JP2005524412A - 抗原提示細胞のための品質アッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の調製物の品質を評価するための方法を提供する。Ｔ細胞の抗原非依存性同時刺激についてのアッセイ、およびＡＰＣによる所定の抗原の提示についてのアッセイを提供する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の抗原非依存性の同時刺激活性を決定するための方法が提供される。この方法は、既知の機能的活性を有しかつ同時刺激活性を実質的には有さないＴ細胞を提供する工程；未知の同時刺激活性を有するＡＰＣのサンプルを提供する工程；Ｔ細胞を最適状態に及ばない濃度の抗原模倣物質と接触させる工程；Ｔ細胞を未知の同時刺激活性を有するＡＰＣのサンプルと接触させる工程；抗原模倣物質および該ＡＰＣのサンプルと接触されたＴ細胞の活性化を決定する工程；ならびにＡＰＣの同時刺激活性を決定するために、Ｔ細胞の決定された活性化をＴ細胞についての標準的な活性化指標と比較する工程、を包含する。

Description

（発明の背景）
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、効果的な免疫応答を誘発するために重要である。ＡＰＣは、抗原特異的レセプターを有するＴ細胞に対して抗原を提示するだけでなく、Ｔ細胞活性化のために必要なシグナルを提供する。そのようなシグナルは、種々の細胞表面分子、ならびにサイトカインおよび／または増殖因子の産生を包含する。未処理のＴ細胞または刺激されていないＴ細胞の活性化に必要なシグナルは、予め刺激された記憶Ｔ細胞の再活性化のために必要なシグナルとは異なると考えられる。
ＡＰＣとしては、単球、Ｂ細胞および樹状細胞が挙げられる。単球およびＢ細胞は、有能なＡＰＣであると示されているが、それらの抗原提示能力は、予め感作されたＴ細胞の再活性化に限られるようである。これらの細胞型は、機能的に未処理のＴ細胞集団または刺激されていないＴ細胞集団を、直接的に活性化することは不可能である。
一方、樹状細胞は、未処理のＴ細胞および予め刺激されたＴ細胞の両方を活性化することが可能である。樹状細胞は、特有の形態および広範な組織分布（血液を含む）を有する不均質な細胞集団である。（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−９６（１９９１）を参照のこと。）樹状細胞の細胞表面は、独特であり、特徴的なベール状の突起を有する。一般に、成熟樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＣＤ１４−、ＣＤ１１ｃ＋およびＨＬＡ−ＤＲ＋として同定される。
樹状細胞は、抗原を取り込み、プロセスし、そして提示し、そして未処理で刺激されていないＴ細胞および記憶Ｔ細胞からの応答を刺激する。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束化Ｔ細胞を感作することについての高度な能力を有し、そしてＴ細胞への抗原の提示に非常に有効である。樹状細胞は、自己抗原（例えば、Ｔ細胞の発生中および寛容中に）および外来抗原（例えば、免疫応答中に）の両方を提示することが可能である。さらに、樹状細胞はまた、非リンパ組織と直接的に連絡し、損傷シグナル（例えば、虚血、感染、または炎症）または腫瘍増殖に関して非リンパ組織を調査する。一旦シグナルが送られると、樹状細胞は、リンパ球および単球の活性を刺激するサイトカインを放出することによって、免疫応答を惹起する。
抗原提示における樹状細胞の有効性に起因して、インビボおよびエキソビボの両方において、免疫刺激性物質として樹状細胞を使用することにおける関心が増大している。特に、成熟樹状細胞は、標的抗原に対して調製され得、その後、その抗原に対する免疫応答を刺激するために被験体（例えば、患者）に投与され得る。例えば、未成熟の樹状細胞は、標的抗原に対して特異的である活性化成熟樹状細胞を生成するために、標的抗原および成熟物質と接触され得る。さらに、細胞集団における成熟した抗原特異的な樹状細胞は、標的抗原に対して特異的な樹状細胞の数を増加させるために拡大され得る。
樹状細胞および樹状細胞前駆体は、種々の方法によって単離され得る。代表的には、これらの細胞型は、低い頻度で存在する（例えば、代表的には、白血球の約１％未満）。従って、樹状細胞および樹状細胞前駆体を単離する方法は、代表的には、十分な数の細胞を提供するために、単独でのまたはエキソビボ培養物と組合わせての相当な精製を必要とする。樹状細胞および樹状細胞前駆体を精製するための方法としては、例えば、密度勾配分離法、蛍光細胞分析分離法、免疫学的な細胞分離技術（例えば、パニング）、補体溶解法、ロゼット法、磁気的な細胞分離技術、ナイロンウール分離法、およびそのような方法の組合わせが挙げられる。（例えば、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０６７−７６（１９９３）；ＹｏｕｎｇおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３１５−３２（１９９０）；ＦｒｅｕｄｅｎｔｈａｌおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：７６９８−７０２（１９９０）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７：２８５−８９（１９８９）；ＭａｒｋｏｗｉｃｚおよびＥｎｇｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−６１（１９９０）；Ｂｅｒｎｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１０９９−１０４（１９９５）；Ｃａｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８−６１（１９９２）；米国特許第５，９９４，１２６号および同第５，８５１，７５６号を参照のこと。）
樹状細胞を調製するために使用され得る種々の方法に起因して、樹状細胞調製物の特性が変化し得る。例えば、樹状細胞は、抗原に応答して未処理のＴ細胞を活性化する能力が変化し得る。Ｔ細胞の活性化は、２つのシグナルを必要とする。第１のシグナルは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して送達され、そしてＴ細胞の抗原特異性を定義する（「抗原特異的」シグナル）。第２のシグナルまたは同時刺激性シグナルは、Ｔ細胞および樹状細胞上の複数のレセプター／リガンド対（同時刺激性対）によって送達され得る。Ｔ細胞および樹状細胞上で発現されるこれらの同時刺激性対としては、それぞれ：ＣＤ２８／ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）およびＣＤ８０／ＣＤ８６；４−１ＢＢおよび４−１ＢＢＬ；ＣＤ２７およびＣＤ７０；ＬＦＡ−１およびＣＤ５４が、挙げられる。
樹状細胞の調製物は、Ｔ細胞に対して抗原を提示する能力において変化し得る。例えば、調製物は、標的抗原を提示する樹状細胞をわずかに含み得る。さらに、樹状細胞の調製物は、Ｔ細胞に対してごく少量の標的抗原を提示し得る。そのような調製物は、インビボおよびエキソビボの両方における免疫刺激性調製物としての有用性を減少させている。
種々のアッセイが、樹状細胞調製物の品質を評価するために使用されている。例えば、そのようなアッセイとしては、調製物中の樹状細胞（例えば、成熟および／または未成熟）の数または比率の決定、特定の細胞表面マーカーの存在の決定、樹状細胞の標的抗原を提示する能力の決定、Ｔ細胞活性化を刺激する能力の決定などが挙げられる。
ＡＰＣ調製物の品質を決定するための１つの方法は、「免疫表現型決定法（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」であり、この方法は、特定のＡＰＣ特異的マーカー（例えば、「樹状細胞」マーカーＣＤ８３および／またはＣＤ１１ｃ）を提示する細胞の数または比率を決定する。しかし、免疫表現型決定法は、Ｔ細胞活性化に関与する調製物の能力についてのわずかな情報しか提供しない。
混合白血球反応（ＭＬＲ）は、同種異系抗原に対する白血球の反応性を測定するために使用されるアッセイである。同系の白血球（すなわち、同一のＨＬＡマーカーを有する）は、（示す場合でも）ほとんど交差反応性を示さないが、同種異系の白血球（異なるＨＬＡマーカーを有する）は、ＨＬＡマーカー間の相違の程度に依存して、異なる程度の交差反応性を示す。従って、ＭＬＲ反応は、同種異系抗原の交差反応性の測定に対して有用であるが、一般に、樹状細胞調製物の他の名目上の機能を決定するには有用ではない。
従って、樹状細胞調製物の品質を測定する方法に対する必要性が依然として存在し続ける。本発明は、この必要性を満たす以上のものである。
（発明の簡単な要旨）
本発明は、Ｔ細胞刺激においてまたは被験体に投与されるための免疫刺激性組成物の調製においてのいずれかで使用されるための、抗原提示細胞の調製物の品質の評価のための方法を提供する。
