TWI382843B - 成熟樹突細胞組合物及培養彼等之方法 - Google Patents

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Description

成熟樹突細胞組合物及培養彼等之方法 [相關申請案之交叉參照]
本申請案主張優先於2004年10月7日提出申請之美國臨時申請案第60/522,512號，該申請案之內容明確地以引用方式併入本文中。
本發明係關於成熟樹突細胞之產生及成熟樹突細胞於細胞療法及育導免疫效應細胞中之用途。成熟樹突細胞係產生自不成熟樹突細胞。
細胞療法係利用經修飾抗原遞呈細胞(antigen presenting cells；APCs)或免疫效應細胞於患者體內引發免疫反應。抗原遞呈細胞對於細胞療法而言最為重要，此乃因其可引發免疫反應。實際上，抗原遞呈細胞係唯一能自T淋巴細胞誘發初次免疫反應的細胞。
樹突細胞(DC)係最有效的APC，其與適應性免疫有關。其配合原初T細胞及B細胞對免疫反應之引發並誘發抗原專一性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。DC以數種方式專門在活體內誘導輔助及殺傷T細胞。舉例而言，存在於外周組織中的不成熟DC具有捕獲抗原並產生免疫原性MHC－肽複合體之能力。反應於諸如炎性細胞因子等成熟誘發刺激，不成熟DC藉由上調黏著及協同刺激分子發展成強T細胞刺激因子。同時，其遷移至次級淋巴器官中，選擇並刺激稀有抗原專一性T細胞。然而，T細胞之強刺激僅發生於DC成熟之後，DC成熟係一於細胞表面上除了增加協同刺激分子外亦可增加MHC/肽複合體之可獲得性以引導反應T細胞之效應子功能之過程。實際上，不成熟DC可能對抗癌及其他免疫療法有害，此乃因其可誘發免疫耐受性而非免疫刺激性。
T細胞通常需要協同刺激來產生足以誘發選殖擴充之細胞因子水平。使樹突分子成為強抗原遞呈細胞的一個特徵在於樹突分子富含免疫反應之協同刺激分子，例如分子CD80及CD86，其可激活T淋巴細胞上之分子CD28。反過來，T輔助細胞表現CD40L，而CD40L連接DC上之CD40。CD與細胞間之該等相互作用引起前者之「成熟」及後者中效應子功能之形成。諸如分子CD54或分子CD11a/CD18等黏著分子之表現可促進樹突細胞與T細胞間之合作。樹突細胞之另一特點係端視其不同之分化階段而採用不同的功能。因此，抗原之捕獲及其轉化係不成熟樹突細胞之兩個主要功能，而其遞呈抗原以刺激T細胞之能力隨著樹突細胞遷移至組織及淋巴神經節中而增強。該功能之改變對應於樹突細胞之成熟。由此，不成熟樹突細胞變化成成熟樹突細胞代表免疫反應之引發中之基本步驟。通常，藉由在該過程期間監測DC上表面標記之改變來跟蹤該成熟。某些表徵樹突細胞之不同成熟階段之更重要的細胞表面標記概述於下表I中。然而，該等表面標記可端視成熟過程而有所變化。
目前，對於免疫療法，成熟DC優於不成熟DC。僅完全成熟的DC子代缺乏GM－CSF受體(GM－CSF－R)並在移除/不存在GM－CSF之情況下穩定地保持成熟狀態。並且，已證明，成熟的DC在活體外及活體外誘發T細胞反應方面具有優勢。相反，據報導，不成熟DC藉由誘發調節T細胞而在活體外(Jonuleit,H.等人(2000)3.Exp.Med.192(9)：1213)及活體內(Dhodapkar,M.V.等人(2001)3.Exp.Med.193(2)：233)誘發耐受性。成熟樹突細胞亦可用於在活體外或活體內捕獲抗原並向T淋巴細胞遞呈抗原。經修飾的抗原遞呈DC及/或自該等經修飾DC育導的T細胞具有許多應用，包括診斷、治療、接種疫苗、研究、篩選及基因遞送。
難以自外周血中分離出成熟的樹突細胞，此乃因少於1%之白血球屬於該類細胞。成熟的DC亦難以自組織中提取。該困難加上DC在細胞療法中之潛在治療功效驅使人們研究及開發使用替代來源產生成熟樹突細胞之新穎方法。據報告，數種方法可自不成熟樹突細胞產生成熟DC。
舉例而言，Jonuleit等人(Eur J Immunol(1997)12：3135－3142)揭示藉由在合一細胞因子混合劑(IL－1β、TNF－α、IL－6及PGE2 )之培養基中培養使不成熟DC成熟。
WO 95/28479揭示一種藉由以下製備樹突細胞之方法：分離出外周血細胞並富集CD34＋ 血液前體細胞，隨後用造血生長因子與細胞因子之組合擴充。
歐洲專利公開案EP－A－0 922 758揭示由自具有表現巨噬細胞或樹突細胞特徵之潛能之多潛能細胞獲得的不成熟樹突細胞產生成熟樹突細胞之方法。該方法需要使不成熟樹突細胞與一含有IFN－γ之樹突細胞成熟因子接觸。
歐洲專利公開案EP－B－0 633930教示藉由首先用(i)GM－CSF、(ii)TNF－α及IL－3、或(iii)GM－CSF及TNF－α培養人類CD34＋造血細胞而誘發CD1a＋ 造血細胞之形成來生產人類樹突細胞之方法。
專利公開案第2004/0152191號揭示藉由使樹突細胞與RU 41740接觸而使樹突細胞成熟之方法。
美國專利公開案第2004/0146492教示一種藉由以下生成重組樹突細胞之方法：轉化造血幹細胞，然後藉由在含有GM－CSF之培養基中培養使該等幹細胞分化成樹突細胞。
美國專利公開案第2004/0038398揭示自哺乳動物之外周血製備實質純的DC及單核細胞群的方法。自哺乳動物分離出骨髓細胞並自該細胞群分離出DC，以獲得單核細胞之分離亞群。然後藉由用抗－CD2抗體實施陰性選擇去除T細胞來富集DC。
儘管成熟DC在功能上符合要求且因此可用於引發抗原專一性T細胞，但並非所有的成熟DC皆受到優化而能誘發該等反應。已證明，某些成熟DC亦藉由分泌IL－12而刺激T輔助細胞。Macatonia,S.E.等人(1995)Immunol.154：5071；Ahuja,S.S.等人(1998)Immunol.161：868及Unintford,A.P.等人(1999)Immunol.97：588。亦已證明在一動物模型中，IL－12可增強對抗原之抗原專一性CD8＋T細胞反應。Schmidt,C.S.等人(1999)Immunol.163：2561。
Mosca,P.J.等人(2000)Blood 96：3499揭示，與在僅含有可溶性CD40L三聚體之培養基中培養相比，在同時含有可溶性CD40L三聚體與IFNγ 1b之AIM V培養基中培養DC可增強IL－12表現。
Koya等人(2003)J.Immunother.26(5)：451報導，IL－12表現可藉由在IFNγ存在下用一編碼CD40配體之慢病毒載體轉導不成熟DC增強。90%以上的CD40L轉導的DC於其細胞表面上表現CD83。不幸的是，慢病毒轉導的細胞不適於治療目的，原病毒整合至經轉導細胞之基因組中可導致白血病。此外，持續的CD40L表現可對APC功能及存活力具有損害作用。
本研究對Mackey等人(1998)J.Immunol.161：2094之早期研究予以補充，Mackey等人報導，在活體內，DC需經由CD40成熟，來產生抗腫瘤免疫力。類似地，Kuniyoshi,J.S.等人(1999)Cell Immunol.193：48已證實，用可溶性三聚體CD40配體加上IFN－γ處理的DC可刺激強T細胞增殖並誘發具有增強的抗原專一性裂解作用之T細胞。Kalady,M.F.等人(2004)J.Surg.Res.116：24報導，暴露於不同成熟刺激(同時或依序施加)下的用編碼黑色素瘤抗原MART－1或流感M1基質蛋白之mRNA轉染之人類單核細胞衍生DC在抗原遞呈、IL－12分泌及於該等DC存在下引發之效應T細胞之免疫原性方面顯示出變化性。最重要的是，該研究顯示，施加一由IL－1β、TNF－α、IL－6及PGE2 組成之「細胞因子混合劑」並隨後施加細胞外可溶性CD40L蛋白質優於同時施加所該等試劑。然而，該等作者並未以依序過程研究IFN－γ信號傳導與瞬時CD40L信號傳導之組合。此外，儘管當同時向培養基中添加IFN－γ及CD40L時產生IL－12，但最近的先前技術顯示，所得的DC實際上具有免疫抑制性而不具有促發炎性(Hwu P等人(2000)J.Immunol.164：3596.Munn D等人(2002)297：1867.Grohmann等人(2003)Trends Immunol.24：242)，此乃因其誘發一酵素而代謝產生色胺酸，導致效應T細胞之饑餓，於是使效應T細胞不能增殖。因此，當前文獻表明，IFN－γ及CD40L之組合不能增強免疫效能。
本發明致力於解決長久以來的需求，以提供用於使DC成熟及提供具有增強的免疫效能之DC的改良方法。
本申請案之申請者已發現，當依序地用一包含一干擾素γ受體(INF－γR)激動劑之第一信號並隨後用一包含一CD40激動劑之第二信號向不成熟樹突細胞傳導信號時可發生強力的免疫刺激。因此，本發明提供一種用於製備成熟樹突細胞(DC)之方法，其包括以下依序步驟：(a)用一包含一干擾素γ受體(IFN－γR)激動劑之第一信號向將分離之不成熟樹突細胞(iDC)傳導信號，以產生經信號標誌樹突細胞；及(b)用一包含有效量CD40激動劑之第二瞬時信號向該等經信號標誌樹突細胞傳導信號，以產生CCR7＋ 成熟樹突細胞。
在較佳實施例中，使該等不成熟DC進一步與PGE2 及視情況與TNF－α接觸。在替代實施例中，該方法進一步包括使該等不成熟DC、經信號標誌DC及/或CCR7＋ 成熟樹突細胞與一化合物接觸，該化合物係選自由下列組成之群：半乳糖基神經醯胺、糖基神經醯胺、呋喃半乳糖基神經醯胺、吡喃阿糖基神經醯胺、α－C－半乳糖基神經醯胺及α－S－半乳糖基神經醯胺。該化合物較佳係半乳糖基神經醯胺。該半乳糖基神經醯胺最佳係(2S,3S,4R)－1－O－(α－D－吡喃半乳糖基)－2－(N－二十六烷酸基胺基)－1,3,4－十八碳三醇(KRN7000)。
在本發明另一實施例中，該IFN－γR激動劑可由一腫瘤壞死因子α受體(TNF－αR)激動劑代替。由此，本發明提供一種製備成熟樹突細胞(DC)富集群之方法，其包括依序以一包含腫瘤壞死因子α受體(TNF－αR)激動劑之第一信號及隨後一包含CD40激動劑之第二信號向不成熟樹突細胞傳導信號，藉此製備成熟樹突細胞富集群。其中該信號傳導係於不存在有效量之IL－1β或IL－6之情況下實施。較佳地，使該等不成熟DC進一步與PGE2 接觸。
優選IFN－γR激動劑係哺乳動物IFN－γ，較佳係人類IFN－γ及其活性片段。優選TNF－αR激動劑係哺乳動物TNF－α，較佳係人類TNF－α及其活性片段。優選CD40激動劑係哺乳動物CD40配體(CD40L)，較佳係人類CD40L及其活性片段和變體以及CD40受體之激動抗體。信號傳導可藉由在培養基中提供信號傳導激動劑、將該激動劑引入細胞中及/或於樹突細胞內轉譯一編碼激動多之mRNA時引發。該方法可於活體內或體外實施。然後，可將根據本發明方法於體外成熟之樹突細胞施用至患者體內以誘發或增強免疫反應。
每一樹突細胞可藉由將免疫原施予該DC進一步加以修飾。該DC將捕獲並處理該免疫原並於其表面上展示該免疫原。該免疫原可於活體內或體外遞送。成熟經培養DC可施用至患者體內來誘發或增強免疫反應。在另一實施例中，使用載有抗原之成熟DC來育導原初免疫效應細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含活體外成熟的樹突細胞，例如CD83＋ CCR7－ 成熟DC及CD83＋ CCR7＋ 成熟DC。與不成熟樹突細胞相比，本發明成熟樹突細胞表現增強水平的IL－12，及/或表現小於500皮克/毫升IL－10/106 個樹突細胞。本發明組合物可用以產生個體免疫反應，其係藉由施予個體一有效量之細胞群體。
在整個本發明中，藉由辨識引用參考多個出版物、專利及公開的專利說明書。該等出版物、專利及公開的專利說明書之揭示內容特此明確地以引用方式併入本發明中，以更全面地闡述本發明所屬技術領域的狀況。
除非另有說明，否則本發明之實施採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，此皆在所屬技術領域之技藝內。此等技術充分地闡述於文獻中。該等方法闡述於下列出版物中。參見，例如Sambrook等人MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,第2版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人編輯(1987))；叢書METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press公司)；PCR：A PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等人IRL Press at Oxford University Press(1991))；PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor編輯(1995))；ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(Harlow及Lane編輯(1988))；USING ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(Harlow及Lane編輯(1999))；及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編輯(1987))。
定義
除非上下文中另有明確說明，否則說明書及申請專利範圍中所用單數形式「一(a，an)」及「該(the)」包括複數含義。舉例而言，術語「一細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。
本文所用術語「包括(comprising)」意欲指該等組合物及方法包括所述要素，但並不排除其他要素。「基本由…組成」當用於定義組合物及方法時，應意指不包括對該組具合有基本重要性之其他要素。由此，一基本由如本文所定義要素組成之組合物將包括來自分離及純化方法之痕量雜質及醫藥上可接受的載劑，例如磷酸緩衝鹽溶液、防腐劑及諸如此類。「由…組成」應意指包括痕量以上的其他成份之要素及用於施用本發明組合物之實質方法步驟。由該等過渡術語中的每一個所定義的實施例在本發明之範圍內。
所有包括範圍在內的數字標識，例如pH、溫度、時間、濃度及分子量皆係約數，其以增量0.1發生(＋)或(－)變化。儘管並非始終明確說明，但應瞭解，本文所述試劑僅具有例示性且此等試劑之等效物在此項技術中為人習知。
術語「抗原」在此項技術中眾所周知且包括具有免疫原性之物質，即免疫原。可理解，任何抗原之使用皆視為用於本發明，因此包括(但不限於)自身抗原(不管是正常的或與疾病相關)、感染性抗原(例如微生物抗原、病毒抗原等)或某些其他外源抗原(例如，一食品成份、花粉等)。術語「抗原」或者「免疫原」適用於一種以上免疫原之總稱，因此可同時調節對多個免疫原之免疫反應。此外，該術語包括多種不同免疫原或抗原調配物中的任一種。
「天然」或「自然」或「野生型」抗原係一多肽、蛋白質或一片段(其含有一表位)，其已自一天然生物來源分離並可專一性地結合至一抗原受體，此時其於患者體內以一MHC/肽複合體且尤其以一T細胞抗原受體(TCR)形式遞呈。
術語「腫瘤相關抗原」或「TAA」指一與一腫瘤相關之抗原。習知TAA之實例包括gp100、MART及MAGE。
術語「主要組織相容性複合體」或「MHC」指一編碼向T細胞遞呈抗原及迅速移植排斥所需細胞表面分子的基因複合體。在人類中，MHC亦稱為「人類白血球抗原」或「HLA」複合體。由MHC編碼之蛋白質稱為「MHC分子」且分為I類及II類MHC分子。I類MHC分子包括膜異二聚體蛋白質，其由一在MHC中編碼的α鏈與β2 －微球蛋白非共價連接構成。I類MHC分子由幾乎所有的有核細胞表現且已證明其在向CD8＋ T細胞遞呈抗原中起作用。在人類中，I類分子包括HLA－A、B及C。II類MHC分子亦包括由非共價結合的α及β鏈構成的膜異二聚體蛋白質。已知II類MHC分子在CD4＋ T細胞中起作用且在人類中包括HLA－DP、－DQ及－DR。
術語「抗原遞呈細胞(APC)」指一類能遞呈一種或多種呈可由免疫系統之專一性效應細胞識別之肽－MHC複合體形式之抗原的細胞，藉此誘發一抵抗所遞呈的該或該等抗原之有效細胞免疫反應。APC可係完整的全細胞，例如巨噬細胞、B細胞、內皮細胞、激活之T細胞及樹突細胞；或其他天然存在或合成的分子，例如純化的與β2－微球蛋白複合的MHCI類分子。雖然許多類型的細胞皆能於其細胞表面上遞呈抗原供T細胞識別，但僅樹突細胞能夠以一有效量遞呈抗原而激活原初T細胞以獲得細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。
術語「樹突細胞(DC)」指各種各樣的於多種淋巴及非淋巴組織中發現的形態上類似細胞類型之群體，Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271－296。樹突細胞構成生物體中最有效的首選APC。雖然樹突細胞可自單核細胞分化，但它們具有完全不同的表現型。舉例而言，樹突細胞中並不存在一特別的分化標記CD14抗原，但單核細胞卻具有該分化標記。並且，成熟的樹突細胞不吞噬細胞，而單核細胞係具有強吞噬作用的細胞。已證明，成熟的DC可提供T細胞激活及增殖所必需的所有信號。
術語「免疫效應細胞」指能結合一抗原並且介導一免疫反應之細胞。該等細胞包括(但不限於)T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，例如CTL株系、CTL選殖株及來自腫瘤、炎症或其他浸潤物之CTL。
一「原初」免疫效應細胞係一尚未暴露於一能激活該細胞之抗原下的免疫效應細胞。激活原初免疫效應細胞既需要識別肽：MHC複合體亦需要由一專職APC同時遞送一協同刺激信號，以增殖並分化成抗原專一性武裝效應T細胞。
「免疫反應」廣義上指淋巴細胞對外源物質之抗原專一性反應。任何可引起一免疫反應之物質皆認為具有「免疫原性」且稱為「免疫原」。所有的免疫原皆係抗原，然而，並非所有的抗原皆係具有免疫原性。本發明之免疫反應可係體液性的(經由抗體活性)或細胞介導的(經由T細胞激活)。
本文所用術語「經育導的抗原專一性免疫效應細胞」指一先前已遭遇一抗原的如上所定義免疫效應細胞。與其原初對應物不同，激活一經育導的抗原專一性免疫效應細胞不需要一協同刺激信號。肽：MHC複合體之識別即足夠。
「激活的」當用於指一T細胞時，意味著該細胞已不再處於G0 期，並且開始產生一種或多種細胞毒素、細胞因子及表徵細胞類型的其他有關的膜相關蛋白質(例如CD8＋ 或CD4＋ )，並且能識別並結合於其表面展現該特定肽/MHC複合體的任何靶細胞，並釋放其效應分子。
本文所用術語「於患者體內誘發一免疫反應」係一在此項技術中熟知的術語，且指，相對於向患者體內引入一抗原(或表位)前的免疫反應(若有)，於將該抗原(或表位)引入該患者體內後可檢測或量測到的對該抗原(或表位)之免疫反應有一至少約2倍之增加，或者至少約5倍，或者至少約10倍，或者至少約100倍，或者至少約500倍，或者至少約1000倍或以上。對一抗原(或表位)之免疫反應包括(但不限於)產生一抗原專一性(或表位專一性)抗體，及產生一於其表面上表現一專一性地結合至一抗原(或表位)之分子的免疫細胞。確定是否已誘發一針對一給定抗原(或表位)之免疫反應的方法在此項技術中眾所周知。舉例而言，可使用此項技術中熟習的多種免疫測定法中的任一種來檢測抗原專一性抗體，該等方法包括(但不限於)ELISA，其中，舉例而言，用一可檢測的經標記第二抗體(例如酵素標記的小鼠抗人Ig抗體)檢測一試樣中之抗體與一固定抗原(或表位)之結合。
「協同刺激分子」與在抗原遞呈細胞及T細胞表面上表現的受體－配體對間的相互作用有關。過去數年間積累的研究結果已有說服力地證明，靜止T細胞需要至少兩個信號來誘發細胞因子基因表現及增殖(Schwartz,R.H.(1990)Science 248：1349－1356及Jenkins,M.K.(1992)Immunol.Today 13：69－73)。一個信號賦予專一性，其可由TCR/CD3複合體與一適宜MHC/肽複合體之相互作用產生。該第二信號不具有抗原專一性且稱為「協同刺激」信號。該信號最初定義為一由骨髓衍生輔助細胞例如巨噬細胞及樹突細胞(所謂的「專職」APC)提供的活性。已證明，數種分子可增強協同刺激活性。其中有熱穩定抗原(HSA)(Liu,Y.等人(1992)3.Exp.Med.175：437－445)、硫酸軟骨素修飾的MHC不變鏈(li－CS)(Naujokas,M.F.等人(1993)Cell 74：257－268)、細胞內黏著分子1(ICAM－1)(Van Seventer,G.A.(1990)].Immunol.144：4579－4586)、B7－1及B7－2/B70(Schwartz,R.H.(1992)Cell 71：1065－1068)。該等分子看來似乎皆可藉由與在T細胞上的其同源配體相互作用而輔助協同刺激。協同刺激分子介導協同刺激信號，在正常的生理條件下需要該等協同刺激信號來達成原初T細胞之完全激活。一例示性受體－配體對係APC5表面上的B7家族協同刺激分子和T細胞上的其反受體CD28或CTLA－4(Freeman等人(1993)Science 262：909－911；Young等人(1992)].Clin.Invest.90：229及Nabavi等人(1992)Nature 360：266－268)。其他重要的協同刺激分子係CD40及CD54。術語「協同刺激分子」涵蓋任何當與一由T細胞表面上之TCR結合之MHC/肽複合體一起作用時可提供一協同刺激效應而達成結合該肽之I細胞之激活的單個分子或分子組合。因此，該術語涵蓋B7或一抗原遞呈基質例如APC上之其他協同刺激分子、其片段(單獨，與另一(些)分子複合，或作為一融合蛋白的一部分)，其與MHC複合體一起結合至一同源配體並導致T細胞之激活，此時T細胞表面上的TCR專一性地結合該肽。儘管並未始終明確說明，但具有類似於野生型或純協同刺激分子之生物活性的分子(例如重組產生的分子或其突變蛋白)意欲在本發明之精神及範圍內使用。
