ES2679043T3 - Inmunoterapia de vacuna - Google Patents

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ES2679043T3 ES10775661.1T ES10775661T ES2679043T3 ES 2679043 T3 ES2679043 T3 ES 2679043T3 ES 10775661 T ES10775661 T ES 10775661T ES 2679043 T3 ES2679043 T3 ES 2679043T3
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John W. Hadden
Kathy Signorelli
James Egan
Paul Naylor
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IRX Therapeutics Inc
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Abstract

Una composición que comprende un biológico derivado de células primarias que comprende interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), factor α de necrosis tumoral (TNF-α) y γ-interferón (IFN-γ), y una vacuna contra el cáncer que comprende al menos un ácido nucleico que codifica un antígeno en un vector vírico.

Description

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DESCRIPCION
Inmunoterapia de vacuna.
Antecedentes de la invencion Campo de la tecnica
La presente invencion se refiere a inmunoterapia de vacuna. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a las composiciones y usos de las mismas para obtener y potenciar una respuesta inmunitaria a al menos un antfgeno codificado en un acido nucleico en un vector vmco en pacientes que tienen cancer u otros estados patologicos que producen antigeno.
Antecedentes de la tecnica
Cada vez se ha vuelto mas evidente que los canceres humanos poseen antfgenos que, si actuan sobre el sistema inmunitario del anfitrion, puede dar como resultado la regresion del tumor. Estos antigenos han sido definidos por enfoques inmunitarios serologicos celulares, que han conducido a la definicion de epitopes tanto de celulas B como T (Sahin, 1997; Van der Eynde, 1997; Wang, 1999). Basandose en estos resultados, se ha convertido en un objetivo de los inmunoterapeutas del cancer para inducir la regresion de los tumores. Sin embargo, historicamente, los esfuerzos satisfactorios han sido esporadicos y generalmente de menor frecuencia y magnitud.
Un problema fundamental en el esfuerzo de inmunizar a los pacientes con cancer, es decir, contra los antfgenos del tumor, es que el estado del portador del tumor esta asociado con mecanismos inmunosupresores derivados del sistema inmunitario alterado tanto del tumor como del anfitrion (Kavanaugh, 1996), haciendo de ese modo diffcil y hasta ahora imposible la inmunizacion sobre una base constante. La inmunosupresion o agotamiento implica una capacidad reducida del sistema inmunitario para responder. Dicha supresion puede ser inducida por drogas, es decir, por tratamiento farmacologico, inducida por virus como, p. ej., en el SIDA, o inducida por un estado patologico como el cancer. El sistema inmunitario en este estado es eficazmente desactivado. En el caso de un estado patologico como el cancer, el cuerpo no puede protegerse contra antfgenos tumorales, permitiendo asf que un tumor crezca y que, posiblemente, se metastatice.
Se han desarrollado diversas estrategias de inmunizacion tumoral. Todas estas estrategias son complejas y se desvfan significativamente de las estrategias convencionales de inmunizacion utilizadas en las enfermedades infecciosas (vease, p. ej., Weber, 2000). Una de estas estrategias de inmunizacion tumoral involucra a THERATOPE® (Biomira), un antfgeno sialil-Tn polisacarido de mucina conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH) y administrado con adyuvante de micobacteria DETOX® y ciclofosfamida en dosis baja (MacLean, 1996). El uso de esta vacuna en pacientes con cancer de mama y de ovario metastasicos ha producido respuestas clmicas importantes (es decir, mayor que 50 % de reduccion tumoral) en solo un pequeno porcentaje de pacientes.
La terapia genica tambien se ha intentado usando construcciones vmcas como vectores de expresion para genes que expresan antfgenos tumorales. Por ejemplo, una construccion de virus de vacuna recombinante que codifica formas modificadas de las secuencias protemicas E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV) se ha utilizado para la inmunizacion de pacientes con cancer de cuello uterino. La vacunacion con esta construccion produjo respuestas clmicas discutibles (Borysiewickz, 1996). Vease, tambien, Sanda, 1999, en donde se uso una construccion de PSA (antfgeno espedfico de la prostata)-vacuna recombinante como vacuna en pacientes con cancer de prostata.
Otro enfoque ha sido la terapia mediada con celulas dendnticas, p. ej., en donde las celulas dendnticas fueron pulsadas con fragmentos de oligopeptidos de los antfgenos de membrana espedficos de prostata (PSMA). Las celulas dendnticas (con o sin los antfgenos PSMA de cribado) se administraron luego a los pacientes con cancer de prostata metastasico. Se obtuvieron respuestas clmicas importantes en solo un pequeno porcentaje de pacientes (Murphy, 1999; vease, tambien, Tjoa, 2000).
Ademas, los tumores autologos se han utilizado con ciclofosfamida en dosis bajas y BCG (Bacilo Calmette-Guerin) para inmunizar a pacientes con cancer con melanoma maligno. Sin embargo, se divulgaron pocas respuestas clmicas (Mastrangelo, 1996). Otra estrategia incluyo el uso de antfgenos de MAGE con diversos adyuvantes de vacuna. Una vez mas, esto ha producido pocas respuestas, si las hay, en pacientes con melanoma maligno (comunicado personal, Thierry Boon).
Varias patentes de Doyle y col. (pat. de EE.UU. N.° 5.503.841; 5.800.810; 6.060.068; 5.643.565; y 5.100.664) divulgan procedimientos para mejorar la respuesta inmunitaria en pacientes que usan interleucina 2 (IL-2). Este procedimiento se divulga para el uso en respuesta a enfermedades infecciosas y principalmente a las funciones que usan los antfgenos conocidos por ser inmunogenicos. Se demostro una aplicabilidad limitada. Segun lo divulgado antes, se sabe que el tratamiento del cancer requiere diferentes enfoques. Hasta la fecha, el tratamiento con IL-2 ha mostrado mmimos resultados en dos canceres, el melanoma de celula renal y el melanoma maligno (tasas de respuesta inferiores al 20 %). En general, se considera ineficaz en el cancer de celula escamosa de cabeza y cuello, y de cuello uterino, y en cancer de prostata. Por ello, no esta aprobado para estos usos.
