KR20120004544A - 항원 제시 세포에 대한 정성적 검정법 - Google Patents

항원 제시 세포에 대한 정성적 검정법 Download PDF

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패트리시아 앤 롯지
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노쓰웨스트 바이오써라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 수지상 세포와 같은, 항원제시 세포 제제의 성질을 평가하기 위한 방법을 제공한다. T 세포의 항원-독립적 공동자극 및 APC에 의한 예정된 항원의 제시에 대한 검정을 제공한다.

Description

항원 제시 세포에 대한 정성적 검정법{Quality assays for antigen presenting cells}
항원-제시 세포(APC)는 효과적인 면역 반응을 유도하는 데 중요하다. APC는 항원-특이적 T 세포 수용체를 가진 T 세포에 항원을 제시할 뿐 아니라, T 세포 활성화에 필요한 시그날을 제공한다. 이들 시그날은 각종 세포 표면 분자 및 사이토킨 및/또는 성장 인자의 생산과 관련이 있다. 비접촉(naive) 또는 초회 항원자극되지 않은(unprimed) T 세포의 활성화에 필요한 시그날들은 이미 초회 항원자극된 면역기억(memory) T 세포의 재-활성화에 요구된 것들과 상이할 수 있다.
APC는 단핵구, B 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 비록 단핵구 및 B 세포의 항원 제시 능력이 이미 감작화된 T 세포의 재-활성화에 제한되는 것으로 나타났지만, 이들은 수용적격(competent) APC인 것으로 보인다. 이들 세포 유형은 기능상 비접촉성이거나 초회 항원자극되지 않은 T 세포 집단을 직접 활성화할 수 없다.
다른 측면에서, 수지상 세포는, 비접촉 및 이미 초회 항원자극된 T 세포 둘다를 활성화할 수 있다. 수지상 세포는 특징적 형태, 및 혈액을 포함하여, 광범위한 조직 분포를 갖는 이질성 세포 집단이다. (예를 들면, [문헌: Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-96(1991)]을 참조한다.) 수지상 세포의 세포 표면은 특징적 막-유사 돌기를 갖는 독특한 형태이다. 성숙한 수지상 세포는 일반적으로 CD11c+ HLA-DR+, CD86+, CD54+, CD3-, CD19-, CD14-, CD11c+ 및 HLA-DR+로 동정된다.
수지상 세포는 항원을 수용, 처리 및 제시하며, 비접촉성 초회 항원자극되지 않은 T-세포 및 면역기억 T 세포로부터 반응을 자극한다. 이들은 MHC-제한 T 세포를 감작화시키는 높은 능력을 가지며 T 세포에 항원을 제시하는 데 매우 효과적이다. 수지상 세포는 자가-항원(예를 들면, T 세포 발달 및 내성 중) 및 외래 항원(예를 들면, 면역 반응 중) 둘 다를 제시할 수 있다. 추가로, 수지상 세포는 또한 비-림프 조직과 직접적으로 소통하며 상해 시그날(예를 들면, 허혈, 감염 또는 염증) 또는 종양 성장에 대해 비림프 조직을 조사한다. 일단 시그날이 전달되면, 수지상 세포는 림프구 및 단핵구의 활성을 자극하는 사이토카인을 방출함으로써 면역 반응을 개시한다.
항원 제시에서 이들의 효능에 기인하여, 면역자극제(생체내 및 생체외 둘 다)로서 수지상 세포를 사용하는 데 관심이 고조되고 있다. 특히, 성숙한 수지상 세포는 표적 항원에 대해 제조될 수 있으며 이어서 피검체(예를 들면, 환자)에 투여되어 당해 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 예를 들면, 비성숙 수지상 세포는 표적 항원(들) 및 성숙화제(들)과 접촉하여 표적 항원에 특이적으로 활성화되고 성숙한 수지상 세포가 될 수 있다. 추가로, 세포 집단내의 성숙한, 항원-특이적 수지상 세포는 표적 항원에 특이적인 수지상 세포의 수를 증가시키기 위해 증폭될 수 있다.
수지상 세포 및 수지상 세포 전구체를 각종 방법으로 분리할 수 있다. 이들 세포 유형은 통상 낮은 빈도로 존재한다(예를 들면, 통상 백혈구의 약 1% 미만). 따라서, 수지상 세포 및 수지상 세포 전구체를 분리시키는 방법은 충분한 수의 세포를 제공하기 위해, 통상 실질적 정제만을 필요로 하거나, 생체외 배양을 함께 필요로 한다. 수지상 세포 및 이들의 전구체를 정제하는 방법은 예를 들면, 밀도 구배 분리, 형광 활성화 세포 분류, 패닝(panning)과 같은 면역학적 세포 분리 기법, 보체 용해, 로젯팅(rosetting), 자기 세포 분리 기법, 나일론 모직 분리 및 이러한 방법의 조합을 포함한다. (예를 들면, [문헌: O'Doherty et al., J.Exp.Med. 178:1067-76(1993); Young and Steinman, J.Exp.Med.171:1315-32(1990); Freudenthal and Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-702(1990); Macatonia et al., Immunol. 67:285-89(1989); Markowicz and Engleman, J.Clin. Invest. 85:955-61(1990); Bernllard et al., Cancer Res. 55:1099-104(1995); Caux et al., Nature 360:258-61(1992); 미국 특허 제5,994,126호 및 제5,851,756호를 참조한다.)
수지상 세포를 제조하는 데 사용될 수 있는 각종 방법에 기인하여, 수지상 세포 제제의 특성은 매우 다양할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포는 항원에 대해 반응하는 비접촉 T 세포를 활성화시키기 위한 이들의 능력이 다양할 수 있다. T 세포의 활성화는 2가지 시그날을 필요로 한다. 제1 시그날은 T 세포 수용체(TCR)을 통해 전달되며 T 세포의 항원 특이성을 정의한다("항원-특이적" 시그날). 제2 시그날 또는 공동 자극 시그날은 T 세포 및 수지상 세포상의 다중 수용체/리간드 쌍(공동 자극 쌍)에 의해 전달될 수 있다. T 세포 및 수지상 세포 각각에서 발현되는 이들 공동 자극 쌍은 CD28/CD152(CTLA-4) 및 CD80/CD86; 4-1BB 및 4-1BBL; CD27 및 CD70; LFA-1 및 CD54를 포함한다.
수지상 세포의 제제는 T 세포에 항원을 제시하는 이들의 능력이 다양할 수 있다. 예를 들면, 제제는 표적 항원을 제시하는 소수의 수지상 세포를 함유할 수 있다. 추가로, 수지상 세포의 제제는 T 세포에 대해 오직 소량의 표적 항원만을 제시할 수 있다. 이러한 제제는 생체내 및 생체외 둘다에서 면역자극 제제로서의 감소된 유용성을 갖는다.
수지상 세포 제제의 성질을 평가하기 위해 각종 검정이 사용되어 왔다. 이러한 검정은 예를 들면, 제제 내의 수지상 세포의 수 또는 비율(예를 들면, 성숙 및/또는 비성숙), 특정 세포 표면 마커의 존재, 수지상 세포의 표적 항원을 제시하는 능력, T 세포 활성화를 자극하는 능력 등의 측정을 포함한다.
APC 제제의 성질을 측정하기 위한 한 방법은 특정 APC-특이적 마커(예를 들면, "수지상 세포" 마커 CD83 및/또는 CD11c)를 나타내는 세포의 수 또는 비율을 측정하는 "면역표현형검사"이다. 그러나, 면역표현형검사는 T 세포 활성화에 참여하는 제제의 능력에 대해 거의 정보를 제공하지 못한다.
혼합된 백혈구 반응(MLR)은 동종항원에 대한 백혈구의 반응성을 측정하기 위해 사용되는 검정이다. 동종 백혈구(즉, 상이한 HLA 마커를 갖는)는 HLA 마커 사이의 상이함의 정도에 따라, 상이한 정도의 교차반응성을 나타내는 반면, 동계 백혈구(즉, 동일한 HLA 마커를 갖는)는 적은(만약 있다면) 교차반응성을 나타낸다. 따라서, MLR 반응은 동종항원 교차반응을 측정하는 데 유용하지만, 일반적으로 수지상 세포 제제의 다른 명목상 기능을 측정하는 데는 유용하지 않다.