１つの実施形態において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の抗原非依存性の同時刺激性活性を決定するための方法が提供される。その方法は、既知の機能的活性を有しかつ同時刺激性活性を実質的には有さないＴ細胞を提供する工程、および未知の同時刺激性活性を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）のサンプルを提供する工程、を包含する。そのＴ細胞は、最適状態に及ばない濃度の抗原模倣物質と接触される。そのＴ細胞はまた、未知の同時刺激活性を有するＡＰＣのサンプルと接触される。その後、抗原模倣物質およびＡＰＣのサンプルと接触されたＴ細胞の活性化が決定され、そしてＴ細胞についての標準的な活性化指標と比較され、ＡＰＣの抗原非依存性の同時刺激性活性が決定される。細胞によって取り込まれ、プロセスされおよび／または提示される所定の抗原の定性的な量または定量的な量もまた、決定され得る。代表的には、抗原の取り込み、プロセシングおよび／または提示は、例えば、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、または抗原特異的Ｔ細胞の活性化によって決定される。
本発明の方法において使用されるＴ細胞は、未知の活性を有する抗原提示細胞と同系または同種異系のいずれかであり得る。代表的には、本発明の方法において使用されるＴ細胞は、末梢血単球細胞から単離される。その方法において使用されるＴ細胞は、細胞表面においてＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ１４、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、および／またはＣＤ８６分子を発現する細胞について枯渇された、末梢血単球細胞サンプル由来のＴ細胞を含む。
本発明の方法において使用される抗原模倣物質は、代表的には、ＣＤ３結合性物質（例えば、ＣＤ３に対して特異的な抗体であるが、これに限定されない）、植物性レクチンまたは非植物起源のマイトジェンである。代表的には、本発明の方法において使用される抗原提示細胞は、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞である。その成熟樹状細胞は、エキソビボで樹状細胞成熟物質と接触された未成熟樹状細胞由来の樹状細胞であり得る。
本発明の方法におけるＴ細胞の活性化は、例えば、増殖中のＴ細胞のＤＮＡ中に取り込まれた放射性標識されたチミジンの量を決定すること、Ｔ細胞サイトカイン（すなわち、ＩＦＮγまたはインターロイキン２）の産生をアッセイすること、またはＴ細胞活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４またはＣＤ１２５であるが、これらに限定されない）の調節をアッセイすること、によって測定され得る。細胞外Ｔ細胞サイトカインまたは細胞内Ｔ細胞サイトカインのいずれかの量が決定され得る。さらに、Ｔ細胞活性化マーカーの調節は、例えば、Ｔ細胞活性化マーカーに対して特異的な標識化抗体を使用することによって決定され得る。
本発明の方法は、抗原提示細胞のＴ細胞活性化を、その方法において使用されるＴ細胞についての標準的な活性化指標と比較することによって、抗原提示細胞の抗原非依存性同時刺激活性を決定する。標準的な活性化指標は、閾値または一定範囲の値（各値は、樹状細胞の所定の品質と関連付けられる）のいずれかとして示され得る。
本発明の別の実施形態において、樹状細胞の調製物の抗原非依存性の同時刺激性活性を決定するための方法が、提供される。その方法は、同時刺激性活性を実質的には有さずかつ既知の機能的活性を有する第１の量のＴ細胞を、最適状態に及ばない量の抗原模倣物質および未知の同時刺激性活性を有する樹状細胞調製物の第１のサンプルと接触させる工程、を包含する。第１の量のＴ細胞に対する第１の活性化値が決定される。その後、第２の量のＴ細胞が、樹状細胞調製物の第２のサンプルまたは最適状態に及ばない量の抗原模倣物質と接触され、そして第２の量のＴ細胞に対する第２の活性化値が決定される。第１の活性化値および第２の活性化値が、樹状細胞調製物の同時刺激性活性を決定するために比較される。
本発明のなお別の実施形態において、樹状細胞の調製物の品質を決定するための方法が、提供される。その方法は、未知の同時刺激性活性および所定の抗原に対する未知の抗原提示能力を有する樹状細胞調製物を提供する工程、樹状細胞調製物の同時刺激性活性を決定する工程、そして所定の抗原に対する樹状細胞調製物の抗原提示能力を定性的または定量的のいずれかで決定する工程、を包含する。これらの値を組み合わせることによって、所定の抗原に対してＴ細胞を活性化することに対する樹状細胞調製物の品質が、評価され得る。
樹状細胞調製物の同時刺激性活性は、既知の機能的活性を有しかつ同時刺激性活性を実質的には有さないＴ細胞を提供すること、そしてそのＴ細胞を最適状態に及ばない量の抗原模倣物質および樹状細胞調製物の第１のサンプルと接触させること、その後、その接触されたＴ細胞の活性化を決定すること、そして樹状細胞調製物の同時刺激性活性を決定するために、その接触されたＴ細胞の決定された活性化をＴ細胞についての標準的な活性化指標と比較すること、によって決定され得る。
樹状細胞調製物による所定の抗原の提示は、樹状細胞調製物の第２のサンプルを所定の抗原と接触させること、そしてその所定の抗原の量を決定すること、あるいはその所定の抗原が、樹状細胞調製物の細胞によって取り込まれ、プロセスされ、または樹状細胞調製物の第２のサンプルの細胞表面にて提示されたかどうかを決定すること、によって決定され得る。
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｔ細胞刺激において使用するためのまたは被験体への投与のための免疫刺激性組成物として使用するための、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の調製物の品質を評価するための方法を提供する。Ｔ細胞の抗原非依存性の同時刺激（同時刺激性活性とも呼ばれる）に対するアッセイ、およびＡＰＣによる所定の抗原の提示に対するアッセイが、ＡＰＣの調製物の品質を決定するために使用され得る。
１つの局面において、ＡＰＣの調製物の品質は、抗原非依存性のＴ細胞同時刺激性（または効力）アッセイによって決定され得る。代表的には、既知の機能的活性を有するＴ細胞が、抗原特異的シグナルを模倣する抗原模倣物質と接触される。そのＴ細胞はまた、未知の同時刺激活性を有するＡＰＣと接触される。その後、Ｔ細胞の活性化が測定され得、そしてＡＰＣの品質を決定するために使用され得る。
別の局面において、ＡＰＣ調製物の品質は、所定の抗原を提示するＡＰＣの能力によって決定され得る。代表的には、ＡＰＣ調製物は、所定の抗原と接触される。抗原の取り込みを可能にするために適切なインキュベーション期間の後、ＡＰＣによる所定の抗原の提示が決定され得る。
（抗原非依存性Ｔ細胞同時刺激（効力）アッセイ）
抗原非依存性Ｔ細胞同時刺激アッセイによってＡＰＣの品質を決定するために、既知の機能的活性を有するＴ細胞は、抗原特異的シグナルを模倣する抗原模倣物質と接触される。未知の同時刺激活性を有するＡＰＣが、そのＴ細胞と接触され、その後、Ｔ細胞の活性化が測定され、そしてＡＰＣの品質を決定するために使用される。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞およびＡＰＣの同時培養中におよび／または同時培養後に決定され得る。本明細書中で使用される場合、Ｔ細胞の活性化は、ＡＰＣと接触することに対する１つ以上のＴ細胞の機能の変化を試験することによって決定され得る。例えば、適切なＴ細胞の機能としては、増加した細胞増殖に関連したＤＮＡ複製における増加、細胞外サイトカイン産生および／または細胞内サイトカイン産生における変化、Ｔ細胞活性化マーカーにおける変化、および抗原提示細胞に対するＴ細胞の他の応答（例えば、抗原特異的シグナルおよび同時刺激シグナル）、が挙げられる。
アッセイにおいて使用されるＴ細胞は、富化されたＴ細胞調製物、ＡＰＣ枯渇化Ｔ細胞調製物または実質的に精製されたＴ細胞調製物（下記）であり得る。そのＴ細胞は、既知の機能的活性を有する。本明細書中で使用される場合、既知の機能的活性とは、同一の同時刺激シグナル（ＡＰＣからの）および同一濃度の抗原模倣物質に応答する、Ｔ細胞の再現可能な応答を言う。例えば、既知の機能的活性は、同一量の同時刺激シグナルおよび抗原模倣物質に対する、所定の増殖（例えば、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定されるＤＮＡ複製）、細胞外サイトカイン産生、細胞内サイトカイン産生、および／またはＴ細胞活性化マーカーの発現、であり得る。Ｔ細胞の所定の機能的活性は、本明細書中で記載される方法の前に、方法と同時に、方法の後に、決定され得る。
