electroporación de las CD
Antes de la electroporación, las CD se recolectaron y lavaron en PBS y luego se resuspendieron en Viaspan enfriado (Barr Laboratories) a 4x107/ml en 0.5 ml o 2.5x107/ml en 0.2 ml y se colocaron en hielo. Las CD se mezclaron con ARNm (1 o 2 |jg/106 para el antígeno que codifica el ARNm y 4 jg/106 para el ARNm de CD40L) y se colocaron en una cubeta de electroporación con un espacio de 4 mm y se electroporaron usando un aparato Biorad. Inmediatamente después de la electroporación, las CD se lavaron en medio X-VIVO 15 y finalmente se resuspendieron en X-VIVO 15 suplementado con GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml) a 1x106/ml y se cultivaron durante 4 o 24 horas a 37°C en placas de seis pocillos de baja adherencia (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). En este punto también se agregaron estímulos de maduración adicionales, que se describen más adelante.
Maduración de CD - Procedimiento base de CD40L.
Después de la electroporación, las CD transfectadas con ARNm de CD40L se trataron con IFN-y (1000 U/ml) o TNF-a (10 ng/ml) o una combinación de IFN-y y PGE2 (1 jg/ml). En comparación, las CD inmaduras se transfectaron con diversos ARNm que codifican antígenos y luego se trataron con un "cóctel de citocinas" que comprende TNF-a (10 ng/ml), IL-1p (10 ng/ml), IL-6 (100 ng/ml) y PGE2 (1 jg/m l) o CD40L soluble (200 ng/ml) más potenciador (1 jg/m l) con adición simultánea o secuencial de 1000 U/ml de IFN-y.
Maduración de CD - Procedimiento PME-CD40L.
Las CD inmaduras maduraron fenotípicamente el día 5 de cultivo con TNF-a (10 ng/ml), IFN-y (1000 U/ml) y PGE2 (1 jg/ml). El día 6, las CD se recolectaron y electroporaron con antígeno y ARNm de CD40L como se describió anteriormente, y se cultivaron en medio X-VIVO 15 que contenía 800 U/ml de GM-CSF y 500 U/ml de IL-4 durante 4 horas antes de la recolección, o formulación para la producción de vacunas.
Maduración de CD con el procedimiento base CD40L, en combinación con a-galactosilceramida (KRN7000)
Se pulsaron 100 ng/ml de KRN7000 en las CD del procedimiento base de CD40L inmediatamente después de la electroporación en combinación con 500 U/ml de IFN-y y 1 jg/m l de PGE2, por 24 hrs de cultivo.
Análisis de citometría de flujo de CD
Se recolectaron 106 CD y se resuspendieron en PBS enfriado/FCS al 1%. Se mezclaron anticuerpos conjugados de ficoeritrina (PE) o FITC específicos para moléculas de MHC (HLA-ABC, HLA-DR), moléculas coestimuladoras (CD80, CD86), marcadores de maduración (CD83) y marcadores de monocitos (CD 14) con 1x105 CD por pocilio en placas de 96 pocilios (BD Biosciences) y se incuban a 4°C durante un mínimo de 15 minutos. Se utilizaron como controles anticuerpos emparejados en isotipo. Después de un lavado a fondo, se realizó un análisis de fluorescencia con un citómetro de flujo FACScalibur (BD Biosciences) utilizando el software CellQuest (BD Biosciences).
La expresión intracelular de CD40L se determinó de la siguiente manera: 2 x 105 CD o células HeLa se recolectaron en diversos puntos de tiempo después de la transfección con ARNm de CD40L y se resuspendieron en 250 pl de solución de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) durante un mínimo de 10 minutos hasta 2 horas a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 2 ml de regulador de pH de tinción (PBS, BSA, NaN3 y EDTA), se resuspendieron en 0.5 ml de regulador de pH de tinción y se almacenaron durante la noche a 4°C. Las células se resuspendieron en 2.0 ml de solución de Perm/Wash (BD Biosciences) durante 15 minutos, se centrifugaron y resuspendieron en 100 pl de solución de Perm/Wash. Se añadieron 20 pl de CD40L PE antihumano de ratón y CD40 A p C antihumano (BD Biosciences) o IgG1 PE e IgGl APC de ratón (BD Biosciences) a cada preparación de CD recolectada y permeabilizada en cada punto de tiempo, y se incubó a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con 1 ml de solución de Perm/Wash y se resuspendieron en regulador de pH de tinción antes del análisis citométrico de flujo.
