PL209998B1 - Sposób in vitro lub ex vivo różnicowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzale komórki dendrytyczne - Google Patents
Sposób in vitro lub ex vivo różnicowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzale komórki dendrytyczneInfo
- Publication number
- PL209998B1 PL209998B1 PL378291A PL37829104A PL209998B1 PL 209998 B1 PL209998 B1 PL 209998B1 PL 378291 A PL378291 A PL 378291A PL 37829104 A PL37829104 A PL 37829104A PL 209998 B1 PL209998 B1 PL 209998B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- dendritic
- antigen
- cell
- dendritic cell
- Prior art date
Links
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 295
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 183
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 115
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 96
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 94
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 94
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 38
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 37
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 claims description 29
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 claims description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 23
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- -1 plasma Proteins 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 13
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 claims description 12
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 7
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 claims description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 abstract description 55
- 230000035800 maturation Effects 0.000 abstract description 36
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 abstract description 25
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 abstract description 25
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 abstract description 23
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 abstract description 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 10
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 69
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 63
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 12
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 11
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 10
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 10
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 10
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 9
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 9
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 9
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 9
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 9
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 7
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 7
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 5
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 4
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 4
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 4
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- KMZHZAAOEWVPSE-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl acetate Chemical compound CC(=O)OCC(O)CO KMZHZAAOEWVPSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 2
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N Ala-Leu-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- KQBVNNAPIURMPD-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KQBVNNAPIURMPD-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BDISFWMLMNBTGP-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 KYIIALJHAOIAHF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 101100168115 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) con-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HBZBPFLJNDXRAY-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBZBPFLJNDXRAY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PMCMLDNPAZUYGI-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PMCMLDNPAZUYGI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940086870 plasbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000029069 type 2 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/72—Undefined extracts from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/70—Non-animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/10—Mineral substrates
- C12N2533/12—Glass
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro lub ex vivo różnicowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzałe komórki dendrytyczne.
Komórki prezentujące antygen (APC, od ang. antigen presenting cells) są ważne przy wzbudzaniu skutecznej odpowiedzi immunologicznej. APC nie tylko prezentują antygeny komórkom T z receptorami swoistymi dla antygenu, ale również dostarczają sygnał ów niezbę dnych do aktywacji komórek T. Takie sygnały pozostają niecałkowicie zdefiniowane, ale wiadomo, że angażują rozmaite cząsteczki na powierzchni komórek, jak również cytokiny lub czynniki wzrostu. Czynniki konieczne do aktywacji dziewiczych (ang. naive) lub nie uczulonych komórek T mogą być odmienne od wymaganych do ponownej aktywacji uczulonych uprzednio komórek T pamięci. Jakkolwiek pokazano, że monocyty i komórki B są kompetentnymi APC, ich zdolności prezentowania antygenu wydają się być ograniczone do ponownej aktywacji uczulonych uprzednio komórek T. A zatem, nie są one zdolne do bezpośredniej aktywacji populacji funkcjonalnych dziewiczych lub nie uczulonych komórek T. Z drugiej strony, komórki dendrytyczne są zdolne do aktywacji zarówno dziewiczych, jak i uczulonych uprzednio komórek T.
Komórki dendrytyczne to heterogenna populacja komórek o charakterystycznej morfologii i szerokiej dystrybucji w tkankach, włącznie z krwią. (Patrz np. Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-96 (1991)). Powierzchnia komórkowa komórek dendrytycznych jest unikatowa, z charakterystycznymi welonopodobnymi wypustkami. Dojrzałe komórki dendrytyczne identyfikuje się ogólnie jako CD3-, CD11c+, CD19-, CD83+, CD86+ i HLA-DR+.
Komórki dendrytyczne dokonują obróbki i prezentują antygeny oraz stymulują odpowiedzi ze strony dziewiczych i nie uczulonych komórek T i komórek T pamięci. W szczególności komórki dendrytyczne mają dużą zdolność do uczulania komórek T podlegających restrykcji MHC i są bardzo skuteczne w prezentowaniu komórkom T antygenów, zarówno antygenów własnych w czasie rozwoju komórek T i tolerancji, jak i obcych antygenów w czasie odpowiedzi immunologicznej. Poza ich rolą w prezentacji antygenu, komórki dendrytyczne również bezpoś rednio komunikują się z tkanką nielimfatyczną i obserwują tkankę nielimfatyczną pod kątem sygnału uszkodzenia (np. niedokrwienia, zakażenia lub zapalenia) albo wzrostu nowotworu. Po odebraniu sygnału, komórki dendrytyczne zapoczątkowują odpowiedź immunologiczną poprzez uwalnianie cytokin, które stymulują aktywność limfocytów i monocytów.
Ze względu na ich skuteczność przy prezentowaniu antygenu, istnieje rosnące zainteresowanie w zastosowaniu komórek dendrytycznych jako czynnika immunostymulacyjnego, zarówno in vivo jak i ex vivo. Zastosowanie wyizolowanych komórek dendrytycznych jako czynników immunostymulacyjnych było jednakże ograniczone na skutek niskiej częstości występowania komórek dendrytycznych we krwi obwodowej i niskiej czystości komórek dendrytycznych izolowanych wcześniejszymi metodami. W szczególności, częstość występowania komórek dendrytycznych w ludzkiej krwi obwodowej oszacowano na około 0,1% krwinek białych. Podobnie, ograniczona jest dostępność komórek dendrytycznych z innych tkanek, takich jak narządy limfoidalne. Niska częstość komórek dendrytycznych zwiększyła zainteresowanie w izolowaniu populacji komórek wzbogaconej w prekursory komórek dendrytycznych i hodowaniu tych prekursorów ex vivo lub in vitro w celu otrzymania wzbogaconych populacji niedojrzałych albo dojrzałych komórek dendrytycznych. Ponieważ właściwości prekursorów komórek dendrytycznych pozostają nie w pełni zdefiniowane, sposoby zazwyczaj stosowane do izolowania prekursorów komórek dendrytycznych nie dają w rezultacie oczyszczonych frakcji pożądanych prekursorów, prowadzą natomiast do uzyskania mieszanych populacji leukocytów wzbogaconych w prekursory komórek dendrytycznych. Zidentyfikowano kilka typów komórek jako mające potencjał działania jako prekursory komórek dendrytycznych. Pochodzące z krwi monocyty CD14+, a w szczególności te, które wyrażają na swojej powierzchni receptor dla czynnika wzrostu - czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF od ang. granulocyte-monocyte colony stimulating factor) są znanymi prekursorami komórek dendrytycznych. Inne pochodzące z krwi prekursory komórek dendrytycznych można wyizolować najpierw usuwając monocyty i inne „prekursory komórek niedendrytycznych. (Patrz np. patenty USA nr 5,994,126 i 5,851,756.). Jeszcze inne znane prekursory komórek dendrytycznych obejmują komórki pochodzące ze szpiku kostnego, które wyrażają komórkowy marker powierzchniowy CD34.
Populacje komórek wzbogacone w prekursory komórek dendrytycznych otrzymano wieloma metodami, takimi jak, na przykład, rozdział w gradiencie gęstości, sortowanie komórek aktywowane
PL 209 998 B1 fluorescencją, techniki rozdziału komórek immunologicznych, np. wyszukiwanie, liza dopełniacza, metoda rozet, magnetyczne techniki rozdziału komórek, rozdział na włóknach nylonowych i kombinacja takich metod (Patrz np. O'Doherty i wsp., J. Exp. Med. 178:1067-76 (1993); Young i Steinman, J. Exp. Med. 171:1315-32 (1990); Freudenthal i Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-702 (1990); Macatonia i wsp., Immunol. 67:285-89 (1989); Markowicz i Engleman, J. Clin. Invest. 85:955-61 (1990), wszystkie włączone tu w całości jako odniesienie). Sposoby selekcji immunologicznej komórek dendrytycznych obejmują na przykład zastosowanie przeciwciał wobec komórkowych markerów powierzchniowych związanych z prekursorami komórek dendrytycznych, takich jak przeciwciała antyCD34 i/lub anty-CD14 sprzęgane z substratem (Patrz np. Bernhard i wsp., Cancer Res. 55:1099-104 (1995); Caux i wsp., Nature 360:258-61 (1992)).
W jednej z typowych przykładowych metod, leukocyty izoluje się poprzez procedurę leukaferezy. Dodatkowe metody stosuje się zazwyczaj do dalszego oczyszczania w celu wzbogacenia we frakcje komórek, które, jak się sądzi, zawierają komórki dendrytyczne i/lub prekursory komórek dendrytycznych. Podobnie, metody takie jak różnicowe wirowanie (np. izolacja kożuszka), wyszukiwanie z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec pewnego typu białek powierzchniowych (np. selekcja pozytywna albo negatywna) i filtracja również dają surową mieszaninę leukocytów zawierających prekursory komórek dendrytycznych.
Inna opisana metoda izolowania namnażających się prekursorów komórek dendrytycznych to zastosowanie komercyjnie przygotowanego podłoża z tworzywa sztucznego (np. kulek albo kulek magnetycznych) w celu wybiórczego usunięcia przywierających monocytów i innych „prekursorów komórek niedendrytycznych. (Patrz np. patenty USA nr 5,994,126 i 5,851,756). Przywierające monocyty i prekursory komórek niedendrytycznych są odrzucane, podczas gdy komórki nie przywierające są zachowywane w celu hodowli i dojrzewania ex vivo. W innej metodzie, komórki po aferezie hoduje się w torbie hodowlanej z tworzywa sztucznego, do której dodano kulki mikronośnika z tworzywa sztucznego (tj. polistyrenowe albo styrenowe) w celu zwiększenia powierzchni torebki. Komórki hoduje się przed okres czasu dostateczny, aby komórki przywarły do kulek, i komórki nie przywierające wymywa się z torebki. (Maffei i wsp., Transfusion 40:1419-1420 (2000); WO 02/44338).
Po zasadniczo wszystkich opisywanych metodach otrzymywania populacji komórek wzbogaconych w prekursory komórek dendrytycznych, populacje komórek hoduje się zazwyczaj ex vivo lub in vitro w celu różnicowania lub utrzymywania się prekursorów komórek dendrytycznych i/lub ekspansji komórek dendrytycznych. Pokrótce, różnicowanie ex vivo monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych obejmuje hodowanie mieszanych populacji komórek wzbogaconych w prekursory komórek dendrytycznych w obecności kombinacji czynników wzrostu, takich jak cytokiny. Przykładowo, monocytarne prekursory komórek dendrytycznych wymagają czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) w połączeniu z co najmniej jedną inną cytokiną wybraną na przykład spośród interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 15 (IL-15), interleukiny 13 (IL-13), interferonu α (IFN- α ) i tym podobnych, aby ró ż nicować komórki do optymalnego stanu do pobierania, obróbki i/lub prezentacji antygenu. Wiele komórek dendrytycznych z niemonocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych, takich jak te otrzymane poprzez usunięcie monocytów i innych prekursorów komórek niedendrytycznych (adsorpcja do powierzchni tworzywa sztucznego) albo selekcję pod kątem komórek CD34+, również namnożono poprzez hodowlę w obecności pewnych cytokin. Sam GM-CSF albo kombinację GM-CSF i IL-4 zastosowano w sposobach wytwarzania populacji komórek dendrytycznych z takich namnaż ają cych się prekursorów komórek dendrytycznych do uż ytku terapeutycznego.
Skuteczność takiego różnicowania, utrzymywania się i/lub ekspansji ex vivo jest jednakże ograniczona przez jakość wyjściowej populacji wzbogaconej w komórki dendrytyczne i prekursory komórek dendrytycznych. W pewnych warunkach hodowli, populacje komórek dendrytycznych i prekursorów komórek dendrytycznych, które są mocno zanieczyszczone krwinkami białymi obojętnochłonnymi, makrofagami i limfocytami albo ich kombinacją mogą zyskać przewagę nad tymi ostatnimi komórkami, co prowadzi do słabych wydajności komórek dendrytycznych. Hodowle komórek dendrytycznych zawierających dużą liczbę krwinek białych obojętnochłonnych, makrofagów i limfocytów albo ich kombinacje są mniej przydatne do stosowania jako preparaty immunostymulacyjne.
Niedojrzałe i dojrzałe komórki dendrytyczne, po otrzymaniu, typowo wystawia się na działanie docelowego antygenu(ów) i czynników dojrzewania w celu uzyskania aktywowanych dojrzałych komórek dendrytycznych. Zasadniczo, antygen jest dodawany do populacji wzbogaconej w niedojrzałe lub dojrzałe komórki dendrytyczne w odpowiednich warunkach hodowli. W przypadku niedojrzałych komórek dendrytycznych, komórkom pozostawia się następnie dostateczny czas do pobrania i obróbki an4
PL 209 998 B1 tygenu oraz wyrażenia antygenowych peptydów na powierzchni komórki w połączeniu z markerami MHC klasy I albo klasy II. Antygen może być prezentowany niedojrzałym komórkom dendrytycznym na powierzchni komórek, w postaci oczyszczonej, w postaci półoczyszczonej, na przykład jako wyizolowane białko albo fuzja białkowa (np. fuzja białkowa GM-CSF-antygen), jako lizat błon, jako kompleks liposom-białko, i innymi metodami. Dodatkowo, ponieważ dojrzałe komórki dendrytyczne nie są zdolne do pobierania i obróbki antygenu, do prezentacji można dodać antygenowe peptydy, które wiążą się z cząsteczkami MHC klasy I lub MHC klasy II.