例えば、抗原模倣物質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体の抗原結合フラグメント、またはＴ細胞レセプターに結合し得かつ抗原模倣シグナルを提供し得る他の分子であり得る。特定の実施形態において、抗原模倣物質は、ＣＤ３結合性物質（例えば、ＣＤ３結合性抗体、またはＣＤ３結合性物質の抗原結合フラグメント）である。特定の実施形態において、ＣＤ３結合性物質は、Ｔ細胞レセプター（例えば、ＯＫＴ３）の不変性ＣＤ３成分と結合するモノクローナル抗体である。（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０−５２（１９９３）を参照のこと。；その開示は本明細書中に参考として援用される。）他の実施形態において、ＣＤ３結合性物質は、ＣＤ３またはＴ細胞レセプターの他の部分と結合し、かつ抗原特異的シグナルを模倣する、ポリクローナル抗体であり得る。
さらなる実施形態において、例えば、抗原模倣物質は、最適状態に及ばない濃度にて、ＡＰＣにより提供される同時刺激シグナルと組み合わせてＴ細胞を活性化するための刺激を提供する、植物性レクチンまたはマイトジェンであり得る。しかし、同時刺激シグナルの非存在下において、最適状態に及ばない濃度または最適状態に及ばない量の植物性レクチンまたはマイトジェンは、最大限のＴ細胞活性化を刺激するのに十分ではない。例えば、適切な植物性レクチンとしては、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン、小麦胚芽凝集素、ヤマゴボウマイトジェンなどが挙げられる。例えば、適切な非植物起源のマイトジェンとしては、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＡ、ＳｔｒｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡ、ホルボールミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ）などが挙げられる。
代表的には、Ｔ細胞は、最適状態に及ばない濃度または最適状態に及ばない量の抗原模倣物質と接触される。本明細書中で使用される場合、「最適状態に及ばない濃度」または「最適状態に及ばない量」とは、それ自身により最大限のＴ細胞活性化を刺激しない抗原模倣物質の濃度または量を言う。代表的な実施形態において、最適状態に及ばない濃度または最適状態に及ばない量の抗原模倣物質は、ＡＰＣによって提供される同時刺激シグナルの所望の範囲を超える、Ｔ細胞による直線応答（すなわち、活性化）を可能にする。他の実施形態において、最適状態に及ばない濃度または最適状態に及ばない量の抗原模倣物質は、ＡＰＣ由来の同時刺激シグナルの閾値レベルを超えるＴ細胞活性化を可能にする。
特定の実施形態において、適切な量の抗ＣＤ３抗体は、約０．０５ｎｇ／１００μｌ〜約２０ｎｇ／１００μｌ、または約５０ｎｇ／１００μｌ、あるいはそれ以上の範囲であり得る。他の実施形態において、最適状態に及ばない濃度または最適状態に及ばない量の植物性レクチンおよび非植物起源のマイトジェンが使用される。使用される植物性レクチンまたは非植物起源のマイトジェンの濃度または量は、選択される組成物に依存する。代表的に使用される最適濃度の植物性レクチンまたは最適濃度の非植物起源のマイトジェンは、当業者に周知であり、最適状態に及ばない濃度は容易に選択され得る。例えば、最適濃度のＰＨＡは、１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌであり、本発明の実施形態において、１μｇ／ｍｌ未満が、最適状態に及ばない濃度として使用される。適切な量（ａｍｏｕｎｔ）または適切な量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）のＴ細胞およびＡＰＣが接触され得る。特定の実施形態において、アッセイは、低いＡＰＣ対Ｔ細胞比で行われる。例えば、そのような比は、約１：３（ＡＰＣ対Ｔ細胞）〜約１：１００（ＡＰＣ対Ｔ細胞）の範囲であり得る。
Ｔ細胞は、ＡＰＣとの同時培養の前に抗原模倣物質と接触され得る。例えば、Ｔ細胞は、組織培養プレートまたはマイクロタイタープレートのウェル中に固定化された最適状態に及ばない濃度の抗原模倣物質と接触され得る。あるいは、Ｔ細胞、ＡＰＣおよび抗原模倣物質は、同時にまたはほぼ同時に接触され得る。
例示的な実施形態において、抗原模倣物質は、培養皿（例えば、平底９６ウェルプレート）中に固定化され得る。例えば、抗原模倣物質（例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体）の適切な量は、９６ウェルプレートの１個のウェル当たり、約０．１ｎｇ〜約５０ｎｇ、またはそれ以上の範囲であり得る。固定化の後、代表的には、そのウェルは、未結合の抗原模倣物質を除去するために洗浄される。他の実施形態において、他のインキュベーション時間およびインキュベーション条件が使用され得る。
例えば、適切なＡＰＣの調製物としては、樹状細胞および単球が挙げられる。他の実施形態において、ＡＰＣは、活性化された非名目上のＡＰＣ（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、あるいは上皮細胞または内皮細胞）であり得る。ＡＰＣは、未成熟であっても成熟であってもよい。代表的には、ＡＰＣおよびＴ細胞は、約６時間〜約４８時間同時培養され得るが、より長い時間およびより短い時間は、本発明の範囲内である。代表的には、同時培養は、Ｔ細胞の活性化を可能にするために十分な時間行われるが、有意な数の未成熟ＡＰＣまたはＡＰＣ前駆体の分化および／または成熟には、より短い時間しか必要とされない。
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞およびＡＰＣの同時培養中におよび／または同時培養後に、決定され得る。例えば、Ｔ細胞活性化に対する適切なアッセイとしては、ＤＮＡ複製アッセイ（例えば、３Ｈ−チミジン取り込み）、細胞外サイトカイン産生および／または細胞内サイトカイン産生アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなど）、およびＴ細胞活性化マーカーアッセイ（例えば、フローサイトメトリー）が、挙げられる。
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞増殖（例えば、ＤＮＡ複製（例えば、標識化チミジン取り込み（例えば、３Ｈ−チミジンまたは他の適切な標識）によって測定され得る））と相関し得る。Ｔ細胞およびＡＰＣの同時培養は、約６時間〜約２４時間、標識（例えば、３Ｈ−チミジン、約１μＣｉ／ウェル）でパルス化され得る。その後、細胞は、回収され得（細胞収穫器を使用して）、そして取り込まれた放射能が液体シンチレーション分光法によって測定され得る。特定の実施形態において、ＡＰＣは、ＡＰＣ ＤＮＡ複製を防止するために、Ｔ細胞と同時培養する前に不活化され得る。あるいは、Ｔ細胞は、取り込まれた標識の量を決定する前に、ＡＰＣから分離され得る。
Ｔ細胞活性化はまた、細胞外サイトカイン産生または細胞内サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ産生物および／またはＩＬ−２産生など）によって測定され得る。細胞外サイトカイン産生は、培養培地中の１種以上のサイトカインのレベルにおける変化を決定することによって測定され得る。代表的には、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、またはウェスタンブロッティング）が使用され得るが、他のアッセイもまた、適切であり得る。（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。その開示は本明細書中に参考として援用される。）細胞内サイトカインレベルに関して、イムノアッセイまたは他のアッセイが使用され得る。必要に応じて、Ｔ細胞は、細胞内サイトカインレベルに関するアッセイの前に、ＡＰＣから分離され得る（例えば、Ｔ細胞マーカーの発現に基づく回収によって）。（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出、を参照のこと。）
さらなる実施形態において、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーの調節によって決定され得る。例えば、そのようなマーカーとしては、ＣＤ２５（インターロイキン２レセプターα鎖とも呼ばれる）、ＣＤ６９（ＶＥＡまたはＡＩＭとも呼ばれる）、ＣＤ４４（Ｐｇｐ−１とも呼ばれる）、ＣＤ１２５（ＩＬ−２レセプターβ鎖とも呼ばれる）などが、挙げられる。例えば、Ｔ細胞活性化マーカーの調節は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルにおける変化を決定することによって、測定され得る。例えば、タンパク質レベルにおける変化は、Ｔ細胞活性化マーカーに対する標識化抗体、転写因子に対する標識化抗体またはＴ細胞活性化に関連する他のタンパク質に対する標識化抗体を使用するフローサイトメトリーによって、およびイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングなど）によって決定され得る。ｍＲＮＡレベルにおける変化は、Ｔ細胞活性化マーカー、転写因子などをコードするメッセージについて決定され得る。例えば、ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、他のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブアレイを使用するアッセイなど）、または他のアッセイによって、決定され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）；米国特許第５，４４５，９３４号；同第５，５３２，１２８号；同第５，５５６，７５２号；同第５，２４２，９７４号；同第５，３８４，２６１号；同第５，４０５，７８３号；同第５，４１２，０８７号；同第５，４２４，１８６号；同第５，４２９，８０７号；同第５，４３６，３２７号；同第５，４７２，６７２号；同第５，５２７，６８１号；同第５，５２９，７５６号；同第５，５４５，５３１号；同第５，５５４，５０１号；同第５，５６１，０７１号；同第５，５７１，６３９号；同第５，５９３，８３９号；同第５，５９９，６９５号；同第５，６２４，７１１号；同第５，６５８，７３４号；および同第５，７００，６３７号を参照のこと；その開示は本明細書中に参考として援用される。）