La tinción de citocinas intracelulares (ICS) se realizó de la siguiente manera: 1x106/ml de células T CD8+ cebadas, retiradas del cocultivo el día 19 y reestimuladas en 200 pl de medio R10 con dianas de PME CD (RCC, survivina, G250, hTERT o eGFP) a 37°C; 5% de CO2 durante 1 hora antes de la adición de brefeldina A (BD GolgiPlug, Cat No. 555029) a 1 pl/ml. Las células se incubaron a 37°C durante 16 horas más. Las células se lavaron y resuspendieron en 150 pl de regulador de pH FACS con 5 pl de CD8 por CP-cy5.5 (BD 341051) y se incubaron a 4°C. Después de 30 minutos, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en paraformaldehído (PFA) al 2%. Posteriormente, las células se lavaron después de 10 minutos y luego se permeabilizaron en saponina al 0.1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA), antes de la incubación con 2 pl de anticuerpo bloqueante, IgGI de ratón puro (BD 349040). Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 0.5 pl de IFN-y - APC (BD 554681), 10 pl de IL-2 - FITC (BD 554702) y 10 pl de anticuerpos CD69-PE (BD 555531) a cada tubo de muestra. Las muestras se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad a TA. Las células se resuspendieron en PFA al 2% después de un lavado final en saponina al 0.1%. Análisis realizado por citometría FACS, recogiendo 100000 eventos.
Análisis funcional de CD40L cuando se expresa a partir de ARNm en células HeLa
Se cultivaron células HeLa en FBS/DMEM al 10% y luego se recogieron y electroporaron en cubetas de 4 mm con GFP y ARN de CD40L (20 pg cada una/5x106 células). La recuperación posterior a la transfección fue de ~70% y las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer durante la noche. Después de la incubación durante la noche, las células HELA transfectadas se recolectaron raspando y se tiñeron con IgG1-PE de ratón o CD40L-PE anti-humano (ambos de BD Biosciences, San Diego, CA) para buscar la expresión de CD40L en la superficie celular. Se tiñeron 2 x 105 células/tubo con 10 pg/ml de anticuerpo en FBS/PBS al 1% durante 30 minutos a 4°C. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo FACScaliber y el software Cellquest (BD Biosciences). Para analizar la función del CD40L expresado en HeLa, se cocultivaron 1 x 106 células dendríticas inmaduras con 1 x 106 células HeLa en suero huAB al 5%/RPMI suplementado con 1000 U/ml de IFN-y (R&D Systems, Minneapolis, MN) en placas de 6 pocillos (2 ml de volumen total) durante la noche. Se incluyó un anticuerpo monoclonal de bloqueo CD40L (24-31 de eBioscience) a 10 pg/ml en pocillos emparejados para confirmar que se requería la expresión de la proteína en la superficie celular para estimular las células dendríticas. El sobrenadante del cultivo se recogió después de 18-24 horas y se analizó la expresión de las citocinas IL-10 e IL-12 mediante ELISA (BD Biosciences).
Ensayo de migración
La quimiotaxis de las CD se midió mediante la migración a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 8 pm en cámaras de transpozos de 24 pocillos (Corning Costar, Acton, MA). Se añadió suero AB humano al 5% en medio de Dulbecco modificado con Iscoves o medio AIM-V que contenía CCL19 de 3 a 300 ng/ml, CCL21 de 5 a 250 ng/ml, una combinación de ambos o medio solo a la cámara inferior. Se añadieron 1-5 x 105 CD en 0.1 ml a la cámara superior y se incubaron durante 2-3 horas a 37°C. La cámara inferior se recogió en tubos de 5 ml (BD Biosciences) y se resuspendió en 0.1 ml de PBS y se realizaron recuentos de células viables utilizando azul tripán.
ELISpot
Las placas ELISpot de membrana de PVDF (Millipore, Ballerica, MA) se recubrieron con 5 pg/ml de anticuerpo de captura anti-IFN-Y monoclonal o anti-IL-2 (BD Pharmingen, San Diego, CA) y se incubaron a 4°C durante 24 horas. Después de la incubación, las placas se lavaron con PBS/0.05% de Tween 20 y se bloquearon con suero AB humano al 5%/medio RPMI 1640 durante 1 hora. Se colocaron en placa PBMC, células T o células T enriquecidas en CD8 a 1x105 células/pocillo y se transfectaron con ARNm, dianas de CD cargadas con antígeno a 1x104 células/pocillo para una relación efector:diana de 10:1, y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 por un mínimo de 16 horas.
Después de la incubación, las placas se lavaron 6 veces y se añadió anticuerpo de detección anti-IFN-Y (BD Pharmingen) o anticuerpo de detección anti-IL-2 (BD Pharmingen) a las placas apropiadas a 1 pg/ml durante 2 horas. Después de seis lavados más, se añadió estreptavidina-HRP (BD Pharmingen) a cada pocillo durante 1 hora. Finalmente, después de otro ciclo de lavado, se llevó a cabo el desarrollo del color con el sustrato de peroxidasa AEC durante 5-15 minutos y se detuvo con agua. Las placas se dejaron secar al aire antes del análisis en CTL Immunospot Plate Reader (CTL, Cleveland, OH).