Po otrzymaniu aktywowanych komórek dendrytycznych, podaje się je pacjentowi w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Aktywowane komórki dendrytyczne można podawać pacjentowi we wstrzyknięciu bolusowym, poprzez ciągły wlew, stałe uwalnianie z implantów lub inne przydatne techniki znane w dziedzinie. Aktywowane komórki dendrytyczne można również podawać jednocześnie z dopuszczalnymi fizjologicznie noś nikami, zaróbkami, buforami i/lub rozcień czalnikami. Ponadto, aktywowane komórki dendrytyczne można zastosować do aktywacji komórek T, np. cytotoksycznych komórek T ex vivo przy zastosowaniu metod dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Cytotoksyczne komórki T swoiste wobec antygenu można następnie podawać pacjentowi w celu leczenia na przykład rosnącego guza nowotworowego albo infekcji bakteryjnej albo wirusowej. Kompozycje te można użyć same albo jako środek wspomagający z innymi terapiami, takimi jak na przykład wycięcie chirurgiczne, chemioterapia, radioterapia, oraz ich kombinacje, jak również inne podejścia terapeutyczne odpowiednie do leczonego stanu.
W niniejszym wynalazku stwierdzono, ż e w przeciwień stwie do wcześ niejszych metod monocytarne prekursory komórek dendrytycznych można różnicować w dojrzałe komórki dendrytyczne i utrzymywać w odpowiednich warunkach, które są w pełni odpowiednie do obróbki i prezentacji antygenu, w obecności samego GM-CSF bez dodatkowych cytokin. Sposoby obejmują dostarczenie populacji komórek zawierających prekursory komórek dendrytycznych, które nie zostały zaktywowane i hodowanie komórek in vitro lub ex vivo w pożywce hodowlanej dla komórek dendrytycznych, która została uzupełniona GM-CSF bez żadnych dodatkowych cytokin. Sposoby typowo stosowane dla wzbogacenia populacji komórek w prekursory komórek dendrytycznych mogą aktywować komórki prekursorowe rozpoczynając terminalne różnicowanie komórek, na przykład w makrofagi. Dodatek innych cytokin, na przykład IL-4, IL-13, IL-15 lub TNF-α działa przeciwnie wobec efektów izolacji związanej z aktywacją komórek. W praktyce sposoby według niniejszego wynalazku dostarczają prostej i oszczędnej metody otrzymywania i utrzymywania niedojrzałych komórek dendrytycznych w stanie zoptymalizowanym dla pobrania, obróbki i prezentacji wybranego antygenu.
Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro lub ex vivo różnicowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzałe komórki dendrytyczne, który obejmuje:
a) dostarczanie populacji komórek zawierających nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych;
b) doprowadzanie do kontaktu nieaktywowanych prekursorów komórek dendrytycznych w naczyniu hodowlanym z pożywką hodowlaną dla komórek dendrytycznych uzupełnioną czynnikiem stymulującym wzrost kolonii granulocytów-makrofagów w nieobecności dodatkowych cytokin, przy czym aktywację monocytarnych komórek prekursorowych komórek dendrytycznych zapobiega się przez hamowanie adhezji komórek prekursorowych do naczynia hodowlanego.
Sposób według wynalazku umożliwia różnicowanie i utrzymywanie niedojrzałych komórek dendrytycznych ex vivo lub in vitro w stanie zoptymalizowanym do pobrania, obróbki i prezentacji wybranego antygenu. W sposobie według wynalazku dostarczane są populacje komórek zawierających nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych, tj. monocyty, które wyrażają na swojej powierzchni receptor GM-CSF, oraz inne takie prekursory komórek dendrytycznych, które są doprowadzane do kontaktu z pożywką hodowlaną dla komórek dendrytycznych uzupełnioną czynnikiem stymulującym wzrost kolonii granulocytów-makrofagów w nieobecności dodatkowych cytokin. W przeciwieństwie do wcześniejszych metod, dodatkowe cytokiny nie są wymagane do wytwarzania komórek dendrytycznych z izolowanych nie aktywowanych monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych.
Aktywacji monocytarnych dendrytycznych komórek prekursorowych zapobiega się poprzez hamowanie albo blokowanie adhezji komórek prekursorowych do stałej powierzchni, z którą komórki miałyby kontakt w trakcie typowego procesu izolowania i/lub wzbogacania lub w czasie hodowli komórek. Powierzchnią stałą może być naczynie hodowlane, takie jak kolba, butelka lub torebka do hodowli komórek stosowana do otrzymania albo utrzymania komórek ex vivo lub in vitro. Powierzchnią stałą
PL 209 998 B1 może być również dowolna powierzchnia naczynia albo urządzenia stosowanego przy wytwarzaniu populacji komórek wzbogaconych w prekursory komórek dendrytycznych, np. powierzchnia filtra, kuleczki stosowane przy oczyszczaniu, takie jak kuleczka magnetyczna, szklana albo z tworzywa sztucznego; rurki, naczynie hodowlane i tym podobne. Korzystnie hamowanie adhezji nie aktywowanych monocytarnych dendrytycznych komórek prekursorowych można realizować poprzez dodanie wysokiego stężenia zwierzęcego albo ludzkiego białka do hodowli komórek albo pożywki hodowlanej dla komórek dendrytycznych. Stosowane tu wysokie stężenie zwierzęcego albo ludzkiego białka obejmuje od około 1 do około 10% wag./obj. białka. Korzystniej, białko zwierzęce obejmuje albuminę, surowicę, osocze, żelatynę, poliaminokwas i tym podobne, o ile one same nie aktywują komórek.
W korzystnej postaci wykonania poż ywka stosowana w sposobie wedł ug wynalazku zawiera ludzką albuminę z surowicy. Korzystniej ludzka albumina w surowicy jest obecna w stężeniu co najmniej 1%. Najkorzystniej ludzka albumina jest obecna w stężeniu od około 2% do około 10%.
Również korzystnie aktywacja monocytarnych dendrytycznych komórek prekursorowych może być blokowana albo hamowana poprzez dodanie czynnika chelatującego metale do pożywki hodowlanej. Korzystniej czynnik chelatujący metale stanowi EDTA i EGTA. Uważa się, że dodanie tych czynników minimalizuje aktywację komórek prekursorowych poprzez zmniejszenie stężenia dwuwartościowych kationów metali w pożywce hodowlanej.
Aktywacji monocytarnych dendrytycznych komórek prekursorowych można zapobiegać albo hamować poprzez izolację albo wzbogacanie i hodowanie dendrytycznych komórek prekursorowych w naczyniach hodowlanych o mał ej przyczepnoś ci komórek. Zatem korzystnie w sposobie wedł ug wynalazku adhezję monocytarnego prekursora komórki dendrytycznej do naczynia hodowlanego hamuje się przez stosowanie naczynia hodowlanego o niskiej przyczepności dla komórek. Najkorzystniej naczynia hodowlane o małej przyczepności komórek obejmują typowo materiały takie jak polipropylen, politetrafluoroetylen (Teflon®) i PFTE. Podobnie jak w przypadku dodania zwierzęcego albo ludzkiego białka, zmniejszenie albo blokowanie adhezji prekursorów komórek dendrytycznych do stałej powierzchni zapobiega aktywacji komórek i umożliwia różnicowanie i utrzymywanie komórek jako niedojrzałe komórki dendrytyczne w pożywce hodowlanej dla komórek dendrytycznych uzupełnionej GM-CSF bez jakichkolwiek dodatkowych cytokin. Przeprowadzenie izolacji komórek prekursorowych w temperaturach poni ż ej okoł o 37°C, na przykł ad w temperaturze pokojowej, dalej zmniejsza proporcję monocytarnych dendrytycznych komórek prekursorowych, które uległy aktywacji w populacji komórek. Sposoby według niniejszego wynalazku mogą obejmować kombinacje dowolnych lub wszystkich tych czynników, materiałów i/lub warunków.
Również korzystnie pożywka hodowlana dla komórek dendrytycznych stosowana w sposobie według wynalazku jest wolna od surowicy.
W jednym konkretnym wykonaniu wynalazku poż ywka hodowlana dla komórek dendrytycznych jest wolna od surowicy i dodane jest białko zwierzęce, takie jak albumina surowicza w celu zmniejszenia przyczepności prekursorów komórek dendrytycznych do powierzchni naczynia hodowlanego w celu zapobiegania i/lub zmniejszania aktywacji monocytarnych dendrytycznych komórek prekursorowych.
Korzystnie, populacje komórek, które zawierają monocytarne dendrytyczne komórki prekursorowe, otrzymuje się z krwi obwodowej, produktu leukaferezy, produktu aferezy, krwi pępowinowej, śledziony, węzła limfatycznego, grasicy lub szpiku kostnego. Korzystniej populacja komórek może być przechowywana w stanie zamrożenia przed i po wykonaniu sposobów według wynalazku. Ponadto, populacja komórek korzystnie jest wzbogacana w monocytarne komórki prekursorowe poprzez filtrację styczną. Możliwe jest także wzbogacanie poprzez wyszukiwanie przeciwciałami, różnicowe wirowanie i tym podobne. Kiedy populacja komórek jest dalej wzbogacana poprzez filtrację styczną, filtr ma korzystnie pory 5,5 mikronów, szybkość recyrkularyzacji (wprowadzania) wynosi korzystnie około 1400 ml/min., szybkość filtracji wynosi około 15 do około 21 ml/min., korzystnie 17 ml/min., a czas filtracji wynosi około 60 do około 90 min., a korzystnie 90 min. (Patrz na przykład, WO2004/000444, opublikowane 31 grudnia, 2003).
Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje ponadto etap doprowadzania niedojrzałych komórek dendrytycznych, które zostały otrzymane jak opisano powyżej, do kontaktu z wybranym antygenem będącym przedmiotem zainteresowania przez czas wystarczający do pobrania antygenu. Po obróbce antygen jest prezentowany na powierzchni komórek dendrytycznych. Ponadto, korzystnie niedojrzałe komórki dendrytyczne można doprowadzić do kontaktu z czynnikiem dojrzewania komórek dendrytycznych. Etap ten może być prowadzony przed, jednocześnie, albo po doprowadzeniu do kon6
PL 209 998 B1 taktu z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania. Czynnik dojrzewania komórek dendrytycznych korzystnie obejmuje Bacillus Calmette-Guerin (BCG), lipopolisacharyd (LPS), czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α), interferon gamma (IFN-γ) lub ich kombinacje. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku czynnikiem dojrzewania komórek dendrytycznych jest kombinacja inaktywowanej BCG i IFN-γ. Wybrane antygeny przydatne w sposobie według wynalazku obejmują korzystnie antygen swoisty wobec nowotworu, antygen związany z nowotworem, antygen wirusowy, antygen bakteryjny, komórki nowotworowe, kwas nukleinowy kodujący antygen wyizolowany z komórki nowotworowej, komórki bakteryjne, zrekombinowane komórki wyrażające antygen, lizat komórkowy, preparat błon, antygen wytworzony na drodze rekombinacji, antygen peptydowy lub antygen wyizolowany. Na dowolnym etapie, włączając w to następujący po doprowadzeniu do kontaktu z wybranym antygenem, pobraniu, obróbce i dojrzewaniu komórek dendrytycznych, komórki można przechowywać korzystnie w stanie zamrożenia do późniejszego użycia.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 przedstawia histogramy ekspresji powierzchniowej CD14 i CD1a na komórkach dendrytycznych w celu określenia różnicowania się in vitro monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w komórki dendrytyczne CD1a+ w obecności samego GM-CSF bez dodatkowych cytokin i w obecności czynnika blokującego (3% albuminy surowicy ludzkiej; HSA), który zapobiega ścisłemu przywieraniu do powierzchni naczynia do hodowli komórkowych.
Fig. 2 przedstawia pomiar ekspresji CD1a i CD14 podczas różnicowania się monocytów w komórki dendrytyczne (DC) w hodowli in vitro w nieobecności IL-4. Na różnicowanie wskazuje odwrotna ekspresja markerów CD1a i CD14 na „żywych komórkach CD11c+. Fig. 2A przedstawia zwiększoną ekspresję CD1a na DC w 5 dniu w stosunku do jego ekspresji na powierzchni monocytów prekursorowych. Fig. 2B przedstawia zmniejszoną ekspresję CD14 na DC w stosunku do jego poziomu na powierzchni monocytów prekursorowych. Dane przedstawiono dla reprezentatywnych hodowli po elektronicznym bramkowaniu komórek linii monocytarnej (CD11c+) dla (i) podgrup i (ii) względnej ekspresji mierzonej poprzez średnią intensywność fluorescencji (mfi). Odjęto barwienie tła obserwowane dla przeciwciał kontrolnych dla odpowiedniego izotypu. Dane te przedstawiają wartości średnie dla hodowanych monocytów wyizolowanych od dwóch niezależnych dawców.
Fig. 3 przedstawia pomiar ilościowy sekrecji IL-12 p70 przez monocytarne prekursory komórek dendrytycznych, którym umożliwiono ścisłe przywieranie lub słabe przywieranie do podłoża przed hodowlą albo z GM-CSF i IL-4 lub z samym GM-CSF.
Fig. 4 przedstawia ekspresję typowych markerów komórek dendrytycznych przez monocytarne prekursory komórek dendrytycznych hodowane z samym GM-CSF.