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Es importante contrastar las vacunas profilacticas que utilizan antfgenos “clasicos” de estructura compleja y de altos pesos moleculares en pacientes sanos frente a las vacunas terapeuticas (en general, insatisfactorias) con antigenos tumorales o peptidos (en general, insatisfactorios) en pacientes inmunodeprimidos (en general, insatisfactorios). La primera es facil y nuestras vacunas vmcas actuales atestiguan su eficacia. La ultima es casi imposible de manera periodica a pesar de treinta anos de intensos esfuerzos.
Las vacunas eficaces contra el cancer requieren la estimulacion de la inmunidad mediada por celulas, quizas incluso con preferencia a la produccion de anticuerpos. Como se observo, a pesar de numerosos estudios con diversos antigenos, adyuvantes y construcciones de vacunas, los datos de las pruebas clmicas hasta la fecha han sido decepcionantes. Los episodios cnticos para una respuesta inmunitaria anticancerosa mediada por celulas T son la presentacion de antigeno a celulas T, principalmente en los ganglios linfaticos que drenan el sitio del tumor o la inmunizacion, seguida de la activacion de las celulas T y la migracion a los sitios perifericos. De hecho, la captacion del antfgeno por macrofagos de tejido, neutrofilos y/o celulas dendnticas, y la presentacion de peptidos procesados en combinacion con antfgenos de MHC clase I y clase II a celulas T en el ganglio linfatico son cruciales para una respuesta inmunitaria completa. La clave para una satisfactoria activacion inmunitaria de celulas T es la generacion del apropiado entorno de citocinas para impulsar la respuesta inmunitaria a una vacuna, tanto en el sitio de la inmunizacion como en los ganglios linfaticos de drenaje. El hecho de que el mecanismo de accion del sistema inmunitario hasta ahora no se haya entendido completamente impide que las vacunas contra el cancer disponibles en la actualidad logren su maximo potencial.
La cinetica de la respuesta inmunitaria incluye dos fases. La primera es el drenaje del antfgeno y de las protemas solubles hacia los ganglios linfaticos, donde se produce una activacion inmunitaria inicial. Despues de veinticuatro a cuarenta y ocho horas, las celulas presentadoras de antfgeno (APC), mas concretamente celulas dendnticas, emigran desde el sitio de inmunizacion a traves de los conductos linfaticos que drenan al ganglio linfatico, donde una segunda oleada de presentacion de antfgeno y se produce la activacion. Mas espedficamente, las APC interaccionan en el ganglio linfatico con celulas T cooperadoras precursoras a traves del acoplamiento de receptores co-estimuladores, asf como los receptores de celulas T para producir las celulas 1 cooperadoras T (Th1) y/o celulas 2 cooperadoras T (Th2). La proporcion de estos subconjuntos controla el desarrollo posterior de respuestas inmunitarias ya sean mediadas por celulas o humorales (anticuerpos) (Th1 que tiene tendencia hacia DTH/citotoxicidad, mientras que Th2 tiene tendencia hacia la produccion de anticuerpos). Despues de la induccion de estas celulas T activadas, la respuesta inmunitaria desaparece, dejando predominantemente celulas T de memoria, que son capaces de responder tras la re-exposicion a antfgeno.
Los episodios cnticos en esta via estan mediados por citocinas que inclinan la respuesta en la direccion de la inmunidad humoral o celular. Las citocinas producidas localmente, como IL-1, IL-2, IFN-y, GM-CSF, IL-6, TNF-a, IL- 12 e IL-8, estan asociadas con el reclutamiento de celulas del sistema inmunitario, captacion de antfgenos, maduracion de celulas dendnticas, amortiguacion de la actividad de celulas T reguladoras, formacion y proliferacion de celulas T, y el desarrollo de celulas Th1 (Naylor, 2003). La interdependencia de la respuesta significa que la actividad de cualquier citocina dada depende de la aparicion de episodios precursores de manera que la presencia simultanea de multiples citocinas puede tener resultados diferentes tanto en el sitio de la inyeccion como en los ganglios linfaticos drenantes, dependiendo de la cinetica de las respuestas de las celulas a diferentes citocinas.
El hecho de no obtener una respuesta inmunitaria suficiente con las vacunas tradicionales ha seguido siendo un desaffo al desarrollo de vacunas. Por ello, los adyuvantes se han desarrollado para acelerar, mejorar y prolongar la respuesta inmunitaria a la vacunacion y reducir la cantidad de antfgeno necesario por dosis. Los adyuvantes se han utilizado durante casi 100 anos. En 1916, por primera vez, Le Moignic y Pinoy reconocieron que la Salmonella typhimurium suspendida en aceite mineral mejoraban respuestas inmunitarias. En 1926, Ramon demostro que podna aumentarse una respuesta antitoxina mediante una gran gama de sustancias como agar, tapioca, lecitina, aceite de almidon, saponina, y migas de pan, y Glenny utilizo sal de aluminio para precipitar el toxoide contra la difteria que mejora la inmunogenicidad, lo cual ha llevado a los alumbres utilizados en la actualidad. En 1936, Thibaud y Richou determinaron que Quil A tema propiedades adyuvantes. Quil A es una saponina de triterpenoides extrafda de la corteza del arbol del jabon Quillaja saponaria Molina Sudamericana. En 1937, Freund tambien desarrollo adyuvantes a partir de emulsiones. Desde entonces se han hecho pequenos progresos. A medida que se empieza a comprender el sistema inmunologico como se ha descrito anteriormente, mas progresos se estan haciendo con los adyuvantes. Se han desarrollado varios adyuvantes para vacunas, incluidas vacunas contra el cancer, pero todavfa solo el alumbre ha tenido realmente exito en todo el mundo. El alumbre es un adyuvante Th2; sin embargo, tambien se desean los adyuvantes que proporcionan una respuesta Th1. Los adyuvantes son especialmente necesarios para los grupos poblacionales que no responden suficientemente a las vacunas convencionales debido a la respuesta inmunitaria alterada, como los ancianos o los pacientes inmunodeprimidos. Los adyuvantes tienen el potencial de superar la inmunotolerancia; sin embargo, ninguno ha tenido mucho exito al hacerlo hasta la fecha. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de un adyuvante eficaz para varias enfermedades incluido el cancer.
