DE69333433T2

DE69333433T2 - Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung

Info

Publication number: DE69333433T2
Application number: DE69333433T
Authority: DE
Inventors: Ralph M. Steinman; Kayo Sakyo Inaba; Gerold Schuler
Original assignee: Rockefeller University; Merix Bioscience Inc
Current assignee: Rockefeller University; Merix Bioscience Inc
Priority date: 1992-04-01
Filing date: 1993-04-01
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2013-04-02
Also published as: US20090029469A1; CA2133409A1; US5994126A; EP0633929A1; ES2215991T3; US6475483B1; JP2002507881A; CA2133409C; PT633929E; US7923247B2; JP3649335B2; US20030134419A1; DE69333433D1; ATE260971T1; EP0633929B1; DK0633929T3; US5851756A

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der USA unter NIH-Stipendium AI13013, das von den National Institutes of Health gewährt wird, gemacht. Die Regierung der USA hat gewisse Rechte an dieser Erfindung. Diese Erfindung wurde auch durch die Österreichische Regierung durch die Stipendien NB 4370 (Österreichische Nationalbank) und P 8549M (Österreichischer Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung) unterstützt.
Fachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen des Immunsystems. Insbesondere wird ein Verfahren zum Kultivieren von proliferierenden Vorläufern dendritischer Zellen und ihre Reifung in vitro zu reifen dendritischen Zellen bereitgestellt. Diese Erfindung bezieht sich auch auf mit dendritischen Zellen modifizierte Antigene, die T-Zell-abhängig sind, das Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Immunogene. Impfstoffe, Verfahren zum Immunisieren von Tieren und Menschen unter Verwendung der reifen dendritischen Zellen der Erfindung und die modifizierten Antigene werden ebenfalls beschrieben.
Hintergrund der Erfindung
Das Immunsystem enthält ein System von dendritischen Zeilen, die spezialisiert sind, Antigene zu präsentieren und mehrere T-abhängige Immunreaktionen einzuleiten. Dendritische Zellen sind in verschiedenen Geweben weit über den ganzen Körper verteilt. Eine Übersicht über die Verteilung von dendritischen Zellen wurde in (1) gegeben. Dendritische Zellen findet man in nichtlymphoiden Organen entweder in der Nähe von Körperoberflächen, wie in der Haut und in den Luftwegen, oder in interstitiellen Bereichen von Organen wie dem Herz und der Leber. Dendritische Zellen, möglicherweise unter der Kontrolle des Cytokins Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (im folgenden GM-CSF), können einen Reifungsvorgang erfahren, der nicht zur Zellproliferation führt (2, 3). Am Anfang verarbeiten und präsentieren die dendritischen Zellen Antigene am wahrscheinlichsten auf häufigen, neu synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen, und dann werden starke akzessorische Funktionen und Zell-Zell-Adhäsionsfunktionen erworben (4–7). Dendritische Zellen können über das Blut und die Lymphe zu lymphoiden Organen wandern (8–10). Dort, vermutlich als die "interdigitierenden" Zellen des T-Bereichs (8, 11–13), können Antigene T-Zellen im rezirkulierenden Pool präsentiert werden (14). Es ist jedoch wenig über die Vorläufer von dendritischen Zellen in den verschiedenen, oben skizzierten Kompartimenten bekannt.
Die Wirksamkeit von dendritischen Zellen bei der Ablieferung von Antigenen in einer solchen Weise, dass eine starke Immunantwort erfolgt, d. h. ihre "Immunogenität", ist weitgehend anerkannt, aber die Verwendung dieser Zellen wird dadurch behindert, dass es in jedem gegebenen Organ nur sehr wenig davon gibt. In menschlichem Blut sind zum Beispiel etwa 0,1% der weißen Zellen dendritische Zellen (25), und ihr Wachstum wurde bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht induziert. Ähnlich wurde bei früheren Studien (20, 21) nicht die Entwicklung großer Zahlen von dendritischen Zellen aus Knochenmark in Kultur beschrieben. Ein jüngerer Bericht beschrieb die Entwicklung von dendritischen Zellen in Knochenmarkkulturen mit GM-CSF-Zusatz, doch wurde keine Dokumentation hinsichtlich des Ursprungs der dendritischen Zellen oder der Verwendung von proliferierenden Aggregaten als angereicherte Quelle von dendritischen Zellen beobachtet, Scheicher et al., J. Immunol. Method. 154: 253–264 (1992). Überdies berichten Markowiecz et al., J. Clin. Invest. 85: 955–961 (1990), über die Verwendung von GM-CSF zur Förderung der Differenzierung und der Überlebensrate von humanen dendritischen Zellen des peripheren Bluts in vitro. Diese Literaturstelle weist jedoch darauf hin, dass GM-CSF nicht bewirkt, dass dendritische Zellen sich teilen und vermehren. Während dendritische Zellen fremde Antigene zu Peptiden verarbeiten können, die von immunologisch aktiven T-Zel len erkannt werden müssen (4, 6, 7, 14), d. h. während dendritische Zellen das Phänomen der "Antigenpräsentation" bewerkstelligen, verhindern die geringen Zahlen von dendritischen Zellen ihre Verwendung beim Identifizieren von immunogenen Peptiden.
Dendritische Zellen in der Milz (15) und der afferenten Lymphe (16, 17) befinden sich nicht im Zellzyklus, sondern stammen von einem proliferierenden Vorläufer. Schließlich kommen dendritische Zellen aus dem Knochenmark (15, 16, 18, 19), doch ist es schwierig, diese Zellen in Kultur zu erzeugen, abgesehen von zwei Berichten, die ihre Bildung in kleinen Zahlen beschreiben (20, 21). Obwohl eine Knochenmark-Vorläuferzelle beschrieben wurde, wurden keine Bedingungen angegeben, die in -Kultur zu ihrer Proliferation führen. R. Steinman, "The Dendritic Cell System and Its Role in Immunogenicity", Ann. Rev. Immunol., 9: 271–96 (1991). Die Identifizierung von proliferierenden dendritischen Zellen in Knochenmark im Gegensatz zu Blut ist schwierig, da es große Zahlen von Granulocyten gibt, die sich als Reaktion auf GM-CSF entwickeln, und diese bevölkern in großer Zahl die Kulturen unreifer dendritischer Zellen, was die Reifung der Vorläufer dendritischer Zellen verhindert. Es wurde berichtet, dass die Verwendung von Zelloberflächenmarkern, um Vorläufer dendritischer Zellen des Knochenmarks anzureichern, nur zu mäßigen Erhöhungen führt, da die Marken auch von zahlreichen nichtdendritischen Knochenmarkzellen exprimiert werden, W. E. Bowers und Goodell, "Dendritic Cell Ontogeny", Res. Immunol. 140: 880–883 (1989).
Relativ kleine Zahlen von dendritischen Zellen wurden auch aus Blut isoliert, J. Vakkila et al., "Human peripheral blood-derived dendritic cells do not produce interleukin 1α, interleukin 1β, or interleukin 6", Scand. J. Immunol., 31: 345–352 (1990); W. C. van Voorhis et al., "Human Dendritic Cells", J. Exp. Med., 1172–1187 (1982). Die Anwesenheit von Vorläufern dendritischer Zellen in Blut wurde jedoch nicht beschrieben, und noch 1989 war die Beziehung zwischen dendritischen Zellen des Bluts und reifen dendritischen Zellen in anderen Geweben ungewiss. Weiterhin wurde erkannt, dass dendritische Zellen "selten und schwierig zu isolieren sind und bis jetzt nicht gezeigt wurde, dass sie in peripheren Geweben zu DC [dendritischen Zellen] führen". G. G. MacPherson, "Lymphoid Dendritic Cells: Their Life History and Roles in Immune Responses", Res. Immunol. 140: 877–926 (1989).
Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) ist ein Faktor, der die Reifung und Funktion dendritischer Zellen moduliert, Witmer-Pack et al., "Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is essential for the viability and function of cultured murine epidermal Langerhans cells", J. Exp. Med. 166: 1484–1498 (1987), C. Heufler et al., "Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin 1 mediate the maturation of murine epidermal Langerhans cells into potent immunostimulatory dendritic cells", J. Exp. Med. 167: 700–705 (1988). Die GM-CSF-stimulierte Reifung von dendritischen Zellen in vitro lässt vermuten, dass die Anwesenheit von GM-CSF in einer Kultur von Vorläufern dendritischer Zellen die Reifung zu immunologisch aktiven Zellen vermitteln würde, aber das wichtige Ziel, ein ausgedehntes Wachstum dendritischer Zellen zu erreichen, muss erst noch erreicht werden.
T-abhängige Immunantworten sind durch die Aktivierung von T-Helferzellen bei der Erzeugung von Antikörper durch B-Zellen gekennzeichnet. Ein Vorteil von T-abhängigen gegenüber T-unabhängigen Immunantworten besteht darin, dass die T-abhängigen Antworten ein Gedächtnis haben, d. h. die Zellen bleiben auch in Abwesenheit von Antigen bereit, auf Antigen mit einer schnellen Erzeugung von Antikörper zu reagieren, und die Immunantwort ist daher "auffrischbar". T-unabhängige Immunantworten sind dagegen bei Kindern relativ schwach, und es fehlt eine Auffrischungsreaktion, wenn ein T-unabhängiges Antigen wiederholt verabreicht wird. Das immunologische Gedächtnis von T-Zellen spiegelt wahrscheinlich zwei Folgen des ersten, "primären" oder "sensibilisierenden" Glieds der Immunantwort wider: (a) eine erhöhte Zahl von antigenspezifischen T-Zellen, die als Reaktion auf antigentragende dendritische Zellen wachsen, und (b) die verstärkten funktionellen Eigenschaften von individuellen T-Zellen, die nach der Vorbereitung der dendritischen Zelle auftreten [Inaba et al., Resting and sensitized T lymphocytes exhibit distinct stimulatory (antigen presenting cell) requirements for growth and lymphokine release; J. Exp. Med. 160: 868–876 (1984); Inaba und Steinman, "Protein-specific helper T lymphocyte formation initiated by dendritic cells", Science 229: 475–479 (1985); Inaba et al., "Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction", Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7686–7690 (1985)].
Bestimmte Typen von Antigenen rufen charakteristischerweise T-Zell-abhängige Antikörperreaktionen hervor, während andere eine T-Zell-unabhängige Antwort hervorrufen. Zum Beispiel rufen Polysaccharide im Allgemeinen eine T-Zell-unabhängige Immunantwort hervor. Es gibt keine Gedächtnisreaktion und daher auch keinen Schutz vor einer anschließenden Infektion mit dem Polysaccharid-Antigen. Proteine rufen bei Säuglingen jedoch eine T-Zell-abhängige Antwort hervor. Die Entwicklung von konjugierten Impfstoffen, die ein Polysaccharid enthalten, das kovalent an ein Protein gekoppelt ist, wandelt die T-unabhängige Reaktion auf Polysaccharid in eine T-abhängige Reaktion um. Unglücklicherweise ist wenig über die Stellen auf Proteinen bekannt, die ihnen den T-Zell-abhängigen Charakter verleihen, was die Gestaltung spezifischerer Immunogene behindert.
Wie bereits gesagt, spielen dendritische Zellen eine entscheidende Rolle bei der Einleitung von T-Zell-abhängigen Reaktionen. Dendritische Zellen binden und modifizieren Antigene, in einer solchen Weise, dass das modifizierte Antigen, wenn es auf der Oberfläche der dendritischen Zelle präsentiert wird, T-Zellen aktivieren kann, so dass sie sich schließlich an der Produktion von Antikörpern beteiligen. Die Modifikation von Antigenen durch dendritische Zellen kann zum Beispiel das Fragmentieren eines Proteins unter Bildung von Peptiden beinhalten, die Bereiche aufweisen, welche spezifisch befähigt sind, T-Zellen zu aktivieren.
Die Ereignisse, durch die Zellen Antigene zu Peptiden fragmentieren und dann diese Peptide in Verbindung mit Produkten des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentieren, werden "Antigenpräsentation" genannt. Der MHC ist ein Bereich von hochgradig polymorphen Genen, deren Produkte auf den Oberflächen einer Vielzahl von Zellen exprimiert werden. MHC-Antigene sind die hauptsächlichen Determinanten der Transplantatsabstoßung. Zwei verschiedene Typen von MHC-Genprodukten, Klasse-I- und Klasse-II-MHC-Moleküle, sind identifiziert worden. T-Zellen erkennen Fremdantigene, die nur an ein einziges spezifisches Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-Molekül gebunden sind. Die Muster der Antigenassoziation mit Klasse-I- oder Klasse-II-MHC-Molekülen bestimmen, welche T-Zellen stimuliert werden. Zum Beispiel binden Peptidfragmente, die von extrazellulären Proteinen stammen, gewöhnlich an Klasse-II-MHC-Moleküle, während Proteine, die in dendritischen Zellen endogen transcribiert werden, im Allgemeinen mit neu synthetisierten Klasse-I-MHC-Molekülen assoziieren. Infolgedessen werden exogen und endogen synthetisierte Proteine typischerweise durch unterschiedliche T-Zell-Populationen erkannt.
Dendritische Zellen sind spezialisierte antigenpräsentierende Zellen in der Immunantwort von ganzen Tieren (14, 31). Wiederum jedoch wird die Fähigkeit, zur Verwendung dendritischer Zellen zum Identifizieren und Extrahieren der immunogenen Peptide durch die geringen Zahlen dieser spezialisierten antigenpräsentierenden Zellen behindert.
Die Aufnahme von Teilchen ist eine spezielle Aktivität von mononukleären und polymorphonukleären Phagocyten. Tote Zellen, Immunkomplexe und Mikroorganismen werden alle gierig internalisiert. Nach der Fusion mit hydrolasereichen Lysosomen werden die aufgenommenen Teilchen abgebaut (60, 61). Dieser Abbau muss bis zum Niveau von permeationsfähigen Aminosäuren (62, 63) und Sacchariden erfolgen, denn ansonsten würde der Vakuolenapparat vor unverdaulichen Stoffen anschwellen (64, 65). Solche Clearance- und Verdauungsfunktionen von Phagocyten tragen zur Wundheilung, Geweberemodellierung und Wirtsabwehr bei.
Eine weitere Folge der Endocytose, die Verarbeitung von Antigenen durch antigenpräsentierende Zellen (APCs), unterscheidet sich in vielerlei Hinsicht von der säubernden Funktion der Phagocytose. Erstens erfordert die Verarbeitung die Erzeugung von Peptiden mit einer Länge von wenigstens 8–18 Aminosäuren (66, 67), während die Säuberung zur Verdauung zu Aminosäuren führt (62, 63). Zweitens erfordert die Präsentation die Bindung von Peptiden an MHC-Klasse-II- Produkte (6, 68), während die Säuberung keine MHC-Produkte erfordert. Drittens kann die Antigenpräsentation mit geringer Kapazität funktionieren, da für eine erfolgreiche Stimulierung bestimmter T-T-Hybride (69, 70) und primärer T-Zell-Populationen (71) nur wenige hundert Ligandmoleküle erzeugt werden müssen. Während der Säuberung beseitigen und zerstören Phagocyten jede Stunde leicht Hunderttausende von Proteinmolekülen (63). Schließlich wird die Antigenpräsentation am besten von Zellen durchgeführt, die reich an MHC Klasse II sind, aber nur wenig phagocytische Aktivität und wenige Lysosomen zeigen, d. h. von dendritischen Zellen und B-Zellen, während Phagocyten (Macrophagen und Neutrophile) häufig geringe Mengen an Klasse II und reichlich Lysosomen aufweisen. Diese Beobachtungen haben zusammen mit der Identifizierung von antigenen Spezialisierungen innerhalb des endocytischen Systems von dendritischen Zellen und B-Zellen zu der Vermutung geführt, dass sich die für die Antigenpräsentation erforderliche Maschinerie von der für die Säuberung erforderlichen unterscheiden könnte, sowohl quantitativ als auch qualitativ (31).
Im Falle von dendritischen Zellen gab es Hinweise darauf, dass diese APCs zu irgendeinem Zeitpunkt während ihres Lebens zur phagocytischen Aktivität befähigt sind. Pugh et al. bemerkten in einigen dendritischen Zellen der afferenten Lymphe Feulgen-gefärbte Einschlüsse und schlugen vor, dass vor dem Eintritt in die Lymphe die Phagocytose anderer Zellen stattgefunden hatte (16). Fossum bemerkte phagocytische Einschlüsse in den interdigitierenden dendritischen Zellen der T-Zell-Bereiche in Mäusen, die allogene Leukocyten abstießen (71). Reis e Sousa et al. (74) fanden heraus, dass frisch isolierte epidermale Langerhans-Zellen, bei denen es sich um unreife, aber nichtproliferierende dendritische Zellen handelt, kleine Mengen bestimmter Teilchen internalisieren. Keiner dieser Berichte zeigt jedoch das Auftreten von Phagocytose oder lässt diese vermuten, wenn Teilchen an Kulturen von proliferierenden dendritischen Zellen verabreicht werden.
Die Injektion von mit pathogenen Lymphocyten gepulsten dendritischen Zellen in Säuger, um eine aktive Immunantwort gegen Lymphome hervorzurufen, ist Gegenstand der PCT-Patentanmeldung WO 91/13632. Außerdem berichteten Francotte und Urbain, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8149 (1985), dass in vitro mit Virus gepulste und zurück in Mäuse injizierte murine dendritische Zellen die primäre Antwort und die sekundäre Antwort auf das Virus verstärkten. Weder der Bericht von Francotte und Urbain noch die Patentanmeldung WO 91/13632 stellen ein praktikables Verfahren der Verwendung von dendritischen Zellen als Adjuvans, um die Immunantwort zu aktivieren, bereit, da diese beiden Verfahren von dendritischen Zellen abhängen, die aus der Milz gewonnen werden, eine für die meisten Therapien oder Immunisierungsverfahren impraktikable Quelle von Zellen. Außerdem stellt keiner der Berichte ein Verfahren bereit, um dendritische Zellen in ausreichenden Mengen zu erhalten, um klinisch verwendbar zu sein.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt folgendes bereit:

(1) ein Verfahren zur Herstellung einer Population von Vorläufern dendritischer Zellen, das folgendes umfasst: a) Bereitstellen einer Gewebequelle, die Vorläufer dendritischer Zellen umfasst; b) Behandeln der Gewebequelle aus a) zur Erhöhung des Anteils an Vorläufern dendritischer Zellen, so dass man eine Population von Zellen erhält, die zur Kultur in vitro geeignet sind; c) Kultivieren der Gewebequelle auf einem Substrat in einem Kulturmedium, das GM-CSF umfasst, so dass man nichtadhärente Zellen und Zellhaufen erhält; d) Subkultivieren der nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen unter Bildung von Zellaggregaten, die proliferierende Vorläufer dendritischer Zellen umfassen; und e) ein- oder mehrmaliges serielles Subkultivieren der Zellaggregate, so dass der Anteil der Vorläufer dendritischer Zellen angereichert wird; sowie
(2) ein Verfahren zur Herstellung einer Population von reifen dendritischen Zellen aus proliferierenden Zellkulturen, das folgendes umfasst: a) Bereitstellen einer Gewebequelle, die Vorläufer dendritischer Zellen umfasst; b) Behandeln der Gewebequelle aus a) zur Erhöhung des Anteils an Vorläufern dendritischer Zellen, so dass man eine Population von Zellen erhält, die zur Kultur in vitro geeignet sind; c) Kultivieren der Gewebequelle auf einem Substrat in einem Kulturmedium, das GM-CSF umfasst, so dass man nichtadhärente Zellen und Zellhaufen erhält; d) Subkultivieren der nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen unter Bildung von Zellaggregaten, die proliferierende Vorläufer dendritischer Zellen umfassen; e) ein- oder mehrmaliges serielles Subkultivieren der Zellaggregate, so dass der Anteil der Vorläufer dendritischer Zellen angereichert wird; und f) Weiterkultivieren der Vorläufer dendritischer Zellen während einer ausreichenden Zeit, so dass sie zu reifen dendritischen Zellen reifen können.

Um den Anteil an nichtdendritischen Vorläuferzellen zu reduzieren, kann die Gewebequelle vor dem Kultivieren der Gewebequelle auf einem Substrat, um die nichtadhärenten Zellen zu erhalten, oder während der frühen Stadien der Kultur vorbehandelt werden. Bevorzugte Gewebequellen für die praktische Durchführung der Erfindung sind Knochenmark und insbesondere Blut.
Die Verfahren (1) und (2) der Erfindung können den Schritt des Erhöhens des Anteils von in der Gewebequelle vorhandenen dendritischen Zellen beinhalten, indem man das Individuum mit einer Substanz behandelt, um die Blutbildung zu stimulieren.
Wenn Knochenmark als Gewebequelle verwendet wird, umfasst der Vorbehandlungsschritt das Abtöten von Zellen, die Antigene exprimieren, welche nicht auf Vorläufern dendritischer Zellen exprimiert werden, durch In-Kontakt-Bringen des Knochenmarks mit Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, die auf Vorläufern dendritischer Zellen nicht vorhanden sind, in einem Medium, das Komplement umfasst. Die Entfernung unerwünschter nichtdendritischer Zellvorläufer kann auch bewerkstelligt werden, indem man die unerwünschten nichtdendritischen Zellen oder ihre Vorläuferzellen auf einem festen Träger adsorbiert.
Die Vorläufer dendritischer Zellen und die dendritischen Zellen, die nach den Verfahren (1) und (2) erhältlich sind, können therapeutisch verwendet werden, und sie können auch verwendet werden, um neue therapeutische Antigene herzustellen.
Die Verfahren (1) und (2) der Erfindung können verwendet werden, um antigenaktivierte dendritische Zellen herzustellen. In den Verfahren werden antigenaktivierte dendritische Zellen Antigen ausgesetzt und exprimieren modifizierte Antigene für die Präsentation gegenüber und Aktivierung von T-Zellen.
Die Verfahren (1) und (2) der Erfindung sind auch geeignet, um neue Antigene bereitzustellen. Solche Antigene werden erzeugt, indem man ein Antigen Kulturen dendritischer Zellen aussetzt, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, wobei das Antigen durch die dendritischen Zellen so modifiziert wird, dass modifizierte Antigene entstehen, bei denen es sich um immunogene Fragmente des unmodifizierten oder nativen Antigens handelt, die T-Zellen aktivieren.
Diese Antigene können verwendet werden, um Tiere und Menschen zu immunisieren und so eine Krankheit zu verhindern oder zu behandeln.
Die Vorläufer dendritischer Zellen sind auch geeignet, um Antigene herzustellen, z. B. durch Bereitstellen von Vorläufern dendritischer Zellen aus einer Population von proliferationsfähigen Vorläuferzellen, In-Kontakt-Bringen der Vorläuferzellen mit Antigen während einer ausreichenden Zeitspanne, um es den Vorläufern dendritischer Zellen zu ermöglichen, das Antigen zu phagozytieren, und antigenhaltige Vorläufer dendritischer Zellen zu erhalten, Kultivieren der antigenhaltigen Vorläufer dendritischer Zellen unter Bedingungen und während einer ausreichenden Zeitspanne, dass das Antigen von Vorläufern dendritischer Zellen verarbeitet und präsentiert werden kann.
Die von den Vorläufern dendritischer Zellen als Ergebnis der Phagocytose verarbeiteten Antigene können selbst allein oder in Kombination mit Adjuvantien einschließlich Vorläufern dendritischer Zellen verwendet werden, um bei einem Individuum eine Immunantwort auf das Antigen hervorzurufen.
Die Ausbeute an Vorläufern dendritischer Zellen wird erhöht, indem man die Vorläufer in einer ausreichenden Menge an GM-CSF und anderen Cytokinen kultiviert, um die Proliferation der Vorläufer dendritischer Zellen zu fördern. Weitere Cytokine sind unter anderem G-CSF, M-CSF, TNF-α, Interleukin-3 und Interleukin-1α, Interleukin-1β, Interleukin 6 und Stammzellenfaktor.
Außerdem können Selbstpeptidantigene hergestellt werden, indem man die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen dendritischen Zellen mit einem Protein, gegen das ein Individuum eine Immunantwort entwickelt hat, pulst und das relevante Selbstpeptid oder das Autoantigen extrahiert. Ein solches Selbstpeptidantigen kann verwendet werden, um Autoimmunkrankheiten zu behandeln, indem man z. B. ein Individuum mit therapeutisch wirksamen Mengen von nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Selbstpeptiden behandelt, um Toleranz gegenüber den Selbstproteinen zu induzieren.
Eine solche Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von antigenaktivierten dendritischen Zellen an ein Individuum, das einer Behandlung bedarf, umfasst, wobei das Antigen ein Selbstprotein oder Autoantigen ist, wird ebenfalls bereitgestellt.
Zu den Autoimmunkrankheiten, die behandelt werden können, gehören juvenile Diabetes, Myasthenia gravis und multiple Sklerose.
Ähnlich können auch Entzündungskrankheiten behandelt werden, bei denen die Pathogenese übertriebene T-Zell-vermittelte Immunreaktionen beinhaltet, wie solche, die bei atopischer Dermatitis und Kontaktdermatitis vorhanden sind.
Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten dendritischen Zellen sind auch geeignet, um ein Antigen gegenüber einem Wirt bereitzustellen, indem man z. B. ein Antigen einer Kultur von nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellten dendritischen Zellen aussetzt, um antigenaktivierte dendritische Zellen zu erzeugen, und anschließend den Wirt mit den antigenaktivierten dendritischen Zellen impft.
Überdies können T-Zellen aktiviert werden, indem man proliferierende dendritische Zellen verwendet, um Protein-, virale und mikrobielle Antigene in situ in einer immunogenen Form einzufangen und dann diese Antigene entweder in vitro oder in situ in potenter Weise T-Zellen zu präsentieren. Es können reife dendritische Zellen und ihre Vorläufer verwendet werden, um MHC-Klasse-I- und -II-Produkten Antigenpeptide zu präsentieren.
Dendritische Zellen oder Vorläufer dendritischer Zellen können als Träger für die aktive Immunisierung und Immuntherapie in situ verwendet werden. Antigene oder die oben beschriebenen antigenaktivierten dendritischen Zellen können als Impfstoffe verwendet werden.
Ein Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Kultivieren von Vorläufern dendritischer Zellen in vitro bereitzustellen, so dass sie sich zu reifen dendritischen Zellen entwickeln, die zur Verwendung als Immunogene oder Adjuvantien geeignet sind, wenn sie mit einem Antigen kombiniert werden.
Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, Vorläufer dendritischer Zellen bereitzustellen, die in der Lage sind, antigenisches Material zu phagozytieren, das von den Vorläufern dendritischer Zellen verarbeitet und präsentiert werden soll.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, eine zweckmäßige und praktikable Quelle für ausreichende Mengen an dendritischen Zellen und Vorläufern dendritischer Zellen, die für die Behandlung oder Prävention einer Krankheit geeignet sind, bereitzustellen.
Legenden der Figuren
1. Flussdiagramm für die Induktion von "Kolonien" von dendritischen Zellen.
2. FACS-Analysen von dendritischen Zellen, die aus proliferierenden Aggregaten freigesetzt werden. Mehrere mAbs, die verschiedene Zelloberflächendeterminanten auf Vorläufern dendritischer Zellen erkennen (23, 24, 28), sind gezeigt. Abgesehen von den MHC-Klasse-I- und -II-Produkten ist der Phänotyp der freigesetzten Zellen homogen. Das Färben mit keinem primären mAb war zu RB6 und RA3 identisch.
3. FACS-Analysen von Vorläufern dendritischer Zellen, die durch Pipettieren von proliferierenden Aggregaten mit der Pasteur-Pipette entfernt werden könnten, und von spontan in Kultur freigesetzten dendritischen Zellen. Die mAb sind: M1/42-Anti-MHC Klasse I [ATCC-Nr. TIB 126]; NLDC145-Anti-interdigitierende Zelle (13); M5/114-Anti-MHC-Klasse-II [ATCC-Nr. TIB 120]; 33D1-Antidendritische-Zelle [ATCC-Nr. TIB 227]; B5-5-Anti-Thy-1. Die Färbung mit Anti-MHC-mAbs ist bimodal, aber die freigesetzte Zellfraktion von dendritischen Zellen ist am reichsten an der Expression von MHC-Klasse-I- und -II.
4. Die MLR-stimulierende Aktivität von Populationen, die aus den GM-CSF-stimulierten Mausblutkulturen isoliert wurden [siehe Text].
5. Progressive Entwicklung von MLR-stimulierender Aktivität in Knochenmark, das in Gegenwart von GM-CSF kultiviert wurde.
Ia-negative Vorläufer, B- und T-Zell-abgereicherte Knochenmarkzellen wurden in GM-CSF kultiviert, wobei alle 2 Tage 3/4 des Mediums ersetzt wurde. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Zellen durch sachtes Pipettieren entfernt. Nach der Bestrahlung wurden abgestufte Dosen von Knochenmarkzellen auf 3 × 10⁵ allogenische [C57BL/6, links] oder syngenische [BALB/C × DBA/2 F1] T-Zellen angewendet und 4 Tage lang im MLR kultiviert. Die Aufnahme von ³H-TdR wurde nach 80–94 h gemessen [die Werte sind Mittelwerte von drei Parallelmessungen mit Standardabweichungsbalken].
6. Physikalische Eigenschaften der MLR-stimulierenden Zellen, die sich in Knochenmarkkulturen mit GM-CSF-Zusatz entwickeln [siehe Text].