ELISA
El procedimiento es como se estableció por BD Pharmingen para conjuntos de ELISA de IL-12 e IL-10 (BD Pharmingen) utilizando el conjunto de reactivos BD Opt EIA B pH 9.5. Brevemente, las placas de ELISA (BD Biosciences) se recubrieron con anticuerpo de captura anti-IL-12p70 o anti-IL-10 ELISA en regulador de pH de recubrimiento durante 24 horas a 4°C. Las placas se bloquearon con 200 pl por pocillo de FCS al 10%/PBS durante una hora antes de la adición de estándares (BD Pharmingen) y muestras de sobrenadante, por duplicado, a 100 pl por pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron y se añadió el anticuerpo de detección anti-citocina, se incubaron durante una hora, las placas se lavaron y las soluciones se reemplazaron con 100 pl de estreptavidina-HRP y se incubaron adicionalmente durante una hora a temperatura ambiente. De nuevo se lavaron las placas y se aplicaron sustratos de desarrollo de color durante 10-20 minutos, seguido del cese del desarrollo de color con la solución de parada. Análisis de placas realizado con el lector de placas ELx800 de Bio-Tek instruments con software KC junior (Winooski, VT). Los resultados muestran el número de picogramos/ml/106 DC. Debido a que los ensayos se establecieron de modo que 1 ml corresponde a 106 DC, los resultados también se pueden expresar como número de picogramos/106 DC. Por ejemplo, 3000 pg/ml/106 CD es equivalente a 3000 pg/106 CD.
Inducción de CTL
Se cocultivaron células dendríticas maduras transfectadas con ARNm con células T purificadas con CD8. Todos los cocultivos se realizaron en medio R-10 (FBS al 10%, RPMI-1640 suplementado con He PES de 10 mM pH 7.4, piruvato sódico de 1 mM, aminoácidos no esenciales de 0.1 mM, glutamato sódico de 2 mM, p-mercaptoetanol de 55 pM). Todos los reactivos de cultivo celular eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las células CD8 + se purificaron usando el kit II de aislamiento de células T CD8 + (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) a partir de células no adherentes recogidas de la etapa de adherencia de monocitos. Las células CD8 + se mezclan con células dendríticas preparadas como se describe anteriormente en CD8 +: CD de 10:1. Durante los primeros siete días, las células se cultivaron en medios suplementados con 0.2 U/ml de IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) y luego se dividieron en alícuotas en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a 1 ml (células 1x106 CD8 +)/pocillo. Después de esta incubación inicial de siete días, se recolectaron las células CD8 +, se contaron y se volvieron a cultivar con estimuladores de CD frescos a 10:1 en medio suplementado con 5 U/ml de IL-2. De nuevo, las células se cultivaron durante una semana y luego se reestimularon con Cd frescas y 20 U/ml de IL-2. Los ensayos de CTL se realizaron 3 o 7 días después de la tercera estimulación.
Ensayo de CTL
Las células T2 se pulsaron previamente con 10 pg/ml del péptido MART-APL restringido a HLA-A201 (LAGIGILTV; SEQ ID NO:24) o péptido nativo (AAGIGILTV; SEQ ID NO:25) o péptido PSA-1 (FLTPKKLQCV; SEQ ID NO:26) mediante incubación durante la noche en medio FBS/RPMI, y se lavó antes de su uso como dianas CTL. Se transfectaron dianas de células dendríticas con ARNm de GFP, ARNm de APL MART-1, ARNm de Flu-M1, como se describió anteriormente y se incubaron durante la noche sin maduración. Las células T2 pulsadas se incubaron con 100 pCi de Na51Cr (Perkin-Elmer Life y Analytical Sciences, Inc., Boston, MA) durante 90 minutos a 37°C. El exceso de 51Cr se eliminó por lavado y las dianas etiquetadas con 5000 se incubaron con diversas relaciones E:T de CD8 + células durante 4 horas. La lisis inespecífica se redujo mediante la adición de células T2 no pulsadas a 25,000 células por pocillo. El 51Cr liberado se midió en el sobrenadante mediante recuento de centelleo. La liberación total se calculó mediante la adición de Triton X-100 al 1% a las dianas, mientras que la liberación espontánea se calculó mediante la adición de medio solo. El porcentaje de lisis se calculó mediante la fórmula (cpm de muestra liberadas-cpm espontáneas) / (cpm totales liberadas-cpm liberadas espontáneamente).