本文所用「細胞因子」指可對細胞施加多種效應(例如誘發生長或增殖)的無數因子中的任一因子。可在本發明之實踐中單獨或組合使用的細胞因子之非限制性實例包括介白素－2(IL－2)、幹細胞因子(SCF)、介白素－3(IL－3)、介白素－6(IL－6)、介白素－12(IL－12)、G－CSF、粒細胞巨噬細胞－集落刺激因子(GM－CSF)、介白素－1α(IL－1α)、介白素－1L(IL－11)、MIP－11、白血病抑制因子(LIF)、c－kit配體、血小板生成素(TPO)及flt3配體。本發明的一實施例包括其中培養基中不包含一有效量的IL－1β及/或IL－6的培養條件。細胞因子可自數個廠家購得，例如Genzyme(Framingham,MA)、Genentech(South San Francisco,CA)、Amgen(Thousand Oaks,CA)、R&D SyStems(Minneapolis,MN)及Immunex(Seattle,WA)。儘管並未始終明確說明，但具有類似於野生型或純協同刺激分子之生物活性的分子(例如重組產生的分子或其突變蛋白)意欲在本發明之精神及範圍內使用。
術語「多核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合形式。多核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物。核苷酸可具有任何三維結構，且可執行任何已知或未知功能。舉例而言，術語「多核苷酸」包括單鏈、雙鏈及三螺旋分子、一基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、分離的具有任一序列之DNA、分離的具有任一序列之RNA、核酸探針及引物。除天然核酸分子外，本發明之核酸分子亦可包括經修飾的核酸分子。本文所用mRNA指一可於一樹突細胞中轉譯之RNA。此等mRNA通常具有帽且具有一核糖體結合位點(Kozak序列)及一可轉譯起始密碼子。
所用術語「肽」廣義上指一由兩個或以上的亞單位胺基酸、胺基酸類似物或擬肽物質構成之化合物。該等亞單位可由肽鍵連接。在另一實施例中，該亞單位可由其他鍵連接，例如酯、醚等。本文所用術語「胺基酸」指天然及/或非天然或合成的胺基酸，包括甘胺酸及D和L旋光異構體二者、胺基酸類似物及擬肽物質。一由三個或以上的胺基酸構成之肽若肽鏈較短則通常稱為寡肽。若肽鏈較長，則該肽通常稱為多肽或蛋白質。
術語「基因修飾的」意指含有及/或表現一外源基因或核酸序列，該外源基因及/或核酸序列反過來修飾該細胞或其子代之基因型或表現型。換言之，其指對一細胞之內源性核苷酸之任何添加、缺失或破壞。
本文所用「表現」指將多核苷酸轉錄成mRNA及將mRNA轉錄成肽、多肽或蛋白質之過程。若該多核苷酸源自一適宜真核宿主之基因組DNA，則表現可包括mRNA之剪接。表現所需調節元件包括結合RNA聚合酶之啟動子序列及用於核糖體結合之轉錄起始序列。舉例而言，一細菌表現載體包括一啟動子，例如lac啟動子，且對於轉錄起始，包括Shine－Dalgarno序列及起始密碼子AUG(Sambrook等人(1989)見上文)。類似地，一真核表現載體包括RNA聚合酶II的一異源或同源啟動子、一下游聚腺苷酸化信號、起始密碼子AUG及一用於核糖體之脫離之終止密碼子。此等載體可購得或可藉由此項技術中習知的方法(例如下文用於構築載體之通用方法)中所述序列裝配而成。
「處於轉錄控制下」係一於此項技術中習知的術語且表示，一多核苷酸序列且通常一DNA序列之轉錄取決於其正以可操作方式連接至一可導致或促進轉錄之啟動的元件。
「以可操作方式連接」指一其中各元件處於一可允許它們起作用之佈置的並列。
一「基因遞送媒介」定義為任何可將插入的多核苷酸運載至一宿主細胞中的分子。基因遞送媒介之實例係脂質體、生物相容聚合物，包括天然聚合物及合成聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金屬粒子；及細菌，或病毒，例如杆狀病毒、腺病毒及逆轉錄病毒；噬菌體、黏粒、質粒、真菌載體及其他通常用於此項技術中的重組媒介，已闡述其用於在多種真核及原核宿主中表現且可用於基因療法以及用於簡單的蛋白質表現。
本文所用術語「基因遞送」、「基因轉移」、「轉染」及諸如此類係指將一異源多核苷酸引入一宿主細胞中，不管使用何種引入方法。轉染指將任一核酸遞送至一細胞內部。基因遞送指遞送一可整合入宿主細胞之基因組中或可獨立於宿主細胞基因組複製的核酸。基因遞送或基因轉移不指將一mRNA引入一細胞中。轉染方法包括多種技術，例如電穿孔、基於蛋白質、脂質及陽離子的核酸遞送複合體、病毒載體、「基因槍」遞送及熟習此項技術者習知的多種其他技術。所引入的多核苷酸可穩定地維持於宿主細胞中或可受到瞬時表現。在較佳實施例中，將一mRNA引入一DC中並瞬時表現之。穩定的維持通常要求所引入的多核苷酸或含有一與宿主細胞相容的複製源或整合入該宿主細胞的一複製子例如一染色體外複製子(例如一質粒)或一核或線粒體染色體中。多種載體皆能介導基因向哺乳動物細胞中的轉移，如此項技術中所習知及本文中所述。
「病毒載體」定義為以重組方式產生的病毒或病毒顆粒、其包含一待於活體內、體外或活體外遞送至一宿主細胞中的多核苷酸。病毒載體之實例包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體、阿爾法病毒載體及諸如此類。阿爾法病毒載體，例如基於勝利基森林病毒(Semliki Forest virus)的載體及基於辛德比斯病毒(Sindbis virus)的載體，亦已開發用於基因療法及免疫療法。參見，Schlesinger及Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5：434－439以及Zaks等人(1999)Nat.Med.7：823－827。在其中基因轉移係由一逆轉錄病毒載體介導的情況下，一載體構築體指包含該逆轉錄病毒基因組或其一部分及一治療基因的多核苷酸。本文所用「逆轉錄病毒介導的基因轉移」或「逆轉錄病毒轉導」具有相同的含義且指由於病毒進入細胞並將其基因組整合至宿主細胞基因組中而可將一基因或核酸序列穩定地轉移至宿主細胞中之過程。該病毒可經由其正常的感染機制進入宿主細胞或可經修飾以便其可結合至一不同的宿主細胞表面受體或配體而進入該細胞。本文所用「逆轉錄病毒載體」指一能經由一病毒或病毒樣進入機制將一異源核酸引入一細胞中的病毒顆粒。
逆轉錄病毒可以RNA形式承載其基因信息；然而，一旦該病毒感染一細胞，則RNA便逆轉錄成DNA形式並整合至所感染細胞之基因組DNA中。整合的DNA形式稱為一前病毒。
在其中基因轉移係由一DNA病毒載體例如一腺病毒(Ad)、假腺病毒或腺相關病毒(MV)介導時，載體構築體指包含該病毒基因組或其一部分及一轉基因之多核苷酸。腺病毒(Ad)係一類相對詳細定性的同源病毒群，包括50種以上的血清型。(參見，例如WO 95/27071)。Ad容易生長且不需要整合至宿主細胞基因組中。亦已構築重組Ad衍生的載體，尤其彼等可降低野生型病毒之重組及產生之潛能者。(參見WO 95/00655及WO 95/11984)。野生型MV具有高感染性及專一性(對於整合至宿主細胞基因組中而言)。(參見，Hermonat及MuZyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466－6470以及Lebkowski等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：3988－3996)。
此項技術中習知既含有一啟動子亦含有一多核苷酸可以可操作方式連接至其中的選殖位點的載體。此等載體能在活體外或活體內轉錄RNA，其可自諸如Stratagene(La Jolla,CA)及Promega Biotech(Madison,WI)等來源購得。為最優化表現及/或活體外轉錄，可能需要去除、添加或改變選殖株之5'及/或3'未轉譯部分，以除去額外的潛在不適宜的替代轉譯起始密碼子或可能在轉錄或轉譯水平干擾或降低表現的其他序列。或者，可緊鄰起始密碼子之5'插入一致核糖體結合位點以增強表現。
基因遞送媒介亦包括數種非病毒載體，包括DNA/脂質體複合體及靶向病毒蛋白質－DNA複合體。亦包括一尋靶抗體或其片段之脂質體可用於本發明之方法中。為增強向一細胞之遞送，本發明之核酸或蛋白質可共軛結合至與細胞表面抗原結合之抗體或其結合片段(例如TCR、CD3或CD4)。
「雜交」指其中一或多個多核苷酸反應形成一經由核苷酸殘基之鹼基間之氫鍵結穩定的複合體的反應。該氫鍵結可藉由沃森－克裏克(Watson－Crick)鹼基配對、Hoogstein結合或以任何其他序列專一性方式發生。該複合體可包含形成一雙螺旋結構之兩個鏈、形成一多鏈複合體之三個或以上的鏈、一自雜交單鏈或該等之任一組合。一雜交反應可構成一更廣泛過程的一個步驟，例如一PCR反應之起始，或一核酶對一多核苷酸之酵素剪切。
嚴格雜交條件如下：於65℃下實施含有一目標核酸之濾器之預雜交8小時至過夜，此係於一由6xSSC、50 mM Tris－HCl(pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA及500微克/毫升的變性鮭魚精子DNA構成之緩衝液中實施。於最適宜的雜交溫度即65℃下將濾器於含有100微克/毫升變性鮭魚精子DNA及5至20x106 cpm的3 2 P－標記探針的預雜交混合物中雜交48小時。隨後，於37℃下在含有2xSSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll及0.01% BSA之溶液中實施濾器洗滌1小時，繼而於50℃下在0.1xSSC中洗滌45分鐘。於該等洗滌步驟後，藉由放射自顯影術可檢測到雜交後的探針。該等方法在此項技術中眾所周知且引述於Sambrook等人，1989及Ausubel等人，1989中。
一多核苷酸或多核苷酸區域(或一多肽或多肽區域)與另一序列具有一定百分比(例如80%、85%、90%或95%)之「序列一致性」，此意指，當比對時，鹼基(或胺基酸)之彼百分比於比較兩個序列時相同。該比對及一致性百分比或序列一致性使用習知的BLAST比對程式及缺省參數測定。替代程式係BLASTN及BLASTP，其使用下列缺省參數：Genetic code(遺傳密碼)＝standard(標準)；filter(濾器)＝none(無)；strand(鏈)＝both(二者同時)；cutoff(截止值)＝60；expect(期望值)＝10；Matrix(矩陣)＝BLOSUM62；Descriptions(說明)＝50個序列；sort by(搜索項)＝HIGH SCORE(高分值)；Databases(數據庫)＝non－redundant(非冗餘)，GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS translations＋SwissProtein＋SPupdate＋PIR。該等程式之詳細內容可見以下環球網地址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi－bin/BLAST。
術語「分離」意指與其中多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段通常在本質上與之相伴隨之成份(細胞性的及另外的)分離。舉例而言，對於一多核苷酸，一分離的多核苷酸係一與其通常在染色體中與之相伴隨的5'及3'序列分離的多核苷酸。如熟習此項技術者通常所明瞭，一非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要「分離」來將其與其天然存在的對應物區別開來。另外，一「濃縮的」、「分離的」或「稀釋的」多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段可與其天然存在的對應物區別開來，因為與其天然存在的對應物相比，每一體積的分子濃度或數量係大於「濃縮的」或小於「分離的」。其一級序列或(例如)其糖基化模式不同於天然存在的對應物之多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段無需以其分離的形式存在，此乃因其可憑其一級序列或者憑另一特徵(例如其糖基化模式)與其天然存在的對應物區別開來。儘管未對本文所揭示發明中的每一個加以明確說明，但應瞭解，本文為每一上文及下文所揭示組合物之所有以上實施例提供適宜的條件。因此，一非天然存在的多核苷酸係以一與分離的天然存在多核苷酸分開的實施例形式提供。一於細菌細胞中產生的蛋白質係一與自一真核細胞分離的天然存在蛋白質(該天然存在的蛋白質在該真核細胞中天然產生)分開的實施例形式提供。若將一哺乳動物細胞(例如樹突細胞)自該細胞在一生物體中存在的解剖位點移取出，則其受到分離。
「宿主細胞」、「靶細胞」或「受體細胞」意欲包括可係或已經係載體或異源性核酸分子、多核苷酸及/或蛋白質之併入的受體之單個細胞或細胞培養物。其亦意欲包括一單個細胞之子代，並且該子代可能因天然、意外的或有意的突變而無需與初始親代細胞完全相同(在形態上或在基因組或總DNA補體上)。該等細胞可係原核細胞或真核細胞，且包括(但不限於)細菌細胞、酵母細胞、動物細胞及哺乳動物細胞，例如，鼠科動物、大鼠、猿猴或人類。
「患者」係一脊椎動物，較佳一哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括(但不限於)鼠科動物、猿猴、人類、家畜、體育動物及寵物。
「對照」係在實驗中用於比較目的之替代受試者或試樣。對照可為「陽性的」或「陰性的」。舉例而言，若實驗之目的係測定一免疫反應與一特定培養條件之相關性，則通常較佳使用一陽性對照及一陰性對照。
「癌症」意指展示相對自發生長之細胞的異常存在，因此一癌細胞展示一特徵為細胞增殖控制顯著喪失之異常生長表現型。癌細胞可係良性的或惡性的。在各種實施例中，癌症影響膀胱、血液、腦部、乳房、結腸、消化道、肺部、卵巢、胰腺、前列腺或皮膚之細胞。本文所用癌細胞之定義不僅包括一原代癌細胞，而且亦包括任何衍生自一原始癌細胞之細胞。此包括轉移的癌細胞，以及衍生自癌細胞之活體外培養物及細胞系。癌症包括(但不限於)實體腫瘤、液體腫瘤、血液惡性腫瘤、腎細胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、神經母細胞瘤、膠質細胞瘤、成視網膜細胞瘤、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、肝瘤、腺瘤、肉瘤、癌瘤、胚細胞瘤等。當提及一類通常表現為一實體腫瘤之癌症時，一「臨床上可檢測的」腫瘤係一可根據腫瘤塊檢測的腫瘤；例如，藉由諸如CAT掃描、磁共振成像法(MRI)、X－射線、超音波或觸診等程序。單獨的生化或免疫發現可能不足以滿足該定義。
術語「培養」指細胞於活體外或於適宜培養基中之維持、分化及/或增殖。「富集的」意指所含細胞的總細胞百分比較該等細胞於所在生物體組織中的百分比高的組合物。舉例而言，由本發明方法製備的CD83＋ CCR7－ DC及CD83＋ CCR7＋ DC之富集培養物及製劑中的總細胞百分比較該等細胞於所在生物體組織(例如血液、皮膚、淋巴結等)中的百分比高。
「組合物」意指活性試劑與另一惰性(例如，一可檢測試劑或標簽)或活性化合物或成份(例如一佐劑)之組合。
「醫藥組合物」意欲包括一活性試劑與一惰性或活性載劑之組合，使該組合物適用於活體外、活體內或體外診斷或治療應用。
本文所用術語「醫藥上可接受的載劑」涵蓋任何標準醫藥載劑，例如一磷酸緩衝鹽溶液、水及乳液(例如油/水乳液或水/油乳液)及各種潤濕劑。該等組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見Martin REMINGTON'S PHARM.SCI.,第18版(Mack Publ.公司，Easton(1990))。
「有效量」指一足以達成有益或期望結果之量。一有效量可於一或多次投藥、應用或劑量中施用。
本文所用「信號傳導」意指使不成熟或成熟樹突細胞與IFN－γ受體激動劑、TNF－α受體激動劑、CD40L多肽或其他CD40激動劑接觸。在一個實施例中，此等激動劑於外部提供，例如，於細胞培養基中提供。在另一實施例中，該多肽激動劑藉由用一編碼該多肽的核酸轉染不成熟或成熟的樹突細胞提供。或者，一核酸適配子激動劑可於培養基中或藉由轉染提供。在其中該(等)多肽係由用一編碼該多肽之核酸轉染樹突細胞提供的情況下，當轉譯編碼該多肽之mRNA而非當用核酸轉染時達成信號傳導。本發明之一態樣提供用於製備可在活體內及/或活體外誘發強免疫刺激反應的成熟樹突細胞(DC)富集群的方法。本文所用術語「成熟樹突細胞」意指與不成熟DC(iDC)相比展現出增強的協同刺激分子CD83細胞表面表現的樹突細胞。本發明之成熟DC既包括CD83＋ CCR7－ DC亦包括CD83＋ CCR7－ DC。可將該第二信號即一CD40激動劑給予不成熟的CD83－ CCR7－ DC或給予CD83＋ CCR7－ 成熟DC。
文獻(Schaft 2005,Bonehill 2004)提出，使用編碼抗原之RNA對DC加以成熟後電穿孔可產生具有更強的激發免疫反應效能之DC。因此，吾人開發出各種方法，藉由轉變為將編碼抗原及CD40L之RNA電穿孔至CD83＋ CCR7－ 成熟DC中(於表現型成熟後)而改變該「CD40L基本過程」(定義為用IFN－γ並隨後用CD40L向CD83－ 不成熟DC傳導信號)。在該實施例中，首先將DC用「炎症介體」TNF－α、IFN－γ及PGE2 在表現型上成熟，然後於18小時後將其用編碼抗原及CD40L之RNA電穿孔。因此，該新穎方法稱為「PME－CD40L」或用CD40L於成熟後電穿孔。活體外分析顯示，於電穿孔後4小時收穫並調配成疫苗的細胞可介導最大的免疫效能(參見實例)。作為另一改進之處，DC可用NKT細胞之激活配體即α－半乳糖基神經醯胺激發，以便募集該效應細胞群來引發免疫反應。NKT細胞同時展現T輔助細胞及T細胞毒性細胞之特徵：NKT細胞可分泌IFN－γ，呈遞CD40L，並且可分泌粒酶B，而粒酶B可於靶細胞中誘發細胞凋亡。因此，NKT細胞募集可由於額外的NKT細胞CD40L/DC－CD40相互作用而導致增強的DC功能，或藉由分泌輔助細胞因子及/或促成對靶細胞的直接裂解效應來增強細胞介導的免疫反應。
於依序向iDC傳導該第一信號(一IFN－γ受體激動劑或一TNF－α受體激動劑)及向CD83－ CCR7－ iDC或向CD83＋ CCR7－ 成熟DC傳導該第二信號(一CD40激動劑)後，所生成的DC(i)展現提高的協同刺激分子CD80、CD83及CD86之細胞表面表現，ii)係CCR7＋ ，及iii)分泌IL－12p70多肽或蛋白質，及/或分泌水平顯著降低的(0至500皮克/毫升/106 個DC)IL－10。IL－10及IL－12水平可藉由在自不成熟DC誘發DC成熟後至多36小時時收集的培養物上清液之ELISA測定。Wierda W.G.等人(2000)Blood 96：2917.Ajdary S等人(2000)Infection and Immunity 68：1760。
不成熟的DC可自一含有DC前體細胞並在活體外分化產生不成熟DC之適宜組織來源分離並製備。舉例而言，一適宜的組織來源或係骨髓細胞、外周血祖細胞(PBPC)、外周血幹細胞(PBSC)及臍帶血細胞中的一或多種。較佳地，該組織來源係一外周血單核細胞(PBMC)。該組織來源可係新鮮的或冷凍的。在另一態樣中，該等細胞或組織來源用一有效量的可促進非幹細胞或祖細胞之生長及分化的生長因子預處理，於是該等非幹細胞或祖細胞可更容易地與目標細胞分離。該等方法在此項技術中為人習知且簡略地闡述於Romani等人(1994)Exp.Med.180：83及Caux,C.等人(1996)Exp.Med.184：695中。在一態樣中，不成熟的DC自外周血單核細胞(PBMC)分離。在一較佳實施例中，於介白素4(IL－4)及/或IL－13存在或不存在下用一有效量之粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)處理該等PBMC，以使PBMC分化成不成熟DC。更佳地，於GM－CSF及IL－4之存在下培養PMBC約4至7天，較佳約5至6天，來產生不成熟DC。另外，於該第一及/或第二信號傳導時GM－CSF及IL－4及/或IL－13可存在於培養基中。