따라서, 수지상 세포 제제의 성질을 측정하는 방법에 대한 필요가 계속되어 왔다. 본 발명은 이러한 필요 및 그 이상을 만족시킨다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 T 세포 자극 또는 피검체에 투여되는 면역자극 조성물의 제제에 사용되는 항원 제시 세포 제제의 성질의 평가 방법을 제공한다.
한 양태에서, 항원제시 세포(APC)의 항원-독립적 공동자극 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 공지된 기능 활성을 가지며 실질적으로 공동자극 활성이 없는 T 세포를 제공하는 단계 및 비공지된 공동자극 활성을 갖는 항원제시 세포(APC)의 샘플을 제공하는 단계를 포함한다. T 세포를 준최적 농도의 항원-유사제와 접촉시킨다. 또한 T 세포를 비공지된 공동자극 활성의 APC 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 항원-유사제 및 APC 샘플과 접촉된 T 세포의 활성화를 측정하고 T 세포에 대한 표준 활성화 지수와 비교하여 APC의 항원 독립적 공동자극 활성을 측정한다. 세포에 의해 수용되고, 처리 및/또는 제시된 예정된 항원의 정성적 또는 정량적 양을 또한 측정할 수 있다. 전형적으로, 항원 수용, 처리 및/또는 제시는 예를 들면, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 유동 세포계수법 또는 항원-특이적 T 세포의 활성화에 의해 측정된다.
본 발명의 방법에 사용된 T 세포는 비공지된 활성을 갖는 항원제시 세포와 동계 또는 동종일 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용된 T 세포는 말초혈액 단핵 세포로부터 분리된다. 당해 방법에 사용된 T 세포는 이들의 표면에 제II형 MHC, CD14, CD54, CD80, CD83 및/또는 CD86 분자를 발현하는 세포가 고갈된 말초혈액 단핵 세포의 샘플로부터의 T 세포를 포함할 것이다.
본 발명의 방법에 사용된 항원-유사제는 통상 CD3에 특이적인 항체, 식물 렉틴 또는 비식물 기원 유사분열제과 같은 CD3 결합제이지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에 사용되는 항원 제시 세포는 통상 비성숙 수지상 세포 또는 성숙 수지상 세포이다. 성숙 수지상 세포는 수지상 세포 성숙화제와 생체외에서 접촉한 비성숙 수지상 세포로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 방법 중 T 세포의 활성화는 예를 들면, 증식중인 T 세포의 DNA내로 삽입된 방사선 표지된 티미딘의 양 측정, T 세포 사이토카인(즉, IFNγ또는 인터루킨 2)의 생산 검정 또는 CD25, CD69, CD44 또는 CD125와 같은(이에 제한되지는 않지만) T 세포 활성화 마커의 변화를 검정함으로써 의해 측정될 수 있다. 세포외 또는 세포내 T 세포 사이토카인의 양을 측정할 수 있다. 추가로, T 세포 활성 마커의 변화는 예를 들면, T 세포 활성 마커에 특이적인 표지된 항체를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 방법은 항원제시 세포의 T 세포 활성화를 당해 방법에 사용된 T 세포의 표준 활성화 지수와 비교함으로써 항원 제시 세포의 항원-독립적 공동자극 활성을 측정한다. 표준 활성화 지수는 역치 값 또는 각각 수지상 세포의 예정된 성질과 관련된 값의 범위로 표현될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 수지상 세포 제제의 항원-독립적 공동자극 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 실질적으로 공동자극 활성이 없고 공지된 기능 활성을 갖는 T 세포의 제1 양을 준최적량의 항원-유사제 및 비공지된 공동자극 활성의 수지상 세포 제제의 제1 샘플과 접촉시키는 단계를 포함한다. T 세포의 제1 양에 대한 제1 활성화 값을 측정한다. 이어서 T 세포의 제2 양을 수지상 세포 제제의 제2 샘플 또는 준최적량의 항원-유사제와 접촉시키고 T 세포의 제2 양에 대한 제2 활성화 값을 측정한다. 제1 및 제2 활성화 값을 비교하여 수지상 세포 제제의 공동자극 활성을 측정한다.
본 발명의 다른 양태에서, 수지상 세포 제제의 성질을 측정하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 예정된 항원에 대한 비공지된 공동자극 활성 및 비공지된 항원제시 능력을 갖는 수지상 세포 제제를 제공하는 단계; 수지상 세포 제제의 공동자극 활성을 측정하는 단계; 및 예정된 항원에 대한 수지상 세포 제제의 항원 제시 능력을 정성적 또는 정량적으로 측정하는 단계를 포함한다. 이들 값을 조합함으로써, 예정된 항원에 대해 T 세포를 활성화시키는 것에 대한 수지상 세포 제제의 성질을 평가할 수 있다.
수지상 세포 제제의 공동자극 활성은 공지된 기능 활성을 가지며 실질적으로 공동자극 활성이 없는 T 세포를 제공하고 당해 T 세포와 준최적량의 항원-유사제 및 수지상 세포 제제의 제1 샘플을 접촉시킨 후, 접촉된 T 세포의 활성화를 측정하고 접촉된 T 세포의 측정된 활성화와 T 세포의 표준 활성화 지수를 비교하여 수지상 세포 제제의 공동자극 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
수지상 세포 제제에 의한 예정된 항원의 제시는 수지상 세포 제제의 제2 샘플과 예정된 항원을 접촉시키고 예정된 항원이 수지상 세포 제제의 세포에 의해 수용되거나, 처리되거나 수지상 세포 제제의 제2 샘플의 세포의 표면에 제시되었는지의 여부 또는 이의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명은 T 세포 자극에 사용하기 위한, 또는 피검체 투여용의 면역자극 조성물로서의 수지상 세포와 같은 항원제시 세포 제제의 성질을 평가하기 위한 방법을 제공한다. T 세포의 항원 독립적 공동자극(또한 공동자극 활성으로 지칭됨) 및 APC에 의한 예정된 항원의 제시에 대한 검정을 APC의 제제의 성질을 측정하기 위해 사용할 수 있다.
한 측면에서, APC의 제제의 성질은 항원-독립적, T 세포 공동자극(또는 효능)검정에 의해 측정할 수 있다. 통상, 공지된 기능 활성의 T 세포를 항원-특이적 시그날을 모방하는 항원-유사제와 접촉시킨다. 또한 당해 T 세포를 비공지된 공동자극 활성의 APC와 접촉시킨다. 이어서 T 세포의 활성화를 측정하고 APC의 성질을 측정하기 위해 사용한다.
다른 측면에서, APC 제제의 성질은 예정된 항원을 제시하는 APC의 능력에 의해 측정할 수 있다. 통상, APC 제제를 예정된 항원과 접촉시킨다. 항원 수용을 허용하는 적합한 기간 동안 항온처리한 후, APC에 의한 예정된 항원의 제시를 측정할 수 있다.
항원-독립적 T 세포 공동자극(효능) 검정
항원-독립적 T 세포 공동자극 검정에 의한 APC의 성질 측정을 위해, 공지된 기능 활성의 T 세포를 항원-특이적 시그날을 모방하는 항원-유사제와 접촉시킨다. 비공지된 공동자극 활성의 APC를 당해 T 세포와 접촉시키고, 이어서 T 세포의 활성을 측정하고 APC의 성질을 측정하기 위해 사용한다. T 세포 활성화는 T 세포 및 APC의 공동-배양 중 및/또는 후에 측정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, T 세포의 활성화는 APC와의 접촉에 대한 반응으로 인한 하나 이상의 T 세포 기능의 변화를 조사함으로써 평가할 수 있다. 적합한 T 세포 기능은 예를 들면, 증가된 세포 증식과 연관된 DNA 복제의 증가, 세포외 및/또는 세포내 사이토카인 생산의 변화, T 세포 활성화 마커의 변화 및 T 세포의 항원제시 세포에 대한 기타 반응(예를 들면, 항원-특이적 시그날 및 공동자극 시그날)을 포함한다.