A. Kulturen ähnlich denjenigen in 5 wurden in nichtadhärente [nicht ausgefüllte Symbole] und locker adhärente Fraktionen [ausgefüllte Symbole] getrennt, wobei letzteres Zellen sind, die durch sachtes Pipettieren über der Monoschicht entfernt werden könnten. Für die Tag-4-Trennungen wurden locker adhärente Zellen [hauptsächlich Granulocyten] am Tag 2 weggespült, und für die Tag-6-Trennung wurden Granulocyten am Tag 2 und Tag 4 weggespült. Die Zellen wurden bestrahlt und wie in 5 in abgestuften Dosen auf allogenische T-Zellen angewendet.
B. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden freie Zellen und Zellaggregate aus der stromalen Monoschicht entfernt und durch 1-g-Sedimentation abgetrennt. Die Aggregate wurden 1 Tage lang kultiviert, um freigesetzte Zellen zu erhalten. Diese Zellen wurden bestrahlt und als MLR-Stimulatoren getestet, genauso wie fest anhaftende Zellen, die in Gegenwart von 10 mM EDTA entfernt wurden [nicht ausgefüllte Quadrate].

7. Cytofluorometrie der Entwicklung von Ia-positiven Zellen aus Aggregaten innerhalb von mit GM-CSF versetzten Knochenmarkkulturen.
GM-CSF-stimulierte Knochenmarkkulturen [links, unfraktioniert] wurden mit locker befestigten Zellaggregaten [Mitte] und nach Kultur über Nacht aus den Aggregaten freigesetzten Zellen [rechts] verglichen. Die Zellen wurden an Tag 4 oder Tag 6 entnommen, so dass die freigesetzten Zellen an Tag 5 und Tag 7 analysiert wurden. Die Zellen wurden ohne primären mAb [no 1ry] oder mit mAb gegen Granulocyten [RB-6] oder MHC-Klasse-II-Produkten [B21-2] und anschließend mit FITC-Maus-Anti-Ratten-Ig angefärbt.
8. Detaillierte cytofluorometrische Phänotyp-Analyse der Ia-positiven Zellen, die aus den wachsenden dendritischen Zellaggregaten freigesetzt wurden. Kontaminierende Ia-negative Granulocyten wurden auf der Basis der geringeren Vorwärtslichtstreuung ausgeleitet, so dass man die Expression vieler Oberflächenantigene auf den größeren Zellen unter Verwendung von Ratten- und Hamster-Anti-Maus-mAbs (7, 17), wie angegeben, untersuchen konnte.
9. Quantifizierung von sich entwickelnden Zellen, die die auf dendritische Zellen beschränkten Granulum-Antigene 2A1 und M342 tragen.
Dendritische Zellen enthalten intrazelluläre Granula, die mit den mAb, wie M342 und 2A1 (34), reagieren. Ia-negative Nichtlymphocyten aus Mausknochenmark wurden in GM-CSF kultiviert, und die locker adhärenten Granulocyten wurden an Tag 2 und Tag 4 weggespült. Die Daten an Tag 2 und 4 stellen Zellen dar, die durch Pipettieren entfernt werden könnten, während die Daten an Tag 3 und an den Tagen 5–8 aus der Monoschicht freigesetzten Zellen entsprachen. Zu jedem der angegebenen Zeitpunkte wurden wenigstens 500 Zellen in präparierten und angefärbten Cytospins gezählt [siehe Text]. Wenn Kulturen mit 5 × 10⁵ Zellen/cm² gestartet und alle 2 Tage mit 3/4 Volumen frischem Medium gefüttert werden, betrugen die Ausbeuten an Gesamt- und Ia-positiven Zellen an Tag 2 1,05 × 10⁶ bzw. 2,1 × 10⁴, an Tag 4 1,81 × 10⁶ bzw. 2,12 × 10⁵ und an Tag 6 1,54 × 10⁶ bzw. 3,12 × 10⁵.
10. Vorläufer-Nachkommenschaft-Beziehungen in wachsenden dendritischen Zellen. Wachsende Aggregate wurden an Tag 4 aus Knochenmarkkulturen abgetrennt und 12 h lang mit ³N-TdR in einer Menge von 0,1 μCi/ml mit 3 × 10⁵ Zellen/Napf gepulst. In allen Näpfen wurde das Medium gegen frisches ausgetauscht, und die Näpfe wurden während 1, 2 oder 3 Tagen Chase-Phase zur Kultur zurückgeführt. Die Ausbeute an während der Chase-Phase freigesetzten Zellen betrug 2,0, 2,9 bzw. 3,0 × 10⁵ pro Napf. Der Gehalt an Ia-positiven Zellen betrug 28% nach dem Puls und 47%, 55% bzw. 62% an den Tagen 1, 2 bzw. 3. Die Daten sind als Prozentsatz von Zellen gezeigt, die radioaktiv markiert waren, wobei es sich bei den ausgefüllten Balken um Zellen handelt, die das 2A1-Granulum-Zellantigen von reifen dendritischen Zellen exprimieren.
11. Diagramm des vorgeschlagenen Weges der Entwicklung dendritischer Zellen in mit GM-CSF versetzten Knochenmarkkulturen. Ein proliferierendes Aggregat bildet sich aus einem Vorläufer, der sich entweder an das Zellstroma heftet oder selbst adhärent ist. Während der Differenzierung der dendritischen Zelle, die am Rand des Aggregats und bei daraus freigesetzten Zellen erkennbar ist, gibt es eine progressive Zunahme der Zellfortsätze, von MHC Klasse II, von NLDC-145-Oberflächenantigen und intrazellulärem Antigen M342 und 2A1 [siehe Text] und eine progressive Abnahme der Adhärenz an Kunststoff.
12: Diff-Quick-Färbungen von sich entwickelnden dendritischen Zellen, die Latex und Kohlenstoff ausgesetzt wurden.

A. Ein Aggregat von sich entwickelnden dendritischen Zellen, die nach 20 h Einwirkung von 2u-Latexkügelchen einem Cytospinning unterzogen wurden. Viele Zellen im Aggregat sind mit den gleichmäßigen Latexteilchen markiert [Pfeile].
B. Genauso wie A, aber die Kulturen wurden einen Tag lang der Chase-Phase ausgesetzt, um die Erzeugung von reifen einzelnen dendritischen Zellen zu ermöglichen. Viele der freigesetzten dendritischen Zellen enthalten die gleichmäßigen und durchsichtigen Latexkügelchen, die um eine klar abgegrenzte Centrosphäre herum angeordnet sind [Pfeile].
C. Genauso wie A und B, aber die Aggregate wurden mit kolloidalem Kohlenstoff gepulst und dann einen Tag lang in kohlenstofffreiem Medium einer Chase-Phase ausgesetzt. Die Centrosphäre einiger der reifen dendritischen Zellen, die aus dem Aggregat freigesetzt werden, enthalten kleine, aber klar abgegrenzte endocytische Granula aus schwarzem, unverdaulichem phagocytischem Tracer [Pfeile].
D. Reife dendritische Zellen wurden Kohlenstoff ausgesetzt, nachdem sie von proliferierenden Aggregaten erzeugt worden waren. Kohlenstoffablagerungen sind nicht zu sehen.

13: Aufnahme von BCG in sich entwickelnde dendritische Zellen unter Verwendung von zweifarbigen Markern für säurefeste Bacillen und Antigene dendritischer Zellen. Cluster von sich entwickelnden dendritischen Zellen [6 Tage Knochenmarkkulturen, induziert mit GM-CSF] wurden 20 h lang BCG ausgesetzt. Die Monoschichten wurden gewaschen und 2 Tage lang in Medium mit GM-CSF einer Chase-Phase ausgesetzt. Die Zellen wurden dissoziiert, mit FITC-Anti-I-A-mAb markiert, und die Klasse-II-reichen Zellen wurden durch Zellsortierung isoliert [die meisten der Zellen in der Kultur sind Klasse-II-reich, wie schon früher gezeigt wurde (16)]. Die sortierten Zellen wurden einem Cytospinning unterzogen, mit Auramin-Rhodamin angefärbt, um das zellassoziierte BCG sichtbar zu machen, und mit einem anderen mAb und Immunoperoxidase doppelt markiert. Das linke und das rechte Bild von jedem Paar sind eine Phasenkontrastansicht bzw. eine Acid-Fast-Ansicht. Die Pfeile auf der linken Seite zeigen die Stelle der Bacillen auf der rechten Seite an. Der Marker für Klasse II [I-A und I-E, M5/114] lässt die Konturen der Zellfortsätze besser erkennen als der auf dendritische Zellen beschränkte NLDC-145-Antikörper.
14: Elektronenmikroskopie von BCG in dendritischen Zellen.
Wie in 2 wurde BCG einen Tag lang zu GM-CSF-stimulierten Tag-6-Knochenmarkkulturen gegeben. Nach dem Waschen und 2 weiteren Tagen Kultur wurden die freigesetzten Zellen für die Elektronenmikroskopie verarbeitet.

A, B. Ansichten mit geringer Vergrößerung, um die typischen dendritischen Zellen mit zahlreichen Fortsätzen und wenigen phagozytierten BCG [Pfeile] zu zeigen.
C, D. Ansichten mit stärkerer Vergrößerung, um die phagosomalen Membranen gegen das BCG sowie Organellen der Centrosphäre der dendritischen Zellen einschließlich endocytischer Vakuolen [E], des Golgi-Apparats [GA] und kleiner Vesikel mit einem dichten Kern [*] zu zeigen.