為增加動物(包括人類)樹突前體細胞之數量，可用刺激血細胞生成之物質對患者加以預處理。此等物質包括(但不限於)G－CSF及GM－CSF。熟習此項技術者可藉由監控接受造血因子之個體之細胞分化情況確定待施用的造血因子之量。通常，諸如G－CSF及GM－CSF等因子之劑量類似於用於治療自用細胞毒性劑處理恢復的個體的劑量。舉例而言，可於移取出源組織前以標準劑量施用GM－CSF或G－CSF 4至7天，以增加樹突細胞前體之比例。美國專利第6,475,483號教示，G－CSF以每日300微克之量給藥5至13天及GM－CSF以每日400微克之量給藥4至19天可產生顯著量的樹突細胞。
本發明方法可產生成熟CD83＋ CCR7＋ 樹突細胞富集群，其為強力免疫刺激劑。特定而言，本發明提供一種用於製備成熟樹突細胞(DC)之方法，其包括以下依序步驟：(a)用一包含干擾素γ受體(IFN－γR)激動劑之第一信號向經分離之不成熟樹突細胞(iDC)傳導信號，以產生經信號標誌樹突細胞；及(b)用一包含有效量CD40激動劑之第二瞬時信號向該等經IFN－γR激動劑信號標誌樹突細胞傳導信號，以產生CCR7＋ 成熟樹突細胞。本發明進一步提供CD83＋ CCR7－ 成熟DC及CD83＋ CCR7－ 成熟DC。在一個實施例中，本發明CD83＋ CCR7＋ 成熟DC可暫時性表現CD40L多肽。較佳地，CD40L主要位於細胞內，而非位於細胞表面上。最佳地，至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之CD40L多肽位於細胞內。
在一替代實施例中，係以一有效量之TNF－α受體激動劑及隨後一CD40激動劑信號向不成熟樹突細胞傳導信號。因此，本發明提供一種製備成熟樹突細胞(DCs)之方法，其包括依序以一包含一腫瘤壞死因子α受體(TNF－αR)激動劑之第一信號及隨後一包含一CD40激動劑之第二信號向經分離之不成熟樹突細胞傳導傳導信號，其中該信號傳導係於不存在有效量的IL－1β及/或IL－6之情況下進行。
對於兩個實施例中的任一個(以IFN－γR激動劑或TNF－αR激動劑作為第一信號)，皆可將該第二CD40激動劑信號給予CD83－ CCR7－ iDC或CD83＋ CCR7－ 成熟DC。在一較佳實施例，使不成熟DC及/或成熟DC與PGE2 接觸。較佳地，約在該等細胞接收該第一信號(一IFN－γR激動劑或TNF－αR激動劑)的同時使該等細胞與PGE2 接觸。在較佳實施例中，在該等樹突細胞接收該第一及第二信號時培養基中存在GM－CSF及IL－4或IL－13中的至少一個。在另外的實施例中，該方法進一步包括使不成熟的樹突細胞、經信號標誌樹突細胞及/或CCR7＋ 樹突細胞與一可激活CD1d限制性NKT細胞且因此可加強固有及過繼免疫力的NKT細胞配體接觸。在較佳實施例中，該NKT細胞配體係一選自由下列組成之群的化合物：α－半乳糖基神經醯胺、α葡糖神經醯胺、α－6－脫氧半乳糖基神經醯胺、α－6－脫氧呋喃半乳糖基神經醯胺、β－6－脫氧呋喃半乳糖基神經醯胺、β－阿糖基神經醯胺、α－C－半乳糖基神經醯胺及α－S－半乳糖基神經醯胺。一較佳化合物係α－半乳糖基神經醯胺，其稱為KRN7000((2S,3S,4R)－1－O－(α－D－吡喃半乳糖基)－2－(N－二十六烷酸基胺基)－1,3,4－十八碳三醇)。
揭示於日本專利第3068910號中之阿吉爾素(agelasphin)係最初於海綿中發現的一類化合物，其具有一α－半乳糖基神經醯胺(α－GalCer)結構及免疫刺激和抗腫瘤活性。KRN7000係阿吉爾素之有效合成類似物，其揭示於美國專利第5,767,092號中，該專利案之內容以引用方式併入。另外的阿吉爾素有用類似物揭示於美國專利第5,936,076號中，該專利案之內容以引用方式併入。KRN7000之結構如下所示：
KRN7000之糖基醯胺類似物(例如，α－半乳糖基神經醯胺、α－葡糖神經醯胺、α－6－脫氧半乳糖基神經醯胺、α－6－脫氧呋喃半乳糖基神經醯胺、β－6－脫氧呋喃半乳糖基神經醯胺、β－阿糖基神經醯胺)揭示於美國專利第5,849,716號中，該專利案之內容以引用方式併入。其內容以引用方式併入之美國專利第5,780,441號，揭示KRN7000之寡糖(二－、三－、四－、五－)衍生物。使用KRN7000及相關類似物來生成KRN7000抗原載DC並激活人類NKT細胞之方法揭示於美國專利申請案第09/721,768號及美國專利第6,531,453號中，兩者之內容皆明確地以引用方式併入。
其內容以引用方式併入之美國專利第5,936,076號揭示由下式代表之α－半乳糖基神經醯胺化合物：
其中脂肪酸鏈R代表：
其中R2 代表H或OH且X表示一自0至26的整數，或R代表－(CH2 )7 CH＝CH(CH2 )7 CH3 及R1 代表由以下(a)至(e)定義的取代基中的任一個(a)－CH2 (CH2 )Y CH3 (b)－CH(OH)(CH2 )Y CH3 (c)－CH(OH)(CH2 )Y CH(CH3 )2 (d)－CH＝CH(CH2 )Y CH (e)－CH(OH)(CH2 )Y CH(CH3 )CH2 CH3 其中Y表示一自5至17的整數。
WO 03/105769、U.S.2004/0127429(其內容以引用方式併入)及Shimieg J.等人，(2003)J.Exp.Med.198 1631－1641揭示α－C－糖脂之結構，其中諸如α－半乳糖基神經醯胺及α－葡糖神經醯胺等α－糖基醯胺之糖苷鍵上之氧原子由碳原子替代。一代表性化合物之結構示於下文中。
其內容併入本文中的WO 03/016326揭示具有諸如「C4」或「OCH」等截短的神經醯胺的KRN7000類似物，C4或OCH具有以下結構：
其內容以引用方式併入的美國專利第6,635,622號揭示α－C－、N或S－糖脂，其中半乳糖基神經醯胺之糖苷鍵上之氧原子由－(CH2 )a －CH＝CH－(CH2 )a ' －、－(CH2 )a －S(O)0 － 2 －CH2 －或－NHCH2 －替代，其中a及a'各自表示一0至5之整數且a＋a'係5或小於5。
在較佳實施例中，該IFN－γR激動劑係IFNγ或其生物活性片段。IFNγ較佳係一哺乳動物IFNγ，最佳係一人類IFNγ。人類IFNγ之cDNA及胺基酸序列分別於SEQ ID NO：5及6中顯示。IFNγ較佳具有SEQ ID NO：6中所示序列，或其片段。在一實施例中，IFN－γR包含一與SESQ ID NO：6具有至少80%之序列一致性之多肽。該IFN－γR激動劑較佳與SEQ ID NO：6具有至少85%、90%、95%、97%、98%或99%之序列一致性。檢測IFN－γR激動劑活性之方法為熟習此項技術者習知，且該等方法中的某些闡述於下文中。可藉由向培養基中添加一IFN－γR激動劑或藉由在樹宿細胞中表現該IFN－γR激動劑向不成熟的DC傳導信號。在一實施例中，用一編碼一IFN－γR激動劑例如SEQ ID NO：6或其生物活性片段之mRNA轉染DC。於是，信號傳導將於該mRNA在樹突細胞內轉譯時發生。最佳將該IFN－γR激動劑添加至含有不成熟DC之培養基中。在一較佳實施例中，該培養基進一步包含PGE2 及/或GM－CSF加IL－4或IL－13。
IFN－γ之受體具有兩個亞單位：IFN－γR1，即配體結合鏈(亦稱為α鏈)，及IFN－γR2，信號轉導鏈(亦稱為β鏈或輔助因子1)。該等蛋白質由位於不同染色體之不同基因(分別為IFNGR1 及IFNGR2 )編碼。當配體結合(或α)鏈與IFN－γ相互作用時，其二聚化並變得與兩個信號轉導(或β)鏈相關。受體裝配導致詹納斯(Janus)激酶JAK1及JAK2之激活及IFN－γR1細胞內區域上的一酪胺酸殘基之磷酸化。此導致STAT1(代表「信號轉導子及轉錄激活子」)之募集及磷酸化，STAT1形成同型二聚體並轉運至細胞核中激活多個IFN－γ－反應基因。於傳導信號後，該等配體結合鏈受到內在化並分裂。然後該等鏈再循環至細胞表面。Bach,E.A.等人(1997)Ann.Rev.Immunol.15,563－591；及Lammas,D.A,Casanova,J.L.和Kumararatne,D.S.(2000)Clin Exp Immunol 121,417－425.。人類IFN－γ與IFN－γRα之可溶性糖基化細胞部分(sIFN－γRα)之複合體之結晶結構已於2.9之解析度使用多波長異常繞射法測定。Thiel DJ等人Structure 8：927－936(2000)。
在一測定中，諸如IFN－γ等INF－γ受體激動劑於人類腸表皮Caco－2細胞中以一時間及濃度依賴方式降低Na＋ －K＋ －ATPase活性。Na＋ －K＋ －ATPase活性可測定為總的與烏本苷敏感性ATPase間的差異。用IFN－γ處理可顯著增強總的及磷酸化－STAT1之表現，此伴隨p38 MAPK之激活。p38 MAP激酶活性可使用p38 MAP激酶分析套組藉由西方點漬分析來分析。總的及磷酸化STAT1蛋白質水平使用PhosphoPlusStati測定。由IFN－γ啟動之轉導機制涉及PKC下游STAT1磷酸化及Raf－1、MEK、ERK2和p38 MAPK途徑之激活。參見Magro等人，Br J Pharmacol advance online publication,2004年7月26日；doi：10.1038/sj.bjp.0705895,其內容以引用方式併入。
出於舉例說明之目的，使用IFN－γ受體激動劑、TNF－α受體激動劑及/或CD40激動劑之信號傳導可藉由使一細胞分別直接與IFN－γ多肽及/或蛋白質及/或TNF－α多肽或蛋白質及/或CD40激動劑接觸提供。或者，用IFN－γR激動劑、TNF－αR激動劑或CD40激動劑向一細胞傳導信號可於在樹突細胞內轉譯編碼此等多肽或蛋白質之mRNA時發生。因此，信號傳導於表現IFN－γR激動劑、TNF－αR激動劑及CD40激動劑多肽及/或蛋白質時發生。
於本發明方法中使用的該第二信號係一使用一CD40激動劑之瞬時信號。一CD40激動劑多肽之持續表現，例如CD40L自一慢病毒載體之表現，如由Koya,R.C.等人(見上文)所述，並不視為瞬時表現(假定驅動此表現之啟動子係原構性的)。若該含有一CD40激動劑之培養基自該等DC移除，或若該等DC載有一編碼一CD40激動劑之mRNA，則該信號被視為瞬時信號。若該等DC用一編碼一CD40激動劑之表現載體加載/轉染或具有該表現載體，則該CD40激動劑信號亦可被視為瞬時信號，但須：1)在DC中驅動CD40激動劑表現之啟動子非原構性，或2)在DC中，該表現載體不整合至DC基因組中或另外複製。
在較佳實施例中，該CD40激動劑係一CD40L多肽或一CD40激動抗體。一般而言，結合CD40之配體起CD40激動劑作用。本申請案之申請者已證實，藉由用CD40L mRNA轉染不成熟或成熟的DC向細胞施用一包含CD40L之第二信號可隨後產生經修飾之DC，該等DC可誘發免疫刺激反應而非免疫抑制性反應。在一實施例中，於CD40L mRNA之轉染後及轉譯前即刻於含IFNγ(以及優選地PGE2 )之培養基中培養CD40L mRNA轉染的樹突細胞，以產生一有效量的CD40L信號。在該實施例中，儘管係於用CD40L mRNA轉染後添加IFNγ，但樹突細胞仍於該信號導致CD40L mRNA轉染前接收該IFNγ信號。因此，該等試劑遞送至細胞之順序之重要性僅在於CD40L信號傳導必須發生於IFN－γ信號傳導之後。如下文更詳細闡述，DC之信號傳導可於活體內或體外發生，或者該方法的一或多個步驟可於體外進行，而剩餘的步驟可於活體內進行。
在一實施例中，該CD40激動劑係一結合CD40之適配子。類似地，IFN－γ及TNF－α可由具有一類似生物活性之適配子、抗體及諸如此類替代。最佳地，該CD40激動劑以編碼CD40L之mRNA形式遞送。
本文所用「CD40配體(CD40L)」應涵蓋專一性地識別並激活CD40受體及激活其生物活性之任何多肽或蛋白質。該術語包括CD40L之跨膜及可溶形式。在較佳實施例中，該CD40激動劑係一哺乳動物CD40L，較佳一人類CD40L。人類與小鼠cDNA及蛋白質之比對分別顯示於圖16及17中。一人類CD40L cDNA及相應胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NOS：1及2中。CD40L之開放閱讀框由SEQ ID NO.1之核苷酸40至822代表，而TGA終止密碼子在位置823至825處。在本發明方法中亦有用者係截短的CD40L(SEQ ID NO：2之殘基47至261，由SEQ ID NO：1之核苷酸殘基178至825編碼)及由SEQ ID NO：1之核苷酸43至825、SEQ ID NO：1之181至825、SEQ ID NO：1之193至825、SEQ ID NO：1之376至825、SEQ ID NO：1之379至825及SEQ ID NO：1之400至825編碼的CD40L片段。在較佳實施例中，該CD40L多肽係選自由下列組成之群：a)一包含SEQ ID NO：2的多肽；b)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基47至261的多肽；c)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基51至261的多肽；d)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基120至261的多肽；e)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基113至261的多肽；f)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基112至261的多肽；g)一包含SEQ ID NO：10的多肽；及h)(a)至(g)中任何一個多肽之片段，其中該片段結合CD40。
較佳地，該CD40L多肽由一包含一選自由下列組成之群的多核苷酸的mRNA編碼：a)一包含SEQ ID NO：1的多核苷酸；b)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸40至822的多核苷酸；c)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸178至822的多核苷酸；d)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸190至822的多核苷酸；e)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸397至822的多核苷酸；f)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸376至822的多核苷酸；g)一包含SEQ ID NO：9的多核苷酸；h)一包含SEQ ID NO：13的多核苷酸；i)一與(a)至(h)之任一多核苷酸具有至少80%之序列一致性的多核苷酸；j)一於嚴格條件下與(a)至(h)之任一多核苷酸雜交的多核苷酸；及k)一(a)至(j)之多核苷酸，其進一步包括選自由SEQ ID NO：14、15、16、17或18之核酸組成之群的3'未轉譯序列，及/或一選自由SEQ ID NO：19、20、21、22或23之核酸組成之群的5'未轉譯序列。
或者，該CD40L多肽係一與一選自由下列組成之群的多肽具有至少77%之序列一致性的多肽：a)一包含SEQ ID NO：2的多肽；b)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基47至261的多肽；c)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基51至261的多肽；d)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基120至261的多肽；e)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基113至261的多肽；f)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基112至261的多肽；g)一包含SEQ ID NO：10的多肽；及h)(a)至(g)中之任一多肽之片段，其中該片段結合CD40。
CD40之特徵首先表現為一於B淋巴細胞上表現之受體。Schonbeck及Libby(2001)Cell Mol.Life Sci.58：4。後來發現，B細胞CD40與在激活的T細胞上表現之CD40L之接合對於T細胞依賴性B細胞激活(即增殖、免疫球蛋白分泌及類別轉換)必不可少。隨後揭示，功能性CD40於除B細胞外的多種細胞類型上表現，該等細胞類型包括造血祖細胞、T淋巴細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞、表皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、角質細胞、纖維母細胞及癌瘤。Schonbeck及Libby(2001)見上文。
該CD40配體於1993年選殖且由Gauchat等人於(1993)FEBS Lett.315：259中報導。Graf等人將其定位至染色體Xq26.3－q27.1(Graf等人(992)Eur.J.Immunol.22：3191－3194)。已闡述CD40配體之細胞相關全長39 kDa形式的分子量為33及18 kDa的更短可溶形式。Graf等人(1995)Eur.J.Immunol.25：1749；Ludewig等人(1996)Eur.J.Immunol.26：3137；Wykes等人(1998)Eur.J.Immunol.28：548。經由細胞內蛋白酶剪切產生的18 kDa可溶形式缺少胞質尾、跨膜區及細胞外區域的一部分，但保留CD40結合區域，其仍保留結合至CD40受體的能力，因此係CD40受體信號傳導試劑的一實例。Graf等人(1995)見上文。
美國專利第5,981,724號揭示編碼CD40配體(CD40L)之DNA序列以及載體，及用於產生CD40L多肽的經轉化宿主細胞。美國專利第5,962,406號揭示編碼CD40L之可溶形式的DNA序列。
該CD40受體亦可藉助CD40激動劑抗體、抗體片段、其衍生物及變體激活。CD40激動劑抗體可自諸如Mabtech(Nacka,Sweden)等廠家購得。產生該等試劑之實例及方法亦於下文提供。該文獻亦提供CD40激動劑抗體及抗體片段的實例。參見，例如Osada等人(2002)25(2)：176及Ledbetter,J.A.等人(1997)Crit.Reviews in Immunol.17：427。
如上所述，具有CD40L之生物活性的試劑可係一自一編碼CD40L之異源多核苷酸(mRNA或DNA)轉譯的多肽。舉例而言，該CD40L mRNA具有序列SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：3。或者，向該等細胞傳導一有效量的CD40L蛋白質及/或多肽(例如彼等具有序列SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：4者)信號。經修飾的CD40L亦可用於本發明之方法中。舉例而言，CD40L包括彼等具有任何數量胺基酸的已藉由添加、減去或取代(保守或非保守地)改變的分子，但須所生成的蛋白質結合DC表面上的CD40。「保守的改變」係一種產生具有類似電荷密度、親水性或疏水性、大小及/或構型的替代胺基酸的改變(例如Val替代Ile)。相反，「非保守的改變」係一種可產生具有不同的電荷密度、親水性或疏水性、大小及/或構型的替代胺基酸的改變(例如Val替代Phe)。實施此等修飾的方法在此項技術中眾所周知且亦可藉助市售套組及載體(例如彼等自New England Biolabs公司，Beverly,Mass.；Clontech,Palo Alto,Calif.獲得者)實現。
當該等試劑以編碼該等試劑之多核苷酸或基因形式遞送時，可藉由此項技術中熟知的任一方法複製一有效量的多核苷酸。PCR技術係一種用於複製DNA之方法且係美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號之標題物且闡述於PCR：THE POLYMERASE CHAIN REACTION(Mullis等人編輯，Birkhauser Press,Boston(1994))及其中引用的參考文獻。下文中提供用於產生多核苷酸之其他方法。
在其中不成熟之樹突細胞用一TNF－α受體之激動劑刺激並隨後用一CD40激動劑刺激的本發明實施例中，該方法於不存在一有效量之介白素1－β(IL－1β)及或介白素6(IL－6)下實施。此項技術中熟知用於測定諸如IL－1β及IL－6等蛋白質之存在的方法。