당해 검정에 사용된 T 세포는 강화된 T 세포제제, APC-고갈 T 세포 제제 또는 실질적으로 정제된 T 세포 제제(하기 참조)일 수 있다. 당해 T 세포는 공지된 기능 활성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 공지된 기능 활성은 동일한 공동자극 시그날(APC로부터의) 및 동일한 농도의 항원-유사제에 대한 T 세포의 재현성 반응을 지칭한다. 예를 들면, 공지된 기능 활성은 동일한 양의 공동자극 시그날 및 항원-유사제에 대한 반응인, 예정된 증식(예를 들면, 3H-티미딘의 삽입에 의해 측정된 DNA 복제), 세포외 사이토카인 생산, 세포내 사이토카인 생산 및/또는 T 세포 활성화 마커의 발현일 수 있다. T 세포의 예정된 기능 활성은 본원에 기술한 방법 전, 동시 또는 후에 측정할 수 잇다.
항원-유사제는 예를 들면, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체의 항원 결합 단편 또는 T 세포 수용체에 결합하고 항원-유사 시그날을 제공할 수 있는 다른 분자일 수 있다. 특정 양태에서, 항원-유사제는 CD3 결합 항체와 같은 CD3 결합제, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 양태에서, CD3 결합제는 T 세포 수용체의 불변 CD3 성분에 결합하는 모노클로날 항체(예를 들면, OKT3)이다. (예를 들면, 본원에 참조로 인용되어 있는 문헌[Thomas et al., J.Immunol.151:6840-52(1993)]을 참조한다.) 다른 양태에서, CD3 결합제는 CD3 또는 T 세포 수용체의 다른 부위에 결합하는 폴리클로날 항체이며, 항원-특이적 시그날을 모방한다.
추가의 양태에서, 항원-유사제는 예를 들면, 준최적 농도에서 APC에 의해 제공된 공동자극 시그날과 결합되어 T 세포를 활성화시키는 자극을 제공하는 식물 렉틴 또는 유사분열제일 수 있다. 그러나, 공동자극 시그날의 부재시, 준최적 농도 또는 양의 식물 렉틴 또는 유사분열제는 최대의 T 세포 활성화를 자극하기에 충분하지 않다. 적합한 식물 렉틴은 예를 들면, 콘카나발린(concanavalin) A, 식물적혈구응집소, 밀배아응집소, 억새풀 유사분열제 등을 포함한다. 비식물 기원의 적합한 유사분열제는 예를 들면, 스타필로코칼(Staphylococcal) 장독소 A, 스트렙토코칼(Streptococcal) 단백질 A, 포볼 미리스틱 아세테이트(PMA) 등을 포함한다.
T 세포를 통상 준최적 농도 또는 양의 항원-유사제와 접촉시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, "준최적 농도" 또는 "준최적 양"은 혼자서는 최대의 T 세포 활성화를 자극시킬 수 없는 항원-유사제의 농도 또는 양을 지칭한다. 전형적인 양태에서, 항원-유사제의 준최적 농도 또는 양은 APC에 의해 제공된 공동자극 시그날의 목적하는 범위에 걸쳐 T 세포에 의해 선형 반응(즉, 활성화)이 일어나게 한다. 다른 양태에서, 항원-유사제의 준최적 농도 또는 양은 APC로부터의 공동자극 시그날의 역치 수준 이상으로 T 세포를 활성화시킨다.
특정 양태에서, 항-CD3 항체의 적합한 양은 약 0.05 내지 약 20ng/100㎕, 또는 약 50ng/100㎕ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 다른 양태에서, 식물 렉틴 및 비식물 기원의 유사분열제의 비최적 농도 또는 양을 사용한다. 사용되는 식물 렉틴 또는 비식물 기원의 유사분열제의 농도 또는 양은 선택된 조성물에 따를 것이다. 식물 렉틴 또는 비식물 기원의 유사분열제의 최적 농도는 통상 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 준최적 농도는 용이하게 선택할 수 있다. 예를 들면, PHA의 최적 농도는 1 내지 5㎍/㎖이고, 본 발명의 양태에서 1㎍/㎖ 미만은 준최적 농도로 사용될 수 있다. 적합한 양 또는 수량의 T 세포 및 APC를 접촉시킬 수 있다. 특정 양태에서, 당해 검정은 APC 대 T 세포의 낮은 비율로 수행한다. 이러한 비율은 예를 들면 약 1:3 APC 대 T 세포 내지 약 1:100 APC 대 T 세포의 범위일 수 있다.
T 세포를 APC와 공동배양하기 전에 항원-유사제와 접촉시킬 수 있다. 예를 들면, T 세포를 조직 배양 또는 미세역가 플레이트의 웰 내에 고정시킨 준최적 농도의 항원-유사제와 접촉시킬 수 있다. 대안적으로, T 세포, APC 및 항원-유사제를 동일한 시간에 또는 거의 동일한 시점에 접촉시킬 수 있다.
실시적 양태에서, 항원-유사제를 배양 디쉬(예를 들면, 평저, 96-웰 플레이트)에 고정시킬 수 있다. 적합한 양의 항원-유사제, 예를 들면, 항-CD3 모노클로날 항체는 예를 들면, 96 웰 플레이트의 웰 당 약 0.1 내지 약 50ng, 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 고정시킨 후, 통상 당해 웰을 세척하여 비결합된 항원-유사제를 제거한다. 다른 양태에서, 다른 항온처리 시간 및 환경을 사용할 수 있다.
APC의 적합한 제제는 예를 들면, 수지상 세포 및 단핵구를 포함한다. 다른 양태에서, APC는 예를 들면, B 세포, T 세포 또는 상피 또는 내피 세포와 같은 활성화된 비-명목 APC일 수 있다. APC는 비성숙하거나 성숙할 수 있다. APC 및 T 세포를 비록 다소의 시간이 본 발명의 영역내에 있을 수 있지만, 통상 약 6 내지 약 48시간 동안 공동 배양한다. 통상 적합한 시간 동안 공동배양을 수행하여 T 세포를 활성화시키지만, 현저한 수의 비성숙 APC 또는 APC 전구체의 분화 및/또는 성숙에 필요한 시간 미만이다.
T 세포 활성화는 T 세포 및 APC의 공동배양 중 및/또는 후에 측정할 수 있다. T 세포 활성화에 대한 적합한 검정은 예를 들면, DNA 복제 검정(예를 들면, 3H-티미딘 삽입), 세포외 및/또는 사이토카인 생산 검정(예를 들면, ELISA, 유동 세포계수법 등) 및 T 세포 활성화 마커 검정(예를 들면, 유동 세포계수)를 포함한다.
T 세포의 활성화는 예를 들면, 표지된 티미딘 삽입(예를 들면, 3H-티미딘 삽입 또는 다른 적합한 표지)에 의해 측정될 수 있는, DNA 복제와 같은 T 세포 증식과 관련될 수 있다. T 세포 및 APC의 공동 배양물은 약 6 내지 약 24시간 동안 표지물(예를 들면, 3H-티미딘, 약 1μCi/웰)을 사용하여 펄스시킬 수 있다. 이어서 당해 세포를 수집할 수 있고(예를 들면, 세포 수집기를 사용하여) 삽입된 방사선을 액체섬광분광법으로 측정할 수 있다. 특정 양태에서, APC를 T 세포와 공동 배양하기 전에 비활성화시켜 APC DNA 복제를 예방할 수 있다. 대안적으로, T 세포를 APC로부터 분리한 후, 삽입된 표지량을 측정할 수 있다.
또한 T 세포 활성화는 세포외 또는 세포내 사이토카인 생산(예를 들면, IFNγ 및/또는 IL-2 생산) 등에 의해 측정할 수 있다. 세포외 사이토카인 생산은 배양 배지 중 하나 이상의 사이토카인의 수준의 변화를 측정함으로써 계측할 수 있다. 다른 검정 또한 적합할 수 있지만, 통상 면역검정(예를 들면, ELISA 검정, 샌드위치 검정, 면역침전 검정 또는 웨스턴 블롯팅)을 사용할 수 있다. (예를 들면, 본원에 참조로서 인용된 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1999)]을 참조한다.) 세포내 사이토카인 수준을 위해, 면역검정 또는 다른 검정을 사용할 수 있다. T 세포를 세포내 사이토카인 수준에 대해 검정하기 전, 임의로 APC로부터 분리(예를 들면, T 세포 마커의 발현을 기준으로 한 수집에 의해)할 수 있다. (예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, 상기 참조]을 참조한다.)