15: Antigenpräsentation gegenüber CFA-vorbereiteten/IFA-vorbereiteten T-Zellen.
T-Zellen wurden aus Lymphknoten gereinigt, die Pfoten entwässern, welche mit vollständigem [CFA] oder unvollständigem [IFA] Freund-Adjuvans vorbehandelt wurden. Die verschiedenen APCs sind aufgeführt. Reife dendritische Zellen sind aus Tag-8-Knochenmarkkulturen, und unreife dendritische Zellen sind aus Tag-5-6-Kulturen.
16: Antigenpräsentation gegenüber naiven Lymphknoten-T-Zellen in situ Wachsende Kulturen von dendritischen Zellen aus Knochenmark wurden an Tag 5–6 mit BCG gepulst und sofort oder nach einer zweitägigen Chase-Kultur verwendet, um T-Zellen zu aktivieren. Die Populationen wurden ohne künstliche Adjuvantien in die Pfoten von naiven Mäusen injiziert. Fünf Tage später wurden die entwässernden Lymphknoten entnommen und in vitro mit abgestuften Dosen von PPD oder BSA stimuliert (die dendritischen Zellen waren mit fetalem Kälberserum gezüchtet worden), wobei das BSA als nichtteilchenförmiges Antigen diente. Die Daten sind Mittelwerte und Standardabweichungen für Gruppen von 5 Mäusen, die jeweils getrennt untersucht wurden. Kontrolllymphknoten, die BCG-gepulsten dendritischen Zellen nicht ausgesetzt waren, reagierten nicht auf PPD oder BSA (< 2000 cpm).
17: Antigenpräsentation gegenüber naiven Milzzellen in situ.
Wachsende Kulturen von dendritischen Zellen aus Knochenmark wurden an Tag 5–6 (unreif), Tag 7–8 (reif) oder an Tag 5–6 mit anschließender zweitägiger Chase-Phase mit BCG gepulst. Von jeder Gruppe wurden 10⁶ Zellen intravenös in Gruppen von Mäusen injiziert. Fünf oder zehn Tage später wurden die Milzzellen in vitro mit abgestuften Dosen von PPD oder BSA als Antigen kultiviert. Da die dendritischen Zellen in FCS kultiviert wurden, dient die Verwendung von BSA als Kontrolle, um zu gewährleisten, dass alle Populationen dendritischer Zellen in vivo eine vergleichbare Immunogenität hatten. Nicht vorbereitete Milz reagierte weder auf BSA noch auf PPD.
18A, B und C: MLR-Assay (mixed leukocyte reaction) von humanen dendritischen Zellen, die nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren erzeugt wurden. Abgestufte Dosen von bestrahlten Zellen (30 bis 30 000 in Verdünnungsreihen mit Verdünnung auf jeweils das Dreifache) wurden zu 2 × 10⁵ an akzessorischen Zellen abgereicherten T-Zellen gegeben. Die T-Zell-Antwort von Zellen, die in Abwesenheit von zugesetztem Cytokin (X) sowie in Gegenwart von GM-CSF (
), GM-CSF + IL-1α (
), GM-CSF + TNF-α (
), GM-CSF + TNF-α + IL-1α (
), GM-CSF + IL-3 (
) bzw. GM-CSF + IL-3 + IL-1 (
) kultiviert worden waren, wurde am fünften Tag mit einem 16-h-Puls von ³H-Thymidin gemessen. Die Reaktion von nichtdentritischen Zellen ist ebenfalls in C gezeigt (
). Drei verschiedene Experimente, A, B und C, werden vorgestellt. Patienten, die Zellen für die Experimente A und B lieferten, wurden mit G-CSF vorbehandelt, und der Patient in Experiment C wurde mit GM-CSF vorbehandelt. Cytokine wurden in den folgenden Konzentrationen verwendet: rhu GM-CSF: 400 oder 800 E/ml; rhu IL-1α: 50 LAF-Einheiten/ml (IL-1α war in Kulturen nur während der letzten 24 Stunden vor dem Ernten der Zellen vorhanden); rhu TNF-α: 50 E/ml; und rhu IL-3: 100 E/ml. Die Werte auf der X-Achse stellen die Anzahl von dendritischen Zellen dar, außer bei den X, bei denen dendritische Zellen abwesend waren und die Zahl äquivalent zur Gesamtzellzahl ist. Die Standardabweichungen von Kulturen in drei Parallelansätzen waren < 10% des Mittelwerts und sind nicht gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Kulturen von proliferierenden Vorläufern dendritischer Zellen, die in vitro zu reifen dendritischen Zellen ausreifen. Die dendritischen Zellen und die Vorläufer dendritischer Zellen, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, können in Mengen hergestellt werden, die für verschiedene immunologische Eingriffe für die Prävention und Behandlung von Krankheiten geeignet sind.
Das Ausgangsmaterial für das Verfahren zur Herstellung von Vorläufern dendritischer Zellen und von reifen dendritischen Zellen ist eine Gewebequelle, die Vorläufer dendritischer Zellen umfasst, wobei die Vorläuferzellen in der Lage sind, in vitro zu proliferieren und zu dendritischen Zellen auszureifen, wenn sie nach dem Verfahren der Erfindung behandelt werden. Solche Vorläuferzellen sind nichtadhärent und lassen sich typischerweise nicht mit mAb-Markern markieren, die man auf reifen dendritischen Zellen findet, wie IA-Antigene, 2A1- und M342-Antigene (34, 44) und das von interdigitierenden Zellen stammende Antigen NLDC145 (13). Vorzugsweise sind solche Gewebequellen die Milz, die afferente Lymphe, Knochenmark und Blut. Besonders bevorzugte Gewebequellen sind Knochenmark und Blut. Blut ist auch eine bevorzugte Gewebequelle für Vorläuferzellen, da es leicht erreichbar ist und in relativ großen Mengen erhalten werden kann.
Um die Zahl an dendritischen Vorläuferzellen in Tieren einschließlich des Menschen zu erhöhen, ist es bevorzugt, solche Individuen mit Substanzen zu behandeln, die die Blutbildung stimulieren. Zu diesen Substanzen gehören G-CSF, GM-CSF und können auch andere Faktoren gehören, die die Blutbildung fördern. Die zu verabreichende Menge an hämatopoetischem Faktor kann vom Fachmann bestimmt werden, indem man das Zelldifferential von Individuen aufzeichnet, denen der Faktor verabreicht wird. Typischerweise werden die Dosen von Faktoren wie G-CSF und GM-CSF ähnlich sein wie die Dosis, die verwendet wird, um Individuen zu behandeln, die sich von einer Behandlung mit cytotoxischen Mitteln erholen. Vorzugsweise wird GM-CSF oder G-CSF 4 bis 7 Tage lang in Standarddosen verabreicht, bevor man die Gewebequelle entfernt, um den Anteil an Vorläufern dendritischer Zellen zu erhöhen. (Editorial, Lancet, 339: 14. März 1992, 648–649). Zum Beispiel haben wir bestimmt, dass Dosen von G-CSF von 300 μg täglich während 5 bis 13 Tagen und Dosen von GM-CSF von 400 μg täglich während 4 bis 19 Tagen zu erheblichen Ausbeuten an dendritischen Zellen führten.
Fetales oder Nabelschnurblut, das auch reich an Wachstumsfaktoren ist, ist ebenfalls eine bevorzugte Quelle für Blut zur Gewinnung von Vorläufern dendritischer Zellen.
Gemäß einem Verfahren der Erfindung kann die Gewebequelle vor dem Kultivieren behandelt werden, um den Anteil an Vorläufern dendritischer Zellen relativ zu anderen Zelltypen anzureichern. Eine solche Vorbehandlung kann auch Zellen entfernen, die mit der Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen konkurrieren oder ihre Proliferation hemmen oder ihre Überlebensrate senken können. Die Vorbehandlung kann auch verwendet werden, um die Gewebequelle besser geeignet für die in-vitro-Kultur zu machen. Das Behandlungsverfahren wird wahrscheinlich gewebespezifisch sein und von der besonderen Gewebequelle abhängen. Zum Beispiel würde man Milz oder Knochenmark, wenn es als Gewebequelle verwendet wird, zuerst so behandeln, dass man einzelne Zellen erhält, und anschließend würde man geeignete Zelltrennungstechniken verwenden, um Leukocyten von anderen Zelltypen zu trennen. Die Behandlung von Blut würde Zelltrennungstechniken beinhalten, um Leukocyten von anderen Zelltypen einschließlich roten Blutkörperchen (RBCs), die toxisch sind, zu trennen. Die Entfernung von RBCs kann nach Standardverfahren bewerkstelligt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Außerdem können Antitoxine, wie monoklonaler Anti-Erythroid-VIE-64-Antikörper, der RBCs bindet, verwendet werden, um die Bindung von RBC an ein Substrat zur Entfernung unter Verwendung einer Panning-Technik zu erleichtern.
Wenn gemäß einem bevorzugten Verfahren dieser Erfindung Knochenmark als Gewebequelle verwendet wird, werden B-Zellen entfernt, bevor man Knochenmark in GM-CSF kultiviert. Während B-Zellen und Vor-B-Zellen als Reaktion auf GM-CSF nicht wachsen, stellen sie ungefähr 50% der anfänglichen Knochenmarksuspension dar und schließen dadurch die Verwendung einer Anfärbung mit monoklonalen Anti-Ia-Antikörpern, um dendritische Zellen schnell zu zählen, aus. Außerdem reagieren Granulocyten auf GM-CSF und proliferieren leicht in Gegenwart von GM-CSF. Als solche maskieren die B-Zellen und Granulocyten die Anwesenheit von Vorläufern dendritischer Zellen. B-Zellen können die Granulum-Antigene M342 und 2A1 exprimieren, die geeignete Marker sind, um dendritische Zellen von Makrophagen und Granulocyten zu unterscheiden. Außerdem haben Granulocyten die Tendenz, die Kulturen zu überwuchern und um verfügbare GM-CSF zu konkurrieren. Das unter dieser Erfindung am meisten bevorzugte Verfahren besteht darin, den größten Teil der nichtadhärenten, neu gebildeten Granulocyten durch sachtes Waschen während der ersten 2–4 Tage in Kultur aus den Knochenmarkkulturen zu entfernen.
Vorzugsweise werden bei einer Form der Vorbehandlung konkurrierende Zellen, die die Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen maskieren, abgetötet. Diese Vorbehandlung umfasst das Abtöten von Zellen, die Antigene, welche nicht auf Vorläufern dendritischer Zellen exprimiert werden, exprimieren, indem man Knochenmark mit Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, die nicht auf Vorläufern dendritischer Zellen vorhanden sind, in einem Medium, das Komplement umfasst, in Kontakt bringt. Eine andere Form der Vorbehandlung zum Entfernen unerwünschter Zellen, die für die Verwendung mit dieser Erfindung geeignet sind, besteht darin, die unerwünschten Vorläuferzellen oder ihre Vorläufer auf einem festen Träger zu adsorbieren, wobei man Antikörper verwendet, die spezifisch für Antigene sind, die auf den unerwünschten Zellen exprimiert werden. Mehrere Verfahren zum Adsorbieren von Zellen auf festen Trägern verschiedener Typen sind dem Fachmann bekannt und für die Verwendung mit dieser Erfindung geeignet. Zum Beispiel können unerwünschte Zellen durch "Panning" unter Verwendung einer Kunststoffoberfläche, wie einer Petri-Schale, entfernt werden. Alternativ dazu umfassen andere Verfahren, die zu den geeigneten gehören, das Adsorbieren von Zellen auf magnetischen Kügelchen, die durch eine Magnetkraft abgetrennt werden können, oder auf Immunobeads, die durch die Schwerkraft abgetrennt werden können. Dann können nichtadsorbierte Zellen, die einen erhöhten Anteil an Vorläufern dendritischer Zellen enthalten, durch bekannte Mittel einschließlich Panning von den auf dem festen Träger adsorbierten Zellen abgetrennt werden. Dieser Vorbehandlungsschritt dient einem doppelten Zweck: Er zerstört die Vorläufer von nichtdendritischen Zellen in der Kultur oder wiederbelebt sie, während er den Anteil an Vorläufern dendritischer Zellen, die in der Kultur um GM-CSF konkurrieren, erhöht.
Außerdem werden Ia-positive Zellen, d. h. B-Zellen und Makrophagen, vorzugsweise abgetötet, indem man die Zellen in Gegenwart eines Gemischs von Anti-Ia-Antikörpern, vorzugsweise monoklonalen Antikörpern, und Komplement kultiviert. Reife dendritische Zellen, die ebenfalls in Knochenmark vorhanden sind, werden ebenfalls abgetötet, wenn die Zellen aus dem Knochenmark in Gegenwart von Anti-Ia-Antikörpern kultiviert werden, doch kommen diese reifen dendritischen Zellen im Blut und Knochenmark in derart geringen Mengen vor und besitzen antigenische Marker, die so verschieden von denen von Vorläufern dendritischer Zellen sind, dass das Abtöten dieser reifen dendritischen Zellen die Proliferation und Ausbeute an Vorläufern dendritischer Zellen nicht wesentlich beeinflusst. T- und B-Zellen sowie Monocyten, die ebenfalls im Knochenmark vorhanden sein können, können abgetötet werden, indem man gegen T- und B-Zell-Antigene gerichtete Antikörper und Monocyten mitverwendet. Zu diesen Antigenen gehören unter anderem CD3, CD4, das B-Zell-Antigen B220, Thy-1, CD8 und Monocyten-Antigene. Die verbleibenden lebensfähigen Zellen aus dem Knochenmark werden dann in Medium, dem etwa 500–1000 E/ml GM-CSF zugesetzt ist, kultiviert, wie es unten beschrieben ist. Es sei angemerkt, dass CD4- und CD8-Antigene auf jungen Vorläufern dendritischer Zellen vorhanden sein können, und daher können Antikörper, die gegen diese Antigene gerichtet sind, die Populationen der Vorläufer dendritischer Zellen abreichern.
Wenn Blut als Gewebequelle verwendet wird, können Blutleukocyten erhalten werden, indem man herkömmliche Verfahren verwendet, bei denen ihre Lebensfähigkeit erhalten bleibt. Gemäß dem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird Blut mit Medium (vorzugsweise RPMI) verdünnt, das Heparin (etwa 100 E/ml) oder ein anderes geeignetes Antikoagulans enthält. Das Volumenverhältnis von Blut zu Medium beträgt etwa 1 zu 1. Zellen werden sedimentiert und durch Zentrifugation des Bluts in Medium mit etwa 1000 U/min (150 × g) bei 4°C gewaschen. Blutplättchen und rote Blutkörperchen werden abgereichert, indem man das Zellsediment in einem Gemisch von Medium und Ammoniumchlorid suspendiert. Vorzugsweise beträgt das Volumenverhältnis in dem Gemisch von Medium und Ammoniumchlorid (Endkonzentration 0,839%) etwa 1 : 1. Zellen werden durch Zentrifugation sedimentiert und etwa noch zweimal, oder bis eine von Blutplättchen und roten Blutkörperchen im Wesentlichen freie Population von Leukocyten erhalten wird, in dem Gemisch aus Medium und Ammoniumchlorid gewaschen.
Jede isotonische Lösung, die gewöhnlich in Gewebekulturen verwendet wird, kann als Medium verwendet werden, um Blutleukocyten von Blutplättchen und roten Blutkörperchen zu trennen. Beispiele für solche isotonischen Lösungen sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Hanks' gepufferte Salzlösung oder vollständige Wachstumsmedien, zu denen zum Beispiel RPMI 1640 gehört. RPMI 1640 ist bevorzugt.
Zellen, die durch die Behandlung der Gewebequelle erhalten werden, werden unter Bildung einer Primärkultur auf einem geeigneten Substrat in einem Kulturmedium kultiviert, das mit GM-CSF oder einem GM-CSF-Derivatprotein oder -peptid mit einer Aminosäuresequenz, bei der die für GM-CSF typische biologische Aktivität erhalten bleibt, versetzt ist. Das geeignete Substrat kann jede gewebekulturverträgliche Oberfläche sein, an der Zellen haften können. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Substrat um kommerziellen Kunststoff, der zur Verwendung in der Gewebekultur behandelt ist. Beispiele dafür sind verschiedene Kolben, Rollflaschen, Petri-Schalen und mehrere Näpfe enthaltende Platten, die zur Verwendung in der Gewebekultur hergestellt sind. Oberflächen, die mit einer Substanz wie zum Beispiel Collagen oder Poly-L-lysin oder mit für einen bestimmten Zelltyp spezifischen Antikörpern behandelt sind, um die Zelladhäsion zu fördern, können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, sie ermöglichen die differentielle Anhaftung von Zellen, wie es unten beschrieben ist. Zellen werden vorzugsweise mit einer Anfangszelldichte von etwa 7,5 × 10⁵ Zellen pro cm² ausgestrichen. In dieser Dosis ist die Oberfläche nicht vollständig mit Zellen bedeckt, aber es gibt auch keine großen Zwischenräume (2–3 Zelldurchmesser).
Wenn Knochenmark, das so behandelt wurde, dass der Anteil an nichtdendritischen Zellvorläufern reduziert ist, kultiviert wird, entstehen Aggregate, die proliferierende dendritische Zellvorläufer umfassen. Die Ia-negativen Knochenmark-Nichtlymphocyten, die Vorläufer dendritischer Zellen umfassen, werden vorzugsweise in hohen Anzahlen von etwa 10⁶/Napf (5 × 10⁵ Zellen/cm²) kultiviert. Knochenmark-Flüssigkulturen, die für andere Zwecke als das Kultivieren von Vorläufern dendritischer Zellen angesetzt werden, werden typischerweise in einem Zehntel dieser Dosis ausgesät, doch ist es dann schwierig, die Aggregate von sich entwickelnden dendritischen Zellen zu identifizieren und zu isolieren.
Das Wachstumsmedium für die Zellen bei jedem Schritt des Verfahrens der Erfindung sollte das Überleben und die Proliferation der Vorläufer dendritischer Zellen ermöglichen. Jedes Wachstumsmedium, das typischerweise verwendet wird, um Zellen zu kultivieren, kann gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, das Medium ist mit GM-CSF versetzt. Zu den bevorzugten Medien gehören RPMI 1640, DMEM und α-MEM, wobei Aminosäuren und Vitamine zugesetzt werden, die mit einer geeigneten Menge an Serum oder einer definierten Menge von Hormonen und einer Menge an GM-CSF, die ausreicht, um die Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen zu fördern, versetzt sind. Serumfreies Medium, das mit Hormonen versetzt ist, ist ebenfalls geeignet, um die Vorläufer dendritischer Zellen zu kultivieren. RPMI 1640, das mit 5% fetalem Kälberserum (FCS) und GM-CSF versetzt ist, wird bevorzugt. Zellen können so ausgewählt oder angepasst werden, dass sie in anderen Seren und bei anderen Serumkonzentrationen wachsen. Zellen aus Humangewebe können ebenfalls in Medium kultiviert werden, das mit Humanserum anstatt mit FCS versetzt ist. Medien können Antibiotika enthalten, um die bakterielle Infektion der Kulturen zu minimieren. Penicillin, Streptomycin oder Gentamicin oder Kombinationen, die diese enthalten, werden bevorzugt. Das Medium oder ein Teil des Mediums, in dem die Zellen kultiviert werden, sollte regelmäßig erneuert werden, um frische Nährstoffe einschließlich GM-CSF bereitzustellen.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass GM-CSF die Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen in vitro fördert. Zellen werden in Gegenwart von GM-CSF in einer ausreichenden Konzentration kultiviert, um das Überleben und die Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen zu fördern. Die Dosis hängt von dem Ausmaß der Konkurrenz durch andere Zellen (insbesondere Makrophagen und Granulocyten) um das GM-CSF oder von der Anwesenheit von GM-CSF-Inaktivatoren in der Zellpopulation ab. Vorzugsweise werden die Zellen in Gegenwart von zwischen etwa 1 und 1000 E/ml GM-CSF kultiviert. Besonders bevorzugt werden Zellen aus Blut in Gegenwart von GM-CSF in einer Konzentration zwischen etwa 30 und 100 E/ml kultiviert. Es hat sich gezeigt, dass diese Dosis notwendig und hinreichend für maximale Reaktionen von aus Mäuseblut erhaltenen Zellen ist. Am meisten bevorzugt werden Zellen in Gegenwart von GM-CSF in einer Konzentration von etwa 30 E/ml kultiviert. Es hat sich gezeigt, dass GM-CSF in einer Konzentration zwischen etwa 400 und 800 E/ml optimal ist, um proliferierende humane dendritische Zellen aus Blut zu kultivieren. Zellen aus Knochenmark erfordern wegen der Anwesenheit großer Zahlen von proliferierenden Granulocyten, die um das verfügbare GM-CSF konkurrieren, höhere Konzentrationen an GM-CSF, und daher werden für Kulturen von aus Knochenmark erhaltenen Zellen Dosen zwischen etwa 500 und 1000 E/ml bevorzugt.
Wenn Suspensionen von Mäuseknochenmark in Gegenwart von GM-CSF kultiviert werden, vermehren sich drei Typen von Myeloidzellen. (1) Neutrophile herrschen vor, haften jedoch nicht an der Kulturoberfläche. Neutrophile haben eine charakteristische Kernmorphologie, exprimieren das RB-6-Antigen und weisen keine MHC-Klasse-II-Produkte auf. (2) Makrophagen haften fest an dem Kulturgefäß, exprimieren erhebliche Mengen an F4/80-Antigen und exprimieren größtenteils wenig oder kein MHC Klasse II [siehe aber unten].
Wenn Leukocyten aus Mäuse- oder Humanblut in GM-CSF mit 30 E/ml bzw. 400–800 E/ml kultiviert werden, entwickeln die Kulturen eine große Zahl von Aggregaten oder Zellkugeln, aus denen schließlich typische dendritische Zellen freigesetzt werden. In Abwesenheit von GM-CSF entwickeln sich keine Kolonien. Cytologische Kriterien können verwendet werden, um am Anfang die dendritischen Zellen nachzuweisen, die charakteristischerweise große flächige Fortsätze oder Schleier aufweisen (25–27).
GM-CSF kann aus natürlichen Quellen isoliert werden, die unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfasst "GM-CSF" nach einem beliebigen Verfahren und aus einer beliebigen Spezies hergestelltes GM-CSF. "GM-CSF" ist hier als irgendein bioaktives Analogon, Fragment oder Derivat des natürlich vorkommenden (nativen) GM-CSF definiert. Solche Fragmente oder Derivatformen von GM-CSF sollten auch die Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen in Kultur fördern. Außerdem können GM-CSF-Peptide mit biologi scher Aktivität anhand ihrer Fähigkeit, GM-CSF-Rezeptoren an geeigneten Zelltypen zu binden, identifiziert werden.
Es kann wünschenswert sein, neben GM-CSF zusätzliche Cytokine in dem Kulturmedium mitzuverwenden, um die Ausbeute an dendritischen Zellen weiter zu erhöhen. Zu diesen Cytokinen gehören Granulocyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF), Monocyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Interleukine 1α und 1β, 3 und 6 (IL-1α, IL-1β, IL-3 bzw. IL-6), Tumornekrosefaktor α (TNFα) und Stammzellenfaktor (SCF). Cytokine werden in Mengen verwendet, die eine Erhöhung des Anteils in der Kultur vorhandener dendritischer Zellen bewirken, indem sie entweder die Proliferation oder das Überleben von Vorläufern dendritischer Zellen verstärken. Vorzugsweise sind Cytokine in den folgenden Konzentrationen vorhanden: IL-1α und β: 1 bis 100 LAF-Einheiten/ml; TNF-α: 5–500 E/ml; IL-3: 25–500 E/ml; M-CSF: 100–1000 E/ml; G-CSF: 25–300 E/ml; SCF: 10–100 ng/ml; und IL-6: 10–100 ng/ml. Besonders bevorzugte Konzentrationen an Cytokinen sind: IL-1α: 50 LAF-Einheiten/ml; TNF-α: 50 E/ml; IL-3: 100 E/ml; M-CSF: 300 E/ml; und G-CSF: 100 E/ml. Bevorzugte Cytokine sind humane Proteine. Die am meisten bevorzugten Cytokine werden unter Verwendung von rekombinanten Techniken aus dem humanen Gen hergestellt (rhu). TNFα in Konzentrationen von etwa 10–50 E/ml können verwendet werden, um die Ausbeuten an dendritischen Zellen mehrfach zu erhöhen.
Man lässt die Primärkulturen aus der Gewebequelle unter Standardgewebekulturbedingungen der Feuchtigkeit und des pH-Werts bei etwa 37°C inkubieren, bis eine Population von Zellen in ausreichendem Maße an dem Substrat haftet, um die Abtrennung von nichtadhärenten Zellen zu ermöglichen. Der Vorläufer dendritischer Zellen in Blut ist anfangs gegenüber Kunststoff nichtadhärent, im Gegensatz zu Monocyten, so dass die Vorläufer nach einer über Nacht erfolgenden Kultur abgetrennt werden können. Monocyten und Fibroblasten machen vermutlich den größten Teil der adhärenten Zellen aus und haften gewöhnlich innerhalb von etwa 6 bis etwa 24 Stunden an dem Substrat. Vorzugsweise werden nichtadhärente Zellen nach etwa 8 bis 16 Stunden von adhärenten Zellen abgetrennt. Am meisten bevorzugt werden nichtadhärente Zellen nach etwa 12 Stunden abgetrennt. Jedes Verfahren, das keine erheblichen Mengen an adhärenten Zellen entfernt, kann verwendet werden, um die adhärenten von nichtadhärenten Zellen zu trennen. Vorzugsweise werden die Zellen durch einfaches Schütteln oder Pipettieren entfernt. Pipettieren wird am meisten bevorzugt.
Um Vorläuferzellen aus Humanblut aus dieser Primärkultur zu kultivieren, werden Zellen, die in Bezug auf Zellen, die keine Vorläufer dendritischer Zellen sind, abgereichert wurden, auf einem Substrat in einer Dichte von vorzugsweise etwa 5 × 10⁵ Zellen pro cm² kultiviert. Nach 5 Tagen, wobei jeden zweiten Tag gefüttert wird, treten Zellaggregate auf (auch als "Kugeln" bezeichnet). Diese Aggregate können dann so behandelt werden, wie es unten beschrieben ist.
Die nichtadhärenten Zellen aus der Primärkultur werden subkultiviert, indem man sie in einer ausreichenden Dichte, so dass die Zellen überleben können und sich mit der Zeit Haufen von wachsenden Zellen entwickeln, die locker an der Kulturoberfläche oder an den festhaftenden Zellen an der Oberfläche haften, in neue Kulturkolben übergeführt. Diese Haufen sind die Brutstätten für proliferierende Vorläufer dendritischer Zellen. Der hier verwendete Ausdruck "Kulturkolben" bezieht sich auf jedes Gefäß, das zum Kultivieren von Zellen geeignet ist. Es ist wünschenswert, alle nichtadhärenten Zellen aus der Primärkultur in einer Dichte zwischen etwa 2 × 10⁵ Zellen und 5 × 10⁵ Zellen pro cm² zu subkultivieren, vorzugsweise bei etwa 2,5 × 10⁵ pro cm². Zellen werden während einer ausreichenden Zeit inkubiert, so dass die Oberfläche der Kulturschale mit einer Monoschicht von festhaftenden Zellen einschließlich Makrophagen und Fibroblasten, an denen Aggregate von nichtadhärenten Zellen befestigt sind, bedeckt sein kann. Zu diesem Zeitpunkt werden alle nichtadhärenten Zellen aus den Näpfen entfernt, und die zellulären Aggregate werden durch Subkultivieren entfernt. Vorzugsweise werden die Zellen aus den Aggregaten nach etwa 10 Tagen subkultiviert, oder wenn die Zahl der aggregierten Zellen pro cm² etwa 3 bis 4 × 10⁵ erreicht.
Um die aggregierten Zellen seriell zu subkultivieren, werden die aggregierten Zellen von den adhärenten Zellen entfernt, und die aggregierten Zellen werden auf einer Gesamtoberfläche von vorzugsweise zwischen etwa den Zwei- bis Fünffachen der Oberfläche der Stammkultur subkultiviert. Besonders bevorzugt werden die Zellen auf einer Oberfläche subkultiviert, die etwa das Dreifache der Oberfläche der Stammkultur beträgt. Zellen mit flächigen Fortsätzen, die für dendritische Zellen typisch sind, treten nach etwa 4–7 Tagen in der Kultur auf. Zwischen etwa Tag 10 und Tag 17 der Kultur verdoppelt sich die Zahl der Einzelzellen, die aus einer gegebenen Oberfläche gewonnen werden können. Sowohl Vorläufer dendritischer Zellen als auch reife dendritische Zellen sind in den Aggregaten vorhanden.
Um dendritische Zellen aus Knochenmark herzustellen, werden vorzugsweise die ausgeprägten Aggregate von proliferierenden, weniger reifen dendritischen Zellen nach etwa 4 bis 6 Tagen Kultur aus dem Stroms abgetrennt. Große Zahlen an dendritischen Zellen werden freigesetzt, und diese freigesetzte Population exprimiert die hauptsächlichen Merkmale von reifen dendritischen Zellen. Da Knochenmark anfangs einen größeren Anteil an Vorläufern dendritischer Zellen enthält als Blut, sind nur etwa 4–6 Tage der Kultur der aus Knochenmark erhaltenen Zellen notwendig, um etwa dieselbe Zahl von Zellen zu erreichen, die man nach etwa 10 bis 25 Tagen Kultur der aus Blut erhaltenen Zellen erhält.
Um die vom Blut stammende Population der dendritischen Zellen weiter auszudehnen, müssen Zellaggregate mehrmals in Abständen, die für die kontinuierliche Proliferation von Vorläufern dendritischer Zellen sorgen, seriell subkultiviert werden. Vorzugsweise werden Aggregate subkultiviert, bevor eine größere Zahl von Zellen mit der dendritischen Zellmorphologie in das Medium freigesetzt werden, zum Beispiel zwischen etwa 3 und 30 Tage. Besonders bevorzugt werden Aggregate von Zellen nach etwa 10 bis 25 Tagen in Kultur und am meisten bevorzugt nach 20 Tagen subkultiviert. Die Zahl der seriellen Subkulturen der Zellen hängt ab von der Zahl der gewünschten Zellen, der Lebensfähigkeit der Zellen und der Fähigkeit der Kulturen, weiter Zellaggregate zu erzeugen, aus denen dendritische Zellen freigesetzt werden. Vorzugsweise können Zellen während etwa 1 bis 2 Monaten, nachdem die nichtadhärenten Zellen subkultiviert wurden, oder etwa ein- bis fünfmal seriell subkultiviert werden. Besonders bevorzugt werden Zellen etwa zwei- bis dreimal seriell subkultiviert. Am meisten bevorzugt werden Zellen zweimal seriell subkultiviert.
Zum seriellen Subkultivieren der Zellen der Primär- und der anschließenden Kulturen werden Zellen gemäß einem bevorzugten Verfahren entfernt, indem man den größten Teil der Aggregate wachsender dendritischer Zellen sowie einige Zellen in der Monoschicht von wachsenden Makrophagen und Fibroblasten abpipettiert. Durch das Pipettieren werden die Aggregate gewöhnlich zerstört, insbesondere die peripheren Zellen der Aggregate, die reifer sind. Im Laufe der Kulturzeit, z. B. nach 2 Wochen, werden die Aggregate der wachsenden dendritischen Zellen stabiler, und es ist möglich, die Aggregate für die Abtrennung durch 1-g-Sedimentation zu entfernen.
Alternative Ansätze können verwendet werden, um die reifen dendritischen Zellen aus den wachsenden Kulturen zu isolieren. Einer besteht darin, Zellen, die nichtadhärent sind, zu entfernen und die Aggregate durch 1-g-Sedimentation von an dem Substrat haftenden Zellen und einzelnen Zellen abzutrennen. Dann werden dendritische Zellen über zusätzliche 1–2 Tage Kultur hinweg in großer Zahl aus den Aggregaten freigesetzt, während reife dendritische Zellen durch Flotation auf dichtem Metrizamid, wie es beschrieben wurde (Freudenthal und Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7698–7702, 1990), aus anderen einzelnen Zellen isoliert werden können. Das zweite Verfahren, das einfacher ist, aber die Wachstumsphase des Verfahrens im Wesentlichen beendet, besteht darin, alle nichtadhärenten Zellen zu ernten, wenn die Aggregate sehr groß sind, die Zellen etwa 20 Minuten lang auf Eis zu lassen, mit einer Pipette kräftig zu resuspendieren, um die Aggregate zu disaggregieren, und die reifen dendritischen Zellen einer Flotation auf Metrizamid-Säulen zu unterziehen.
Typischerweise wird der Inhalt von fünf 16-mm-Näpfen auf eine 6-ml-Säule mit 50% FCS-RPMI 1640 in einem 15-ml-Spitzröhrchen [Sarstedt, 62.553.002 PS] aufgetragen. Nach wenigstens 20 min werden das aufgetragene Medium und die oberen 1 ml der Säule entfernt. RPMI wird hinzugefügt, die Aggregate werden 5 min lang bei 4°C mit 1000 U/min sedimentiert, und die Zellen werden für die Subkultur in frischem Medium sachte suspendiert.
Verschiedene Techniken können verwendet werden, um die in den Kulturen vorhandenen Zellen zu identifizieren. Diese Techniken können die Analyse auf Morphologie, den Nachweis von zelltypspezifischen Antigenen mit monoklonalen Antikörpern, die Identifikation von proliferierenden Zellen unter Verwendung von Autoradiographie mit tritiiertem Thymidin, die Bestimmung von gemischten Leukocytenreaktionen und den Nachweis der Zielsteuerung dendritischer Zellen umfassen.
Neben der Identifikation anhand ihrer sternartigen Form können die dendritischen Zellen auch identifiziert werden, indem man ihre Expression spezifischer Antigene unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern nachweist.
Ein Panel von monoklonalen Antikörpern kann verwendet werden, um die Zellen in den GM-CSF-expandierten Kulturen zu identifizieren und zu charakterisieren. Eine Übersicht über die monoklonalen Antikörper findet man an anderer Stelle (23, 24, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird).
Zu den spezifischen monoklonalen Antikörpern, die zum Identifizieren von reifen dendritischen Zellen geeignet sind, gehören: 1) solche, die an das MHC-Klasse-I-Antigen binden (M1/42-Anti-MHC-Klasse-I [ATCC-Nr. TIB 126]); 2) solche, die an das MHC-Klasse-II-Antigen binden (B21-2-Anti-MHC-Klasse-II [ATCC-Nr. TIB 229]; M5/114-Anti-MHC-Klasse-II [ATCC-Nr. TIB 120]); 3) solche, die an wärmestabiles Antigen binden (M1/69-Anti-wärmestabiles-Antigen [HSA, ATCC-Nr. TIB 125]); 4) 33D1-Anti-dendritische-Zellen-Antikörper [ATCC-Nr. TIB 227]; 5) solche, die an das Antigen interdigitierender Zellen binden (NLDC145-Antiinterdigitierende-Zelle (13); und 6) solche, die an Antigene in Granula im perinukleären Bereich von reifen dendritischen Zellen binden (monoklonale Antikörper 2A1 und M342, (23) Agger et al.). Andere Antigene, die durch die dendritischen Zellen der Erfindung exprimiert werden und die verwendet werden können, um reife dendritische Zellen zu identifizieren, sind CD44 (identifiziert mit monoklonalem Antikörper 2D2C) und CD11b (identifiziert mit monoklonalem Antikörper M1/70). Die monoklonalen Antikörper M1/69, M1/70, M1/42 sind beschrieben in Monoclonal Antibodies, NY, Plenum 1980, Hrsg. R. Kennett et al., Seite 185–217. Der Fachmann wird erkennen, dass auch andere Antikörper, die zum Identifizieren von reifen dendritischen Zellen geeignet sind, hergestellt und charakterisiert werden können. In ähnlicher Weise erleichtert die Herstellung von Vorläufern dendritischer Zellen auch die Herstellung von Antikörpern, die spezifisch für Vorläufer dendritischer Zellen sind.