熟習此項技術者可藉由取樣一細胞或來自該群體的少量DC測定其是否存在表現CD40L mRNA及/或CD40L多肽的成熟DC來確定何時達成本發明之目標。在另一態樣中，本發明之成熟CD83＋ CCR7＋ DC表現介白素12(IL－12)p35蛋白質。在再一態樣中，成熟CD83＋ CCR7＋ DC表現IL－12 p70蛋白質，及/或表現有限的IL－10(不超過500皮克/毫升/106 DC)。
該方法之步驟可於活體內或體外實施。當於體外實施時，該方法可於一敞開或封閉的系統中實施。用於培養及富集細胞群之方法及系統在此項技術中為人習知。參見，美國專利公開案第2004/0072347號之實例1及2。亦參見美國專利公開案第2003/0235908號，其闡述用於細胞擴充之封閉系統。
在本發明之另一態樣中，藉由增加向不成熟或成熟DC遞送一有效量之抗原(該抗原然後受到處理並由成熟的DC遞呈)這一步對上述方法加以改進。因此，本發明之方法進一步包括向iDC、經信號標誌DC或CCR7＋ 成熟DC中引入一或多個抗原或編碼一或多個抗原之多核苷酸，以產生載有抗原的CCR7＋ 成熟DC。該抗原或編碼抗原的多核苷酸可於該第一信號之前引入。或者，該抗原或編碼抗原的多核苷酸於該第一信號之後及該第二信號之前遞送。在另一實施例中，該抗原或多核苷酸於該第二信號之後或實質與該第二信號同時遞送。
舉例而言，抗原包括(但不限於)病原體、病原體裂解物、病原體提取物、病原體多肽、病毒顆粒、細菌、蛋白質、多肽、癌細胞、癌細胞裂解物、癌細胞提取物、癌細胞專一性多肽。抗原可係天然存在的或以重組方式生成的抗原。可使用下文概述之此項技術中熟知的方法將該等免疫原作為多肽、蛋白質或作為核酸遞送至細胞。較佳地將一或多個編碼一或多個抗原之多核苷酸引入iDC、經信號標誌DC或CCR7＋ 成熟DC中。可藉由熟習此項技術者習知的方法將多核苷酸引入DC中。在一較佳實施例中，藉由電穿孔引入多核苷酸。最佳地，該多核苷酸係一mRNA。在較佳實施例中，抗原或編碼抗原之mRNA與一編碼一CD40激動劑之mRNA一起或實質與CD40激動劑信號傳導同時引入。
該等方法可進一步藉由使細胞與一有效量之細胞因子或協同刺激分子例如GM－CSF、IL－4及PGE2 接觸加以改進。在其中向不成熟的DC傳導一TNFαR激動劑信號並隨後傳導CD40激動劑信號的實施例中，培養物中明確地不包括有效量的IL－1β及/或IL－6。
抗原可以其「天然」形式遞送，此因為在製備該抗原或將該抗原引入至其於其中遭遇APC之環境中時不涉及人為干擾。另一選擇為或另外地，該抗原可包含一粗製劑，例如通常以一習用過敏預防針或以一腫瘤裂解物形式施用的製劑類型。或者，該抗原可實質上係純淨的，例如純度係至少約90%。
在該抗原係一肽之情況下，則其可(舉例而言)藉由分離出的蛋白質之蛋白酶剪切產生。可使用多種剪切劑中的任一種，包括(但不限於)胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。或者，肽可以化學方式合成，合成較佳於一此項技術中現有的自動合成儀上實施。並且，可利用重組技術來產生一編碼目標肽之核酸，並於期望條件下表現該肽。
或者，該抗原可具有一不同於任何天然存在化合物之結構。在某些本發明實施例中，該抗原係一「經修飾抗原」，因為該抗原具有一與天然存在抗原之結構實質相同但於一或多處偏離天然存在化合物之精確結構的結構。舉例而言，在該天然存在的抗原係一蛋白質或多肽抗原的情況下，則一經修飾的抗原與該蛋白質或多肽抗原相比將具有一在一或多個胺基酸之添加、取代或缺失方面不同於天然存在抗原的胺基酸序列，及/或將包括一或多個因添加、取代或缺失一或多個共價結合至該胺基酸的化學部分而不同於天然存在抗原中的對應胺基酸的胺基酸。在一態樣中，該等天然存在的抗原與經修飾的抗原共有至少一個由至少5個至少約75%相同的胺基酸構成的區域。熟習此項技術者將瞭解，在對兩個胺基酸序列加以比較以確定其一致性程度時，無需始終保持相同胺基酸之序列段(即由至少兩個構成之區域)間之間距。天然存在的與經修飾的蛋白質或多肽抗原在至少一個由至少5個胺基酸構成之區域之胺基酸序列上顯示至少約80%的一致性，或者85%、90%、95%以上或99%以上的一致性。通常，胺基酸的一更長的區域(例如10、20、50或100個胺基酸)顯示指定的一致性程度可能有用。
在較佳實施例中，該抗原以一編碼該抗原之多核苷酸或基因形式遞送，以使在接受治療之個體(此時於活體內遞送)或細胞培養系統(此時於活體外遞送)中該基因之表現導致抗原之產生。用於產生包括一可表現基因之核酸的技術及用於將此等核酸引入至一表現系統(在該系統中將產生由該可表現基因編碼的任何蛋白質)的技術在此項技術中為人習知且概述於下文中。較佳地，將一編碼該抗原之mRNA引入至DC中。
在一實施例中，係於該第一信號之前遞送該免疫原，其中該第一信號係一IFNγR激動劑或TNF－αR。或者，該免疫原於該第一信號之後及該第二信號之前遞送，或該免疫原於該第二信號之後遞送。在另一實施例中，該免疫原實質與該第二信號同時遞送。
如熟習此項技術者所容易地瞭解，於任一特定組合物或應用中採用的抗原量將取決於該特定抗原之性質及其所用於的應用之性質。
載有抗原的樹突細胞可用於激起一針對該(等)抗原之免疫反應。因此，在一態樣中，本發明提供一種於一患者體內激起一免疫反應之方法，其包括向該患者施用一有效量的載有免疫原CCR7＋ 成熟DC。該等經加載的DC對於該患者而言可係異體或自體DC。
本發明進一步提供一種刺激免疫效應細胞之方法，其包括於存在藉由本發明方法生成的載有抗原的CCR7＋ 成熟DC下培養該等細胞，以生成經刺激的免疫效應細胞。在另一實施例中，本發明提供一種增強患者體內免疫力之方法，其包括向該患者施用一有效量的此等經刺激的免疫效應細胞。
在本發明之另一態樣中，於活體外或活體內將一有效量之細胞因子及/或協同刺激分子遞送至細胞或患者體內。該等試劑可作為多肽、蛋白質或者作為編碼其之多核苷酸或基因遞送。細胞因子、協同刺激分子及趨化因子可作為不純製劑(例如表現細胞之內源或外源細胞因子基因之細胞之分離物)或呈一「純淨」形式提供。純製劑之純度較佳為至少約90%，或者另一選擇為，純度至少為約95%，或更進一步地，純度至少為約99%。或者，可提供編碼該等細胞因子或誘發劑之基因，以便基因表現在所治療個體或在另一自其可獲得用於施用至個體的受到表現的細胞因子或誘發劑之表現系統(例如，一活體外轉錄/轉譯系統或一宿主細胞)中導致細胞因子或誘發劑之產生。
在細胞因子及抗原皆欲遞送至一個體的情況下，它們可一起或分開提供。當其作為多肽或蛋白質遞送時，其可於一常用包膠器件中或藉助諸如共價鍵、氫鍵結、疏水性相互作用、凡得瓦(van der Waals)相互作用等物理聯合作用遞送。在一替代實施例中，該等化合物一起提供，並提供編碼二者之基因。舉例而言，二者之基因可作為同一核酸分子之一部分提供。在某些實施例中，可製備該核酸分子，使兩種因子皆自一個連續多核苷酸作為一其中細胞因子與抗原經由一肽鍵彼此共價結合的融合蛋白質表現。另一選擇為或另外地，該等基因可連接至相同或等效的對照序列，以便兩種基因皆反應於同一刺激而變得於個體內表現。此項技術中習知多種於不同條件下在不同宿主細胞內具有活性的不同對照序列。該等對照序列包括原構性對照序列、可誘發性對照序列、及可抑制性對照序列，其可根據本發明使用，但可誘發性或可抑制性序列對於其中需要對基因表現之時間節律加以額外控制的應用而言特別佳。
熟習此項技術者可瞭解，細胞因子及/或抗原之施用視情況可與諸如(舉列而言)一佐劑或其他免疫調節化合物等任何其他的期望免疫系統調節因子之施用相結合。
抗原亦可以編碼抗原之多核苷酸或基因形式遞送。抗原亦可藉助一肽鍵藉由將一來自一第一多肽(例如一第一抗原)之序列的一部分連接至一來自一第二多肽(例如，一第二抗原、一信號序列、一跨膜區域、一純化柄等)之序列的一部分加以修飾。熟習此項技術者可瞭解此等根據本發明使用之融合蛋白之遞送。重組技術進一步容許藉由胺基酸序列之取代、缺失、添加或倒置容易地修飾多肽或蛋白質抗原之胺基酸序列。
在該免疫原係一抗原之片段之情況下，其可(舉例而言)藉由分離出的蛋白質之蛋白酶剪切產生。可利用多種剪切劑中的任一種，包括(但不限於)胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。或者，肽可較佳於一此項技術中現有的自動合成儀上以化學方式合成(參見，例如，Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical公司，1984)。並且，可利用重組技術產生一編碼目標肽之核酸，並於期望條件下(例如，於一宿主細胞或一其可自該系統容易地純化的活體外表現系統中)表現該肽。
在較佳實施例中，該抗原係來自一癌細胞或病原體。較佳地，該贅生性細胞係一腎癌細胞、一多發性骨髓瘤細胞或一黑色素瘤細胞。優選病原體係HIV及HCV。在較佳實施例中，抗原以自一贅生性細胞或一病原體分離或衍生出的RNA形式遞送至抗原遞呈細胞中。自任何細胞(例如一贅生性細胞或病原體細胞)提取RNA之RT－PCR方法及活體外轉錄揭示於同在申請中之美國臨時專利申請案第60/525,076號中，該專利申請案之內容以引用方式併入。
根據本發明使用之抗原或係一天然存在的化合物或者可具有一不同於任何天然存在化合物之結構。在本發明之某些實施例中，該抗原係一「經修飾的抗原」，因為該抗原具有一與天然存在抗原實質相同但在一或多處偏離該天然存在化合物之精確結構的結構。
本發明亦提供藉由任一本文所述方法製備的成熟DC之富集群。藉由本發明方法製備之成熟DC具有增強的免疫刺激特性。在另一態樣中，本發明提供一種存儲一成熟DC富集群之方法，其包括使本發明之樹突細胞富集群於適宜的條件下與一適宜低溫保存劑接觸。
本文所述組合物可用於藉由向患者施用一有效量的諸如DC、經修飾DC或經育導免疫效應細胞等細胞富集群在患者中激起一免疫反應。該等細胞可係異體性或自體性細胞。其可施用至一患者以在該患者中誘發一免疫反應，包括向該患者施用一有效量的如上所述富集群。對於患者而言，該等細胞可係異體性或自體性細胞。其亦可用於藉由在存在本發明成熟DC下或以本發明成熟DC為代價培養免疫效應細胞來育導免疫效應細胞。亦可藉由向患者遞送一有效量的經育導效應細胞來使用該等細胞增強患者體內之免疫力。
根據上述說明，下列實例意欲舉例說明而非限制本發明之各態樣。
產生及遞送多核苷酸之方法
本發明之某些實施例需要使用多核苷酸。該等多核苷酸可使用此項技術中習知的任何方法產生及複製，舉例而言，熟習此項技術者可使用本文提供之序列及一市售DNA合成儀來複製DNA。或者，其可藉由以下獲得：提供該多核苷酸之直鏈序列、適宜的引物分子、諸如酵素等化學品及其複製所用指令，並以適當的取向以化學方式複製或連接該等核苷酸，以獲得多核苷酸。在一不同的實施例中，進一步分離該等多核苷酸。仍進一步地，熟習此項技術者可將多核苷酸插入一適宜複製載體中並將該載體插入一適宜宿主細胞(原核或真核)中進行複製及擴增。如此擴增之DNA可藉由熟習此項技術者習知的方法自細胞分離。本文進一步提供藉由該方法獲得多核苷酸之過程及如此獲得之多核苷酸。
在一實施例中，將試劑(例如CD40L)作為mRNA遞送。RNA可藉由以下獲得，首先將一DNA多核苷酸插入一適宜宿主細胞中，或較佳地藉由活體外轉錄獲得。DNA可藉由任何適宜方法插入，例如，藉助一適宜基因遞送媒介(例如脂質體、質粒或載體)或藉由電穿孔。細胞複製且DNA轉錄成RNA；然後可使用熟習此項技術者習知的方法分離出RNA，如於Sambrook等人(1989)見上文中所闡述。舉例而言，可根據Sambrook等人(1989)見上文中所列程序使用各種水解酵素或化學溶液分離或按照製造商提供之隨附說明用核酸結合樹脂提取。
在較佳實施例中，CD40L表現盒含有一適於活體外轉錄之啟動子，例如T7啟動子或SP6啟動子。較佳地，對在活體外轉錄的CD40L或CD40激動劑mRNA加以優化以達成轉譯之穩定性及效率。舉例而言，SEQ ID NO：13代表一優化CD40L mRNA，其中在5'未轉譯區中的ATG密碼子已改變以避免不恰當地引發轉譯。
mRNA穩定性及/或轉譯效率亦可藉由在mRNA中包含3'UTR及/或5'UTR提高。3'UTR之較佳實例係彼等來自人類CD40、β－肌動蛋白及輪狀病毒基因6者。5'UTR之較佳實例包括CD40L，以及在Hsp70、VEGF、脾臟壞死病毒RU5及煙草蝕斑病毒之5'UTR中的轉譯增強子。
舉例而言，CD40L表現通常部分由3'UTR介導的mRNA不穩定性調節，且因此CD40L 3'UTR之大部分不包含於當前之CD40L mRNA中。CD40L通常不於DC中表現。相反，CD40受體於DC中表現，文獻中沒有證據表明其表現於轉錄後受到調節，特別是在mRNA穩定性水平上。於CD40L mRNA之3'端或區域包含CD40受體3'UTR(SEQ ID NO：14，或其活性片段)將給出類似於天然存在的CD40信息的RNA3'未轉譯序列，同時不賦予任何不期望的調節活性。
β－肌動蛋白係一於人類非肌細胞中大量表現之基因。人類β－肌動蛋白促進子已廣泛用於在哺乳動物細胞系及轉基因小鼠中驅動基因表現。已證實肌動蛋白3'UTR加側接區域之納入可增加mRNA自含有β－肌動蛋白啟動子之基因表現構築體積聚之水平。Qin及Gunning(1997)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 36 pp.63－72。SEQ ID NO：15代表人類β－肌動蛋白3' UTR之最終外顯子之未轉譯區域。SEQ ID NO：16顯示該3'UTR之最小區域。
猿猴輪狀病毒基因6之3'UTR(SEQ ID NO：17)mRNA於其加帽的非聚腺苷酸化病毒轉錄體中具有轉譯增強子作用。亦已證實該3'UTR可於兔網織紅血球裂解物中增強異源報導mRNA之轉譯。Yang等人，2004 Archives of Virology 149：303－321。該3'UTR之最小功能元件顯示於SEQ ID NO：18中。
已證實人類hsp70基因之5' UTR(SEQ ID NO：19)可於不存在應激誘發之情況下增強報導mRNA之轉譯，同時不顯著影響信息穩定性。增強子功能已於多種人類細胞系中展示。Vivinus等人，2001 European Journal of Biochemistry 268：1908－1917。
小鼠VEGF 5' UTR(SEQ ID NO：20)增強一單順反子報導RNA之轉譯且亦具有IRES(內部核糖體進入位點)活性。其增強子活性已於大鼠、倉鼠及人類細胞系中展示。全長5'UTR係1014個核苷酸，但證實一163個核苷酸突變型(SEQ ID NO：21)活性更強。Stein等人1998 Molecular and Cellular Biology 18：3112－3119。
脾臟壞死病毒(SNV)係一鳥類逆轉錄病毒。該病毒5' LTR之RU5區域(SEQ ID NO：22)於人類293個細胞中刺激一非病毒報導RNA之轉譯效率。Roberts及Boris－Lawrie 2000 Journal of Virology 74：8111－8118。
煙草蝕斑病毒RNA之143核苷酸5'前導序列(SEQ ID NO：23)於植物及動物細胞系中促進報導mRNA之帽依賴性轉譯。儘管該前導序列不進一步增強加帽轉錄體之轉譯，但樹突細胞中之帽依賴性CD4L表現係活體內加帽的極富吸收力之替代選擇。Gallie等人(1995)Gene 165：233－238。Niepel及Gallie(1999)Journal of Virology 73：9080－9088。Gallie,Journal of Virology (2001)75：12141－12152。
樹突細胞可藉由此項技術中習知的方法用核酸轉染，該等方法包括(但不限於)磷酸鈣沉澱法、微注射法或電穿孔法。樹突細胞可單獨添加或與一適宜載劑例如一醫藥上可接受載劑(例如磷酸緩衝鹽溶液)組合。另一選擇為，或另外地，可將核酸併入一表現或插入載體中以併入該等細胞中。此項技術中習知同時含有多核苷酸可以可操作方式連接至其中的選殖位點及啟動子的載體。此等載體能於活體外或活體內轉錄RNA，且可自諸如Stratagene(La Jolla,CA)及Promega Biotech(Madison,WI)等來源購得。為最優化表現及/或活體外轉錄，可能需去除、添加或改變選殖株之5'及/或3'未轉譯部分以消除額外的潛在不適宜替代轉譯啟始密碼子或其他可能在轉錄或轉譯水平干擾或降低表現之序列。或者，可緊鄰起始密碼子之5'插入一致核糖體結合位點以增強表現。載體之實例係病毒，例如杆狀病毒及逆轉錄病毒，噬菌體、腺病毒、腺相關病毒、黏粒、質粒、真菌載體及及其他通常用於此項技術中的重組媒介，已闡述其用於在多種真核及原核宿主中表現且可用於基因療法以及用於簡單的蛋白質表現。
其中有數種非病毒載體，包括DNA/脂質體複合體及靶向病毒蛋白質DNA複合體。為增強向一細胞之遞送，本發明之核酸或蛋白質可共軛結合至與細胞表面抗原結合之抗體或其結合片段。亦包含一靶向抗體或其片段之脂質體可用於本發明之方法中。本發明亦提供用於本文所揭示方法中之靶向複合體。
使用此項技術中習知的方法將多核苷酸插入載體基因組中。舉例而言，可使插入片段及載體DNA於適宜條件下與一限制酵素接觸，以於每一分子上產生彼此配對且可用一連接酶結合在一起的互補端。或者，合成核酸連接子可連接至限制多核苷酸之終端。該等合成連接子含有對應於載體DNA中一特定限制位點之核酸序列。另外，可連接一含有一終止密碼子及一適宜限制位點之寡核苷酸，以插入一含有(例如)下列中的某些或全部的載體中：一用於哺乳動物細胞中穩定或瞬時轉染子之選擇的可選擇標記基因，例如新黴素基因；用於高水平轉錄的來自人類CMV之立即早期基因的增強子/啟動子序列；用於mRNA穩定之來自SV4O之轉錄終止及RNA處理信號；用於恰當附加型複製的SV4O多瘤病毒複製源及ColE1；多種多選殖位點；及用於有義和反義RNA之活體外轉錄的T7和SP6 RNA啟動子。此項技術中習知並擁用其他方法。
蛋白質及多肽之製備及分離
多肽及蛋白質係本發明各種方法中所必需之組份。蛋白質及多肽可使用諸如彼等由Perkin Elmer/Applied Biosystems公司，430A或431A型，Foster City,CA,USA製造的合成儀等市售自動肽合成儀藉由化學合成獲得。可對該等合成的蛋白質或多肽加以沉澱並進一步純化，例如藉由高效液相層析法(HPLC)。或者，該等蛋白質及多肽可使用下述宿主細胞及載體系統藉由如本文所述的習知重組方法獲得。
熟習此項技術者習知可對任何肽加以修飾以使其具有改變的性質。本文所用術語「胺基酸」指天然及/或非天然的或合成的胺基酸，包括甘胺酸及D和L旋光異構體二者，及胺基酸類似物和擬肽物質。一由三個或以上的胺基酸構成之肽若肽鏈較短則通常稱為寡肽。若肽鏈較長，則該肽通常稱為多肽或蛋白質。用於本發明之肽可經修飾，以包括非天然的胺基酸。因此，該等肽可包含D胺基酸、D與L胺基酸之組合以及各種「設計」胺基酸(例如，β－甲基胺基酸、C－α－甲基胺基酸及N－α－甲基胺基酸等)來將特定性質轉予肽。另外，藉由在特定結合步驟配位特定的胺基酸可產生具有α－螺旋β轉角、β折疊、γ－轉角之肽及環狀肽。在另一實施例中，將選擇可賦予有用的化學及結構性質之肽之亞單位。舉例而言，包含D胺基酸之肽可於活體內對L胺基酸專一性蛋白酶具有抗性。可合成具有D胺基酸的經修飾化合物，使胺基酸次序顛倒地配位，以產生作為retro－inverso肽之本發明肽。另外，本發明預期製備具有更明確地規定的結構性質之肽，以及使用擬肽物質及擬肽物質鍵(例如酯鍵)來製備具有新穎性質的肽。在另一實施例中，可產生一併入一經還原的肽鍵即R1 －CH2 NH－R2 之肽，其中R1 及R2 係胺基酸殘基或序列。一經還原的肽鍵可作為一二肽亞單位引入。此一分子將對肽鍵水解(例如蛋白酶活性)具有抗性。此等分子將提供具有獨特功能及活性的肽，例如因對代謝分解或蛋白酶活性具有抗性而在活體內之半衰期延長。此外，眾所周知，在某些系統中，受限制的肽顯示增強的功能活性(Hruby(1982)Life Sciences 31：189－199及Hruby等人 (1990)Biochem 3.268：249－262)；本發明提供一種生產一在所有其他位置併入隨機序列的受限制肽的方法。
分離幹細胞之方法
此項技術中習知多種用於分離幹細胞以進行活體外擴充及分化的方法。下列闡述內容僅係出於舉例說明之目的，而絕非意欲限制本發明之範圍。
幹細胞可藉由用結合不期望細胞之抗體(例如CD4＋ 及CD8＋ (T細胞)、CD45＋ (panB細胞)及GR－1)淘選骨髓細胞來分離。關於該方案之詳細闡述，參見Inaba等人 (1992)3.Exp.Med.176：1693－1702。
人類CD34＋ 細胞可自多種來源獲得，包括臍帶血、骨髓及流通外周血液。CD34＋ 細胞之純化可藉由抗體親和程序達成。參見，舉例而言，Paczesny等人 (2004)3 Exp Med.199：1503－11；Ho等人(1995)Stem Cells 13(suppl.3)：100－105；Brenner(1993)Journal of Hematotherapy 2：7－17；以及Yu等人(1995)PNAS 92：699－703。