Inducción de CTL específicos de MART-1 empleando CD madurada de procedimiento base de CD40L, pulsado con KRN7000
Se generaron CD maduras como se describió anteriormente, empleando el 'procedimiento base de CD40L', y se cargaron con ARNm que codifica MART-1. Después de la electroporación, las CD se incubaron con KRN7000, IFN-y y PGE2. Las CD y las PBMC se cultivaron conjuntamente en una proporción de 1:10 en presencia de 20 U/ml de IL-2. Las PBMC se reestimularon tres veces en las mismas condiciones, y la frecuencia de inducción de CTL se determinó mediante tinción con tetrámeros MART-1/A2, y la expansión de células NKT se enumeró usando tetrámeros KRN7000/CD1d mediante FACS.
Resultados de ejemplos experimentales
Maduración secuencial con interferón-Y, y CD40L optimiza la secreción de IL-12p70
Se prepararon CD inmaduras mediante cultivo de 6 días de células adherentes PBMC en medios X-VIVO 15, incluidos GM-CSF e IL-4. Las CD se recuperaron el día 6 y se electroporaron con 2 pg de ARNm que codifica eGFP por millón de CD y se maduraron durante 36 horas con un "cóctel de citocinas". Alternativamente, la maduración se logró cultivando las CD en presencia de IFN-y y CD40L soluble, se aplicaron de forma simultánea o secuencial. Las CD se controlaron para determinar el aumento de la expresión de moléculas coestimuladoras, pero del modo más importante, para la secreción de IL-12p70 frente a IL-10. La Figura 1 muestra que las CD maduradas con el cóctel de citocinas secretan un exceso de IL-10 en comparación con IL-12p70 en el sobrenadante del cultivo durante el período de cultivo de 36 horas. Por el contrario, las CD que maduraron simultáneamente con CD40L soluble más IFN-y secretan un exceso de IL-12p70. Sin embargo, la aplicación secuencial de IFN-y durante 18 horas, seguida de la adición de CD40L soluble directamente al cultivo, y un período de cultivo adicional de 18 horas dio como resultado niveles significativamente mejorados de secreción de IL-12p70. Inesperadamente, la aplicación de CD40L soluble, seguida de IFN-y, evitó la secreción significativa de IL-12p70. En conclusión, la administración secuencial de un estímulo innato para "cebar" la maduración de CD (IFN-y), seguida de una señal sustituta de células T colaboradoras, administradas por CD40L soluble, optimiza la maduración de CD para la secreción de IL-12p70.
El cocultivo de células HeLa, transfectadas con ARNm que codifica CD40L, con DCS inmaduras da como resultado la inducción de IL-12p70 derivada de CD.
La Figura 2 muestra que las células HeLa transfectadas con ARNm que codifica CD40L dan como resultado una expresión significativa en la superficie celular de la proteína CD40L después de 24 horas de cultivo, como se define mediante un anticuerpo anti-CD40L y citometría de flujo. Se cultivaron conjuntamente células HeLa transfectadas con ARNm de CD40L con CD inmaduras, en presencia de 1000 U/ml de IFN-y. La Tabla II muestra que las células HeLa transfectadas con una cola extendida de poli-A (>400 'A') son capaces de inducir una secreción significativa de IL-12p70 cuando se cultivan con CD inmaduras durante el período de cultivo de 18 horas. Es importante destacar que la inclusión de un anticuerpo anti-CD40L de bloqueo evita la secreción de IL-12p70 y confirma la identidad y la importancia funcional de la proteína codificada por la secuencia de ARNm transfectada.
TABLA II
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Células dendríticas transfectadas con ARNm de CD40L y cultivadas en presencia de IFN-y secretan IL-12p70.
Las CD inmaduras se recolectaron después de 6 días en cultivo con GM-CSF e IL-4, y se transfectaron con una titulación de ARNm de CD40L (400-poliA), y se cultivaron de forma inmediata en presencia de 1000 U/ml de IFN-y. La Figura 3 muestra que los sobrenadantes recolectados después de 18 horas de cultivo contienen un exceso de IL-12p70 sobre IL-10, y que se requieren al menos 4 pg de ARNm de CD40L por millón de CD para la secreción óptima de citocinas. El aumento de la carga útil de ARNm de CD40L por encima de 4 pg por millón de CD da como resultado una reducción significativa en el rendimiento de CD después de la maduración (datos no mostrados). En un experimento paralelo, se transfectaron CD inmaduras con 4 pg de ARNm de CD40L por millón de células y se aplicó inmediatamente una titulación de IFN-y a los cultivos. La Figura 4 muestra que se requieren al menos 100 U/ml de IFN-y para apoyar la inducción óptima de IL-12p70. La Figura 5a muestra que IL-12p70 aparece a niveles detectables 6 a 8 horas después de la transfección y cocultivo con IFN-y, registrándose la acumulación óptima en el sobrenadante del cultivo entre 20 y 24 horas. Por el contrario, la sustitución de 10 ng/ml de TNF-a por IFN-y también apoya la producción de IL-12, pero a niveles reducidos (Figura 5b). Además, el IFN-y da como resultado niveles concomitantemente más bajos de producción de IL-10 que el TNF-a. (Figura 5c)
La inducción de IL-12p70 por CD transfectadas con ARNm de CD40L depende de la "señalización intracelular" en oposición a las interacciones célula-célula.