추가의 양태에서, T 세포 활성화는 T 세포 활성화 마커의 변화에 의해 측정할 수 있다. 이러한 마커는 예를 들면, CD25(또한 인터루킨 2 수용체 알파 쇄로 지칭됨), CD69(또한 VEA 또는 AIM으로 지칭됨), CD44(또한 Pgp-1으로 지칭됨), CD125(또한 IL-2 수용체 베타 쇄로 지칭됨) 등을 포함한다. T 세포 활성화 마커의 변화는 예를 들면, 단백질 수준 또는 mRNA 수준의 변화를 측정함으로써 계측할 수 있다. 예를 들면, 단백질 수준내의 변화는 T 세포 활성화 마커, 전사 인자 또는 T 세포 활성화에 연관된 다른 단백질에 대한 표지된 항체를 사용하는 유동 세포계수법, ELISA 또는 웨스턴 블롯팅과 같은 면역검정 등에 의해 측정될 수 있다. mRNA 수준의 변화는 T 세포 활성화 마커, 전사 인자 등을 암호화하는 메시지에 대해 측정할 수 있다. mRNA 수준은 예를 들면, 노던 블롯팅, 폴리머라제 연쇄 반응(예를 들면, RT-PCR), 다른 하이브리드화 검정(예를 들면, GeneChipR 프로브 배열을 사용한 검정 등) 또는 기타 검정에 의해 측정될 수 있다. (예를 들면, 본원에 참조로서 인용된 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, NY(2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York(1999)]; 미국 특허 번호: 제5,444,934호; 제5,532,128호; 제5,556,752호; 제5,242,974호; 제5,384,261호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,472,672호; 제5,527,681호; 제5,529,756호; 제5,545,531호; 제5,554,501호; 제5,561,071호; 제5,571,639호; 제5,593,839호; 제5,599,695호; 제5,624,711호; 제5,658,734호; 및 제5,700,637호를 참조한다.)
활성화 검정(측정 활성화)에 의해 측정된 T 세포의 활성화를 임의로 단독의 항원-유사제, 및/또는 APC와 접촉시킨 T 세포의 배경 활성화에 의해 조정(즉, 감소)할 수 있다. 추가로, 활성화를 T 세포 제제내의 비-T 세포(예를 들면, B 세포, NK 세포 등)의 배경 수준에 대해 임의로 조정할 수 있다.
측정된 활성화(배경 활성화의 공제 유무)를 T 세포에 대한 표준 활성화 지수와 비교하여 APC(예를 들면, 수지상 세포)의 공동자극 활성을 측정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표준 활성화 지수는 APC의 항원 독립적, 공동자극 활성을 사용하거나 이와 관련될 수 있는 정량적 값 또는 일련의 값을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 표준 활성화 지수는 역치 값일 수 있다(예를 들면, 3H-티미딘 삽입 수준, 세포외 또는 세포내 사이토카인 생산 수준 또는 하나 이상의 T 세포 활성화 마커의 존재 및/또는 부재). 또한 표준 활성화 지수는 APC에 의한 T 세포 공동자극의 상이한 수준과 관련된 일련의 값일 수 있다(예를 들면, 3H-티미딘 삽입의 상이한 양, 세포외 또는 세포내 사이토카인 생산량 또는 T 세포 활성화 마커(들)의 존재 및/또는 부재). 다른 양태에서, 표준 활성화 지수는 정성적일 수 있다(예를 들면, 하나 이상의 T 세포 활성화 마커의 존재 및/또는 부재, 사이토카인 생산의 존재 또는 부재 등). 예를 들면, 특정 양태에서, 표준 활성화 지수는 T 세포 활성화 정도 또는 수준을 측정하기 위한 15,000 cpm의 3H-티미딘 삽입과 관련될 수 있으며, 이는 APC의 공동자극(또는 효능)의 정도 또는 수준에 직접적으로 비례할 수 있다.
특정 양태에서, 표준 활성화 지수는 APC(비공지된 효능의)와 T 세포 및 항-CD3 항체의 접촉으로 기인한 활성화(예를 들면, cpm) 대 T 세포 및 항-CD3 항체의 접촉(APC 없이)으로 기인한 활성화의 비율로서 측정될 수 있다. 수득된 값은 APC 공동자극 활성 또는 효능의 지수일 수 있다.
표준 활성화 지수는 T 세포의 개별 제제를 사용하여 측정하거나 하나 이상의 T 세포 제제를 기준으로 하여 표준화시킬 수 있다. 특정 양태에서, 표준 활성화 지수는 참조 T 세포 제제 또는 T 세포주 및 참조 APC 제제 또는 APC 세포주를 사용하여 측정할 수 있다.
측정된 활성화 및 상응하는 표준 활성화 지수(또는 지수들)은 전형적으로 APC의 공동자극 활성에 직접적으로 비례한다. 따라서, APC 공동자극 활성은 예를 들면, 조사, 동물 연구, 임상 시험 및 다른 기타 임상학적 용도를 위해 APC를 정성화하는 데 사용될 수 있다. 추가로, APC 공동자극 활성 검정은 APC 제제의 일관성을 측정하기 위해 사용하거나 APC 제품(예를 들면, 세포성 백신 제품)에 대한 품질 관리 검정으로 사용할 수 있다.
APC 항원 제시 검정
본 발명의 다른 측면에 따라, APC 제제에 의한 예정된 항원의 제시를 측정함으로써 APC의 제제의 성질을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 위에 개시한 바와 같이, APC의 제제는 항원을 수용, 처리 및 제시하는 이들의 능력에 있어 다양할 수 있다. 예를 들면, 성숙한 수지상 세포는 일반적으로 신규한 항원을 수용, 처리 및 제시하는 감소된 능력을 나타낸다. 대조적으로, 비성숙 수지상 세포는 일반적으로 항원을 효과적으로 수용하지만, 성숙시까지 항원을 효과적으로 처리 및 제시하지는 않는다. 항원 제시는 검정될 세포 유형에 따라, 특정한 예정된 항원, 또는 항원의 그룹 또는 샘플을 수용, 처리 및 제시하는 APC의 능력의 측정 기준일 수 있거나, 이와 관련될 수 있다.
항원 제시를 측정하기 위해, APC의 샘플을 하나 이상의 예정된 항원과 접촉시킬 수 있다. APC를 배양하여 예정된 항원(또는 이의 에피토프)을 수용 및 임의로, 처리 및/또는 제시하도록 배양시킬 수 있다. APC에 의해 제시된 예정된 항원의 양은 예를 들면, APC 내의 하중 및/또는 처리의 측정에 의한 제시, 및/또는 통상 MHC 분자와 관련된, APC의 표면상의 제시와 관련될 수 있다. 이들 검정은 총체적으로 "제시 검정" 또는 "제시"로 지칭된다.
예정된 항원은 예를 들면, 세균 또는 바이러스 항원, 종양-특이적 또는 종양-관련 항원(예를 들면, 종양 세포 용해물, 종양 세포 막 제제, 종양으로부터 분리된 항원(들), 융합 단백질 또는 리포좀) 또는 다른 항원일 수 있다. 예시적 양태에서, 항원은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이다.
특정 양태에서, 예정된 항원 제시량은 APC에 의한 항원의 적재와 관련될 수 있다. 예를 들면, APC를 항원과 함께 적재하고, 세포를 수집하고, 임의로 세척하여 세포 외에 잔존하는 항원을 제거시킬 수 있다. 세포 용해물을 제조하고, 면역검정에 의해 당해 용해물을 분석하여 APC에 의해 적재된 예정된 항원량을 측정할 수 있다. 이러한 검정은 웨스턴 블롯팅, ELISA 검정, 면역침전 등을 포함한다. (예를 들면, 상기한 문헌[Harlow and Lane]을 참조한다.)