DC亦可於GM－CSF＋IL－4之保護下自外周血中常見的但非增殖的CD14＋ 前體(單核細胞)產生(參見，例如WO 97/29182)。該方法闡述於Sallusto,F.及Lanzavecchia,A.(1994)J.Exp.Med.179：1109以及Romani,N.等人(1994)J.Exp.Med.180：83中。簡言之，CD14＋ 前體十分充足，因此據報導在大多數情況下無需用細胞因子例如G－CSF(用於增加外周血中之CD34＋ 細胞及更定向的前體)對患者加以予處理(Romani,N.等人(1996)J.Im munol.Methods 196：137)。另有人報導，由該方法產生之DC似乎具有相當大之一致性且可呈不成熟狀態或完全分化的或成熟狀態產生。已證明，藉由使用自體單核細胞調節的培養基作為成熟刺激可避免諸如FCS(f胎牛血清)等非人類蛋白質並獲得完全且不可逆地成熟而穩定的DC(Romani,N.等人(1996)Immunol.Methods 196：137；Bender,A.等人(1996)J.Immunol.Methods 196：121)。然而，與本發明不同，該等研究未產生具有增加的IL－12水平及/或降低的IL－10水平的成熟DC。
使幹細胞分化成不成熟的樹突細胞
藉由用適宜的細胞因子培養幹細胞可使幹細胞分化成樹突細胞。Inaba等人 (1994)見上文，闡述藉由用鼠科動物GM－CSF培養幹細胞使鼠科動物幹細胞於活體外分化成樹突細胞。簡言之，於標準RPMI生長培養基中用介於1與200奈克/毫升間之鼠科動物GM－CSF且較佳約20奈克/毫升之GM－CSF培養分離出的幹細胞。約每隔一天用新鮮的培養基更換培養基。7天後，在培養物，大部分細胞為樹突細胞，如藉由表面標記之表現及形態所評定。藉由螢光激活細胞分選(FACS)或藉由其他標準方法分離出樹突細胞。
人類細胞CD34＋ 造血幹細胞較佳藉由用人類GM－CSF及TNF－α培養該等細胞於活體外分化。參見，舉例而言，Szabolcs等人(1995)154：5851－5861。
對於小鼠DC，鼠科動物幹細胞可藉由在具有鼠科動物GM－CSF之培養物培養該等幹細胞而分化成樹突細胞。通常，培養物中GM－CSF之濃度係至少約0.2奈克/毫升，較佳係至少約1奈克/毫升。通常該範圍將在約20奈克/毫升與200奈克/毫升之間。在許多較佳實施例中，該劑量將係約100奈克/毫升。可視情況以類似劑量範圍添加IL－4來製備鼠科動物DC。
當轉導人類細胞時，以類似範圍使用人類GM－CSF，亦添加TNF－α來促進分化。TNF－α通常亦以約相同的範圍添加。視情況，以類似的劑量範圍添加SCF或其他增殖配體(例如F1t3)來製備人類DC。
如熟習此項技術者所明瞭，用於分化幹細胞之所有上述劑量範圍皆係約數。不同之供應商提供之細胞因子及同一供應商之不同批次之細胞因子在細胞因子活性上存在差異。熟習此項技術者可容易地用滴定法量測每一細胞因子，此可用於確定任一特定細胞因子之最佳劑量。
T細胞之分離及擴充
在某些本發明方法中，自哺乳動物分離T細胞，以便可於活體外用成熟的經修飾DC對其加以育導(或激活)。在一方法中，根據既定程序使用Ficoll－Hypaque密度梯度離心自紅血球及嗜中性粒細胞分離PBMC。用補加有1%胎牛血清(FBS)之經修飾AIM－V(其由AIM－V(GIBCO)及2 mM穀胺醯胺、10微克/毫升硫酸慶大黴素、50微克/毫升鏈黴素組成)洗滌該等細胞。根據標準技術藉由用結合至管柱或磁珠之適宜單株抗體實施負性或陽性選擇來富集T細胞。分析一等份細胞之細胞表面表現型，包括CD4、CD8、CD3及CD14。
僅出於舉例說明之目的，洗滌細胞並將其以約5 X 105 個細胞/毫升如上經修飾且含有5% FBS及100 U/毫升重組IL－2(rIL－2)的AIM－V(補加AIM－V)的濃度重懸浮。在該等細胞係自一HIV＋ 患者分離的情況下，向細胞培養物中添加25 nM CD4－PE4O(一由HIV－1－結合CD4區域與綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A之易位及ADP－核糖基化區域結合而構成的重組蛋白質)或選擇性地與HIV雜交的其他類似重組細胞毒性分子，以進行剩餘的細胞擴充，來選擇性地自培養物移除受HIV感染的細胞。巳證明，CD4－PE4O可抑制受HIV感染的細胞培養物中p24之生成並選擇性地殺死受HIV－1感染的細胞。
為刺激增殖，可添加OKT3單株抗體(Ortho Diagnostics)至10奈克/毫升的濃度，並將細胞塗佈於24孔板中(0.5毫升/加樣孔)。於約37℃之溫度下於一具有5% CO2 之濕潤培養器中培養該等細胞48小時。自細胞抽吸出培養基並向1毫升含有載體之上清液(如下所述)中補加5微升/毫升硫酸魚精蛋白、100 U/毫升rIL－2、100 U/毫升青黴素、0.25微克/毫升兩性黴素B/毫升及一額外的100微克/毫升鏈黴素(可添加25 nM CD4－PE4O)。
在另一態樣中，可使用細胞表面標記來分離實施本發明方法所需的細胞。舉例而言，人類幹細胞通常表現CD34抗原，而DC表現MHC分子及協同刺激分子(例如B7－1及B7－2)，無對粒細胞、NK細胞、B細胞及T細胞具有專一性之標記。表面標記之表現便於該等細胞之識別及純化。該等識別及分離方法包括FACS、管柱層析、用磁株淘選、西方點漬分析、放射線照射術、電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析及諸如此類，以及各種免疫方法，例如液體或凝膠沉澱素反應、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酵素聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫螢光測定及諸如此類。關於免疫及免疫測定程序之概括評論，參見Stites及Terr(編輯)1991 Basic and Clinical Immunology(第7版)以及Paul見上文。關於如何製備針對所選抗原之抗體，參見Harlow及Lane(1989)見上文。
細胞分離或於細胞純化期間用於檢測細胞之免疫測定可以數種配置中的任一種實施，例如彼等於下列文獻中評述者：Maggio(編輯)(1980)Enzyme Immunoassay CRC Press,Boca Raton,Fla.；Tijan(1985)「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,」Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam；Harlow及Lane，見上文；Chan(編輯)(1987)Immunoassay：A Practical Guide Academic Press,Orlando,Fla.；Price及Newman(編輯)(1991)Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press,NY；以及Ngo(編輯)(1988)Non－isotopic Immunoassays Plenum Press,NY。
細胞可藉由諸如FACS分析等流式細胞術分離及定性。習知多種流式細胞術方法。關於螢光激活流式細胞術，參見，舉例而言，Abbas等人 (1991)Cellular and Molecular immunology W.B.Saunders Company,尤其是第3章，以及Kuby(1992)Immunology W.H.Freeman and Company，尤其是第6章。FACS機器可自(例如)Becton Dickinson獲得。
可用於標細胞抗原之標記劑包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、蛋白質、或其他聚合物，例如親和基質、碳水化合物或脂質。檢測可藉由任何習知方法實施，例如免疫印跡法、西方點漬分析、放射活性或生物發光標記之追蹤、毛細管電泳或其他根據大小、電荷或親和力追蹤分子之方法。
抗體
該方法之某些態樣需要使用抗體。此等抗體可係單株或多株抗體。其可係抗體衍生物或抗體變體。其可係嵌合抗體、人源化抗體或完全人類抗體。使用一蛋白質或多肽，熟習此項技術者可另外產生專一性地結合至受體的抗體。亦可使用抗體之功能片段或衍生物，包括Fab、Fab'、Fab2、Fab'2及單鏈可變區域。抗體可於細胞培養物中、於噬菌體中或於各種動物中產生，該等動物包括(但不限於)牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、綿羊、犬、貓、猴子、黑猩猩、猿等。只要該片段或衍生物保留結合蛋白質或其片段之專一性，其就可使用。可藉由在一給定條件組下對與適宜抗原之結合和與不相關抗原或抗原混合物之結合加以比較來檢測抗體之結合專一性。若該抗體與適宜抗原之結合係與不相關抗原或抗原混合物之結合的至少2、5、7及較佳地10倍，則該抗體被視為具有專一性。
此項技術中習知用於製備此等部分至全人類抗體之技術，可使用此等技術中的任一技術。根據一實施例，全人類抗體序列於一已受到改造而表現人類重及輕鏈抗體基因的轉基因小鼠中製備。已獲得可產生不同種類抗體的多個品系的此等轉基因小鼠。可對來自轉基因小鼠的可產生一期望抗體的B細胞加以融合來製備雜交瘤細胞系，用以持續地產生期望的抗體。參見，舉例而言，Russel,N.D.等人(2000)Infection and Immunity 2000年4月：1820－1826；Gallo,M.L.等人(2000)European J.of Immun.30：534－540；Green,L.L.(1999)J.of Immun.Methods 231：11－23；Yang,X－D等人(1999A)J.of Leukocyte BioIogy 66：401－410；Yang,X－D(1999B)Cancer Research 59(6)：1236－1243；Jakobovits,A.(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31：33－42；Green,L.及Jakobovits,A.(1998)3.Exp.Med.188(3)：483－495；iakobovits,A.(1998)Exp.Opin.Invest.Drugs 7.(4)：607－614；Tsuda,H.等人(1997)Genomics 42：413－421；Sherman－Gold,R.(1997).Genetic Engineering News 17(14)；Mendez,M.等人(1997)Nature Genetics 15：146－156；Jakobovits,A.(1996)WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,THE INTEGRATED IMMUNE SYSTEM VOL.IV,194.1－194.7；Jakobovits,A.(1995)Current Opinion in Biotechnology 6：561－566；Mendez,M.等人(1995)Genomics 26：294－307；Jakobovits,A.(1994)Current Biology 4(8)：761－763；Arbones,M.等人(1994)Immunity 1(4)：247－260；iakobovits,A.(1993)Nature 362(6417)：255－258；Jakobovits,A.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(6)：2551－2555；Kucherlapati等人，美國專利第6,075,181號。
亦可使用噬菌體展示技術製備抗體。此等技術可用於分離起始抗體或用於產生具有改變的專一性或抗體親抗原性特徵的變體。方便時亦可使用單鏈Fv。若需要，其可自接種疫苗之轉基因小鼠製得。
本發明抗體亦可加以修飾產生嵌合抗體。嵌合抗體係彼等其中抗體之重及輕鏈之不同區域係由一種以上物種DNA所編碼之抗體。參見，例如，美國專利第4,816,567號。
術語「抗體變體」亦包括「雙抗體」，雙抗體係具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中片段包含一連接至一輕鏈可變區域(VL)的重鏈可變區域(VH)，二者位於同一多肽鏈中(VHVL)。參見，舉例而言，歐洲專利第404,097號；WO 93/11161；及Hollinger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444－6448。藉助一因過短而不允許同一鏈上之兩個區域間之配對的連接子，迫使該等區域與另一鏈上之互補區域配對並產生兩個抗原結合位點。亦參見頒予Chen等人之美國專利第6,632,926號，其揭示將一或多個胺基酸插入親代抗體之超變區的抗體變體，並且該等抗體變體對靶抗原之結合親和力係親代抗體對該抗原結合親和力的至少約2倍。該術語亦包括抗體或片段轉譯後修飾成直鏈多肽序列。
術語「抗體變體」進一步包括「直鏈抗體」。製備直鏈抗體之程序在此項技術中為人習知且闡述於Zapata等人(1995)Protein Eng.8(10)：1057－1062中。簡言之，該等抗體包含一組串聯Fd區段(VH~CH 1－VH－CH1)，其形成一組抗原結合區域。直鏈抗體具有雙專一性或單專一性。
檢測核酸之方法
已知多種用於定量目標基因(例如CD40L及/或IL－12p35)之表現的方法，該等方法包括(但不限於)雜交測定法(北方墨點分析)及基於PCR之雜交測定法。
於測定在mRNA水平例如IL－12p35 mRNA或CD40L mRNA之改變時，首先提取一試樣中所含的核酸。舉例而言，mRNA可根據Sambrook等人(1989)見上文中所述程序使用各種水解酵素或化學溶液分離或按照製造商提供之隨附說明用市售核酸結合樹脂提取。然後根據標準程序藉由雜交(例如北方墨點分析)及/或擴增程序分別使用核酸探針及/或引物檢測所提取的核酸試樣中所含的mRNA。
在診斷方法中，可使用具有至少10個核苷酸且展示出與待檢測核酸具有序列互補性或一致性之核酸分子作為雜交探針或引物。此項技術中習知，對於一專一性雜交而言不需要一「完美匹配的」探針。由少量鹼基之取代、缺失或插入於探針序列中達成的微小改變不影響雜交專一性。一般而言，可容忍20%之多的鹼基對失配(當最優地比對時)。舉例而言，一用於測定CD40L mRNA之探針與一先前鑑別出的序列中所含具有相當大小之同源區域具有至少約80%之一致性，例如，參見SEQ ID NO：1或3。或者，於比對同源區域後，該探針與相應基因序列至少85%或甚至至少90%相同。片段總的大小以及互補序列段之大小將視特定核酸區段之預期用途或應用而定。更小之基因片段通常用於雜交實施例中，其中互補區域之長度可根據期望檢測的互補序列而變化，例如在約10與約100個核苷酸之間，或甚至為全長。
具有長度大於約10個核苷酸之互補序列段之核苷酸探針將增加雜合體之穩定性及選擇性，藉此可提高所獲得特定雜交分子之專一性。可設計具有長度為大於約25個且甚至更佳大於約50個核苷酸或若需要甚至更長之基因互補序列段的核酸分子。此等片段可容易地藉由以下製備：舉例而言，藉由化學方式直接合成片段，藉由應用核酸複製技術，例如於美國專利第4,603,102號中所述的使用兩個活化寡核苷酸的PCRTM技術，或藉由將所選序列引入重組載體中進行重組生產。
在某些實施例中，有利情況係使用本發明核酸序列與一用於檢測雜交且因此檢測互補序列之適宜試劑(例如一標記物)的組合。此項技術中習知多種適宜的指示劑，包括螢光指示劑、放射活性指示劑、酵素催化指示劑或其他配體，例如親和素/生物素，該等指示劑能給出一可檢測信號。亦可使用一螢光標記的或一酵素標簽例如脲酶、鹼性磷酸酶或過氧化物酶來代替放射活性試劑的或其他對環境有害的試劑。在使用酵素標簽之情況下，已知色度指示劑(能使用其來提供人類肉眼或通過分光光度方式可見的試劑)可識別與含互補核酸的試樣之專一性雜交。
雜交反應可於具有不同「嚴格度」之條件下實施。相關條件包括溫度、離子強度、培養時間、反應混合物中額外溶質(例如甲醯胺)之存在、以及洗滌程序。較高之嚴格條件係彼等條件，例如較高的溫度及較低的鈉離子濃度，要形成一穩定的雜交複合體需要雜交元件間具有較高的最小互補性。增加雜交反應之嚴格性的條件廣為人知且在此項技術中公開。參見，Sambrook等人(1989)見上文。亦可使用定量PCR或高通量分析例如基因表現之系列分析(SAGE)(如Velculescu,V.等人(1995)Science 270：484－487中所述)檢測及定量mRNA水平或其表現。簡言之，該方法包括自疑含有轉錄體之細胞或組織試樣分離多種mRNA。視情況，可將該等基因轉錄體轉變成cDNA。使基因轉錄體之採集試樣經受序列專一性分析並對其加以定量。將該等基因轉錄體序列豐度與包含患病及健康患者之正常數據組之參考數據庫序列豐度加以比較。患者患有其數據組與之最密切相關之疾病，且對於該應用，包括轉錄體之差異。
在某些態樣中，可能需要使用多核苷酸作為核苷酸探針或引物來擴增及檢測基因或基因轉錄體。一用於檢測差異表現mRNA之引物與一基因或多核苷酸的具有相當大小之同源區域係至少約80%相同。對於本發明而言，擴增意指利用一能以合理的保真性複製一靶序列的引物依賴性聚合酶的任何方法。擴增可用天然或重組DNA－聚合酶例如T7 DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶之克列諾(Klenow)片段、以及反轉錄酶實施。
PCR之一般程序教示於MacPherson等人，PCR：A PRACTICAL APPROACH,(IRL Press at Oxford University Press(1991))中。然而，用於各應用反應之PCR條件根據經驗確定。多種參數影響反應之成功。其中有退火溫度及時間、伸展時間、Mg2 ＋ ATP濃度、pH，及引物、模板和脫氧核糖核苷酸之相對濃度。
擴增後，所得DNA片段可藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測並隨後用溴化乙錠染色及紫外光照明觀察。受到差異表現之目標基因之專一性擴增可藉由證明擴增後之DNA片段具有預期大小、展示斷定的限制消化模式、及/或與恰當選殖的DNA序列雜交來證實。熟習此項技術者習知用於檢測基因表現之其他方法。參見，舉例而言，國際PCI申請案第WO 97/10365號、美國專利第5,405,783號、第5,412,087號及第5,445,934號、第5,405,783號、第5,412,087號、第5,445,934號、第5,578,832號、第5,631,734號；以及LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY,Vol.24：Hybridization with Nucleic Acid Probes,P.Tijssen，編輯Elsevier,N.Y.(1993)。
檢測及定量蛋白質或多肽之方法
此項技術中有多種技術可用於蛋白質分析，該等技術包括(但不限於)放射免疫測定、ELISA(酵素聯免疫吸附測定)、「夾心式」免疫測定、免疫放射測定、原位免疫測定(使用例如膠體金、酵素或放射性同位素標記物)、西方點漬分析、免疫沉澱測定、免疫螢光測定以及PAGE－SDS。
體外療法
如上所述，本發明亦提供使用藉由本發明方法產生的樹突細胞或經育導T細胞之體外治療方法。舉例而言，用一免疫原轉化之樹突細胞可用於在活體外激活細胞毒性和輔助T細胞。或者，可將轉化後的樹突細胞引入一哺乳動物體內以在活體內激活T細胞。另外，可將在活體外育導之T細胞引入一哺乳動物體內，在哺乳動物體內，該等T細胞對I類MHC分子上具有抗原性肽(對應於T細胞受到激活而識別的彼等)之靶細胞具有細胞毒性。該等靶細胞通常為癌細胞，或受感染的細胞，該等細胞於其MHC I類表面上表現獨特的抗原性肽。
類似地，在MHC II類之環境下識別抗原性肽之輔助T細胞亦可受到在I類及II類MHC兩種環境下皆包含抗原性肽的本發明DC的刺激。輔助T細胞亦刺激一抗一靶細胞之免疫反應。如同細胞毒性T細胞一樣，可於活體外或活體內用重組DC刺激輔助T細胞。
樹突細胞及T細胞可自向其中投與DC及/或激活的T細胞的哺乳動物分離。或者，該等細胞可係自一供體提供或儲存於一細胞庫(例如，一血液庫)中之異體細胞。
活體內療法
可將由本發明方法產生之T細胞或樹突細胞直接施用至患者以產生一有效對抗一所選免疫原之T細胞。施用可藉由此項技術中習知的方法實施以成功地遞送一細胞，使之與一患者之血液或組織細胞最大程度地接觸。
該等細胞可以任何適宜方法施用，通常與醫藥上可接受的載劑一起施用。已有向一患者施用本發明細胞之適宜方法，並且，儘管可使用一種以上的途徑來施用一特定的細胞組合物，但一特定途徑通常可提供一較另一途徑更直接且更有效的反應。
醫藥上可接受載劑部分由所施用的特定組合物決定，以及由用於施用該組合物之特定方法決定。因此，本發明之醫藥組合物之適宜調配形式有多種。最典型地，實施品質控制(微生物術，選殖發生測定、存活率檢測)，並將細胞重新輸注回患者體內，之前施用苯海拉明及氫化可的松。參見，舉例而言，Korbling,M.等人(1986)Blood 67：529－532以及Haas等人(1990)Exp.Hematol.18：94－98。