La presente invencion utiliza el IRX-2 biologico derivado de celula primaria, tambien conocido previamente como una mezcla de citocinas natural (NCM), segun lo divulgado en las patentes de los Estados Unidos 5.632.983 y 5.698.194, concedidas al solicitante, para inmunizar a pacientes y/o mejorar la inmunizacion con una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica al menos un antfgeno. Mas espedficamente, se
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ha mostrado previamente en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.698.194 que IRX-2 es mas eficaz en fomentar el desarrollo y la funcion de las celulas de T en ratones envejecidos, inmunodeprimidos. Se demostro que IRX-2 disminma la proporcion de celulas T inmaduras y aumentaba la proporcion de celulas T maduras en el timo. El IRX-2 inclma IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-y, TNF-a, GM-CSF, G-CSF, e IL-3, IL-4, IL-7 en cantidades traza. Naylor y col. (2008) Journal of Urology, 179:45, describe los estudios preclmicos que utilizan IRX-2 para mejorar las respuestas inmunitarias a dos peptidos de antigeno de membrana espedfico de prostata. El documento US 2007/0025958 tambien describe composiciones y procedimientos de inmunoterapia usando IRX-2 para potenciar respuestas inmunitarias a antfgenos de peptidos.
Sera evidente a partir de la divulgacion detallada en el presente documento que las composiciones de citocinas descritas en el presente documento y sus usos son aplicables a la estimulacion de una respuesta inmunitaria a cualquier antigeno de interes, p. ej., antigenos de cancer o tumorales. Segun lo detallado en el presente documento, la mezcla de citocinas actua como un adyuvante preferiblemente para estimular la inmunidad de celulas T in vivo.
Ademas, la presente invencion esta relacionada con la obtencion de una respuesta inmunitaria a un antigeno codificado en un acido nucleico en un vector vmco, que es procesado y presentado por APC (como las celulas dendnticas) in vivo.
Como se describe en el presente documento, la presente invencion es util para desarrollar un procedimiento consistente y eficaz de inmunoterapia de vacuna, en donde las respuestas inmunitarias se obtienen en pacientes con cancer, usando las composiciones de citocinas en combinacion con antigenos codificados asociados a enfermedad endogena y/o exogena, incluidos antfgenos tumorales y peptidos, asf como con otros adyuvantes.
Sumario de la invencion
La presente invencion contempla una composicion que comprende un biologico derivado de celulas primarias que comprende interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), factor a de necrosis tumoral (TNF-a) y Y-interferon (IFN-y), y una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica un antigeno en un vector vmco.
Se preve que el vector vmico puede ser un retrovirus, adenovirus, o virus adeno-asociado (AAV), virus del herpes o virus de la viruela. En las realizaciones preferidas, el virus de la viruela puede ser un virus de vacuna, vacuna Ankara modificada (MA), NYVAC, viruela aviar, TROVAX, viruela de aves de corral o viruela del canario. En una realizacion particularmente preferida la viruela del canario puede ser ALVAC o ALVAC (2).
Se preve que la composicion puede incluir ademas un adyuvante independiente de receptor tipo peaje y/o un adyuvante dependiente de receptor tipo peaje.
La presente invencion permite la reversion de la inmunosupresion y la adquisicion de inmunidad al cancer, mediante el establecimiento de la administracion de un biologico derivado de celulas primarias que incluye las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN-y, y una vacuna que comprende al menos un acido nucleico que codifica al menos un antigeno, estimulando la produccion de celulas T sin tratamiento previo, madurando las celulas dendnticas inmaduras y permitiendo la presentacion por celulas dendnticas maduras del antfgeno a las celulas T sin tratamiento previo, revirtiendo de ese modo la inmunosupresion y adquiriendo inmunidad al cancer.
Se preve que el biologico derivado de celulas primarias puede comprender 60-6.000 pcg/ml de IL-1, 600-60.000 pcg/ml de IL-2, 60-6.000 pcg/ml de IL-6, 6.000-600.000 pcg/ml de IL-8, 200-200.000 pcg/ml de TNF-a y 200-200.000 pcg/ml de IFN-y.
La presente invencion tambien proporciona una composicion segun se reivindica para uso en el tratamiento del cancer.
La presente invencion proporciona ademas una composicion que comprende un biologico derivado de celulas primarias que comprende IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN-y, para su uso en un procedimiento de vacunacion, comprendiendo dicho procedimiento administrar dicha composicion y una vacuna que comprende al menos un acido nucleico que codifica un antfgeno en un vector vmco.
En una realizacion preferida, la vacuna es una vacuna contra el cancer.