Um die proliferierenden Zellen und ihre Nachkommenschaft zu identifizieren und ihren Phänotyp zu bestimmen, können Kulturen mit tritiiertem Thymidin markiert werden, um die Zellen in der S-Phase der Mitose zu identifizieren. Neben dem markieren der Zellen mit einem Mitosemarker können Zellen auch gleichzeitig mit monoklonalen Antikörpern markiert werden, um zu bestimmen, wann mit reifen dendritischen Zellen assoziierte Marker exprimiert werden. Der ausgeprägte Phänotyp der Vorläufer dendritischer Zellen ist stabil, so dass die Nachkommenschaft dendritischer Zellen zum Beispiel auch dann nicht zu Makrophagen wird, wenn sie in Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (M-CSF) gehalten wird.
Ein weiterer Hinweis auf die Reife dendritischer Zellen ist die Fähigkeit von reifen dendritischen Zellen, die Proliferation von T-Zellen in der gemischten Leukocytenreaktion (MLR) zu stimulieren. Die Fähigkeit dendritischer Zellen, zu Lymphknoten zu wandern, d. h. die Zielsteuerung dendritischer Zellen, ist ein weiterer Hinweis auf die Reifung dendritischer Zellen, der verwendet werden kann, um die Reife der Zellen in Kultur zu bewerten.
Die Kriterien, die sichtbar geworden sind, um Vorläufer dendritischer Zellen gemäß der Erfindung zu identifizieren, ermöglichen die Identifizierung von proliferierender Nachkommenschaft von dendritischen Zellen in anderen Organen. Es ist bekannt, dass proliferierende Vorläufer zu den schnell sich umsetzenden Populationen von dendritischen Zellen in der Milz (15) und der afferenten Lymphe (16) führen. Die Proliferation von Leukocyten [außer T-Zellen] erfolgt im Knochenmark, aber es kann sein, dass das Knochenmark in Bezug auf dendritische Zellen auch Nachkommenschaft in das Blut und andere Gewebe aussät, die dann ausgedehnt proliferiert, wie es hier gezeigt ist. Indem man in der Lage ist, die ansonsten nur in Spuren vorhandenen dendritischen Zellen gemäß dem Verfahren dieser Erfindung in großen Zahlen herzustellen, können jetzt andere, zuvor unerforschte Bereiche der Funktion dendritischer Zellen bestimmt werden. Insbesondere werden durch das Kultivieren dendritischer Zellen Molekulare und klinische Studien über den Wirkungsmechanismus dieser APCs erleichtert, einschließlich ihrer Kapazitäten, Antigene in einer immunogenen Form einzufangen und zurückzuhalten und als Adjuvantien für die Bildung von Immunität in vivo zu wirken.
Es gibt ein zunehmendes Interesse an der Verwendung von konstituierenden Proteinen und Peptiden, um T-Zell-Antworten auf komplexe mikrobielle und zelluläre Antigene in situ zu modulieren. Typischerweise sind künstliche Adjuvantien, wie Alaun, erforderlich, um einen maximalen immunogenen Effekt zu erzielen. Von mehreren Antigenen ist bekannt, dass sie immunogen sind, wenn sie in Verbindung mit dendritischen Zellen, aber in Abwesenheit von zusätzlichen Adjuvantien verabreicht werden (1). Die Immunogenität von dendritischen Zellen in situ wurde aufgezeigt zum Beispiel mit Kontaktallergenen (45), Transplantationsantigenen (46–49) und in neuerer Zeit mit Fremdproteinen (31, 50, 51). Weitere Typen von Antigenen sind unter anderem mikrobielle, Tumor- und virale Antigene. Dendritische Zellen dienen direkt als APCs in situ, da die T-Zellen, die vorbereitet sind, darauf beschränkt sind, nur Antigene zu erkennen, die durch die besondere MHC-Klasse der immunisierenden dendritischen Zellen anstatt durch Wirts-APCs präsentiert werden (14, 31, 50, 51). Diese Beobachtungen, gekoppelt mit Daten, dass dendritische Zellen in situ ein Einfangen von Proteinantigenen in einer immunogenen Form bewirken (52–54), erlauben es, diese APCs als das "Adjuvans der Natur" anzusehen. Diese Erfindung ermöglicht daher die Verwendung von dendritischen Zellen durch Offenbarung von Verfahren und Zusammensetzungen, die geeignet sind, um ausreichende Mengen an Vorläufern dendritischer Zellen bereitzustellen, um Vorteil aus ihren einzigartigen antigenpräsentierenden Eigenschaften in der klinischen und therapeutischen Praxis zu ziehen.
Dendritische Zellen sind in der Lage, komplexe Antigene zu denjenigen Peptiden zu verarbeiten, die Selbst-MHC-Produkte präsentieren würden. Zu den bevorzugten Ausführungsformen unserer Erfindung gehört ein Verfahren zur Verwendung von dendritischen Zellen, wodurch die Vorläufer dendritischer Zellen während eines frühen Stadiums in ihrer Entwicklung aus proliferierenden Vorläufern Teilchen internalisieren. Wir haben festgestellt, dass die Stimulierung von Knochenmarksuspensionen mit GM-CSF zur Erzeugung von Haufen von proliferierenden Vorläufern dendritischer Zellen führt. Den Zellen, die in den Haufen durch Pulsen mit ³H-Thymidin markiert werden, fehlen viele der charakteristischen Marken von dendritischen Zellen, z. B. sternförmige und antigenische Merkmale, wie NLDC-145-Antigen, und hohe Mengen an MHC Klasse II. In Pulse-Chase-Experimenten wird die ³H-Thymidin-markierte Nachkommenschaft mit allen Merkmalen dendritischer Zellen freigesetzt. Wir haben herausgefunden, dass Zellen innerhalb des Aggregats auch phagocytisch sind und dass die dendritischen Zellen der Nachkommenschaft in analogen Pulse-Chase-Vorschriften eindeutig mit dem phagocytischen Mahl markiert sind. Wenn die Teilchen BCG-Organismen sind, wie solche, die Tuberkulose verursachen, werden mit den dendritischen Zellen assoziierte mycobakterielle Antigene in vitro und in situ in potenter Weise gegenüber T-Zellen präsentiert.
Fremd- und Autoantigene werden von den nach dem Verfahren der Erfindung erhältlichen dendritischen Zellen so verarbeitet, dass ihre immunogene Form erhalten bleibt. Die immunogene Form des Antigens impliziert die Verarbeitung des Antigens durch Fragmentierung unter Bildung einer Form des Antigens, das von den T-Zellen erkannt werden und diese stimulieren kann. Vorzugsweise sind solche Fremd- oder Autoantigene Proteine, die von den dendritischen Zellen zu Peptiden verarbeitet werden. Die relevanten Peptide, die von den dendritischen Zellen erzeugt werden, können zur Verwendung als Immunogene extrahiert und gereinigt werden.
Peptide, die von den dendritischen Zellen verarbeitet werden, können auch als Toleragene verwendet werden, um eine Toleranz gegenüber den Proteinen zu induzieren, die von den dendritischen Zellen oder Vorläufern dendritischer Zellen verarbeitet werden. Vorzugsweise wenn sie als Toleragene verwendet werden, werden die verarbeiteten Peptide auf dendritischen Zellen präsentiert, die so behandelt wurden, dass ihre Kapazität zum Hervorrufen einer Immunantwort reduziert ist, wie durch Hemmen ihrer akzessorischen Funktion durch Blockieren von akzessorischen Molekülen wie B7, die auf den dendritischen Zellen vorhanden sind.
Antigenaktivierte dendritische Zellen können hergestellt werden, indem man Antigen in vitro gegenüber den nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten dendritischen Zellen präsentiert. Dendritische Zellen werden in Kulturschalen ausgestrichen und Antigen in ausreichender Menge und während einer ausreichenden Zeitspanne ausgesetzt, so dass das Antigen an die dendritischen Zellen binden kann. Die Menge und die Zeit, die notwendig sind, um eine Bindung des Antigens an die dendritischen Zellen zu erreichen, kann durch einen Immunoassay oder Bindungsassay bestimmt werden. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um die Anwesenheit von Antigen auf den dendritischen Zellen nach der Einwirkung von Antigen auf dieselben nachzuweisen.
Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen, lassen die Informationen zur Zeit vermuten, dass die Entwicklung von dendritischen Zellen auf dem folgenden Weg verläuft [11]. Den Vorläufern dendritischer Zellen sowohl im Blut als auch im Knochenmark fehlen MHC-Klasse-II-Antigene sowie B- und T-Zell- und Monocytenmarker [B220, CD3, Thy-1, CD4/8], und die Vorläufer sind nichtadhärent. Die Vorläufer heften sich an das Stroma und führen zu Aggregaten von Klasse-II-positiven Zellen. Vielleicht ergeben sich die wachsenden Aggregate aus einer Teilmenge der stark positiven Klasse-II-Zellen, die sich auch zu späteren Zeitpunkten in der festhaftenden Monoschicht befinden. Diesen festhaftenden, Klasse-II-reichen Zellen fehlt jedoch die MLR-stimulatorische Wirkung von dendritischen Zellen, und sie können erhebliche Mengen an Fcγ-Rezeptoren und des F4/80-Antigens exprimieren. Das letzte Stadium der Entwicklung besteht darin, dass das locker angeheftete Aggregat reife, nichtproliferierende dendritische Zellen freisetzt. Letztere weisen noch größere Mengen an MHC Klasse II auf [2–3] und können sich vorübergehend an Kunststoff anheften, ganz ähnlich wie viele der dendritischen Zellen, die aus der Milz freigesetzt werden (25). Während im Aggregat eine Entwicklung stattfindet, scheint es eine Reduktion des Grads der cytoplasmatischen Anfärbung für Fcγ-Rezeptoren und F4/80-Antigen und eine Erhöhung der Granulum- [M342, 2A1] und Oberflächenantigene [33D1, NLDC145], die charakteristisch für dendritische Zellen sind, zu geben. Schließlich nimmt die akzessorische Funktion für primäre T-abhängige Immunreaktionen zu, während Zellen aus den wachsenden Aggregaten freigesetzt werden.
Reife dendritische Zellen sind zwar effektiv in bezug auf die Sensibilisierung von T-Zellen gegenüber mehreren verschiedenen Antigenen, zeigen jedoch wenig oder keine phagocytische Aktivität. In dem Maße, wie eine Endocytose für die Antigenverarbeitung und -präsentation erforderlich ist, war bisher nicht offensichtlich, wie dendritische Zellen teilchenassoziierte Peptide präsentieren würden. Auf der Grundlage unserer Arbeit ist es jetzt offensichtlich, dass Vorläufer von dendritischen Zellen, die diese Erfindung bereitgestellt, solche Teilchen für die Verarbeitung und Präsentation internalisieren können. Zu den Arten von Teilchen, die durch Phagocytose internalisiert werden können, gehören Bakterien, Viren, Mycobakterien oder andere infektiöse Agentien, die Krankheiten verursachen können. Dementsprechend ist jedes antigenische Teilchen, das von den Vorläufern dendritischer Zellen dieser Erfindung internalisiert und verarbeitet werden kann, auch geeignet, um die verschiedenen Immunogene, Toleragene und Impfstoffe herzustellen, die als Bestandteil dieser Erfindung beschrieben werden. Die Verarbeitung von Antigen durch dendritische Zellen oder Vorläufer dendritischer Zellen beinhaltet die Fragmentierung eines Antigens zu Antigenfragmenten, die dann präsentiert werden.
Phagocytosen von teilchenförmigen Stoffen durch Vorläufer dendritischer Zellen können erreicht werden, indem man die Vorläufer dendritischer Zellen während einer ausreichenden Zeit, damit die Zellen das Antigen phagozytieren, verarbeiten und präsentieren können, in Gegenwart von teilchenförmigen Stoffen kultiviert. Vorzugsweise sollte das Kultivieren der Zellen in Gegenwart der Teilchen während einer Zeitspanne von 1 bis 48 Stunden erfolgen. Besonders bevorzugt erfolgt das Kultivieren von Zellen in Gegenwart von teilchenförmigen Stoffen während etwa 20 Stunden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Zeitspanne, die notwendig ist, damit eine Zelle ein Teilchen phagozytieren kann, vom Zelltyp und der Natur des phagozytierten Teilchen abhängt. Verfahren zur Überwachung des Ausmaßes dieser Phagocytose sind dem Fachmann wohlbekannt.
Zellen sollten dem Antigen während einer ausreichenden Zeit ausgesetzt werden, damit Antigene internalisiert und auf der Zelloberfläche präsentiert werden können. Die Zeit, die notwendig ist, damit die Zellen das verarbeitete Antigen internalisieren und präsentieren können, können unter Verwendung von Pulse-Chase-Vorschriften bestimmt werden, wobei auf die Einwirkung des Antigens eine Auswaschzeit folgt. Sobald die minimale Zeit, die notwendig ist, damit Zellen verarbeitetes Antigen auf ihrer Oberfläche exprimieren, bestimmt ist, kann eine Pulse-Chase-Vorschrift verwendet werden, um Zellen und Antigene herzustellen, um immunogene Reaktionen hervorzurufen.
Die phagozytischen dendritischen Vorläuferzellen werden erhalten, indem man Zellkulturen, die Vorläufer dendritischer Zellen umfassen, mit GM-CSF stimuliert, um Aggregate aus wachsenden dendritischen Zellen zu induzieren. Diese dendritischen Vorläuferzellen können von jedem der oben beschriebenen Quellgewebe erhalten werden, die Vorläufer dendritischer Zellen enthalten. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Quellgewebe um Knochenmark oder Blutkulturen. Zellen innerhalb dieser Aggregate sind eindeutig phagozytisch. Wenn die sich entwickelnden Kulturen Teilchen ausgesetzt, gewaschen und 2 Tage lang einer Chase-Phase ausgesetzt werden, nimmt die Zahl der MHC-Klasse-II-reichen dendritischen Zellen wesentlich zu, und wenigstens 50% enthalten internalisierte Teilchen, wie BCG-Mycobakterien oder Latexteilchen. Die mit Mycobakterien beladenen, neu entwickelten dendritischen Zellen sind viel potenter in Bezug auf die Präsentation von Antigenen gegenüber vorbereiteten T-Zellen als entspre chende Kulturen von reifen dendritischen Zellen, die einem Puls von Organismen ausgesetzt werden.
Eine ähnliche Situation gilt, wenn BCG-beladene dendritische Zellen in den Fußballen oder Blutstrom von naiven Mäusen injiziert werden. Solche dendritischen Zellen, die phagozytierte Organismen aufweisen, induzieren die stärksten T-Zell-Reaktionen auf mycobakterielle Antigene in entwässernden Lymphknoten und der Milz. Die Verabreichung von Antigenen an GM-CSF-induzierte, sich entwickelnde dendritische Zellen – durch Erhöhung sowohl der Antigen-Aufnahme als auch der Zellzahlen – erleichtert die Verwendung dieser APCs für die aktive Immunisierung in situ. Die Herstellung solcher starker immunogener Reaktionen aufgrund der Präsentation von Antigen durch die dendritischen Zellen macht diese Zellen und dieses System als Adjuvantien, die für die Herstellung von immunogenen Reaktionen in Individuen geeignet sind, besonders wünschenswert. Solche immunogenen Reaktionen und die Entwicklung von Antikörpern gegen die präsentierten Antigene können verwendet werden, um fortschreitende Infektionen zu behandeln oder zukünftige Infektionen, wie mit einem Impfstoff, zu verhindern. Die Verwendung von dendritischen Zellen zur Herstellung einer therapeutischen oder prophylaktischen Immunantwort bei einem Individuum kann besonders gut geeignet sein, um eine Infektion durch wirkstoffresistente Organismen, wie zum Beispiel die BCG-Mycobakterien, die Tuberkulose verursachen, zu behandeln oder zu verhindern.
Die Immunogenität von aufgenommenen Teilchen kann mit BCG-Mycobakterien erhalten werden (12–13). In jedem Inokulum des BCG-Impfstoffs gibt es lebende Bacillen [ungefähr 50% der Bacillen wirken als koloniebildende Einheiten], tote Bacillen und wahrscheinlich mehrere mycobakterielle Proteine. Der phagozytierte Pool an BCG wird durch dendritische Zellen gegenüber T-Zellen präsentiert. Dies ist offensichtlich, nachdem man die Präsentation von mycobakteriellen Antigenen mit Rinderserumalbumin (BSA), einer Komponente des Serums, in dem die dendritischen Zellen gezüchtet werden, verglichen hat. Alle APC-Populationen waren hinsichtlich der Präsentation von BSA vergleichbar, aber dendritische Zellen, die die meisten BCG phagozytiert hatten, waren die effek tivsten APCs für Mycobakterien (12 und 13,
). Die Aufnahme von BCG-Teilchen erklärt daher den größten Teil der mycobakteriellen Vorbereitung durch die Vorläufer dendritischer Zellen.
Vorläufer dendritischer Zellen können mit Mycobakterien-Tuberkulose-Bakterien-Antigen gepulst werden; dazu gehört zum Beispiel das BCG-Antigen, um die Resistenz des Wirts gegenüber einer Mycobakterieninfektion zu induzieren, was wichtig ist, da es notwendig ist, bessere Impf- und Behandlungsvorschriften für Tuberkulose einschließlich der wirkstoffresistenten Varietät zu entwickeln (78).
Tatsächlich ermöglicht es die Pulse- und Chase-Vorschrift, die verwendet werden kann, um sich entwickelnde dendritische Zellen mit Organismen gemäß unserer Erfindung zu beladen, dass die beiden breiten Komponenten der Immunstimulierung nacheinander stattfinden. Diese Komponenten sind a) das Abfangen und Präsentieren des Antigens, hier das Abfangen von Teilchen durch unreife dendritische Zellen, und b) die Entwicklung von potenten akzessorischen oder immunstimulatorischen Funktionen während der Chase-Phase. Die Situation ist mit derjenigen vergleichbar, die man bei der Handhabung von löslichen Proteinen (4, 6) und Teilchen (74) durch epidermale Langerhans-Zellen beobachtet. Jede der beiden breiten Komponenten der APC-Funktion bringt viele Subkomponenten mit sich. Zum Beispiel sind unreife dendritische Zellen nicht nur phagozytisch, sondern weisen auch andere Merkmale auf, die für die Antigenpräsentation benötigt werden, wie aktive Biosynthese von häufigen MHC-Klasse-II-Molekülen und Invarianten Ketten (6, 7) und zahlreiche saure endocytische Vakuolen (36).
Die Kapazität zur Beladung von APCs mit Antigenen unter Verwendung von Pulse-Chase-Vorschriften kann ein spezielles Merkmal von dendritischen Zellen sein. Frühere Studien mit Makrophagen und B-Zellen hatten vermuten lassen, dass T-Zell-Epitope kurzlebig sind (75). Die hier und an anderer Stelle (6, 14, 71) beschriebenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass immunogene Peptide wenigstens 2 Tage vor der Injektion in Mäuse auf dendritischen Zellen langlebig sein können. Diese Retentionskapazität sollte dendritische Zellen in die Lage versetzen, zu wandern und T-Zellen in entwässernden Lymphoidgeweben über einen Zeitraum von mehreren Tagen zu sensibilisieren (14, 50, 51).
Ein wichtiges Merkmal der nach dem Verfahren dieser Erfindung erhältlichen dendritischen Zellen ist die Fähigkeit, mikrobielle und andere Antigene sowohl auf Klasse-I- als auch auf Klasse-II-Produkten effizient zu präsentieren. Im Falle von BCG sind die meisten der vorbereiteten Zellen CD4-positive T-Zellen, höchstwahrscheinlich weil die antigenische Beladung durch den endocytischen Weg und MHC-Klasse-II-Produkte gehandhabt wird (76). Im Falle der Influenza hat sich gezeigt, dass der Klasse-I-Weg zur Induktion von CD8-positiven cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) eine ausreichende Abgabe von Antigen (infektiösem Virus) in das Cytoplasma erfordert, während der rein endocytische Weg nichtinfektiöse Virionen für die Präsentation nur gegenüber CD4-positiven Helferzellen liefert (77). Durch die Entwicklung von dendritischen Zellkulturen erhält man eine Gelegenheit, MHC-Klasse-I-Produkte mit Peptid zu beladen, da die Zellproliferation die Anwendung verschiedener Verfahren der Gen-Insertion (wie mit retroviralen Vektoren) erlaubt.
In die proliferierenden dendritischen Zellen kann ein Vektor injiziert werden, der die Expression von spezifischen Proteinen durch die dendritischen Zellen ermöglicht. Diese viralen Proteine, die von der dendritischen Zelle exprimiert werden, können dann verarbeitet und auf der Zelloberfläche auf MHC-I-Rezeptoren präsentiert werden. Die viralen antigenpräsentierenden Zellen oder die verarbeiteten viralen Antigene selbst können dann als Immunogene verwendet werden, um eine immunogene Reaktion auf die vom Vektor codierten Proteine zu erzeugen.
Vektoren kennen so hergestellt werden, dass sie spezifische DNA-Sequenzen enthalten, die Gene für Proteine, gegen die eine immunogene Reaktion gewünscht wird, codieren und exprimieren. Vorzugsweise werden retrovirale Vektoren verwendet, um die dendritischen Zellen zu infizieren. Die Verwendung von retroviralen Vektoren, um Wirtszellen zu infizieren, ist dem Fachmann bekannt und ist beschrieben in WO 92/07943, das am 14. Mai 1992 veröffent licht wurde, und in Richard C. Mulligan, "Gene Transfer and Gene Therapy: Principle, Prospects and Perspective", in Enology of Human Disease at the DNA Level, Kapitel 12, J. Linsten und A. Peterson, Hrsg. Rover Press, 1991.
Durch Verwendung sich entwickelnder dendritischer Zellen zum Beladen von MHC-Klasse-I- und/oder -II-Produkten können mehrere wünschenswerte Komponenten der T-Zell-Modulation in situ erreicht werden. Die Antigenaufnahme und Präsentation durch unreife Vorläufer ermöglicht es dem APC, die Peptide, die für die MHC-Produkte eines Individuums geeignet sind, maßzuschneidern und erhöht die Zahl der spezialisierten stimulatorischen APCs. Diese Eigenschaften von Populationen von Vorläufern dendritischer Zellen erfüllen viele der Anforderungen bei der Verwendung von Zellen als Träger für die aktive Immunisierung und Immuntherapie in situ.
Die vorliegende Erfindung stellt erstmals ein Verfahren zur Gewinnung von dendritischen Zellen in ausreichenden Mengen bereit, die verwendet werden sollen, um Tiere oder Menschen mit dendritischen Zellen zu behandeln, die mit Antigenen aktiviert wurden. Außerdem können dendritische Zellen in ausreichenden Mengen erhalten werden, so dass sie als Reagentien geeignet sind, um Antigene so zu modifizieren, dass sie als T-Zell-abhängige Antigene effektiver werden.
Zur Verwendung von antigenaktivierten dendritischen Zellen als Therapeutikum oder Immunogen werden die antigenaktivierten dendritischen Zellen nach irgendeinem Verfahren, das eine Immunantwort hervorruft, in ein syngenisches Tier oder einen syngenischen Menschen injiziert. Vorzugsweise werden dendritische Zellen in dasselbe Tier oder denselben Menschen, aus dem das Quellgewebe erhalten wurde, zurückinjiziert. Der Injektionsweg kann subkutan, intraperitoneal, intramuskulär, intradermal oder intravenös sein. Die Zahl der antigenaktivierten dendritischen Zellen, die zurück in das behandlungsbedürftige Tier oder den behandlungsbedürftigen Menschen injiziert werden, kann variieren, unter anderem in Abhängigkeit vom Antigen und der Größe des Individuums. Ein entscheidendes Merkmal in der Funktion von dendritischen Zellen in situ ist die Fähigkeit, zu den T-abhängigen Bereichen von Lymphoidgeweben zu wandern (Homing), wo die dendritischen Zellen in einer optimalen Position wären, um die erforderlichen antigenreaktiven T-Zellen aus dem Pool von rezirkulierenden latenten Lymphocyten auszuwählen und dadurch die T-abhängige Antwort einzuleiten.
Gemäß dem bevorzugten Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort bei einem Individuum würde man eine Gewebequelle von diesem Individuum identifizieren, die die Vorläufer dendritischer Zellen liefert. Wenn Blut als Gewebequelle verwendet wird, wird das Individuum vorzugsweise zuerst mit Cytokin behandelt, um die Blutbildung zu stimulieren. Nach der Isolation und Expansion der Population der Vorläufer dendritischer Zellen werden die Zellen mit dem Antigen in Kontakt gebracht. Vorzugsweise wird der Kontakt mit dem Antigen in vitro durchgeführt. Nachdem ausreichend Zeit vergangen ist, damit die Zellen das Antigen verarbeiten und auf ihren Oberflächen präsentieren können, werden die Zell-Antigen-Komplexe in ausreichender Menge, um eine Immunantwort hervorzurufen, in das Individuum zurückgebracht. Vorzugsweise werden zwischen 1 × 10⁶ und 10 × 10⁶ antigenpräsentierende Zellen in das Individuum zurückinjiziert.
Antigene können hergestellt werden, indem man zu modifizierende Substanzen oder andere Antigene mit den dendritischen Zellen kombiniert, die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurden. Die dendritischen Zellen verarbeiten oder modifizieren Antigene in einer Weise, die die Stimulation von T-Zellen durch die verarbeiteten oder modifizierten Antigene fördert. Solche durch dendritische Zellen modifizierten Antigene sind vorteilhaft, da sie spezifischer sein können und weniger unerwünschte Epitope haben als nichtmodifizierte T-abhängige Antigene. Die durch dendritische Zellen modifizierten Antigene können nach biochemischen Standardverfahren gereinigt werden. Zum Beispiel ist bekannt, Antikörper gegenüber Produkten des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) zu verwenden, um Komplexe aus MHC und antigenischen Peptiden auszuwählen und dann die erforderlichen verarbeiteten Peptide mit Säure zu eluieren [Ru densky et al., Nature 353: 622–7 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261–3 (1992)].
Antigenaktivierte dendritische Zellen und durch dendritische Zellen modifizierte Antigene können beide verwendet werden, um eine Immunantwort gegen ein Antigen hervorzurufen. Die aktivierten dendritischen Zellen oder modifizierten Antigene können als Impfstoffe verwendet werden, um eine zukünftige Infektion zu verhindern, oder sie können verwendet werden, um das Immunsystem zu aktivieren und so eine vorhandene Krankheit zu behandeln. Die aktivierten dendritischen Zellen oder modifizierten Antigene können mit geeigneten Trägern, wie physiologischer Kochsalzlösung oder anderen injizierbaren Flüssigkeiten, zur Verwendung als Impfstoffe oder pharmazeutische Zusammensetzungen zubereitet werden. Die Impfstoffe oder pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die modifizierten Antigene oder die antigenaktivierten dendritischen Zellen umfassen, würde man in therapeutisch wirksamen Mengen verabreichen, die ausreichen, um eine Immunantwort hervorzurufen. Vorzugsweise sollten etwa 1 bis 100 Mikrogramm modifiziertes Antigen oder sein Äquivalent, wenn es an dendritische Zellen gebunden ist, pro Dosis verabreicht werden.
Die dendritischen Zellen können verwendet werden, um Selbstpeptide herzustellen, die für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten geeignet sind. Zu diesen Autoimmunkrankheiten gehören unter anderem juvenile Diabetes, multiple Sklerose, Myasthenia gravis und atopische Dermatitis. Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, glauben wir, dass Autoimmunkrankheiten daraus resultieren, dass eine Immunantwort gegen "Selbstproteine" gerichtet ist, d. h. gegen Autoantigene, die in einem Individuum vorhanden bzw. körpereigen sind. Bei einer Autoimmunreaktion werden diese "Selbstproteine" gegenüber T-Zellen präsentiert und bewirken, dass die T-Zellen "selbstreaktiv" werden. Dendritische Zellen werden mit dem endogenen Antigen gepulst, um das relevante "Selbstpeptid" zu erzeugen. Das relevante Selbstpeptid ist für jedes Individuum verschieden, da MHC-Produkte in hohem Maße polymorph sind und jedes einzelne MHC-Molekül verschiedene Peptidfragmente binden könnte. Das "Selbstpeptid" kann dann verwendet werden, um konkurrierende Peptide zu entwerfen oder um eine Toleranz gegenüber dem Selbstprotein bei dem behandlungsbedürftigen Individuum zu induzieren.
Da dendritische Zellen jetzt gemäß den hier identifizierten Verfahren und Prinzipien aus Vorläufern gezüchtet werden können und da dendritische Zellen Antigene so modifizieren können, dass sie Killer-T-Zellen erzeugen, sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung besonders gut als Impfstoffe gegenüber Viren und Tumorzellen geeignet, für die Killer-T-Zellen eine Resistenz liefern könnten.
Beispiele
Beispiel 1 Herstellung von murinen dendritischen Zellen in vitro aus proliferierenden Vorläufern dendritischer Zellen aus Blut
Material
A. Mäuse
BALB/c, BALB/c × DBA/2 F1, BALB/c × C57BL/6 F1, C57BL/6 × DBA/2 F1 und C57BL/6, Männchen und Weibchen, 6–8 Wochen alt, wurden von Japan SLC Inc. [Shizuoka, Japan], dem Trudeau Institute [Saranac Lake, NY] und von Charles River Wiga [Sulzberg, Deutschland] bezogen. Vier Präparate von rGM-CSF wurden mit ähnlichen Ergebnissen bewertet, wobei die Ausbeute an dendritischen Zellen ein Plateau mit 30–100 E/ml erreicht. Die Präparate stammten von Dr. S. Gillis, Immunex Corp., Seattle WA, dem Genetics Institute [Überstand von COS-Zellen, mit mGM-CSF transfiziert; mit 30 E/ml oder darüber verwendet], und von Dr. T. Sudo [Überstand von CHO-Zellen, mit dem Expressionsvektor pHSmGM-CSF (22) transfiziert, und von E. coli exprimiertes Material].
B. Blutpräparat
Blut wurde durch Herzpunktion oder aus der Halsschlagader erhalten. Das Blut wurde mit RPMI-1640 mit 100 E/ml Heparin [etwa 2 ml/Maus] verdünnt oder eintropfen gelassen. Blutzellen wurden mit 1000 U/min bei 4°C sedimentiert, in RPMI 1640 resuspendiert und wieder sedimentiert. Das Sediment wurde in 1 ml RPMI 1640 pro Maus suspendiert und mit einem gleichen Volumen 1,66%igem Ammoniumchlorid in destilliertem Wasser gemischt, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Nach 2 min bei Raumtemperatur wurde die Suspension bei 4°C mit 1000 U/min zentrifugiert. Das Sediment, das immer noch rote Blutkörperchen enthielt, wurde 2 min lang in 0,5 ml RPMI und 0,5 ml NH₄Cl resuspendiert, mit RPMI verdünnt und wiederum sedimentiert. Nach 2 weiteren Waschvorgängen waren die meisten Blutplättchen und roten Blutkörperchen abgereichert, und eine Population von Blutleukocyten war erhalten worden.
C. Aggregate von proliferierenden dendritischen Zellen aus mit GM-CSF versetztem Blut
Blutleukocyten, gewöhnlich aus CxD2-F1-Mäusen, wurden in 16-mm-Gewebekulturnäpfen [24-Napf-Schalen, Costar, Nr. 25820] in Medium (1 ml pro Napf), das mit 30 E/ml GM-CSF versetzt war, in einer Menge von 1,5 × 10⁶ Zellen/Napf kultiviert. Bei dem Medium handelte es sich um RPMI 1640, versetzt mit 5% fetalem Kälberserum [JRH Biosciences, Lenexa, KA], 50 μM 2-ME, 20 μg/ml Gentamicin und rekombinantem Maus-GM-CSF. Nach Kultur über Nacht waren viele Monocyten adhärent, und die nichtadhärenten Zellen wurden auf neue 16-mm-Näpfe übertragen. Die adhärenten Zellen entwickelten keine dendritischen Zellkolonien, aber während der nächsten Woche wiesen die nichtadhärenten Populationen drei Veränderungen auf. Erstens starben die meisten der Lymphocyten und Granulocyten ab oder konnten durch Waschen entfernt werden. Zweitens wurde die Oberfläche des Napfes mit einer Monoschicht aus fest anhaftenden Zellen bedeckt, die Macrophagen und Fibroblasten beinhalteten. Drittens entwickelten sich kleine Zellaggregate, befestigt an verstreuten Stellen auf der Monoschicht. Die Kulturen wurden am Tag 6–7 mit GM-CSF (30 E/ml) und dann alle 3 Tage durch Absaugen von 0,5–0,75 ml des Mediums und Zurückgeben eines gleichen Volumens an frischem Medium mit GM-CSF gefüttert. Die Aggregate expandierten weiter in Anzahl und Größe. Etwa am Tag 10 waren die Zellen bereit für eine Subkultur. Alle restlichen lockeren Zellen konnten weggespült werden, bevor man die Aggregate in frisches Medium und GM-CSF überführte. Etwa 0,8–1 Million entfernte Zellen pro ursprünglichem Napf wurden in 3 Subkulturnäpfe unterteilt.
Die meisten der Aggregate zerfielen während dieser ersten Subkultur, während der größte Teil der adhärenten Monoschicht an den ursprünglichen Napf angeheftet blieb. Nach der Übertragung hafteten die meisten der Zellen in den entfernten Aggregaten als einzelne Zellen an dem neuen Kulturnapf, aber über einen Zeitraum von 2–3 Tagen traten wieder Aggregate auf. Die Aggregate wurden wiederum an adhärenten stromalen Zellen befestigt, aber diese adhärenten Zellen waren viel weniger zahlreich als die dichte Monoschicht in der ursprünglichen Kultur. Über die nächsten 4–7 Tage füllten Aggregate die Näpfe. Diese Kolonien waren häufig größer als diejenigen der ursprünglichen Näpfe und waren mit vielen flächigen Fortsätzen bedeckt, die typisch für dendritische Zellen sind. Es war schwieriger, Zellen zu diesem Zeitpunkt zu zählen, da viele der Aggregate einen Kern aus fest assoziierten Zellen enthielten. Die Zahl der einzelnen Zellen, die pro Napf gewonnen werden konnte, expandierte jedoch zwischen den Tagen 10 und 17 der Kultur auf etwa das Zweifache.