調配物適合於非經腸施用，例如(舉例而言)，關節內(於關節中)、靜脈內、肌內、皮內、腹膜腔內、節點內及皮下途徑，且載劑包括：等滲無菌注射水溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及賦予該調配物以與預期接受者之血液等滲性的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。皮內及靜脈內施用係施用本發明DC或T細胞之首選方法。
施用至患者之細胞(例如，激活的T細胞，或樹突細胞)之劑量係一有效量，可隨時間於患者體內達成期望的有益治療反應，或抑制癌細胞之生長，或抑制感染。
僅出於舉例說明之目的，該方法可藉由以下實施：於輸注以進行隨後的分析及比較之前獲得並保存來自患者之血樣。通常將至少約104 至106 且通常在1 X 108 與1 X 101 0 之間的細胞經大約60至120分鐘靜脈內或腹膜腔內輸注至一70公斤的患者體內。在一態樣中，施用係藉由靜脈輸注實施。藉由脈動式血氧計密切監測生命指徵及氧飽和情況。輸注後5分鐘及1小時獲得血樣並保存以留待分析。大致每個月重複細胞再輸注，在一年內共實施10至12次治療。於第一次治療後，可由臨床醫師在門診患者基礎上自行實施輸注。若該再輸注為一門診患者再輸注，則於治療後監測參與者至少4小時。
對於施用，本發明之細胞能夠以一由細胞類型之LD－50(或其他毒性量度)及如根據患者之質量及總體健康狀況施加的不同濃度細胞類型之副作用決定的速度施用。施用可經由單次或分次劑量實現。本發明之細胞可輔助藉由習知習用療法的對疾病之其他治療，包括細胞毒性劑、核苷酸類似物及生物反應調節劑。類似地，對於用本發明之DC或激活的T細胞進行的治療，可視情況添加生物反應調節劑。舉例而言，該等細胞視情況可與一佐劑或諸如GM－CSF、IL－12或IL－2等細胞因子一起施用。
活體外測定及套組
本發明提供市售套組來實施本發明之成熟方法。在一態樣中，該套組包含：IFNγ多肽，或一用於在活體內或活體外表現IFNγ mRNA之表現盒，以及CD40L多肽，或一在CD40L之活體內或活體外表現中用於表現CD40L mRNA之表現盒。在另一態樣中，該套組包含：TNFα多肽，或一用於在活體內或活體外表現TNFα mRNA之表現盒，及一CD40L多肽，或一在CD40L之活體內或活體外表現中用於表現CD40L mRNA之表現盒。該等套組可進一步包含一用於活體外轉錄之RNA聚合酶。
評價免疫原性之方法
藉由本發明方法生成之抗原遞呈細胞或經育導T細胞之免疫原性可藉由包括(但不限於)下列之習知方法測定： 51 Cr－釋放裂解測定 可比較抗原專一性T細胞對由肽激發的5 1 Cr標記靶之裂解作用。「活性更強的」組合物將顯示更強的隨時間而變化的靶裂解作用。可使用裂解動力學以及於一固定時刻(例如4小時)之總靶裂解狀況來評價性能。Ware等人(1983)3 .Immunol.131：1312。
細胞因子釋放測定 對T細胞與經修飾APC接觸時所分泌細胞因子之類型及數量之分析結果可係功能活性的一量度。可用ELISA或ELISPOT測定來量測細胞因子，以確定細胞因子產生之速率及總量。Fujihashi等人(1993)J.Immunol.Meth.160：181；Tanquay及Killion(1994)Lymphokine Cytokine Res.13：259。
活體外T細胞育導 可測定本發明組合物由來自正常供體或患者之PBMC誘發反應性T細胞群之能力。在該系統中，可檢測誘發後的T細胞之裂解活性、細胞因子釋放、多株性及與抗原表位之交叉反應性。Parkhurst等人(1996)Immunol.157：2539。
轉基因動物模型 免疫原性可藉由以下於活體內評價：用本發明之組合物給HLA轉基因小鼠接種疫苗，並檢測所誘發免疫反應之性質及大小。或者，hu－PBL－SCID小鼠模型允許藉由人類PBL之過繼轉移於小鼠體內重建一人類免疫系統。該等動物可用該等組合物接種並對它們的免疫反應加以分析，如先前在Shirai,M.等人(1995)J.Immunol.154：2733；Mosier,D.E.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2443中所述。
增殖測定 T細胞將反應於反應性組合物而增殖。可藉由量測(例如)3 H－胸苷吸收來定量地監測增殖情況。Caruso,A.等人(1997)Cytometry 27：71。
靈長類動物模型 可利用一非人類靈長類動物(黑猩猩)模型系統來監測HLA限制性配體之活體內免疫原性。已證明，黑猩猩與人類MHC分子共有重疊MHC配體專一性，因此可容許檢測HLA限制性配體之相對活體內免疫原性。Bertoni,R.等人(1998)Immunol.161：4447。
監測TCR信號轉導事件 數個細胞內信號轉導事件(例如磷酸化)與MHC配體複合體對TCR之成功接合有關。已將該等事件之定性及定量分析與組合物激活效應細胞之相對能力(通過TCR接合)聯繫起來。Salazar,E.等人(2000)Tnt.J.Cancer 85：829；Isakov,N.等人(1995)J.Exp.Med.181：375)。
實驗實例 試劑
Histopaque 1077及吐溫(Tween)20自Sigma(St Louis,MO)購得。PBS及X－VIVO 15購自Cambrex(East Rutherford,Ni)。AIM－V培養基、Iscove之經修飾的Dulbecco培養基及RPMI 1640培養基以及錐蟲藍(Trypan Blue)和胎牛血清(FBS)購自Invitrogen(Carlsbad,CA)。Viaspan購自Dupont Pharma Labs(Wilmington,DE)。GM－CSF、IL－4、TNF－α、IL－1β、IL－6及IFN－γ皆購自R&D Sytems(Minneapolis,MN)。PGE2 購自Cayman Chemicals(Ann Arbor,CA)。可溶性CD40L購自Alexis Biochemicals(San Diego CA)。人類AB血清購自Valley Biochemical(Winchester,VA)。
趨化因子CCL19及CCL21購自Peprotech(Rocky Hill,NJ)。表現型分析抗體(HLA－ABC、HLA－DR、CD80、CD86、CD83、CD14及陰性同種型對照)、ELISpot抗體對(IFN－γ和IL－2)ELISA組(IL－12和IL－10)及鏈黴親和素－HRP連同BD Opt[IA試劑組B(pH9.5)皆購自BD Pharmingen(San Diego,CA)。AEC過氧化物酶受質購自Vector labs(Vector Labs,Burlingame,CA)。封阻抗CD40L抗體購自eBioscience。CD1d/α－半乳糖基神經醯胺(KRN7000)四聚體及天然KRN7000由Kirin Brewery,Pharamaceuticals Division,Tokyo,Japan饋贈。MART－1/HLA－A201四聚體購自Beckman－Coulter(Miami,FL)。
DC之產生
從由Life Blood(Memphis,Tennessee)提供的來自健康志願者之白血球分離術收集物中分離出人類PBMC。藉由Ficoll－Histopaque密度離心製備PBMC並於室溫下用PBS洗滌4次。將2 x 108 PBMC重新懸浮於30毫升AIM－V培養基中並容許其於37℃下黏著至150公分3 塑料燒瓶2小時。去除未黏著的細胞並將剩餘細胞於37℃、5%CO2 下在補加有GM－CSF(1000U/毫升)及IL－4(1000U/毫升)的X－VIVO 15培養基中培養5至6天。
CD40L之選殖
在RPMI中用PMA刺激T細胞1小時。收穫細胞並用PBS洗滌一次。使用QIAGEN RNeasy程序提取總RNA。
使用一高保真性Advantage Polymerase(Clontech)並使用Gene Amp Gold套組(Applied Bioscience)使1微克來自激活的T細胞之總RNA發生單試管RT－PCR反應。CD40L序列之基因專一性引物對應於CD40L序列CD40L 5'引物：5'－GCATCATCGAAACATACAACC－3'(SEQ ID NO.11)及CD403'引物：5'－GTATTATGAAGACTCCCAGCG－3'(SEQ ID NO.12)之鹼基47和895。純化該PCR片段並使用T4 DNA連接酶(Invitrogen)亞選殖至pCR2.1載體。對CD40L開放閱讀框之序列分析及與一GenBank一致序列之比對揭示兩個突變之存在。一個突變為保守突變，並未導致胺基酸改變。另一取代產生一功能胺基酸改變Asn－Ser。實施定點誘變，將該非保守胺基酸改變糾正回天冬醯胺。簡言之，在使用定製5'磷酸化及HPLC純化的引物(QIAGEN)、PFU Ultra酵素及伴隨的10X PCR緩衝液(Stratagene)和dNTPS(Clontech)的定點誘變中使用10至40奈克的CD40L PCR2.1質粒DNA。於PCR反應後，添加DPNI限制酵素(Promega)並於37℃下培養1小時，以消化掉親代模板。然後將5微升該反應物轉化至Oneshot MACH T1R感受態細胞(Invitrogen)並塗佈於含新製備的氨苄西林之LB板上。選擇6個集落並作為3毫升培養物在含氨苄西林之LB中生長過夜。使用質粒小量製劑(QIAGEN)分離DNA。將每一選殖株的一等份純化DNA遞交至University of North Carolina(UNC)測序機構，使用M13F及M13R引物(Invitrogen)分析CD40L開放閱讀框之序列。然後使用DNASTAR Seqman分析軟體將所有選殖株與CD40L之一致GenBank序列加以比對。選出2號選殖株(重命名為CD40L WT PCR 2.1)，因其含有恰當的經誘變處理的鹼基。
用於DC之轉染的mRNA之產生
使用Spel限制酵素直鏈化CD40L WT PCR 2.1質粒，並藉由苯酚/氯仿提取及隨後藉由乙醇沉澱來純化之。於水中重構該直鏈模板並按照製造商之指示使用mMessage mMachine T7 Ultra套組(Ambion)於活體外轉錄。於進行聚腺苷酸化反應前保存一等份RNA用於最終的分析。按照RNA淨化方案使用RNeasy管柱(QIAGEN)純化經聚腺苷酸化的RNA。於水中溶洗RNA並將其於－150℃下以個體大小等份試樣儲存。使用RNA Bioanalyzer 2100對比分析非聚腺苷酸化RNA與最終產物來確定聚腺苷酸尾長度。
DC之電穿孔
於電穿孔前，收穫DC並於PBS中洗滌之，然後重懸浮於冷凍Viaspan中(4x107 /毫升，0.5毫升；或2.5x107 /毫升，0.2毫升)並置於冰上。混合DC與mRNA(對於mRNA編碼的抗原為1或2微克/106 ，對於CD40L mRNA為4微克/106 )並置於一4毫米縫隙的電穿孔比色皿中，使用Biorad裝置實施電穿孔。於電穿孔後立即於X－VIVO 15培養基中洗滌DC並將其最終以1x106 /毫升重懸浮於補加有GM－CSF(800 U/毫升)及IL－4(500 U/毫升)之X－VIVO 15中，並於37℃下在低黏著力六孔板(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)中培養4或24小時。此時亦施加如下文所述的額外突變刺激。
DC突變－CD40L基本過程
於電穿孔後，使用IFN－γ(1000 U/毫升)或TNF－α(10奈克/毫升)或IFN－γ與PGE2 (1微克/毫升)之組合來處理用CD40L mRNA轉染之DC。作為比較，用多種編碼抗原的mRNA轉染不成熟的DC，然後用一由TNF－α(10奈克/毫升)、IL－1β(10奈克/毫升)、IL－6(100奈克/毫升)及PGE2 (1微克/毫升)或可溶性CD40L(200奈克/毫升)加增強子(1微克/毫升)構成之「細胞因子混合劑」(同時或依序添加1000 U/毫升IFN－γ)處理。
DC成熟－PME－CD40L過程
不成熟的DC在用TNF－α(10奈克/毫升)、IFN－γ(1000 U/毫升)及PGE2 (1微克/毫升)培養第5天上成熟。在第6天，收穫DC並如上所述用抗原及CD40L mRNA電穿孔，並於含800 U/毫升GM－CSF及500 U/毫升IL－4之X－VIVO 15培養基中培養4小時，然後收穫，或加以調配來生產疫苗。
使用CD40L基本過程結合α－半乳糖基神經醯胺(KRN7000)之DC成熟
於電穿孔後立即用100奈克/毫升的KRN7000與500 U/毫升IFN－γ及1微克/毫升PGE2 之組合激發CD40L基本過程DC，培養24小時。
DC之流式細胞術分析
收穫106 DC並重懸浮於冷凍的PBS/1% FCS中。於一96孔板(BD Biosciences)中混合對MHC分子(HLA－ABC、HLA－DR)、協同刺激分子(CD80、CD86)、成熟標記(CD83)及單核細胞標記(CD14)具有專一性之藻紅蛋白(PE)或FITC共軛結合抗體與1x105 DC/加樣孔並於4℃下最少培育15分鐘。使用同種型區域的抗體作為對照。於徹底洗滌後，使用CellQuest軟體(BD Biosciences)用一FACScalibur流式細胞儀(BDBiosciences)實施螢光分析。
CD40L之細胞內表現如下測定：於用CD40L mRNA轉染後不同時間點收穫2 x 105 個DC或HELA細胞並於4℃下重懸浮於250微升Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)中最少10分鐘至長達2小時。細胞用2毫升染色緩衝液(PBS、BSA、NaN3 及EDTA)洗滌兩次，重懸浮於0.5毫升染色緩衝液中並於4℃下儲存過夜。將細胞重懸浮於2.0毫升Perm/Wash溶液(BD Biosciences)中15分鐘，離心並重懸浮於100微升Perm/Wash溶液中。向於各時間點收集並經透化處理的各DC製劑中添加20微升的小鼠抗人CD40L PE及抗人CD40 APC(BD Biosciences)或小鼠IgG1 PE及IgG1 APC(BD Biosciences)，並於黑暗中於4℃下培育30分鐘。於流式細胞術分析前，將細胞用1毫升Perm/Wash溶液洗滌兩次並重懸浮於染色緩衝液中。
如下實施細胞內細胞因子染色(ICS)：於第19天自共培養物中移取出1x106 /毫升接觸過抗原的CD8＋T細胞並於添加1微升/毫升之佈雷菲德菌素A(BD GolgiPlug，目錄號555029)之前於200微升R10培養基中用PME DC靶(RCC、存活蛋白、G250、hTERT或eGFP)在37℃和5%CO2 下重新刺激1小時。於37℃下將細胞再培育16小時。洗滌細胞並重懸浮於具有5微升CD8 perCP－cy5.5(BD 341051)之150微升FACS緩衝液中並於4℃下培育。30分鐘後，將細胞洗滌兩次並重懸浮於2%低聚甲醛(PFA)中。隨後，10分鐘後洗滌細胞，然後於用2微升封阻抗體小鼠IgG 1純(BD 349040)培育前在室溫(RT)下於0.1%皂素中實施透化處理10分鐘。於RT下培育10分鐘後，向各試管中添加0.5微升IFN－g－APC(BD 554681)、10微升IL－2－FITC(BD 554702)及10微升CD69－PE(BD 555531)抗體。於RT下在暗處培育試樣30分鐘。於0.1%皂素中最終洗滌後，將細胞重懸浮於2% PFA中。藉由FACS細胞術實施分析，收集100,000個事件。
當在HeLa細胞中自mRNA表現時CD40L之功能分析
於10% FBS/DMEM中生長HeLa細胞，然後收穫之並於4毫米比色皿中用GFP及CD40L RNA(各20微克/5x106 個細胞)實施電穿孔。轉染後回收率約為70%，將細胞塗佈於6孔盤中並允許其生長過夜。於過夜培育後，藉由刮擦收穫經轉染的HELA細胞並用小鼠IgG1－PE或抗人類CD40L－PE(皆來自BD Biosciences,San Diego,CA)染色來檢查CD40L之細胞表面表現。於4℃下在1% FBS/PBS中用10微克/毫升的抗體將2x105 個細胞/試管染色30分鐘。使用一FACScaliber流式細胞儀及Cellquest軟體(BD Biosciences)分析細胞。為分析由HeLa表現的CD40L之功能，於6孔盤(總體積為2毫升)中於補加有1000 U/毫升的IFN－γ(R&D Systems,Minneapolis,MN)之5% huAB血清/RPMI中將1x106 個不成熟樹突細胞與1x106 個HeLa細胞共培養過夜。於匹配的加樣孔中加入10微克/毫升的封阻性CD40L單株抗體(來自eBioscience之24－31)，以證實刺激樹突細胞需要蛋白質之細胞表面表現。於18至24小時後收穫培養上清液並藉由ELISA(BD Biosciences)分析細胞因子IL－10及IL－12之表現。
遷移測定
藉由在24孔transwell室(corning Costar,Acton,MA)中通過一8微米孔徑聚碳酸酯濾料之遷移量測DC之趨化性。將在含3至300奈克/毫升CCL19、5至250奈克/毫升CCL21或兩者之組合的Iscoves經修飾的Dulbecco培養基或AIM－V培養基中或在單獨的培養基中之5%人類AB血清添加至下部室中。將0.1毫升的1至5x 105 個DC添加至上部室中並於37℃下培育2至3小時。將下部室中之培養物收穫至5毫升試管(BD Biosciences)中並重懸浮於0.1毫升PBS中，使用錐蟲藍計數存活的細胞。
ELISpot
用5微克/毫升單株抗IFN－γ或抗IL－2捕捉抗體(BD Pharmingen,San Diego,CA)塗佈PVDF膜ELISpot板(Millipore,Ballerica,MA)並於4℃下培育24小時。培育後，用PBS/0.05%吐溫20洗滌板並用5%人類AB血清/RPMI 1640培養基封阻1小時。以1x105 /加樣孔塗覆PBMC、T細胞或CD8富集的T細胞，並以1x104 /加樣孔塗覆用mRNA轉染並載有抗原的DC靶，使效應子：靶比率為10：1，並於37℃及5% CO2 下最少培育16小時。
於培育後，洗滌板6次，向適宜的板中以1微克/毫升添加抗IFN－γ檢測抗體(BD Pharmingen)或抗IL－2檢測抗體(BDPharmingen)並培育2小時。再洗滌6次後，向各加樣孔中添加鏈黴親和素－HRP(BD Pharmingen)並培育1小時。最後，於另一洗滌循環後，用AEC過氧化物酶受質顯色5至15分鐘，並用水停止。於在CTL Immunospot板讀數器(CTL,Cleveland,OH)上分析前使板空氣乾燥。
ELISA
該方法由BD Pharmingen使用BD Opt EIA試劑組B(pH 9.5)針對IL－12及IL－10 ELISA組(BD Pharmingen)設計。簡言之，於4℃下用在塗佈緩衝液中的抗IL－12p70或抗IL－10 ELISA捕捉抗體塗佈ELISA板(BD Biosciences)24小時。用200微升/加樣孔10% FCS/PBS封阻板1小時，然後以100微升/加樣孔添加標樣(BD Pharmingen)及上清液試樣(一式兩份)，並於室溫下培育2小時。洗滌各板並添加抗細胞因子檢測抗體，培育1小時，洗滌各板，並用100微升鏈黴親和素－HRP替換溶液並再於室溫下培育1小時。再次洗滌板並施加顯色受質10至20分鐘，隨後用停止溶液使顯色停止。使用Bio－Tek儀器ELx800板讀數器及KC初級軟體(Winooski,vT)實施板分析。
CTL誘發
將用mRNA轉染的成熟樹突細胞與CD8純化的T細胞一起共培養。所有的共培養皆於R－10培養基(10% FBS、RPMI－1640，補加有10 mM HEPES pH 7.4、1 mM丙酮酸鈉、0.1 mM非必需胺基酸、2 mM穀胺酸鈉、55 μMm β－巰基乙醇)中實施。所有細胞培養試劑皆來自Invitrogen(Carlsbad,CA)。使用CD8＋T細胞分離套組II(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)從由單核細胞黏著步驟收穫的非黏著細胞純化CD8＋細胞。以10：1 CD8＋：DC混合CD8＋細胞與如上所述製備的樹突細胞。對於首個7天，於補加有0.2 U/毫升IL－2(R&D Systems,Minneapolis,MN)之培養基中培養細胞，然後以1毫升(1x106 CD8＋細胞)/加樣孔等分入24孔組織培養盤中。於該初始的7天培育後，收穫CD8＋細胞，加以計數並於補加有5 U/毫升IL－2之培養基中用新鮮的DC刺激因子以10：1再培養。再將該等細胞培養1周，然後用新鮮的DC及20 U/毫升IL－2再刺激。於該第三次刺激後3或7天實施CTL測定。
CTL測定