Breve descripcion de los dibujos
Otras ventajas de la presente divulgacion se comprenden facilmente pues el mismo se entiende mejor por referencia a la siguiente descripcion detallada cuando se considera conjuntamente con los dibujos adjuntos en donde:
La Figura 1 es un grafico de barras que muestra el tamano de los ganglios linfaticos en controles normales, controles con cancer o poblaciones con H&NSCC tratadas con IRX-2;
La Figura 2A es un grafico de barras que muestra el area de celulas T y la Figura 2B muestra la densidad en controles normales, controles con H&NSCc y los pacientes con H&NSCC tratados con IRX-2;
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La Figura 3A es un grafico de barras que compara el area de las celulas B y la Figura 3B es un grafico de barras que compara los folfculos en los tres grupos de tratamiento;
La Figura 4A muestra una comparacion de otras celulas y la Figura 4B muestra una comparacion de la histiocitosis sinusal (SH) en los tres grupos de tratamiento;
La Figura 5 es un grafico que muestra un registro con ajuste de un ganglio de B&T (celulas B y celulas T) y un tumor de B&T;
La Figura 6 es un grafico que ilustra el porcentaje de supervivencia de los pacientes tratados a los cuarenta y ocho meses;
La Figura 7 es un grafico que ilustra la supervivencia de las personas que responden bien al tratamiento de forma completa y parcial en comparacion con las personas que no responden al tratamiento o lo hacen de forma insignificante;
La Figura 8 es un grafico que ilustra la relacion del mdice de patologfa frente a supervivencia;
La Figura 9 es un grafico que muestra la relacion de infiltracion de linfocitos frente a supervivencia;
La Figura 10 es un grafico que ilustra el porcentaje de supervivencia (dosis respuesta) de pacientes tratados a los veinticuatro meses, en donde "x" equivale a aproximadamente 100 Ul/ml de IL-2;
La Figura 11A es un grafico de barras que ilustra la acumulacion de celulas dendnticas (DC) CD83+parcialmente maduras en los ganglios linfaticos de pacientes con cancer de SH+;
La Figura 11B es un grafico de barras que muestra un aumento en el numero de DC activadas CD86+ despues del tratamiento con IRX-2 (IRX-2);
La Figura 12 es un grafico que muestra que IRX-2 (IRX-2) induce la maduracion de DC segun se detecto por una expresion de CD83 aumentada en las DC;
Las Figuras 13A-B representan el efecto de IRX-2 en la morfologfa de las DC derivadas de monocitos en las preparaciones de citocentrifugacion. Las celulas tratadas con IRX-2 (Figura 13B) mostraron las caractensticas morfologicas de las DC maduras tal como proyecciones celulares y grandes nucleos con forma irregular;
La Figura 14 contiene histogramas que muestran la regulacion a la baja del antfgeno CD1a y la regulacion al alza de la expresion de antfgeno MHCII, CD86, CD40 y CD54 (ICAM-1) mediante celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) incubadas con IRX-2 (IRX-2). Estos cambios indican que el IRX-2 estimula la maduracion de las DC.
La Figura 15 es un grafico que muestra que el IRX-2 (IRX-2) reduce la actividad endodtica de las DC inmaduras, cuya actividad reducida es indicativa de la maduracion de las DC.
La Figura 16 es un grafico que muestra que IRX-2 (IRX-2) realza la capacidad estimuladora de las celulas T de las DC, cuya mejora es indicativa de la maduracion y activacion de las DC;
La Figura 17A es un grafico de barras que muestra que IRX-2 (IRX-2) aumenta el numero de DC que producen IL-12 intracelularmente. IL-12 es una citocina producida por las DC activadas maduras;
La Figura 17B es un grafico de barras que muestra que IRX-2 (IRX-2) aumenta la cantidad total de IL-12 bioactiva segregada por las DC;
La Figura 18 es un grafico de barras que muestra que IRX-2 (IRX-2) disminuye la apoptosis mediada por VEGF en las DC, lo que indica un efecto protector de IRX-2 sobre la supervivencia de las DC;
La Figura 19A contiene dos graficos de barras que representan el aumento en porcentaje de monocitos/macrofagos con tincion positiva para la combinacion de marcadores de activacion, CD86, HLA-DR, CD80 y CD40, despues del tratamiento de las PBMC adherentes con IRX-2, segun lo determinado por la citometna de flujo;
La Figura 19B es una serie de graficos de barras que representan el aumento de la intensidad media de fluorescencia (MFI) para los marcadores de activacion, CD86, HLA-DR, CD80 y CD40, despues del tratamiento de las PBMC adherentes con IRX-2, segun lo determinado por citometna de flujo;
La Figura 19C muestra dos graficos de barras que muestran el efecto de IRX-2 sobre CD40 y CD80 a partir de monocitos/macrofagos.
La Figura 20 contiene graficos de barras que demuestran que el IRX-2 de la invencion activa monocitos/macrofagos, es decir, induce la expresion de marcadores de activacion, CD86, HLA-DR, CD80 y CD40, en mayor grado que el TNF-a;
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La Figura 21 contiene graficos de barras que demuestran que el IRX-2 de la invencion activa los monocitos/macrofagos, es decir, induce los marcadores de activacion, HLA-DR, CD86 y CD40, incluso en presencia de la citocina inmunosupresora IL-10. El IRX-2 es mejor en la activacion de monocitos/macrofagos que los LPS, tanto en presencia como en ausencia de IL-10.