Wenn man die Kulturen überwachsen ließ, wurden einige Zellen mit der Morphologie von dendritischen Zellen freigesetzt. Typischerweise jedoch ließ man die Zellen nicht überwachsen, und die Aggregate wurden entfernt und nach etwa 20 Tagen wiederum subkultiviert. Vor der Subkultur konnten die Aggregate durch 1-g-Sedimentation von freien Zellen gereinigt werden. Solche Trennungen ließen sich mit längeren Kulturzeiten leichter durchführen, d. h, es war nach 3 Wochen leichter als nach 2 Wochen oder gar nach einer Woche Kultur, intakte Aggregate zu isolieren. Mit der weiteren Subkultur wurde die Zahl der Aggregate, die pro Napf erzeugt wurden, progressiv reduziert. Wie jedoch durch 3H-TdR-Markierung und Autoradiographie [unten] bestätigt wurde, konnten Kolonien von wachsenden Zellen 1–2 Monate lang in Subkulturen erzeugt werden. Nach 2–3 Wochen Subkultur wurden jetzt typische einzelne dendritische Zellen in das Medium freigesetzt. Gemäß einer direkten Beobachtung mit Videoaufzeichnung hatten diese freigesetzten Zellen die aktive Motilität von dendritischen Zellen und streckten ständig große Schleier oder flächige Fortsätze aus und zogen sie wieder ein. In Gegenwart von fortgesetztem GM-CSF beobachtete man sowohl freie dendritische Zellen als auch expandierende Kolonien. In Abwesenheit von GM-CSF wurden nur freie dendritische Zellen freigesetzt, und die Aggregate fielen im Wesentlichen auseinander und bildeten sich im Medium nicht neu, und es entwickelten sich keine Kolonien von Aggregaten. Die Ausbeuten an freien dendritischen Zellen pro Subkultur lagen im Bereich von 0,3 bis 2,5 × 10⁵.
Um es zusammenzufassen, aus einer Ausgangs-Blut-Mononukleären-Kultur von 1,5 × 10⁶ Zellen, wobei dendritische Zellen schwierig nachzuweisen waren, erhielten wir nach 3 Wochen im Durchschnitt 5–10 Subkulturen mit jeweils wenigstens 3–10 × 10⁴ freigesetzten dendritischen Zellen sowie viele Aggregate, die zur weiteren Proliferation befähigt sind. Daher entwickelten sich Aggregate von wachsenden Zellen in Mausblut mit zugesetztem GM-CSF, und diese Aggregate wurden mit dendritischen Zellen bedeckt, von denen viele spontan in das Medium freigesetzt werden konnten.
D. Phänotyp der Zellaggregate und der daraus freigesetzten dendritischen Zellen
Cytospin-Präparate wurden in einer Shandon-Cytozentrifuge unter Verwendung von 3–10 × 10⁴ Zellen hergestellt. Die Objektträger wurden mit einem Trockenmittel gelagert, bevor sie in Aceton fixiert und mit mAb und anschließend Peroxidase-Maus-Anti-Ratten-Ig [Boehringer Mannheim Biochemicals, Nr. 605–545] oder Kaninchen-Anti-Hamster-Ig [Accurate Chemical & Scientific Corp., Nr. JZY-036-003] angefärbt wurden. Die Präparate wurden für die Hellfeldanalyse mit Giemsa angefärbt und in Permount montiert. Für die Cytofluorographie [FACScan, Becton Dickinson] wurden Aliquote von Zellen mit primären Ratten- oder Hamster-mAb und anschließend FITC-Maus-Anti-Ratten-Ig [Boehringer, Nr. 605–540] oder Biotin-Kaninchen-Anti-Hamster-Ig [Accurate, JZY-066-003] und FITC-Avidin angefärbt.
Cytospin-Präparate von 2–3 Wochen alten Kulturen wurden mit einem Panel von mAb und einem Immunoperoxidase-Verfahren untersucht. Die freigesetzten Zellen und viele der Zellen, die vom Rand des Aggregats entfernt werden konnten, waren ähnlich hinsichtlich ihrer sternartigen Form und ihres Phänotyps. Die meisten der Zellen zeigten eine starke Färbung mit mAb gegen MHC-Klasse-II, das gemeinsame Leukocytenantigen CD45, CR3-Rezeptor CD11b und wärmestabiles Antigen (HSA) sowie CD44. Die Färbung mit mAbs gegen den Fc- Rezeptor [2.4G2] und das Makrophagen-F4/80-Antigen (MAC) war bei > 95% der Zellen schwach oder nicht nachweisbar. Die Kulturen enthielten nur seltene B-Zellen [B220 mAb, RA-3], T-Zellen [thy-1 mAb, B5-5] oder Granulocyten [GRAN, mAb RB6]. Einige Zellen am Rand des Aggregats und viele der Zellen, die aus den Aggregaten freigesetzt wurden, wurden mit zwei Markern angefärbt, die weitgehend auf dendritische Zellen beschränkt waren. Das Antigen interdigitierender Zellen [mAb NLDC 145 (13), IDC], das auch an thymisches Epithel bindet, färbte viele, aber nicht alle dendritischen Profile. Praktisch alle dendritischen Profile, die mit den mAbs 2A1 und M342 gefärbt wurden, zeigten Färbungen in den Granula im perinukleären Bereich von reifen dendritischen Zellen, B-Lymphocyten sowie interdigitierenden Zellen in Schnitten durch die T-Bereiche von Lymphoidorganen. Makrophagen von vielen Stellen [Blutmonocyten; Makrophagen der Bauchfellhöhle; Makrophagen in Schnitten von Lymphknoten, Thymus, Milz] enthalten keine 2A1- oder M342-reaktiven Granula.
Cytofluorographie wurde verwendet, um halbquantitative Informationen über die Expression von Antigenen an der Zelloberfläche zu gewinnen. Ein Panel von mAb wurde auf zwei Populationen angewendet: Zellen, die durch Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette aus den Aggregaten entfernt werden konnten, und Zellen, die spontan freigesetzt wurden, wenn die Aggregate 1 Tag lang einer Subkultur unterzogen wurden. Diese "entfernten" und "freigesetzten" Populationen waren identisch hinsichtlich ihrer dendritischen Form und des Phänotyps, doch mit einigen Ausnahmen, die im folgenden betrachtet werden. Der Phänotyp der freigesetzten Zellen ist in 2 gezeigt, und die wenigen Unterschiede zwischen aggregierten und freigesetzten Zellen sind in 3 gezeigt.
Praktisch alle dendritischen Zellen, die sich in und aus den Aggregaten entwickelten, exprimierten große Mengen des gemeinsamen Leukocytenantigens [CD45, mAb M1/9.3] und wärmestabiler [mAbs M1/69 und J11d] Antigene sowie große Mengen an CD44 und CD11b [mAb M1/70]. Geringe Mengen der folgenden Antigene wurden auf der Zelloberfläche nachgewiesen: das Antigen von dendritischen Zellen 33D1, der Makrophagenmarker F4/80, das Fcγ-Rezeptor-Antigen 2.4G2, das p55-IL-2-Rezeptor-CD25-Antigen 3C7 und das CD11c- Integrin N418 [2]. Diese Antigene wurden durch FACS an allen Zellen festgestellt, obwohl viele der Antigene, wie F4/80 und 2.4G2, bei einem Immunoperoxidase-Verfahren im Cytoplasma schwach waren oder fehlten. Mehrere Antigene fehlten: RB6-Granulocyt, RA3-B-Zelle, B5-5-Thy-1, GK 1.5 CD4 und SER-4 Randzonenmakrophage [2].
Die Expression von Klasse-I- und -II-MHC-Produkten durch die dendritischen Zellen in diesen Kulturen war sehr hoch, aber nichtdestoweniger bimodal [2 und 3]. Die meisten der dendritischen Zellen, die aus den Aggregaten entfernt worden waren, wiesen etwas kleinere Mengen an MHC-Klasse I und II auf, während dendritische Zellen, die aus den Aggregaten freigesetzt worden waren, sehr große Mengen an MHC-Produkten aufwiesen. Der andere Marker, der in den freigesetzten und locker befestigten dendritischen Zellen unterschiedlich war, war NLDC 145, der in der freigesetzten Population stärker vertreten war [3, obere Bilder]. Wir schließen daraus, dass der Phänotyp der Zellen, die sich aus den proliferierenden Aggregaten ergeben, ganz ähnlich ist wie derjenige, der in kultivierten dendritischen Zellen aus der Haut, aus der Milz und dem Thymus zu beobachten ist (24, 28), mit der Ausnahme, dass der M1/70-CD11b-Marker häufiger ist.
E. 3H-TdR-Autoradiographie, um das Wachstum von Vorläufern dendritischer Zellen zu bestätigen
Nach 2 bzw. 3 Wochen in Flüssigkultur enthielten die Näpfe zahlreiche expandierende Aggregate von Zellen und setzten in einigen Fällen bereits in großen Zahlen nichtadhärente dendritische Zellen frei. Kulturen wurden mit ³H-Thymidin markiert, um die proliferierenden Zellen und ihre Nachkommenschaft zu identifizieren und ihren Phänotyp zu bestimmen. Für die Pulse-Markierung wurde ³H-TdR zu den Kulturen gegeben [6 Ci/mM, 1 μCi/ml endgültig]. Zwei Stunden später wurde das Medium durch ³H-TdR-freies Medium ersetzt, und die Kulturen wurden zur Untersuchung auf Cytospin-Präparaten [Shandon Inc., Pittsburgh PA, Nr. 59900102] in nichtadhärente freigesetzte Zellen und restliche adhärente Aggregate getrennt. Die Cytospin-Zellen wurden wie oben mit mAb und Immunoperoxidase auf spezifische Antigene angefärbt. Außerdem wurden die Objektträger zur Bestrahlung [5 Tage] in photographische Emulsion eingetaucht [Kodak-Autoradiographieemulsion Typ NTB2 Nr. 165-4433], bevor sie entwickelt, mit Giemsa angefärbt und in Permount montiert wurden. Für Pulse-Chase-Experimente wurde eine geringere Dosis von ³H-TdR verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten, aber die Zellen wurden ansonsten genauso behandelt. Der Puls wurde mit 0,1 μCi/ml 2 h lang oder 16 h lang angewendet, letzteres, um höhere Anfangsmarkierungsindices zu erhalten. Die Zellen wurden gewaschen und 1–3 Tage lang einer Chase-Phase ausgesetzt, bevor sie geerntet und wie oben mit Immunoperoxidase, Autoradiographie und Giemsa-Färbung analysiert wurden.
Die 2 und 3 Wochen alten Kulturen wurden ³H-TdR ausgesetzt und auf proliferative Aktivität untersucht. Die markierten Zellen wurden gewaschen, auf Objektträger geschleudert; und die Cytospins wurden mit mAb und einem Immunoperoxidase-Verfahren angefärbt, bevor sie zur Bestrahlung in photographische Emulsion eingetaucht wurden. Wichtige Marker waren die mAbs 2A1 und NLDC-145, die bei reifen dendritischen Zellen intrazelluläre Granula bzw. ein Zelloberflächenantigen erkennen.
Wenn Kulturen mit einem 2-h-Puls von ³H-TdR markiert wurden, war zu erkennen, dass der Markierungsindex in den Aggregaten sehr hoch war, wobei sich wenigstens 10–15% der Profile in den Aggregaten in der S-Phase befanden. Wenn dagegen ³H-TdR auf Kulturen angewendet wurde, die typische nichtadhärente dendritische Zellen freisetzen, enthielt die freigesetzte Fraktion nur seltene markierte Profile. Wenn GM-CSF entfernt wurde, hörte die ³H-TdR-Markierung innerhalb eines Tages auf. Praktisch alle ³H-TdR-markierten Zellen in dem Aggregat ließen sich nicht mit mAb gegen Marker markieren, die man auf reifen dendritischen Zellen findet, d. h. 2A1 und NLDC145. Das Ausmaß der Färbung mit Anti-MHC-Klasse-II-mAb war auf den Zellen in der S-Phase geringer als in den freigesetzten dendritischen Zellpopulationen [nicht gezeigt].
Dann wurden Pulse-Chase-Experimente durchgeführt, um zu bestätigen, dass markierte Zellen in dem Aggregat zu typischen dendritischen Zellen führten. Kulturen wurden zuerst einer geringen Dosis von ³H-TdR ausgesetzt, entweder 2 h lang oder 16 h lang, letzteres, um einen größeren Prozentsatz der Zellen in den Aggregaten zu markieren. Die Näpfe wurden frei von radioaktivem Marker gewaschen, und dann wurden die Aggregate entfernt und durch 1-g-Sedimentation von freien Zellen abgetrennt. Die Aggregate wurden in frisches Medium ohne radioaktiven Marker übergeführt, und über die nächsten 1–3 Tage der Kultur hinweg wurden viele dendritische Zellen in das Medium freigesetzt. Als die der Chase-Phase ausgesetzten Kulturen untersucht wurden, zeigten sich mehrere Ergebnisse. Der Markierungsindex blieb hoch, d. h. der größte Teil der Nachkommenschaft von Zellen, die in den Aggregaten proliferierten, gingen nicht aus den Kulturen verloren. Zweitens waren die Kornzählungen gegenüber denjenigen, die im ursprünglichen Puls sichtbar waren, mehrfach verdünnt. Drittens waren Zellen, die die Marker von reifen dendritischen Zellen exprimierten [NLDC145, das Granulum-Antigen 2A1, große Mengen an MHC-Klasse II], jetzt radioaktiv markiert. Daher proliferierten Zellaggregate, die von GM-CSF in kultiviertem Mäuseblut induziert wurden, aktiv und setzten nichtproliferierende Nachkommenschaft mit vielen der typischen cytologischen und antigenischen Merkmalen von reifen dendritischen Zellen einschließlich des Granulum-Antigens 2A1, des NLDC145-Markers und großer Mengen von MHC Klasse II frei.
F. Akzessorische Zellfunktion für proliferative T-Zell-Reaktionen
Die MLR-stimulierende Aktivität wurde in den mit GM-CSF behandelten Blutkulturen überwacht. Zellen aus den Blutkulturen wurden 1500 rad [¹³⁷Cs] ausgesetzt und in abgestuften Dosen auf 3 × 10⁵ gereinigte syngenische oder allogenische T-Zellen in 96-Napf-Flachboden-Mikrotestnäpfen angewendet. Bei den T-Zellen handelte es sich um gegenüber Nylonwolle nichtadhärente Milz- und Lymphknotensuspensionen, die mit Anti-Ia plus J11d-mAbs und Komplement behandelt wurden, um restliches APC zu entfernen. Die ³H-TdR-Aufnahme wurde nach 72–86 h gemessen [6 Ci/mM, 4 μCi/ml endgültig].
Anfangs gab es nur wenig oder keine MLR-stimulierende Aktivität [4,
] was stimulierende Aktivität wurde am Tag der Kultur festgestellt [4,
]. Eine Untersuchung von Cytospin-Präparaten zeigte, dass diese 1 Tag alten nichtadhärenten Blutzellen eine geringe [< 0,3%], aber eindeutige Teilmenge an Ia-reichen dendritischen Profilen aufwiesen. Bis zum Tag 7, als die proliferierenden Aggregate zum ersten Mal auf der Monoschicht zu sehen waren, hatte die stimulierende Aktivität der entfernten Aggregate weiter zugenommen, hatte jedoch immer noch eine 100mal geringere spezifische Aktivität als typische endritische Zellen [4, vergleiche
und
], obwohl die meisten der Zellen am Tag 7 und zu anschließenden Zeitpunkten MHC-Klasse-II-positiv waren. Bis zum Tag 14, als typische nichtadhärente dendritische Zellen gerade anfingen, aus den Aggregaten freigesetzt zu werden, hatte die nichtadhärente Population eine beträchtliche MLR-stimulierende Aktivität [4,
]. Nach 3 Wochen waren typische reife dendritische Zellen häufig geworden, und diese stimulierten tatsächlich vergleichbar mit ihren Gegenstücken aus der Milz [4, vergleiche
und
]. Andere Zellen in der Kultur wie solche die aus den Agregaten entfernt wurden, waren etwa 10mal weniger aktiv als dendritische Zellen [4
]. Wir schließen daraus, dass die Aggregate von proliferierenden dendritischen Zellen etwas MLR-stimulierende Aktivität haben, aber dass erst die reifen freigesetzten Zellen vollständig potent sind, einige 100–300mal aktiver pro Zelle als die Populationen in der Ausgangskultur nach 1–7 Tagen. Während den Tagen 7–20 der Kultur expandierten die Gesamtzellzahlen ebenfalls auf wenigstens das 5–10fache.
G. Homina-Aktivität dendritischer Zellen in vivo
Ein zweites spezialisiertes Merkmal dendritischer Zellen ist ihre Fähigkeit, in die T-Bereiche von peripheren lymphoiden Geweben zu wandern (8, 10). Dendritische Zellen oder andere Zelltypen wurden 10 min lang in einer Menge von 2–10 × 10⁶/ml mit Carboxyfluorescein auf Eis markiert [Molecular Probes C-1157; 30 μM Endkonzentration in Hanks' gepufferter Salzlösung (HBSS) mit 5% FCS], in RPMI 1640 gewaschen und in einem Volumen von 50 μl RPMI-1640 in die Fußballen injiziert. Einen Tag später wurden die entwässernden Kniekehlenlymphknoten entfernt, in OCT-Medium eingefroren und in einem Kryostaten geschnitten [10 μ-Schnitte]. Um Proben aus dem gesamten Knoten zu entnehmen, nahmen wir in regelmäßigen Abständen doppelte Proben. Die Schnitte wurden auf Multinapf-Objektträger [Carlson Scientific Microslides Nr. 111006] aufgetragen, bei –20°C gelagert, 30 min vor der Verwendung in einem Exsiccator getrocknet [oder über Nacht auf Raumtemperatur gelassen], in Aceton fixiert und mit einem Peroxidase-konjugierten Kaninchen-Anti-FITC-Antikörper angefärbt [Dakopatts, P404]. Um zu bestätigen, dass sich die dendritischen Zellen im Lymphknoten in den T-abhängigen Bereichen befanden, wie es beschrieben ist (8), gaben wir geeignetes mAb zu B-Zellen, T-Zellen, Makrophagen oder dendritischen Zellen und machten letztere sichtbar mit Alkalische-Phosphatase-konjugiertem Maus-Anti-Ratten-Ig [Boehringer Mannheim, Nr. 605-5357] plus einem Chromogen-Kit [Biomeda Corp., Foster City CA Nr. S04]. Dann blockierten wir endogene Peroxidase mit "Endo Blocker" [Biomeda Corp., Nr. M69], und anschließend folgte das Peroxidase-Anti-FITC wie oben.
Blutleukocyten, selbst wenn sie in einer Dosis von 10⁶ Zellen pro Fußballen verabreicht wurden, wanderten nicht zum Lymphoidorgan. Als wir dendritische Zellen testeten, die mit GM-CSF aus Blut erzeugt worden waren, wurde die Wanderung zum T-Bereich mit Injektionen von 200 000 Zellen beobachtet. Die selektive Lokalisierung auf die T-Bereiche wurde durch doppelte Markierung der Proben mit mAb, die B-Zellen oder T-Zellen anfärben, bestätigt. Daher haben in Kultur erzeugte dendritische Zellen die entscheidenden funktionellen Merkmale dieses Zellklons: Wanderung zu den T-abhängigen Bereichen und starke akzessorische Wirkung.
H. Bedingungen für die Erzeugung von dendritischen Zellkolonien aus Blut
Der Oberflächenphänotyp der Blutzelle, der zu den Kolonien dendritischer Zellen führt, wurde durch Behandlung der Ausgangspopulation mit Antikörpern und Komplement bewertet. Die Behandlung mit entweder Anti-dendritische-Zelle 33D1, Anti-MHC-Klasse-II oder Anti-Thy-1 entfernte die koloniebildende Einheit nicht [nicht gezeigt]. Stattdessen wurden die Koloniezahlen durch die Entfernung von Thy-1⁺- oder Ia⁺-Zellen mehrfach angereichert. Andere CSFs als GM-CSF wurden ebenfalls getestet, entweder zu Beginn der 1–3 Wochen dauernden Kultur oder nach Übertragung von 2–3 Wochen alten Aggregaten unter Bildung von Zellen mit Schleiern. Keines der getesteten CSFs, d. h. IL-3, M-CSF, G-CSF, SCF, unterstützte die Bildung von Kolonien oder reifen dendritischen Zellen. Daher hängen die wachsenden dendritischen Kolonien sehr stark von GM-CSF ab.
In einem Versuch, proliferierende Vorläufer des dendritischen Zellsystems zu identifizieren, setzten wir Kulturen von mehreren Geweben an, denen reife dendritische Zellen fehlen, und versetzten diese mit unterschiedlichen Wachstumsfaktoren, insbesondere den CSFs [M-CSF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1 und SCF]. Dendritische Zellvorläufer von der neonatalen Epidermis, die hauptsächlich Ia-negative Langerhans-Zellen enthält (29), wurden nicht beobachtet. Um ein Überwachsen von Granulocyten in Bulk-Knochenmarkkulturen zu vermeiden, was die Identifizierung von typischen Zellkolonien oder von großen Zahlen von dendritischen Zellen schwierig machen kann, werden die nichtadhärenten proliferierenden Granulocyten vorzugsweise an den Tagen Z und 4 entfernt. Blut, das bei der Maus wenige typische dendritische Zellen aufweist (30), erwies sich als sehr effektiv, um Vorläufer dendritischer Zellen zu erhalten. Wachsende Zellaggregate erschienen nach etwa 6 Tagen in Kultur, und diese waren häufig mit Profilen bedeckt, die die ungewöhnlichen und motilen Fortsätze von dendritischen Zellen aufwiesen. Mit der Zeit wurden typische nichtadhärente dendritische Zellen freigesetzt. Letztere hatten die Morphologie und die Bewegung von dendritischen Zellen, wie sie bereits bei kultivierter Mäusemilz, Mäusehaut, Lymphe von mehreren Spezies und Humanblut beschrieben wurde (25–27). Daher scheint es zum Identifizieren von proliferierenden dendritischen Zellen entscheidend zu sein, mit einer geeigneten Ausgangspopulation, vorzugsweise Blut, zu beginnen und die Kultur mit GM-CSF zu versetzen.
Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen, glauben wir, dass die Anfangsaggregate, die in den Kulturen erschienen, Klone repräsentierten, da sehr kleine Gruppen von 4–6 Zellen früh, zum Beispiel am Tag 5, beobachtet wurden. Wir versuchten zu beweisen, dass die Aggregate klonal waren, indem wir Blutzellen aus Stämmen miteinander mischten, die mit Markern gegen polymorphe Antigene, wie CD44 und MHC Klasse II, unterschieden wurden. Wir konnten jedoch die Experimente nicht vervollständigen, da wir herausfanden, dass sich die Mäusestämme hinsichtlich der Zahl und Geschwindigkeit, mit der sich die Kolonien entwickelten, unterschieden. BALB/c und DBA [und die davon abgeleiteten F1-Stämme] waren am aktivsten, B6 und B10 waren mehrfach weniger aktiv, und Stämme wie CBA/J, C3H/He und A/J waren schlechte Quellen für proliferierende dendritische Zellaggregate.
Die Vorläufer der Aggregate proliferierender dendritischer Zellen waren keine typischen Monocyten oder dendritischen Zellen, da die Zahl von Aggregaten, die sich entwickelten, wesentlich erhöht werden konnte, wenn man Monocyten durch Adhärenz oder Ia-positive Zellen mit Antikörper und Komplement abreicherte. Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen, kommen wir versuchsweise zu dem Schluss, dass Blut einen Ia-negativen Vorläufer enthält, der ein proliferierendes Aggregat bildet. In dem Aggregat reifen dendritische Zellen heran und werden als nichtproliferierende Nachkommenschaft freigesetzt.
Die Bildung von Aggregaten von dendritischen Zellen erforderte exogenes GM-CSF. Wenn die Aggregate in auf Makrophagen oder Granulocyten beschränkte CSFs [M-CSF, G-CSF] gebracht wurden, hörte die Proliferation auf, und weder Makrophagen noch Granulocyten wurden gebildet. Da die Kulturen neben den Aggregaten dendritischer Zellen Makrophagen und einige stromale Zellen enthielten, war es möglich, dass andere Cytokine hergestellt wurden, die für die Bildung dendritischer Zellen entscheidend waren. Es scheint jedoch, dass die Zellen in den Aggregaten ihre Reaktionsfähigkeit auf M- und G-CSF verloren haben und dass dendritische Zellen einen getrennten Myeloid-Weg der Entwicklung darstellen. Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen, stammt der Weg vielleicht von einem gemeinsamen Vorläufer ab, bei dem der dendritische Zellklon ein Ableger ist, der nicht mehr auf CSFs reagiert, die auf Makrophagen und Granulocyten beschränkt sind.
Die Markierung mit ³H-Thymidin unter Verwendung von Pulse- und Pulse-Chase-Vorschriften war wichtig, um die Vorläufer-Produkt-Beziehungen zu etablieren, die in diesen Flüssigkulturen stattfanden. Bei einem 2-h-Puls fehlten praktisch jeder markierten Zelle zwei typische Marker von reifen dendritischen Zellen, d. h. das Oberflächenantigen NLDC-145 von interdigitierenden Zellen (13) und die vor kurzem identifizierten granulären cytoplasmatischen Antigene 2A1/M342 (34). Diese mAb färben die meisten Makrophagenpopulationen nicht, die wir entweder als isolierte Zellen [Blut, Milz, peritoneale Makrophagen] oder in Schnitten [Thymusrinde, rotes Mark der Milz, Lymphknotenmark] untersucht haben. In Pulse-Chase-Vorschriften wurden große Zahlen von markierten Nachkommen aus den Aggregaten freigesetzt, und diese freigesetzten Zellen waren in der MLR nichtadhärent, motil und stark stimulatorisch. Nach einer kombinierten Autoradiographie und Immunoperoxidase-Markierung trugen die markierten Nachkommen die granulären Antigene, das NLDC-145-Antigen und sehr große Mengen an MHC Klasse II. Jeder dieser cytologischen und antigenischen Marker sind weitgehend auf dendritische Zellen beschränkt.
Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen, glauben wir, dass die Reifung zu typischen nichtproliferierenden dendritischen Zellen innerhalb des Aggregats stattfand. Die Aggregate waren mit Zellen mit den flächigen oder schleierartigen Fortsätzen dendritischer Zellen bedeckt. Zellen mit Markern von reifen dendritischen Zellen [hohes MHC Klasse II, 2A1-positive Granula, NLDC-Antigen] wurden auch am Rand der Zellaggregate beobachtet. Es war jedoch schwierig, das Aggregat intakt zu isolieren, d. h. ohne diese reiferen Zellen zu entfernen. Der Mechanismus, mit dem dendritische Zellen reiften und das Aggregat verließen, war nicht klar. Die Reifung wurde in älteren Kulturen [> 2 Wochen] oder durch Entfernung adhärenter Stromazellen verstärkt. Sowohl die Proliferation als auch die Reifung waren blockiert, wenn die Zellen zu viele Fibroblasten enthielten.
Die funktionelle Reifung, die in dem proliferierenden Aggregat stattfand, ist verblüffend. Die dendritischen Zellen, die in Kultur erzeugt wurden, waren potente MLR-Stimulatoren. 100 dendritische Zellen induzierten eine viel stärkere primäre MLR als 100 000 Blutleukocyten. Die Erhöhung der stimulierenden Aktivität pro Ia-positiver Zelle betrug wenigstens 2 Zehnerpotenzen zwischen dem Zeitpunkt, als die Aggregate zum ersten Mal erschienen, und dem Zeit punkt, als typische dendritische Zellen in großen Zahlen freigesetzt wurden. Über diesen Zeitraum nahm die Zellgewinnung auf das 5-10fache zu. Außerdem wanderten die dendritischen Zellnachkommen genau zum T-Zellbereich des Lymphknotens, eine weitere funktionelle Eigenschaft, die bei Blutzellen nicht nachweisbar war [Daten nicht gezeigt].
Beispiel 2 Erzeugung großer Zahlen von dendritischen Zellen aus mit GM-CSF versetzten Mäuseknochenmarkkulturen
Material
A. Mäuse
Weibliche BALB/c-, männliche DBA/2- und weibliche C57BL/6-Mäuse, 7 Wochen alt, wurden von Japan SLC [Hamamatsu, Shizuoka, Japan] bezogen. BALB/c × DBA/2 F1, beiderlei Geschlechts, 7–10 Wochen alt, stammten von Japan SLC und vom Trudeau Institute, Saranac Lake, NY.
Reagentien
Das Kulturmedium war RPMI-1640 [Nissui, Tokyo, Japan; Gibco, Grand Island, NY], versetzt mit 5% FCS, 50 μM 2-Mercaptoethanol und 20 μg/ml Gentamicin. Murines rGM-CSF [10⁸ E/mg Protein] wurde freundlicherweise von der Kirin Brewery Co. [Maebashi, Gumma, Japan] zur Verfügung gestellt. Ein Panel von Ratten- und Hamster-mAbs gegen Mäuseleukocyten-Antigene ist an anderer Stelle beschrieben (23, 24). FITC- und Peroxidase-konjugiertes Maus-Anti-Ratten-IgG wurde von Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN] bezogen, und FITC- und Peroxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Hamster-Ig [γ- und L-Kette] stammten vom Jackson Immunoresearch Lab [Westgrove, PA] bzw. Caltag [San Francisco, CA].
B. Knochenmarkkulturen
Nach dem Entfernen von allen Muskelgeweben mit Gaze aus den Oberschenkenknochen und Schienbeinen der Maus wurden die Knochen 1 min lang in eine 60-mm-Schale mit 70% Alkohol gegeben, zweimal mit PBS gewaschen und in eine frische Schale mit RPMI-1640 übergeführt. Beide Enden der Knochen wurden in der Schale mit einer Schere abgeschnitten, und dann wurde das Mark herausgespült, wobei man 2 ml RPMI-1640 mit einer Spritze und 25G-Nadel verwendete. Das Gewebe wurde suspendiert, durch ein Nylonnetz passiert, um kleine Stücke von Knochen und Trümmern zu entfernen, und rote Blutkörperchen wurden mit Ammoniumchlorid lysiert. Nach dem Waschen wurden Lymphocyten und Ia-positive Zellen 60 min lang bei 37°C mit einem Cocktail von mAbs und Kaninchen-Komplement abgetötet. Die mAbs waren GK 1.5 Anti-CD4, HO 2.2 Anti-CD8, B21-2 Anti-Ia und RA3-3A1/6.1 Anti-B220/CD45R, die alle von der ATCC erhalten wurden [TIB 207, 150, 229 bzw. 146]. 7,5–10 × 10⁵ Zellen wurden in 24-Napf-Platten [Nunc, Naperville, IL] in 1 ml Medium, das mit 500–1000 E/ml rGM-CSF versetzt war, gegeben. Die Kulturen wurden etwa 2 bis 10 Tage lang gewöhnlich alle 2 Tage gefüttert, indem man die Platten sachte aufwirbelte, 3/4 des Mediums absaugte und frisches Medium mit GM-CSF wieder zugab. Ein Ziel dieser Waschvorgänge bestand darin, nichtadhärente Granulocyten zu entfernen, ohne Haufen von sich entwickelnden dendritischen Zellen, die locker an fest adhärenten Makrophagen befestigt waren, zu entfernen.
Um mit wachsenden dendritischen Zellen anzureichern, verwendeten wir ein ähnliches Verfahren, wie es für die Mäuseblut-Zellkulturen von Beispiel 1 beschrieben ist. Kurz gesagt, die Aggregate von angehefteten Zellen wurden mit Pasteur-Pipetten entfernt und auf 6-ml-Säulen mit 50% FCS-RPMI 1640 aufgetragen. Restliche Granulocyten in den Kulturen, häufig auch in Aggregaten, wurden in diesem Schritt leicht dissoziiert. Nach 1-g-Sedimentation der entfernten Zellen wurden auf den Boden des Röhrchens gesunkene Haufen und einzelne Granulocyten an der Oberseite gelassen. Die Aggregate wurden mit 2–3 × 10⁵/ml in frischem Medium mit GM-CSF subkultiviert, typischerweise 1 Tag lang in 16-mm-Näpfen. Nach einer Kultur über Nacht wurden große Zahlen typischer dendritischer Zellen freigesetzt. Adhärente Makrophagen expandierten ebenfalls in diesen Kulturen, aber die meisten blieben fest adhärent an der Kulturoberfläche.
C. Cytologischer Vergleich von Vorläufern dendritischer Zellen und Ia-negativen Knochenmark-Nichtlymphocyten
Um die freigesetzten [mit dendritischen Zellen angereicherten; oben] und die adhärenten [mit Makrophagen angereicherten; unten] Fraktionen von 7 Tage alten Knochenmarkkulturen miteinander zu vergleichen, wurden Ia-negative Knochenmark-Nichtlymphocyten in GM-CSF kultiviert. An den Tagen 2 und 4 wurden nichtadhärente Zellen sachte weggewaschen, und am Tag 6 wurden die locker angehefteten Zellaggregate durch 1-g-Sedimentation isoliert. Nach einem Tag in Kultur wurden die Zellen, die aus den Aggregaten freigesetzt wurden, durch Cytospinning auf Objektträger aufgebracht und mit verschiedenen mAbs plus Peroxidase-Anti-Ig sowie Giemsa und unspezifische Esterase angefärbt. Die festhaftenden Zellen in den ursprünglichen Kulturen wurden mit EDTA entfernt und ebenfalls einem Cytospinning unterzogen. In der freigesetzten Fraktion befinden sich viele dendritische Profile [eine Lupe ist nützlich, um die Zellform und die kontaminierenden Granulocyten in der Giemsa-Färbung nachzuweisen], während die adhärenten Zellen zum größten Teil typische vakuolisierte Makrophagen sind. Eine starke MHC-Klasse-II-Expression erfolgt auf allen freigesetzten Zellen außer wenigen typischen Granulocyten. Nur eine Teilmenge der festhaftenden Zellen exprimiert Klasse II. Die meisten freigesetzten Zellen exprimieren das endocytische Vakuolenantigen 2A1, während die adhärenten Zellen 2A1-schwach oder -negativ sind.
D. Zelloberflächen- und intrazelluläre Antigene
Bei der Zelloberflächenfärbung wurde Cytofluorographie verwendet [FACScan; Becton Dickinson, Mountain View CA]. Auf die Färbung mit primären Ratten- oder Hamster-mAbs folgten FITC-konjugierte Maus-Anti-Ratten- oder Ziegen-Anti-Hamster-Igs, wie es in Beispiel 1D beschrieben ist. Ein Panel von mAbs gegen die Zelloberfläche (23, 24) und gegen intrazelluläre Antigene (33, 34) wurde auf Cytospin-Präparaten getestet. Wir untersuchten sowohl adhärente als auch nichtadhärente Populationen, wobei erstere in Gegenwart von 10 mM EDTA entfernt wurden [die adhärenten Zellen wurden zweimal mit PBS und einmal mit EDTA-PBS gespült und dann 20 min bei 37°C mit EDTA-PBS inkubiert]. Die Cytospins wurden in Aceton fixiert und mit mAbs und anschließend Peroxidase-konjugiertem Anti-Ratten- oder Anti-Hamster-Ig angefärbt. Die Peroxidase wurde mit Diaminobenzidin sichtbar gemacht, und die Kerne wurden mit Giemsa gegengefärbt.
E. Cytologische Assays
Giemsa-Färbungen wurden mit Cytospin-Präparaten durchgeführt, wie es bei der Färbung mit unspezifischer Esterase [α-Naphthylacetat als Substrat] unter Verwendung von Standardverfahren (35) der Fall war, außer dass die Cytospin-Präparate mit 2% Glutaraldehyd in Hanks-Medium anstelle von gepuffertem Aceton-Formalin fixiert wurden. Phasenkontrastbeobachtungen, gewöhnlich von lebenden Zellen, wurden mit umgekehrten Mikroskopen [Nikon Diaphot] bei einer endgültigen Vergrößerung von 100 × und 400 × durchgeführt. Transmissionselektronenmikroskopie (36) und ³H-Thymidin-Autoradiographie wurden an sich entwickelnden dendritischen Zellen durchgeführt, wie es in Beispiel 1E beschrieben ist.
F. Gemischte Leukocytenreaktionen
Zellen aus den Knochenmarkkulturen wurden 15 Gy Röntgenstrahlung ausgesetzt und 4 Tage lang in abgestuften Dosen auf 3 × 10⁵ syngenische oder allogenische T-Zellen in 96-Napf-Flachboden-Kulturplatten angewendet. Die T-Zellen wurden hergestellt, indem man Milz- und Lymphknotensuspensionen durch Nylonwolle passierte und dann die restlichen APCs mit Anti-Ia plus J11d-mAbs plus Komplement abreicherte. Die Aufnahme von ³H-Thymidin wurde nach 80–94 h nach einem Puls von 4 μCi/ml [222 GBq/mmol; American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, MO] gemessen.
G. Aggregate von proliferierenden dendritischen Zellen aus mit GM-CSF versetztem Mäuseknochenmark
Vor der Kultur behandelten wir die Knochenmarksuspensionen mit einem Cocktail von mAbs gegen B-Zellen, T-Zellen und MHC-Klasse-II-Antigene plus Komplement. Diese Vorbehandlung von Knochenmarkzellen, die die Zahl der B-Zellen und Granulocyten reduziert, ist notwendig, um wachsende dendritische Zellen in Knochenmark zu identifizieren, da B-Zellen und Granulocyten ebenfalls auf GM-CSF ansprechen und proliferieren und die Anwesenheit von Vorläufern dendritischer Zellen maskieren.