Fig. 5 przedstawia kinetykę różnicowania się in vitro nie aktywowanych monocytów do komórek dendrytycznych w pożywce hodowlanej uzupełnionej samym GM-CSF, określaną na podstawie ekspresji CD1a i CD14.
Fig. 6A do 6E przedstawiają porównanie fenotypów nie aktywowanych monocytów różnicujących się w komórki dendrytyczne hodowanych albo w torebkach z Teflon®u albo butelkach z tworzywa sztucznego do hodowli tkankowych, w pożywce do hodowli komórek uzupełnionej samym GM-CSF lub GM-CSF plus IL-4 w obecności lub w nieobecności czynnika dojrzewania komórek dendrytycznych. Fig. 6A przedstawia udział procentowy komórek, które były CD1a-dodatnie. Fig. 6B przedstawia udział procentowy komórek, które były CD83-dodatnie. Fig. 6C przedstawia względny poziom ekspresji (mfi) CD80. Fig. 6D przedstawia względny poziom ekspresji (mfi) CD86. Fig. 6E przedstawia względny poziom ekspresji (mfi) HLA-DR.
Fig. 7A i 7B przedstawiają swoistą wobec antygenu odpowiedź komórek T dla komórek dendrytycznych otrzymanych poprzez przywieranie do powleczonych szkłem kulek mikronośnika, hodowanych w obecności albo samego GM-CSF lub GM-CSF plus IL-4, a następnie doprowadzonych do kontaktu albo z kontrolnym antygenem hemocjaniną ze skałoczepa lub 40-merowym peptydem grypy A M1-A4 oraz czynnikiem dojrzewania komórek dendrytycznych. Fig. 7A przedstawia analizę komórek T cytotoksycznych swoistych wobec antygenu dla komórek wyizolowanych z dawcy P016, a Fig. 7B to podobna analiza dla dawcy P052.
Fig. 8A i 8E przedstawiają profile fenotypowe komórek linii monocytarnej, które wyróżnicowały się w komórki dendrytyczne (DC) w trakcie hodowli in vitro w nieobecności IL-4. Markery na wszystkich podgrupach i ich względne poziomy ekspresji (mfi) pokazano dla „żywych komórek CD11c+. Fig. 8A przedstawia udział procentowy komórek CD11c+, które jednocześnie wyrażają specyficzne markery na monocytach i na DC 5 dnia. Fig. 8B przedstawia względną ekspresję markerów fenotypoPL 209 998 B1 wych. Dane przedstawiono dla niezależnych hodowli dla dwóch różnych dawców oznaczonych 63665 i 63666 po elektronicznym bramkowaniu komórek linii monocytarnej (CD11c+) dla (i) podgrup i (ii) względnej ekspresji mierzonej poprzez średnią intensywność fluorescencji (mfi). Odjęto barwienie tła obserwowane dla przeciwciał kontrolnych dla odpowiedniego izotypu.
Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów różnicowania się monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzałe komórki dendrytyczne (DC). Monocytarne prekursory komórek dendrytycznych, które nie zostały zaktywowane, można doprowadzić do kontaktu z pożywką do hodowli komórek dendrytycznych uzupełnioną GM-CSF jako jedyną cytokiną, aby indukować różnicowanie i utrzymywać komórki jako niedojrzałe komórki dendrytyczne. Sposoby, które wymagają jedynie dodawania pojedynczej cytokiny, są mniej kosztowne w stosowaniu i są skuteczniejsze niż te, które stosowano wcześniej, a które wymagają dodawania innych cytokin w celu zapobieżenia różnicowaniu się monocytarnych komórek dendrytycznych w inne typy komórek, włączając w to, na przykład, makrofagi i tym podobne.
Niedojrzałe komórki dendrytyczne wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku są fenotypowo i funkcjonalnie podobne do tych, które wytwarzano wcześniejszymi sposobami, w których stosowano bardziej złożone warunki hodowli, i można następnie doprowadzić do ich kontaktu z czynnikiem dojrzewania komórek dendrytycznych, takim jak BCG i IFNy i ewentualnie z wcześniej określonym antygenem w odpowiednich warunkach dojrzewania. Do kontaktu antygenu z niedojrzałymi komórkami dendrytycznymi według wynalazku można doprowadzić zarówno w trakcie, jak i przed dojrzewaniem.
Monocytarne prekursory komórek dendrytycznych i niedojrzałe komórki dendrytyczne
Tak jak tutaj stosowano, monocytarne prekursory komórek dendrytycznych obejmują monocyty, które mają na swojej powierzchni receptor GM-CSF i inne komórki prekursorowe pochodzące ze szpiku, odpowiadające na GM-CSF. Komórki można otrzymać z dowolnej tkanki, w której się znajdują, w szczególności z tkanek limfatycznych takich jak śledziona, szpik kostny, węzły chłonne i grasica. Monocytarne prekursory komórek dendrytycznych można także izolować z układu krążenia. Krew obwodowa jest łatwo dostępnym źródłem monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych. Innym źródłem monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych jest krew pępowinowa. Monocytarne prekursory komórek dendrytycznych można izolować z szeregu różnych organizmów, u których można wywoływać odpowiedź układu immunologicznego. Do takich organizmów należą, na przykład, ludzie, zwierzęta inne niż człowiek, takie jak naczelne, ssaki (w tym psy, koty, myszy i szczury), ptaki (w tym kury), jak również ich transgeniczne gatunki.
W pewnych wykonaniach, monocytarne prekursory komórek dendrytycznych i/lub niedojrzałe komórki dendrytyczne można izolować ze zdrowego dawcy lub z pacjenta wymagającego immunostymulacji, takiego jak, na przykład, pacjent chory na raka lub inny pacjent, dla którego immunostymulacja może być korzystna lub pożądana (tj. pacjent z infekcją wirusową, bakteryjną, pasożytniczą i tym podobne). Monocytarne prekursory komórek dendrytycznych i/lub niedojrzałe komórki dendrytyczne można także uzyskać od zdrowego osobnika o układzie HLA zgodnym z biorcą w celu przekształcenia w niedojrzałe komórki dendrytyczne, dojrzewania, aktywacji i podawania pacjentowi wymagającemu immunostymulacji o układzie HLA zgodnym z dawcą.
Sposoby izolowania nie aktywowanych monocytarnych prekursów komórek dendrytycznych i niedojrzałych komórek dendrytycznych z różnych źródeł dostarczonych powyżej, w tym krwi i szpiku kostnego, można wykonywać w różny sposób. Zwykle, od osobnika pobiera się populację komórek i wzbogaca się ją w nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych. Na przykład, mieszaną populację komórek zawierającą nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych można otrzymać z krwi obwodowej poprzez leukaferezę, aferezę, wirowanie w oparciu o gęstość, lizę różnicową, filtrację, wyszukiwanie przy użyciu przeciwciał lub przygotowywanie kożuszka. Wybrany sposób nie może powodować aktywacji monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych. Na przykład, jeżeli do wzbogacenia populacji komórek w prekursory wybrano wyszukiwanie przy użyciu przeciwciał, wybrane przeciwciała nie mogą aktywować komórek, np. poprzez indukowanie wypływu jonów wapnia, który może nastąpić w wyniku krzyżowego wiązania cząsteczek na powierzchni, do której wiążą się przeciwciała. Zwykle, w wyszukiwaniu przy użyciu przeciwciał stosowane są przeciwciała eliminujące makrofagi, komórki B, komórki NK, komórki T i tym podobne. Przeciwciała można stosować także do pozytywnej selekcji komórek monocytarnych, które wyrażają CD14.
PL 209 998 B1
W jednym z wykonań niniejszego wynalazku, nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych otrzymuje się zapobiegając silnemu przywieraniu populacji komórek zawierającej monocytarne prekursory komórek dendrytycznych do naczynia do hodowli komórkowych. Silnemu przywieraniu można zapobiegać poprzez, na przykład, dodawanie czynnika blokującego do pożywki hodowlanej stosowanej do utrzymywania prekursorów komórek dendrytycznych in vitro lub ex vivo. Do takich czynników blokujących należeć mogą wysokie stężenia białek, w tym na przykład między innymi, białek zwierzęcych lub ludzkich, takich jak albuminy, surowica, osocze, żelatyna, kwasy poliaminowe i tym podobne. W szczególności, zwykle stosowane są albuminy ludzkie lub wołowe. Zwykle stosuje się czynnik blokujący w stężeniu od około 1% do około 10% wag./obj. Konkretnie, albumina surowicy ludzkiej (HSA) może być stosowana w stężeniu około 1%, 2% do około 5% lub więcej. Należy zauważyć, że czynniki blokujące należy dobrać tak, aby same nie aktywowały komórek. Pożywką hodowlaną może być dowolna pożywka standardowo stosowana do hodowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych, w tym takie, które nie wymagają surowicy.
W innym wykonaniu wynalazku, moż na dodać czynnik chelatują cy metale w celu dalszego zapobiegania lub ograniczania aktywacji monocytarnych komórek dendrytycznych poprzez chelatowanie kationów dwuwartościowych, w tym na przykład, między innymi, jonów wapnia. Stosowanie naczyń do hodowli o słabym przywieraniu lub wiązaniu także może ograniczyć siłę przyłączania lub wiązania prekursorów komórek dendrytycznych w celu zapobiegania aktywacji komórek. Szczególnie korzystne nisko wiążące materiały obejmują, między innymi, polipropylen. Teflon®, PFTE i tym podobne. Czynnik chelatujący metale można stosować w połączeniu z czynnikami blokującymi opisanymi powyżej.
Monocytarne prekursory komórek dendrytycznych i niedojrzałe komórki dendrytyczne można także otrzymać w zamkniętym, aseptycznym układzie. Tak jak stosowano tutaj, termin „zamknięty, aseptyczny układ lub „układ zamknięty odnosi się do układu, w którym kontakt z niejałowym, otaczającym lub krążącym powietrzem lub innymi warunkami powodującymi brak jałowości jest zminimalizowany lub wyeliminowany. Zamknięte układy do izolacji prekursorów komórek dendrytycznych i niedojrzałych komórek dendrytycznych generalnie wykluczają wirowanie w gradiencie gęstości w otwartych probówkach, przenoszenie komórek w kontakcie z powietrzem, hodowanie komórek na szalkach do hodowli tkankowych lub w nie zamkniętych szczelnie butelkach i tym podobne. W typowym wykonaniu, zamknięty układ pozwala na aseptyczne przenoszenie prekursorów komórek dendrytycznych i niedojrzałych komórek dendrytycznych z początkowego naczynia do zbierania do szczelnie zamykanego naczynia do hodowli tkankowych bez kontaktu z niejałowym powietrzem.
W pewnych wykonaniach, nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych izolowane są poprzez częściowe przywieranie do substratu wiążącego monocyty, jak ujawniono w WO03/010292, ujawnienie którego włączono tutaj jako odniesienie. Przyk ładowo, moż na doprowadzić do kontaktu populacji leukocytów (np. wyizolowanych poprzez leukaferezę) z podłożem, do którego przylegają monocytarne prekursory komórek dendrytycznych, np. kulkami mikronośnika powlekanymi szkłem, w obecności czynnika blokującego zapobiegającego niespecyficznemu wiązaniu, a także zmniejszającego siłę wiązania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych. Gdy doprowadza się do kontaktu populacji leukocytów z podłożem, monocytarne prekursory komórek dendrytycznych z populacji leukocytów preferencyjnie, słabo przylegają do podłoża. Inne leukocyty (włączając w to inne potencjalne prekursory komórek dendrytycznych) np. proliferujące prekursory komórek dendrytycznych i tym podobne wykazują obniżone powinowactwo wiązania się do podłoża, przez co możliwe jest preferencyjne wzbogacenie na powierzchni podłoża klasy monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych. Słaba adhezja nie aktywuje monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych. Następnie po związaniu komórek i elucji nie przylegających komórek, klasa monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych jest wymywana z podłoża buforowanym roztworem soli, który można uzupełnić nietoksycznym czynnikiem chelatującym. Za „nietoksyczne czynniki chelatujące uważa się takie, które nie zmniejszają znacząco żywotności monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych, na przykład, między innymi, EDTA, EGTA i tym podobne.
Odpowiednie podłoża obejmują, na przykład, takie, które mają duży stosunek pola powierzchni do objętości, takie jak cząstki szklane lub mikronośniki pokryte szkłem. Takimi podłożami mogą być, na przykład, podłoża złożone z drobnych cząstek stałych (pył) lub z włókien. Odpowiednie podłoża złożone z drobnych cząstek stałych obejmują, na przykład, cząstki szklane, cząstki tworzywa sztucznego pokryte szkłem, cząstki polistyrenu pokryte szkłem, oraz inne ziarna odpowiednie do adsorpcji białek. Odpowiednie podłoża złożone z włókien obejmują szklane lub pokryte szkłem rurki mikrokapilarne i błony mikrokosmkowe. Podłoża złożone z drobnych cząstek stałych lub z włókien zwykle poPL 209 998 B1 zwalają na elucję przywierających monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych bez powodowania obniżenia żywotności przylegających komórek. Podłoża złożone z drobnych cząstek stałych lub z włókien mogą być zasadniczo nie porowate, aby umożliwić elucję monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych lub komórek dendrytycznych z podłoża. Podłoże „zasadniczo nie porowate to podłoże, w którym przynajmniej większość porów obecnych w podłożu jest mniejsza niż komórki, co zapobiega zamykaniu komórek w podłożu.