La Figura 2 demuestra que la proteína CD40L traducida a partir del ARNm se puede expresar en la superficie celular de las células transfectadas, y que la proteína retiene la capacidad de señalizar adecuadamente las CD para la secreción de IL-12p70 como consecuencia de su interacción con su contraparte en las DC, a saber, CD40. Para determinar la distribución celular de CD40L en las CD transfectadas y para confirmar su identidad funcional, se recolectaron las CD en diversos puntos de tiempo después de la transfección, se determinó la presencia de CD40L en la superficie celular o los compartimentos intracelulares. Las Figuras 6 a y 6 b muestran que la mayoría de CD40L se localiza dentro de un compartimento intracelular, y que la expresión de proteína significativa (27% de CD positivas de CD40L) no fue evidente hasta 60 minutos después de la transfección. Por tanto, aunque el IFN-y se aplica inmediatamente después de la transfección, la administración de los eventos de maduración es secuencial, con la señal de IFN-y que precede a la de CD40L. Como se muestra en la Figura 1, la maduración secuencial de las CD con IFN-y y CD40L optimiza la secreción de IL-12p70. Además, la Figura 7 muestra que las CD transfectadas con CD40L y tratadas con IFN-y, cuando se cultivan en presencia de un exceso de anticuerpo anti-CD40L bloqueante durante 18 horas después de la transfección, siguen secretando niveles significativos de IL-12p70. Estos datos muestran que las interacciones CD40L/CD40, que son necesarias para la producción de IL-12p70 en este sistema, pueden tener lugar dentro del compartimento intracelular.
Frecuencia de células CD40L positivas a lo largo del tiempo
Se transfectaron CD inmaduras con 4 pg de ARNm de CD40L por 106 CD y se co-maduraron con 1000 U/ml de IFN-y. Alternativamente, y a modo de control negativo para la tinción de CD40L, las CD inmaduras se maduraron con un "cóctel de citocinas". La frecuencia máxima de expresión se logra alrededor de 3 a 4 horas después de la transfección con ARN CD40L (véase Figura 6 b), aunque el 80% de las CD expresan CD40L cuando las células están fijadas y permeabilizadas, la tinción de la superficie celular solo detecta aproximadamente el 15% de las CD (Figura 6 c). Estos datos muestran que la mayor parte de la proteína CD40L se retiene dentro de las CD y no se expresa en la superficie celular. La proteína CD40L se expresa transitoriamente, y la mayoría de las CD se vuelven negativas para CD40L 26 horas después de la transfección. La expresión de CD40, la molécula receptora análoga de CD40L, no se ve modificada por la transfección de las CD con ARNm que codifica CD40L, en comparación con las CD que solo reciben un "cóctel de citocinas".
Se requiere PGE2 para inducir la migración de CD en la maduración con CD40L e IFN-y
Además de la capacidad de secretar IL-12p70 y exhibir un fenotipo maduro, típicamente definido como células que expresan niveles elevados de moléculas coestimuladoras como c D80, CD83 y CD86 (véase Tabla III), las CD deben mostrar la capacidad de migrar, si van a ser capaces de dirigirse a un ganglio linfático in vivo. Diversos estudios han demostrado que PGE2 prepara a las CD maduras para la migración (Luft et al. (2002) Blood 100: 1362, Scandella et al. (2002) Blood 100: 1354). La Figura 8 muestra que la inclusión de 1pg/ml de PGE2, además de IFN-y, permite que las CD en maduración migren, y que la adquisición de este potencial migratorio es proporcional a la carga útil de ARNm de CD40L. Por tanto, CD40L contribuye no solo al fenotipo de CD en maduración y al perfil dominante de IL-12p70 (véase Tabla II), sino también a la preparación para la migración. Por el contrario, las CD maduraron por transfección con ARNm de CD40L y se cultivaron en presencia de IFN-y, pero en ausencia de PGE2, no migraron (datos no mostrados), a pesar de mostrar una expresión significativa en la superficie celular del receptor de quimiocinas, CCR7.