Dementsprechend wirbelten wir die Platten nach Tag 2 und Tag 4 der Kultur sachte auf, um locker adhärente Zellen zu entfernen, die sich als Granulocyten mit typischer Morphologie und Expression des RB6-Antigens erwiesen [siehe unten]. Mit diesen Schritten erkannten wir bis zum Tag 4 zelluläre Aggregate, die an einer Schicht von adhärenten Zellen befestigt waren. Einige der Profile in den Aggregaten hatten die Schleier oder flächigen Fortsätze von dendritischen Zellen. Die Aggregate konnten durch sachtes Pipettieren entfernt und durch 1-g-Sedimentation abgetrennt werden. Innerhalb von 3 h des Ausplattierens wanderten viele stachlige adhärente Zellen aus den Haufen heraus und hatten das Aussehen von frischen adhärenten Zellen aus der Milz (13). Nach einem weiteren Tag der Kultur verließen diese adhärenten Zellen die Oberfläche, und viele typische dendritische Zellen wurden im Kulturmedium schwimmend beobachtet. Optimale Ausbeuten von dendritischen Zellen wurden erhalten, als die Aggregate am Tag 6 geerntet und dann über Nacht kultiviert wurden. Die Kapazität von Knochenmark zur Erzeugung von dendritischen Zellen ist verblüffend: > 5 × 10⁶ aus den 4 Hauptknochen der Hintergliedmaßen in einer Woche.
Angeheftet an die Oberfläche der Kulturnäpfe waren Zellen mit den cytologischen Merkmalen von Makrophagen und diese expandierten ebenfalls in der Anzahl während der ersten Kulturwoche. Diese Zellen konnten nach der Inkubation bei 37°C in Gegenwart von 10 mM EDTA durch Pipettieren entfernt werden.
Wenn die Kulturen in M-CSF gehalten wurden, wuchsen große Zahlen von Makrophagen heraus und waren fest an die Kunststoffoberfläche geheftet. Es waren jedoch keine dendritischen Zellen oder dendritischen Zellaggregate zu sehen. Wenn ein Gemisch von M-CSF und GM-CSF aufgetragen wurde, dann wurden Kolonien von adhärenten Makrophagen sowie Aggregate von wachsenden Granulocyten und dendritischen Zellen festgestellt.
H. Entwicklung von potenten MLR-Stimulatorzellen in Knochenmarkkulturen
Es ist bekannt, dass Suspensionen von Mäuseknochenmark nicht als MLR-Stimulatoren aktiv sind (38) und keine nachweisbaren dendritischen Zellen enthalten (30). In Anbetracht der obigen cytologischen Beobachtungen kultivierten wir 6 Tage lang Ia-negative Knochenmark-Nichtlymphocyten und überprüften die MLR-stimulierende Aktivität in täglichen Abständen. Solange die Kulturen mit GM-CSF versetzt wurden, entwickelte sich eine starke MLR-stimulierende Aktivität [5]. Die Zunahme war progressiv und bis zum Tag 6 induzierten nur 100 der Knochenmarkzellen MLRs mit Stimulationsindices von 20 oder mehr.
Um die Entwicklung von MLR-stimulierender Aktivität mit dem Auftreten von dendritischen Zellen in diesen heterogenen Kulturen zu korrelieren, trennten wir die Kulturen zuerst in nichtadhärente und locker adhärente Fraktionen [6A]. Die nichtadhärenten Zellen, bei denen es sich in den ersten 4 Tagen hauptsächlich um Granulocyten handelte, wurden erhalten, indem man die Platten sachte aufwirbelte und die Zellen erntete. Die locker adhärenten Zellen, die am Tag 4 und zu späteren Zeitpunkten die Aggregate von vermuteten Vorläufern dendritischer Zellen und dendritischen Zellen enthielten, wurden entfernt, indem man die Oberfläche von fest adhärenten stromalen Zellen überpipettierte. Am Tag 2 und am Tag 4 befand sich die potenteste stimulierende Aktivität in der adhärenten Fraktion. Bis zum Tag 6 war die nichtadhärente Fraktion sehr aktiv. Wenn man fest adhärente Makrophagen testete, gab es keine MLR-stimulierende Aktivität [6B, nicht ausgefüllte Quadrate].
Wie oben erwähnt, entwickelten die Kulturen in Gegenwart von GM-CSF zwischen den Tagen 4 und 8 der Kultur Aggregate von wachsenden Zellen, die typische dendritische Zellen freisetzen. Diese Aggregate konnten durch sachtes Pipettieren über die Monoschicht und anschließende 1-g-Sedimentation isoliert werden. Als die Aggregate zur Kultur zurückgegeben wurden, wurden mit dendritischen Zellen angereicherte Populationen freigesetzt, und es erwies sich, dass diese freigesetzten Zellen die sehr starke MLR-stimulierende Aktivität aufweisen, die für dendritische Zellen charakteristisch ist [6B].
I. Zelloberflächenmarker – Cytofluorographie: Durch Cytofluorographie ließen sich in den nichtadhärenten oder leicht entfernten Zellen leicht zwei Populationen von Zellen unterscheiden. Eine Population hatte eine geringe Vorwärtslichtstreuung, große Mengen des RB6-Antigens und geringe Mengen an MHC Klasse II. Die andere Population war größer und hatte den reziproken Phänotyp. Die aggregierten Zellen waren im Vergleich zu unfraktionierten Kulturen an MHC-Klasse-II-positiven Zellen angereichert [8, vergleiche links und Mitte], und die Menge an MHC Klasse II auf einzelnen Zellen nahm zu, als die Aggregate über Nacht kultiviert wurden, um hochgradig angereicherte Populationen an dendritischen Zellen freizusetzen [8, vergleiche Mitte und rechts]. Nach 6 Tagen im Vergleich zu 4 Tagen Kultur wurden MHC-Klasse-II-reichere, RB6-Antigen-negative Zellen beobachtet [8]. Keine der Zellen reagierte mit den mAbs gegen das B220-Antigen von B-Zellen oder das SER-4-Antigen von Makrophagen [nicht gezeigt].
Detailliertere FACS-Studien wurden mit Zellen durchgeführt, die aus den Aggregaten freigesetzt wurden. Die Granulocyten wurden auf der Basis der geringeren Vorwärtslichtstreuung ausgeschleust. Die größeren dendritischen Zellen hatten gleichmäßig hohe Niveaus an MHC Klasse I und II sowie CD44 und CD11b [Mac-1; M1/70]. Eine Färbung auf mittlerem Niveau wurde für das hitzestabile Antigen [HSA; M1/69], CD45 [M1/9.3] und CD18 [2E6] festgestellt. Färbung auf geringerem Niveau war bei dem niedrigaffinen IL-2-Rezeptor [CD25, 7D4], dem Antigen interdigitierender Zellen [NLDC-145], Fcγ-Rezeptor [2.4G2], dem Antigen dendritischer Zellen [33D1], dem Makrophagenantigen [F4/80] und CD11c-p150/90-β2-Integrin [N418] zu erkennen. Mehrere Antigene waren nicht nachweisbar; dazu gehören die Marker von Phagocyten [SER-4-Randzonenmakrophage, RB6-Granulocyt] und Lymphocyten [RA3-6.1-B-Lymphocyt; Thy-1-, CD3-, -4-, -8-T-Lymphocyt]. Dieser Phänotyp ist in vielerlei Hinsicht ähnlich wie der in dendritischen Zellen der Milz und der Epidermis beobachtete (24, 27, 28). Die einzige Ausnahme ist das hohe Niveau an CD11b bei den von Knochenmark abgeleiteten Zellen, ein Integrin, dass dabei hilft, die Emigration von Myeloidzellen aus der Gefäßversorgung zu vermitteln.
J. Cytospin-Präparate
Cytospins wurden hergestellt, um die freigesetzten dendritischen Zellen weiter mit der fest adhärenten stromalen Population zu vergleichen. Nach Giemsa-Färbung hatten die Zellen, die aus den Aggregaten freigesetzt worden waren, die typische sternartige Form von dendritischen Zellen, während die adhärenten Zellen zum größten Teil vakuolisierte Makrophagen waren. Viele der dendritischen Zellen wiesen einen perinukleären Fleck von unspezifischer Esterase-Färbung auf, während die stärker adhärenten Populationen eine große Häufigkeit von cytoplasmatischer Esterase aufwiesen.
Die freigesetzten Zellen zeigten eine starke Färbung für MHC-Klasse-II-Produkte, außer den Kontaminanten mit typischen Granulocytenkernen. Die stark adhärenten Zellen enthielten eine Subpopulation von Klasse-II-positiven Zellen. Vor kurzem wurden Antigene beschrieben, die primär in intrazellulären Vakuolen von dendritischen Zellen und B-Zellen, aber nicht von mononukleären Phagocyten lokalisiert sind. Die Antikörper werden M342 (34) und 2A1 genannt. Viele der dendritischen Zellen zeigten eine starke 2A1-Färbung, und eine geringere Zahl exprimierte M342. Die adhärenten Zellen wiesen wenige Profile mit schwachem 2A1 auf.
Die Entwicklung von Ia-positiven Zellen und von Zellen, die granuläre intrazelluläre Antigene exprimieren, wurde an Cytospins quantifiziert [10]. MHC-Klasse-II-Antigene wurden zuerst exprimiert, gefolgt von den granulären Antigenen 2A1 und M342 [10]. Bis zum Tag 8 war der größte Teil der Zellen dendritisch und wies große Mengen an MHC-Klasse-II-Produkten und 2A1-Antigen auf. Wenn keine Granulocyten aus den Kulturen entfernt wurden, war die Ausbeute an nichtadhärenten Zellen viel größer, aber der größte Prozentsatz an MHC-Klasse-II-positiven Zellen, der nachgewiesen wurde, betrug 30%, und es war schwierig, die Aggregate, die der Stelle des Wachstums der dendritischen Zellen entsprachen, zu identifizieren und zu isolieren.
Als die Cytospins auf andere Myeloidantigene angefärbt wurden, zeigten die freigesetzten Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen den Fcγ-Rezeptor [2.4G2] und mit auf Makrophagen beschränktem Antigen [F4/80] eine schwache und zuweilen überhaupt keine Färbung oberhalb des Hintergrunds. Die meisten der fest adhärenten Zellen zeigten dagegen eine starke Färbung für beide Antigene. Dies lässt vermuten, dass man auf der Oberfläche der freigesetzten dendritischen Zellen zwar geringe Mengen an 2.4G2 und F4/80 findet, doch die Synthese und Expression wahrscheinlich herunterreguliert sind, ähnlich wie wenn epidermale dendritische Zellen in Kultur gebracht werden (27).
Am Tag 4 schwammen einige 30–50 000 Ia-positive Zellen in den Kulturen, während sowohl am Tag 6 als auch am Tag 8 weitere 50–100 000 Ia-positive Zellen geerntet wurden. Die quantitativen Daten wiesen darauf hin, dass jeder Napf in einer Woche einige 200 000 oder mehr Ia-positive Zellen erzeugte. Da wir etwa 20–30 Näpfe der Ia-negativen Ausgangsknochenmarkzellen aus zwei Schienbeinen und zwei Oberschenkelknochen erhielten, beträgt die Gesamtausbeute an Ia-positiven Zellen 5 × 10⁶ oder mehr, was die geschätzte Gesamtzahl an Langerhans-Zellen in der Haut einer Maus übersteigt (27).
K. ³H-Thymidin-Pulse-Chase-Experimente
Um die Proliferation und Differenzierung von dendritischen Zellen in diesen Kulturen weiter zu dokumentieren, wurden am Tag 4 Haufen von Zellen isoliert, einem 12-h-Puls von ³H-Thymidin ausgesetzt und sofort oder nach 1, 2 bzw. 3 Tagen Chase-Phase in ³H-Thymidin-freiem Medium durch Autoradiographie untersucht. Am Anfang war der größte Teil der Zellen in dem Aggregat markiert, und fast alle aus den Aggregaten freigesetzten Zellen waren markiert. Während der Chase-Phase exprimierten zunehmende Prozentanteile der freigesetzten Nachkommenschaft das granuläre Antigen 2A1 von reifen dendritischen Zellen.
L. Elektronenmikroskopie
Die freigesetzten Zellen wiesen viele große Schleier oder Lamellipodien auf, die aus mehreren Richtungen des Zellkörpers wegragten. Das Cytoplasma hatte viele Mitochondrien, wenige elektronendichte Granula und Lysosomen, aber mehrere elektronendurchscheinende Vesikel, einige mit den cytologischen Merkmalen von multivesikulären Körpern. Die zahlreichen Zellfortsätze, die von den dendritischen Zellen wegragten, waren in den halbdünnen Schnitten unserer Präparate zu erkennen.
Am Tag 5 der Kultur zeigt eine von Knochenmark abgeleitete dendritische Zelle viele cytoplasmatische Schleier. Eine Vergrößerung des perinukleären Bereichs zeigt Profile von glattem Reticulum und Vakuolen. Es gibt wenige lysosomale oder phagocytische Strukturen.
Beispiel 3 Murine Vorläufer dendritischer Zellen phagozytieren Teilchen, die Mäuse in vivo gegenüber mycobakteriellen Antigenen sensibilisieren
Material und Verfahren
A. Mäuse
Männliche und weibliche Mäuse der Stämme BALB/c × DBA/2 F1, C57BL/6 × DBA/2 F1 und BALB/c wurden vom Trudeau Institute [Saranac Lake, NY] und von Japan SLC [Hamamatsu] bezogen und im Alter von 6–10 Wochen verwendet.
B. Knochenmarkkulturen
Wie oben in Beispiel 2 beschrieben, wurde Knochenmark aus den Oberschenkenknochen und Schienbeinen gespült, mit 0,83%igem Ammoniumchlorid an roten Blutkörperchen abgereichert und in 24-Napf-Platten [Nunc, Napaville, IL, und Corning Nr. 25820, Corning, NY] in einer Menge von 10⁶ Zellen/Napf in 1 ml RPMI-1640 kultiviert, das mit 5% fetalem Kälberserum, 20 μg/ml Gentamicin und 1000 E/ml rekombinantem murinem GM-CSF [Kirin Brewery, Maebashi, Gumma, Japan; 9,7 × 10⁷ E/mg] versetzt wurde. Am Tag 2 wurden 0,75 ml Medium und die nichtadhärenten Zellen entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Dies wurde am Tag 4–5 wiederholt, wodurch der größte Teil der sich entwickelnden Granulocyten entfernt wurde und Haufen von proliferierenden dendritischen Zellen zurückblieben, die an einem Stroma hafteten, das verstreute Makrophagen enthielt. Dann wurde das Kulturmedium mit Teilchen von BCG-Mycobakterien [unten ausführlicher beschrieben] versetzt, und gewöhnlich an den Tagen 5–6 ließ man die Phagocytose 20–24 h lang fortschreiten. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen von lockeren Zellen und Teilchen freigespült, und die Zellen wurden sofort auf Teilchenaufnahme analysiert. Alternativ dazu wurden die Zellen in den gewaschenen Kulturen entfernt, und 3–4 × 10⁶ Zellen wurden 1 oder 2 Tage lang für eine 1 oder 2 Tage dauernde Chase-Phase in eine 60-mm-Petri-Schale mit frischem teilchenfreiem, mit GM-CSF versetztem Medium übergeführt. Während der Chase-Phase entwickelten sich Klasse-II-reiche reife dendritische Zellen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, und diese wurden durch Zellsortierung [unten] isoliert. Um die phagocytische Aktivität von sich entwickelnden und reifen dendritischen Zellen miteinander zu vergleichen, wurden auch Teilchen an 7–8 Tage alte Knochenmarkkulturen verabreicht, die reich an einzelnen nichtproliferierenden reifen dendritischen Zellen sind.
C. Teilchen
BCG-Mycobakterien [Trudeau Institute, 1,5–2,5 × 10⁸ CFU/ml; Kyowa Pharmaceutical Industries, Tokyo] wurden in einer Menge von ungefähr 10⁷ lebenden BCG pro Napf mit 16 mm Durchmesser verabreicht. Die Aufnahme wurde nach einer "Säurefest"-Färbung bewertet, wobei man ein Auramin-Rhodamin-Verfahren verwendete, das empfindlicher ist als das Ziehl-Neelsen-Verfahren und das Zählen der Organismen erleichtert. Kolloidaler Kohlenstoff [Pelikan-Ink, Hannover, Deutschland] wurde in einer Verdünnung von 1 : 2000 hinzugefügt. Der Kohlenstoff wurde in Proben, die mit Diff-Quik^® [Baxter Healthcare Corp., Miami, FL] angefärbt worden waren, als schwarze granuläre Färbung identifiziert. Suspensionen von 2 μm großen Latexteilchen [0,5% v/v; Seradyn, Indianapolis, IN] wurden in einer Menge von 50 μl/Napf auf die Kulturen angewendet, eine Dosis, die die Oberfläche der Kultur gut mit Kügelchen abdeckt.
D. Isolierung von reifen dendritischen Zellen durch Zellsortierung
Wie zuvor in Beispiel 2 angemerkt wurde, exprimieren die dendritischen Zellen, die in mit GM-CSF stimulierten Knochenmarkkulturen erzeugt werden, sehr große Mengen an Oberflächen-MHC-Klasse-II-Produkten [monoklonale Antikörper B21-2, TIB 227 und M5/114, TIB 120 von der ATCC] sowie mäßige Mengen an einem auf dendritische Zellen beschränkten Antigen, das durch monoklonale NLDC-145 erkannt wird. Sofort nach dem Puls mit BCG oder nach 2 weiteren Tagen einer Chase-Kultur wurden die Zellen mit Biotin B21-2 und FITC-Streptavidin [Tago, Burlingame, CA] angefärbt. Dann wurden Klasse-II-reiche Zellen sortiert [FACStar Plus, Becton Dickinson, Mountainview, CA] und durch Cytospinning auf Objektträger [Shandon Inst., Sewicky, PA] aufgebracht. Die sortierten Zellen wurden mit Diff Quick^® angefärbt, das die Konturen der sternartigen Form von dendritischen Zellen in Cytospin sichtbar macht und es erlaubt, Profile zu zählen, die perinukleäre Ablagerungen von internalisiertem kolloidalem Kohlenstoff oder Latexkügelchen enthalten. Um BCG sichtbar zu machen, wurden die Cytospins 10 min lang bei Raumtemperatur in absolutem Aceton fixiert und mit M5/114-Anti-Klasse-II, NLDC145-Anti-dendritische-Zelle oder RA3-6B2-Anti-B220 oder Anti-B-Zelle [letzteres als Kontrolle] und anschließend POX-konjugiertem Maus-Anti-Ratten-Ig [Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN] und Diaminobenzidin-Tetra-HCl [Polyscience Inc., Warrington, PA] angefärbt. Die Präparate wurden dann mit Auramin-Rhodamin doppelt für säurefeste Bacillen markiert. Praktisch alle Zellen in dem Präparat waren reich an NLDC-145 und MHC-Klasse-II-Produkten. Die Anzahl der BCG-Bacillen in wenigstens 400 Zellen wurde bestimmt.
E. Elektronenmikroskopie
Um zu beweisen, dass alle zellassoziierten BCG internalisiert wurden, wurden die in Pulse-Chase-Vorschriften [oben] erzeugten dendritischen Zellen in 2,5%igem Glutaraldehyd fixiert und für EM verarbeitet, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
F. Antigenpräsentation in vitro
Mäuse wurden mit Freund's vollständigem Adjuvans [CFA, Sigma, St. Louis, MO; 25 μl in die vorderen und hinteren Pfoten] oder als Kontrolle Mycobakterien-freiem Freund's unvollständigem Adjuvans [ICFA] vorbereitet. Die entwässernden Lymphknoten wurden 7–14 Tage später zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert und mit mAbs gegen MHC Klasse II, B220 und wärmestabile Antigene [M5/114-Anti-Ia, RA3-6B2-Anti-B220 und J11d-Anti-HSA; TIB 120, 146 bzw. 183 von der ATCC] und Kaninchen-Komplement an APCs abgereichert. 3 × 10⁵ dieser APC-abgereicherten, vorbereiteten T-Zellen wurden in 96-Napf-Flachboden-Mikrotestnäpfen [Corning Nr. 25860] in RPMI-1640 kultiviert, das mit 0,5%igem Mäuseserum und 50 μM 2-Mercaptoethanol versetzt wurde. Abgestufte Dosen von BCG-gepulsten APCs aus Knochenmark oder Milz wurden hinzugefügt. 1 μCi ³N-Thymidin [NEN, Boston, MA; 20 Ci/mmol; 4 μCi/ml] zur Aufnahme wurden hinzugefügt, um die DNA-Synthese nach 72–88 h zu überwachen. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte von drei Parallelansätzen, wobei die Standardabweichungen < 15% des Mittelwerts waren.
G. Antigenpräsentation in vivo
APCs, die in vitro mit Antigen gepulst worden waren, wurden in vivo an unvorbereitete CxD2-F1-Mäuse verabreicht. Um T-Zellen im entwässernden Lymphknoten vorzubereiten, wurden 2 × 10⁵ dendritische Zellen in die Pfoten injiziert, und die Lymphknotenzellen wurden 5 Tage später präpariert. Um T-Zellen in der Milz vorzubereiten, wurden 10⁶ Zellen intravenös injiziert, und 5 oder 10 Tage später wurden Splenocyten präpariert. Um die Vorbereitung der T-Zellen zu messen, wurden Bulk-Lymphknoten- oder Milzzellen wie oben kultiviert und mit angestuften Dosen von Proteinantigenen gereizt, entweder mit gereinigtem Proteinderivat [PPD, vom Statenserum Institute, Kopenhagen, Dänemark, oder von Dr. Ichiro Toida, Research Institute for BCG in Japan, Kiyose, Tokyo] oder mit Rinderserumalbumin [Sigma], und ³H-Thymidin wurde nach 72–88 h gemessen. Um die proliferierenden Zellen zu charakterisieren, wurden die Populationen vor der Messung der ³H-Thymidin-Aufnahme mit Antikörpern und Komplement behandelt.
H. Phagocytose von Latexteilchen innerhalb von Haufen von sich entwickelnden dendritischen Zellen
Puls- und Pulse-Chase-Vorschriften. Wenn Mäuseknochenmark oder -blut mit GM-CSF stimuliert wird, erscheinen proliferierende Zellaggregate, und diese führen zu großen Anzahlen von typischen immunostimulatorischen dendritischen Zellen. In Knochenmark, das für die unten beschriebenen Experimente verwendet wurde, werden die proliferierenden Aggregate am besten identifiziert, indem man den größten Teil der nichtadhärenten Granulocyten, die in den Kulturen ebenfalls durch GM-CSF induziert werden, wegwäscht. An den Tagen 5 bis 6, dem Zeitpunkt, als die Größe der Aggregate zum ersten Mal messbar war [5–10 Zellen breit], wendeten wir über einen Zeitraum von 20–22 h verschiedene Teilchen an.
Nach der Verabreichung von 2-μm-Latexkügelchen wurde in verstreuten Makrophagen auf der Monoschicht eine starke Markierung festgestellt. Außerdem trat innerhalb der Aggregate sich entwickelnder dendritischer Zellen etwas klare Markierung auf [12A]. Aggregate, die Teilchen ausgesetzt worden waren, wurden weitere 2 Tage lang erneut kultiviert. Während dieser Zeit wurden große Zahlen von Zellen in die Suspension freigesetzt. Diese waren in erster Linie reife dendritische Zellen mit charakteristischen sternartigen Formen und großen Mengen an MHC-Klasse-II- und NLDC-145-Antigenen. Als die freigesetzten Zellen durch Lichtmikroskopie untersucht wurden, enthielten viele davon Latexkügelchen, häufig um eine klare perinukleäre Zone oder Centrosphäre herum [12B]. Wir untersuchten in ähnlicher Weise auch die Aufnahme von kolloidalem Kohlenstoff. Wenn Aggregate mit kolloiden und reifen dendritischen Zellen gepulst wurden, die man während einer Chase-Phase sich bilden ließ, hatten einige der freigesetzten Zellen eine Centrosphäre mit kleinen, aber klar abgegrenzten Kohlenstoffablagerungen [12C]. Wenn Latex oder Kohlenstoff dagegen reifen dendritischen Zellen angeboten wurde, trat nur wenig Aufnahme auf [12D].
I. Aufnahme von BCG-Mycobakterien durch sich entwickelnde dendritische Zellen – Säurefestfärbungen
Lebende BCG-Mycobakterien wurden über einen Zeitraum von 20–22 h als phagocytisches Mahl verabreicht, wobei man die oben beschriebene Vorschrift für die Verabreichung von Latexteilchen verwendete. Zellassoziierte Bacillen wurden durch eine empfindliche fluoreszente Säurefestfärbung sichtbar gemacht. Nach dem 20-h-Puls enthielten die sich entwickelnden dendritischen Zellaggregate viele Organismen. Um die reiferen dendritischen Zellen aus den Kulturen zu isolieren, wurde die Zellen resuspendiert, und die Zellen mit hohen Niveaus von MHC-Klasse-II-Produkten wurden aussortiert. Unmittelbar nach dem BCG-Puls enthielten etwa 20% der aussortierten Zellen säurefeste Bacillen [Tabelle 1]. Der größte Teil der MHC-Klasse-II-schwachen Zellen wurde wegen übermäßiger Klebrigkeit während der Zellsortierung nicht weiter untersucht.
Dann wurden begleitende Zellkulturen nach 2 Tagen Chase-Kultur untersucht. Da während der Chase-Phase viele reife dendritische Zellen gebildet wurden, war die Zahl der Ia-reichen Nachkommen auf das Vierfache gewachsen [Tabelle 1].
Tabelle 1 Häufigkeit von dendritischen Zellen mit phagozytierten BCG-Organismen in GM-CSF-stimulierten Mäuseknochenmarkkulturen
Quantitative Daten für dendritische Zellen, die BCG enthalten. Mäuseknochenmarkkulturen wurden in 16-mm-Näpfen 5 Tage lang mit GM-CSF stimuliert, gewaschen und 20 h lang BCG-Organismen ausgesetzt. Die Kulturen wurden wieder gewaschen und entweder sofort untersucht oder vereinigt und in eine 60-mm-Schale übergeführt, um weitere 2 Tage Chase-Kultur durchzuführen. Die dendritischen Zellen in den Kulturen wurden unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers als Ia-reiche Zellen ausgewählt und dann durch Cytospinning auf Objektträger aufgebracht, um säurefeste Bacillen anzufärben. Während der Chase-Phase nahm der Prozentsatz an Ia-reichen Zellen in den Kulturen auf das 2–2,5fache zu, und die Gesamtzahl der Zellen nahm auf das 2fache zu, was zu einer 4–5fachen Zunahme der Zahl der Ia-reichen Zellen führte.
Der Prozentsatz an dendritischen Zellen, die BCG enthalten, stieg ebenfalls auf 50% [Tabelle 1, 13]. Experimente mit doppelter Markierung bestätigten, dass Zellen mit säurefesten Bacillen MHC Klasse II und das auf dendritische Zellen beschränkte NLDC-145-Antigen exprimierten, 13. Da die Gesamtzahl von MHC-Klasse-II- und NLDC-145-positiven Zellen in nur 2 Tagen auf das 4fache gestiegen war, ist es wahrscheinlich, dass diese BCG-beladenen dendritischen Zellen von weniger reifen, aber phagozytischen Vorläufern in den Aggregaten abstammten.
J. Elektronenmikroskopie von BCG-gepulsten APCs
Die perinukleäre Lokalisierung der zellassoziierten Teilchen durch Lichtmikroskopie wies darauf hin, dass Organismen internalisiert wurden. Dies wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt. Etwa 50% der Profile dendritischer Zellen enthielten internalisiertes BCG, obwohl die Zahl der Organismen pro Profil gering war, gewöhnlich einer, aber nur bis zu vier, 14A, B. Jeder Organismus schien seine eigene Vakuole zu besetzen. Es schien, dass sich eine phagosomale Membran stark an die meisten Bacillen annäherte, 14C, D.
K. In-vitro-Präsentation von mycobakteriellen Antigenen gegenüber vorbereiteten T-Zellen
Um die Präsentationsfunktion dendritischer Zellen zu testen, die mit BCG-Organismen gepulst oder einem Pulse-Chase-Experiment mit diesen ausgesetzt wurden, stellten wir zuerst auf Antigen ansprechende T-Zellen aus den entwässernden Lymphknoten von Mäusen her, in die CFA [Freunds vollständiges Adjuvans, das durch Wärme abgetötete Mycobakterien enthält] oder Freunds unvollständiges Adjuvans [IFA als Kontrolle; siehe "Verfahren"] injiziert worden war. Als dendritische Zellen zu IFA-vorbereiteten T-Zellen gegeben wurden, wurde eine syngenische gemischte Leukocytenreaktion beobachtet. Dies war vergleichbar, ob die APCs nun BCG ausgesetzt worden waren oder nicht [15, rechts]. Wenn dendritische Zellen jedoch mit BCG gepulst und zu CFA-vorbereiteten T-Zellen gegeben worden waren, wurden starke proliferative Reaktionen induziert [15, links]. Wenn dendritische Zellen unmittelbar nach dem eintägigen Puls oder nach einer zusätzlichen zweitägigen Chase-Phase getestet wurden, war die einer Chase-Phase unterzogene Population viel potenter [15, links; vergleiche
und
]. Nur 100 einem Pulse-Chase-Experiment mit BCG unterzogene dendriti sche Zellen riefen in vitro messbare T-Zell-Reaktionen hervor [15, links;
]. Die einem Pulse-Chase-Experiment mit BCG unterzogenen Populationen waren auch 5–10mal potenter in Bezug auf die Induktion eines Ansprechverhaltens gegenüber mycobakteriellem Antigen als reife dendritische Zellen, die frisch entweder PPD oder BCG ausgesetzt worden waren [15, links; vergleiche
mit
,
]. Daher schien es, dass das Ausmaß der Phagocytose mit der Wirksamkeit der Präsentation korrelierte, da die dem Pulse-Chase-Experiment unterzogenen Populationen die aktivsten APCs waren und am meisten intrazelluläres BCG enthielten [Tabelle 1].
L. Präsentation von mycobakteriellen Antigenen gegenüber unsensibilisierten Mäusen in vivo
Vergleichbare Populationen von BCG-gepulsten sowie BCG-gepulsten und einer Chase-Phase unterzogenen APCs wurden auf ihre Fähigkeit getestet, mycobakterielle Antigene gegenüber unvorbereiteten Mäusen zu präsentieren. Nach der Injektion in die Fußballen wurde ein starkes Ansprechverhalten gegenüber PPD beobachtet [16]. Wiederum waren die dendritischen Zellen am potentesten, wenn die nach einer zweitägigen Chase-Phase getestet wurden [16; vergleiche
und
], und diese Chase-Phase erhöhte stark die Gesamtausbeute an dendritischen Zellen.
Um zu testen, ob die erhöhte antigenpräsentierende Funktion von einem Pulse-Chase-Experiment mit BCG unterzogenen dendritischen Zellen mit der erhöhten Anzahl von BCG tragenden APCs zusammenhing, wurden die vorbereiteten Populationen auch auf ihr Reaktionsverhalten gegenüber Rinderserumalbumin [BSA] getestet, da die dendritischen Zellen in Gegenwart von fetalem Kälberserum gezüchtet worden waren. Alle dendritischen Zellpopulationen bereiteten unabhängig von den Einzelheiten der Einwirkung von BCG Mäuse ähnlich vor wie BSA [16, ausgefüllte Symbole]. Dies weist darauf hin, dass jede Population in Bezug auf die Immunisierung gegen ein lösliches Protein vergleichbar effizient war, während die dendritischen Zellen, die BCG phagozytiert hatten, effektiver bei der Verursachung von Reaktionen auf mycobakterielle Antigene waren.
Die Oberflächenmarker der vorbereiteten Zellen wurden durch Antikörper- und Komplement-vermittelte Lyse der Populationen getestet, bevor die Aufnahme von 3H-Thymidin gemessen wurde [Daten nicht gezeigt]. Die proliferierenden Zellen reagierten positiv auf Thy-1, aber negativ auf MHC Klasse II, hitzestabiles Antigen und B220. Der Kulturüberstand von Anti-CD4-Hybridomen blockierte die Proliferation stärker als 85%, d. h. die vorbereiteten Zellen waren T-Zellen des Helfertyps.
Eine Vorbereitung wurde auch beobachtet, wenn Milz-T-Zellen nach einer intravenösen Infusion von BCG-gepulsten und einem BCG-Pulse-Chase-Experiment unterzogenen dendritischen Zellen getestet wurden [17]. Die Zellen waren nach 5 Tagen reaktiver als nach 10 Tagen nach der Injektion [vergleiche die 17A und C]. Wiederum waren dendritische Zellen, die nach Einwirkung von BCG 2 Tage lang kultiviert [einer "Chasing"-Phase unterzogen] worden waren, am potentesten [12; vergleiche
] mit
; aber alle Populationen bereiteten die Milzzellen ähnlich vor wie BSA [17B]. Wir schließen daraus, dass Vorläufer dendritischer Zellen mycobakterielle Antigene in einer Weise einfangen und zurückhalten, die in vivo hochgradig immunogen ist.
Beispiel 4 Antigenaktivierte dendritische Zellen als Immunogene
Dendritische Zellen, die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, werden in einer Konzentration von ungefähr 1 × 10⁵ Zellen pro Napf einer 24-Napf-Kunststoffkulturplatte ausgestrichen. Die Zellen werden in RPMI 1640 inkubiert, das 5% fetales Kälberserum und GM-CSF (30 E/ml) enthält.
Antigen wird zu den Kulturen dendritischer Zellen gegeben, und die Kulturen werden ungefähr 4 Stunden lang mit Antigen inkubiert, oder während einer ausreichenden Zeit, dass die dendritischen Zellen das Antigen in einer immunologisch relevanten Form oder in einer Form, die von T-Zellen erkannt werden kann, handhaben können. Diese Handhabung des Antigens durch die dendritischen Zellen beinhaltet, dass die dendritischen Zellen das Antigen 1) erwerben, 2) verarbeiten und 3) gegenüber den T-Zellen in einer Form präsentieren, die von den T-Zellen erkannt wird. Nach der Bindung des Antigens an die dendritischen Zellen werden die Zellen aus der Kultur gewonnen und verwendet, um syngenische Mäuse zu immunisieren. Die aktivierten dendritischen Zellen werden in einer ausreichenden Menge, um eine Immunantwort auf das Antigen zu induzieren, subkutan in die Mäuse injiziert.
Beispiel 5
Dendritische Zellen, die so hergestellt werden, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, werden während einer ausreichenden Zeit mit einem Proteinantigen gepulst, um es den dendritischen Zellen zu erlauben, das modifizierte Antigen auf der Oberfläche der dendritischen Zellen zu erwerben, zu verarbeiten und zu präsentieren. Dann werden die dendritischen Zellen zur Extraktion des modifizierten Antigens aus der Kultur gewonnen.
Zur Extraktion des modifizierten Antigens werden die dendritischen Zellen mit Detergens löslich gemacht, um das an MHC-Moleküle gebundene modifizierte Antigen zu extrahieren. Die an modifiziertes Antigen gebundenen MHC-Moleküle werden durch Ausfällung mit Antikörpern, die die MHC-Moleküle binden, wie MH2, gereinigt. Die modifizierten Antigene werden zur Analyse aus dem Niederschlag extrahiert.
Beispiel 6 Herstellung von dendritischen Zellen aus Humanblut
A. Patienten
Siebzehn Experimente wurden durchgeführt mit Blut von humanen Patienten, die sich einer Konsolidierungs-Chemotherapie unterzogen (15 mit Leukämie/Lymphomen in voller Remission, 2 mit festen Tumoren), und anschließend wurde mit G-CSF behandelt. Drei Experimente wurden mit Blut von Patienten nach der Chemotherapie (1 (akute myeloische) Leukämie, 2 feste Tumoren) und GM-CSF-Behandlung durchgeführt. Die Ergebnisse von drei Experimenten, zwei aus der mit G-CSF behandelten Gruppe von Patienten, A und B, und eines aus der mit GM-CSF behandelten Gruppe von Patienten, C, sind dargestellt.
B. Prinzip
Ergebnisse von Verfahren, die in Beispiel 1, das sich auf Mäuseblut bezieht, und in Beispiel 2, das sich auf Knochenmark bezieht, beschrieben sind (J. Exp. Med. 175: 1157–1167, 1992, und J. Exp. Med. 176: 1693–1702, 1992) identifizierten mehrere Merkmale des Wachstums und der Entwicklung von dendritischen Zellen: (a) Vorläufer dendritischer Zellen exprimieren nicht die MHC-Klasse-II-Antigene, die für reife immunostimulatorische Nachkommen und für viele andere Zelltypen (B-Zellen, Monocyten) typisch sind; (b) Vorläufer dendritischer Zellen erfordern zur Proliferation und zur Reifung GM-CSF und vielleicht noch andere Cytokine, die von den Zellen in Kultur oder als Zusätze bereitgestellt werden können; (c) entscheidende Schritte im Wachstum und in der Entwicklung von dendritischen Zellen finden in unterscheidbaren Aggregaten statt, die locker an den Oberflächen von Standardgewebekulturen haften; (d) durch Überwachung des Auftretens dieser Aggregate kann man die zahlreichen Variablen bewerten, die sich auf die Erzeugung von dendritischen Zellen beziehen, eines nur in Spuren vorhandenen, aber spezialisierten Typs von antigenpräsentierender Zelle, der in potenter Weise eine Induktion der T-Zell-Immunität und Toleranz in situ bewirkt (Ann. Rev. Immunol. 9: 271–296, 1991).
C. Vorschrift