Przywieranie monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych do podłoża bez powodowania aktywacji może być ewentualnie modulowane poprzez dodawanie pożywki wiążącej. Odpowiednie pożywki wiążące obejmują pożywki do hodowli monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych (np. AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® i tym podobne) uzupełnione, pojedynczo lub w dowolnej kombinacji, np. cytokinami (np. czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF)), osoczem krwi, surowicą (np. ludzką surowicą, taką jak surowice autologiczne lub allogeniczne), oczyszczonymi białkami, takim jak albumina surowicy, kationami dwuwartościowymi (np. jony wapnia i/lub magnezu) i innymi cząsteczkami, które pomagają w specyficznym przywieraniu monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych do podłoża, lub które zapobiegają przywieraniu prekursorów nie monocytarnych komórek dendrytycznych do podłoża. W niektórych wykonaniach, osocze lub surowica krwi mogą być inaktywowane termicznie. Termicznie inaktywowane osocze może być autologiczne lub heterologiczne w stosunku do leukocytów.
W innym sposobie wzbogacania populacji komórek w monocytarne prekursory komórek dendrytycznych z próbki składników krwi stosuje się filtrację styczną leukocytów z debris komórkowego, krwinek czerwonych i innych komórek i cząstek w próbce krwi. Opis urządzenia i jego stosowanie są opisane w WO2004/000444, włączonym tu w całości jako odniesienie. Sposób obejmuje (1) wprowadzenie próbki krwi do jednostki filtracji stycznej (TFF, od ang. tangential flow filtration), gdzie jednostka zawiera komorę przepływu krzyżowego, komorę na filtrat oraz filtr na drodze płynu między komorą przepływu krzyżowego i komorą na filtrat, gdzie filtr ma pory od około 1 do około 10 mikronów, zazwyczaj około 5,5 mikronów; (2) recyrkularyzację próbki przez jednostkę TFF przy ustalonej wstępnie szybkości wprowadzania, zazwyczaj około 1400 ml/min., ustalonej wstępnie szybkości filtracji, zazwyczaj od około 15 do około 21 ml/min., bardziej typowo około 17 ml/min., gdzie ustalona wstępnie szybkość wprowadzania jest to najmniej pięciokrotność ustalonej wstępnie szybkości filtracji; gdzie ustalona wstępnie szybkość filtracji jest mniejsza niż szybkość filtracji dla filtra bez przeciwnego przepływu i (3) izolowanie populacji komórek wzbogaconej w leukocyty. Typowo czas filtracji wynosi około 60 do około 90 minut. Sposób może prowadzić do wzbogacania populacji komórek, która jest zasadniczo wolna od składników krwi innych niż leukocyty, włączając w to osocze, płytki krwi i erytrocyty. Wzbogacone populacje komórek wytwarzane przy zastosowaniu tej metody mogą zawierać co najmniej około 50% monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych, a korzystnie co najmniej około 70% monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych, które nie zostały zaktywowane. Sposób obejmuje ponadto pobranie krwi od dawcy i przygotowanie próbki z krwi poprzez leukaferezę, aferezę, wirowanie w oparciu o gęstość, lizę różnicową, filtrację lub przygotowywanie kożuszka przed filtracją styczną. Przeprowadzenie oczyszczania metodą TFC monocytarnych prekursorów DC w temperaturze pokojowej lub niższej (tj. poniżej 37°C) dalej pomaga w zmniejszeniu aktywacji komórek.
Populacje komórek wzbogacone w nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych hoduje się ex vivo lub in vitro w celu różnicowania i/lub ekspansji. (Tak jak tu się stosuje, wyizolowane niedojrzałe komórki dendrytyczne, prekursory komórek dendrytycznych, komórki T i inne komórki dotyczą komórek, które w wyniku działania człowieka istnieją poza swoim naturalnym środowiskiem, a zatem nie są produktem natury. Wyizolowane komórki mogą istnieć w postaci oczyszczonej, w postaci półoczyszczonej albo środowisku nienaturalnym). Pokrótce, różnicowanie ex vivo obejmuje hodowanie nie aktywowanych prekursorów komórek dendrytycznych albo populacji komórek zawierających nie aktywowane prekursory komórek dendrytycznych w obecności jednego albo większej liczby czynników kombinacji czynników różnicowania. Konkretnie, czynnikiem różnicowania według niniejszego wynalazku jest czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) stosowany sam bez innych dodawanych cytokin, a w szczególności bez stosowania interleukiny 4 (IL-4). W niektórych wykonaniach nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych różnicuje się z pochodzących z monocytów niedojrzałych komórek dendrytycznych zdolnych do indukowania aktywacji i proliferacji zasadniczej liczby komórek T w populacji komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej.
PL 209 998 B1
Prekursory komórek dendrytycznych można różnicować i utrzymywać jako niedojrzałe prekursory komórek dendrytycznych w odpowiednich warunkach hodowli. Odpowiednie pożywki do hodowli tkankowych obejmują AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® i tym podobne uzupełnione surowicą, aminokwasami, witaminami, kationami dwuwartościowymi i temu podobnymi w celu promowania różnicowania się komórek w komórki dendrytyczne. W niektórych wykonaniach, prekursory komórek dendrytycznych można hodować w pożywce wolnej od surowicy. Takie warunki hodowli mogą ewentualnie wykluczać jakiekolwiek produkty pochodzenia zwierzęcego. Typowo, GM-CSF dodaje się do pożywki hodowlanej w stężeniu od około 100 do około 1000 jednostek/ml, albo, typowo 500 jednostek/ml GM-CSF. Prekursory komórek dendrytycznych, po różnicowaniu się z utworzeniem niedojrzałych komórek dendrytycznych wykazują typowy wzór ekspresji białek powierzchniowych obserwowanych dla niedojrzałych monocytarnych komórek dendrytycznych, np. komórki są zazwyczaj CD14 i CD11c+, CD83- i wyraż ają niskie poziomy CD86. Dodatkowo, niedojrzał e komórki dendrytyczne są zdolne do wyłapywania rozpuszczalnych antygenów poprzez wyspecjalizowane mechanizmy pobierania.
Niedojrzałe komórki dendrytyczne można poddawać dojrzewaniu z wytworzeniem dojrzałych komórek dendrytycznych. Dojrzałe DC tracą zdolność do pobierania antygenu i komórki wykazują podwyższony poziom ekspresji kostymulacyjnych cząsteczek powierzchniowych i wydzielają rozmaite cytokiny. Konkretnie, dojrzałe DC wyrażają wysokie poziomy antygenów MHC klasy I i II i są ogólnie zidentyfikowane jako CD80+, CD83+, i CD86+. Większa ekspresja MHC prowadzi do zwiększonej gęstości antygenu na powierzchni DC, podczas gdy zwiększenie poziomu regulacji cząsteczek kostymulacyjnych CD80 i CD86 wzmacnia sygnał aktywacji komórek T poprzez odpowiednik cząsteczek kostymulacyjnych, takich jak CD28 na komórkach T.
Dojrzałe komórki dendrytyczne można otrzymać (tj. poddać dojrzewaniu) poprzez doprowadzenie do kontaktu niedojrzałych komórek dendrytycznych, które były hodowane w obecności samego
GM-CSF ze skutecznymi ilościami albo stężeniami czynników dojrzewania komórek dendrytycznych.
Czynniki dojrzewania komórek dendrytycznych mogą obejmować na przykład BCG, IFNy, LPS, TNFa i temu podobne. Skuteczne ilości BCG zazwyczaj mieszczą się w zakresie od około 105 do 107 jednostek tworzenia kolonii na mililitr pożywki do hodowli tkankowej. Skuteczne ilości IFNy zazwyczaj mieszczą się w zakresie od około 100-1000 jedn. na mililitr pożywki do hodowli tkankowej. Bacillus Calmette-Guerin (BCG) to awirulentny szczep M. bovis. Stosowany tu termin BCG dotyczy całego BCG, jak również składników ściany komórkowej, pochodzących z BCG lipoarabidomannanów i innych składników BCG, które są związane z indukcją odpowiedzi immunologicznej typu 2. BCG jest ewentualnie inaktywowany, na przykład BCG inaktywowany termicznie, BCG traktowany formaliną i tym podobne.
Zazwyczaj doprowadza się do kontaktu niedojrzałe DC ze skutecznymi ilościami BCG i IFNy przez od około jednej godziny do około 48 godzin. Niedojrzałe komórki dendrytyczne można hodować i poddawać dojrzewaniu w odpowiednich warunkach hodowli do dojrzewania. Odpowiednie pożywki do hodowli tkankowych obejmują AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® i tym podobne. Pożywki do hodowli tkankowych mogą być uzupełnione aminokwasami, witaminami, cytokinami, takimi jak GM-CSF, kationami dwuwartościowymi i temu podobnymi w celu promowania dojrzewania komórek. Typowo, stosuje się 500 jednostek/ml GM-CSF.
Dojrzewanie komórek dendrytycznych można śledzić przy zastosowaniu sposobów znanych w tej dziedzinie dla komórek dendrytycznych. Komórkowe markery powierzchniowe można wykrywać w testach znanych w tej dziedzinie, takich jak cytometria przepływowa, immunohistochemia i temu podobne. Komórki można ponadto śledzić pod kątem wytwarzania cytokin (np. poprzez ELISA, inny test immunologiczny albo poprzez użycie zastawu oligonukleotydów). Dojrzałe DC według niniejszego wynalazku również tracą zdolność do pobierania antygenu, co można analizować poprzez testy pobierania znane specjaliście w tej dziedzinie.
Antygeny
Dojrzałe, uczulone komórki dendrytyczne otrzymane przy zastosowaniu sposobów według niniejszego wynalazku mogą prezentować antygen komórkom T. Dojrzałe, uczulone komórki dendrytyczne można wytworzyć poprzez doprowadzenie do kontaktu niedojrzałych komórek dendrytycznych z ustalonym uprzednio antygenem albo przed albo w trakcie dojrzewania.
Odpowiednie ustalone uprzednio antygeny do zastosowania w niniejszym wynalazku mogą obejmować dowolny antygen, dla którego pożądana jest aktywacja komórek T. Takie antygeny obejmują między innymi komórki bakteryjne, antygeny swoiste dla nowotworu lub związane z nowotworem
PL 209 998 B1 (np. całe guzy lub komórki nowotworowe, lizat komórek nowotworowych, preparaty błonowe komórek nowotworowych, wyizolowane albo częściowo wyizolowane antygeny z nowotworów, białka fuzyjne, liposomy i temu podobne), cząstki wirusowe lub inne preparaty zawierające antygeny wirusowe i dowolny inny antygen albo fragment antygenu, np. antygen peptydowy albo polipeptydowy. W niektórych wykonaniach antygen może być związany z rakiem prostaty, na przykład antygenem może być między innymi swoisty dla prostaty antygen błonowy (PSMA, ang. prostate specific membrane antigen), kwaśna fosfataza z prostaty (PAP, ang. prostatic acid phosphatase) albo antygen swoisty dla prostaty (PSA). (Patrz np. Pepsidero i wsp., Cancer Res. 40:2428-32 (1980); McCormack i wsp., Urology 45:729-44 (1995). Antygenem może być również komórka bakteryjna, lizat bakteryjny, fragment błonowy z lizatu komórkowego albo dowolne inne źródło znane w tej dziedzinie. Antygen może być wyrażany albo wytwarzany poprzez rekombinowanie DNA a nawet syntetyzowany chemicznie. Zrekombinowany antygen może być również wyrażany na powierzchni komórki gospodarza (np. komórkach bakteryjnych, drożdżowych, owadzich lub ssaczych), może być obecny w lizacie albo oczyszczony z lizatu. Alternatywnie, antygen może być zakodowany przez kwasy nukleinowe, którymi mogą być kwas rybonukleinowy (RNA) lub kwas deoksyrybonukleinowy (DNA), które są oczyszczane lub powielane z komórki nowotworowej.
Antygen może być również obecny w próbce od pacjenta. Przykładowo, próbkę tkanki ze stanu hiperproliferacji lub innego stanu można użyć jako źródło antygenu. Taką próbkę można otrzymać na przykład poprzez biopsję albo wycięcie chirurgiczne. Taki antygen można użyć jako lizat albo wyizolowany preparat. Alternatywnie, można również zastosować preparat błon od pacjenta (np. pacjenta z rakiem) albo wyprowadzonej linii komórkowej jako antygen albo źródło antygenu albo kwas nukleinowy kodujący antygen.
W przykładowym wykonaniu, źródło antygenu można zastosować lizat komórek nowotworowych uzyskany z próbek chirurgicznych. Przykładowo, próbkę własnego guza pacjenta z rakiem otrzymaną przez biopsję albo wycięcie chirurgiczne można użyć bezpośrednio do prezentacji antygenu komórkom dendrytycznym albo w celu uzyskania lizatu komórkowego albo kwasów nukleinowych do prezentacji antygenu. Alternatywnie, można zastosować preparat błon z komórek nowotworowych pacjenta z rakiem. Komórką nowotworową może być na przykład komórka prostaty, płuc, jajnika, okrężnicy, mózgu, czerniaka lub dowolny inny typ. Lizat i preparat błon można otrzymać z izolowanych komórek nowotworowych przy zastosowaniu metod znanych w tej dziedzinie.