TABLA III
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Se prepararon CD a partir de monocitos adherentes y se cultivaron durante 6 días en GM-CSF/IL-4. Tras la recolección, las CD se transfectaron con diversas cargas útiles de ARNm y se sometieron a maduración durante 24 horas más. Se recogieron nuevamente las CD y las células se tiñeron para diversos marcadores de la superficie celular, particularmente aquellos asociados con una función aumentada, a saber, coestimulación y migración. Los sobrenadantes de los cultivos de maduración se recogieron y se sometieron a análisis de citocinas IL-12p70 e IL-10.
(a) Las CD se transfectaron con 2 pg por millón de células con ARNm de la gripe como carga útil que codifica el antígeno, además de 4 pg por millón de células de ARNm de eGFP. El ARNm de eGFP permite la confirmación de transfección por FACS, y para actuar como control sustituto para la carga útil de maduración de ARNm de CD40L de 4 pg por millón de células, en el procedimiento alternativo. Estas CD transfectadas con gripe / eGFP se maduraron en presencia del "cóctel de citocinas".
(b) Las CD se transfectaron con 2 pg por millón de células con ARNm de MART-APL como carga útil que codifica el antígeno y se sometieron a maduración con el "cóctel de citocinas".
(c) Las CD se transfectaron con 2 pg por millón de células con ARNm de la gripe como carga útil que codifica el antígeno, concomitante con 4 pg por millón de células ARNm de CD40L como carga útil de maduración. Estas células se colocaron inmediatamente en cultivo con IFN-y y PGE2 como se describe en materiales y procedimientos.
(d) Las CD se transfectaron con 2 pg por millón de células con MARTAPL como carga útil que codifica el antígeno, concomitante con 4 pg por millón de células de ARNm de CD40L como carga útil de maduración. Estas células se colocaron inmediatamente en cultivo con IFN-y y PGE2 como se describe en materiales y procedimientos.
(e) Secreción de IL-12p70 de CD que experimentan maduración.
(f) Secreción de IL-10 de las CD en proceso de maduración.
Las CD maduradas secuencialmente mediante transfección con ARNm de CD40L e IFN-Y/PGE2 invocan potentes respuestas de recuperación de células T.
Para determinar la "inmunopotencia" de las CD maduradas mediante transfección de ARNm de CD40L e IFN-Y/PGE2, las CD se cotransfectaron con 2 pg de ARNm que codifica la proteína de la matriz de la gripe por millón de CD, además del entorno de cultivo de ARNm de CD40L e IFN-Y/PGE2.18 horas después de la transfección, se recolectaron las CD, se lavaron y se cultivaron conjuntamente con células T autólogas en ensayos ELISpot de IFN-y. La Figura 9 muestra que las CD maduradas a través de CD40L/IFN-Y/PGE2 despliegan una inmunopotencia aumentada, en comparación con las CD transfectadas con ARNm de la gripe y maduradas con 'cóctel de citocinas', según se define por la frecuencia de manchas de IFN-y específicas de la gripe en el ensayo.
CD maduradas secuencialmente mediante transfección con ARNm de CD40L e IFN-Y/PGE2 invocan respuestas primarias.
Las respuestas de recuperación, como la descrita en la Figura 9, dependen menos de la presencia de CD que expresan moléculas coestimuladoras optimizadas y entornos de citocinas de apoyo. Por lo tanto, se evaluó la capacidad de las CD para invocar respuestas inmunitarias primarias al antígeno asociado al melanoma, MART-1, en el que muchos donantes sanos mantienen una alta frecuencia de precursores de células T naive. Como se utilizaron preferentemente donantes de HLA-A201, las CD se transfectaron con un ARNm que codifica MART-1 en el que el determinante restringido A2 se optimizó mediante la mutación de la secuencia de ARNm por mutagénesis dirigida al sitio, de modo que la alanina en la posición 27 fue sustituida por leucina, y aquí se denomina MART-APL (Valmori, D et al (1998) J. Immunol. 160:1750). Las CD cotransfectadas con 2 pg de ARNm de MART-APL con 4 pg de ARNm de CD40L e inmediatamente pulsadas con IFN-Y/PGE2 durante 18 horas se compararon con las CD cargadas únicamente con MART-APL y maduradas durante la noche con el "cóctel de citocinas". CD maduradas y cargadas con antígeno se añadieron a células T CD8+ autólogas purificadas y se cultivaron durante 7 días en presencia de 0,2 U/ml de IL-2 humana. Después de este período, las células T se recuperaron y se cultivaron conjuntamente con una segunda ronda de estimuladores de CD cargados con antígeno, según fuera apropiado, en un ensayo ELISpot de IL-2. La Figura 10 muestra que las células T CD8+ cultivadas en presencia de CD maduradas a través de CD40L e IFN-Y/PGE2 dan como resultado un aumento muy significativo de las células T capaces de secretar IL-2 en una respuesta específica al epítopo MART-APL optimizado originalmente codificado dentro de la secuencia de ARNm de MART-APL. En conclusión, las CD expuestas a la maduración secuencial a través de IFN-Y/PGE2 y CD40L son significativamente más potentes para generar las respuestas inmunitarias primarias que las CD maduradas con el "cóctel de citocinas" estándar actualmente aceptadas. Además, la Figura 11 muestra que los CTL generados con CD cargados con MART-APL, maduradas con el 'cóctel de citocinas' no logran mediar la citotoxicidad mediada por CD8 independiente de CD4 contra las células T2 pulsadas con el péptido MART-APL restringido a HLA-A2 apropiado (Figura 11b). Por el contrario, los CTL generados en CD maduradas con CD40L/IFN-Y/PGE2 son completamente activos y matan las dianas T2 pulsadas con péptido MART-APL (Figura 11 a).