1. Mononukleäre Blutzellen wurden durch Sedimentation in Medien mit Standarddichte, hier Lymphoprep (Nycomed, Oslo), isoliert.
2. Die isolierten mononukleären Zellen wurden an Zellen abgereichert, die keine Vorläufer dendritischer Zellen waren. Diese Kontaminanten wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 und HLA-DR-Antigene beschichtet und auf Petri-Schalen, die mit affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Maus-IgG beschichtet waren, abgereichert ("Panning").
3. 10⁶ Zellen in 1 ml Kulturmedium wurden in Kunststoffkulturnäpfen von 16 mm Durchmesser (Costar, Rochester, NY) ausgestrichen. Das Medium war RPMI-1640, das mit 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin, 5% Serum aus Nabelschnurblut (ohne Hitzeinaktivierung) oder 5% fetalem Kälberserum (mit Inaktivierung) und 400 E/ml humanem rekombinantem GM-CSF versetzt wurde. Danach wurden die Kulturen jeden zweiten Tag und insgesamt 16 Tage lang gefüttert, indem man 0,3 ml des Mediums entfernte und durch 0,5 ml frisches, mit den Cytokinen versetztes Medium ersetzte. Zellen wurden unter den folgenden Bedingungen kultiviert: 1) ohne die Anwesenheit zusätzlicher Cytokine; 2) GM-CSF, 400 oder 800 E/ml; 3) GM-CSF, 400 oder 800 E/ml, plus IL-1α, 50 LAF-Einheiten/ml während der letzten 24 h der Kultur; 4) GM-CSF, 400 oder 800 E/ml, plus TNFα, 50 E/ml; 5) GM-CSF, 400 oder 800 E/ml, plus TNFα, 50 E/ml, plus IL-1α, 50 LAF-Einheiten/ml während der letzten 24 h der Kultur; 6) GM-CSF, 400 oder 800 E/ml, plus IL-3, 100 E/ml; 7) GM-CSF, 400 oder 800 E/ml, plus IL-3, 100 E/ml, plus IL-1α, 50 LAF-Einheiten/ml während der letzten 24 h. In Experiment C wurden auch nichtdendritische Zellen getestet, die in dichtem Metrizamid versanken.
4. Charakteristische Aggregate proliferierender dendritischer Zellen (im folgenden "Kugeln" genannt) erschienen bis zum 5. Tag, wie man aus einer Untersuchung mit einem Umkehrphasenkontrastmikroskop ersieht. Diese Kugeln expandierten größenmäßig im Verlauf von einer Woche (Tag 5–11). Einige Kugeln erschienen in den ursprünglichen Näpfen (Schritte 3 und 4), aber typischerweise vergrößerten sich diese nicht in demselben Ausmaß wie bei den nichtadhärenten Näpfen (Schritt 4). Wenn die Zelldichte zunimmt, müssen die Näpfe subkultiviert werden, z. B. wird 1 Napf in 2–3 Näpfe aufgespalten.
5. Zwei alternative Ansätze wurden verwendet, um die reifen dendritischen Zellen aus den wachsenden Kulturen zu isolieren. Ein Verfahren bestand darin, Zellen, die nichtadhärent waren, zu entfernen und die Kugeln durch 1-g-Sedimentation von Nichtkugeln zu trennen. Dann wurden dendritische Zellen über weitere 1–2 Tage der Kultur in großen Zahlen aus den Kugeln freigesetzt, und reife dendritische Zellen wurden durch Flotation auf dichtem Metrizamid aus den Nichtkugeln isoliert, wie es beschrieben ist (Freudenthal und Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7698–7702, 1990). Das zweite Verfahren ist einfacher, beendet jedoch die Wachstumsphase des Verfahrens im Wesentlichen. Gemäß dem zweiten Verfahren wurden die nichtadhärenten Zellen geerntet, wenn die Kugeln sehr groß waren. Die Zellen wurden 20 Minuten lang auf Eis gelassen, mit einer Pipette kräftig resuspendiert, um die Kugeln zu disaggregieren, und die reifen dendritischen Zellen wurden auf Metrizamid-Säulen schwimmen gelassen.
6. Um die immunostimulatorische Aktivität der Nachkommenschaft der dendritischen Zellen zu demonstrieren, wurden abgestufte Dosen bestrahlter Zellen (30 bis 30 000 in seriellen dreifachen Verdünnungen) zu an akzessorischen Zellen abgereicherten T-Zellen gegeben (200 000 für den gemischten Leukocytenreaktionsassay, MLR; 150 000 für den oxidativen Mitogeneseassay, OXMI). Die T-Zell-Reaktion wurde mit einem 16-h-Puls von ³H-Thymidin am fünften (MLR) oder zweiten Tag (OXMI) gemessen. T-Zell-Stimulationsexperimente (oxidative Mitogenese und gemischte Leukocytenreaktion) wurden in Gegenwart von 1 Mikrogramm/ml Indomethacin durchgeführt. Daten von drei MLR-Experimenten sind in den 18A, B und C dargestellt.