W innym przykładowym wykonaniu, jako antygen można również zastosować swoisty dla prostaty antygen błonowy (PSMA, znany również jako antygen PSM), który reaguje swoiście z przeciwciałem monoklonalnym 7E11-C.5. (Patrz ogólnie Horoszewicz i wsp., Prog. Clin. Biol. Res. 37:115-32 (1983), patent USA nr 5,162,504; patent USA nr 5,788,963; Feng i wsp.. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 32: (Abs. 1418) 238 (1991); ujawnienie których jest tu włączone jako odniesienie). W jeszcze innym przykładowym wykonaniu, jako antygen można zastosować antygenowy peptyd mający sekwencję reszt aminokwasowych Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val (NR ID. SEKW.: 1) (nazywany PSM-P1), który odpowiada resztom aminokwasowym 4-12 z PSMA. Alternatywnie, jako antygen można zastosować antygenowy peptyd mający sekwencję reszt aminokwasowych Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val (NR ID. SEKW.:2) (nazywany PSM-P2), który odpowiada resztom aminokwasowym 711-719 PSMA.
W konkretnym wykonaniu jako antygen można zastosować peptyd antygenowy mający sekwencję reszt aminokwasowych Xaa Leu (lub Met) Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val (lub Leu) (nazywany PSM-PX), gdzie Xaa reprezentuje dowolną resztę aminokwasową. Ten peptyd przypomina motyw wiążący HLA-A0201, tj. motyw wiążący złożony z 9-10 reszt aminokwasowych z „resztami kotwiczącymi, leucyną i waliną znajdywanymi u pacjentów HLA-A2. (Patrz np. Grey i wsp.. Cancer Surveys 22:37-49 (1995)). Peptyd ten można użyć jako antygen u pacjentów HLA-A2+ (patrz. Central Data Analysis Committee Allele Frequencies, Część 6.3, Tsuji, K. i wsp. (wyd.), Tokyo University Press, str. 1066-1077). Podobnie, można zastosować inne peptydy przypominające motyw wiążący HLA.
Typowo, niedojrzałe komórki dendrytyczne otrzymane sposobami według niniejszego wynalazku hoduje się w obecności czynnika dojrzewania komórek dendrytycznych, takiego jak BCG, IFNy, LPS, TNFa albo ich kombinacji, i ustalonego uprzednio antygenu w odpowiednich warunkach dojrzewania, jak opisano powyżej. Ewentualnie, niedojrzałe komórki dendrytyczne można mieszać z ustalonym uprzednio antygenem w typowej pożywce do hodowli komórek dendrytycznych z albo bez GMCSF i/lub czynnika dojrzewania. Po co najmniej 10 minutach do około 2 dni hodowli z antygenem, antygen można usunąć i można dodać pożywkę hodowlaną uzupełnioną BCG i IFNy. GM-CSF można
PL 209 998 B1 również dodać do pożywki do dojrzewania bez dodatkowych cytokin, takich jak IL-4. Sposoby doprowadzenia do kontaktu komórek dendrytycznych z antygenem są generalnie dobrze znane w tej dziedzinie. (Patrz ogólnie Steel i Nutman, J. Immunol. 160:351-60 (1998); Tao i wsp., J. Immunol. 158:4237-44 (1997); Dozmorov i Miller, Cell Immunol. 178:187-96 (1997); Inaba i wsp., J Exp Med. 166:182-94 (1987); Macatonia i wsp., J Exp Med. 169:1255-64 (1989); De Bruijn i wsp., Eur. J. Immunol. 22:3013-20 (1992); ujawnienie których jest tu włączone jako odniesienie).
Otrzymane w rezultacie dojrzałe, uczulone komórki dendrytyczne hoduje się jednocześnie z komórkami T, takimi jak dziewicze komórki T. Komórki T, albo podgrupę komórek T można otrzymać z róż nych tkanek limfoidalnych do zastosowania jako komórki odpowiedzi. Takie tkanki obejmują mię dzy innymi śledzionę, węzły limfatyczne i/lub krew obwodową. Komórki można hodować jednocześnie z dojrzałymi, uczulonymi komórkami dendrytycznymi jako mieszana populacja komórek T albo jako oczyszczona podgrupa komórek T. Oczyszczenie komórek T można uzyskać poprzez pozytywną albo negatywną selekcję, włączając w to między innymi zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciw CD2, CD3, CD4, CD8 i tym podobne.
Poprzez doprowadzenie do kontaktu komórek T z dojrzałymi uczulonymi komórkami dendrytycznymi uzyskuje się reaktywne wobec antygenu albo aktywowane, spolaryzowane komórki T albo limfocyty T. Stosowany tu termin „spolaryzowany dotyczy komórek T, które wytwarzają wysokie poziomy IFNy, albo w inny sposób uczulonych do odpowiedzi typu 1 (Th-1). Takie sposoby typowo obejmują doprowadzenie do kontaktu komórek dendrytycznych z BCG i IFNy w celu otrzymania dojrzałych, uczulonych komórek dendrytycznych. Niedojrzałe komórki dendrytyczne można doprowadzić do kontaktu z ustalonym uprzednio antygenem w trakcie albo przed dojrzewaniem. Niedojrzałe komórki dendrytyczne można hodować jednocześnie z komórkami T (np. dziewiczymi komórkami T) w trakcie dojrzewania albo hodować jednocześnie z komórkami T (np. dziewiczymi komórkami T) po dojrzewaniu i uczuleniu komórek dendrytycznych do odpowiedzi typu 1. Ponadto niedojrzałe i dojrzałe komórki dendrytyczne można częściowo oczyszczać lub wzbogacać przed dojrzewaniem. Dodatkowo, można wzbogacić populację limfocytów w komórki T przed doprowadzeniem do kontaktu z komórkami dendrytycznymi. W konkretnym wykonaniu wzbogacone albo oczyszczone populacje komórek T CD4+ doprowadza się do kontaktu z dojrzałymi, uczulonymi komórkami dendrytycznymi. Jednoczesne hodowanie dojrzałych, uczulonych komórek dendrytycznych z komórkami T prowadzi do stymulacji specyficznych komórek T, które dojrzewają w reaktywne wobec antygenu komórki T CD4+ lub reaktywne wobec antygenu komórki T CD8+.
W innym aspekcie dostarczone są sposoby restymulacji komórek T in vitro poprzez hodowanie komórek w obecności niedojrzałych komórek dendrytycznych albo dojrzałych komórek dendrytycznych uczulonych w kierunku odpowiedzi komórkowej typu 1 (Th-1). Takie komórki T można hodować na komórkach odżywczych. Niedojrzałe komórki dendrytyczne lub dojrzałe, uczulone komórki dendrytyczne mogą być ewentualnie napromieniowane przed doprowadzeniem do kontaktu z komórkami T. Odpowiednie warunki hodowli mogą obejmować jedną lub większą liczbę cytokin (np. oczyszczoną IL-2, supernatant znad komórek śledziony stymulowanych konkanawaliną A, interleukinę 15 (IL-15) i tym podobne, jak również ich kombinację). Taką restymulację in vitro komórek T można zastosować do promowania ekspansji populacji komórek T.
Stabilną, swoistą wobec antygenu, spolaryzowaną hodowlę komórek T albo linię komórek T można utrzymywać in vitro przez dłuższe okresy czasu poprzez okresową restymulację. Hodowlę komórek T albo linię komórek T wytworzoną w ten sposób można przechowywać, i jeżeli została zabezpieczona (np. przez zmieszanie z czynnikiem ochronnym do mrożenia i zamrożenie), stosować, aby ponownie dostarczyć aktywowanych, spolaryzowanych komórek T w pożądanych odstępach czasu do długotrwałego stosowania.
W pewnych wykonaniach, aktywowane komórki T CD8+ lub CD4+ można wytwarzać zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku. Typowo, dojrzałe, uczulone komórki dendrytyczne zastosowane do wytworzenia reaktywnych wobec antygenu dojrzałych, spolaryzowanych komórek T są syngeniczne wobec osobnika, któremu mają zostać podane (np. są otrzymane od osobnika). Alternatywnie, komórki dendrytyczne mające taki sam haplotyp HLA co osobnik, który ma być biorcą, można wytworzyć in vitro stosując komórki nienowotworowe (np. komórki prawidłowe) od dawcy zgodnego pod względem HLA. W konkretnym wykonaniu, reaktywne wobec antygenu komórki T, włączając w to komórki CTL i Th-1, namnaża się in vitro jako źródło komórek do leczenia.
Zgodnie z jeszcze innym aspektem wynalazku, nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych, niedojrzałe komórki dendrytyczne i dojrzałe uczulone komórki dendrytyczne możPL 209 998 B1 na przechowywać, np. przechowywać w stanie zamrożenia. Każdą populację można odzyskać przed kontynuowaniem opisanego tu sposobu. Przykładowo, monocytarne prekursory komórek dendrytycznych można otrzymać od pacjenta w postaci produktu leukaferezy albo aferezy przed hodowaniem w pożywce dla komórek dendrytycznych w obecności czynnika blokującego adhezję i GM-CSF w celu wytworzenia i utrzymania niedojrzałych komórek dendrytycznych. Po wytworzeniu niedojrzałych komórek dendrytycznych komórki te można przechowywać w stanie zamrożenia albo przed wystawieniem na działanie antygenu i dojrzewaniem albo przed podawaniem osobnikowi, który ma być leczony. Czynniki do przechowywania w stanie zamrożenia, które można zastosować, obejmują między innymi dimetylosulfotlenek (DMSO), glicerol, poliwinylpirolidon, glikol polietylenowy, albuminę, dekstran, sacharozę, glikol etylenowy, i-erytrytol, D-rybitol, D-mannitol, D-sorbitol, i-inozytol, D-laktozę, chlorek choliny, aminokwasy, metanol, acetamid, monooctan glicerolu i sole nieorganiczne. Różne czynniki do przechowywania w stanie zamrożenia i różne typy komórek mają typowo różne optymalne szybkości chłodzenia. Ciepło fazy przejściowej, gdzie woda przemienia się w lód, typowo powinno być minimalne. Procedurę chłodzenia powinno się wykonywać przez zastosowanie na przykład programowalnych urządzeń do chłodzenia albo procedury z łaźnią metanolową. Programowalne urządzenia do chłodzenia umożliwiają ustalenie optymalnego tempa chłodzenia i ułatwiają standardowe powtarzalne schładzanie. Programowalne urządzenia do chłodzenia z kontrolowaną szybkością, takie jak Cryomed lub Planar, umożliwiają precyzyjne dopasowanie trybu chłodzenia do pożądanej krzywej szybkości chłodzenia.
Po starannym zamrożeniu, komórki dendrytyczne można szybko przenieść do naczynia do długotrwałego przechowywania w stanie zamrożenia. W typowym wykonaniu próbki można przechowywać w stanie zamrożenia w ciekłym azocie (-196°C) lub jego parach (-165°C). Uwarunkowania i procedury manipulacji, przechowywania w stanie zamrożenia i długotrwałego przechowywania krwiotwórczych komórek macierzystych, a w szczególności ze szpiku kostnego albo krwi obwodowej mają w dużej mierze zastosowanie wobec nieaktywowanych komórek dendrytycznych według niniejszego wynalazku. Dyskusję na temat przechowywania w stanie zamrożenia dla krwiotwórczych komórek macierzystych można znaleźć na przykład w następujących odnośnikach, włączonych tu jako odniesienie: Taylor i wsp., Cryobiology 27:269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15:19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, Lip. 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, str. 107-186.
Zamrożone komórki zazwyczaj rozmraża się szybko (np. w łaźni wodnej utrzymywanej w 37°-41°C) i schładza się natychmiast po rozmrożeniu. Może być pożądane traktowanie komórek w celu zapobiegania zlepianiu się komórek po rozmrożeniu. Aby zapobiegać zlepianiu, można zastosować różne procedury, w tym między innymi dodawanie przed i/lub po zamrożeniu DNazy (Spitzer i wsp., Cancer 45: 3075-85 (1980)), dekstranu o niskiej masie cząsteczkowej i cytrynianu, skrobi hydroksyetylowej (Stiff i wsp., Cryobiology 20: 17-24 (1983)) i tym podobnych. Czynnik chroniący przy zamrażaniu, jeżeli jest toksyczny dla ludzi, powinien być usunięty przed zastosowaniem terapeutycznym rozmrożonych słabo przywierających komórek dendrytycznych. Jednym ze sposobów usuwania czynnika chroniącego przy zamrażaniu jest rozcieńczanie do nieistotnego stężenia. Po zamrożeniu DC można rozmrażać i odzyskiwać i można je stosować do aktywacji komórek T, jak tu opisano w odniesieniu do nie zamrożonych DC.