活性化アッセイによって決定されたＴ細胞の活性化（決定された活性化）は、必要に応じて、抗原模倣物質と、および／またはＡＰＣ単独と接触されたＴ細胞のバックグラウンドの活性化によって調整（すなわち減少）され得る。さらに、必要に応じて、活性化は、Ｔ細胞調製物中の非Ｔ細胞（例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）のバックグラウンドレベルに関して調整され得る。
決定された活性化（バックグラウンドの活性化について差引かれたかまたは差引かれていない）は、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）の同時刺激活性を決定するために、Ｔ細胞についての標準的な活性化指標と比較され得る。本明細書中で使用される場合、標準的な活性化とは、ＡＰＣの抗原非依存性の同時刺激活性とともに使用され得るかまたは相関し得る、定量的な値または一連の値を言い得る。例えば、標準的な活性化指標は、閾値（例えば、３Ｈ−チミジン取り込みのレベル、細胞外サイトカイン産生のレベルまたは細胞内サイトカイン産生のレベル、または１種以上のＴ細胞活性化マーカーの存在および／または非存在）であり得る。標準的な活性化指標はまた、ＡＰＣによるＴ細胞同時刺激の異なるレベルと相関する一連の値（例えば、異なる量の３Ｈ−チミジン取り込み、細胞外サイトカイン産生または細胞内サイトカイン産生の量、またはＴ細胞活性化マーカーの存在および／または非存在）であり得る。他の実施形態において、標準的な活性化指標は、定性的（例えば、１種以上のＴ細胞活性化マーカーの存在および／または非存在、サイトカイン産生の存在または非存在など）であり得る。例えば、特定の実施形態において、標準的な活性化指標は、Ｔ細胞活性化の程度またはレベルを測定することに関する、１５，０００ｃｐｍの３Ｈ−チミジン取り込みと相関付けされ得る。このＴ細胞活性化の程度またはレベルは、ＡＰＣの同時刺激（効力）の程度またはレベルに対して正比例し得る。
特定の実施形態において、標準的な活性化指標は、Ｔ細胞および抗ＣＤ３抗体を、（未知の効力の）ＡＰＣと接触させることから生じる活性化 対 Ｔ細胞および抗Ｃｄ３抗体を（ＡＰＣなしに）接触させることから生じる活性化の比（例えば、ｃｐｍ）として計算され得る。値の結果が、ＡＰＣ同時刺激活性または効力の指標であり得る。
標準的な活性化指標は、Ｔ細胞の個々の調製物を使用して決定され得、または１種以上のＴ細胞調製物に基づいて標準化され得る。特定の実施形態において、標準的な活性化指標は、参照のＴ細胞調製物または参照のＴ細胞株、ならびに参照のＡＰＣ調製物または参照のＡＰＣ細胞株を使用して決定され得る。
決定された活性化、および相当する標準的な活性化指標は、代表的には、ＡＰＣの個々の刺激活性に対して正比例する。従って、ＡＰＣ同時刺激活性は、例えば、研究に対して、動物研究に対して、臨床試験に対して、および他の非臨床的使用に対してＡＰＣを認定するために、使用され得る。さらに、ＡＰＣ同時刺激活性アッセイは、ＡＰＣ調製物の整合性を決定するために、またはＡＰＣ生成物（例えば、細胞ワクチン生成物）に対する品質制御アッセイとして使用され得る。
（ＡＰＣ抗原提示アッセイ）
本発明の別の局面に従って、ＡＰＣの調製物による所定の抗原の提示を決定することによってＡＰＣの調製物の品質を決定するための方法が、提供される。上記のように、ＡＰＣの調製物は、それらが抗原を取り込み、プロセスし、提示する能力が変化し得る。例えば、成熟樹状細胞は、一般に、新規抗原を取り込み、プロセスし、提示する、減少された能力を示す。対照的に、未成熟樹状細胞は、一般に、効率的に抗原を取り込み得るが、成熟に達するまで効率的にプロセスせず、かつ抗原を提示しない。抗原提示は、アッセイされる細胞の型に従って、特定の所定の抗原、あるいは抗原群または抗原サンプルを取り込み、プロセスしかつ提示するＡＰＣの能力の尺度であり得、またはそのＡＰＣの能力と相関し得る。
抗原提示を決定するために、ＡＰＣのサンプルは、１種以上の所定の抗原と接触され得る。ＡＰＣは、所定の抗原（またはそのエピトープ）の取り込みを可能にするために培養され得、必要に応じて、プロセシングおよび／または提示を可能にするために培養され得る。ＡＰＣにより提示される所定の抗原の量は、代表的には、ＭＨＣ分子との関連において、例えば、ＡＰＣ内でのローディングおよび／またはプロセシング、および／またはＡＰＣの表面上での提示を測定することにより、提示と相関し得る。これらのアッセイは、総合的に、「提示アッセイ」または「提示」と呼ばれる。
例えば、所定の抗原は、細菌性抗原またはウイルス抗原、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞溶解物、腫瘍細胞膜調製物、腫瘍由来の単離された抗原、融合タンパク質、またはリポソーム）、または他の抗原であり得る。例示的な実施形態において、抗原は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。
特定の実施形態において、所定の抗原提示の量は、ＡＰＣによる抗原のローディングと相関し得る。例えば、ＡＰＣは、抗原をロードされ得、その細胞は回収され得、そして必要に応じて、細胞の外側に残っている抗原を除去するために洗浄され得る。細胞溶解物が調製され得、そしてその溶解物は、ＡＰＣによりロードされた所定の抗原の量を決定するために、イムノアッセイによって分析され得る。そのようなアッセイとしては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫沈降などが挙げられる。（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，前出、を参照のこと。）
さらなる実施形態において、所定の抗原の提示は、ＡＰＣの表面上で提示された抗原（またはそのエピトープ）を検出することによって決定され得る。例えば、所定の抗原と接触されたＡＰＣは、浸透圧ショックなどによって、可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ドデシル硫酸ナトリウムまたはＮＰ４０（登録商標））で処理され得る。放出された抗原（またはそのエピトープ）は、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降など）によって検出され得る。必要に応じて、所定の抗原または抗体は、検出可能に標識化（例えば、放射性同位体、発蛍光団、化学発光標識、酵素などで）され得、そして放出された抗原は、適切な検出手段（例えば、シンチレーションカウンター）を用いて検出され得る。
関連する実施形態において、抗原提示は、フローサイトメトリーによって決定され得る。例えば、ＡＰＣは、所定の抗原と接触され得、そして、適切なインキュベーション期間の後、その接触されたＡＰＣは、抗原特異的標識で染色され得、そしてその細胞表面上に提示された抗原の量が検出され得る。例えば、適切な標識としては、標識化抗体または抗原に対して特異的な他の結合剤、またはその一部分が挙げられ得る。
抗原提示はまた、抗原特異的Ｔ細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞株）を使用して決定され得る。ＡＰＣは、所定の抗原と接触され得、そして抗原の取り込み、プロセシングおよび提示を可能にするために培養され得る。抗原提示は、本明細書中で検討されるように、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を測定することによって（例えば、ＤＮＡ複製、細胞外サイトカイン産生または細胞内サイトカイン産生、Ｔ細胞活性化などを決定することによって）決定され得る。
（Ｔ細胞調製物およびＡＰＣ調製物）
本発明に従って使用するためのＴ細胞は、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。抗原非依存性同時刺激アッセイのために、Ｔ細胞は、富化されたＴ細胞調製物、ＡＰＣ枯渇化Ｔ細胞調製物、または実質的には精製されたＴ細胞調製物（下記）であり得る。Ｔ細胞、またはＴ細胞の部分集合は、種々のリンパ組織から得られ得る。そのような組織としては、脾臓、リンパ節、および末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、Ｔ細胞集団または精製されたＴ細胞の部分集合と混合され得る。