추가의 양태에서, 예정된 항원의 제시는 APC의 표면상에 제시된 항원(또는 이의 에피토프)를 검출함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 예정된 항원과 접촉된 APC를 삼투압 충격 등에 의해 가용성 제제(예를 들면, TWEENR, 나트륨 도데실 설페이트 또는 NP40R)로 처리할 수 있다. 방출된 항원(또는 이의 에피토프(들)은 예를 들면, 면역검정(예를 들면, ELISA, 면역검정 등)에 의해 검출될 수 있다. 예정된 항원 또는 항체는 임의로 검출가능하게 표지시킬 수 있으며(예를 들면, 방사선동위원소, 형광단, 화학발광 표지, 효소 등을 사용하여), 방출된 항원은 적합한 검출 방법(예를 들면, 섬광계수법)을 사용하여 검출할 수 있다.
관련 양태에서, 항원 제시는 유동 세포계수법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, APC를 예정된 항원과 접촉시키킨 후 적합한 기간 동안 항온처리하고, 접촉된 APC를 항원 특이적 표지로 염색하고 세포 표면에 제시된 항원의 양을 검출할 수 있다. 적합한 표지는 예를 들면, 표지된 항체 또는 항원에 특이적인 다른 결합제 또는 이의 일부이다.
항원 제시는 또한 항원-특이적 T 세포주와 같은, 항원-특이적 T 세포를 사용함으로써 측정할 수 있다. APC를, 항원을 수용, 처리 및 제시하도록, 예정된 항원과 접촉시키고 배양할 수 있다. 항원 제시는 본원에 기재된 바와 같이, 항원-특이적 T 세포의 활성화를 계측함으로써 측정할 수 있다(예를 들면, DNA 복제, 세포외 또는 세포내 사이토카인 생산, T 세포 활성화 등을 측정함으로써).
T 세포 및 APC 제조
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 T 세포를 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 항원-독립적 공동자극 검정을 위해, T 세포는 강화된 T 세포 제제, APC-고갈 T 세포 제제 또는 실질적으로 정제된 T 세포 제제(하기 참조)일 수 있다. T 세포 또는 T 세포의 서브세트는 각종 림프성 조직으로부터 수득할 수 있다. 이러한 조직은 비장, 림프절 및 말초 혈액을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. T 세포는 혼합된 T 세포 집단 또는 정제된 T 세포 서브세트일 수 있다.
특정 양태에서, T 세포는 T 세포의 수 또는 퍼센트가 T 세포의 분리된 집단의 측면에서 증가된 강화된 T 세포 제제이다. 다른 양태에서, T 세포는 실질적으로 APC가 없으며, 대부분의 APC(예를 들면, >75%)는 T 세포로부터 분리되어 있다. 실시적 양태에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 헤파린화된 바이알내에서와 같이 혈액으로부터 수득될 수 있다. PBMC는 원심분리에 의해 적혈구로부터 분리될 수 있으며(예를 들면, HISTOPAQUER 1077(Sigma Aldrich Co.)) PBMC는 접촉면으로부터 회수된다. 회수한 PBMC는 임의로 세척할 수 있다(예를 들면, PBS를 사용하여).
예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD19 및/또는 제 II형 MHC 분자에 대해 지시된 항체의 사용을 포함한(이에 제한되지는 않음) 양성 또는 음성 선택에 의해, T 세포 정제를 수행할 수 있다. 본 발명에 유용한 T 세포 제제는 통상 CD4+ 또는 CD4+ 및 CD8+의 혼합된 집단이다. 특정 양태에서, T 세포 집단은 약 50% 이상의 T 세포를 함유한다. 추가의 양태에서, T 세포는 분리된 T 세포주일 수 있다.
APC-고갈 T 세포는 공동자극 시그날을 제거하는 것으로부터 제조할 수 있다. 공동자극 시그날은 예를 들면, 제II형 MHC 분자에 대한 항체를 사용하여 "패닝"시킴으로써 제거할 수 있다. 예를 들면, T 세포 또는 PBMC를 제II형 MHC 분자에 특이적인 항체에 커플링시킨 자성 비드와 접촉시켜 공동자극 시그날을 제거할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 공동자극 시그날이 없는 T 세포는 무의미한 수준의 T 세포 활성화를 나타낸다(예를 들면, 충분히 활성화된 T 세포의 활성화의 약 5% 미만 또는 약 1% 미만).
사람 및 사람외 영장류, 다른 포유 동물 및 척추동물을 포함하여, 각종 제공원으로부터 APC를 제조할 수 있다. 특정 양태에서, APC는 사람 또는 사람외 척추동물의 혈액으로부터 제조할 수 있다. 또한 APC는 백혈구의 강화된 집단으로부터 분리할 수 있다. 백혈구의 집단은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 헤파린화된 혈액 수집, 아페레시스(apheresis) 또는 백혈구 아페레시스, 백혈구연층 제조, 로젯팅, 원심분리, 밀도구배 원심분리(예를 들면, Ficoll(FICOLL-PAQUER와 같은), PERCOLLR(콜로이드성 실리카 입자), 슈크로스 등을 사용), 비백혈구 세포의 분별 용해, 여과 등을 포함한다. 또한 백혈구 집단은 피검체로부터 혈액을 수집하고, 탈피브린화하여 혈소판을 제거하고 적혈구를 용해시켜 제조할 수 있다. 당해 백혈구 집단은 또한 단핵성 수지상 세포 전구체에 대해 임의로 강화시킬 수 있다.
혈액 세포 집단은 백혈구의 강화된 집단의 바람직한 용도에 따라, 각종 피검체로부터 수득할 수 있다. 당해 피검체는 건강한 피검체일 수 있다. 대안적으로, 혈액 세포를 예를 들면, 암 환자 또는 면역자극이 유리할 것인 다른 환자와 같이, 면역자극을 필요로하는 피검체로부터 수득할 수 있다. 또한, 혈액 세포는 예를 들면, 자가면역 장애(예를 들면, 류마티스 관절염, 당뇨병, 루푸스, 다발성경화증 등)을 갖는 환자와 같이 면역 억제를 필요로하는 피검체로부터 수득할 수 있다. 또한 백혈구 집단은 HLA-매치된 건강한 개인으로부터 수득할 수 있다.
특정 양태에서, 단핵성 수지상 세포 전구체는 예를 들면, 강화된 백혈구 또는 단백구와 단핵성 수지상 세포 전구체 부착 기질을 접촉시켜 분리할 수 있다. (예를 들면, 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌인, 미국 가특허 출원 제60/307,978호(2001, 7월 25일 출원)을 참조한다). 간략하게, 강화된 백혈구 또는 단핵구의 집단이 기질과 접촉된 경우, 세포 집단내의 단핵성 수지상 세포 전구체, 또는 단핵구는 기질에 부착된다. 다른 백혈구는 기질에 대한 감소된 결합 친화성을 나타내며, 이에 따라 단핵성 수지상 세포 전구체가 기질의 표면상에서 우선적으로 강화되게 한다.
적합한 기질은 예를 들면, 유리 입자, 플라스틱 입자, 유리-피복된 플라스틱 입자, 유리-피복된 폴리스티렌 입자, 미세모관 및 미세융모막과 같은 입자성 기질을 포함한다. 당해 기질의 표면을 임의로 단핵성 수지상 세포 전구체의 기질에 대한 부착력을 증강시키도록 처리할 수 있다. 당해 기질의 표면은 예를 들면, 단백질; 사이토카인(예를 들면, 과립백혈구/대식세포 콜로니 자극 인자, 인터루킨 4 및/또는 인터루킨 13); 혈장(예를 들면, 자가 또는 동종 혈장); 단핵성-결합 단백질 등으로 피복시킬 수 있다.
백혈구- 또는 단핵구-강화 세포 집단을 단핵성 수지상 세포 전구체 부착 기질과 접촉시킨 후, 단핵성 수지상 세포 전구체를 기질에 부착시켜 기질상에 단핵성 수지상 세포 전구체를 포함하는 복합체를 형성한다. 단핵성 수지상 세포 전구체 결합을 예를 들면, 항-세포 표면 마커 항체(예: 항-CD14 항체)를 사용하는 항체 검출, FACS 전방 및 측면 산란 분석 등에 의해 관찰할 수 있다. 일부 양태에서, 백혈구 집단을 기질과 약 5 내지 약 300분 동안, 보다 전형적으로는 약 30 내지 약 120분 동안 접촉시킨다.