Podawanie populacji komórek in vivo
W innym aspekcie wynalazku dostarczone są sposoby podawania dojrzał ych, uczulonych komórek dendrytycznych albo aktywowanych spolaryzowanych komórek T albo populacji komórek zawierających takie komórki osobnikowi wymagającemu immunostymulacji. Takie populacje komórek mogą obejmować niedojrzałe komórki dendrytyczne, komórki dendrytyczne poddane częściowemu dojrzewaniu, populacje dojrzałych, uczulonych komórek dendrytycznych i/lub populacje aktywowanych spolaryzowanych komórek T. W niektórych wykonaniach sposoby przeprowadza się poprzez otrzymanie nie aktywowanych prekursorów komórek dendrytycznych lub niedojrzałych komórek dendrytycznych, różnicowanie tych komórek przy zastosowaniu GM-CSF w nieobecności dodatkowych cytokin i poddanie dojrzewaniu tych komórek w obecności czynnika dojrzewania, takiego jak, na przykład
BCG, i/lub IFNy i ustalonego wstępnie antygenu w celu wytworzenia populacji dojrzałych komórek dendrytycznych uczulonych w kierunku odpowiedzi Th-1. Można doprowadzić do kontaktu niedojrzałych komórek dendrytycznych z antygenem przed albo w trakcie dojrzewania. Takie niedojrzałe uczulone komórki dendrytyczne można podawać bezpośrednio osobnikowi wymagającemu immunostymulacji.
PL 209 998 B1
W pokrewnym wykonaniu, można doprowadzić do kontaktu dojrzałych uczulonych komórek dendrytycznych z limfocytami od osobnika w celu stymulacji komórek T w obrębie populacji limfocytów. Aktywowane, spolaryzowane limfocyty, poddane ewentualnie klonalnemu namnażaniu w hodowli komórkowej aktywnych wobec antygenu limfocytarnych komórek T CD4+ i/lub CD8+ można podawać osobnikowi wymagającemu immunostymulacji. W niektórych wykonaniach aktywowane, spolaryzowane komórki T są autologiczne wobec osobnika.
W innym wykonaniu komórki dendrytyczne, komórki T i osobnik będący biorcą mają ten sam haplotyp MHC (HLA). Sposoby ustalania haplotypu HLA osobnika są znane w tej dziedzinie. W pokrewnym wykonaniu, komórki dendrytyczne i/lub komórki T są allogeniczne względem osobnika będącego biorcą. Przykładowo, komórki dendrytyczne mogą być allogeniczne wobec komórek T i biorcy, które mają ten sam haplotyp MHC (HLA). Komórki allogeniczne typowo pasują do co najmniej jednego allelu MHC (np. mają wspólne co najmniej jeden ale nie wszystkie allele MHC). W mniej typowym wykonaniu, komórki dendrytyczne, komórki T i komórki osobnika będącego biorcą są wszystkie allogeniczne względem siebie, ale wszystkie mają co najmniej jeden wspólny allel MHC.
Według jednego z wykonań, komórki T są otrzymane od tego samego osobnika, od którego otrzymane zostały niedojrzałe komórki dendrytyczne. Po dojrzewaniu i polaryzacji in vitro, autologiczne komórki T podaje się osobnikowi w celu sprowokowania i/lub zwiększenia istniejącej odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo, komórki T można podawać poprzez wlew dożylny, na przykład w dawkach około 108-109 komórek/m2 pola powierzchni ciała (Patrz np. Ridell i wsp., Science 257:238-41 (1992), włączone tu jako odniesienie). Wlew można powtarzać w pożądanych odstępach, na przykład co miesiąc. Biorców można monitorować w trakcie i po wlewie komórek T pod kątem występowania niekorzystnych efektów ubocznych.
Według innego wykonania komórki dendrytyczne otrzymane w procesie opisanym w niniejszym wynalazku hoduje się jedynie w obecności GM-CSF, poddaje dojrzewaniu przy użyciu BCG i IFNy i zgodnie z niniejszym wynalazkiem można je wstrzykiwać bezpośrednio do guza nowotworowego, regionu otaczającego guz nowotworowy albo innej tkanki zawierającej docelowy antygen. Takie dojrzałe komórki mogą pobrać antygen i prezentować antygen komórkom T in vivo.
Następujące przykłady są dostarczone jedynie jako ilustracja rozmaitych aspektów wynalazku i nie powinny być traktowane jako ograniczające wynalazek w jakiekolwiek sposób.
P r z y k ł a d 1
W tym przykładzie pokazano, że różnicowanie monocytów in vitro w komórki dendrytyczne CD1a+ w obecności samego GM-CSF wymaga, aby komórkom nie pozwolono na początkowe przywieranie do naczynia hodowlanego.
Pokrótce, monocyty CD14+CD1a- zawieszano albo w pożywce Dulbecco zmodyfikowanej przez Iscove (IMDM, BioWhittaker) plus 2 mM L-glutamina (Gibco BRL) albo X-VIVO-15® (BioWhittaker) plus 3% ludzka albumina surowicza (HSA, Bayer). Zawiesiny komórek przenoszono do butelek hodowlanych T-25 (Greiner) i inkubowano przez 30 minut w inkubatorze w 6% CO2, 37°C. Po inkubacji dodawano ludzką albuminę surowiczą (HSA) i czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytówmakrofagów (GM-CSF, Immunex), tak aby uzyskać końcowe stężenie 3% HSA i 500 jednostek/ml GM-CSF. Obydwie hodowle inkubowano przez 4 dni w inkubatorze w 6% CO2, 37°C. Ekspresję powierzchniową CD14 i CD1a analizowano przy użyciu wyznakowanych przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec cząsteczek i wykrywanie przy zastosowaniu cytometru przepływowego. Kropkowane histogramy reprezentują barwienie kontroli izotypowej (tło) (Fig. 1).
Komórki, monocyty inkubowane wyjściowo w pożywce bez HSA wykazywały mocne przywieranie do tworzywa sztucznego, co ustalono poprzez mikroskopię z kontrastem fazowym jako rozpłaszczanie się komórek na powierzchni, podczas gdy komórki inkubowane w pożywce z HSA wykazywały zmniejszony zakres adhezji. Przejawiało się to jako kulisty kształt komórek, co ustalano poprzez mikroskopię z kontrastem fazowym. Po 4 dniach w hodowli, wcześniejsza hodowla zachowywała pewną ekspresję CD14 i bardzo niską ekspresję CD1a. (Fig. 1). W przeciwieństwie do tego większość komórek, które nie mogły przywrzeć ściśle do powierzchni naczynia hodowlanego, było CD14- i CD1a+, co jest charakterystyczne dla niedojrzałych komórek dendrytycznych.
W innym przykładzie wykazano, że monocyty mogły różnicować się in vitro w komórki dendrytyczne CD1a+ w obecności samego GM-CSF, kiedy komórkom nie pozwolono na przywieranie do torebki hodowlanej z Teflon®u.
Pokrótce, izolowane monocyty od dwóch dawców poddanych leukaferezie zawieszano niezależnie w X-VIVO-15® (BioWhittaker) plus czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów-makrofagów
PL 209 998 B1 (GM-CSF, Immunex) i ludzka albumina surowicza (HSA, Plasbumin™, Bayer), tak aby uzyskać końcowe stężenie 500 jednostek/ml GM-CSF i 2% HSA w torebkach z Teflon®u. Zawiesiny komórek w torebkach przenoszono do inkubatora do 6% CO2, 37°C na 5 dni. Na zakończenie okresu hodowli dodawano do hodowli czynniki dojrzewania (rozcieńczenie 1:400 inaktywowanego BCG (Organon-Teknika) i 500 jedn./ml IFN-γ (R and D Systems)). Pozwolono, aby proces dojrzewania zachodził przez 4 godziny. Ekspresję powierzchniową CD14 i CD1a na „żywych komórkach analizowano po bramkowaniu z rozrzutem przednim (FS, ang. forward scatter) i rozrzutem bocznym (SS, ang. side scatter) z wyznakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi dla cząsteczek, stosując analizę przepływową komórek aktywowaną fluorescencją (Fig. 2A i 2B). Przeciwciała dla kontroli izotypowej zastosowano jako kontrole dla tła fluorescencji i były to IgG1 w przypadku przeciwciała swoistego wobec CD1a oraz IgG2b w przypadku przeciwciała swoistego wobec CD14.
Wyizolowane wyjściowo komórki prekursorowe wyrażały wysokie poziomy CD14 i wyrażały bardzo niskie albo wcale CD1a, typowego dla monocytów. (Fig. 2A i 2B). W przeciwieństwie do tego większość komórek po hodowli o słabym przywieraniu, było CD14- i CD1a+, czego należało oczekiwać od komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów.
P r z y k ł a d 2
W tym przykładzie niedojrzałe komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów, którym nie pozwolono na przywieranie do powierzchni naczynia hodowlanego, poddawano dojrzewaniu i testowano pod kątem wydzielania IL-12. Ilość IL-12 wydzielanej z komórek dendrytycznych porównywano z dojrzałymi komórkami dendrytycznymi izolowanymi przy zastosowaniu typowych metod i hodowanymi w obecności GM-CSF i IL-4.
Pokrótce, przechowywane w stanie zamrożenia monocyty zawieszano w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce Dulbecco zmodyfikowanej przez Iscove (IMDM, BioWhittaker) plus 2 mM L-glutamina (Gibco BRL) w nieobecności albo obecności 3% ludzkiej albuminy surowiczej (HSA, Bayer). Zawiesinę komórek przenoszono do dwóch butelek hodowlanych (Greiner) dla danego warunku i hodowano przez 30 minut w inkubatorze z nawilżaniem w 6% CO2, 37°C. Po okresie inkubacji dodawano HSA, tak aby uzyskać końcowe stężenie 3% HSA we wszystkich butelkach. Do hodowli w każdych warunkach dodawano czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF, Immunex) lub GM-CSF i interleukinę-4 (IL-4, R & D Systems) w stężeniu 500 jednostek/ml. Wszystkie hodowle inkubowano przez 4 dni w inkubatorze z nawilżaniem w 6% CO2, 37°C. Na zakończenie okresu hodowli dodawano do butelek czynniki dojrzewania (rozcieńczenie 1:400 inaktywowanego Bacillus Calmette-Guerrin (BCG, Organon-Teknika) i 500 jedn./ml interferonu-γ (IFN-γ R and D Systems)). Pozwolono, aby proces dojrzewania zachodził przez 18-24 godziny. Supernatanty znad hodowli zbierano i badano pod kątem wydzielenia IL-12 p70. Porównano wyniki z dwóch odrębnych doświadczeń. W obydwu doświadczeniach wydzielenie IL-12 p70 wykrywano w hodowlach uzupełnionych samym GM-CSF lub GM-CSF i IL-4. (Fig. 3). Dodatkowo monocyty, którym umożliwiono wstępnie ścisłe przywieranie, a następnie hodowlę w samym GM-CSF, nie wydzielały IL-12 p70 w obydwu doświadczeniach. W jednym z doświadczeń, wydzielenie IL-12 p70 wykrywano w hodowli, w której umożliwiono wstępnie ścisłe przywieranie, a następnie hodowano przez 4 dni w obecności GM-CSF i IL-4.
P r z y k ł a d 3
W tym przykładzie ekspresję komórkowych markerów powierzchniowych typowych dla komórek dendrytycznych testowano w hodowlach nie aktywowanych monocytów w obecności samego GM-CSF. Nie aktywowane monocyty hodowane w obecności samego GM-CSF wykazywały ekspresję komórkowych markerów powierzchniowych typowych dla dojrzałych DC.
Pokrótce, przechowywane w stanie zamrożenia monocyty zawieszano w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli DC zawierającej X-VIVO-15® (BioWhittaker), 2% ludzkiej albuminy surowiczej (Bayer) i 500 jedn./ml GM-CSF (Immunex). Zawiesinę komórek przenoszono do butelki do hodowli tkankowych (Greiner) i hodowano przez 4 dni w inkubatorze z nawilżaniem w 6% CO2, 37°C. Na zakończenie okresu hodowli dodawano do hodowli czynniki dojrzewania (rozcieńczenie 1:400 inaktywowanego BCG (Organon-Teknika) i 500 jedn./ml IFN-γ (R and D Systems)). Pozwolono, aby proces dojrzewania zachodził przez 18-24 godziny. Dojrzałe DC zebrano i scharakteryzowano. Komórki poddano reakcji z wyznakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi wobec CD11c, CD1a, CD40, CD80, CD86, CD54 i CD83. Dodatkowo, komórki barwiono jodkiem propidyny. Znacznik wykrywano metodą cytometrii przepływowej. Dane te pokazują, że 80% odzyskiwanych komórek stanowiły żywe DC (CD11c+ i jodek propidyny). Ponadto, te komórki wyrażały typowe markery DC,
PL 209 998 B1 tj. wykazywały brak ekspresji CD14 oraz ekspresję CD11c, CD1a, CD40, CD80, CD86, CD54 oraz CD83. (Fig. 4).
P r z y k ł a d 4
W tym przykładzie dla monocytowych komórek prekursorowych komórek dendrytycznych, które były hodowane w obecności środka blokującego adhezję, testowano kinetykę różnicowania in vitro w komórki dendrytyczne w poż ywce uzupełnionej samym GM-SCF.
Pokrótce, przechowywane w stanie zamrożenia monocyty zawieszano w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli DC zawierającej X-VIVO-15® (BioWhittaker), 2% ludzkiej albuminy surowiczej (Bayer) i 500 jedn./ml GM-CSF (Immunex). Zawiesinę komórek przenoszono do torebki z Teflon®u (American Fluoroseal), i hodowano przez 5 dni w inkubatorze z nawilż aniem w 6% CO2,
37°C. Piątego dnia do torebki dodano czynniki dojrzewania (rozcieńczenie 1:400 inaktywowanego
BCG (Organon-Teknika) i 500 jedn./ml IFN-γ (R and D Systems)). Pozwolono, aby proces dojrzewania zachodził przez 18 godzin. Komórki codziennie zbierano z torebki do analiz metodą cytometrii przepływowej wyrażania CD14 i CD1a. Dane z tych analiz wykazały, że przekształcenie z monocytów (CD14+ i CD1a-) w DC (CD14- i CD1a+) zaczęło się między 1 i 2 dniami po rozpoczęciu hodowli. (Fig. 5). Do dnia 3 przekształcenia fenotypów zakończyły się.