La Figura 22 es un grafico de barras que demuestra que el IRX-2 de la invencion estimula la produccion de TNF-a a partir de monocitos/macrofagos activados y supera los efectos inmunosupresores de IL-10, el IRX-2 estimulaba la produccion de TNF-a en mayor medida que LPS;
La Figura 23 es un diagrama que ilustra la respuesta DTH espedfica de peptido del antigeno de membrana espedfico de la prostata (PSMA) de ratones inmunizados con varios conjugados y adyuvantes, que incluyen el IRX- 2 de la invencion (IRX), en donde la respuesta se indica como hinchamiento en mm para ratones individuales (puntos) y para el promedio (barra), el adyuvante se indica en el eje x, sin tratamiento previo indica ratones no inmunizados, y los demas ratones estan inmunizados con conjugados de peptidos Ovoalbumina-PSMA excepto cuando se indique (KLH);
La Figura 24A representa la respuesta inmunitaria mejorada DTH espedfica de peptido en ratones inmunizados con el IRX-2 de la invencion (IRX-2) en combinacion con un conjugado OVA-PSMA o KLH-PSMA y luego se desafio con los peptidos de PSMA (utilizados para generar el conjugado) en un ensayo de DTH: el aumento en hinchamiento para los ratones individuales esta representado por los puntos de datos, siendo el aumento promedio del hinchamiento representado por las cajas sombreadas, y la Figura 24B representa la respuesta de la DTH al desaffo con solamente el portador usado en la inmunizacion con conjugado;
La Figura 25 representa la influencia del tratamiento con ciclofosfamida en la respuesta de la DTH espedfica del peptido en ratones inmunizados con el conjugado OVA-PSMA y el IRX-2: el tratamiento con ciclofosfamida no tuvo ningun efecto sobre la respuesta de DTH;
La Figura 26 representa una comparacion de los efectos de varios adyuvantes, que incluyen el IRX-2 de la invencion (IRX), sobre la respuesta de la DTH espedfica de peptidos en ratones inmunizados con un conjugado de PSMA en combinacion con los respectivos adyuvantes: el efecto adyuvante de IRX-2 era mayor que los otros adyuvantes probados, y ratones sin tratamiento previo, es decir, ratones no inmunizados, representan un control negativo;
La Figura 27A representa la respuesta de la DTH espedfica del peptido de ratones adultos frente a jovenes inmunizados con un conjugado OVA-PSMA en combinacion con IRX-2 (IRX) o alumbre como adyuvante: el IRX-2 de la invencion estimulaba una mayor respuesta de DTH espedfica del peptido tanto en ratones adultos como jovenes en comparacion con el alumbre, y la Figura 27B representa la respuesta DTH espedfica del portador de ratones adultos frente a jovenes inmunizados con un conjugado de PSMA en combinacion bien con IRX-2 (IRX) o bien con alumbre como adyuvante: el IRX-2 de la invencion restablecio la respuesta de DTH espedfica del portador en los ratones adultos con la observada en los ratones jovenes;
La Figura 28 representa la respuesta mejorada de las celulas T en forma de IFN-y secretado por las celulas del bazo de ratones inmunizados con un conjugado KLH-PSMA y el IRX-2 de la invencion (IRX-2), los resultados se expresan para ratones individuales (marcadores de puntos de datos), asf como la respuesta promedio (barras sombreadas): todos los aumentos en IFN-y secretado eran estadfsticamente significativos comparados con los controles sin tratamiento previo;
Las Figuras 29A-C representan las respuestas de anticuerpos sericos observadas en ratones inmunizados con los conjugados PSMA en combinacion con el IRX-2 de la invencion en comparacion con otros adyuvantes, es decir, alumbre y CpG, la Figura 29A representa la respuesta del anticuerpo serico al portador OVA en ratones inmunizados con el conjugado OVA-PSMA e IRX-2 (IRX), Alumbre o CpG, los datos se presentan como media y desviacion estandar de la media para 5-10 ratones por grupo, la Figura 29B representa la respuesta de anticuerpos sericos a los peptidos PSMA en ratones inmunizados con el conjugado OVA-PSMA e IRX-2 (IRX), alumbre o CpG, y la Figura 29C representa la respuesta de anticuerpos sericos a los peptidos PSMA en ratones inmunizados con el conjugado KLH-PSMA en combinacion con IRX-2 (IRX), alumbre o pBs, los resultados fueron determinados por analisis de ELISA y se presentan como densidad optica.
La Figura 30 representa la estabilizacion de los niveles de PSA durante un penodo de 6 meses en tres pacientes con cancer de prostata tratados con el IRX-2 de la invencion en combinacion con antfgenos de peptidos PSMA;
La Figura 31 es un grafico de barras de respuestas de la DTH espedfica de peptidos de ratones inmunizados con PSMA irradiados que expresan celulas 3T3;
La Figura 32 es un grafico de barras que muestra una DTH espedfica de peptidos en PSMA-KLH frente a sin portador;
La Figura 33A es un grafico que muestra la respuesta creciente de IRX-2 al antfgeno de una manera dependiente de la dosis, y la Figura 33B es un grafico de barras del efecto de inyecciones adicionales de IRX-2 sobre la respuesta inmunitaria al antfgeno;
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La Figura 34 es un grafico de barras que muestra el ensayo de la DTH de ratones inmunizados con peptido de PSMA inyectados con IRX-2 frente a otros adyuvantes;
La Figura 35 es un grafico de barras de la produccion de IFN-y en respuesta al antfgeno de peptido;
La Figura 36 es un grafico de respuestas de anticuerpos sericos;
La Figura 37 es un grafico de respuesta del anticuerpo serico de IRX-2 frente a otros adyuvantes;
La Figura 38A es un grafico del numero de celulas T que producen IFN-y en respuesta al antfgeno de peptido; la Figura 38B es un grafico que compara el numero de celulas productoras de IFN-y frente a la produccion total de IFN- Y en respuesta al antfgeno de peptido;
La Figura 39 es un grafico de la cinetica de la produccion de IFN-y en respuesta a la vacunacion con peptido;
La Figura 40A es un grafico de la produccion de IFN-y en respuesta a la dosis en respuesta a la vacunacion con peptido; la Figura 40B es un grafico del numero de celulas que producen IFN-y despues de diversas administraciones de IRX-2;
La Figura 41A es un grafico de la produccion de IFN-y despues de la vacunacion con IRX-2 frente a otros adyuvantes; la Figura 41B es un grafico de respuesta de anticuerpos despues de la vacunacion con IRX-2 frente a otros adyuvantes;
La Figura 42A es un grafico de crecimiento tumoral despues de la inmunizacion previa con IRX-2 y una vacuna de celulas enteras; la Figura 42B es un grafico de crecimiento tumoral despues de la inmunizacion previa con IRX-2 y una vacuna de peptido-conjugado; la Figura 42C es un grafico de crecimiento tumoral despues de la inmunizacion previa con IRX-2 y el conjugado solo.