단핵성 수지상 세포 전구체 복합체는 임의로 적합한 세척 완충액을 사용하여 세척하여 비-특이적으로 결합한 백혈구를 제거할 수 있다. 적합한 세척 완충액은 조직 배양 배지(예를 들면, AIM-V, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15 등), 인산완충염, Dulbecco 인산완충염 등이 포함된다. 당해 배지를 아미노산, 비타민 및/또는 호르몬 등으로 보충하여 단핵성 수지상 세포 전구체의 생존능 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있다. 세척 효능은 세척 완충액의 FACS 전방 및 측면 산란 분석, 세포 표면 마커에 대한 용출된 세포의 염색 등에 의해 관찰할 수 있다. 통상, 당해 복합체를 수회 세척하여 비특이적으로 결합된 백혈구를 제거한다.
부착된 단핵성 수지상 세포 전구체를 기질로부터 용출시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 전구체를 0.4% EDTA 또는 다른 무독성 킬레이트 제제를 함유하는 인산완충염으로 처리하여 기질로부터 용출시킬 수 있다. 단핵성 수지상 세포 전구체를 통상 트립신 또는 다른 프로테아제를 사용하지 않고 기질로부터 용출시킨다.
다른 양태에서, 수지상 세포를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 방법에 따라 분리할 수 있다. (예를 들면, 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[O'Doherty et al., J.Exp.Med.178:1067-76(1993); Young and Steinman, J. Exp. Med.171:1315-32(1990); Freudenthal and Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-702(1990); Macatonia et al., Immunol. 67:285-89(1989); Markowicz and Engleman, J.Clin.Invest. 85:955-61(1990); 미국 특허 제5,994, 126호 및 제5,851,756호]를 참조한다.) 수지상 세포를 면역-선택하기 위한 방법에는 예를 들면, 수지상 세포 전구체와 관련된 세포 표면 마커에 대한 항체, 예를 들면, 기질에 커플링된 항-CD34 및/또는 항-CD14 항체(예를 들면, 문헌[Bernhard et al., CancerRes. 55:1099-104(1995); Caux et al., Nature 360:258-61(1992)를 참조한다) 또는 충분히 분화된 수지상 세포와 관련된 세포 표면 마커(예를 들면, CD11c, CD54, CD83, CD80, CD86 등)에 대한 항체를 사용하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, APC는 염증 또는 다른 활성화 조건하의 비명목 APC일 수 있다. 예를 들면, 비명목 APC는 인터페론-감마, T 세포, B 세포 및/또는 APC 활성을 유도하는 인자 또는 조건에 의해 활성화된 단핵구를 사용하여 자극시킨 상피 세포를 포함할 수 있다. 이러한 비명목 APC는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
APC 의 배양, 증폭 및 분화
필요에 따라, APC의 유형에 따라 APC를 배양, 증폭, 분화 및/또는 성숙시킬 수 있다. APC를 예를 들면, 배양 플레이트, 플라스크, 배양낭, 생반응기 등과 같은 임의의 적합한 배양 용기 내에서 배양시킬 수 있다. (예를 들면, 미국 가특허 출원 제60/307,978호(2001년 7월 25일 출원)을 참조한다.)
특정 양태에서, APC를 적합한 배양 또는 성장 배지 내에서 배양시켜 제제 내의 APC의 수를 유지시키고/거나 증폭시킬 수 있다. 배양 배지를 분리된 APC 유형에 따라 선택할 수 있다. 예를 들면, 성숙한 수지상 세포와 같은 성숙한 APC를 이들의 유지 및 증폭에 적합한 성장 배지(예를 들면, AIM-V, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15 등)내에서 배양시킬 수 있다. 배양 배지를 아미노산, 비타민, 항생제, 이가양이온 등으로 보충할 수 있다. 추가로, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 호르몬을 성장 배지내에 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 성숙한 수지상 세포의 유지 및/또는 증폭을 위해, 과립백혈구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및/또는 인터루킨 4(IL-4)와 같은 사이토카인을 통상 약 500단위/㎖의 농도로 첨가할 수 있다.
다른 양태에서, 비성숙 APC를 배양 및/또는 증폭시킬 수 있다. 비성숙 수지상 세포는 이들이 신규한 항원을 수용 및 처리하는 능력을 유지하기 때문에 본 발명의 특정 측면에 바람직할 수 있다. (예를 들면, 문헌[Koch et al., J. Immunol. 155: 93-100(1995)]를 참조한다.) 실시적 양태에서, 비성숙 수지상 세포는 이들의 유지 및 배양에 적합한 배지(예를 들면, AIM-V, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15 등) 내에서 배양시킬 수 있다. 배양 배지를 아미노산, 비타민, 항생제, 이가양이온 등으로 보충할 수 있다. 추가로, 사이토카인, 성장 인자 및/또는 호르몬을 성장 배지에 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 비성숙 수지상 세포의 유지 및/또는 증폭을 위해, 과립백혈구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및/또는 인터루킨 4(IL-4)와 같은 사이토카인을 통상 약 500단위/㎖의 농도로 첨가할 수 있다.
다른 비성숙 APC는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 유사하게 배양 또는 증폭시킬 수 있다.
비성숙 APC의 제제를 성숙시켜 성숙한 APC를 형성할 수 있다. APC의 성숙은 비성숙 APC의 유형에 따라, 항원(예를 들면, 예정된 항원)에 대한 노출 중 또는 노출 후에 발생할 수 있다.
특정 양태에서, 비성숙 수지상 세포의 제제를 성숙시킬 수 있다. 적합한 성숙 인자는 예를 들면, 사이토카인(예를 들면, TNF-α), 세균 생산물(예를 들면, BCG) 등을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 예정된 항원에 특이적인 APC를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 항원은 예를 들면, 세균 및 바이러스 항원, 종양 특이적 또는 종양 관련 항원(예를 들면, 종양 세포 용해물, 종양 세포 막 제제, 종양으로부터 분리된 항원, 융합 단백질 또는 리포좀) 또는 다른 항원일 수 있다. 실시적 양태에서, 비성숙 수지상 세포를 암 면역치료 및/또는 종양 성장 억제를 위해 전립선 특이적 막 항원(PSMA)의 존재하에 배양시킨다. APC를 통상 예정된 항원과 접촉시키고 적합한 시간 동안 배양하여 항원을 수용 및 처리하게 한다.
다른 측면에서, 분리된 APC 전구체를 비성숙 또는 성숙 APC의 제제를 제조하기 위해 사용한다. APC 전구체를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 배양, 분화 및/또는 성숙시킬 수 있다.
특정 양태에서, 단핵성 수지상 세포 전구체를 아미노산, 비타민, 사이토카인(예를 들면, GM-CSF 및/또는 IL-4), 이가양이온 등을 첨가한 적합한 배양 배지(예를 들면, AIM-V, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15 등)의 존재하에 배양시켜 단핵성 수지상 세포 전구체의 비성숙 수지상 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 통상 사이토카인 배합물은 GM-CSF 및 IL-4 각각 약 500단위/㎖이다.
다음의 실시예는 단지 본 발명의 각종 측면의 예시로서 제공되었으며 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.
[실시예]
실시예 1: 공동 자극 검정
당해 실시예에서, 항원-독립적 공동자극 검정은 수지상 세포 제제의 성질을 측정하기 위해 사용된다.
수지상 세포 제제는 다음과 같이 26개의 상이한 사람 피검체로부터 제조되었다: 각각의 환자로부터의 백혈구 아페레시스 혈액으로부터 PBMC를 분리하고 5% 자가성 혈장을 첨가한 OptiMEM 배지(Gibco-BRL) 내에서 6일 동안 배양한 후, BCG, 수지상 세포 성숙화제의 존재하에 추가로 1일 배양하였다.