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、富化されたＴ細胞調製物である。その富化されたＴ細胞調製物において、Ｔ細胞の数またはパーセンテージは、Ｔ細胞の単離された集団に関して増加される。他の実施形態において、Ｔ細胞は、ＡＰＣを実質的には有さず、ほとんどの（例えば、７５％を超える）ＡＰＣは、Ｔ細胞から分離されている。例示的な実施形態において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、血液（例えば、ヘパリン処理したバイアル中で）から得られ得る。ＰＢＭＣは、遠心分離（例えば、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）１０７７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）を使用して）によって赤血球から分離され得、そして界面からＰＢＭＣが回収され得る。必要に応じて、回収されたＰＢＭＣは、洗浄（例えば、ＰＢＳで）され得る。
例えば、Ｔ細胞精製は、正の選択または負の選択（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体の使用、が挙げられるが、これらに限定されない）によって達せられ得る。本発明において有用なＴ細胞調製物は、代表的には、ＣＤ４＋またはＣＤ４＋とＣＤ８＋の混合調製物である。特定の実施形態において、Ｔ細胞調製物は、少なくとも約５０％のＴ細胞を含む。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は単離されたＴ細胞株であり得る。
同時刺激シグナルが取り除かれたＡＰＣ枯渇化Ｔ細胞が、調製され得る。同時刺激シグナルは、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体を使用する「パニング」によって取り除かれ得る。例えば、Ｔ細胞またはＰＢＭＣは、同時刺激シグナルを取り除くために、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して特異的な抗体と連結された磁気ビーズと接触され得る。本明細書中で使用される場合、同時刺激シグナルを実質的に有さないＴ細胞は、一般に、些細なレベルのＴ細胞活性化しか示さない（例えば、完全に活性化されたＴ細胞の活性のうち、約５％未満、または約１％未満）。
ＡＰＣは、種々の供給源から調製され得る。その供給源としては、ヒトおよび非ヒト霊長類、他の哺乳動物、および脊椎動物が挙げられる。特定の実施形態において、ＡＰＣは、ヒトの血液または非ヒト脊椎動物の血液から調製され得る。ＡＰＣはまた、富化された白血球の集団から単離され得る。白血球の集団は、当業者に公知の方法によって調製され得る。代表的には、そのような方法としては、ヘパリン処理血液の回収、アフェレーシスまたは白血球搬出、軟膜の調製、ロゼット法、遠心沈殿法、密度勾配遠心沈殿法（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標））、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）（コロイド状シリカ粒子）、スクロースなどを使用して）、非白血球細胞の差次的溶解、濾過などが挙げられる。白血球集団はまた、被験体から血液を収集し、血小板を除去するために線維素除去すること、および赤血球細胞を溶解することによって、調製され得る。必要に応じて、白血球集団は、単球樹状細胞前駆体について富化され得る。
血球集団は、富化された白血球集団の所望の使用に従って、種々の被験体から得られ得る。被験体は、健常な被験体であり得る。あるいは、血球は、免疫刺激を必要とする被験体（例えば、癌患者、または免疫刺激が有益な他の患者）から得られ得る。同様に、血球は、免疫抑制を必要とする被験体（例えば、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症など）を有する患者）から得られ得る。白血球集団はまた、ＨＬＡ適合性の健常な個体から得られ得る。
特定の実施形態において、単球樹状細胞前駆体は、例えば、富化された白血球または単球を、基材に付着している単球樹状細胞前駆体と接触させることによって単離され得る。（例えば、米国仮特許出願番号６０／３０７，９７８（２００１年７月２５日出願）を参照のこと；その開示は本明細書中に参考として援用される。）簡単に述べると、富化された白血球集団または単球集団が基材と接触された場合、細胞調製物中の単球樹状細胞前駆体、または単球が、その基材に付着する。他の白血球は、基材に対して減少した結合親和性を示す。それによって、単球樹状細胞前駆体が、基材の表面上で優先的に富化されることが可能となる。
適切な基材としては、粒子状基材（例えば、ガラス微粒子、プラスチック微粒子、ガラスで覆われたプラスチック微粒子、ガラスで覆われたポリスチレン微粒子、マイクロキャピラリー管および微小絨毛膜）が挙げられる。必要に応じて、基材の表面は、基材への単球樹状細胞前駆体の付着を促進するために処理され得る。基材の表面は、例えば、タンパク質、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン４および／またはインターロイキン１３）、血漿（例えば、自己血漿または同種異系血漿）、単球結合性タンパク質などで覆われ得る。
白血球富化細胞調製物または単球富化細胞調製物を、基材に付着している単球樹状細胞前駆体と接触させた後、単球樹状細胞前駆体は、基材に付着し、基材上で単球樹状細胞前駆体を含む複合体を形成する。単球樹状細胞前駆体の結合は、例えば、抗細胞表面マーカー抗体（例えば、抗ＣＤ１４抗体）を使用する抗体検出、ＦＡＣＳ前方散乱分析およびＦＡＣＳ側方散乱分析などによって、モニターされ得る。いくつかの実施形態において、白血球集団は、基材と約５分間〜約３００分間、より代表的には約３０分間〜約１２０分間接触される。
必要に応じて、単球樹状細胞前駆体複合体は、非特異的に結合した白血球を除去するために、適切な洗浄用緩衝液で洗浄され得る。適切な洗浄用緩衝液としては、組織培養培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ １５など）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水などが挙げられる。その培地は、単球樹状細胞前駆体の生存率および／または増殖を促進するために、アミノ酸、ビタミン、および／またはホルモンが補充され得る。洗浄の効力は、洗浄緩衝液のＦＡＣＳ前方散乱分析およびＦＡＣＳ側方散乱分析によって、細胞表面マーカーについて溶出された細胞の染色などによって、モニターされ得る。代表的には、その複合体は、非特異的に結合した白血球を除去するために、数回洗浄され得る。
付着した単球樹状細胞前駆体は、基材から溶出され得る。例えば、その前駆体は、０．４％ＥＤＴＡまたは他の非毒性キレート剤を含むリン酸緩衝化生理食塩水を用いる処理によって、基材から溶出され得る。単球樹状細胞前駆体は、代表的には、トリプシンまたは他のプロテアーゼを使用することなく、基材から溶出される。
他の実施形態において、樹状細胞は、当業者に公知の他の方法に従って単離され得る。（例えば、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０６７−７６（１９９３）；ＹｏｕｎｇおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３１５−３２（１９９０）；ＦｒｅｕｄｅｎｔｈａｌおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５：９５５−６１（１９９０）；米国特許第５，９９４，１２６号および同第５，８５１，７５６号を参照のこと；その開示は本明細書中に参考として援用される。）樹状細胞を免疫選択するための方法としては、例えば、樹状細胞前駆体に関する細胞表面マーカーに対する抗体（例えば、基材に連結された抗ＣＤ３４抗体または抗ＣＤ１４抗体（例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１０９９−１０４（１９９５）；Ｃａｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８−６１（１９９２）を参照のこと））、または完全に分化した樹状細胞に関する細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）に対する抗体を使用することが挙げられる。
他の実施形態において、ＡＰＣは、炎症条件下または他の活性化条件下で、非名目上のＡＰＣであり得る。例えば、非名目上のＡＰＣとしては、インターフェロンγで刺激された上皮細胞、ＡＰＣ活性を誘導する因子または条件によって活性化された、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および／または単球が挙げられる。そのような非名目上のＡＰＣは、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。