Análisis fenotípico de CD inmaduras que maduran según el procedimiento PME-CD40L
Las CD maduraron el día 5 con el procedimiento PME-CD40L descrito en este documento. Específicamente, los monocitos se cultivaron en medio GM-CSF e IL-4 durante 5 días para producir CD inmaduras de CD83'. El día 5, las CD inmaduras se alimentaron con medio que contenía TNFa, IFNy y PGE2 (TIP). El día 6 , se determinó el fenotipo post TIP (véase Tabla IV). Como se muestra en la Tabla IV, la mayoría de las células fueron positivas para CD80, CD83, CD86 y CD209. Estas CD también fueron CCR7 negativas (datos no mostrados). El bajo porcentaje de células CD14+ representa monocitos que no se diferenciaron en células dendríticas. El día 6 , las CD CD83 + CCR7' se cotransfectaron (mediante electroporación) con 1 pg de ARNm preparado a partir de RNA de carcinoma de células renales amplificado y 4 pg de ARNm de CD40L por millón de células. La expresión de CD40L se midió 4 horas después de la transfección. Las células se crioconservaron en nitrógeno líquido 4 horas después de la transfección. La recuperación y viabilidad posteriores a la descongelación se midieron inmediatamente después de la descongelación y 24 horas después de la descongelación. Como puede verse, 24 horas después de la descongelación, la mayoría de CD se convirtieron en CCR7+. Las CD de CCR7+ también fueron positivas para CD80, CD83 y CD8 6. Los resultados de 3 experimentos separados se muestran en la Tabla IV.
TABLA IV
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Las CD maduradas mediante el procedimiento PME-CD40L son altamente migratorias en respuesta a las quimiocinas autodirigidas de los ganglios linfáticos, CCL19 y 21.
Se ensayó la migración de las CD maduradas con PME-CD40L en respuesta a las quimiocinas, CCL19 y 21, veinticuatro horas después de la cotransfección con ARN de RCC amplificado total y ARN de CD40L. La Figura 12 muestra que, utilizando cuatro donantes independientes, las CD maduras de PME-CD40L son altamente migratorias, de modo consistente con el nivel muy alto de expresión de CCR7 logrado 24 horas después de la electroporación con el procedimiento PME-CD40L (véase Tabla IV).
Las CD maduradas mediante el procedimiento PME-CD40L muestran una inmunopotencia significativamente mejorada sobre las CD maduradas con el 'procedimiento base CD40L'.
A pesar de la inducción de respuestas inmunes primarias por el 'procedimiento de base CD40L', el procedimiento de 'electroporación post-maduración-CD40L', por el cual las CD se maduran primero con TNF-a, IFN-y y PGE2, antes de la electroporación con CD40L más ARNm que codifica antígenos, da como resultado una mejora significativa en la actividad de CTL utilizando el sistema de modelo de antígeno MART (Figura 13). Además, el procedimiento PME-CD40L se probó para la inducción de respuestas de IFN-y e IL-2 utilizando materiales totalmente autólogos derivados de un paciente con carcinoma de células renales: se prepararon CD de pacientes como se describe anteriormente para el procedimiento PME-CD40L y se sometieron a electroporación con ARN tumoral de RCC amplificado total autólogo. Las CD cargadas con antígeno se cultivaron con células T CD8 autólogas de pacientes, y los CTL respondedores resultantes se estudiaron mediante tinción intracelular con citocinas en respuesta a las CD desencadenantes y a las CD individuales transfectadas con los antígenos asociados a tumores, hTERT, Survivina y el antígeno específico de CCR, G250. Las CD transfectadas con ARNm que codifica eGFP se utilizaron como estimuladores de control negativo. La Figura 14 muestra que las células T del paciente respondieron a las CD cargadas con ARN de RCC amplificado total, y también a los tres antígenos asociados a tumores, con frecuencias de IFN-y e IL-2 más altas que las inducidas por el control negativo transfectado con ARNm de eGFP. (Respuesta a eGFP restada de la respuesta total a cada diana de CD asociada a RCC)
Las CD maduradas por el 'procedimiento base CD40L' y pulsadas con KRN7000 pueden reclutar células NKT que mejoran la inducción de CTL primarios.