말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 다음과 같이 제조하였다: 백혈구 아페레시스 혈액을 완충염으로 희석하고, FICOLL 용액으로 도포하고 2000rpm에서 20분 동안 회전시켰다. 경계면에서 백혈구를 분리하였다. 자성 비드 선별을 사용하여 PBMC로부터 공동자극 기능을 제거하였다. 요약하면, 제 II형 MCH 분자에 대한 항체를 자성 비드(Dynal New York)에 커플링시켰다. 자성 비드를 PBMC에 첨가하여 다음과 같이 제II형 MHC 분자를 갖는 세포를 제거하였다: 셀당 2 내지 10개의 비드를 PBMC에 첨가하고, 한 시간 동안 항온처리하였다. 이러한 항온처리 후, 비드-결합 세포(APC)를 자성 장치를 사용하여 제거하였다. 수득된 PBMC의 집단은 주로 APC가 없었으며 T 세포를 50% 초과로 함유하였다.
증식 검정은 다음과 같이 수행하였다: 1 ×104개의 수지상 세포를 96-웰 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 항-CD3 항체(BD Pharmingen, San Diego, California)와 접촉시켰다. 이어서 1 ×105개의 강화된 T 세포(상기 참조)를 첨가하고, 웰당 0.2㎖의 최종 농도가 되게 하였다. 당해 플레이트를 26시간 동안 항온처리하고, 이어서 3H-티미딘으로 펄스시켰다. 삽입된 표지를 수거 및 측정하기 전에 당해 플레이트를 추가로 18시간 동안 항온처리하였다.
T 세포 증식(델타 cpm)은 항-CD3 항체의 존재하에 수지상 세포 제제의 샘플로 자극시킨 T 세포에 의한 3H-티미딘 삽입과 수지상 세포 제제 단독의 샘플로 자극시킨 T 세포에 의한 3H-티미딘 삽입의 차 사이의 상이함으로 측정하였다. 각각의 수지상 세포 제제에 대한 평균 델타 cpm은 3개의 샘플의 평균으로서 계산하였다. 당해 검정의 결과는 다음의 표 1에 나타낸다.
Figure pat00001
단독의 항-CD3 항체와 배양시킨 T 세포는 약 370의 평균 cpm을 나타내었다. 이러한 낮은 수준의 3H-티미딘 삽입은 항-CD3 항체가 준최적 농도에서 첨가되었음을 입증한다. 단독의 수지상 세포 제제의 샘플과 공동 배양시킨 T 세포는 약 2281cpm의 평균 cpm을 나타내었다. 대조적으로, 항-CD3 항체 및 수지상 세포와 공동배양시킨 T 세포에 대한 평균 델타 cpm은 14,972cpm의 표준 편차를 갖는, 39,747cpm이었다. 델타 cpm 값의 분포는 표준적이지만, 델타 cpm 값의 범위의 높은 말단에 대해서는 현저한 비대칭을 가졌다.
정상 사람 공여자로부터의 수지상 세포 제제의 참조 샘플은 표준 편차 12.911cpm을 갖는, 약 51,260의 평균 델타 cpm을 가졌다. 이들 데이타를 기준으로 하여, 15,000 델타 cpm 또는 그 이상의 증식을 나타내는 수지상 세포 제제가 허용되는 성질의 제제임이 밝혀졌다.
실시예 2: 항원 독립적 공동자극 검정의 특이성
당해 공동자극 검정은 특정 유형의 APC의 항원-독립적 T 세포 증폭을 자극하는 능력을 기준으로 한다. 다음의 연구는 당해 검정의 특이성을 입증하기 위하여 수행되었다.
수지상 세포 제제에서 가장 흔하게 발견되는 비수지상 세포 유형을 제조하고 공동자극 검정에 단독으로 사용하고 특성화된(참조) 수지상 세포 제제내에 가하였다. T 세포, B 세포 및 단핵구를 항체를 사용한 음성-선별을 사용한 자성 비드 분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 정제하였다. T 세포를 위해, HLA-DR, CD19 및 CD56에 대한 항체를 사용하였고, B 세포를 위해서는, CD2, CD3 및 CD14에 대한 항체를 사용하였다. 단핵구를 위해서는, CD3, CD19 및 CD56에 대한 항체를 사용하였다.
당해 검정은 다음과 같이 수행하였다: 실시예 1에 기술한 바와 같은 증폭 검정에서 수지상 세포를 대신하여 T 세포, B 세포 및 단핵구를 사용하였다. 수지상 세포 대신 사용한 T 세포는 증식을 예방하기 위해 방사선 조사하였다. 이어서, 상기한 바와 같이, 동종 지표 T 세포를 첨가하고 40분 후에 증식을 결정하였다.
수지상 세포 대신 사용된 경우, T 및 B 림프구는 어떠한 시험 농도로도 공동자극 검정에서 T 세포를 자극할 수 없었다. 다음의 표 2에 나타낸 바와 같이, PBMC로부터 분리된 단핵구는 수지상 세포의 세포수를 약 2.5배 첨가한 경우, T 세포 증식(3H-티미딘 삽입)을 자극할 수 있었다. 그러나, 당해 증식은 동일한 수의 수지상 세포를 사용하여 수득된 것보다 매우 낮았다.
Figure pat00002
수지상 세포 제제내의 CD14 양성, CD11c 양성 세포 및 CD14 음성, CD11c 양성 세포가 등가의 공동자극 활성을 가지는 것으로 나타났으며 둘 다 수지상 세포인 것으로 사료되었다.
실시예 3: 수지상 세포의 특성화
*CD11c 양성, CD14 양성 세포 및 CD11c 양성, CD14 음성의 공동자극 활성을 CD14(Pharmingen)에 대한 표지된 항체를 사용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 수지상 세포 제제로부터 분리하였다.
이들 검정에서, 수지상 세포 제제로부터의 CD11c 양성, CD14 양성 세포 및 CD11c 양성, CD14 음성 세포가 등가의 공동자극 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 세포 유형 둘 다 총체적으로 수지상 세포로서 지칭되었다.
실시예 4: 공동자극 검정에서 수지상 세포 생존능의 효과
본 발명에 따르는 검정에서 사멸 세포의 가능한 효과를 측정하였다. 요약하면, 수지상 세포를 1% 포름알데하이드로 30분 동안 처리하고 56℃에서 1시간 동안 가열하여 치사시켰다. 이들 사멸(치사된) 세포 현탁액을 공동자극 검정에 사용하였다. 이들 사멸 세포를 정해진 비율로 살아 있는 수지상 세포와 혼합하였다. 이들 검정은 하기한 바와 같은 다른 경우를 제외하고, 실시예 1에서 상기한 바와 같이 수행하였다.
다음의 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 가열-치사시킨 수지상 세포는 본 발명에 따르는 공동자극 검정에서 본질적으로 어떠한 활성도 보유하지 않았다. 포름알데하이드-처리된 수지상 세포는 프로피듐 요오다이드 염색에 의해 측정된 바와 같이, 약 20%의 생존 수지상 세포를 여전히 보유하였고; 이들 세포는 감소된 수준에서 공동자극 활성을 유지하였다. 제3의 실험에서, 치사시킨 세포의 첨가는 당해 검정을 방해하지 않았다.
공동자극 검정에 따른 세포 생존능의 효과
웰당 사용한 세포 생존능 델타 cpm
104개의 생존 DC 100% 27482
104개의 총 DC 63% 15791
104개의 포름알데하이드-고정된 DC 20% 6957
104개의 가열-치사시킨 DC 4% -42
공동자극 검정에 따른 사멸 세포의 효과
웰당 첨가한 수 또는 사멸 세포 치사 방법 델타 cpm
1000 포름알데하이드 27,076
2000 포름알데하이드 27,336
3000 포름알데하이드 27,661
5000 포름알데하이드 26,478
1000 가열 25,391
2000 가열 24,270
3000 가열 23,560
실시예 5: 항원-독립적 공동자극 검정의 선형성
증가된 수의 수지상 세포를 고정된 수의 지표 T 세포에 첨가하여 수지상 세포수 및 3H-티미딘 검정사이의 관계를 측정하였다. 0, 2000, 6000 또는 10,000개의 수지상 세포를 웰에 두었다. 실시예 1에 기술된 바와 같은, 다음의 배양 환경을 사용하였다(예를 들면, 105개의 T 세포를 갖는 웰당 항-CD3 항체 1ng). 총 항온처리 시간은 40시간이었으며; 항온처리 중 마지막 18시간은 3H-티미딘의 존재하에 수행하였다.