（ＡＰＣの培養、拡大および分化）
ＡＰＣは、そのＡＰＣの型に従って、所望のように、培養され得、拡大され得、分化され得、および／または成熟され得る。ＡＰＣは、任意の適切な培養容器（例えば、培養プレート、フラスコ、培養袋、バイオリアクターなど）中で培養され得る。（例えば、米国仮特許出願番号６０／３０７，９７８（２００１年７月２５日出願）を参照のこと。）
特定の実施形態において、ＡＰＣは、調製物中のＡＰＣの数を維持および／または拡大するために、適切な培養培地および増殖培地中で培養され得る。その培養培地は、単離されたＡＰＣの型に従って選択され得る。例えば、成熟ＡＰＣ（例えば、成熟樹状細胞）は、その維持および拡大に適切な増殖培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ １５など）中で培養され得る。その培養培地は、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、二価陽イオンなどが補充され得る。さらに、サイトカイン、増殖因子および／またはホルモンが、増殖培地中に含まれ得る。例えば、成熟樹状細胞の維持および／または拡大のために、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および／またはインターロイキン４（ＩＬ−４））が、約５００単位／ｍｌの濃度で、代表的には添加される。
他の実施形態において、未成熟ＡＰＣが、培養され得、および／または拡大され得る。未成熟樹状細胞は、その未成熟樹状細胞が新規抗原を取り込む能力およびプロセスする能力を保持するので、本発明の特定の局面において好ましくあり得る。（例えば、Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：９３−１００（１９９５）を参照のこと。）例示的な実施形態において、未成熟樹状細胞は、その未成熟樹状細胞の維持および培養のために適切な培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ １５など）中で、培養され得る。その培養培地は、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、二価陽イオンなどが補充され得る。さらに、サイトカイン、増殖因子および／またはホルモンが、その増殖培地中に含まれ得る。例えば、未成熟樹状細胞の維持および／または拡大のために、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および／またはインターロイキン４（ＩＬ−４））が、約５００単位／ｍｌの濃度で、代表的には添加される。
他の未成熟ＡＰＣが、当業者に公知の方法に従って、同様に培養され得る。
未成熟ＡＰＣの調製物は、成熟され、成熟ＡＰＣを形成し得る。ＡＰＣの成熟は、未成熟ＡＰＣの型に従って、抗原（例えば、所定の抗原）への曝露中または曝露後に起こり得る。
特定の実施形態において、未成熟樹状細胞の調製物が、成熟され得る。適切な成熟因子としては、例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）、細菌産物（例えば、ＢＣＧ）などが挙げられる。
本発明の特定の局面において、所定の抗原に対して特異的なＡＰＣを調製することが望まれる。そのような抗原は、例えば、細菌性抗原およびウイルス性抗原、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞溶解物、腫瘍細胞膜調製物、腫瘍由来の単離された抗原、融合タンパク質、またはリポソーム）、または他の抗原であり得る。例示的な実施形態において、未成熟樹状細胞は、癌免疫治療および／または腫瘍増殖阻害のために、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の存在下で培養される。ＡＰＣは、代表的には、所定の抗原と接触され、そして抗原の取り込みおよびプロセシングを可能にするのに適切な時間の間、培養される。
別の局面において、単離されたＡＰＣ前駆体は、未成熟ＡＰＣまたは成熟ＡＰＣの調製物を調製するために使用される。ＡＰＣ前駆体は、当業者に公知のように、培養され得、分化され得、および／または成熟され得る。
特定の実施形態において、単球樹状細胞前駆体は、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４）、二価陽イオンなどが補充された適切な培養培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ １５など）の存在下で培養され得、単球樹状細胞前駆体から未成熟樹状細胞への分化が促進される。代表的なサイトカインの組み合わせは、各々が約５００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である。
以下の実施例は、単に本発明の種々の局面の例示として提供され、そしていかなる観点においても本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１：同時刺激アッセイ）
本実施例において、抗原非依存性同時刺激アッセイを使用し、樹状細胞の調製物の品質を測定する。
樹状細胞調製物を、２６人の異なるヒト被験体から、以下のように作製した：ＰＢＭＣを、各々の患者由来の白血球搬出血液から単離し、そして５％自己血漿を補充したＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で６日間培養し、その後、もう１日間、樹状細胞成熟物質であるＢＣＧの存在下で培養した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以下のように調製した：白血球搬出された血液を、緩衝化生理食塩水で希釈し、ＦＩＣＯＬＬ溶液上に上層し、そして２０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。界面にある白血球を単離した。磁気ビーズ選択を使用して、ＰＢＭＣからその同時刺激機能を取り出した。簡単に述べると、ＭＨＣクラスＩＩについての抗体を、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に連結した。その磁気ビーズを、ＰＢＭＣに添加し、ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する細胞を、以下のように取り出した：ビーズを、１細胞当たり２個〜１０個のビーズにて、ＰＢＭＣに添加し、そして１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、ビーズ結合性細胞（ＡＰＣ）を、磁気デバイスを使用して除去した。生じたＰＢＭＣの集団には、概ねＡＢＣを有さず、そして５０％を超えるＴ細胞を含んだ。
増殖アッセイを、以下のように実施した：１×１０４個の樹状細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルに添加し、そして１ｎｇの抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と接触させた。その後、１×１０５個の富化されたＴ細胞（上記）を添加し、結果として１つのウェル当たり０．２ｍｌの最終容積とした。そのプレートを、２６時間インキュベートし、その後、３Ｈ−チミジンを加えた。そのプレートを、１８時間さらにインキュベートした後、収集し、取り込まれた標識を決定した。
Ｔ細胞増殖（Δｃｐｍ）を、｛（抗ＣＤ３抗体の存在下で樹状細胞調製物のサンプルで刺激されたＴ細胞による３Ｈ−チミジン取り込み）−（樹状細胞調製物のサンプル単独で刺激されたＴ細胞による３Ｈ−チミジン取り込み）の差異｝として測定した。各々の樹状細胞調製物についての平均Δｃｐｍを、３連のサンプルの平均として計算した。そのアッセイの結果を、以下の表１に示す。
（表１）
同時刺激アッセイ
Figure 2005524412
 抗ＣＤ３抗体単独とインキュベートされたＴ細胞は、平均ｃｐｍ約３７０を示した。この３Ｈ−チミジン取り込みの低いレベルは、抗ＣＤ３抗体が最適状態に及ばない濃度で添加されたことを確立する。樹状細胞調製物のサンプル単独と同時培養されたＴ細胞は、約２２８１ｃｐｍという平均ｃｐｍを示した。対照的に、抗ＣＤ３抗体および樹状細胞と同時培養されたＴ細胞についての平均Δｃｐｍは、１４，９７２ｃｐｍの標準偏差で、３９，７４７ｃｐｍであった。Δｃｐｍ値の分布は標準的であったが、Δｃｐｍ値の範囲のより高い端に向かって有意な非対称性であった。
標準的なヒト供血者由来の樹状細胞調製物の参照サンプルは、１２，９１１ｃｐｍの標準偏差で、平均Δｃｐｍ約５１，２６０を有した。これらのデータに基づいて、１５，０００以上のΔｃｐｍの増殖を示す樹状細胞調製物は、許容可能な品質であることが見出された。
（実施例２：抗原非依存性同時刺激アッセイの特異性）
同時刺激アッセイは、特定の型のＡＰＣが抗原非依存性Ｔ細胞増殖を刺激する能力に基づく。以下の研究を、そのアッセイの特異性を確立するために実施した。