La Figura 43 es un grafico de la produccion del IFN-y de las celulas T despues de la vacunacion con IRX-2 y otros adyuvantes;
La Figura 44 es un grafico de celulas espedficas del antfgeno despues de la vacunacion con IRX-2 y otros adyuvantes;
La Figura 45 es un grafico de citotoxicidad in vivo despues de la vacunacion con IRX-2 y otros adyuvantes;
La Figura 46 es un grafico de respuesta de anticuerpos sericos despues de la vacunacion con una vacuna vmca e IRX-2;
La Figura 47 es un grafico de las respuestas de IFN-y de las celulas T despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus e IRX-2;
La Figura 48 es un grafico de las respuestas de IFN-y de las celulas T despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus que expresa TRICOM e IRX-2;
La Figura 49 es un grafico de las respuestas de IFN-y de las celulas T despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus e IRX-2;
La Figura 50 es un grafico de respuestas de IgM despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus e IRX- 2; y
La Figura 51 es un grafico de respuestas de IgGi e lgG2A despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus e IRX-2.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a composiciones y usos de las mismas para la vacunacion y el tratamiento del cancer, segun se reivindica. Mas espedficamente, la invencion se refiere a composiciones para provocar una respuesta inmunitaria a los antfgenos asociados con un cancer, en donde un biologico derivado de celulas primarias que comprende IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-y, y TNF-a, asf como una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica al menos un antfgeno en un vector vmco mediante el establecimiento de la administracion a un paciente de una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria al antfgeno en el paciente. El biologico derivado de celulas primarias tambien se puede utilizar en combinacion con otros adyuvantes como se describe en el presente documento.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, el termino "adyuvante" indica una composicion con la capacidad de mejorar la respuesta inmunitaria a un antfgeno determinado. Tal capacidad se manifiesta por un aumento significativo en la proteccion mediada inmunitaria. Para ser eficaz, un adyuvante debe ser enviado al sitio o cerca del sitio del
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antigeno. La mejora de la inmunidad se manifiesta tipicamente por un aumento significativo (generalmente mas de 10 veces) en el tftulo del anticuerpo elevado para el antfgeno y/o a la mejora de la inmunidad celular, que se puede medir por una prueba positiva de la piel, analisis de celulas T citotoxicas, analisis ELISPOT para IFN-y o IL-2, o la infiltracion de celulas T en el tumor. Las composiciones de citocinas de la presente invencion son particularmente adecuadas para mejorar las respuestas inmunitarias mediadas por celulas T. Los efectos adyuvantes de las composiciones de citocinas de la invencion incluyen la generacion de celulas T sin tratamiento previo, la promocion de la diferenciacion y la maduracion de las celulas dendnticas, la estimulacion de monocitos y macrofagos, y en el caso de los pacientes con cancer, el aumento de la infiltracion de linfocitos en los tumores, la fragmentacion del tumor, la regresion del tumor y la reduccion de la histiocitosis sinusal en los ganglios linfaticos.
"Sistema adyuvante" como se usa en el presente documento indica la combinacion de adyuvantes para trabajar juntos para obtener, de forma optima, una formulacion eficaz y segura, en la que cada parte de la vacuna, el antfgeno y adyuvantes, trabajen juntos para producir una respuesta inmunitaria. Ejemplos de tales sistemas adyuvantes son vacunas formuladas ASO2, 3 y 4 elaboradas por Glaxo Smith Kline (GSK).
"Vacuna" como se usa en el presente documento, se refiere a una vacuna que incluye al menos un antfgeno, y preferiblemente mas de un antfgeno, que se administra a un paciente para crear una respuesta inmunitaria y preferiblemente respuesta de celulas T a antfgenos enviados. La vacuna puede incluir otros diversos componentes tales como una portadora u otras moleculas estimuladoras. Las vacunas pueden ser vacunas basadas en ADN, vacunas basadas en peptidos, o vacunas basadas en protemas, codificadas en varios vectores o celulas vmcos/bacterianos.
Como se usa en el presente documento, "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de biologico derivado de celulas primarias que es necesario para lograr el resultado deseado de la presente invencion, a saber, producir una respuesta inmunitaria a un antfgeno de una manera sinergica. Un experto en la tecnica puede determinar la cantidad eficaz del biologico derivado de celulas primarias que se debe dar a un paciente en particular.
"IRX-2", tambien conocido como "citopluricin", es un biologico natural derivado de celulas primarias, derivado de leucocitos, producido por globulos blancos (celulas mononucleares) humanos purificados, estimulados por fitohemaglutinina (PHA) y ciprofloxacina (CIPRO). Por definicion, IRX-2 es un sistema adyuvante. Los componentes activos principales son interleucina 1p (IL-1p, tambien referido en el presente documento como IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y Y-interferon (IFN-y). Preferiblemente, el IRX-2 usado en la presente invencion incluye estas seis citocinas cnticas. El IRX-2 tambien se ha referido previamente como "NCM", mezcla natural de citocinas, definida y expuesta en las patentes de los Estados Unidos N.° 6.977.072 y 7.153.499. Los terminos IRX-2, biologico derivado de celulas primarias, y NCM se utilizan indistintamente en el presente documento.
En resumen, IRX-2 se prepara en la presencia continua de un antibiotico de 4-aminoquinolona y con la presencia continua o pulsada de un mitogeno, que en la realizacion preferida es PHA. Sin embargo, tambien se pueden utilizar otros mitogenos. El IRX-2 producido para la administracion a los pacientes contiene una concentracion de IL-1 p que vana de 60-6.000 pcg/ml, mas preferiblemente, de 150-1.800 pcg/ml; una concentracion de IL-2 que vana de 600
60.000 pcg/ml, mas preferiblemente, de 3.000-12.000 pcg/ml, y las concentraciones de IFN-y y de TNF-a que vana de 200-20.000 pcg/ml, mas preferiblemente, de 1.000-4.000 pcg/ml.