P r z y k ł a d 5
W tym przykładzie porównywano fenotyp DC hodowanych albo w torebce teflonowej albo w butelkach w różnych warunkach hodowli. Komórki hodowano albo w samym GM-CSF, albo w GM-CSF uzupełnionym IL-4. Dokonano również porównania dla fenotypu komórek, które były albo nie były wystawione na działanie czynników dojrzewania.
Pokrótce, monocyty zawieszano w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w X-VIVO-15® (BioWhittaker) i 2% HSA (Bayer) uzupełnionej 500 jedn./ml samego GM-CSF (Immunex) albo GM-CSF w kombinacji z 500 jedn./ml IL-4. Zawiesiny komórek (powtórzone torebki dla każdego warunku hodowli) hodowano w torebkach z Teflonu® (Americal Fluoroseal) albo butelkach do hodowli tkankowych (jedynie kombinacja GM-CSF/IL-4) w inkubatorze z nawilżaniem w 6% CO2, 37°C. Po 5 dniach, do jednej z powtórzonych hodowli w torebkach z Teflonu®, jak również hodowli w butelce dodawano czynniki dojrzewania (rozcieńczenie 1:400 inaktywowanego BCG (Organon-Teknika) i 500 jedn./ml IFN-γ (R and D Systems)). 6 dnia wszystkie hodowle zbierano. Ich fenotypy analizowano w czasie barwienia monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi wobec CD80, CD83, CD86 i HLA-DR z detekcją metodą cytometrii przepływowej.
Większość DC ze wszystkich pięciu warunków hodowli wyrażało CD1a (89-97%). (Fig. 6A). W obydwu hodowlach, GM-CSF i GM-CSF/IL-4, znaczącą ekspresję markera dojrzewania DC, CD83, (Fig. 6B) obserwowano jedynie w hodowlach wystawionych na działanie czynników dojrzewania. Dodatkowo, obserwowano znaczący wzrost ekspresji powierzchniowej cząsteczek kostymulacyjnych (CD80 i CD86, Fig. 6C i 6D), jak również HLA-DR (Fig. 6E), ponieważ te DC uległy dojrzewaniu. Poziomy ekspresji tych cząsteczek były bardzo podobne we wszystkich trzech populacjach dojrzałych DC.
Dodatkowo, funkcje stymulacji komórek T przez DC wytworzone z monocytów poddanych początkowo etapowi mocnego przywierania porównywano z DC wytworzonymi w nieobecności mocnego przywierania w obecności czynnika blokującego adhezję. W tych badaniach zastosowano dwa źródła monocytów jako wyjściowe populacje. W przypadku populacji monocytów mocno przywierających, jednojądrzaste komórki z krwi obwodowej (PBMC) inkubowano w OPTIMEM-1 (Gibco BRL) plus 1% inaktywowanego termicznie autologicznego osocza przez 1 godzinę w butelce do hodowli tkankowej (Greiner). Po inkubacji nie przywierające komórki usuwano, pozostawiając wzbogaconą populację przywierających aktywowanych monocytów na powierzchni butelki. W celu otrzymania populacji nie aktywowanych monocytów, monocyty otrzymano z kolumny (ang. bead box) zawierającej szklane kulki mikronośnika opłaszczone ludzką albuminą surowiczą (HSA).
Każdą z populacji monocytów, aktywowaną i nie aktywowaną inkubowano następnie w X-VIVO-15® z 2% HSA w obecności samego GM-CSF albo w kombinacji z IL-4 przez 5 dni. Otrzymane w rezultacie niedojrzałe DC ładowano 40-merowym peptydem grypy A M1-A4 z hemocyjaniną ze skałoczepa (KLH) przez jedną godzinę przed przemywaniem i dojrzewaniem przy użyciu BCG (roz. 1:400) i IFN-γ (500 jedn./ml). Po zebraniu i przepłukaniu dojrzałych DC, nastawiono jednoczesne hodowle z DC i autologicznymi PBMC przy proporcji 1:10 DC:PBMC w AIM-V® plus 5% ludzka surowica AB (HuAB Sera) uzupełniona 20 ng/ml IL-2 od dnia 2 do dnia 8. Po ośmiu dniach hodowli, linie komórek T zbiePL 209 998 B1 rano i analizowano pod kątem ekspansji komórek T CD8 swoistych wobec M1-A4 (komórki T Ve17+ CD8+) metodą cytometrii przepływowej.
W porównaniu z kontrolami KLH, DC wytwarzane poprzez przywieranie do tworzywa sztucznego wymagają IL-4 dla wytwarzania odpowiedzi swoistej wobec grypy (M1-A4). (Fig. 7A). Jednakże DC wytwarzane z monocytów izolowanych z kulek (nie aktywowanych) są bardziej wydajne w inicjowaniu wtórnej odpowiedzi komórek T CD8, kiedy sam GM-CSF był stosowany w trakcie ich wytwarzania. (Fig. 7B).
P r z y k ł a d 6
W tym przykładzie ekspresję komórkowych markerów powierzchniowych typowych dla komórek dendrytycznych testowano dla nie aktywowanych monocytów, które zostały wzbogacone poprzez filtrację styczną i hodowane w obecności samego GM-CSF. Nie aktywowane monocyty hodowane w obecności samego GM-CSF wykazywały ekspresję komórkowych markerów powierzchniowych typowych dla dojrzewających DC.
Pokrótce, przechowywane w stanie zamrożenia monocyty wyizolowano uprzednio w procesie filtracji stycznej od dwóch dawców krwi. Proces ten obejmował TFF próbki monocytów w urządzeniu mającym filtr o rozmiarze porów 5,5 mikronów. Szybkość recyrkularyzacji (wprowadzania) wynosiła około 1400 ml/min, szybkość filtracji wynosiła około 17 ml/min., a czas wynosił około 90 min. Wzbogacone monocytarne prekursory komórek dendrytycznych hodowano niezależnie w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli DC zawierającej X-VIVO-15® (BioWhittaker), 2% ludzkiej albuminy surowiczej (Bayer) i 500 jedn./ml GM-CSF (Immunex). Zawiesinę komórek hodowano w torebkach z Teflonu® przez 5 dni w inkubatorze z nawilżaniem w 6% CO2, 37°C. Na zakończenie okresu hodowli dodawano do hodowli czynniki dojrzewania (rozcieńczenie 1:400 inaktywowanego BCG (OrganonTeknika) i 500 jedn./ml IFN-γ (R and D Systems)). Pozwolono, aby proces dojrzewania zachodził przez 4 godziny. Dojrzewające DC zbierano i charakteryzowano. Komórki poddano reakcji z wyznakowanymi przeciwciałami monokonalnymi swoistymi wobec CD11c, CD1a, CD40, CD80, CD86, CD54 i CD83. Ekspresję markerów na „żywych komórkach analizowano po bramkowaniu przy rozrzucie przednim (FS, ang. forward scatter) i rozrzucie bocznym (SS, ang. side scatter) z wyznakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi swoistymi dla cząsteczek i wykrywanie przy zastosowaniu cytometrii przepływowej. Dodatkowo, komórki barwiono jodkiem propidyny. Znacznik wykrywano metodą cytometrii przepływowej. Więcej niż 80% odzyskiwanych komórek stanowiły linie monocytów, które wyrażały CD11c i były „żywymi DC (jodek propidyny, nie pokazano). Co znaczące, komórki, które różnicowały się w nieobecności IL4, wyrażały typowe markery DC, tj. zmniejszoną ekspresję CD14 i ekspresję CD1a, CD40, CD80, CD86, CD54 i CD83 (Fig. 8A i 8B). Fluorescencję tła mierzono przy zastosowaniu przeciwciał dla kontroli izotypowej i były to IgG1, z ekspresją CD14, gdzie kontrolą izotypową było przeciwciało IgG2b.
P r z y k ł a d 7
W tym przykładzie ustalono, że monocyty, które miały kontakt z powierzchniami tworzywa sztucznego (tj. butelkami do hodowli tkankowych), stawały się aktywowane, o ile ścisłe oddziaływanie nie było blokowane przez dodanie czynnika blokującego, takiego jak ludzka albumina surowicza (HAS).
Monocyty (1x106/ml) wysiewano w butelkach do hodowli tkankowych w pożywce Dulbecco zmodyfikowanej przez Iscove (IMDM) z albo bez 3% (wag./obj.) HSA, przez około 1 godzinę. Po 1 godzinie inkubacji w 37°C, dodawano również 3% HSA do hodowli, która była wyjściowo wysiewana w nieobecności HSA, obydwie hodowle inkubowano przez noc w 37°C. Następnie zbierano supernatanty i mierzono poziomy różnych cytokin, które są typowo związane z aktywacją monocytów. Stężenia cytokin (ng/ml) są pokazane w Tabeli 1 poniżej.
Tabela 1
| Cytokina | Bez HSA | 3% HSA |
| Interleukina 8 | 7192 | 710 |
| Interleukina 6 | 752 | 200 |
| TNF-alfa | 44 | <5 |
Poprzednie przykłady są dostarczone w celu ilustracji, a nie ograniczenia zakresu, zastrzeganych wynalazków. Inne warianty wynalazków będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie i objęte załączonymi zastrzeżeniami. Wszystkie publikacje, patenty, zgłoszenia patentowe i inne zacytowane tu odnośniki są tu włączone jako odniesienie.
Claims (22)
1. Sposób in vitro lub ex vivo różnicowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzałe komórki dendrytyczne, znamienny tym, że obejmuje:
a) dostarczanie populacji komórek zawierających nie aktywowane monocytarne prekursory komórek dendrytycznych;
b) doprowadzanie do kontaktu nieaktywowanych prekursorów komórek dendrytycznych w naczyniu hodowlanym z pożywką hodowlaną dla komórek dendrytycznych uzupełnioną czynnikiem stymulującym wzrost kolonii granulocytów-makrofagów w nieobecności dodatkowych cytokin, przy czym aktywację monocytarnych komórek prekursorowych komórek dendrytycznych zapobiega się przez hamowanie adhezji komórek prekursorowych do naczynia hodowlanego.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że adhezję monocytarnych komórek prekursorowych komórek dendrytycznych hamuje się przez doprowadzenie do kontaktu komórek z pożywką hodowlaną dla komórek dendrytycznych zawierającą wysokie stężenie białka zwierzęcego albo ludzkiego.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że białkiem zwierzęcym albo ludzkim jest albumina, surowica, osocze, żelatyna lub poliaminokwas.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywację monocytarnej dendrytycznej komórki prekursorowej hamuje się przez doprowadzenie do kontaktu komórek z pożywką hodowlaną dla komórek dendrytycznych zawierającą czynnik chelatujący metale.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że czynnik chelatujący metale stanowi EDTA lub
EGTA.
6. Sposób według jednego z zastrz. 1-5, znamienny tym, że adhezję monocytarnego prekursora komórki dendrytycznej do naczynia hodowlanego hamuje się przez doprowadzenie do kontaktu komórek z naczyniem hodowlanym o niskiej przyczepności dla komórek.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że naczynie hodowlane o słabej przyczepności dla komórek zawiera polipropylen, politetrafluoroetylen lub PFTE.
8. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że białkiem jest ludzka albumina z surowicy.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że ludzka albumina z surowicy jest obecna w stężeniu co najmniej 1%.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ludzka albumina z surowicy jest obecna w stężeniu od około 2% do około 10%.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywką hodowlaną dla komórek dendrytycznych jest pożywka wolna od surowicy.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że populacja komórek obejmuje krew obwodową, produkt leukaferezy, produkt aferezy, krew pępowinową, śledzionę, węzeł limfatyczny, grasicę lub szpik kostny.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że populacja komórek była przechowywana w stanie zamrożenia.
14. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że naczynie hodowlane zawiera polistyren, polistyren powleczony szkłem, styren albo szkło.
15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że prekursory komórek dendrytycznych są dalej wzbogacane przez filtrację styczną.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że filtr ma pory o rozmiarze 5,5 mikronów, szybkość recyrkularyzacji (wprowadzania) wynosi około 1400 ml/min., szybkość filtracji wynosi około 17 ml/min., a czas filtracji wynosi około 90 min.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu zróżnicowanych prekursorów komórek dendrytycznych z antygenem będącym przedmiotem zainteresowania przez czas wystarczający do pobrania antygenu.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu zróżnicowanych prekursorów komórek dendrytycznych z czynnikiem dojrzewania komórek dendrytycznych.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że czynnik dojrzewania komórek dendrytycznych obejmuje Bacillus Calmette-Guerin (BCG), lipopolisacharyd (LPS), TNF-α, interferon gamma (IFN-γ) lub ich kombinacje.
PL 209 998 B1
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że czynnik dojrzewania komórek dendrytycznych stanowi kombinacja BCG i IFN-γ.
21. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że antygenem są antygen swoisty wobec nowotworu, antygen związany z nowotworem, antygen wirusowy, antygen bakteryjny, komórki nowotworowe, kwas nukleinowy kodujący antygen wyizolowany z komórki nowotworowej, komórki bakteryjne, zrekombinowane komórki wyrażające antygen, lizat komórkowy, preparat błon, antygen wytworzony na drodze rekombinacji, antygen peptydowy lub antygen wyizolowany.
22. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że obejmuje ponadto przechowywanie komórek dendrytycznych w stanie zamrożenia.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45101503P | 2003-02-27 | 2003-02-27 | |
| PCT/US2004/006119 WO2004076651A2 (en) | 2003-02-27 | 2004-02-27 | Generation of dendritic cells from monocytic dendritic precursor cells with gm-csf in the absence of additional cytokines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL378291A1 PL378291A1 (pl) | 2006-03-20 |
| PL209998B1 true PL209998B1 (pl) | 2011-11-30 |
Family
ID=32927693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL378291A PL209998B1 (pl) | 2003-02-27 | 2004-02-27 | Sposób in vitro lub ex vivo różnicowania monocytarnych prekursorów komórek dendrytycznych w niedojrzale komórki dendrytyczne |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8389278B2 (pl) |
| EP (1) | EP1604016B1 (pl) |
| JP (1) | JP4762887B2 (pl) |
| KR (2) | KR20110106474A (pl) |
| CN (1) | CN1784488B (pl) |
| AT (1) | ATE420946T1 (pl) |
| AU (2) | AU2004214896A1 (pl) |
| BR (1) | BRPI0407900A (pl) |
| CA (1) | CA2517295C (pl) |
| CY (1) | CY1109099T1 (pl) |
| DE (1) | DE602004019057D1 (pl) |
| DK (1) | DK1604016T3 (pl) |
| ES (1) | ES2321939T3 (pl) |
| IL (1) | IL170512A (pl) |
| MX (1) | MXPA05009178A (pl) |
| NZ (1) | NZ542071A (pl) |
| PL (1) | PL209998B1 (pl) |
| RU (1) | RU2364625C2 (pl) |
| TW (1) | TW200506061A (pl) |
| WO (1) | WO2004076651A2 (pl) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040057935A1 (en) * | 2002-09-20 | 2004-03-25 | Cedars-Sinai Medical Center | Intratumoral delivery of dendritic cells |
| JP4859169B2 (ja) * | 2002-12-06 | 2012-01-25 | ノースウエスト バイオセラピューティクス，インコーポレイティド | 腫瘍の処置のための、インビトロでの部分的に成熟した樹状細胞の投与 |
| EP1670513B1 (en) * | 2003-10-06 | 2013-01-23 | Cedars-Sinai Medical Center | Cox-2 inhibitors and dendritic cells for use in the treatment of cancer. |
| WO2005043155A1 (en) * | 2003-10-21 | 2005-05-12 | Cedars-Sinai Medical Center | System and method for the treatment of cancer, including cancers of the central nervous system |
| US7790039B2 (en) | 2003-11-24 | 2010-09-07 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Tangential flow filtration devices and methods for stem cell enrichment |
| WO2006127150A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-11-30 | Argos Therapeutics, Inc. | Dendritic cell compositions and methods |
| KR20150082688A (ko) * | 2005-12-08 | 2015-07-15 | 노쓰웨스트 바이오써라퓨틱스, 인크. | 미성숙 단핵구성 수지상 세포의 활성화를 유도하기 위한 조성물 및 방법 |
| EP1806395A1 (en) * | 2006-01-06 | 2007-07-11 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Maturation of dendritic cells |
| WO2008039874A2 (en) * | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Cedars-Sinai Medical Center | Cancer stem cell antigen vaccines and methods |
| CA2700436C (en) | 2006-09-28 | 2017-04-18 | John S. Yu | Cancer vaccines and vaccination methods |
| EP1920781B1 (en) * | 2006-11-10 | 2015-03-04 | Glycotope GmbH | Compositions comprising a core-1 positive microorganism and their use for the treatment or prophylaxis of tumors |
| KR100896747B1 (ko) | 2007-05-30 | 2009-05-11 | 동아대학교 산학협력단 | 후코이단 또는 그 유사체를 함유하는 수지상 세포의 성숙화유도용 조성물 |
| US8728465B2 (en) * | 2008-06-17 | 2014-05-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Use of toll-like receptor ligands as adjuvants to vaccination therapy for brain tumors |
| US9068020B2 (en) * | 2008-09-02 | 2015-06-30 | Cedars-Sinai Medical Center | CD133 epitopes |
| JP2010063404A (ja) * | 2008-09-10 | 2010-03-25 | Olympus Corp | 幹細胞の分離方法 |
| FR2940451B1 (fr) * | 2008-12-18 | 2014-09-12 | Proteus | Procede d'evaluation de l'immunogenicite des proteines |
| PT2427485T (pt) * | 2009-05-07 | 2017-03-13 | Immunocellular Therapeutics Ltd | Epitopos cd133 |
| CA2768398C (en) * | 2009-07-24 | 2020-01-07 | Rhode Island Hospital | Dendritic cell vaccines for asparaginyl-.beta.-hydroxylase expressing tumors |
| EP2498795B1 (en) * | 2009-10-12 | 2016-12-07 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department of Health and Human Services | Granulysin in immunotherapy |
| AU2011227447B2 (en) * | 2010-03-15 | 2016-04-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | System and method of preparing and storing activated mature dendritic cells |
| RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
| SG11201404570WA (en) * | 2012-02-10 | 2014-11-27 | Hakushinkouseikai Foundation | Proliferating agent for monocyte, culture medium for proliferating monocyte, method for producing monocyte, method for producing dendritic cell, and method for producing dendritic cell vaccine |
| EP2956544B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-11-01 | Immunocellular Therapeutics Ltd. | Cancer vaccines and vaccination methods |
| DK3173420T3 (da) * | 2014-07-23 | 2021-10-18 | Nat Ct Nanoscience & Technology China | Polypeptid og polypeptidkompleks til undertrykkelse af tumormetastase og behandling af leukæmi samt fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelse deraf |
| CN104098652B (zh) * | 2014-07-23 | 2016-11-09 | 国家纳米科学中心 | 一种抑制肿瘤转移的多肽和多肽复合物、其制备方法及其应用 |
| PL424035A1 (pl) * | 2015-06-30 | 2019-01-02 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Optymalnie aktywowane komórki dendrytyczne, które indukują ulepszoną lub zwiększoną przeciwnowotworową odpowiedź odpornościową |
| BR112018005180B1 (pt) | 2015-09-15 | 2023-11-28 | Northwest Biotherapeutics, Inc | Método in vitro para determinar a potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras, método in vitro para selecionar um paciente com um tumor sólido que responderá ou não responderá à administração da composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras derivadas do paciente e método in vitro para selecionar um agente de maturação de célula dendrítica para produzir células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras com potência imunoterapêutica aumentada |
| CN105483084A (zh) * | 2016-01-04 | 2016-04-13 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 肿瘤抗原靶向性dc细胞的制备方法 |
| CA3104469A1 (en) | 2018-06-19 | 2019-12-26 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Oncolytic virus or antigen presenting cell mediated cancer therapy using type i interferon and cd40-ligand |
| KR102159766B1 (ko) * | 2018-11-12 | 2020-09-24 | 조선대학교산학협력단 | 홍조류추출물을 이용한 미성숙수지상세포 분화유도용 배지조성물 및 미성숙수지상세포 분화유도방법 |
| SG11202110970QA (en) * | 2019-04-03 | 2021-10-28 | Akron Biotechnology Llc | Cryopreservation and cell culture media |
| CA3148229A1 (en) * | 2019-07-12 | 2021-01-21 | Kyushu University, National University Corporation | Development of therapy for improving myocardial contraction and method for inhibiting cardiomyocyte death |
| BR112022009560A2 (pt) * | 2019-11-18 | 2022-08-02 | Childrens Medical Center | Células dendríticas hiperativas possibilitam imunidade antitumoral baseada na transferência de células adotivas duráveis |
| WO2022235072A1 (ko) * | 2021-05-07 | 2022-11-10 | 아주대학교산학협력단 | 수지상 세포의 배양 방법 |
| CN113881632B (zh) * | 2021-09-29 | 2023-09-29 | 四川省医学科学院·四川省人民医院 | 一种提高dc细胞活性的细胞培养基及培养方法 |
| US20230288400A1 (en) * | 2022-01-20 | 2023-09-14 | 3T Biosciences, Inc. | T cell receptor (tcr) compositions and methods for optimizing antigen reactive t-cells |
| GB2624871A (en) * | 2022-11-29 | 2024-06-05 | Alv B As | Process for preparing a population of dendritic cells and immunotherapy using the same |
| CN118389430A (zh) * | 2024-04-12 | 2024-07-26 | 广东壹加再生医学研究院有限公司 | 一种高抗肿瘤特异性dc-cik细胞的制备方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE72829T1 (de) * | 1985-06-11 | 1992-03-15 | Us Commerce | In einem serumfreien medium in suspension kultivierte humane monozyten. |
| US5162504A (en) | 1988-06-03 | 1992-11-10 | Cytogen Corporation | Monoclonal antibodies to a new antigenic marker in epithelial prostatic cells and serum of prostatic cancer patients |
| DK0633929T3 (da) | 1992-04-01 | 2004-06-28 | Univ Rockefeller | Fremgangsmåde til in vitro proliferation af dendritcelleforstadier og deres anvendelse til at producere immunogener |
| US6010905A (en) * | 1995-01-27 | 2000-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Method for inducing monocytes to exhibit the phenotype of activated myeloid dendritic cells |
| US5788963A (en) | 1995-07-31 | 1998-08-04 | Pacific Northwest Cancer Foundation | Isolation and/or preservation of dendritic cells for prostate cancer immunotherapy |
| US7659119B2 (en) * | 1996-02-12 | 2010-02-09 | Argos Therapeutics, Inc. | Method and compositions for obtaining mature dendritic cells |
| US20020094545A1 (en) | 2000-11-30 | 2002-07-18 | Harris Paul E. | Growth of human dendritic cells for cancer immunotherapy in closed system using microcarrier beads |
| WO2003010292A2 (en) | 2001-07-25 | 2003-02-06 | Northwest Biotherapeutics, Inc. | Methods and apparatus for enrichment and culture of monocytic dendritic cell precursors |
| BRPI0212545B8 (pt) * | 2001-09-06 | 2021-05-25 | Northwest Biotherapeutics Inc | método ex vivo ou in vitro para produzir uma população de célula dendrítica madura e método para produzir células t |
| DK2298436T3 (da) * | 2002-06-19 | 2014-11-10 | Northwest Biotherapeutics Inc | Brug af en tangentiel flowfiltreringsenhed og metoder til leukocytberigelse |
| EP1597356A4 (en) * | 2003-02-10 | 2007-07-11 | Northwest Biotherapeutics Inc | ANTIGEN-PRESENTING CD14 + CULTURAL CELLS |
-
2004
- 2004-02-27 DK DK04715780T patent/DK1604016T3/da active
- 2004-02-27 AU AU2004214896A patent/AU2004214896A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-27 CN CN2004800105421A patent/CN1784488B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-27 WO PCT/US2004/006119 patent/WO2004076651A2/en active Application Filing
- 2004-02-27 CA CA2517295A patent/CA2517295C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-27 AT AT04715780T patent/ATE420946T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-02-27 JP JP2006503922A patent/JP4762887B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-27 US US10/789,807 patent/US8389278B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-27 PL PL378291A patent/PL209998B1/pl unknown
- 2004-02-27 ES ES04715780T patent/ES2321939T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-27 KR KR1020117021421A patent/KR20110106474A/ko not_active Ceased
- 2004-02-27 BR BRPI0407900-0A patent/BRPI0407900A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-02-27 MX MXPA05009178A patent/MXPA05009178A/es active IP Right Grant
- 2004-02-27 TW TW093105079A patent/TW200506061A/zh unknown
- 2004-02-27 KR KR1020057016059A patent/KR101201875B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-27 EP EP04715780A patent/EP1604016B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-27 NZ NZ542071A patent/NZ542071A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-02-27 DE DE602004019057T patent/DE602004019057D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-27 RU RU2005129561/13A patent/RU2364625C2/ru active
-
2005
- 2005-08-25 IL IL170512A patent/IL170512A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-04-14 CY CY20091100437T patent/CY1109099T1/el unknown
-
2010
- 2010-04-01 AU AU2010201319A patent/AU2010201319B2/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-03-05 US US13/786,208 patent/US9102917B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2015
- 2015-07-30 US US14/814,315 patent/US10731130B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2020
- 2020-08-03 US US16/983,300 patent/US11827903B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11827903B2 (en) | Generation of dendritic cells from monocytic dendritic precursor cells with GM-CSF in the absence of additional cytokines | |
| JP5954918B2 (ja) | 未成熟な単球性樹状細胞の活性化を誘導するための組成物および方法 | |
| US20040197903A1 (en) | Method for induction of proliferation of natural killer cells by dendritic cells cultured with GM-CSF and IL-15 | |
| HK40051623A (en) | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells | |
| AU2013206016B2 (en) | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells | |
| HK1086597B (en) | Generation of dendritic cells from monocytic dendritic precursor cells with gm-csf in the absence of additional cytokines | |
| HK1193842A (en) | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells | |
| HK1128161A (en) | Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells |