BR112018005180B1 - Método in vitro para determinar a potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras, método in vitro para selecionar um paciente com um tumor sólido que responderá ou não responderá à administração da composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras derivadas do paciente e método in vitro para selecionar um agente de maturação de célula dendrítica para produzir células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras com potência imunoterapêutica aumentada - Google Patents

Método in vitro para determinar a potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras, método in vitro para selecionar um paciente com um tumor sólido que responderá ou não responderá à administração da composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras derivadas do paciente e método in vitro para selecionar um agente de maturação de célula dendrítica para produzir células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras com potência imunoterapêutica aumentada Download PDF

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Abstract

MÉTODO IN VITRO PARA DETERMINAR A POTÊNCIA IMUNOTERAPÊUTICA DE UMA COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS ATIVAS E NÃO TOTALMENTE MADURAS, MÉTODO IN VITRO PARA SELECIONAR UM PACIENTE COM UM TUMOR SÓLIDO QUE RESPONDERÁ OU NÃO RESPONDERÁ À ADMINISTRAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS ATIVAS E NÃO TOTALMENTE MADURAS DERIVADAS DO PACIENTE E MÉTODO IN VITRO PARA SELECIONAR UM AGENTE DE MATURAÇÃO DE CÉLULA DENDRÍTICA PARA PRODUZIR CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS ATIVAS E NÃO TOTALMENTE MADURAS COM POTÊNCIA IMUNOTERAPÊUTICA AUMENTADA REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDO(S) RELACIONADO(S). A presente divulgação proporciona células dendríticas parcialmente maduras e ativas que produzem níveis de citocinas/quimiocinas, por exemplo, uma ou qualquer combinação de e/ou todas IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFAlfa, que são relacionados com resultados clínicos melhorados, aumento significativo do tempo de sobrevivência e aumento significativo do tempo de recorrência de câncer ou câncer. As quantidades limites determinadas dessas citocinas podem ser usadas para (i) um teste de potência imunoterapêutica para células dendríticas ativas, (ii) seleção de pacientes que responderam ao tratamento, (iii) rejeição dos pacientes que não responderam ao tratamento e (iv) rastreamento da ativação de células dendríticas ou agentes de maturação que também podem induzir a produção da quantidade limite (...).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDO(S) RELACIONADO(S)
[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório Americano com o Número de Série 62/219,058, depositado em 15 de setembro de 2015, incorporado aqui na sua totalidade para todos os fins.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Os pacientes com tumores sólidos irressecáveis, localmente avançados ou metastáticos têm um prognóstico ruim e poucas opções terapêuticas, especialmente após terem falhado em terapias padrão. Amato, Semin. Oncol. 27: 177186, 2000; Bramwell et al., Cochrane Database Syst. Rev. 3: Cd003293, 2003; Klelger et al., Ann. Oncol. 25: 1260-1270, 2014). Recentemente, tem havido vários avanços promissores em terapias imunológicas contra o câncer (Ito et al., Biomed. Res. Int. 2015: 605478, 2015; West, JAMA Oncol. 1:115, 2015); no entanto, para montar uma resposta imunológica eficaz contra o câncer, o sistema imunológico deve primeiro ser preparado para atacar as células cancerígenas. (Melero et al., Nat. Rev. Cancer 15: 457-472, 2015). Especificamente, antígenos de tumor específico devem ser apresentados a células T naive por células apresentadoras de antígeno, que por sua vez induzem a diferenciação de células T em células T citotóxicas ativas (CTLs). (Ito et al., Biomed. Res. Int. 2015: 605478, 2015; MacKeon et al., Front. Immunol. 6: 243, 2015).
[003] As células dendríticas (DCs) são proficientes em iniciar respostas imunes adaptativas, através da captação e subsequente apresentação ao sistema imunológico de compostos antigênicos. As DCs estimulam tanto as células B quanto as células T e geram moléculas coestimulatórias, como as citocinas, para impulsionar a expansão da CTL. (Banchereau et al., Nature 392: 245-252, 1998). Dada a capacidade das DCs de induzir uma ampla resposta imunológica, a pesquisa de imunoterapia baseada em DC tem crescido rapidamente nos últimos anos. Testes clínicos de vacinas contra o câncer baseados em DC mostraram vários graus de promessa, e vários produtos estão atualmente em testes clínicos em estágio final. (Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67: 731-753, 2015). As várias DCs encontradas no sangue são conhecidas por sua eficiente apresentação cruzada de antígenos e sua capacidade de migrar efetivamente para a drenagem de nódulos linfóides. No entanto, as DCs compõem menos de 1% das células mononucleares do sangue periférico, o que significa que há material celular insuficiente para gerar uma composição para iniciar e manter uma imunidade específica do tumor. (MacKeon, Front. Immunol. 6:243, 2015; Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67: 731-753, 2015) Como resultado, as DCs geradas ex vivo derivadas de monócitos coletados para o indivíduo a ser tratado por, por exemplo, leucaférese; no entanto, as estratégias usando outros tipos de DC estão sendo investigadas atualmente. Depois de gerar as DCs, as células, geralmente, são pulsadas com um antígeno e infectadas de volta ao paciente. A escolha e fonte do antígeno, (por exemplo, antígeno específico ao tumor purificado ou antígeno associado ao tumor).
[004] Em estudos pré-clínicos, a DC ativa (aDC; DCVax®- Direct) mostraram-se superiores à DC imatura na remoção de tumores de camundongos, após injeção intratumoral.
[005] As células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras de antígenos profissionais do sistema imunológico que se acredita serem capazes de ativar as células T naive e de memória. As células dendríticas são cada vez mais preparadas ex vivo para uso em imunoterapia, particularmente, para imunoterapia de câncer. A preparação de células dendríticas com ótimas propriedades imunoestimulantes requer uma compreensão e exploração da biologia dessas células para cultura ex vivo. Vários protocolos para a cultura dessas células foram descritos, com várias vantagens atribuídas a cada protocolo.
[006] A ativação de células dendríticas inicia o processo que converte DCs imaturas, que são fenotipicamente semelhantes às células de Langerhans da pele, às células apresentadoras de antígenos maduras que podem migrar para os nódulos linfáticos. Este processo resulta na perda gradual e progressiva da capacidade de captação de antígeno potente que caracteriza a célula dendrítica imatura, e na regulação ascedente da expressão de moléculas de superfície celular co-estimulantes e várias citocinas. Vários estímulos podem iniciar a maturação das DCs. Este processo é complexo e pelo menos a maturação completa in vitro de células dendríticas, e, particularmente, células dendríticas monocíticas, dependendo do agente de maturação de células dendríticas usado, pode levar até 48 horas para se completar. Uma outra consequência da maturação é uma alteração nas propriedades migratórias in vivo das células. Por exemplo, a indução da maturação de células dendríticas imaturas induz vários receptores de quimiocinas, incluindo CCR7, que direcionam as células para as regiões dos nódulos linfáticos que drenam as células T, onde as DCs maduras ativam as células T contra os antígenos apresentados na superfície DC no contexto de moléculas de MHC de classe I e de classe II. Os termos "ativação" e "maturação" e "ativo" e "maduro" descrevem o processo de induzir e completar a transição de uma DC imatura (parcialmente caracterizada pela capacidade de captar o antígeno) para uma DC madura (parcialmente caracterizada pela capacidade de estimular eficazmente as respostas das células T de novo). Os termos são tipicamente usados de forma intercambiável na técnica.
[007] Os protocolos de maturação conhecidos baseiam-se no ambiente in vivo que se acredita que as DCs encontrem durante ou após a exposição a antígenos. Um exemplo precoce desta abordagem é o uso de meios condicionados de monócitos (MCM) como um meio de cultura de células. O MCM é gerado in vitro pela cultura de monócitos e usado como fonte de fatores de maturação. (Ver, por exemplo, US 2002/0160430, aqui incorporada por referência.) Os principais componentes no MCM responsáveis pela maturação são referidos como sendo as citocinas (pro)inflamatórias Interleucina 1 beta (IL- 1β), Interleucina 6 (IL-6) e fator alfa de necrose tumoral (TNFα). Outros agentes de maturação de células dendríticas incluem, por exemplo, agonistas do receptor do tipo Toll em misturas de citocinas, tais como fator de necrose tumoral α (TNFα), interleucina (IL)-1β, IL-6 e prostaglandina E2 (PGE2).
[008] A maturação de DCs, portanto, pode ser desencadeada ou iniciada por uma multiplicidade de fatores diferentes que atuam através de uma série de vias de transdução de sinal. Consequentemente, não existe um resultado ou via de maturação única, mas existe, de fato, um universo de estágios de DCs maduras, cada um com suas próprias características funcionais distintas. Conceitualmente isso faz sentido porque as várias ameaças ao corpo que o sistema imunológico deve responder são múltiplas, exigindo diferentes estratégias de ataque. Por exemplo, enquanto a infecção bacteriana é melhor eliminada por macrófagos ativados suplementados com anticorpos específicos, uma infecção viral é melhor atacada através de células T citotóxicas que efetivamente matam as células infectadas por vírus. A morte de células cancerígenas envolve tipicamente uma combinação de células T citotóxicas, células assassinas naturais e anticorpos.
[009] A maturação in vitro das DCs pode, portanto, ser projetada para induzir o sistema imunológico a favorecer um tipo de resposta imunológica em detrimento de outro, ou seja, polarizar a resposta imunológica. A maturação direcional das DCs descreve a noção de que o resultado do processo de maturação dita o tipo de resposta imunológica resultante do tratamento com as DCs maduras. Na sua forma mais simples, a maturação direcional resulta em uma população de DC que produz citocinas que direcionam uma resposta de células T polarizada a ou uma resposta imunológica do tipo Th1 ou Th2. Interferon y, interferon α, e ácido poli-isosínico:policitidílico têm sido usados para suplementar um agente de maturação de células dendríticas a fim de gerar DCs do tipo 1 polarizadas maduras que secretam IL-12. As DCs maduras vinculam um perfil do tipo célula T auxiliar 1 (TH1) que induz a ativação da célula assassina natural e CTL. (Maillard et al., Cancer Res. 64: 5934-5937, 2004; Trinchieri, Blood 84: 4008-4027, 1994). A ativação de CTL desencadeia um estado pró-inflamatório, estimulando essas células a matar células tumorais diretamente. (Coulie et al., Nat. Rev. Cancer 14: 135-146, 2014).
[0010] As DCs expressam até nove receptores semelhantes a Toll diferentes (TLR1 a TLR9), cada um dos quais pode ser usado para ativar a maturação. Não surpreendentemente, a interação de produtos bacterianos com TLR2 e TLR4 resulta em maturação direcional de DCs resultando em uma resposta polarizada mais apropriada para lidar com infecções bacterianas. Por outro lado, a maturação desencadeada por TLR7 ou TLR9 parece resultar mais em uma resposta do tipo anti-viral. Como um exemplo adicional, a adição de interferon gama (IFN-y) à maioria dos protocolos de maturação resulta na produção de interleucina 12 pelas DCs maduras, o que determina uma resposta imunológica do tipo Th1. Por outro lado, a inclusão de prostaglandina E2 tem o efeito oposto.
[0011] Células dendríticas totalmente maduras diferem qualitativamente e quantitativamente de células DCs imaturas. Uma vez totalmente maduras, as DCs expressam níveis mais altos de antígenos do MHC classe I e classe II, e níveis mais altos de moléculas co-estimulatórias de células T, como CD80 e CD86. Essas alterações aumentam a capacidade das células dendríticas de ativar as células T porque elas aumentam a densidade do antígeno na superfície celular, bem como a magnitude do sinal de ativação das células T através das contrapartes das moléculas co- estimulatórias nas células T, por exemplo, CD28 e semelhantes. Além disso, as DCs maduras produzem grandes quantidades de citocinas, que estimulam e polarizam a resposta das células T. Essas citocinas incluem interleucina 12 associada a uma resposta imunológica do tipo Th1 e interleucina-10 e interleucina-4 associadas a uma resposta imunológica do tipo Th2.
[0012] Geralmente, os métodos para geração de DC ex vivo incluem a obtenção de uma população de células enriquecidas para células precursoras de DC a partir de um indivíduo e, então, a diferenciação das células precursoras de DC in vitro em DC completamente maduras antes da introdução de volta ao indivíduo. Tipicamente, durante este processo, as DCs em maturação são colocadas em contato com o antígeno para captação e processamento à medida que as DC se tornam maduras. Alguns acreditam que as DCs devem ser diferenciadas de maneira terminal, ou se diferenciarão de novo em monócitos/macrófagos e perderão muito de sua capacidade de imunopotencialização. A maturação ex vivo de DCs geradas a partir de monócitos foi realizada com sucesso com métodos e agentes bem conhecidos na técnica.
[0013] As células dendríticas (DCs) são reconhecidas como o veículo de escolha para imunoterapia ativa do câncer. Experimentos em animais demonstraram o potencial da imunoterapia com base em DC tanto na proteção de camundongos a partir da formação de tumores quanto na eliminação de tumores estabelecidos. Esses sucessos foram pelo menos parcialmente duplicados em humanos em pequenos testes clínicos. A transição de pequenos testes de segurança ou prova de conceito para testes maiores, nos quais a atividade ou a eficácia podem ser demonstradas, tem sido dificultada pela natureza trabalhosa e pesada da preparação da DC, como descrito acima. Como consequência, poucas empresas têm se interessado em desenvolver vacinas contra o câncer baseadas em DC, apesar do grande valor terapêutico potencial de tais produtos.
[0014] Além da maturação, o método de administração tem um impacto significativo nos resultados. A rota de administração deve permitir que as DCs atinjam os nódulos linfáticos, para que possam induzir a diferenciação das células T. Vários métodos, incluindo injeção intravenosa, intradérmica e intranodal, foram estudados anteriormente. (Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67: 731-753, 2015). A injeção intratumoral (IT) de DCs é uma forma especial de imunoterapia baseada em DC. Após injeção, as DCs naive retomam e processam o(s) antígeno(s) in vivo a partir de, por exemplo, células tumorais apoptóticas ou morrendo (necróticas) e meio tumoral, e apresentam o(s) antígeno(s) a células T após migração para os nódulos linfáticos. De fato, verificou-se que a eficácia de tais tratamentos em modelos animais está correlacionada com o grau de apoptose no tumor (Candido et al., Cancer Res. 61: 228-236, 2001), o que sugere que esta abordagem é totalmente compatível com o tratamento. Os tumores com agentes quimioterápicos ou radiação antes da injeção de DCs. Adicionalmente, vários grupos demonstraram que tal terapia de combinação é particularmente eficaz contra tumores estabelecidos (Nikitina et al., Int. J. Cancer 94: 825-833, 2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer 101: 265-269, 2002; Tong et al., Cancer Res. 61: 7530-7535, 2001).
[0015] Uma vez que as células tumorais in vivo são a fonte de antígeno, a injeção intratumoral renuncia à necessidade tanto da seleção como da fabricação de antígenos tumorais, tal como são atualmente utilizados na maioria das abordagens de terapia baseadas em DC in vitro. A seleção de um antígeno tumoral é frequentemente conduzida pela necessidade das empresas terem uma posição proprietária e os poucos antígenos tumorais identificados até o momento ainda precisam ser provados para fornecer benefícios clínicos significativos. Além disso, a utilização de tais antígenos tumorais resulta frequentemente numa composição imunogênica monovalente ou vacina, que pode perder sua eficácia se as células do tumor regulam descendente a expressão do antígeno utilizado na imunização. Além disso, a necessidade de fabricar o antígeno do tumor sob as condições exigidas pelas Boas Práticas de Fabricação (GMP) acrescenta custos adicionais aos métodos clássicos de imunização baseados em DC.
[0016] A injeção de DCs em IT pode sujeitar as células dendríticas a um ambiente de tumor imunossupressivo. Sabe- se que os tumores produzem citocinas que inativam as DCs ou que tem a capacidade de distorcer a resposta das células T para uma resposta imunológica menos eficaz do tipo Th2. Vários grupos usaram a modificação genética de DCs para tentar superar esses efeitos supressores, especialmente através da produção da citocina Interleucina 12 (IL-12; Nishioka et al., Cancer Res. 59: 4035-4041, 1999; Melero et al., Gene Therapy 6: 1779-1784, 1999) ou a expressão do ligante de CD40 (Kikuchi et al., Blood 96: 91-99, 2000). Os resultados encorajadores descritos por esses grupos demonstram ainda mais a viabilidade da injeção de IT de DCs como uma abordagem terapêutica.
[0017] Triozzi et al. (Cancer 89: 2647-2654, 2000) descrevem a injeção IT de DCs em pacientes com melanoma metastático ou câncer de mama. Eles obtiveram regressão tumoral em 4 pacientes com melanoma e em dois pacientes com carcinoma de mama. Biópsias das lesões em regressão demonstraram células T infiltradas, sugerindo que a DC realmente ativou uma resposta imunológica contra as células tumorais. No geral, esses dados demonstraram que a injeção de IT em DCs era viável em seres humanos e poderia fornecer benefícios clínicos significativos. No entanto, foi observada uma regulação descendente significativa dos antígenos de MHC de classe II e da molécula co-estimuladora de B7-2 (CD86) nas DCs injetadas. Espera-se que a regulação descendente dessas moléculas críticas reduza o potencial imunoestimulatório das DCs.
[0018] Um método para superar esta regulação descendente foi divulgado em WO 2004/053072 (aqui incorporado por referência), onde se verificou que a regulação descendente pode ser evitada através da maturação parcial das DCs antes da administração. Neste método, os precursores de células dendríticas (células da medula óssea após lise de células vermelhas ou precursores de células dendríticas monocíticas) foram primeiramente induzidos in vitro para se diferenciar em células dendríticas imaturas e subsequentemente, as células dendríticas imaturas foram induzidas para iniciar a maturação cultivando as células com um agente de maturação de célula dendrítica, como BCG e IFNy, lipopolissacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral α (TNFα), um composto imidazoquinolina, um polirribonucleotídeo sintético de fita dupla, um agonista de um receptor semelhante a Toll (TLR), uma sequência de ácidos nucléicos contendo motivos CpG não metilados conhecidos por induzirem a maturação de DC, combinações de citocinas como, por exemplo, fator de necrose tumoral α (TNFα), combinado com interleucina 1β (IL-1), interleucina 6 (IL-6) e prostaglandina E2 (PGE2), ou qualquer combinação destes. Deixou-se as células dendríticas imaturas continuarem a maturação durante um período de tempo menor do que o anteriormente determinado para as células dendríticas imaturas amadurecerem completamente. Se as células dendríticas pudessem amadurecer completamente in vitro, as células seriam incapazes de captar e processar o antígeno subsequente à administração ao paciente. Os métodos aqui divulgados demonstram que as células dendríticas devem ser deixadas amadurecer durante um período de tempo suficiente para ativação, de modo que os níveis significativos de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα como aqui estabelecido antes são produzidos antes do isolamento das células dendríticas parcialmente maduras e formulação para administração a um paciente ou indivíduo com necessidade de imunoestimulação.
[0019] Inesperadamente, determinou-se que as células dendríticas ativadas que produzem certas quantidades, ou quantidades limiares, de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα têm um nível de potência imunoterapêutica que se correlaciona com melhor resultado clínico, medido por tais características como aumento do tempo de sobrevivência e/ou aumento do tempo para recorrência do câncer. Como tal, as células dendríticas ativas que produzem acima das quantidades limiares de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα proporcionam composições melhoradas para utilização na administração a um indivíduo e as composições demonstram uma capacidade aumentada para produzir um resultado clínico positivo.
SUMÁRIO
[0020] Este sumário é fornecido para introduzir uma seleção de conceitos de forma simplificada, que são descritos a seguir na Descrição Detalhada. Este sumário não pretende identificar as principais características do objeto reivindicado, nem se destina a ser usado como um auxiliar na determinação do escopo do objeto reivindicado.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0021] Os aspectos precedentes e muitas das vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais prontamente apreciadas à medida que o mesmo se torne melhor compreendido por referência à seguinte descrição detalhada, quando considerada em conjunto com os desenhos anexos, em que:
[0022] As FIGURAS 1A a 1C representam a infiltração de células T seguindo ao tratamento com DC ativa. A coloração imunoquímica mostra que os linfócitos infiltrantes no tumor, incluindo células T ativas com CD3+. A coloração imunohistoquímica mostra que os linfócitos infiltrantes de tumor, incluindo células T ativas com CD3+, células auxiliares CD4+ e células assassinas CD8+, aumentaram desde o início em 15 dos 27 pacientes biopsiados. As imagens representativas são de um tumor de sarcoma de células claras tratado com 6 milhões de DCs ativas/injeção. Duas injeções foram administradas no momento da biópsia. A ampliação é 20X e a barra de escala representa 200 μm. A Fig. 1B e a Fig. 1C ilustram a produção de citocinas pelas células T ativas. As seções de tecido foram investigadas para: Fig. 1B IFNy e Fig. 1C mostram expressão de TNFα utilizando RNAscope (pontos escuros) e co-coloração para expressão de CD3 (pontos mais claros) utilizando imunohistoquímica. As setas pretas representam células T ativas com CD3+ expressando as respectivas citocinas. As setas brancas representam células produtoras de citocinas CD3-, provavelmente, macrófagos. As imagens representativas são de um tumor de sarcoma de células claras tratado com 6 milhões de DCs ativas/injeção. Duas injeções foram administradas no momento da biópsia. A ampliação é de 20x e a barra da escala representa 100 μm.
[0023] As FIGURAS 2A a 2F representam caracterizações de DCs ativadas. A Figura 2A mostra a correlação entre a produção de IL-8 (ng/106 DCs/dia) e a sobrevivência global. A curva de Kaplan-Meyer da produção de IL-8 e sobrevivência. A linha pontilhada indica sobrevivência em pacientes injetados com aDCs produzindo <985 ng/106 DCs/dia (a mediana da concentração de IL-8); a linha sólida representa aqueles injetados com células produzindo > 985 ng/106 DCs/dia. A Figura 2B mostra a correlação entre a produção de IL-12p40 (ng/106 DCs/dia) e sobrevivência global. A curva de Kaplan-Meyer da produção de IL-12p40 e sobrevivência. A linha tracejada indica sobrevivência em pacientes injetados DCs ativas produzindo < 330 ng/106 DCs/dia (a mediana da concentração de IL-12p40); a linha sólida representa aqueles injetados com células produzindo > 330 ng/106 DCs/dia. A Figura 2C demonstra o número de pacientes com doença estável (SD) na semana 8 e sobrevivência. Curva de Kaplan-Meyer de pacientes com SD na semana 8 comparada com a de pacientes com doença progressiva (PD) na semana 8. A linha tracejada indica sobrevivência em pacientes com PD na semana 8; a linha sólida representa os pacientes com SD na semana 8. A sobrevivência global foi significativamente diferente entre os dois grupos (p = 0,04). A Figura 2D demonstra a produção de TNFα pelas DCs ativas e o estado da doença na semana 8. O número de pacientes com SD na semana 8 é mostrado com barras pretas, e o número de pacientes com PD é mostrado com barras brancas. Não houve pacientes com PD na semana 8 em pacientes com níveis de TNFα > 130 ng/106 DCs/dia. Em uma análise multivariada, a produção de TNFα se correlaciona com a sobrevivência (p = 0,016). Para a Fig. 2A - Fig. 2D, n = 39. Associações entre a sobrevivência do paciente e os níveis de expressão dos marcadores de superfície celular. A Figura 2E mede a coloração para MHC- II e a Figura 2F mostra coloração para CD86 (n = 25 em ambas as figuras). A Figura 2E, a linha sólida indica pacientes com células tendo > 12000 de intensidade de fluorescência média (MFI) quando coradas para MHC-II; a linha tracejada indica pacientes com células tendo 6200- 12000 MFI; e a linha pontilhada representa pacientes com células tendo <6200 MFI. A Figura 2F, a linha sólida indica pacientes com células tendo > 3400 intensidade de fluorescência média (MFI) quando coradas para CD86; a linha tracejada indica pacientes com células com 2000 - 3400 MFI; e a linha pontilhada representa pacientes com células tendo < 2000 MFI. A análise log-rank foi utilizada para a Figura 2A - Figura 2C e Figura 2E - Figura 2F. A análise Chisquare foi utilizada para a Figura 2D.
[0024] A FIGURA 3 demonstra o fenótipo de células dendríticas ativas. São apresentados histogramas representativos de citometria de fluxo de vários marcadores de ativação de células dendríticas. Os histogramas cinzentos escuros são da população de monócitos colhida durante a leucaférese. Histogramas cinzentos claros são de DCs ativos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0025] A presente divulgação proporciona um método para determinar a potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas ativas, o método compreendendo as etapas de: (i) preparar células dendríticas ativas; (ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα; (iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα para uma quantidade limite; e (iv) determinar que a composição de células dendríticas ativas é de baixa potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα estiver abaixo do limiar; ou que a composição de células dendríticas ativas é de elevada potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e TNFα estiverem acima do limiar.
[0026] Também é proporcionado um método para aumentar a potência imunoterapêutica de uma população de DC ativa, o método compreende as etapas de: (i) preparar uma população de células dendríticas ativas; (ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα; (iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα a uma quantidade limite; (iv) determinar se qualquer de uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα está abaixo do limiar; e (v) adicionar uma quantidade suficiente de um agente que possa induzir a produção de uma ou qualquer combinação de, e ou de todas as IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα pela DC ativa para trazer a quantidade de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα acima da quantidade limite, de modo a formar uma população DC ativa com uma potência imunoterapêutica aumentada.
[0027] Além disso, a presente divulgação proporciona um método para selecionar um paciente que responderá a administração de células dendríticas ativas através da determinação da potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas ativas derivada do paciente, compreendendo o método as etapas de: (i) preparar células dendríticas ativas; (ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα; (iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα a uma quantidade limite; e (iv) determinar que a composição de células dendríticas ativas é de baixa potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα estiver abaixo do limiar, ou que a composição de células dendríticas ativas é de alta potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda IL-6, IL-8, IL-12 e TNFα estiverem acima do limiar e selecionando aqueles pacientes acima do limiar como pacientes que responderão.
[0028] Além disso, a presente divulgação fornece um método para selecionar um paciente que não responderá à administração de células dendríticas ativas pela determinação da potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas ativas derivadas do paciente, o método compreendendo as etapas de: (i) preparação células dendríticas ativas; (ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα; (iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα a uma quantidade limite; e (iv) determinar que a composição de células dendríticas ativas é de baixa potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα estiver abaixo do limiar, ou que a composição de células dendríticas ativas tem uma elevada potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação ou, e/ou toda de IL-6, IL-8, IL-12 e TNFα estiverem acima do limiar e selecionar os pacientes abaixo do limiar como pacientes que não irão responder.
[0029] A presente divulgação proporciona ainda um método para selecionar agentes de maturação de células dendríticas para produzir células dendríticas ativas com potência imunoterapêutica aumentada, o método compreendendo as etapas de: (i) preparar células dendríticas ativas por contato de células dendríticas imaturas com um agente de maturação de células dendríticas teste; (ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα; (iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα a uma quantidade limite; e (iv) determinar que a composição de células dendríticas ativas é de baixa potência imunoterapêutica, se uma ou qualquer combinação de, e ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα estiver abaixo do limiar, ou que a composição de células dendríticas é de alta potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα estão acima do limiar e selecionar o agente de maturação das células dendríticas que induz a produção de células dendríticas ativas acima do limiar. Uma vez determinado o agente de maturação de célula dendrítica, este pode ser utilizado para induzir a produção de células dendríticas parcialmente maduras e ativas, como aqui descrito.
[0030] Numa modalidade típica de qualquer um dos métodos acima, as células dendríticas ativas produzem quantidades limiares de cerca de 50 a cerca de 200 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6; cerca de 500 a cerca de 2000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; pelo menos cerca de 30 a cerca de 70 ng/1 milhão de células/24 horas de TNFα; pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas da subunidade IL-12 p40; e cerca de 1 a 3 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70 biologicamente ativa. As células dendríticas ativas podem também produzir cerca de 75 a cerca de 150 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6; cerca de 750 a cerca de 1500 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; pelo menos cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p40; menos cerca de 1 a 3 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70; e pelo menos cerca de 30 a 70 ng/1 milhão de células/24 horas de TNFα ou cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6, e 1000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8, pelo menos cerca de 100ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p40; pelo menos cerca de 2 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70; e pelo menos cerca de 30 ng de TNFα.
[0031] As células dendríticas ativas utilizadas em qualquer uma das modalidades acima podem ser preparadas pelas seguintes etapas: (i) isolamento de uma população celular compreendendo PBMCs humanas a partir de sangue periférico; (ii) enriquecer a população de células compreendendo PBMCs humanas para precursores de células dendríticas monocíticas humanas; (iii) cultivar a população de células enriquecidas em precursores de células dendríticas monocíticas humanas com um meio de cultura de tecido suplementado com uma quantidade eficaz de um agente de diferenciação de células dendríticas durante um período de tempo suficiente para diferenciar os precursores de células dendríticas monocíticas humanas em dendríticas humanas imaturas; (iv) cultivar a população de células enriquecida em ci^ células dendríticas humanas imaturas com uma quantidade eficaz de um agente de maturação de células dendríticas para ativar as células dendríticas humanas imaturas; e (v) isolar e lavar as células dendríticas humanas ativas.
[0032] Noutra modalidade, as células dendríticas ativas são preparadas pelas seguintes etapas: (i) isolar uma população de células compreendendo precursores de células dendríticas monocíticas humanas; (ii) cultivar a população de células enriquecidas para precursores de células dendríticas monocíticas humanas com um meio de cultura de tecido suplementado com uma quantidade eficaz de um agente de diferenciação de células dendríticas durante um período de tempo suficiente para diferenciar os precursores de células dendríticas monocíticas humanas em células dendríticas humanas imaturas; (iii) cultivar a população de células enriquecida em células dendríticas humanas imaturas com uma quantidade eficaz de um agente de maturação de células dendríticas para ativar as células dendríticas humanas imaturas; e (iv) isolar e lavar as células dendríticas humanas ativas. O agente de diferenciação de células dendríticas pode ser GM-CSF sem qualquer outra citocina, ou GM-CSF em combinação com IL-4, IL-7, IL-13 ou IL-15.
[0033] Os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser obtidos a partir de pele, baço, medula óssea, timo, gânglios linfáticos, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico. Em certas modalidades, as células precursoras de células dendríticas monocíticas são precursores de células dendríticas monocíticas não ativas. Além disso, os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser obtidos do indivíduo a ser tratado, ou se o indivíduo não tiver um número suficiente de precursores de células dendríticas monocíticas responsivas, os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser obtidos a partir de um indivíduo em particular saudável HLA compatível para o indivíduo em particular a ser tratado.
[0034] O agente de maturação útil de células dendríticas nos métodos para produzir células dendríticas ativas parcialmente maduras pode ser Bacillus Calmette- Guerin (BCG) inativo, BCG em combinação com interferon y (IFNy), lipopolissacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral α (TNFα), um composto de imidazoquinolina, um polirribonucleodíteo sintético de fita dupla, um agonista de um receptor do tipo Toll (TLR), uma sequência de ácidos nucleicos contendo motivos CpG não metilados conhecidos para induzir a maturação de células dendríticas, ou qualquer combinação destes. O BCG inativo pode compreender BCG total, constituintes da parede celular de BCG, lipoarabidomananos derivados de BCG, ou componentes de BCG e o BCG pode ser BCG inativo utilizando inativação por calor, tratamento com formalina, ou uma combinação destes. Tipicamente, a quantidade eficaz de BCG é de cerca de 105 a 107 ufc por mililitro de meio de cultura de tecido e a quantidade eficaz de IFNy é de cerca de 100 a cerca de 1000 Unidades por mililitro de meio de cultura de tecido. Além disso, o composto de imidazoquinolina pode ser um composto de imidazoquinolina-4-amina e, tipicamente, é o 4-amino-2- etoximetil-α,α-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-5 etanol ou 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina, ou um derivado deste. Tipicamente, o polirribonucleotídeo sintético de fita dupla é poli[I]:poli[C(12)U].
Descrição das Modalidades
[0035] As células dendríticas são uma população diversificada de células apresentadoras de antígenos, encontradas em uma variedade de tecidos linfóides e não linfóides. (Ver Liu, Cell 106:259-262, 2001; Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-296, 1991). As células dendríticas incluem células dendríticas linfóides do baço, células de Langerhans da epiderme e células veladas na circulação sanguínea. Coletivamente, as células dendríticas classificadas como um grupo com base na sua morfologia, níveis elevados de expressão de superfície MHC de classe II e ausência de certos outros marcadores de superfície expressos em células T, células B, monócitos e células assassinas naturais. Em particular, as células dendríticas derivadas de monócitos (também referidas como células dendríticas monocíticas) normalmente expressam CD11c, CD80, CD86 e são HLA-DR+, mas são CD14-.
[0036] Em contraste, precursores de células dendríticas monocíticas (tipicamente monócitos) são normalmente CD14+. Os precursores de células dendríticas monocíticas podem ser obtidos a partir de qualquer tecido onde eles residam, particularmente, tecidos linfóides como o baço, medula óssea, nódulos linfáticos e timo. Precursores de células dendríticas monocíticas também podem ser isolados do sistema circulatório.
[0037] O sangue periférico é uma fonte facilmente acessível de precursores de células dendríticas monocíticas. O sangue do cordão umbilical é outra fonte de precursores de células dendríticas monocíticas. Precursores de células dendríticas monocíticas podem ser isolados de uma variedade de organismos, nos quais uma resposta imunológica pode ser induzida. Tais organismos incluem animais, por exemplo, incluindo seres humanos, e animais não humanos, tais como primatas, mamíferos (incluindo cães, gatos, camundongos e ratos), aves (incluindo galinhas), bem como espécies transgênicas dos mesmos.
[0038] Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas e/ou células dendríticas imaturas podem ser isolados de um indivíduo saudável ou de um indivíduo com necessidade de imunoestimulação, tal como, por exemplo, um paciente com câncer ou outro indivíduo para quem a imunoestimulação celular pode ser benéfica ou desejado (isto é, um indivíduo com uma infecção bacteriana ou viral, ou uma condição hiperplásica e semelhantes). Os precursores de células dendríticas e/ou células dendríticas imaturas também podem ser obtidos a partir de um indivíduo saudável com HLA compatível para ativação parcial e administração a um indivíduo HLA compatível necessitado de imunoestimulação. Numa modalidade particular, em que precursores de células dendríticas e/ou células dendríticas imaturas isoladas de um indivíduo não formam uma composição de células dendríticas ativas que produzem fatores de potência imunoestimuladores de um nível apropriado, células precursoras dendríticas ou células dendríticas imaturas de um doador normal compatível com HLA pode ser usado.
Precursores de Células Dendríticas e Células Dendríticas Imaturas
[0039] Os métodos para isolar populações de células enriquecidas para precursores de células dendríticas, tais como precursores de células dendríticas não ativas e células dendríticas imaturas de várias fontes, incluindo sangue e medula óssea, são conhecidos na técnica. Por exemplo, precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem ser isolados por coleta de sangue heparinizado, por aférese ou leucaférese, por preparação de buffy coat, rosetting, centrifugação, centrifugação por gradiente de densidade (por exemplo, usando Ficoll® (como FICOLL-PAQUE®), PERCOLL® (partículas de sílica coloidal (15-30 nm de diâmetro) revestidas com polivinilpirrolidona não dialisável (PVP)), sacarose e semelhantes), lise diferencial de células, filtração e semelhantes. Em certas modalidades, uma população de leucócitos pode ser preparada, tal como, por exemplo, coletando sangue de um indivíduo, desfibrinando para remover as plaquetas e lisando os glóbulos vermelhos. Precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem, opcionalmente, ser enriquecidos para precursores de células dendríticas monocíticas através de, por exemplo, centrifugação através de um gradiente de PERCOLL®, filtração de anticorpos e semelhantes.
[0040] Precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas podem opcionalmente ser preparados em um sistema asséptico fechado. Como aqui utilizado, os termos "sistema asséptico fechado" ou "sistema fechado" referem-se a um sistema, em que a exposição a condições de ambiente não estéril, ou ar de circulação ou outras condições não estéreis é minimizada ou eliminada. Sistemas fechados para o isolamento de precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas, geralmente, excluem a centrifugação em gradiente de densidade em tubos de topo aberto, transferência de células ao ar livre, cultura de células em placas de cultura de tecidos ou frascos não vedados e semelhantes. Numa modalidade típica, o sistema fechado permite a transferência asséptica dos precursores de células dendríticas e células dendríticas imaturas de um recipiente de coleta inicial para um recipiente de cultura de tecido vedável sem exposição ao ar não estéril.
[0041] Outro método relatado para isolar precursores de células dendríticas é usar um substrato plástico comercialmente tratado (por exemplo, esferas ou esferas magnéticas) para remover seletivamente monócitos aderentes e outros "precursores de células não dendríticas". (Ver, por exemplo, Patentes US Nos. 5,994,126 e 5,851,756). Os monócitos aderentes e precursores de células não dendríticas são descartados enquanto as células não aderentes são retidas para cultura e maturação ex vivo. Noutro método, as células de aférese foram cultivadas em sacos de cultura de plástico, aos quais foram adicionadas esferas de microtransportadores de plástico, isto é, poliestireno ou estireno, para aumentar a área da superfície do saco.
[0042] As células são cultivadas durante um período de tempo suficiente para certas células aderirem às esferas e as células não aderentes foram lavadas do saco. (Maffei, et al., Transfusion 40: 1419-1420, 2000; WO 02/44338, aqui incorporado por referência). Em certas outras modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas são isolados por aderência a um substrato de ligaição a monócitos, como divulgado no documento WO 03/010292, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. Por exemplo, uma populaçãoo de leucócitos (por exemplo, isolados por leucaférese) pode ser colocada em contacto com um substrato aderente ao precursor de células dendríticas monocíticas. Quando a população de leucócitos entra em contato com o substrato, os precursores de células dendríticas monocíticas na população de leucócitos, preferencialmente, aderem ao substrato. Outros leucócitos (incluindo outros precursores de células dendríticas potenciais) exibem reduzida afinidade de ligaçãoo ao substrato, permitindo, assim, que os precursores de células dendríticas monocíticas sejam, preferencialmente, enriquecidos na superfície do substrato.
[0043] Substratos adequados incluem, por exemplo, aqueles tendo uma grande área superficial para razão de volume. O substrato pode ser, por exemplo, um substrato particulado ou fibroso. Os substratos particulados adequados incluem, por exemplo, partículas de vidro, partículas de plástico, partículas de plástico revestidas com vidro, partículas de poliestireno revestidas com vidro, e outras esferas adequadas para absorção de proteínas. Substratos fibrosos adequados para utilização na presente invenção incluem tubos microcapilares e membranas de microvilos, e semelhantes. O substrato particulado ou fibroso permite, tipicamente, que os precursores de células dendríticas monocíticas aderidas sejam eluídos sem reduzir substancialmente a viabilidade das células aderidas. Um substrato particulado ou fibroso pode ser substancialmente não poroso para facilitar a eluição de precursores de células dendríticas monocíticas ou células dendríticas a partir do substrato. Um substrato "substancialmente não poroso" é um substrato, no qual pelo menos a maioria dos poros presentes no substrato é menor do que as células para minimizar as células aprisionadas no substrato.
[0044] A aderência dos precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato pode, opcionalmente, ser aumentada pela adição de um meio de ligação. Meios de ligação adequados incluem, por exemplo, meios de cultura precursores de células dendríticas monocíticas (por exemplo, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, XVIVO 15® e semelhantes) suplementados, individualmente ou em qualquer combinação, por exemplo, com citocinas (por exemplo, Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos/Macrófagos (GM-CSF) ou GM-CSF em combinação com Interleucina 4 (IL-4), Interleucina 15 (IL-15) ou Interleucina 13 (IL-13)), plasma sanguíneo, soro (por exemplo, soro humano, como soros autólogos ou alogênicos), proteínas purificadas, como a albumina sérica, cátions divalentes (por exemplo, íons cálcio e/ou magnésio) e outras moléculas que auxiliam na aderência específica de precursores de células dendríticas monocíticas ao substrato, ou que impedem a aderência de precursores de células dendríticas não monocíticas ao substrato. Em certas modalidades, o plasma ou soro sanguíneo pode ser inativado por aquecimento. O plasma inativo pelo calor pode ser autólogo ou heterólogo para os leucócitos.
[0045] Após a aderência dos precursores das células dendríticas monocíticas ao substrato, os leucócitos não aderentes são separados dos complexos precursor/substrato das células dendríticas monocíticas. Qualquer meio adequado pode ser usado para separar as células não aderentes dos complexos. Por exemplo, a mistura dos leucócitos não aderentes e dos complexos pode ser deixada decantar, e os leucócitos e meios não aderentes decantados ou drenados. Alternativamente, a mistura pode ser centrifugada e o sobrenadante contendo os leucócitos não aderentes decantados ou drenados dos complexos sedimentados.
[0046] Noutro modo, os precursores de células dendríticas monocíticas não ativas podem ser isolados a partir de uma populaçãoo celular enriquecida em leucócitos preparados pela utilização de um dispositivo de filtração de fluxo tangencial, tal como o descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2004/000444, depositado em Junho 19, 2003, agora, Patente US No. 7,695,627, ambas aqui incorporadas por referência. Um dispositivo de filtração de fluxo tangencial útil para o isolamento de uma população celular enriquecida em precursores de células dendríticas monocíticas pode compreender uma unidade removedora possuindo uma câmara de fluxo cruzado, uma câmara de filtrado e um filtro disposto entre elas. O filtro está em comunicação fluida de um lado, a superfície do retido, com a câmara de fluxo cruzado, e no outro lado, a superfície do filtrado, com a câmara do filtrado. A câmara de fluxo cruzado tem uma entrada adaptada para introduzir uma amostra de constituintes do sangue compreendendo leucócitos na câmara de fluxo cruzado e paralela à superfície doie retido do filtro. Uma saída é também proporcionada na câmara de fluxo cruzado disposta centralmente numa parte da câmara oposta superfície do retido do filtro. O filtro adequado para utilização no dispositivo de filtração de fluxo tangencial tem tipicamente um tamanho médio de poro que varia entre cerca de 1 e cerca de 10 mícrons. O filtro pode ter um tamanho médio de poros de cerca de 3 a cerca de 7 mícrons. Um meio para fornecer uma taxa de entrada predeterminada da amostra para a entrada da câmara de fluxo cruzado e um meio para controlar uma taxa de filtração do filtrado através do filtro e para dentro da câmara de filtrado pode também ser incluído. O meio de controle da taxa de filtragem limita a taxa de filtração a menos do que a taxa de filtração sem oposição para o filtro. A amostra compreendendo constituintes de sangue pode ser proporcionada por um dispositivo de fonte tal como um dispositivo de leucaférese ou um recipiente compreendendo uma amostra coletada de um dispositivo de leucaférese.
[0047] Os precursores de células dendríticas monocíticas e populações celulares enriquecidas para os precursores podem ser cultivadas ex vivo ou in vitro para diferenciação e maturação e/ou expansão parcial. Como aqui utilizado, células dendríticas imaturas isoladas, precursores de células dendríticas e outras células, referem-se a células que, pela mão humana, existem à parte do seu ambiente nativo e, portanto, não são um produto da natureza. Células isoladas podem existir na forma purificada, na forma semi-purificada, ou em um ambiente não nativo. Resumidamente, a diferenciação de células dendríticas in vitro e/ou ex vivo envolve tipicamente a cultura de precursores de células dendríticas monocíticas ou populações de células possuindo precursores de células dendríticas, na presença de um ou mais agentes de diferenciação de células dendríticas. Agentes de diferenciação adequados podem incluir, por exemplo, fatores de crescimento celular, por exemplo, citocinas como (GM- CSF), ou uma combinação de GM-CSF e Interleucina 4 (1L-4), Interleucina 13 (1L-13), Interleucina 15 (IL-15) ou Interleucina 7 (IL-7)). Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas monocíticas são diferenciados para formar células dendríticas imaturas derivadas de monócitos.
[0048] Os precursores de células dendríticas podem ser cultivados e diferenciados em condições adequadas de cultura in vitro. Os meios de cultura de tecidos de células dendríticas adequados incluem, mas não se limitam a, AIM- V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® e semelhantes. Os meios de cultura de tecidos podem ser suplementados com soro, plasma, aminoácidos, vitaminas, citocinas, tais como GM-CSF e/ou IL-4, IL-7, IL-13, IL-15, cátions divalentes e semelhantes, para promover a diferenciação das células. Em certas modalidades, os precursores de células dendríticas podem ser cultivados em meio isento de soro. As condições de cultura podem, opcionalmente, excluir quaisquer produtos derivados de animais. Uma combinação típica de citocina utilizada com meio de cultura de células dendríticas compreende cerca de 500 unidades/mL de cada um de GM-CSF e IL-4, IL-7, IL-15 ou IL-13. Numa modalidade típica, em que são utilizados precursores de células dendríticas não ativas, um meio de cultura de tecidos de células dendríticas típicas pode ser suplementado com GM-CSF sem qualquer outra citocina. Quando o GM-CSF é usado sozinho, o meio de cultura de tecidos é também, tipicamente, suplementado com uma alta concentração de proteína humana ou animal para prevenir a adesão do precursor de células dendríticas monocíticas não ativas ao substrato de cultura de tecido, ativando, assim, a maturação do precursor da célula dendrítica. Tipicamente, a proteína humana ou animal é adicionada a uma concentração superior a 1% e é, tipicamente, utilizada a uma concentração de 10% ou menos. A proteína humana ou animal pode ser uma albumina, tal como albumina do soro humano, soro, plasma, gelatina, um poli- aminoácido e semelhantes.
[0049] Os precursores de células dendríticas, quando diferenciados para formar células dendríticas imaturas, são fenotipicamente semelhantes às células de Langerhans da pele. As células dendríticas imaturas tipicamente são CD14- e CD11c+, expressam baixos níveis de CD86 e CD83 e são capazes de capturar antígenos solúveis via endocitose especializada.
[0050] Os agentes de maturação de células dendríticas podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a BCG, LPS, TNFα, uma combinação de TNFα, interleucina (IL)-iβ, IL-6 e prostaglandina E2 (PGE2), um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil- α,α-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-etanol (designado por R848) ou 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina, e seus derivados (ver, por exemplo, documento WO2000/47719, incorporado aqui como referência na sua totalidade), um polirribonucleotídeo de fita dupla sintético, por exemplo, poli[I]:poli[C(12)U] e semelhantes, agonistas de um receptor do tipo Toll (TLR), tais como TLR- 3, TLR-4, TLR-7 e/ou TLR-9, uma sequência de ácidos nucleicos contendo motivos CpG não metilados conhecidos por induzirem a maturação de DC, e semelhantes, ou qualquer combinação destes. Além disso, o interferon y pode ser combinado com um ou mais dos agentes de maturação de células dendríticas acima para influenciar a maturação das células dendríticas imaturas na direcão de um fenótipo que possa induzir uma resposta do tipo Th1. Quantidades eficazes de BCG variam tipicamente de um equivalente a cerca de 105 a 107 ufc por mililitro de meio de cultura de tecido antes da desativação. Quantidades eficazes de IFNy variam tipicamente de cerca de 100 a cerca de 1000 U por mililitro de meio de cultura de tecido.
[0051] Bacilo Calmette-Guerin (BCG) é uma cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Tal como aqui utilizado, o BCG refere-se a BCG total, bem como constituintes da parede celular, lipoarabidomananos derivados de BCG e outros componentes de BCG. O BCG é, opcionalmente, inativo, tal como BCG inativado por calor, BCG tratado com formalina, ou por combinações de calor e outros métodos de inativação e semelhantes. Uma quantidade eficaz de um composto de imidazoquinolina, por exemplo, um composto imidazoquinolina-4-amina, tal como 4-amino-2-etoximetil- α,α-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-etanol (designado R848) pode ser de cerca de 1 a cerca de 50 μg/ml de meio de cultura, mais tipicamente, 5 a cerca de 10 μg/ml de meio de cultura é utilizado. O composto de imidazoquinolina pode ser usado sozinho ou pode ser combinado com, por exemplo, BCG e/ou IFNy), ou um agonista adicional de TLR.
[0052] As DCs imaturas são, tipicamente, colocadas em contato com quantidades eficazes do agente de maturação de células dendríticas, tais como BCG e INFy, durante um período de tempo suficiente para induzir a maturação e para ativar, mas não amadurecer completamente as células dendríticas. Tipicamente, é necessário pelo menos um período de incubação de 24 horas para maturação completa quando BCG e INFy são usados para amadurecer células dendríticas, e dependendo do agente de maturação de células dendríticas usado, um período típico de incubação de cerca de 48 a 72 horas é necessário para maturação completa. Em certas modalidades, dependendo do agente de maturação da célula dendrítica utilizado, o período de tempo pode ser de cerca de 5 horas a cerca de 19 horas, ou mais. Numa modalidade mais típica, em que se utiliza BCG e IFNy, o período de tempo para a maturação parcial e a ativação ótima das células dendríticas pode ser de cerca de 8 a cerca de 19 horas, ou mais. As células dendríticas imaturas podem ser cultivadas e parcialmente amadurecidas e ativadas em condições de cultura de maturação adequadas. Meios de cultura de tecidos adequados incluem, mas não estão limitados a, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® e semelhantes. Os meios de cultura de tecidos podem ser suplementados com aminoácidos; vitaminas; citocinas, tais como GM-CSF sozinho (ver, por exemplo, Patente US No. 8,389,278, aqui incorporada como referência em sua totalidade, ou GM-CSF em combinação com IL-4, IL-7, IL-13 ou IL-15; cátions divalentes e similares, para promover a indução da maturação das células. Uma citocina típica pode ser apenas GM-CSF com uma alta concentração de proteína humana ou animal ou GM-CSF quando usada em combinação é usada em uma concentração de cerca de 500 unidades/ml a cerca de 1000 unidades/ml de GM-CSF e 100 ng/ml de IL-4, IL-13 ou IL-15.
[0053] A maturação parcial e a ativação de células dendríticas imaturas podem ser monitoradas por métodos conhecidos na técnica para células dendríticas. Marcadores de superfície celular podem ser detectados em ensaios familiares à técnica, tais como citometria de fluxo, imunohistoquímica e semelhantes. As células também podem ser monitoradas para produção de citocinas (por exemplo, por ELISA, outro ensaio imunológico ou por utilização de um conjunto de oligonucleotídeos). Em DCs cultivadas e parcialmente amadurecidas e otimamente ativas de acordo com a presente invenção na presença de um agente de maturação de células dendríticas, como por exemplo, mas não limitado a, BCG e IFNy, um nível aumentado de JAK2 fosforilada (Janus Kinase 2 ativada) em comparação com células dendríticas imaturas pode ser medida para indicar o início da maturação por métodos bem conhecidos na técnica. A indução da expressão de marcadores de superfície celular e citocinas, bem como a fosforilação de moléculas sinalização, por exemplo, jak2, também é conhecida como um indicador de que as células dendríticas são condicionadas para a captação de antígeno in vivo e a indução de uma resposta imunológica, uma vez que as células dendríticas tenham sido administradas a um indivíduo.
[0054] As células dendríticas imaturas são sujeitas à maturação apenas durante um período de tempo necessário para iniciar a maturação das células dendríticas imaturas e para amadurecer parcialmente e ativar as células dendríticas. Tipicamente, verificou-se que um período de tempo de cerca de 5, ou 8, ou 10 a 19 horas de incubação com uma quantidade eficaz de BCG e uma quantidade eficaz de IFNy amadurece parcialmente e ativa as células dendríticas para utilização como uma composição quando combinado com um transportador farmaceuticamente aceitável para administração a um indivíduo. DCs completamente maduras perdem a capacidade de absorver o antígeno e apresentam expressão regulada ascendente de moléculas de superfície celular co-estimuladoras e várias citocinas. Especificamente, DCs maduras expressam níveis mais altos de antígenos MHC classe I e II do que células dendríticas imaturas, e células dendríticas maduras são, geralmente, identificadas como sendo CD80+, CD83+, CD86+ e CD14-. A expressão do MHC maior leva a um aumento na densidade do antígeno na superfície da DC, enquanto a regulação das moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86 fortalece o sinal de ativação das células T através das contrapartes das moléculas co-estimulatórias, como CD28 nas células T. células dendríticas parcialmente maduras e ativas como utilizadas na presente divulgação compreendem tipicamente as células dendríticas que uma vez expostas a um agente de maturação de células dendríticas demonstram uma regulação ascendente na expressão de uma molécula co-estimulante na superfície celular em comparação com células dendríticas imaturas. Estas moléculas co-estimulantes incluem, mas não se limitam a, CD80, CD86 e/ou CD54. As células podem ou não expressar CD83, mas as células mantêm a capacidade de absorver e processar eficientemente o antígeno. Além disso, as células dendríticas parcialmente e otimamente maduras podem produzir uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 e/ou IL-12 que não são tipicamente produzidos em quantidades por células dendríticas imaturas.
[0055] As células dendríticas ativas que produzem determinadas quantidades de uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα foram agora correlacionadas com um resultado clínico melhorado. Um resultado clínico melhorado pode ser medido, por exemplo, pelo aumento do tempo de sobrevivência e/ou aumento do tempo antes da recorrcência do tumor em comparação com indivíduos não tratados ou com indivíduos tratados com um protocolo de tratamento aprovado padrão. Na presente descrição verificou-se que as células dendríticas ativas que produzem cerca de 50 a cerca de 200 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6, cerca de 500 a cerca de 2000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; pelo menos cerca de 30 a cerca de 70 ng/1 milhão de células/24 horas de TNFα; e/ou pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas da subunidade IL-12 p40 e cerca de 1 a 3 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70 biologicamente ativa possuem uma potência imunológica que correlaciona-se com melhor resultado clínico. Estas citocinas/quimiocinas também podem variar entre cerca de 75 a cerca de 150 ng/1 milhão de células/24 horas e preferencialmente cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6; cerca de 750 a cerca de 1500 ng/1 milhão de células/24 horas e, de um modo preferido, cerca de 1000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; pelo menos cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p40 e, preferivelmente, pelo menos cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70 e produzem uma potência imunológica que se correlaciona com resultados clínicos melhorados. Como previamente divulgado, um resultado clínico melhorado é definido por um tempo de sobrevivência significativamente aumentado ou um tempo significativamente aumentado de recorrência tumoral ou câncer em comparação a um indivíduo com o mesmo câncer ou tumor que não foi tratado ou foi tratado usando o padrão atualmente estabelecido de cuidado.
[0056] As células dendríticas totalmente maduras não são preferidas para a presente invenção porque, uma vez que estejam completamente maduras, as células não capturam e processam o antígeno mais eficientemente. Além disso, as células dendríticas imaturas utilizadas nos métodos anteriores não são desejadas, porque os ambientes imunossupressores tipicamente encontrados num tumor, ou no tecido circundante de um tumor, incluem concentrações substanciais de citocinas conhecidas por impedirem o processamento do antígeno por células dendríticas imaturas. Na presente divulgação, a maturação parcial e a ativação ótima das células dendríticas imaturas regula descendentemente os receptores de citocinas na superfície das células, tornando-as menos sensíveis ou responsivas a quaisquer efeitos imunossupressores de citocinas presentes no espaço intratumoral ou tecido circundante, e proporcionam células que podem absorver e processar eficientemente antígenos presentes dentro do espaço intratumoral ou tecido circundante. As células dendríticas capturam e processam quantidades substanciais de antígeno tumoral de células tumorais apoptóticas e moribundas encontradas no espaço intratumoral ou no tecido circundante. Uma vez que as células dendríticas parcialmente maturadas e ativamente ativadas tenham amadurecido dentro do espaço intratumoral como medido, por exemplo, pela expressão do receptor de quimiocina CCR7, as células dendríticas migram para os nódulos linfoides, onde as células dendríticas que agora apresentam antígeno entrarão em contato com as células T para regular ascendentemente a resposta imunológica a qualquer antígeno de tumor apresentado pelas células dendríticas.
[0057] De acordo com ainda outro aspecto da invenção, as várias DCs da divulgação podem ser preservadas, por exemplo, por criopreservação como precursores de células dendríticas monocíticas, células dendríticas imaturas antes da maturação, ou após a maturação parcial em combinação com ou sem um veículo farmaceuticamente aceitável. Agentes de crioconservação que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a dimetilssulfóxido (DMSO), glicerol, polivinilpirrolidona, polietileno glicol, albumina, dextrano, sacarose, etileno glicol, i-eritritol, D-ribitol, D-manitol, D-sorbitol, inositol, D-lactose, cloreto de colina, aminoácidos, metanol, acetamida, monoacetato de glicerol e sais inorgânicos. Uma taxa controlada de resfriamento lento pode ser crítica. Diferentes agentes crioprotetores e diferentes tipos de células tipicamente têm taxas ótimas de resfriamento diferentes.
[0058] O calor da fase de fusão, onde a água se transforma em gelo, deve ser mínimo. O procedimento de resfriamento pode ser realizado utilizando, por exemplo, um dispositivo de congelamento programável ou um procedimento de banho de metanol. Aparelhos de congelamento programáveis permitem a determinação de taxas ótimas de resfriamento e facilitam o resfriamento padrão reproduzível. Os freezers de taxa controlada programável, como o Cryomed® ou o Planar®, permitem o ajuste do regime de congelamento para a curva da taxa de resfriamento desejada.
[0059] Após o congelamento completo, as células precursoras monocíticas, as DCs imaturas e/ou DCs parcialmente maduras, com ou sem um veículo farmaceuticamente aceitável, podem ser rapidamente transferidas para um recipiente de armazenamento criogênico de longa duração. Numa modalidade típica, as amostras podem ser armazenadas criogenicamente em nitrogênio líquido (196°C) ou no seu vapor (-165°C). Considerações e procedimentos para a manipulação, criopreservação e armazenamento a longo prazo de células troncos hematopoiéticas, particularmente, da medula óssea ou sangue periférico, são largamente aplicáveis às células da invenção. Tal discussão pode ser encontrada, por exemplo, nas seguintes referências, aqui incorporadas por referência: Taylor et al., Cryobiology 27:269-78 (1990); Gorin, Clinics in Hematology 15: 19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, Jul. 2226, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp. 107-186.
[0060] As células congeladas são, preferivelmente, descongeladas rapidamente (por exemplo, num banho de água mantido a 37°C - 41°C) e resfriadas imediatamente após descongelamento. Pode ser desejável tratar as células a fim de impedir o aglomerado celular no descongelamento. Para evitar a aglomeração, podem ser utilizados vários procedimentos, incluindo, mas não limitados à adição antes e/ou após congelação de DNase (Spitzer et al., Cancer 45: 3075-85 (1980)), dextrano e citrato de baixo peso molecular, hidroxietil amido. (Stiff et al., Cryobiology 20: 17-24 (1983)) e semelhantes. O agente crioprotetor, se tóxico em humanos, deve ser removido antes do uso terapêutico das DCs parcialmente maturadas descongeladas. Uma maneira de remover o agente crioprotetor é por diluição para uma concentração insignificante. Uma vez congelados precursores de células dendríticas monocíticas, células dendríticas imaturas e/ou DCs parcialmente maturadas foram descongeladas e recuperadas, podem depois ser utilizadas em métodos adicionais para continuar com a produção de células dendríticas ativas parcialmente maduras ou para produzir um produto farmacêutico formulado. As células dendríticas parcialmente maturadas e ativas otimamente podem ser administradas como aqui descrito em relação às DCs parcialmente mortas e otimamente ativas não congeladas.
Determinação da Potência Imunoterapêutica das Células Dendríticas Ativas e Parcialmente Maturadas
[0061] A quantidade de várias citocinas e quimiocinas inflamatórias pode ser medida por métodos bem conhecidos na técnica. No presente caso, as quantidades de um ou uma combinação ou, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα produzida pelas células dendríticas ativas podem estar associadas a resultados clínicos melhorados. Um resultado clínico melhorado pode ser medido, por exemplo, por um tempo de sobrevivência significativamente aumentado e/ou um tempo significativamente aumentado antes da recorrência do tumor em comparação com indivíduos não tratados ou com indivíduos tratados com um protocolo de tratamento aprovado padrão. Inesperadamente, verificou-se que células dendríticas ativas que produzem cerca de 50 a cerca de 200 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6, cerca de 500 a cerca de 2000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; pelo menos cerca de 30 a cerca de 70 ng/1 milhão de células/24 horas de TNFα; e/ou pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas da subunidade IL-12 p40 e cerca de 1 a 3 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70 biologicamente ativa possuem uma potência imunológica que correlaciona-se com melhor resultado clínico. Estas citocinas/quimiocinas também podem variar entre cerca de 75 a cerca de 150 ng/1 milhão de células/24 horas e, preferencialmente, cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6; cerca de 750 a cerca de 1500 ng/1 milhão de células/24 horas e, de um modo preferido, cerca de 1000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; pelo menos cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p40 e, de preferência pelo menos cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p70.
[0062] Estas células dendríticas ativas podem ser utilizadas para um teste de potência imunoterapêutica para determinar se uma composição de células dendríticas ativas provavelmente produz um resultado clínico melhorado quando administrada de volta ao indivíduo. Além disso, o teste de potência imunoterapêutica pode ser utilizado para selecionar pacientes com probabilidade de desenvolver uma resposta imunológica significativa, rejeitar lotes de composição de células dendríticas que não se espera que produzam uma resposta imunológica significativa quando administrados de volta ao indivíduo; ou pode ser utilizado para rastrear agentes de ativação de células dendríticas que podem produzir os níveis desejados de uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα. Quando o sangue periférico isolado de um indivíduo não produz células dendríticas ativas capazes de produzir os níveis desejados de uma ou qualquer combinação de, e/ou de todas as IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα, esse paciente com necessidade precisa ser tratado com células dendríticas ativas isoladas de um doador normal compatível com HLA.
[0063] Os métodos para determinar a potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas ativas podem compreender as etapas de: i) preparar células dendríticas ativas utilizando qualquer dos métodos apresentados acima; ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα utilizando qualquer método bem conhecido na técnica; iii) comparar a quantidade determinada de uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα a uma quantidade limite; iv) determinar que a composição de células dendríticas ativas tem uma potência imunoterapêutica baixa se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα estiver abaixo do limiar; ou que a composição de células dendríticas ativas é de elevada potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e TNFα estiverem acima do limiar. As quantidades limiares para IL-6, IL-8, IL-12 e TNFα são apresentadas acima. Se as células dendríticas ativas demonstrarem elevada potência imunoterapêutica, as células dendríticas ativas podem ser formuladas para administração com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0064] Noutra modalidade, é proporcionado um método para aumentar a potência imunoterapêutica de uma população de DC ativa. O método compreende as etapas de: i) preparar de uma população de células dendríticas ativas; ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα por um método bem conhecido na técnica; iii) comparar a quantidade determinada de uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα a uma quantidade limite; iv) determinar se uma ou qualquer combinação de, e/ou toda a IL-6, IL-8, IL-12 e ou TNFα está abaixo do limiar; v) adicionar uma quantidade suficiente de um agente que possa induzir a produção de uma ou qualquer combinação de, e/ou de toda a IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα pela DC ativa para trazer a quantidade de IL-6, IL-8, IL-12 e/ou TNFα acima da quantidade limite, de modo a formar uma população de DC ativada com uma potência imunoterapêutica aumentada.
Administração In Vivo de Células Dendríticas Parcialmente Amadurecidas
[0065] São proporcionados métodos e composições para administração de células dendríticas parcialmente maduras e ativas, ou uma população celular enriquecida e contendo tais células, a um indivíduo tendo, por exemplo, um câncer ou um tumor. Em certas modalidades, esses métodos são realizados pela obtenção de precursores de células dendríticas ou células dendríticas imaturas, diferenciando e maturando parcialmente essas células na presença de um agente de maturação de células dendríticas, tais como BCG e IFNy, ou qualquer outro agente de maturação de células dendríticas listado acima. As células dendríticas parcialmente maduras e ativas podem ser fornecidas a um médico num estado criogênico. Antes da administração, as células congeladas são rapidamente descongeladas, resfriadas e formuladas com um transportador, excipiente, tampão e/ou diluente fisiologicamente aceitável utilizando métodos e composições bem conhecidos do perito na técnica. As células dendríticas parcialmente maduras e ativas podem ser administradas diretamente a um indivíduo com necessidade de imunoestimulação. Tipicamente, cerca de 102 a cerca de 1010 células são suspensas num veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. As células são injetadas no tumor diretamente ou numa região próxima, adjacente, ou num vaso circulatório ou duto linfático em contato com o tumor ou leito tumoral para assegurar que as células tenham acesso ao câncer ou ao antígeno tumoral.
[0066] Por exemplo, mas não por limitação, as células podem ser administradas diretamente em um tumor, no leito do tumor após a remoção cirúrgica ou ressecção do tumor, espaço peritumoral, em um nódulo linfóide drenante em contato direto com o tumor, em um vaso sanguíneo ou duto linfático que conduz ou que alimenta um tumor ou órgão afetado pelo tumor, por exemplo, a veia porta ou uma veia ou artéria pulmonar e semelhantes. A administração das células dendríticas parcialmente e optimamente maduras da invenção pode ser simultânea com ou subsequente a outros tratamentos para o tumor, tal como quimioterapia ou radioterapia. Além disso, as células dendríticas parcialmente maduras da invenção podem ser co-administradas com outro agente, agente esse que atua como um adjuvante para a maturação das células dendríticas e/ou o processamento de antígeno dentro do tumor ou região perto ou adjacente ao tumor. Além disso, as células dendríticas também podem ser formuladas ou compostas em uma matriz de liberação lenta para implantação em uma região ou em torno do tumor ou leito tumoral de forma que as células sejam liberadas lentamente no tumor ou leito tumoral, para contato com os antígenos tumorais.
[0067] Um tumor, tal como utilizado na presente divulgação, inclui tumores sólidos, tais como, por exemplo, e não limitado, um sarcoma; um tumor pancreático; um tumor colorretal; um melanoma; um tumor pulmonar; um tumor de mama; um tumor ovariano; um tumor na cabeça ou pescoço; um tumor de estômago; um tumor na próstata; um tumor esofágico; um tumor cervical ou vaginal; um tumor cerebral, tal como, por exemplo, um glioblastoma, um astrocitoma, um meningioma ou um meduloblastoma; e similar. Tumores sólidos adicionais são também sujeitos ao tratamento utilizando uma composição ou método aqui revelado.
[0068] As células dendríticas parcialmente maduras e ativas da presente divulgação podem ser administradas por qualquer meio apropriado para a formulação e modo de administração. Por exemplo, as culas podem ser combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável e administradas com uma seringa, um cateter, uma cânula e semelhantes. Como acima, as células podem ser formuladas numa matriz de liberação lenta. Quando administrada desta maneira, a formulação pode ser administrada por um meio apropriado para a matriz utilizada. Outros métodos e modos de administração aplicáveis à presente invenção são bem conhecidos do perito na técnica.
[0069] As composições da presente invenção podem ser utilizadas por elas próprias no tratamento de um indivíduo. Além disso, as composições podem ser utilizadas em combinação com qualquer outro método para tratar um câncer ou um tumor. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser utilizados em combinação com resseccão cirúrgica de um tumor, quimioterapia (fármacos citotóxicos, agentes apoptóticos, anticorpos e semelhantes), terapia com radiação, crioterapia, braquiterapia, terapia imunológica (administração de células dendríticas ativas maduras de antígenos específicos, células NK, anticorpos específicos para uma célula cancerosa ou um antígeno tumoral, etc.) e semelhantes. Qualquer um e todos esses métodos também podem ser usados em qualquer combinação. Os tratamentos combinados podem ser simultâneos ou sequenciais e podem ser administrados em qualquer ordem, conforme determinado pelo médico assistente.
[0070] Noutra modalidade, as células dendríticas e o indivíduo receptor possuem o mesmo haplotipo de MHC (HLA). Os métodos de determinação do haplotipo HLA de um indivíduo são conhecidos na técnica. Numa modalidade relacionada, as células dendríticas parcialmente maduras são alogênicas ao indivíduo receptor. As células alogênicas são tipicamente combinadas para pelo menos um alelo do MHC (por exemplo, compartilhando pelo menos um, mas não todos os alelos do MHC). Numa modalidade menos típica, as células dendríticas e o indivíduo receptor são todos alogénicos uns em relação aos outros, mas todos têm pelo menos um alelo de MHC em comum.
[0071] Uma resposta imunológica antitumoral pode ser medida por qualquer um ou mais métodos bem conhecidos. Por exemplo, uma resposta antitumoral pode ser medida por uma redução no tamanho de um tumor, a indução de morte de células tumorais ou necrose de células tumorais, uma redução na proliferação de células tumorais ou pela infiltração de células T específicas de antígeno tumoral (TILs) e similares.
EXEMPLOS
[0072] O exemplo seguinte é fornecido meramente como ilustrativo de vários aspectos da presente descrição e não deve ser interpretado como limitando os métodos e composição aqui descritos de qualquer forma. Embora uma modalidade preferida do método e/ou método tenha sido ilustrada e descrita, será apreciado que podem ser feitas várias alterações sem sair do escopo e âmbito da presente descrição.
[0073] Neste exemplo, as células dendríticas ativas são testadas num estudo de escalonamento de dose em vários tumores sólidos.
MÉTODOS
[0074] Quarenta indivíduos foram incluídos neste estudo de escalonamento de dose para testar a segurança e viabilidade da injeção intratumoral de DC ativa (aDC), incluindo células dendríticas ativas de forma otimizada, em tumores sólidos. Os indivíduos com 18-75 anos de idade com doença localmente avançada ou metastática, os quais tinham sido submetidos pelo menos a um regime de tratamento antitumoral dentro das 12 semanas de triagem, foram elegíveis para o estudo. Outros critérios de elegibilidade incluíram um status de desempenho do Grupo Cooperativo Oncológico Oriental (ECOG) de 0 ou 1, tendo pelo menos uma massa tumoral injetável maior que 1 cm de diâmetro e localizada longe de grandes estruturas vasculares ou áreas não suscetíveis à dilatação (por exemplo, tumores das vias aéreas), produzindo um número suficiente de monócitos para fabricar uma dose completa, com uma esperança de vida superior a 6 meses, e tendo uma adequada função da medula óssea e renal. Indivíduos com história de doença autoimunológica ou transplante de órgãos foram excluídos do estudo. Outros critérios de exclusão incluídos tendo um status positivo para HIV-1,2 ou HTLV-I ou II; tendo quimioterapia mielossupressora ou mielotóxica intensa nas 4 semanas anteriores à primeira injeção; recebendo imunoterapia de câncer dentro de 2 anos; tendo metástases cerebrais não tratadas; necessitando de terapias contínuas com esteróides ou anticoagulantes; ou tendo uma infecção aguda ou descontrolada. As características dos indivíduos estão resumidas na Tabela 1. Tabela 1. Características base dos pacientes tratados
Esboço do estudo
[0075] Esta foi uma avaliação da segurança e eficácia de DCs ativas. A porção de escalonamento de dose do estudo usou um desenho "3 + 3". Três níveis de dose foram incluídos neste estudo: 2 milhões, 6 milhões e 15 milhões de DCs ativas por injeção.
[0076] Cada indivíduo foi submetido à leucaférese para coletar monócitos, as células precursoras de DC. As DCs ativas (aDC; nome comercial DCVax®-Direct) foram preparadas como descrito abaixo. A primeira injeção de aDC ocorreu aproximadamente 3 semanas após a leucaférese e as injeções subsequentes foram administradas às 1, 2, 8, 16 e 32 semanas após a primeira injeção. Todas as injeções foram administradas usando orientação de imagem, seja ultrassonografia ou tomografia computadorizada (TC), para colocar uma agulha guia dentro do tumor e, em seguida, uma agulha mais fina distribuiu o produto diretamente para o tecido do tumor. Para cada imunização, foram utilizadas 3 a 4 passagens de agulha para administrar as células dentro das margens do tumor, aumentando a exposição aDC às células tumorais mortas e moribundas, evitando a administração de um único bolus ao centro necrótico da massa tumoral. Após as injeções, os indivíduos foram observados por 2 horas com sinais vitais (frequência cardíaca, temperatura e pressão arterial) a cada 30 minutos.
Toxicidade em dose-limitante (DLT) e dose máxima tolerada (MTD)
[0077] DLT foi definida como qualquer uma das seguintes: reações no local da injeção de grau > 3, desenvolvimento de sinais clínicos e sintomas de doença autoimune, reação alérgica de grau > 2, reação imunológica de grau > 2 que durou durante 3 ou mais dias ou necessitou de intervenção medicamentosa, grau > 3 para os Critérios Comuns de Toxicidade do Instituto Nacional do Câncer (NCI CTC) v.4 toxicidade , ou grau 4 ou eventos com risco de vida que não estão relacionados à progressão da doença maligna. A dose máxima tolerada (MTD) foi definida como o nível mais elevado de dose, no qual não mais do que um terço dos indivíduos experimentaram toxicidades limitantes da dose (DLT).
Avaliação de eficácia
[0078] A eficia do tratamento foi avaliada por estudos de imagem por tomografia computadorizada (TC) ou ressonâcia magnética (MR) de acordo com os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos v. 1.1 (Eisenhauer et al., Eur. J. Cancer 4: 228-247, 2009) ou critérios relacionados com resposta imunológica (Hoos et al., J. Nat’l. Cancer Inst. 102: 1388-1397, 2010). Resumidamente, a Doença Progressiva (PD) foi definida como um aumento > 20% na soma dos diâmetros da lesão alvo em comparação com a menor soma observada durante o estudo, e a soma absoluta deve aumentar > 5 mm. A Doença Estável (SD) foi definida como tendo redução do tumor insuficiente para se qualificar como uma resposta parcial (^ 30% da redução do diâmetro da lesão alvo), enquanto também teve crescimento insuficiente do tumor para se qualificar como PD.
Preparação de DCs ativas
[0079] Os monócitos foram purificados a partir do produto de leucaférese utilizando filtração de fluxo tangencial. As células foram colocadas em bolsas de cultura de tecidos de Teflon (Saint-Gobain, Malvern, PA) e diferenciadas em DC imaturas por 5 dias na presença de fator estimulante de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF mais 2% de albumina sérica humana). As células foram cultivadas durante 5 dias, e, então, micobactérias BCG mortas e IFNy foram adicionadas para induzir a ativação de DC durante um período de tempo de cerca de 10 a 19 horas. Após ativação, as células dendríticas ativas foram ressuspensas num pequeno volume de RPMI-1640, 40% de albumina do soro humano e 10% de DMSO e as células foram criopreservadas em alíquotas de dose única. A citometria de fluxo foi realizada nas células em busca de marcadores de ativação de células dendríticas (Figura 3).
Determinação do nível de citocinas
[0080] Um conjunto magnético personalizado multiplex (Luminex Corp., Austin, TX) definido para TNFα, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12p40 e um conjunto único para IL-12p70 (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram utilizados para determinar as concentrações de citocinas em sobrenadantes clarificados de culturas de produtos DCVax-Direct de acordo com o protocolo do fabricante. Os dados são relatados como o valor médio de determinações duplicadas padronizadas por milhão de DCs ativos.
Avaliação de biópsias tumorais
[0081] Os tumores biopsiados foram fixados em formol e embebidos em parafina (FFPE) usando métodos padrão. Toda imunohistoquímica foi realizada por QualTek Molecular Laboratories (Santa Bárbara, CA).
[0082] A detecção in situ de transcriptos IFNy e TNFα em amostras FFPE foi realizada utilizando o ensaio RNAscope com sondas Hs-IFNy e Hs-TNFα (cat#310501 e 310421 respectivamente, Advanced Cell Diagnostics (ACD), EUA), bem como sonda de controle positivo PPIB (cat#313901) e kit reagente HD RNAscope 2.0 (Brown) (cat#310035, ACD, EUA) seguindo os procedimentos recomendados pelo fabricante. Para verificar a especificidade do IFNy e do RNAFscope do TNFα, as PBMCs de três dadores saudáveis foram testadas antes e depois da estimulação das células T. Para estimular as células T, as PBMCs foram isoladas usando Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich), ressuspensas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e tratadas com 50 ng/mL de acetato de miristato de forbol (PMA) e 1 μg/mL de ionomicina (Sigma-Aldrich) durante 5 horas a 37°C e 5% de CO2. As células foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% (NBF) em Histogel, processadas e embebidas em blocos FFPE. Seções (5 μm) foram, então, testadas usando RNAscope, como indicado acima. As células T estimuladas demonstraram um forte aumento tanto no IFNy quanto no TNFα em comparação com as células não tratadas. As imagens digitais das lâminas manchadas foram adquiridas com um scanner digital de slides Aperio ScanScope XT.
Análise estatística
[0083] Análises estatísticas foram realizadas para determinar se os níveis de citocinas estavam associados ao desfecho. Além disso, avaliou-se se as características basais ou os fatores de tratamento eram preditivos dos níveis ou resultadod das citocinas. A resposta foi medida com base em duas variáveis: SD na semana 8 como uma medida binária e duração da sobrevivência. Ajustes não foram realizados para testar a multiplicidade. Um valor de p de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
[0084] Primeiramente, medidas descritivas foram geradas para os níveis de citocinas, incluindo correlações entre as medidas de potência. Em seguida, a associação entre as características basais ou os fatores de tratamento com os níveis de citocinas foi avaliada por meio dos métodos não paramétricos ANOVA (Wilcoxon). Gráficos de dispersão das medidas foram revisados para todos os pares de níveis de citocinas. Um modelo de riscos proporcionais foi utilizado para ajustar a sobrevivência em função dos níveis individuais de citocinas, e uma regressão reversa foi usada para determinar se medidas especiais eram mais preditivas em um modelo conjunto. Um modelo logístico foi utilizado para ajustar a SD em 8 semanas em função dos níveis individuais de citocinas, e uma regressão reversa foi usada para determinar se medidas especiais eram mais preditivas em um modelo em conjunto. Modelos de riscos proporcionais, modelos logísticos, testes de tendências ou testes de x2 da razão de semelhança foram usados para avaliar a associação das características base e fatores de tratamento com a sobrevivência e a SD em 8 semanas, conforme apropriado para a medida e parâmetro. Para os gráficos de sobrevivência de Kaplan-Meier baseados nos níveis de citocinas, o valor mediano foi usado para cada citocina como o ponto de corte entre os dois grupos.
[0085] Com base nas análises e uma revisão dos gráficos de dispersão, um grupo de observações pareceu ser potencialmente discrepante ou, possivelmente, um conjunto único de indivíduos (descrito mais adiante em Resultados). As análises foram repetidas com esses registros removidos de indivíduos. As análises foram concluídas usando o SAS versão 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultados Indivíduos
[0086] No total, 40 indivíduos foram incluídos no estudo. Destes, um indivíduo foi considerado não avaliável devido a uma formulação incorreta dos aDCs. Os dados demográficos e as características clínicas dos pacientes estão apresentados na Tabela 1. A idade média dos pacientes foi de 53 anos (variação de 30 a 73 anos). O estudo incluiu 21 mulheres (53,8%). Um grande número de tipos de tumores foi incluído no estudo, sendo o mais comum sarcoma (n = 8), câncer colorretal (n = 7) e melanoma (n = 6). Os indivíduos tinham uma média de três lesões (faixa = 1 a 5 lesões). O número médio de tratamentos anteriores foi dois (média = 3; faixa = 1 a 9). Todos os procedimentos foram realizados em ambulatório sob orientação de imagem (tomografia computadorizada) ou ultrassonografia) facilitada pela sedação consciente por um radiologista intervencionista. Na dose de 2 milhões de aDC, 16 indivíduos receberam média de quatro injeções (faixa = 1 a 6 injeções). Na dose de 6 milhões de aDC, 20 indivíduos receberam em média de três injeções (faixa = 2 a 6 injeções). Na dose de 15 milhões de células aórticas, três indivíduos receberam uma média de quatro injeções (faixa = 3 a 4 injeções). Apenas um tumor foi injetado por indivíduo.
[0087] As aDCs foram administradas intratumoralmente sob orientação de imagem, a uma dose de 2 milhões, 6 milhões ou 15 milhões de DC ativas, autólogas, ativas por injeção. Em cada visita de injeção (dias 0, 7, 14, depois semanas 8, 16 e 32), uma única lesão foi injetada. Para preparar a DC para injeção intratumoral, elas foram ativas através da exposição ao BCG e IFNy. Os sobrenadantes das DC ativas foram coletados para medir a produção de citocinas. Biópsias tumorais foram avaliadas quanto à necrose tumoral e infiltração de linfócitos. O tamanho do tumor foi monitorado através de procedimentos de imagem padrão, e o sangue foi coletado para monitoramento imunológico.
Segurança e sobrevivência
[0088] A injeção intratumoral sob orientação de imagem foi, geralmente, bem tolerada e viável. No total, injeções i.t. foram realizadas, em 16 indivíduos aos 2 milhões, 20 indivíduos aos 6 milhões e 3 indivíduos aos 15 milhões de doses. Não foram observadas toxicidades limitantes de dose (DLTs) durante o escalonamento da dose, e assim, uma dose máxima tolerada (MTD) não foi determinada. A dose máxima testada (15 milhões de aDCs) foi bem tolerada. Os eventos adversos relacionados ao tratamento do estudo estão relatados na Tabela 2. Tabela 2. Eventos adversos relacionados ao tratamento. Abreviaturas: aDCs, células dendríticas ativas; G, grau (de acordo com os Critérios Comuns de Terminologia para Eventos Adversos do Instituto Nacional do Câncer, versão 4). a Quando os eventos adversos foram observados em várias datas em diferentes graus, o maior grau observado foi listado. b Por cento do total de pacientes, N = 39.
[0089] Os eventos adversos relacionados ao tratamento foram observados em 32 indivíduos (82,1%), mas a maioria destes foi grau 1 ou 2 e a maioria tinha resolvido até o final do período do estudo. Os eventos adversos mais comuns foram pirexia (n = 31, 79,5%), calafrio (n = 16, 41,0%), fadiga (n = 12, 23,1%), dor ou desconforto no local da injeção (n = 11, 28,2%), suores noturna (n = 10, 25,6%), diminuição do apetite (n = 9, 23,1%) e mialgia (n = 7, 17,9%).
[0090] Houve quatro eventos adversos relacionados ao tratamento de grau 3 (10,3%) e um de grau 4 (2,6%), todos nos 6 milhões de aDCs por dose de injeção.
Histologia
[0091] Séries de dados de biópsia foram coletadas de 28 indivíduos. No total, 104 biópsias foram realizadas. Necrose nova ou aumentada foi observada em 14 indivíduos biopsiados (57%). Números novos ou aumentados de linfócitos estromais foram observados em 14 indivíduos biopsiados (50,0%); Números novos ou aumentados de linfócitos infiltrantes foram observados em 15 indivíduos biopsiados (54%); e ambos os linfócitos infiltrantes e estromais foram observados em 8 indivíduos biopsiados (29%). As biópsias foram coletadas na semana 3 e na semana 8, e as células T peritumorais ou intratumorais foram, geralmente, detectadas às 8 semanas após o início do tratamento. Portanto, a resposta imunológica foi iniciada em algum lugar dentro desse período de tempo. Em alguns indivíduos, o acúmulo de células T foi detectado 2 ou 3 semanas após a primeira injeção. Essas células T podem representar uma resposta imunológica antitumoral pré-existente que se localiza no tumor após a injeção de DC ativa.
[0092] A expressão de novo ou significativamente aumentada de PD-L1 foi observada em 19 das 25 biópsias tumorais avaliadas. Entre as biópsias marcadas para ambos os linfócitos e PD-L1, observou-se a expressão de PD-L1 nova ou aumentada em 9 de 12 indivíduos com novo aumento de células T infiltrantes e 11 de 12 indivíduos com linfócitos estromais novos ou aumentados. Entre os 19 indivíduos com expressão nova ou aumentada de PD-L1, 14 indivíduos apresentavam linfócitos peritumorais ou infiltrados.
[0093] Quando se observaram células T infiltrantes, estas eram, principalmente, uma mistura de células CD4+ e CD8+; no entanto, houve alguns casos em que as células T CD4+ ou CD8+ foram detectadas exclusivamente. Em alguns casos, as células T constituíram mais de 30% do total de células na seção da biópsia (veja também a Figura 1A).
[0094] Para avaliar a funcionalidade de células T associadas aos tumores e infiltração, realizou-se a análise de RNAscope para a expressão de IFNy e TNFα em tecidos selecionados. A maioria das células T nas amostras testadas foram positivas para ambas as citocinas (Figuras 1B e 1C), sugerindo que células T totalmente funcionais foram recrutadas para o tumor. Macrófagos teciduais expressando TNFα também foram detectados.
Níveis de citocinas, sobrevivência e doença estável (SD)
[0095] Os níveis de citocinas das DCs foram avaliados antes da injeção no indivíduo. Como cada lote de DCs foi derivado dos próprios monócitos do indivíduo, houve um grande grau de variabilidade interindivíduos observada nos níveis de citocinas. Assim, as correlações internas entre os níveis de citocinas e as associações entre os níveis de citocinas e características de base, fatores de tratamento, sobrevivência e SD foram avaliados em 8 semanas.
[0096] Durante as análises estatísticas, três indivíduos tinham DCs ativas que tinham níveis elevados de IL-8 e IL-6, mas níveis baixos de TNFα. Estes indivíduos consistentemente emergiram como valores discrepantes estatísticos. O primeiro indivíduo com valor discrepante foi um indivíduo masculino de 51 anos com melanoma do grupo de tratamento de 6 milhões de aDC. Ele teve 5 lesões e foi submetido a uma rodada de tratamento previamente. Ele recebeu três injeções, teve SD na semana 8 e morreu aproximadamente 9 meses após a primeira injeção. O segundo indivíduos com valor discrepante foi um indivíduo do sexo feminino com 59 anos com câncer de mama, no grupo de tratamento de 6 milhões de aDC. Ela teve três lesões e passou por oito rodadas de tratamento anteriormente. Ela recebeu três injeções e morreu aproximadamente 1 mês após a primeira injeção. O terceiro indivíduo com valor discrepante foi um indivíduo do sexo masculino com 52 anos com câncer de pulmão no grupo de tratamento de 15 milhões de aDC. Ele teve três lesões e foi submetido a cinco rodadas de tratamento anteriormente. Ele recebeu três injeções, teve PD (Doença Progressiva) na semana 8 e morreu aproximadamente 3,5 meses após a primeira injeção. Todos os três indivíduos tinham um pesado fardo de doença e um prognóstico extremamente insuficiente. Os três indivíduos não tinham outras características proeminentes conhecidas que os separassem do resto dos indivíduos do estudo. Uma análise exploratória das aDCs de um dos indivíduos sugere que os monócitos purificados podem não ter se transformado completamente em aDCs. Nas análises subsequentes, os dados de indivíduo com valor discrepante foram excluídos.
Correlações internas entre os níveis de citocinas
[0097] Para avaliar a qualidade de ativação e o efeito das citocinas produzidas pelas aDCs, os níveis de TNFα, IL- 6, IL-8, IL-10, IL12p40 e IL-12p70 foram determinados. Houve um alto nível de correlação interna entre as várias citocinas avaliadas. Esses valores foram correlacionados com o resultado (doença estável (SD) ou sobrevivência) em análises não ivariadas. Separadamente, um modelo de regressão reversa foi usado para avaliar a força preditiva relativa das medidas e identificar combinações de variáveis com base em um modelo conjunto, começando com todos os fatores. As citocinas correlacionadas foram classificadas em três grupos. O primeiro grupo incluiu IL-6, IL-12p40 e, em menor grau, TNFα. O valor r de Pearson para IL-6 e IL- 12p40 foi de 0,64 (p = 0,004). O valor de r para IL-6 e TNFα foi de 0,88 (p = <0,001). O valor de r para IL-8 e IL- 12p40 foi de 0,641 (p <0,001). O segundo grupo foi IL-10 e IL-8. O valor de r para IL-18 e IL-10 foi de 0,63 (p <0,001). O terceiro grupo foi IL-12p40 e IL-12p70, que teve um valor de r de 0,55 (p <0,001). Deve-se notar que o curto tempo de ativação usado para gerar aDCs não foi o ideal para detectar o complemento total da produção de IL-12p70.
Associação entre níveis de citocinas e características de base e fatores de tratamento
[0098] Em seguida, associações entre nível de citocinas e características de base e fatores de tratamento, incluindo indicações, número de lesões, tratamento prévio, dose, número de injeções, idade, soma ou o maior diâmetro do tumor (SLD) e contagem absoluta de linfócitos na triagem (ALC) foi determinado usando análise de regressão. SLD foi negativamente associado com níveis de IL-8 (R2 = 0,20; p = 0,006), IL-12p40 (R2 = 0,14; p = 0,026) e IL-12p70 (R2 = 0,11; p = 0,051), e positivamente associado aos níveis de IL-10 (R2 = 0,023). ALC foi positivamente associada com IL- 12p40 (R2 = 0,26; p = 0,002). Nem SLD ou ALC foram independentemente associados com a sobrevivência.
Associações entre níveis de citocinas e sobrevivência
[0099] Os níveis de citocinas foram ajustados individualmente em um modelo de risco proporcional para determinar se eles eram preditivos de sobrevivência. A análise não variada indicou que a IL-6 (p = 0,048), a IL-8 (p = 0,014) e a IL-12p40 (p = 0,016) foram associadas à sobrevivência. Especificamente, os níveis de IL-8 superiores a 985 ng/106 células/dia e níveis de IL-12p40 superiores a 330/106 células/dia apresentaram sobrevivência global significativamente maior (p = 0,0022 e p = 0,0077, respectivamente; Figuras 2A e 2B).
[00100] Uma análise exploratória foi realizada para avaliar um modelo conjunto de pares de citocinas isoladas e avaliar possíveis interações entre fatores. A combinação de IL-8 e IL-12p40 foi associada a um termo de interação potencialmente significativo (p = 0,020). O modelo de interação conjunta indica que indivíduos com altos valores de IL-8 e IL-12p40 podem responder melhor em geral. Este resultado sugere que pode haver relações mais complexas entre as medidas de potência DC e resultados clínicos.
Associação entre nível de citocinas e doença estável na semana 8
[00101] A análise de Kaplan-Meyer mostrou que a sobrevivência foi significativamente associada à semana 8 DP (p = 0,004), Figura 2C); assim, determinou-se se havia marcadores de citocinas associados a SD. Os níveis de citocinas foram ajustados individualmente em um modelo logístico para determinar se eles eram preditivos da SD da Semana 8. A análise não variada revelou uma associação positiva entre da Semana 8 de SD e a TNFα (p = 0,015, Figura 2D), e essa associação foi confirmada em um modelo de regressão reversa multivariada (p = 0,014).
Outras medidas de qualidade DC
[00102] A aDC injetada de 25 indivíduos foi analisada para expressão de marcadores de superfície. Correlações fracas entre a sobrevivência e os níveis de expressão (intensidade média de fluorescência dividida em tercis) de antígenos MHC de classe I (log-rank p para tendência = 0,07) e a molécula coestimuladora CD86 (log-rank p para tendência = 0,1), suporte para a hipótese de que a qualidade da DC é um fator primário para o resultado do indivíduo quando administrado por via intratumoral (Figura 2E e Figura 2F).
[00103] Estabilização da doença foi observada em mais indivíduos tratados com aDC que produziam níveis elevados de TNF (p <0,01). A sobrevivência também está associada aos altos níveis de produção de TNFα, IL-6 e IL-8.
[00104] Neste estudo, a segurança e a eficácia de células dendríticas autólogas ativadas (aDCs) foram testadas. As DCs foram injetadas intratumoralmente, como tratamento para indivíduos com tumores sólidos irressecáveis, localmente avançados ou metastáticos. Os indivíduos foram tratados com 2, 6 ou 15 milhões de aDCs por injeção na semana 0, 1, 2, 8, 16 e 32, ou até que não houvesse aDCs autólogas para administrar. Nenhum DLTs foi observado e, portanto, não houve MTD. Esta observação é consistente com outros estudos de vacina DC nos quais nenhum DLTs ou MTDs foi identificado (Butterfield, Front. Immunol. 4: 454, 2013, Draube et al., PLoS One 6: e18801, 2011). Dado que as vacinas DC usam células autólogas, não foi surpresa que houvesse toxicidade limitada. Foi notado anteriormente que uma dose de vacina DC é limitada apenas pelo número de células que podem ser extraídas durante a leucaférese e convertidas para tratamento, o que é referido como a dose máxima viável (Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67:731-753, 2015).
[00105] A dose máxima aqui administrada foi de 15 milhões de aDCs por injeção, e essa dose foi bem tolerada; no entanto, esta dose grande pode não ser necessária para gerar uma resposta eficaz das células T. Uma grande meta- análise de triagem de vacinas DC com câncer de próstata e renal identificou uma correlação positiva entre dose e resultado (Draube et al., PLoS One 6: e18801, 2011). No entanto, vários outros estudos mostraram que um número menor de células pode alcançar respostas imunes equivalentes com relativamente poucas DCs, desde que as DCs efetivamente atinjam a drenagem linfática (Tel et al., Cancer Res. 73: 1063-1075, 2013; Aarntzen et al., Clin. Cancer Res. 19: 1525-1533, 2013, Verdijk et al., Expert Opin. Biol. Ther. 87:865-874, 2008), Celli et al., Blood 120:3945-3948, 2012). Relativamente poucos eventos adversos relacionados ao tratamento de baixo grau foram observados com o tratamento aDC neste estudo. Esses eventos adversos foram principalmente associados à ativação do sistema imunológico, como a pirexia. Estes resultados, juntamente com a falta de MTD, indicam que os aDCs são um tratamento seguro para tumores sólidos.
[00106] Com relação à eficácia das aDCs, biópsias de tumores injetados mostraram aumento da necrose e infiltração de linfócitos, incluindo células CD4+ e CD8+ células assassinas. Em casos individuais, observou-se reatividade imunológica com infiltração rápida e tardia de células T em biópsias de pacientes e extensa necrose. Estas observações precederam uma redução demonstrável no tamanho do tumor (dados não mostrados). Estudos demonstraram que o aumento da infiltração e acumulação de certos tipos de células T, tais como linfócitos estromais e CTLs, em tumores, está fortemente correlacionado com melhores resultados em vários tumores sólidos (Tosolini et al., Cancer Res. 71: 1263-1271, 2011; Smyth et al., Adv. Immunol., 90: 1-50, 2006; Clemente et al., Cancer 77: 13031310, 1996). Além disso, a PD-L1 foi regulada positivamente em 19 dos 25 tumores testados, e essa regulação ascendente provavelmente reflete a resposta do tumor à ativação imunológica, particularmente, porque as biópsias tumorais que testaram positivo para células T eram mais propensas a ter expressão aumentada de PD-L1. A PD-L1 é uma molécula co-inibitória induzida durante a infiltração de linfócitos que regula negativamente a atividade das células T para controlar reações imunológicas excessivas, e os tumores a utilizam para evitar respostas imunológicas (Ito et al., Biomed. Res. Int. 2015: 605478, 2015 Anguille et al., Pharmacol. Rev. 67: 731-753, 2015). Uma vez que os dados acima de PD-L1 são de tumores biopsiados, o surgimento da expressão de PD-L1 pode servir como um marcador de indução de resposta imunológica antitumoral bem-sucedida, em vez de uma indicação de regulação descendente da resposta imunológica. No geral, esses resultados fornecem evidências de que os aDCs estimulam uma resposta eficaz de células T em tumores sólidos.