樹状細胞調製物中においてほとんど一般的に見出される非樹状細胞型を調製し、そして同時刺激アッセイのみに使用し、特徴付けされた（参照）樹状細胞調製物中にスパイクした。Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を、抗体を使用する負の選択を用いる磁気ビーズ分離法によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製した。Ｔ細胞について、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９およびＣＤ５６に対する抗体を使用した；Ｂ細胞について、ＣＤ２に対する抗体、ＣＤ３に対する抗体およびＣＤ１４に対する抗体を使用した。単球について、ＣＤ３に対する抗体、ＣＤ１９に対する抗体およびＣＤ５６に対する抗体を使用した。
アッセイは、以下のように実施した：実施例１で記載されたように、増殖アッセイにおいて、Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球を樹状細胞の代わりに使用した。樹状細胞の代わりに使用したＴ細胞を照射し、増殖を妨げた。その後、同種異系の指示Ｔ細胞を添加し、そして４０時間後、上記のように増殖を決定した。
樹状細胞の代わりに使用された場合、Ｔリンパ球およびＢリンパ球は、同時刺激アッセイにおいて、試験されたいずれの濃度でもＴ細胞を刺激することは不可能であった。以下の表２に示されるように、ＰＢＭＣから単離された単球は、樹状細胞数の２．５倍で添加した場合に、Ｔ細胞増殖（３Ｈ−チミジン取り込み）を刺激することが可能であった。しかし、その増殖は、等しい数の樹状細胞を使用して得られた増殖よりも、はるかに低かった。
（表２）
Figure 2005524412
 樹状細胞調製物中で、ＣＤ１４陽性かつＣＤ１１ｃ陽性の細胞、およびＣＤ１４陰性かつＣＤ１１ｃ陽性の細胞が、同等な同時刺激活性を有することを見出し、そしてそれらの細胞は両方とも樹状細胞であるとみなした。
（実施例３：樹状細胞の特徴付け）
Ｃｄ１１ｃ陽性かつＣＤ１４陽性な細胞、およびＣｄ１１ｃ陽性かつＣＤ１４陰性の細胞の同時刺激活性を、ＣＤ１４に対する標識化抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、樹状細胞調製物から分離した。
これらのアッセイにおいて、樹状細胞調製物由来のＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ１４陽性の細胞、およびＣＤ１１ｃ陽性かつＣＤ１４陰性の細胞は、同等な同時刺激活性を有するようであった。従って、両方の細胞型は、まとめて樹状細胞と呼んだ。
（実施例４：同時刺激アッセイに対する樹状細胞生存率の影響）
本発明に従うアッセイに対する死細胞についての可能な影響を決定した。簡単に述べると、３分間の１％ホルムアルデヒドによる処理、または１時間の５６℃までの加熱によって、樹状細胞を殺した。この死（殺した）細胞懸濁液を、同時刺激アッセイにおいて試験した。その死細胞を、規定された比で生存樹状細胞と混合した。上記の実施例１のように、但しそうでない場合は以下に記載されるように、アッセイを実施した。
以下の表３および表４に示されるように、加熱死させた樹状細胞は、本発明に従う同時刺激アッセイにおいて、実質的には、活性を本質的には全く保持しなかった。ホルムアルデヒド処理した樹状細胞は、ヨウ化プロピジウム染色によって決定した場合に、約２０％の生存樹状細胞を依然として保持する；この細胞は、減少されたレベルで同時刺激活性を保持する。第３の実験において、死細胞の添加は、アッセイを妨げなかった。
（表３）
同時刺激アッセイに対する細胞生存率の影響
Figure 2005524412
 （表４）
同時刺激アッセイに対する死細胞の影響
Figure 2005524412
 （実施例５：抗原非依存性同時刺激アッセイの直線性）
固定した数の指示Ｔ細胞に、漸増数の樹状細胞を添加して、樹状細胞数と３Ｈ−チミジンアッセイとの間の関係を決定した。０個、２０００個、６０００個または１０，０００個の樹状細胞を、ウェル中に配置した。実施例１に記載されるように、以下の培養条件（例えば、１０５個のＴ細胞で、１つのウェル当たり１ｎｇの抗ＣＤ３抗体）を使用した。合計のインキュベーション時間は４０時間であった；インキュベーションの最後の１８時間は、３Ｈ−チミジンの存在下で実施した。
指示Ｔ細胞の３Ｈ−チミジン取り込みは、樹状細胞の数を増加するにつれて実質的に直線的に増加した。特に、観察されたΔｃｐｍは、各々、０、約７，０００ｃｐｍ、約１５，０００ｃｐｍおよび約２７，０００ｃｐｍであった。式 ｙ＝２．７１８３−１３４．１３（Ｒ２＝０．９８７９）で、この直線関係が近似される。これらの結果は、同時刺激活性がＤＣの数に依存して直線的であり得ることを実証した。
（実施例６：精度）
実施例１に従う同時刺激アッセイの精度を、３人の実施者が同一のロットの樹状細胞を試験することによって決定した。各実施者は、そのロットを３回（連続した３日間において１日に１回）試験した。そのデータを、重複性（アッセイ内分散）、反復性（アッセイ間分散）、および再現性（実施者間分散）について分析した。以下の表５に未加工データを示す。変動係数（ＣＶ）は、１．２５〜１６．１８の範囲であり、より低いレベルの３Ｈ−チミジン取り込みにて、より高いＣＶが観察された。
（表５）
同時刺激アッセイの精度−未加工データ
Figure 2005524412
Figure 2005524412
 すべての条件を３連で実行し、その結果、３連のｃｐｍ値を、重複性の尺度として試験した。反復性および再現性は、Δｃｐｍを使用して分析した。各実施者についての平均Δｃｐｍ、標準偏差およびアッセイ間の変動係数（ＣＶ）を、以下の表６に示す。実施者番号１のＣＶは、５７．８％、実施者番号２について１４．４％、そして実施者番号３について１９．６％であった。再現性は、３人すべての実施者について、平均ΔｃｐｍのＣＶによって表され、そしてそれは１４％である。
（表６）
反復性および再現性
Figure 2005524412
 （実施例７）
ＰＳＭＡをロードした樹状細胞を、以下のようにアッセイする：ロードされた樹状細胞を、界面活性剤を使用して溶解させ、５×１０５個の細胞に相当するその溶解物を、７．５％ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルの各レーン中で電気泳動する。１５０ボルトにて約１時間、溶解物タンパク質を分解した後、そのタンパク質を、ＰＶＤＦ膜またはナイロン膜に移す。ＰＳＭＡ特異的モノクローナル抗体である４Ｄ８（ＡＴＣＣ ＨＢ １２４８７；米国特許第６，１５０，５０８号）を使用して、ウェスタンブロッティングを実施する。その抗体の結合を、化学発光およびフィルムへの曝露によって可視化する。ＰＳＭＡの身元は、ゲルで電気泳動した標準ＰＳＭＡタンパク質の同時局在化によって決定する。
上記の実施例は、本願発明を例示するために提供されるが、本願発明を限定するためには提供されない。本発明の他の改変形は、当業者に容易に明らかであり、そして添付の特許請求の範囲に包含される。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、参考として本明細書によって援用される。
図１。 図２。 図３。 図４。 図５。 図６。 図７。 図８。

Claims (47)

  1. 抗原提示細胞（ＡＰＣ）の抗原非依存性の同時刺激性活性を決定するための方法であって、
    既知の機能的活性を有しかつ同時刺激性活性を実質的には有さないＴ細胞を提供する工程；
    未知の同時刺激性活性を有するＡＰＣのサンプルを提供する工程；
    該Ｔ細胞を最適状態に及ばない濃度の抗原模倣物質と接触させる工程；
    該Ｔ細胞を該未知の同時刺激性活性を有するＡＰＣのサンプルと接触させる工程；
    該抗原模倣物質および該ＡＰＣのサンプルと接触された、該Ｔ細胞の活性化を決定する工程；ならびに
    該ＡＰＣの該同時刺激性活性を決定するために、該Ｔ細胞の該決定された活性化を該Ｔ細胞についての標準的な活性化指標と比較する工程
    を包含する、方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞および前記ＡＰＣが、同系である、方法。
  3. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞および前記ＡＰＣが、同種異系である、方法。
  4. 請求項１に記載の方法であって、前記抗原模倣物質が、ＣＤ３結合性物質、植物性レクチンまたはマイトジェンである、方法。
  5. 請求項４に記載の方法であって、前記ＣＤ３結合性物質が、抗ＣＤ３抗体である、方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、前記ＡＰＣが、樹状細胞である、方法。
  7. 請求項６に記載の方法であって、前記樹状細胞が、樹状細胞成熟物質とエキソビボで接触させることによって未成熟樹状細胞から誘導される成熟樹状細胞である、方法。
  8. 請求項６に記載の方法であって、前記樹状細胞が、未成熟樹状細胞である、方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、細胞表面上にＣＤ１４分子、ＣＤ５４分子、ＣＤ８０分子、ＣＤ８３分子またはＣＤ８６分子を発現する末梢血単核細胞について実質的には枯渇されている、方法。