藉由在FBS/RPMI培養基中培育過夜預先用10微克/毫升的HLA－A201限制性MART－APL肽(LAGIGILTV)或天然肽(AAGIGILTV)或PSA－1肽(FLTPKKLQCV)激發T2細胞，並於作為CTL靶使用前加以洗滌。如上所述用GFP mRNA、MART－1 APL mRNA、流感－M1 mRNA中的任一種轉染樹突細胞靶，並在不進行成熟處理的情況下培育過夜。於37℃下用100μCi的Na5 1 Cr(Perkin－Elmer Life and Analytical Sciences公司,Boston,MA)培育激發後的T2細胞90分鐘。洗去過量的5 1 Cr並以不同的E：T比率用CD8＋細胞培育5000個經標記的靶4小時。以25,000細胞/加樣孔添加未經激發的T2細胞降低非專一性裂解。藉由閃爍計數法量測上清液中釋放的5 1 Cr。藉由向靶添加1% Triton X－100計算總釋放，而藉由單獨添加培養基來計算自然產生的釋放。裂解百分比使用公式(釋放的試樣cpm－自然產生的)/(釋放的cpm－釋放的天然產生的cpm)計算。
利用KRN7000激發的CD40L基本過程成熟DC誘發MART－1專一性CTL
如上所述產生DC，其中利用「CD40L基本過程」，並用編碼MART－l之mRNA加載。電穿孔後，用KRN7000、IFN－γ及PGE2 培育DC。於20 U/毫升IL－2之存在下以1：10之比率共培養DC及PBMC。於相同條件下重刺激PBMC三次，藉由用MART－1/A2四聚體染色測定CTL誘發頻率，並藉由FACS使用KRN7000/CD1d四聚體計數NKT細胞之擴充。
實驗實例之結果 使用干擾素γ及CD40L之依序成熟優化II12p70之分泌
藉由在包含GM－CSF及IL－4之X－VIVO 15培養基中培養黏著細胞PBMC 6天來製備不成熟DC。於第6天回收DC並用2微克編碼eGFP之mRNA/106 個DC電穿孔，並用「細胞因子混合物」成熟36小時。或者，藉由在IFN－γ及可溶性CD40L(同時或依序施加)之存在下培養DC達成成熟。就協同刺激分子之增強的表現但最重要地就IL－12p70相對IL－10之分泌對DC加以監測。圖1顯示，用細胞因子混合劑成熟之DC在36小時的培養期間向培養上清液中分泌超量的IL－10(與IL－12p70相比)。相反，同時用可溶性CD40L加IFN－γ成熟的DC分泌超量的IL－12p70。然而，加入IFN－γ並培養18小時，隨後直接向培養物中添加可溶性CD40L並再培養18小時，該依序施加產生顯著增強的IL－12p70分泌。出乎意料地，施加可溶性CD40L並隨後施加IFN－γ阻礙了IL－12p70之顯著分泌。由此可得出結論，依序遞送一固有刺激來「誘導」DC成熟(IFN－γ)並隨後用一由可溶性CD40L遞送的替代T輔助細胞信號來誘導可最優化DC成熟以獲得最佳的IL－12p70分泌。
用編碼CD40L之mRNA轉染的HeLa細胞與不成熟DC之共培養導致誘發源自DC之IL－12p70
圖2顯示，用編碼CD40L之mRNA轉染之HeLa細胞於培養24小時後產生CD40L蛋白質之顯著細胞表面表現，如由抗CD40L抗體及流式細胞術所確定。於1000 U/毫升IFN－γ之存在下共培養用CD40L mRNA轉染的HeLa細胞與不成熟的DC。表II顯示，用一延伸的聚腺苷酸尾(大於400個「A」)轉染的HeLa細胞當與不成熟DC一起經18個小時的培養時能誘發顯著的IL－12p70分泌。重要的是，包含一封阻性抗CD40L抗體可阻礙IL－12p70之分泌，證實了由經轉染的mRNA序列編碼的蛋白質之特性及功能重要性。
表II
用編碼CD40L之mRNA轉染的HeLa細胞當於IFN－γ之存在下與不成熟的DC共培養時導致IL－12p70之分泌。於培養物中包含「封阻性」抗CD40L抗體可阻礙IL－12p70之誘發。
(a)用4微克具有400個以上核苷酸聚腺苷酸尾之CD40L mRNA轉染HeLa細胞，並於IFN－γ之存在下與DC一起培育。
(b)同(a)，但存在封阻性抗CD40L抗體(24－31)。
用CD40L mRNA轉染並於IFN－γ之存在下培養的樹突細胞分泌IL－12p70
於用GM－CSF及IL－4培養6天後收穫不成熟的DC，用CD40L mRNA(400個聚腺苷酸)之滴定轉染，並立即於1000 U/毫升IFN－γ之存在下培養。圖3顯示，於培養18小時後收穫的上清液含有超過IL－10之IL－12p70，且最佳的細胞因子分泌需要至少4微克CD40L mRNA/106 個DC。使CD40L mRNA有效載增加至大於4微克/106 個DC可導致成熟後DC之產率顯著降低(數據未顯示)。在一平行實驗中，用4微克CD40L mRNA/106 個細胞轉染不成熟的DC，立即向培養物中滴定IFN－γ。圖4顯示，要維持IL－12p70之最佳誘發，需要至少100 U/毫升之IFN－γ。圖5a顯示，轉染並與IFN－γ共培養6至8小時後IL－12p70之水平可檢測到，在培養上清液中之最佳積聚在20與24小時之間記錄到。相比之下，用10奈克/毫升TNF－α替代IFN－γ亦支持IL－12之產生，但水平降低(圖5b)。然而，伴隨情況為，IFN－γ產生之IL－10之水平較TNF－α低。(圖5c)
用CD40L mRNA轉染之DC對IL－12p70之誘發取決於「細胞內信號傳導」而非細胞間相互作用
圖2展示，自mRNA轉譯之CD40L蛋白質可於轉染後細胞之細胞表面上表現，且該蛋白質保留了適宜地向DC傳導信號來分泌IL－12p70之能力，此係由該蛋白質與位於DC上的其配對物即CD40之相互作用導致。為測定CD40L於經轉染的DC中之細胞分佈並確認基功能特性，於轉染後不同時間點上收穫DC，測定細胞表面上或細胞內區室中CD40L之存在。圖6a及6b顯示，大多數CD40L位於一細胞內區室中，且直至轉染後60分鐘才出現顯著的蛋白質表現(27% DC CD40L陽性)。因此，儘管於轉染後立即實施加IFN－γ，但成熟事件之遞送為依序遞送，其中IFN－γ信號先於CD40L之信號。如圖1所示，使用IFN－γ及CD40L之DC依序成熟可使IL－12p70分泌最優化另外，圖7顯示，用CD40L轉染及用IFN－γ處理之DC當於轉染後在過量封阻性抗CD40L抗體之存在下培養18小時後，仍分泌顯著水平之IL－12p70。該數據表明，在此系統中IL－12p70產生所需的CD40L/CD40相互作用實際上在一細胞內區室中發生。
CD40L陽性細胞隨時間之頻率
用4微克CD40L mRNA/106 個DC轉染不成熟的DC，並用1000 U/毫升IFN－γ共成熟之。或者，作為CD40L染色之陰性對照，用「細胞因子混合劑」使不成熟的DC成熟。表現之最大頻率在用CD40L RNA轉染後約3至4小時達成(參見圖6b)，儘管當固定該等DC細胞並對其實施透化處理時，80%之DC表現CD40L，但細胞表面染色僅檢測到約15%之DC(圖6c)。該數據表明，大部分CD40L蛋白質保留在DC內，而不於細胞表面上表現。CD40L蛋白質受到瞬時表現，大多數DC在轉染後26小時變為CD40L陰性。當與僅接受「細胞因子混合劑」之DC相比時，用編碼CD40L之mRNA轉染DC並不改變CD40L之同源受體分子CD40之表現。
當用CD40L及IFN－γ成熟時需要PGE 2 來誘發DC之遷移
除分泌IL－12p70之能力及展示一成熟的表現型(通常定義為表現高水平的諸如CD80、CD83及CD86協同刺激分子(參見表III)的細胞)外，DC必須展示遷移的能力，若其將要能於活體內尋靶至一淋巴結。數份研究已證實，PGE2 誘導成熟的DC發生遷移(Luft T等人(2002)Blood 100：1362,Scandella E等人(2002)Blood 100：1354)。圖8顯示，除IFN－γ外加入1微克/毫升PGE2 能使成熟的DC發生遷移，該遷移潛能之獲得與CD40L mRNA有效載成正比。因此，CD40L不僅可促進DC表現型的成熟及佔優勢IL－12p70的分佈(參見表II)，而且亦可誘導遷移。相比之下，藉由用CD40L mRNA轉染成熟並在存在IFN－γ但不存在PGE2 下培養的DC未能遷移(數據未顯示)，但顯示出顯著的趨化因子受體CCR7之細胞表面表現。
表III
經受由「細胞因子混合劑」或CD40L加IFN－γ及PGE2 所誘發成熟作用的DC之表現型分析及所分泌細胞因子分佈
自黏著單核細胞製備DC並於GM－CSF/IL－4中培養6天。收穫後，用不同的mRNA有效載轉染DC並使之進一步經受24小時之成熟作用。再次收穫DC，將該等細胞染色來檢測各種不同的細胞表面標記，尤其是彼等與增強的功能即協同刺激及遷移相關的細胞表面標記。收集來自成熟培養物之上清液並使之經受IL－12p70及IL－10細胞因子分析。
(a)除4微克/106 個細胞的eGFP mRNA外，用流感mRNA作為編碼抗原的有效載以2微克/106 個細胞轉染DC。eGFP mRNA容許藉由FACS確認轉染，且在替代方法中作為4微克/106 個細胞的CD40L mRNA成熟有效載的替代對照。於「細胞因子混合劑」之存在下使該等流感/eGFP轉染的DC成熟。
(b)使用MART－APL mRNA作為編碼抗原的有效載以2微克/106 個細胞轉染DC，並使之經受使用「細胞因子混合劑」之成熟作用。
(c)使用流感mRNA作為編碼抗原之有效載以2微克/106 個細胞轉染DC，同時以4微克/106 個細胞的CD40L mRNA作為成熟有效載。立即將該等細胞置於如在材料及方法中所述的含有IFN－γ及PGE2 之培養物中。
(d)使用MART－APL作為編碼抗原之有效載以2微克/106 個細胞轉染DC，同時以4微克/106 個細胞的CD40L mRNA作為成熟有效載。立即將該等細胞置於如在材料及方法中所述的含有IFN－γ及PGE2 之培養物中。
(e)由經受成熟處理的DC分泌的IL－12p70。
(f)由經受成熟處理的DC分泌的IL－10。
經由用CD40L mRNA轉染及IFN－γ/PGE 2 依序成熟的DC激發強T細胞回憶反應
為測定經由CD40L mRNA轉染及IFN－γ/PGE2 成熟之DC之「免疫效能」，除CD40L mRNA及IFN－γ/PGE2 培養環境外，用2微克/106 個DC的編碼流感基質蛋白之mRNA共轉染DC。轉染後18小時，收穫DC，洗滌，並於IFN－γELISpot測定中用自體T細胞共培養。圖9顯示，如於該測定中藉由流感專一性IFN－γ斑點之頻率所確定，與用流感mRNA轉染及用「細胞因子混合劑」成熟之DC相比，經由CD40L/IFN－γ/PGE2 成熟之DC顯示增強的免疫效能。
經由用CD40L mRNA轉染及IFN－γ/PGE 2 依序成熟之DC激發初次反應
回憶反應，例如圖9中所闡述的回憶反應不太依賴於表現最優化協同刺激分子及支持細胞因子環境之DC之存在。因此，檢測DC激發對抗黑色素瘤相關抗原MART－1之初次免疫反應之能力，而對於MART－1，許多健康供體維持一較高的原初T細胞前體頻率。由於優先使用HLA－A201供體，故用一編碼MART－1之mRNA轉染DC，其中A2限制性決定子藉由定點誘變導致的mRNA序列突變最優化以便位置27處之丙胺酸由白胺酸取代且在此處稱為MART－APL(Valmori,D等人(1998)J.Immunol.160：1750)。將用2微克MART－APL mRNA及4微克CD40L mRNA共轉染並立即用IFN－γ/PGE2 激發18小時之DC與僅用MART－APL加載且用「細胞因子混合劑」成熟過夜的DC加以比較。向純化的自體CD8＋ T細胞中添加載有抗原且成熟的DC，並於0.2 U/毫升人類IL－2之存在下培養7天。於該時期後，回收T細胞並且適宜時於一IL－2 ELISpot測定中用第二輪載有抗原的DC刺激因子共培養。圖10顯示，於經由CD40L及IFN－γ/PGE2 成熟的DC之存在下培養的CD8＋ T細胞可導致極顯著地增加能夠於一對最優化MART－APL表位(其最初在MART－APL mRNA內受到編碼)的專一性反應中分泌IL－2的T細胞。總之，經受經由IFN－γ/PGE2 及CD40L之依序成熟的DC在激起初次免疫反應上顯著較用當前接受的標準「細胞因子混合劑」成熟的DC強。此外，圖11顯示，使用載有MART－APL且用「細胞因子混合劑」成熟之DC產生的CTL不能調介不相依於CD4且由CD8介導的細胞毒性來對抗用適宜HLA－A2限制性MART－APL肽激發的T2細胞(圖11b)。相反，於由CD40L/IFN－γ/PGE2 成熟之DC上產生的CTL具有完全活性且可殺死由MART－APL肽激發的T2靶(圖11a)。
於PME－CD40L過程下成熟的不成熟DC之表現型分析
第5天用本文所述之PME－CD40L過程使DC成熟。特定而言，於培養基GM－CSF及IL－4中將單核細胞培養5天來產生不成熟的CD83－ DC。在第5天，向不成熟的DC中添加含有TNFα、IFNγ及PGE2 (TIP)之培養基。在第6天，測定TIP後表現型(參見表IV)。如表IV中所示，大多數細胞對於CD80、CD83、CD86及CD209呈陽性。該等DC亦係CCR7陰性(數據未顯示)。低百分比之CD14＋ 細胞代表未分化成樹突細胞的單核細胞。在第6天，用每106 個細胞1微克的自經擴增腎細胞癌瘤RNA製備的mRNA及4微克的CD40LmRNA共轉染(經由電穿孔)CD83＋ CCR7－ DC。於轉染後4小時量測CD40L表現。於轉染後4小時將該等細胞低溫保存於液態氮中。於解凍後及於解凍後24小時立即量測解凍後回收率及存活率。可看出，於解凍後24小時，大多數DC變為CCR7＋。CCR7＋ DC亦對於CD80、CD83及CD86呈陽性。3個分開試驗之結果顯示於表IV中。
經由PME－CD40L過程成熟的DC其有反應於淋巴結尋靶趨化因子CCL19及21的高遷移性
用全部經擴增RCC RNA及CD40L RNA共轉染後24小時，測定用PME－CD40L成熟的DC反應於趨化因子CCL19及21之遷移情況。圖12顯示，使用4個獨立的供體，用PME－CD40L成熟的DC具有高遷移性，此與用PME－CD40L過程電穿孔後24小時達成的極高水平的CCR7表現一致(參見表IV)。
經由PME－CD40L過程成熟的DC顯示較用「CD40L基本過程」成熟的DC顯著增強的免疫效能
儘管藉由「CD40L基本過程」可誘發初次免疫反應，但「成熟後電穿孔CD40L」過程(藉此於用CD40L加上編碼抗原的mRNA電穿孔前首先用TNF－α、IFN－γ及PGE2 使DC成熟)使用MART抗原模型系統可顯著提高CTL活性(圖13)。另外，使用自一腎細胞癌瘤患者獲得的全自體材料檢測PME－CD40L過程誘發IFN－γ及IL－2反應之情況：患者DC如上文針對PME－CD40L過程所述製備並用自體全擴增RCC腫瘤RNA加以電穿孔。用自體患者CD8 T細胞培養載有抗原的DC，並反應於誘發性DC及反應於使用腫瘤相關抗原hTERT、存活蛋白及RCC專一性抗原G250轉染的個別DC藉由細胞內細胞因子染色研究所產生的效應CTL。使用由編碼eGFP之mRNA轉染的DC作為陰性對照刺激因子。圖14顯示，患者T細胞反應於載有總擴增RCC RNA之DC，亦反應於三個腫瘤相關的抗原，其中IFN－γ及IL－2頻率皆高於由eGFP mRNA轉染的陰性對照誘發的頻率。(自對每一RCC相關DC靶之總反應減去對eGFP之反應)
用「基本CD40L過程」成熟並用KRN7000激發的DC能募集可增強初級CTL之誘發的NKT細胞
與用媒劑代替KRN7000激發的載有RNA的相同成熟DC相比，載有MART－1 mRNA、用CD40L基本過程成熟且用KRN7000激發的DC可增加PBMC培養物中NKT細胞之頻率，如藉由CD1d/KRN7000四聚體染色所確定(圖15a)。使用效應CTL之四聚體分析(MART－1/HLA－A2)，對使用MART－1 mRNA轉染的DC產生激發作用的KRN7000之存在可顯著增加MART反應性T細胞之頻率(圖15b)。因此，PBMC培養物中NKT細胞之擴充提供一擴增循環，此可能由能支持初級CD8 CTL產生的NKT細胞提供之「幫助」達成。
CD40L mRNA之最優化
自質粒模板pCR2.1 CD40L WT來轉錄在展示一較佳成熟方式之初始DC實驗中使用的CD40L RNA。較佳CD40L RNA含有一ARCA帽類似物及聚腺苷酸尾。藉由去除位於起始ATG密碼子之5'處之XbaI－EcoRV片段對質粒pCR2.1 CD40L WT加以修飾。該片段包含載體序列之32個核苷酸並含有3個隱性潛在起始ATG密碼子。該修飾之基本原理係，該等額外的ATG可能藉由與正確的CD40L轉譯起始位點競爭而干擾CD40L轉譯之有效起始。CD40L之編碼序列不受該等修飾的影響。如藉由IL－12表現之誘發所量測，在兩個獨立的DC轉染實驗中，自經修飾的質粒模板轉錄的CD40L RNA之性能較當前的CD40L參考標準為佳。該經修飾的質粒稱為pCR2.1 CD40L WT△X－E。
另外，我們希望確定藉由將CD40L 5'未轉譯區域直接置於CD40L起始密碼子之上游是否進一步優化CD40L RNA之表現。藉由插入緊鄰CD04L轉染起始位點之上游的39 bp CD40L 5'未轉譯序列進一步修飾pCR2.1 CD40L WT△X－E質粒。自該質粒轉錄的RNA之性能不及自CD40L WT△X－E轉錄之RNA，但是其性能類似於自pCR2.1 CD40L WT轉錄的當前CD40L(圖18)。因此，pCR2.1 CD40L WT△X－E質粒係首選的質粒。對應於自pCR2.1 CD40L WT△X－E質粒轉錄之CD40L RNA的DNA序列顯示於SEQ ID NO：11中。ATG起始密碼子自位置41開始。
[序列表簡單說明]
SEQ ID NO：1係一人類CD40L cDNA。核苷酸40至825代表編碼區域，包括ATG轉譯起起密碼子及TGA轉譯終止密碼子。
SEQ ID NO：2係全長人類CD40L蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3係一人類CD40 cDNA。核苷酸67至522代表編碼區域，包括ATG轉譯起始密碼子及TAG轉譯終止密碼子。
SEQ ID NO：4係人類CD40(CD40L之受體)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：5係一人類IFN－γ cDNA。核苷酸109至609代表編碼區域，包括ATG轉譯起始密碼子及轉譯終止密碼子。
SEQ ID NO：6係人類IFN－γ之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7係一人類TNF－α cDNA。核苷酸170至971代表編碼區域，包括ATG轉譯起始密碼子及TGA轉譯終止密碼子。
SEQ ID NO：8係人類TNF－α之胺基酸序列。
SEQ ID NO：9係一小鼠CD40L cDNA。核苷酸13至795代表編碼區域，包括ATG轉譯起始密碼子及TGA轉譯終止密碼子。
SEQ ID NO：10係全長小鼠CD40L蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO：11係一CD40L 5'引物。
SEQ ID NO：12係一CD40L 3'引物。
SEQ ID NO：13係對應於一最優化人類CD40L mRNA之DNA序列。
SEQ ID NO：14係CD40受體3'UTR。
SEQ ID NO：15係人類β－肌動蛋白3'UTR之最終外顯子之未轉譯區域。
SEQ ID NO：16係人類β－肌動蛋白3'UTR之最小功能元件。
SEQ ID NO：17係猿猴輪狀病毒基因6 3'UTR。
SEQ ID NO：18係猿猴輪狀病毒基因6 3'UTR之最小功能元件。
SEQ ID NO：19係人類Hsp70 5'UTR(HSPA1A)。
SEQ ID NO：20係小鼠VEGF 5'UTR。
SEQ ID NO：21係小鼠VEGF 5'UTR之最小功能元件。
SEQ ID NO：22係脾臟壞死病毒LTR RU5區域。
SEQ ID NO：23係煙草蝕紋病毒5'前導序列。
圖1顯示用IFN－γ然後用可溶性CD40L使DC依序成熟可產生最佳的IL－12p70分泌。用細胞因子混合劑、單獨用可溶性CD40L或用CD40L加IFN－γ使DC成熟。用1000 U/毫升IFN－γ預培養不成熟DC 18小時，隨後添加不溶性CD40L並再培養18小時，產生最大的IL－12p70釋放。將首先施加不溶性CD40L並隨後施加IFN－γ視為一陰性信號，產生最小的IL－12p70釋放，並伴隨產生IL－10。
圖2顯示，用編碼CD40L並具有一大於400個核苷酸之聚腺苷酸尾之mRNA轉染的HELA細胞表現細胞表面蛋白質，如用抗－CD40L(CD154)抗體藉由FACS分析所確定。
圖3顯示用CD40L mRNA轉染之細胞之IL－12p70分泌與轉染有效載之大小成正比例。用CD40L mRNA之滴定轉染DC，隨後立即添加1000 U/毫升IFN－γ。要誘發顯著水平的IL－12p70釋放，需要至少4微克/106 個DC的CD40L mRNA。
圖4顯示需要至少100 U/毫升的IFN－γ才能與CD40L mRNA有效載協同誘發最大的IL－12p70分泌。用4微克CD40L mRNA/106 個細胞轉染DC，立即用IFN－γ之滴定培養。於24小時後量測培養上清液中之IL－12p70及IL－10。
圖5A顯示於DC轉染及在IFN－γ存在下培養後約24小時出現由CD40L/IFN－γ誘發的IL－12p70分泌。用4微克CD40L mRNA/106 個細胞轉染DC，並立即用1000 U/毫升IFN－γ培養。於規定時間自複製培養物收集上清液並分析上清液之IL－12p70及IL－10含量。
圖5B顯示，向用CD40L mRNA轉染之DC中添加TNF－α可產生IL－12p70，但表現水平較用IFN－γ作為共成熟劑所達成的低。
圖5C顯示，使用TNF－α作為共成熟因子與使用IFN－γ相比亦產生升高的IL－10水平。
圖6A及6B顯示用編碼CD40L之mRNA轉染的DC展現細胞表現，如用抗－CD40L(CD154)抗體藉由FACS分析所確定。在圖6A中，用4微克CD40L mRNA/106 個細胞轉染DC並於不同時間點上加以分析。如由一4小時時間點所展示，大多數CD40L位於一細胞內區室中，此時表面表現相當低。圖6B顯示，在60分鐘時可明顯觀察到顯著的細胞內表現，此時陽性DC為27%，3小時的時候陽性DC增加至79%。
圖6C顯示用編碼CD40L之mRNA轉染DC後CD40L蛋白質之瞬時表現。
圖7顯示用CD40L mRNA轉染並於IFN－γ存在下培養之DC分泌IL－12p70，儘管存在過量之封阻性抗－CD40L抗體－CD40/CD40L相互作用於一「細胞內」區室內運作。將DC用4微克CD40L mRNA轉染並立即用1000 U/毫升IFN－γ培養，此係於10或50微克/毫升封阻抗性－CD40L抗體存在下實施。IL－12p70釋放僅降低50%，表明細胞內信號傳導而非細胞間信號傳導係誘發IL－12p70之主要途徑。
圖8顯示用CD40L mRNA轉染並用IFN－γ共培養之DC需要PGE2 之存在才能達成趨化因子依賴性遷移。用CD40L mRNA之滴定轉染DC並立即用1000 U/毫升IFN－γ及1微克/毫升PGE2 培養。用eGFP轉染並用一含PGE2 之細胞因子混合劑成熟之DC代表一陽性對照。成熟18小時後，於「transwell」遷移分析中使用淋巴結尋靶趨化因子CCL19及21檢測來自各培養條件之DC。DC遷移與CD40L mRNA有效載之大小成正比例。
圖9顯示，與在「細胞因子混合劑」存在下成熟之DC相比，經由用CD40L mRNA轉染並於IFN－γ及PGE2 存在下培養成熟之DC可激起有效的T細胞「回憶反應」。用作為抗原有效載之每106 個細胞2微克流感Ml mRNA及4微克eGFP mRNA對照共轉染DC，隨後用細胞因子混合劑使之成熟。或者，用作為抗原有效載之每106 個細胞2微克流感Ml mRNA及作為成熟有效載之4微克CD40L mRNA共轉染DC。立即於1000 U/毫升IFN－γ及1微克/毫升PGE2 中培養該等後一批細胞來完成成熟過程。24小時後，在ELISpot分析中使用各DC群來募集一抗流感M1回憶反應，如藉由相應T細胞分泌IFN－γ之頻率測定。藉由在IFN－γ及PGE2 存在下用CD40L mRNA轉染成熟之DC引發一更強的抗流感反應。
圖10顯示與在「細胞因子混合劑」存在下成熟之DC相比，經由用CD40L mRNA轉染並於IFN－γ及PGE2 存在下培養成熟的DC引發有效的「初次T細胞反應」。用作為抗原有效載之2微克MART－APL mRNA/106 個細胞轉染DC，隨後用細胞因子混合劑使之成熟。或者，用作為抗原有效載之每106 個細胞2微克MART－APL mRNA及作為成熟有效載之4微克CD40L mRNA共轉染DC。立即於1000 U/毫升IFN－γ及1微克/毫升PGE2 中培養該等後一批細胞以完成成熟過程。於24小時後，使用各DC群來喚起T細胞對由轉染的MART－APL mRNA有效載產生的MART－APL肽之反應，此藉由在0.2 U/毫升IL－2之存在下共培養自體原初CD8＋T細胞7天達成。於該第一輪刺激後，收穫T細胞並用於IL－2 ELISpot分析中，用適當成熟的載有抗原之DC再刺激。藉由在IFN－γ及PGE2 存在下用CD40L mRNA轉染成熟的DC引發一更強的抗－MART－APL反應，如藉由效應CD8＋T細胞分泌IL－2之頻率所測定。
圖11顯示表現MART－APL mRNA之DC對細胞毒性T細胞之誘發。圖11a顯示，在添加可溶性干擾素－γ/PGE2 的情況下使用作為抗原源之MART－APL mRNA及CD40L mRNA共轉染的DC之成熟引發一有效的CTL反應，而圖11b顯示用MART－APL mRNA轉染但用一「細胞因子混合劑」成熟之DC並不引發一有效的CTL反應。T2－PSA：用作為陰性對照靶之來自前列腺專一性抗原(PSA)之HLA－A2限制性肽激發的T2細胞。MART－T2：用呈其天然序列的HLA－A2限制性MART表位激發的T2細胞。MART－APL－T2：用作為首選「改變的肽配體」之HLA－A2限制性MART表位激發的T2細胞。
圖12顯示在transwell分析中使用PME－CD40L成熟的DC反應於淋巴結趨化因子CCL19及21之遷移能力。平行測試4個獨立的健康供體，其中每一DC製劑皆用1微克經擴增的總RCC腫瘤RNA及4微克CD40L RNA/106 個DC轉染。用mRNA有效載轉染後24小時建立遷移分析。
圖13顯示自一健康供體誘發對於黑色素瘤相關抗原MART－1之CTL反應。製備並用MART－1 RNA裝載DC，並經由「CD40L基本過程」使之成熟，或使用PME－CD40L過程製備DC。以1：10之比率共培養DC及純化的CD8T細胞，使之於IL－2之存在下經受三輪刺激。該數據顯示以多種效應子－靶比率使用MART－1肽激發之T2靶細胞的5 1 CR釋放細胞毒性分析。
圖14顯示對於載有全擴增RCC腫瘤RNA之DC、用PME－CD40L成熟的DC之全自體CTL反應之誘發。以1：10之比率共培養DC與純化的CD8 T細胞，使之於IL－2之存在下經受三輪刺激。最後一次刺激後5天，用使用全擴增RCC RNA、hTERT RNA、存活蛋白RNA、G250 RNA轉染之DC或用eGFP RNA轉染之陰性對照DC再刺激CD8 T細胞。數據源自於藉由激活標記CD69之細胞表面染色識別效應T細胞，並且同時檢測細胞內IFN－γ及IL－2。將細胞內細胞因子反應再分，以辨別IFN－γ單陽性(效應細胞)與IFN－γ/IL－2雙陽性(記憶細胞)。
圖15顯示用KRN7000或媒劑激發且用MART－1 RNA轉染及用CD40L基本過程成熟的DC對NKT－細胞(a)及MART－1反應性CTL(b)之擴充。該數據清楚地表明，用KRN7000激發之DC可擴充NKT－細胞，如由CD1d/KRN7000四聚體染色所確定，且一NKT－細胞擴充群之存在可增加初級CTL向MART－1之伴隨募集，如藉由使用MART－1/HLA－A2四聚體之四聚體染色所定義。
圖16顯示人類(SEQ ID NO：1)與小鼠(SEQ ID NO：9)CD40L cDNA之比對。圖16A、16B及16C代表SEQ ID NO：1與2之比對之3個連續頁。
圖17顯示人類(SEQ ID NO：2)與小鼠(SEQ ID NO：10)CD40L蛋白質之比對。
圖18顯示用mRNA轉染之DC之IL－12表現水平，而該mRNA係使用mMessage mMachine T7 Ultra套組(Ambion)於100微克規模(△X－E 1)或1毫克規模(△X－E 2)轉錄反應中自pCR2.1 CD40L WT△X－E質粒轉錄。參考RNA自質粒pCR2.1 CD40L WT轉錄。轉錄後的CD40L RNA藉由使用聚腺苷酸＋套組(Epicentre)添加聚腺苷酸尾來修飾。將RNA轉染至DC中。轉染後約20小時，使用Elisa量測成熟DC之上清液中IL－12之量。陰性：在無任何CD40L RNA之情況下電穿孔之DC上清液中之IL－12表現量測結果。
<110> Argos Therapeutics,Inc.Kirin Beer Kabushiki Kaisha Healey,Don Tcherepanova,Irina Adams,Melissa Hinohara,Atsushi <120> 成熟樹突細胞組合物及培養彼等之方法<130> MER030TW <140> 094135203 <141> 2005－10－07 <150> US 60/522,512 <151> 2004－10－07 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1816 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (40)..(825) <400> 1 <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> 人類<400> 2 <210> 3 <211> 1570 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (67)..(522) <400> 3 <210> 4 <211> 151 <212> PRT <213> 人類<400> 4<210> 5 <211> 1193 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (109)..(609) <400> 5 <210> 6 <211> 166 <212> PRT <213> 人類<400> 6 <210> 7 <211> 1669 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (170)..(871) <400> 7 <210> 8 <211> 233 <212> PRT <213> 人類<400> 8 <210> 9 <211> 1250 <212> DNA <213> 小家鼠<220> <221> CDS <222> (13)..(795) <400> 9 <210> 10 <211> 260 <212> PRT <213> 小家鼠<400> 10<210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成引物<400> 11<210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成引物<400> 12<210> 13 <211> 915 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 最優化人類CD40L <400> 13<210> 14 <211> 251 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> CD40受體3'UTR <400> 14 <210> 15 <211> 597 <212> DNA <213> 人類<400> 15<210> 16 <211> 381 <212> DNA <213> 人類<400> 16<210> 17 <211> 139 <212> DNA <213> 猿猴輪狀病毒<400> 17<210> 18 <211> 65 <212> DNA <213> 猿猴輪狀病毒<400> 18<210> 19 <211> 179 <212> DNA <213> 人類<400> 19<210> 20 <211> 1014 <212> DNA <213> 人類<400> 20<210> 21 <211> 163 <212> DNA <213> 小家鼠<400> 21<210> 22 <211> 180 <212> DNA <213> 脾臟壞死病毒<400> 22<210> 23 <211> 143 <212> DNA <213> 煙草蝕斑病毒<400> 23

Claims (42)

  1. 一種製備CD83+ CCR7+ 成熟樹突細胞(dendritic cells；DCs)之方法，其包括以下依序步驟：(a)用一包含干擾素γ受體(interferon gamma receptor；IFN-γR)激動劑之第一信號向經分離的不成熟樹突細胞(immature dendritic cells；iDCs)傳導信號，在腫瘤壞死因子α 受體(tumor necrosis factor alpha receptor；TNF-αR)激動劑存在下以產生CD83+ 成熟樹突細胞；及(b)用一包含有效量CD40激動劑之第二瞬時信號向該等CD83+ 成熟樹突細胞(mature dendritic cells；mDCs)傳導信號，以產生CD83+ CCR7+ 成熟樹突細胞，其中該第二瞬時信號係以編碼該CD40激動劑之mRNA轉染該成熟樹突細胞在約該第一信號發出後12至30小時提供。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包括將該等iDCs或該等經信號標誌DCs與PGE2 接觸。
  3. 如請求項1之方法，其中步驟(a)及(b)進一步包括將該等細胞與GM-CSF及IL-4或IL-13其中至少一種接觸。
  4. 2或3之方法，其中該CD40激動劑係針對CD40之激動抗體。
  5. 2或3之方法，其中該CD40激動劑係CD40L多肽。
  6. 如請求項5之方法，其中該CD40L多肽係選自由下列組成 之群：a)一包含SEQ ID NO：2之多肽；b)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基47至261之多肽；c)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基51至261之多肽；d)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基120至261之多肽；e)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基113至261之多肽；f)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基112至261之多肽；g)一包含SEQ ID NO：10之多肽；及h)(a)至(g)中任一多肽之片段，其中該片段可鍵結CD40。
  7. 如請求項5之方法，其中該CD40L多肽為與一選自由下列組成之群的多肽具有至少77%之序列一致性之多肽：a)一包含SEQ ID NO：2之多肽；b)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基47至261之多肽；c)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基51至261之多肽；d)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基120至261之多肽；e)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基113至261之多肽；f)一包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基112至261之多肽；g)一包含SEQ ID NO：10的多肽；及h)(a)至(g)中任一多肽之片段，其中該片段可鍵結CD40；其中該CD40L多肽具有CD40L之結合活性。
  8. 2或3之方法，其中該第一信號係在轉譯編碼IFN-γR激動劑之mRNA時發生作用。
  9. 2或3之方法，其中該第一信號係在將該等iDCs與IFN-γR激動劑接觸時發生作用。
  10. 2或3之方法，其中該二信號係在轉譯編碼CD40激動劑之mRNA時發生作用。
  11. 如請求項1之方法，其中該細胞係使用電穿孔進行轉染。
  12. 如請求項10之方法，其中該mRNA係編碼CD40L多肽且包含一選自由下列組成之群之多核苷酸：a)一包含SEQ ID NO：1之多核苷酸；b)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸40至822之多核苷酸；c)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸178至822之多核苷酸；d)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸190至822之多核苷酸；e)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸397至822之多核苷酸；f)一包含SEQ ID NO：1之核苷酸376至822之多核苷酸；g)一包含SEQ ID NO：9之多核苷酸；h)一包含SEQ ID NO：13之多核苷酸；i)一與(a)至(h)中任一多核苷酸具有至少80%之序列一致性之多核苷酸；j)一於嚴格條件下可與(a)至(h)中任一多核苷酸雜交之多核苷酸；及k)一(a)至(j)之多核苷酸，其進一步包含一選自由SEQ ID NO：14、15、16、17或18之核酸組成之群之3'未轉譯序列，及/或一選自由SEQ ID NO：19、20、21、22或23之核酸組成之群之5'未轉譯序列。
  13. 2或3之方法，其中該等CCR7+ 成熟DC可分泌0至500皮克/毫升IL-10/106 個DC。
  14. 2或3之方法，其中該等CCR7+ 成熟DC可分泌IL-12 p70蛋白質。
  15. 2或3之方法，其中該等不成熟樹突細胞係自CD34+ 幹細胞製備。
  16. 2或3之方法，其中該等不成熟樹突細胞係自外周血單核細胞(perpheral blood mononuclear cells；PBMCs)製備。
  17. 如請求項16之方法，其中該等不成熟樹突細胞係藉由將該等PBMCs與GM-CSF於IL-4及/或IL-13之存在下接觸製備之。
  18. 2或3之方法，其中該IFN-γR激動劑係IFN-γ或其生物活性片段。
  19. 如請求項18之方法，其中該IFN-γ具有序列SEQ ID NO：6。
  20. 2或3之方法，其中該IFN-γR激動劑包含一與SEQ ID NO：6具有至少80%序列一致性之多肽。
  21. 2或3之方法，其進一步包括向該等iDCs、經信號標誌DCs或CCR7+ 成熟DCs中引入一或多個抗原或編碼一或多個抗原的一或多個多核苷酸，以產生載有抗原之CCR7+ 成熟DCs。
  22. 如請求項21之方法，其中該抗原係選自由病原體、病原體裂解物、病原體提取物、病原體多肽、癌細胞、癌細 胞裂解物、癌細胞提取物、癌細胞專一性多肽組成之群。
  23. 如請求項21之方法，其中一編碼該(等)抗原之一(或多個)多核苷酸引入至該等iDCs、經信號標誌DCs或CCR7+ 成熟DC中。
  24. 如請求項23之方法，其中該多核苷酸係藉由電穿孔進行引入。
  25. 如請求項23之方法，其中該多核苷酸係mRNA。
  26. 如請求項25之方法，其中該編碼抗原之mRNA係與一編碼CD40激動劑之mRNA一起引入。
  27. 如請求項21之方法，其中該抗原或多核苷酸係於該第一信號之前引入。
  28. 如請求項21之方法，其中該抗原或多核苷酸係於該第一信號之後及於該第二信號之前遞送。
  29. 如請求項21之方法，其中該抗原或多核苷酸係於該第二信號之後遞送。
  30. 如請求項21之方法，其中該抗原或多核苷酸係實質與該第二信號同時遞送。
  31. 一種如請求項21之方法製備之CCR7+ 成熟DCs之用途，其係用於製造引發個體免疫反應之藥物。
  32. 如請求項31之用途，其中該等DCs對於該個體而言係為異體性。
  33. 如請求項31之用途，其中該等DCs對於該個體而言係自體性。
  34. 一種刺激免疫效應細胞之方法，其包括於藉由如請求項21之方法製備之載有抗原CCR7+ 成熟DC之存在下培養該等細胞，以產生經刺激之免疫效應細胞。
  35. 一種如請求項34之方法製備之經刺激免疫效應細胞之用途，其係用於製造增強個體免疫力之藥物。
  36. 2或3之方法，其進一步包括將該等不成熟樹突細胞、該等經信號標誌樹突細胞或該等CCR7+ 樹突細胞與一NKT細胞配體接觸。
  37. 如請求項36之方法，其中該NKT細胞配體係一選自由下列組成之群的化合物：α-半乳糖基神經醯胺、α-葡糖神經醯胺、α-6-脫氧半乳糖基神經醯胺、α-6-脫氧呋喃半乳糖基神經醯胺、β-6-脫氧呋喃半乳糖基神經醯胺、β-阿糖基神經醯胺、α-C-半乳糖基神經醯胺及α-S-半乳糖基神經醯胺。
  38. 如請求項37之方法，其中該化合物係(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酸基胺基)-1,3,4-十八碳三醇(KRN7000)。
  39. 如請求項36之方法，其中該等CCR7+ 樹突細胞係與該化合物接觸。
  40. 如請求項36之方法，其中該等不成熟DC係與該化合物接觸。
  41. 如請求項36之方法，其中該等經信號標誌DC係與該化合物接觸。
  42. 一種藉由如請求項1-30及36-41中任一項之方法製備之CCR7+ 成熟DC。
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