[00107] Para que o tratamento de aDC seja eficaz, também deve melhorar os resultados dos pacientes. A hipótese aqui é que o mecanismo de sobrevivência estava relacionado à potência da DC, como medida pelas citocinas secretadas pelas aDCs. Portanto, os níveis de citocinas das aDCs foram avaliados antes de serem injetados nos tumores. Observou-se que a IL-12p40 foi significativamente associada à sobrevivência. A IL-12p40 é uma subunidade do complexo heterodimérico IL-12, também chamado IL-12p70. A IL-12 é conhecida por estimular células assassinas naturais e células T maduras. Sabe-se também que ajuda a converter as células TH2 em células TH1 que possuem atividade antitumoral (Del Vecchio et al., Clin. Cancer Res. 12: 4677-4685, 2007). Assim, as aDCs produtoras de IL-12p40 são ideais para uma vacina DC eficaz. Além disso, a secreção de IL-8 foi associada à sobrevência. Especificamente, a alta secreção de IL-8 mostrou uma sobrevivência global significativamente maior. A IL-8 é largamente considerada como associada negativamente ao câncer. A IL-8 promove angiogênese, proliferação celular e sobrevivência celular; no entanto, também promove a infiltração de células imunológicas no microambiente tumoral (Waugh e Wilson, Clin. Cancer Res. 14:6735-6741, 2008). No caso da imunoterapia com BCG, a IL-8 foi associada com o desenvolvimento de uma resposta imunológica antitumoral (de Boer et al., Urol. Res. 25: 31-34, 1997). Parece possível que a aplicação localizada de aDCs produtoras de IL-8 estimulasse a infiltração de céulas imunológicas no tumor. Em adição, o modelo de regressão indicou que a combinação dos dois foi positivamente associada com a sobrevivência. Esta observação indica que a combinação de IL-8 e IL-12p40 (e possivelmente outras citocinas), em vez de citocinas individuais, pode ser fundamental para melhorar a sobrevivência. Atualmente, não está claro se as citocinas secretadas que se correlacionam com a sobrevivência têm significado funcional direto ou se estão servindo como medidas sensíveis da potência total da DC. As associações observadas entre os parâmetros de base do paciente e a potência DC medidos pela produção de citocinas sugerem que fatores como SLD e ALC podem predispor os pacientes a um benefício maior das terapias baseadas em DC, embora os valores de R2 sugiram que esses parâmetros bases explicam até 25% da variação nos níveis de citocinas. Essa possibilidade merece mais atenção em estudos posteriores com populações de pacientes mais homogêneas e será objeto de futuras investigações.
[00108] A análise de sobrevivência adicional dos pacientes tratados com aDC mostrou que a SD na semana 8 foi significativamente correlacionada com a sobrevivência. Estes dados indicam que, se o tumor puder ser estabilizado por aDCs, então as chances de sobrevivência livre de progressão aumentam significativamente. Portanto, investigou-se o que as citocinas estavam associadas à Semana 8 de SD. A análise dos níveis de citocinas mostrou que TNFα se associou positivamente com a Semana 8 de SD. A TNFα é uma citocina bem caracterizada, extensivamente associada com a regulação ascendente da resposta imunológica, incluindo a maturação da DC e a preparação, proliferação e recrutamento de células T (Calzascia et al., J. Clin. Invest. 117: 3833-3845, 2007; van Horssen et al. al., Oncologist 11: 397-408, 2006). Estudos em humanos mostraram que a perfusão isolada do TNFα pode ser usada para tratar sarcomas avançados de tecidos moles localmente (Eggermont et al., Lancet Oncol. 4: 429-437, 2006). Além disso, demonstrou-se que o TNFα é crítico para respostas imunológicas antitumorais em camundongos (Calzascia et al., J. Clin. Invest. 117: 3833-3845, 2007). A associação positiva observada aqui entre o TNFα é consistente com estes resultados. Uma correlação interna significativa também foi observada entre IL-6, IL-8 e IL-12p40; no entanto, a significância aparente pode ser o resultado de uma correlação interna entre IL-8 e IL-12p40 em vez de uma biologicamente relevante. Alternativamente, pode ser um reflexo da potência total da DC, como discutido acima. Esta hipótese é apoiada pelas tendências correlativas entre sobrevivência e expressão de MHC-II e CD86, marcadores críticos de maturação DC, na superfície dos aDCs (Steinman e Banchereau, Nature 449: 419-426, 2007).
[00109] Foi mostrado aqui que DCs (aDCs) ativas são uma opção de tratamento segura e viável para pacientes com tumores sólidos. Foram identificadas citocinas específicas que, quando uma ou mais são secretadas pelas aDCs levam à estabilização da doença, resultando em sobrevivência prolongada. Tendo em vista os dados acima, está claro que os aDCs são um tratamento promissor para estender a sobrevivência de pacientes com tumores sólidos irressecáveis, localmente avançados ou metastáticos, sem toxicidade significativa em múltiplos tumores sólidos, e podem desencadear respostas imunológicas locais e sistêmicas. Resultados clínicos, como estabilização da doença e sobrevivência, estão significativamente associados a medidas de potência de DC como a produção de citocinas in vitro.
[00110] Com base nos resultados da presente invenção verificou-se que (i) a injeção intratumoral (i.t.) de células dendríticas ativas é segura e bem tolerada; (ii) resultados clínicos seguintes de injecção i.t. de DC ativas estão correlacionados com a potência de DC, medida pela produção de citocinas; (iii) as citocinas individuais apresentam associações diferentes com parâmetros de resultados clínicos, sugerindo correlações complexas entre a função da DC e o possível benefício terapêutico.
[00111] Embora tenham sido ilustradas e descritas modalidades ilustrativas, será apreciado que podem ser feitas várias alterações sem sair do escopo e âmbito da invenção.

Claims (15)

1. Método in vitro para determinar a potência imunoterapêutica de uma composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras para uso no tratamento de um tumor sólido, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: i) preparar as células dendríticas ativas que não amadureceram totalmente conforme medido pela retenção da capacidade de absorção e processamento do antígeno de maneira eficiente; ii) determinar as quantidades relativas de Interleucina 6 (IL-6), Interleucina 8 (IL-8), Interleucina 12 p40 (IL-12 p40) e fator de necrose tumoral α (TNFα) da composição de células dentríticas não totalmente maduras; iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα com uma quantidade limite; e iv) determinar que a composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras tem pouca potência imunoterapêutica se uma ou qualquer combinação de e/ou todas as IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα estiver abaixo do limite; ou que a composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras tem elevada potência imunoterapêutica se todas as IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα estiverem acima do limite.
2. Método in vitro para selecionar um paciente com um tumor sólido que responderá ou não responderá à administração da composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras derivadas do paciente, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: i) preparar uma composição compreendendo células dendríticas ativas e não totalmente desenvolvidas, conforme medido pela retenção da capacidade de absorver e processar o antígeno de forma eficiente; ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL- 8, IL-12 p40 e TNFα das células dentríticas humanas ativas e não totalmente maduras; iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα com uma quantidade limite; e iv) determinar que a composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras tem baixa potência imunoterapêutica se todas as IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα estiverem abaixo do limite, ou que a composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras tem elevada potência imunoterapêutica se todas as IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα estiverem acima do limite e selecionar aqueles pacientes acima do limite como pacientes que responderão ou selecionar aqueles pacientes abaixo do limite como pacientes que não responderão ao tratamento.
3. Método in vitro para selecionar um agente de maturação de célula dendrítica para produzir células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras com potência imunoterapêutica aumentada para uso no tratamento de um tumor sólido, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: i) preparar células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras pelo contato de células dendríticas imaturas com um agente de maturação de célula dendrítica de teste por um período de tempo suficiente para induzir a maturação das células dendríticas imaturas, mas não permitindo que as células dendríticas amadureçam totalmente, conforme determinado pela capacidade das células dendríticas para absorver e processar o antígeno de forma eficiente; ii) determinar as quantidades relativas de IL-6, IL- 8, IL-12 p40 e TNFα; iii) comparar a quantidade determinada de IL-6, IL- 8, IL-12 p40 e TNFα com uma quantidade limite; e iv) determinar que a composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras tem baixa potência imunoterapêutica se todas as IL-6, IL-8, IL-12 p40 e TNFα estiverem abaixo do limite, ou que a composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras tem elevada potência imunoterapêutica se todas as IL-6, IL- 8, IL-12 p40 e TNFα estão acima do limite e selecionar o agente de maturação de células dendríticas que induz a produção in vitro da composição de células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras acima do limite.
4. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras produzem de 50 a 200 ng/1 milhão de células/24 horas de IL- 6; de 500 a 2000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; e/ou pelo menos de 75 a 100 ng/1 milhão de células/24 horas da subunidade da IL-12 p40.
5. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula dendrítica humana ativa e não totalmente madura produz de 75 a 150 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6; de 750 a 1500 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-8; e/ou pelo menos 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p40; preferencialmente em que as células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras produzem 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-6, e 1000 ng/1 milhão de células/24 horas de IL- 8, e/ou pelo menos cerca de 100 ng/1 milhão de células/24 horas de IL-12 p40.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que as células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras são preparadas pelas seguintes etapas: i) isolar uma população celular compreendendo células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) do sangue periférico; ii) enriquecer a população celular compreendendo PBMCs humanas para precursores de células dendríticas monocíticas humanas; iii) cultivar a população de células enriquecida para precursores de células dendríticas monocíticas humanas com um meio de cultura de tecido suplementado com uma quantidade eficaz de um agente de diferenciação de células dendríticas durante um período de tempo suficiente para diferenciar os precursores de células dendríticas monocíticas humanas em células dendríticas humanas imaturas; iv) cultivar a população celular enriquecida para células dendríticas humanas imaturas com uma quantidade eficaz de um agente de maturação de células dendríticas para ativar e não amadurecer totalmente as células dendríticas humanas imaturas, conforme determinado pela eficiência das células dendríticas humanas para absorver e processar o antígeno; e v) isolar e lavar as células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras.
7. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que as células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras são preparadas pelas seguintes etapas: i) isolar uma população celular enriquecida em e compreendendo precursores de células dendríticas monocíticas humanas; ii) cultivar a população de células enriquecida para precursores de células dendríticas monocíticas humanas com um meio de cultura de tecido suplementado com uma quantidade eficaz de um agente de diferenciação de células dendríticas durante um período de tempo suficiente para diferenciar os precursores de células dendríticas monocíticas humanas em células dendríticas humanas imaturas; iii) cultivar a população celular enriquecida para células dendríticas humanas imaturas com uma quantidade eficaz de um agente de maturação de células dendríticas para ativar e induzir a maturação das células dendríticas humanas imaturas; e iv) isolar e lavar as células dendríticas humanas ativas e não totalmente maduras.
8. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que os precursores de células dendríticas monocíticas são obtidos a partir da pele, baço, medula óssea, timo, nódulos linfáticos, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico.
9. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que as células precursoras de células dendríticas monocíticas humanas são precursores de células dendríticas monocíticas não ativas.
10. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que os precursores de células dendríticas monocíticas humanas são obtidos a partir do indivíduo especificamente a ser tratado para o tumor sólido; ou em que os precursores de células dendríticas monocíticas humanas são obtidos a partir de um indivíduo saudável, adaptado a HLA ao indivíduo a ser tratado para o tumor sólido.
11. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de diferenciação de células dendríticas humanas é GM-CSF sem qualquer outra citocina, ou GM-CSF em combinação com IL-4, IL-7, IL-13 ou IL-15.
12. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de maturação de células dendríticas humanas é Bacilo Calmette-Guérin (BCG) inativo, interferon y (IFNy), lipopolissacarídeo (LPS), fator de necrose tumoral α (TNFα), um composto de imidazoquinolina, um polirribonucleotídeo de fita dupla sintética, um agonista de um receptor de tipo Toll (TLR), uma sequência de ácidos nucleicos contendo motivos de CpG não metilados conhecidos por induzir a maturação de células dendríticas ou qualquer combinação destes, preferencialmente em que o agente de maturação é uma combinação de BCG e IFNy e o polirribonucleotídeo de fita dupla sintético é poli[I]:poli[C(12)U].
13. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o BCG inativo compreende BCG inteiro, constituintes de parede celular de BCG, lipoarabidomannanos derivados de BCG ou componentes de BCG; preferencialmente em que o BCG inativo é BCG inativo por calor, BCG tratado com formalina ou BCG tratado com formalina e inativo por calor.
14. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade eficaz de BCG é de 105 a 107 cfu por mililitro de meios de cultura de tecidos e a quantidade eficaz de IFNy é de 100 a 1000 Unidades por mililitro de meios de cultura de tecidos.
15. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de imidazoquinolina é um composto imidazoquinolina-4-amina; preferencialmente em que o composto imidazoquinolina-4-amina é o 4-amino- 2-etoximetil-α,α-dimetil-1H-imidazol[4,5-c]quinolin-1-5 etanol ou 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina, ou um derivado deste.
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