CD madurada con el procedimiento base de CD40L, cargada con ARNm MART-1, pulsada con KRN7000, aumenta la frecuencia de células NKT en cultivos de PBMC en comparación con las mismas CD cargadas de ARN maduro pulsadas con vehículo en lugar de KRN7000, según lo definido por tinción con tetrámero de CD1d/KRN7000 (Figura 15a). Usando análisis de tetrámeros para CTL respondedores (MART-1/HLA-A2), la presencia de KRN7000 pulsada en CD transfectadas con ARNm de MART-1 aumenta significativamente la frecuencia de células T reactivas a MART (Figura 15b). Por lo tanto, la expansión de las células NKT en los cultivos de PBMC proporciona un bucle de amplificación, probablemente logrado por la "ayuda" derivada de las células NKT, que puede apoyar el desarrollo de CTL CD8 primarios.
Optimización de ARNm de CD40L

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Células dendríticas humanas maduras (CD) de CCR7+ maduradas in vitro obtenidas mediante un procedimiento que comprende los pasos secuenciales de:
(a) señalización de células dendríticas inmaduras aisladas (CDi) in vitro con una primera señal que comprende IFN-y, TNF-a y PGE2 para producir células dendríticas CD83+ maduras señalizadas, en el que dichas células dendríticas inmaduras se preparan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC); y
(b) señalizar dichas células dendríticas maduras CD83+ in vitro con una segunda señal transitoria que comprende una cantidad eficaz de CD40L para producir células dendríticas maduras CCR7+ CD83+, en el que dicha segunda señal se efectúa tras la traducción de un ARNm que codifica CD40L, y dichas células se transfectan con dicho ARNm usando electroporación, en el que la electroporación se inicia de 12 a 30 horas después del inicio de la señalización de las CD con IFN-y y TNF-a, y en el que las CD se cargan con un antígeno por transfección con un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, dicha transfección también tiene lugar usando electroporación, y además en el que las CD producen al menos 1000 pg de IL-12 p70/106 CD y tienen la capacidad de migrar.
2. Las células de la reivindicación 1, en las que las etapas (a) y (b) del procedimiento comprenden además poner en contacto dichas células con GM-CSF y al menos una de IL-4 o IL-13.
3. Las células de cualquier reivindicación anterior, en las que dicho CD40L se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2;
b) un fragmento del polipéptido del paso (a) en el que dicho fragmento se une a CD40, o en el que CD40L es un polipéptido que tiene al menos un 77% de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: i) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:2; y
ii) un fragmento del polipéptido de (a) en el que dicho fragmento se une a CD40.
4. Las células de cualquier reivindicación anterior, en las que dicho ARNm codifica un polipéptido CD40L y comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido de SEQ ID NO:1;
b) un polinucleótido que comprende los nucleótidos 40 a 822 de SEQ ID NO:1;
c) un polinucleótido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con cualquier polinucleótido de (a) o (b); y d) un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con cualquier polinucleótido de (a) hasta (c).
5. Las células de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que las CD maduras CCR7+ secretan de 0 a 500 pg de IL-10 por 106 CD, y/o en las que las células dendríticas inmaduras se preparan poniendo en contacto dichas PBMc con GM-CSF en presencia de IL -4 y/o IL-13.
6. Las células de cualquier reivindicación anterior, en las que el antígeno se selecciona de patógenos, lisados de patógenos, extractos de patógenos, polipéptidos de patógenos, células cancerosas, lisados de células cancerosas, extractos de células cancerosas y polipéptidos específicos de células cancerosas.
7. Las células de cualquier reivindicación anterior, en las que el ARNm que codifica el antígeno o los antígenos se introduce en dichas CD junto con el ARNm que codifica un CD40L.
8. Las células de cualquier reivindicación anterior, el IFN-y tiene la secuencia de SEQ ID NO:6 o comprende un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:6.
9. Una población enriquecida de CD maduras de cualquier reivindicación anterior.
10. Las células de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la población enriquecida de CD maduras de la reivindicación 9, en donde dicha señalización está en ausencia de una cantidad eficaz de IL-1p y/o IL-6.
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