D. Ergebnisse

1. GM-CSF ist ein essentielles Cytokin. G-CSF, M-CSF, IL-3 oder kein Cytokin erlauben nicht die Entwicklung von Kugeln aus dendritischen Zellen. GM-CSF in einer Menge von 400–800 E/ml ist optimal, unabhängig davon, ob die Spender entweder mit GM-CSF oder mit G-CSF behandelt wurden, um die Zahl der myeloiden Vorläuferzellen im Blut zu vergrößern. Die Zugabe von TNFα in 10–50 E/ml erhöhte gewöhnlich, aber nicht immer die Ausbeuten der dendritischen Zellen bis auf das Zweifache (vgl. Caux et al., Tumor necrosis factor alpha strongly potentiates interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced proliferation of human hematopoietic CD34+ progenitor cells, Blood 2292–2298, 1990). Wie man aus den in den 18A, B und C beschriebenen repräsentativen Experimenten erkennt, verbessert der Zusatz von TNFα auch wesentlich die Funktion der Nachkommenschaft der dendritischen Zellen. rhu IL-1α (50 LAF-Einheiten/ml) beweist in einigen Experimenten eine weitere Zunahme der Funktion, wenn es während der letzten 24 h der Kultur hinzugefügt wird. Experimente mit Gewebe von Patienten mit festen Tumoren oder Leukämien/Lymphomen ergaben vergleichbare Ergebnisse in Bezug auf die Erzeugung dendritischer Zellen.
2. Ausgehend von 60 ml Blut und nach der Kultivierung in Gegenwart nur von GM-CSF betrug die Ausbeute an typischen reifen immunostimulatorischen dendritischen Zellen 6–12 × 10⁶ Zellen, was 40–80% der Gesamtzellen darstellt. Diese Ausbeute ist wenigstens 20mal größer als die Ausbeute an reifen dendritischen Zellen in 60 ml frischem Blut, die höchstens 5% (3–6 × 10⁵) davon betragen würde (Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 7698–7702, 1990).
3. Der Phänotyp der durch dieses Verfahren erzeugten dendritischen Zellen beinhaltete die Tatsache, dass die Zellen stark positiv auf HLA-DR, MHC-Klasse-II-Produkte, aber negativ auf CD1a, CD14 und B-Zell-Marker reagierten.
4. Die Entwicklung von Granulocyten in den Kulturen reduziert die Reinheit der dendritischen Zellen. Typischerweise sind diese Granulocytenkugeln stärker adhärent und werden beim Überführungsschritt am zweiten Tag der Vorschrift zurückgelassen. Wenn diese adhärenten Granulocytenkolonien wiederauftreten, können die wachsenden dendritischen Zellen einfach in einen anderen Napf übergeführt werden.

Beispiel 7
Weitere Quellen für Vorläufer dendritischer Zellen wurden nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren getestet:

a) Bei zwei Patienten wurde auch eine kleine Probe von Knochenmark bereitgestellt. Wenn das obige Verfahren angewendet wurde, wurden die Bälle aus dendritischen Zellen und reifen immunostimulatorischen dendritischen Zellen in großen Zahlen gebildet.
b) Blut von 7 normalen Spendern wurde unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren bewertet. Die Zahl der Kugeln erwies sich als viel geringer (10–20/Napf aus 2 × 10⁶ Zellen), aber die Verwendung von normalem Blut ist offensichtlich einfacher und hat den Vorteil, dass sich keine Granulocytenkolonien bilden, wie bereits bei Vergleich von Mäuseblut und Knochenmark angemerkt wurde (Kommentar 5), J. Exp. Med. 175: 1157–1167, 1992, vs. J. Exp. Med. 176: 1693–1702, 1992).
c) Fetales oder Nabelschnurblut wurde ebenfalls getestet, da es ebenfalls mehr Vorläuferzellen enthält als Blut von Erwachsenen. Da die Zahl der CD34-positiven Vorläufer immer noch sehr gering ist (etwa 1%), testeten wir das obige einfachere Verfahren, bei dem am Anfang keine CD34-positiven Zellen gereinigt werden. DC-Kugeln werden leicht induziert, außer dass rote Blutkörperchen, die toxisch sind, durch Zugabe des monoklonalen Anti-Erythroid-Antikörpers VIE-G4 (zur Verfügung gestellt von Dr. W. Knapp, Wien) zu dem Panning-Schritt (Schritt 2) und Verwendung einer zusätzlichen Flotation auf Lymphoprep (Schritt 1) nach dem Panning abgereichert wurden. Die Ausbeuten an dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut sind ungefähr mit denjenigen vergleichbar, die bei dem Verfahren beschrieben wurden (1–5 × 10⁶ dendritische Zellen, die 20–40% der Gesamtzellen aus 40 ml Nabelschnurblut ohne einen Metrizamid-Flotationsschritt darstellen). Die Kugeln sind stärker adhärent, und die dendritischen Zellen exprimieren CD1a, im Gegensatz zu Blut von Erwachsenen.

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Claims

Verfahren zur Herstellung einer Population von Vorläufern dendritischer Zellen, umfassend: a) Bereitstellen einer Gewebequelle, die Vorläufer dendritischer Zellen umfasst; b) Behandeln der Gewebequelle zur Erhöhung des Anteils an Vorläufern dendritischer Zellen, so dass man eine Population von Zellen erhält, die zur Kultur in vitro geeignet sind; c) Kultivieren der Gewebequelle auf einem Substrat in einem Kulturmedium, das GM-CSF umfasst, so dass man nichtadhärente Zellen und Zellhaufen erhält; d) Subkultivieren der nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen unter Bildung von Zellaggregaten, die proliferierende Vorläufer dendritischer Zellen umfassen; e) ein- oder mehrmaliges serielles Subkultivieren der Zellaggregate, so dass der Anteil der Vorläufer dendritischer Zellen angereichert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Gewebequelle um Blut oder Knochenmark handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 1–1000 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, das weiterhin folgendes umfasst: wenn es sich bei der Gewebequelle um Knochenmark handelt, umfasst der Behandlungsschritt (b) das Abtöten von Zellen, die Antigene exprimieren, welche nicht auf Vorläufern dendritischer Zellen exprimiert werden, durch In-Kontakt-Bringen des Knochenmarks mit Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, die auf Vorläufern dendritischer Zellen nicht vorhanden sind, in einem Medium, das Komplement umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Gewebequelle um Knochenmark handelt und die Antikörper gegen wenigstens ein Antigen gerichtet sind, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ia-Antigen, auf T-Zellen vorhandenen Antigenen und auf reifen dendritischen Zellen vorhandenen Antigenen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Knochenmark mit rGM-CSF in einer Konzentration von etwa 500–1000 E/ml kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei Ia-negative Mark-Nichtlymphocyten in einer Konzentration von etwa 5 × 10⁵ Zellen/cm² kultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Anti-Ia-Antigen-Antikörper und die Anti-T-Zell-, Anti-B-Zell- und Anti-Monocyten-Antikörper aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus GK 1.5 Anti-CD4, Ho 2.2 Anti-CD8, B21-2 Anti-Ia und RA3-3A1/6.1 Anti-B220/CD45R besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zellaggregate von Schritt (e) ein- bis fünfmal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Zellaggregate zwei- bis dreimal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Zellaggregate zweimal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen von Schritt (c) nach etwa 0,3 bis 1 Tag subkultiviert werden und die Zellaggregate alle 3 bis 30 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Zellaggregate alle 10 bis 20 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Zellaggregate alle 20 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Gewebequelle um Blut oder Knochenmark handelt, die nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen von Schritt (c) nach etwa 0,3 bis 1 Tag subkultiviert werden, die Zellaggregate ein- bis fünfmal alle 3 bis 30 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen von Schritt (c) nach etwa einem halben Tag subkultiviert werden und die Zellaggregate nach 20 Tagen zweimal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Kulturmedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus RPMI 1640, DMEM und α-MEM besteht, und wobei das Kulturmedium mit Serum ergänzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei fetales Kälberserum in dem Kulturmedium in einer Menge von etwa 1 bis 15% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das fetale Kälberserum in dem Kulturmedium in einer Menge von etwa 10% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei der Gewebequelle um Blut handelt und die Konzentration an GM-CSF in dem Medium etwa 30–100 E/ml beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei der Gewebequelle um Knochenmark handelt und die Konzentration an GM-CSF in dem Medium etwa 500–1000 E/ml beträgt.
Verfahren zur Herstellung einer Population von reifen dendritischen Zellen aus proliferierenden Zellkulturen, umfassend: a) Bereitstellen einer Gewebequelle, die Vorläufer dendritischer Zellen umfasst; b) Behandeln der Gewebequelle aus a) zur Erhöhung des Anteils an Vorläufern dendritischer Zellen, so dass man eine Population von Zellen erhält, die zur Kultur in vitro geeignet sind; c) Kultivieren der Gewebequelle auf einem Substrat in einem Kulturmedium, das GM-CSF umfasst, so dass man nichtadhärente Zellen und Zellhaufen erhält; d) Subkultivieren der nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen unter Bildung von Zellaggregaten, die proliferierende Vorläufer dendritischer Zellen umfassen; e) ein- oder mehrmaliges serielles Subkultivieren der Zellaggregate, so dass der Anteil der Vorläufer dendritischer Zellen angereichert wird; und f) Weiterkultivieren der Vorläufer dendritischer Zellen während einer ausreichenden Zeit, so dass sie zu reifen dendritischen Zellen reifen können.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei es sich bei der Gewebequelle um Blut oder Knochenmark handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 1–1000 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, das weiterhin folgendes umfasst: wenn es sich bei der Gewebequelle um Knochenmark handelt, umfasst der Vorbehandlungsschritt das Abtöten von Zellen, die Antigene exprimieren, welche nicht auf Vorläufern dendritischer Zellen exprimiert werden, durch In-Kontakt-Bringen des Knochenmarks mit Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, die auf Vorläufern dendritischer Zellen nicht vorhanden sind, in einem Medium, das Komplement umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei es sich bei der Gewebequelle um Knochenmark handelt und die Antikörper gegen wenigstens ein Antigen gerichtet sind, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ia-Antigen, auf T-Zellen vorhandenen Antigenen und auf reifen dendritischen Zellen vorhandenen Antigenen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Knochenmark mit rGM-CSF in einer Konzentration von etwa 500–1000 E/ml kultiviert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei Ia-negative Mark-Nichtlymphocyten in einer Konzentration von etwa 5 × 10⁵ Zellen/cm² kultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die Anti-Ia-Antigen-Antikörper und die Anti-T-Zell-, Anti-B-Zell- und Anti-Monocyten-Antikörper aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus GK 1.5 Anti-CD4, Ho 2.2 Anti-CD8, B21-2 Anti-Ia und RA3-3A1/6.1 Anti-B220/CD45R besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Zellaggregate von Schritt (e) ein- bis fünfmal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Zellaggregate zwei- bis dreimal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Zellaggregate zweimal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen von Schritt (c) nach etwa 0,3 bis 1 Tag subkultiviert werden und die Zellaggregate alle 3 bis 30 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die Zellaggregate alle 10 bis 20 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Zellaggregate alle 20 Tage seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die Zellaggregate ein- bis fünfmal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die nichtadhärenten Zellen und Zellhaufen von Schritt (c) nach etwa einem halben Tag subkultiviert werden und die Zellaggregate nach 20 Tagen zweimal seriell subkultiviert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das Kulturmedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus RPMI 1640, DMEM und α-MEM besteht, und wobei das Kulturmedium mit Serum ergänzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei fetales Kälberserum in dem Kulturmedium in einer Menge von etwa 1 bis 15% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei das fetale Kälberserum in dem Kulturmedium in einer Menge von etwa 10% vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei es sich bei der Gewebequelle um Blut handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 30–100 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei es sich bei der Gewebequelle um Knochenmark handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 500–1000 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei der Gewebequelle um humanes Blut handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 400 bis 800 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei in dem Kulturmedium wenigstens ein Faktor vorhanden ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TNF-α, G-CSF, IL-1 und IL-3 besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei der Gewebequelle um humanes Blut handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 400 bis 800 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei in dem Kulturmedium wenigstens ein Faktor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TNF-α, G-CSF, IL-1 und IL-3 besteht, zusammen mit GM-CSF vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei der Gewebequelle um humanes Blut handelt und GM-CSF in dem Medium in einer Konzentration von etwa 400 bis 800 E/ml vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei in dem Kulturmedium wenigstens ein Faktor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TNF-α, G-CSF, IL-1 und IL-3 besteht, zusammen mit GM-CSF vorhanden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Gewebequelle von einem Individuum erhalten wird, das vor der Entnahme der Gewebequelle aus dem Individuum mit einer Substanz vorbehandelt wurde, die die Hämatopoese stimuliert.
Verfahren gemäß Anspruch 47, wobei die hämatopoetische Substanz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GM-CSF und G-CSF besteht.