지표 T 세포의 3H-티미딘 수용은 수지상 세포의 수가 증가함에 따라 실질적으로 선형으로 증가하였다. 특히, 관측된 델타 cpm은 각각, 0, 약 7,000cpm, 약 15,000cpm 및 약 27,000cpm이었다. 식 y=2.7183-134.13(R2=0.9879)이 이러한 선형 관계에 근접하였다. 이들 결과는 공동자극 활성이 DC의 수에 선형적으로 의존할 수 있음을 증명하였다.
실시예 6: 정밀도
실시예 1에 따른 공동자극 검정의 정밀도는 3명의 작동자가 동일한 양의 수지상 세포를 시험하게 함으로써 측정하였다. 각각의 작동자는 자신의 롯트를 3회(3일 연속 중 1일 1회) 시험하였다. 당해 데이타를 복제성(검정내 변수), 반복성(검정간 변수) 및 재현성(작동자간 변수)에 대해 분석하였다. 미처리 데이타를 다음의 표 5에 나타낸다. 변이 계수(CV)는 1.25 내지 16.18의 범위였으며, 높은 CV가 낮은 수준의 3H-티미딘 삽입에서 관측되었다.
Figure pat00003
Figure pat00004
모든 조건을 3회 수행하였으며, 따라서 3개의 cpm 값을 복제성의 측정치로서 시험하였다. 반복성 및 재현성은 델타 cpm을 사용하여 분석하였다. 각각의 작동자에 대한 평균 델타 cpm, 표준편차 및 검정간 변이 계수(CV)가 다음의 표 6에 제시되어 있다. 작동자 #1의 CV는 57.8%, 작동자 2는 14.4%, 작동자 3은 19.6%였다. 모든 3명의 작동자에 대한 평균 델타 cpm의 CV으로 재현성을 나타내며, 이는 14%이다.
Figure pat00005
실시예 6
PSMA-적재된 수지상 세포를 다음과 같이 분석한다: 적재된 수지상 세포를 세제를 사용하여 용해시키고, 5 ×105개의 세포의 용해물 당량을 7.5% SDS PAGE 겔의 각각의 줄에서 전기영동시킨다. 약 1시간 동안 150볼트에서 용해물 단백질을 분해시킨 후, 당해 단백질을 PVDF 또는 나일론 막으로 옮긴다. PSMA-특이적 모노클로날 항체, 4D8(ATCC HB 12487; 미국 특허 제6,150,508호)를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한다. 항체의 결합을 화학발광으로 가시화하고 필름에 노출시킨다. 겔상에 전개시킨 표준 PSMA 단백질의 동시-국소화에 의해 PSMA의 실체를 결정한다.
상기한 실시예는 예시를 위해 제공되며, 청구된 발명의 영역을 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 변형은 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백해질 것이며 첨부된 청구항에 포함될 것이다. 본원에 인용된 모든 출원, 특허, 특허 출원 및 기타 참조문헌은 참조로서 본원에 포함되어 있다.

Claims (18)

  1. 공지된 기능 활성을 가지며 실질적으로 공동자극 활성이 없는 T 세포를 제공하는 단계;
    비공지된 공동자극 활성을 갖는 항원제시 세포(APC)의 샘플을 제공하는 단계;
    상기 T 세포를, 혼자서는 최대의 T 세포 활성화를 자극할 수 없는 농도의 CD3 결합제로 이루어지는 항원-유사제와 접촉시키는 단계;
    상기 T 세포를 비공지된 공동자극 활성을 갖는 APC의 샘플과 접촉시키는 단계;
    CD3 결합제로 이루어지는 항원-유사제 및 APC의 샘플과 접촉시킨 T 세포의 활성화를 측정하는 단계; 및
    T 세포의 측정된 활성화와 T 세포에 대한 표준 활성화 역치 값 또는 값의 범위와 비교하여 APC의 공동자극 활성 및 성질을 측정하는 단계를 포함하여, APC의 항원-독립적, 공동자극 활성을 측정함으로써 APC의 성질을 평가하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, APC가 수지상 세포인 방법.
  3. 제2항에 있어서, T 세포의 측정된 활성화와 T 세포에 대한 표준 활성화 역치 값 또는 값의 범위와의 비교가, 수지상 세포의 성질을 측정하기 위해 수지상 세포 단독의 샘플과 접촉시킨 T 세포의 측정된 활성화와 비교하는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, APC가 수지상 세포이고,
    공지된 기능 활성을 가지며 실질적으로 공동자극 활성이 없는 T 세포의 제1 양을, 혼자서는 최대의 T 세포 활성화를 자극할 수 없는 농도의 CD3 결합제로 이루어지는 항원-유사제 및 비공지된 공동자극 활성을 갖는 수지상 세포 제제의 제1 샘플과 접촉시키는 단계;
    T 세포의 제1 양에 대한 제1 활성화 값을 측정하는 단계;
    T 세포의 제2 양을, 수지상 세포 제제의 제2 샘플 또는 혼자서는 최대의 T 세포 활성화를 자극할 수 없는 농도의 CD3 결합제로 이루어지는 항원-유사제와 접촉시키는 단계;
    T 세포의 제2 양에 대한 제2 활성화 값을 측정하는 단계; 및
    제1 및 제2 활성화 값을 비교하여 수지상 세포 제제의 공동자극 활성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, APC에 의한 항원 제시를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, APC가 수지상 세포이고,
    (1) 비공지된 공동자극 활성 및 항원에 대한 비공지된 항원 제시 능력의 수지상 세포 제제를 제공하는 단계;
    (2) (a) 공지된 기능 활성 및 실질적으로 공동자극 활성이 없는 T 세포를 제공하고, (b) 상기 T 세포를, 혼자서는 최대의 T 세포 활성화를 자극할 수 없는 농도의 CD3 결합제로 이루어지는 항원-유사제 및 수지상 세포 제제의 제1 샘플과 접촉시키며; (c) 상기 접촉된 T 세포의 활성화를 측정하고; (d) 상기 접촉된 T 세포의 측정된 활성화와 T 세포에 대한 표준 활성화 역치 값 또는 값의 범위와 비교하여 수지상 세포 제제의 공동자극 활성을 측정함을 포함하여 수지상 세포 제제의 공동자극 활성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 및 APC 또는 수지상 세포가 동계인 방법.
  8. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 및 APC 또는 수지상 세포가 동종인 방법.
  9. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CD3 결합제가 항-CD3 항체, 또는 식물 렉틴 또는 유사분열제인 방법.
  10. 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포가, 수지상 세포 성숙화제와 생체외 접촉되어 비성숙 수지상 세포로부터 유래된 성숙한 수지상 세포인 방법.
  11. 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 수지상 세포가 비성숙 수지상 세포인 방법.
  12. 제1항 또는 제4항에 있어서, T 세포에 이들의 세포 표면상에 제II형 MHC 분자, CD14, CD54, CD80, CD83 또는 CD86 분자를 발현시키는 말초 혈액 단핵 세포가 고갈된 방법.
  13. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 활성화를 3H-티미딘 삽입 검정, T 세포 사이토카인 생산 검정, 또는 T 세포 활성화 마커의 발현 조절 검출로 측정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 검정된 T 세포 사이토카인 생산이 IFNγ또는 인터루킨 2 생산, 세포외 사이토카인 생산, 또는 세포내 사이토카인 생산인 방법.
  15. 제13항에 있어서, T 세포 활성화 마커가 CD25, CD69, CD44 또는 CD125인 방법.
  16. 제13항에 있어서, T 세포 활성화 마커를 T 세포 활성화 마커에 결합할 수 있는 표지된 항체를 사용하여 검출하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 표준 활성화 역치 값 또는 값의 범위가 상이한 공동자극 활성과 관련되는 방법.
  18. 제5항에 있어서, 항원의 제시를 웨스턴 블롯팅, 유동 세포계수법 또는 항원 특이적 T 세포의 활성화로 측정하는 방법.
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