  10. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、細胞表面上でＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する末梢血単核細胞について実質的に枯渇されている、方法。
  11. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイによって決定される、方法。
  12. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞サイトカイン産生をアッセイすることによって決定される、方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、前記アッセイされるＴ細胞サイトカイン産生が、ＩＦＮγ産生またはインターロイキン２産生である、方法。
  14. 請求項１２に記載の方法であって、前記アッセイされるＴ細胞サイトカイン産生が、細胞外サイトカイン産生である、方法。
  15. 請求項１２に記載の方法であって、前記アッセイされるＴ細胞サイトカイン産生が、細胞内サイトカイン産生である、方法。
  16. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞活性化マーカーの発現の調節を検出することによって決定される、方法。
  17. 請求項１６に記載の方法であって、前記Ｔ細胞活性化マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４またはＣＤ１２５である、方法。
  18. 請求項１６に記載の方法であって、前記Ｔ細胞活性化マーカーが、該Ｔ細胞活性化マーカーと結合可能な標識化抗体を使用して検出される、方法。
  19. 請求項１に記載の方法であって、前記決定された活性化を前記標準的な活性化指標と比較する工程が、該決定されたＴ細胞活性化を前記樹状細胞のサンプル単独と接触された前記Ｔ細胞の活性化と比較して、前記樹状細胞の品質を決定する工程を包含する、方法。
  20. 請求項１に記載の方法であって、前記標準的な活性化指標が、閾値である、方法。
  21. 請求項１に記載の方法であって、前記標準的な活性化指標が、一定範囲の値であり、各々の値は、樹状細胞の所定の品質と関連付けられる、方法。
  22. 請求項１に記載の方法であって、ＡＰＣによる所定の抗原の提示を決定する工程をさらに包含する、方法。
  23. 請求項２２に記載の方法であって、前記所定の抗原の提示が、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリーまたは抗原特異的Ｔ細胞の活性化によって決定される、方法。
  24. 樹状細胞の調製物の抗原非依存性の同時刺激性活性を決定するための方法であって、該方法は、
    同時刺激性活性を実質的には有さずかつ既知の機能的活性を有する第１の量のＴ細胞を、最適状態に及ばない量の抗原模倣物質と、および未知の同時刺激活性を有する樹状細胞調製物の第１のサンプルと、接触させる工程；
    該第１の量のＴ細胞についての第１の活性化値を決定する工程；
    第２の量のＴ細胞を、該樹状細胞調製物の第２のサンプルまたは該最適状態に及ばない量の抗原模倣物質と接触させる工程；
    該第２の量のＴ細胞についての第２の活性化値を決定する工程；ならびに
    該第１の活性化値および該第２の活性化値を比較して、該樹状細胞調製物の該同時刺激性活性を決定する工程
    を包含する、方法。
  25. 請求項２４に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、前記樹状細胞調製物に関して同種異系である、方法。
  26. 請求項２４に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、前記樹状細胞調製物に関して同系である、方法。
  27. 請求項２４に記載の方法であって、前記抗原模倣物質が、抗ＣＤ３抗体、植物性レクチンまたはマイトジェンである、方法。
  28. 請求項２４に記載の方法であって、前記樹状細胞による所定の抗原の提示を決定する工程をさらに包含する、方法。
  29. 請求項２８に記載の方法であって、前記所定の抗原の提示が、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリーまたは抗原特異的Ｔ細胞の活性化によって決定される、方法。
  30. 樹状細胞の調製物の品質を決定するための方法であって、該方法は、
    （１）所定の抗原について未知の同時刺激性活性および未知の抗原提示能力を有する樹状細胞調製物を提供する工程；
    （２）該樹状細胞調製物の該同時刺激性活性を決定する工程であって、該同時刺激性活性の決定は、
    （ａ）既知の機能的活性を有しかつ同時刺激性活性を実質的には有さないＴ細胞を提供する工程；
    （ｂ）該Ｔ細胞を、最適状態に及ばない量の抗原模倣物質および該樹状細胞調製物の第１のサンプルと接触させる工程；
    （ｃ）該接触されたＴ細胞の活性化を決定する工程；および、
    （ｄ）該接触されたＴ細胞の該決定された活性を、該Ｔ細胞についての標準的な活性化指標と比較して、該樹状細胞調製物の同時刺激性活性を決定する工程；
    を包含する工程、
    （３）該樹状細胞の調製物による該所定の抗原の提示を決定する工程であって、該提示の決定は、
    （ａ）該樹状細胞調製物の第２のサンプルを、該所定の抗原と接触させる工程；および、
    （ｂ）該樹状細胞によって提示された所定の抗原の量を決定する工程；
    を包含する工程、ならびに、
    （４）該決定された同時刺激性活性および該所定の抗原の決定された抗原特異的提示に基づいて、該樹状細胞調製物の品質を決定する工程
    を包含する、方法。
  31. 請求項３０に記載の方法であって、前記抗原模倣物質が、ＣＤ３結合性物質、植物性レクチンまたはマイトジェンである、方法。
  32. 請求項３１に記載の方法であって、前記ＣＤ３結合性物質が、抗ＣＤ３抗体である、方法。
  33. 請求項３０に記載の方法であって、前記樹状細胞が、成熟物質とエキソビボで接触させることによって未成熟樹状細胞から誘導される成熟樹状細胞である、方法。
  34. 請求項３０に記載の方法であって、前記樹状細胞が、未成熟樹状細胞である、方法。
  35. 請求項３０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、細胞表面上にＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ１４分子、ＣＤ５４分子、ＣＤ８０分子、ＣＤ８３分子またはＣＤ８６分子を発現する末梢血単核細胞について実質的には枯渇されている、方法。
  36. 請求項３０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、３Ｈ−チミジン増殖アッセイによって決定される、方法。
  37. 請求項３０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、Ｔ細胞サイトカイン産生をアッセイすることによって決定される、方法。
  38. 請求項３７に記載の方法であって、前記Ｔ細胞サイトカイン産生が、ＩＦＮγ産生またはインターロイキン２産生である、方法。
  39. 請求項３７に記載の方法であって、前記Ｔ細胞サイトカイン産生が、細胞外サイトカイン産生である、方法。
  40. 請求項３７に記載の方法であって、前記Ｔ細胞サイトカイン産生が、細胞内サイトカイン産生である、方法。
  41. 請求項３０に記載の方法であって、前記Ｔ細胞の活性化が、少なくとも１種のＴ細胞活性化マーカーの発現によって決定される、方法。
  42. 請求項４１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞活性化マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４またはＣＤ１２５である、方法。
  43. 請求項４１に記載の方法であって、前記Ｔ細胞活性化マーカーが、該Ｔ細胞活性化マーカーと結合可能な標識化抗体を使用して検出される、方法。
  44. 請求項３０に記載の方法であって、前記同時刺激性活性を決定する工程が、前記決定されたＴ細胞活性化を該Ｔ細胞についての標準的な活性化指標と比較する工程を包含する、方法。
  45. 請求項４４に記載の方法であって、前記標準的な活性化指標が、閾値である、方法。
  46. 請求項４４に記載の方法であって、前記標準的な活性化指標が、一定範囲の値であり、該値は、異なる所定の同時刺激性活性と関連付けられる、方法。
  47. 請求項３０に記載の方法であって、前記所定の抗原の提示が、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリーまたは抗原特異的Ｔ細胞の活性化によって決定される、方法。
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