IRX-2 puede contener tambien una concentracion de IL-6 que vana de 60-6.000 pcg/ml, mas preferiblemente, de 300-2.000 pcg/ml; una concentracion de IL-8 que vana de 6.000-600.000 pcg/ml, mas preferiblemente de 20.000
180.000 pcg/ml; una concentracion de TNF-a que vana de 200-20.000 pcg/ml, mas preferiblemente, de 1.000-4.000 pcg/ml. Se pueden utilizar citocinas recombinantes, naturales o pegiladas, o IRX-2 puede incluir una mezcla de citocinas recombinantes, naturales o pegiladas. IRX-2 puede contener solamente las citocinas anteriores; sin embargo, pueden incluirse otras citocinas. El IRX-2 de la presente invencion puede incluir ademas otras citocinas recombinantes, naturales o pegiladas, tal como IL-7, IL-12, IL-15, GM-CSF (a una concentracion que vana de 100
10.000 pcg/ml, mas preferiblemente de 500-2.000 pcg/ml), y G-CSF. El procedimiento de elaborar IRX-2 se divulga en las patentes anteriormente citadas.
Tambien abarcados por la presente invencion estan los derivados, fragmentos y peptidos relacionados con las citocinas divulgadas en el presente documento, donde tales derivados, fragmentos y peptidos conservan la actividad biologica de sus respectivas citocinas.
Tambien se pueden administrar otros compuestos junto con IRX-2, como las composiciones para fomentar la inmunosupresion, tal como inhibidores qrnmicos; farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE); cinc y sus combinaciones. El inhibidor qrnmico puede ser cualquier agente quimioterapeutico que no sea inmunosupresor (usado preferiblemente en dosis bajas) y que tenga efectos inmunomoduladores para aumentar la inmunidad y/o una respuesta inmunitaria, p. ej., inhibiendo la inmunosupresion o mecanismos supresores en el cuerpo. Segun una realizacion preferida, el inhibidor qrnmico es un agente anti-neoplasico que incluye, pero no se limita a agentes alquilantes, antimetabolitos y antibioticos. El inhibidor qrnmico puede tambien ser un agente inmunomodulador tal como talidomida. El inhibidor qrnmico puede tambien estar en una sal u otra forma compleja. Preferiblemente, el inhibidor qrnmico es el agente alquilante ciclofosfamida (CY). El AINE es preferiblemente indometacina (INDO), que
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es a la vez un inhibidor Coxl y Coxll. El AINE puede ser tambien ibuprofeno o inhibidores Coxll tal como celecoxib y rofecoxib, o combinaciones de los mismos. Los cuatro componentes utilizados juntos (es decir, inhibidor qmmico, AINE, biologico derivado de celulas primarias y cinc) son capaces de abordar el entorno supresor creado por la diana inmunitaria y restablecer la respuesta inmunitaria celular del paciente. Mas espedficamente, el inhibidor qmmico inhibe celulas reguladoras T; el AINE invierte la inmunosupresion local mediante prostaglandinas, el biologico derivado de celulas primarias activa las celulas dendnticas, estimula las celulas T y protege de apoptosis a las celulas T; y el zinc proporciona nutrientes clave para la funcion de celulas T como se muestra en la FIGURA 2. Esta accion combinada fomenta la respuesta inmunitaria a los antigenos tanto endogenos como exogenos.
Como se usa en el presente documento, el termino "antigeno endogeno" indica un antigeno que se produce y se situa in vivo.
Como se usa en el presente documento, el termino "antfgeno exogeno" indica un antfgeno que es producido, es decir, aislado o generado, in vitro.
Como se usa en el presente documento, el termino "antfgeno asociado al tumor” indica una protema o peptido u otra molecula capaz de inducir una respuesta inmunitaria a un tumor. Esto puede incluir, pero no se limita a, peptidos PSMA, peptidos MAGE (Sahin, 1997; Wang, 1999), peptidos del virus Papiloma (E6 y E7), fragmentos de MAGE, NY ESO-1 u otros antfgenos similares. Anteriormente, estos antfgenos no se consideraban eficaces en el tratamiento de pacientes basados en su tamano, es decir, se consideraban demasiado pequenos, o previamente se crefa que caredan de propiedades inmunogenicas (es decir, se consideraban auto-antfgenos).
Los peptidos largos sinteticos se definen como secuencias peptfdicas entre 22 y 45 aminoacidos. Las vacunas de peptidos largos sinteticos ofrecen varias ventajas sobre las vacunas de secuencia peptfdica minima, que se explican a continuacion. Uno de los factores clave en la eficacia de la vacuna es el contexto en el que los peptidos se presentan al sistema inmunitario. Los peptidos largos sinteticos no pueden unirse directamente a MHC clase I pero necesitan ser captados y procesados por celulas dendnticas y despues presentados a las celulas T citotoxicas. Por el contrario, los peptidos mmimos de celulas T citotoxicas (8-10 aminoacidos), son facilmente cargados de forma exogena en las moleculas MHC de clase I y pueden ser presentados tanto por APC (DC) profesional como por APC (celulas T y celulas B) no profesional in vivo. La presentacion de los epitopes citotoxicos de peptido de celulas T en las celulas de B no activadas induce una respuesta citotoxica transitoria de celulas T que es seguida por una eliminacion posterior de estas celulas T CD8+. La lenta liberacion y larga duracion de presentacion a antfgeno que es inducida por el adyuvante IFA, mas de 100 dfas, en combinacion con la presentacion minima de peptidos de celulas T citotoxicas en ganglios linfaticos no-inflamatorios por APC no profesional induce tolerancia de celulas T CD8+ y fratricidio cuando las celulas T CD8+ activadas por vacuna de peptido presentan el peptido mmimo de celulas T citotoxicas entre sf. En cambio, la carga de peptidos mmimos de union de MHC clase I directamente sobre DC puede transformar un peptido tolerante de celulas T citotoxicas en un peptido que desencadena la expansion de una respuesta de celulas T citotoxicas protectoras del tumor. De forma similar, la extension de la secuencia de peptidos de celulas T citotoxicas frente a un peptido sintetico largo, que requiere el procesado profesional por las DC, tiene el mismo beneficio. Los peptidos sinteticos largos se procesan y presentan sobre todo por el APC profesional y por lo tanto estimulan las celulas T citotoxicas predominantemente dentro del fuerte entorno estimulador de la linfa de drenaje inflamada. Otra ventaja de las vacunas de peptidos sinteticos largos sobre las vacunas de peptidos mmimos de celulas T citotoxicas es la mayor duracion de la presentacion del epitope in vivo al antfgeno que drena el ganglio linfatico, que es importante para la extension clonica y para la produccion del IFN-y por celulas T efectoras. Esto mejoraba la presentacion in vivo y la induccion simultanea de la expansion de celulas T por un epitope de peptido sintetico largo es particularmente evidente si el epitope de celulas T citotoxicas al que se refiere presenta una union mas debil de mHc de clase I. Por lo tanto, la transformacion de peptidos mmimos de celulas T citotoxicas en peptidos largos ofrece una alternativa a procedimientos tales como la modificacion de peptidos mmimos de celulas T citotoxicas para aumentar la inmunogenicidad.
Ejemplos de peptidos largos sinteticos para HPV son los siguientes:
E61-32: MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHD;
E619-50: LPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVY;
E641-65: KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN;
E655-80: RDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKI;
E671-95: DKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTL;
E685-109: HYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIR;
E691-120: YGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEK;
E6109-140: RCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT;
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E6127-158: DKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL;
E71-35: MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE;
E722-56: LYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVT;
E743-77: GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR;
E764-98: TLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP.
Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a una composicion que incluye un biologico derivado de celulas primarias (IRX-2) que tiene las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-y, y una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica al menos un antigeno en un vector vmco. El IRX-2 actua como adyuvante solo o en combinacion con otros adyuvantes, con el antigeno o antigenos codificados por la vacuna, es decir, estimula una respuesta inmunitaria con el antigeno. En otras palabras, IRX-2 actua de una manera sinergica con el antigeno exogeno para crear una mayor respuesta inmunitaria que la que se puede lograr administrando los antigenos exogenos solos. IRX-2 proporciona ventajas sobre los adyuvantes previos debido a su efecto de “activar” totalmente el sistema inmunitario de un paciente cuyo sistema inmunitario esta de cualquier manera suprimido de su funcion completa. Sin revertir la supresion del sistema inmunitario, el antfgeno no se puede presentar con eficacia para tratar el cancer y otras enfermedades. El mecanismo por el cual IRX-2 "activa” el sistema inmunitario se describe mas adelante.
La composicion se puede utilizar para tratar muchos tipos diferentes de enfermedades como canceres, como, pero no limitado a, carcinoma de celula escamosa de cabeza y cuello (H&NSCC), cancer de mama, cancer colorrectal, cancer del estomago, cancer pancreatico, cancer de pulmon, cancer de cerebro, cancer de colon, cancer de ovario, cancer de lengua, cancer de faringe, cancer de prostata y melanoma. Ademas, las composiciones y los procedimientos de la invencion se pueden utilizar para tratar lesiones persistentes no cancerosas tales como lesiones infecciosas que producen un antfgeno in vivo, p. ej., candidiasis cutanea o sistemica, verrugas venereas asociadas con el virus del papiloma, o displasia de cuello uterino.
El IRX-2 es esencialmente como se describio anteriormente en la seccion de las definiciones y, opcionalmente, puede incluir citocinas adicionales distintas de las seis citocinas cnticas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-y, y la composicion puede incluir, ademas, opcionalmente, otros diversos compuestos que se administran en el regimen tfpico de IRX-2, es decir, un inhibidor qmmico, un AINE, y cinc tambien como se describio anteriormente.
La vacuna es cualquier vacuna que comprende al menos un acido nucleico que codifica un antfgeno en un vector vmco, que se usa para tratar el cancer estimulando una respuesta inmunitaria a un antfgeno particular e incluye, generalmente, al menos un antfgeno comunmente producido en ese tipo particular de cancer.
Los antfgenos comunes utilizados en las vacunas contra el cancer incluyen AFP, alfa-actinin-4, ARTC1, BAGE, BCR-abl, B-RAF, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, antfgeno carcinoembrionario, antfgeno carcinoembrionario modificado, mucinas mutadas asociadas a carcinoma, cdc27, CDK4, CDKN2A, CEA, cromogranina A, COA-1, cinasa-4 dependiente de ciclina, protema de fusion dek-can, EFTUD, factor 2 de elongacion, receptor EGFRvIII del factor de crecimiento epidermico, producto genico del virus de Epstein-Barr EBNA, ETA, protema de fusion ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GAGE, gangliosidos, GPNMB, gp75/TRP-1, gp100, H1FT, HAGE, HERV-K-MEL, protema HER2/neu, HIP-55, HIV-1, HIV-2, HLA-A2, HLA-A11, hsp70-2, KIAAO205, cinesina 2, KK-LC-1, KLK-4, KM-HN-1, KSA, LAGE, protema de fusion LDLR-fucosiltransferasa AS, MAGE, mamaglobina-A, MART-1/Melan A, MART-2, ME1, proteoglicano de melanoma, miosina clase I, MUC-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA-88, NCAM-180, neo-PAP, NFYC, NY-BR, NY-ESO-1, OA1, OGT, OS-9, p15, p21-ras, p53, p185 HER2/neu, E7 del virus del papiloma, E6 del virus del papiloma, protema de fusion pmi-RARalfa, PRDX5, PTPRK, PSA, PSMA, RAGE, K-ras, N-ras, RAB38, RBAF600, SAGE, SIRT2, SNRPD1, sp17, protema de fusion SYT-SSX1, protema de fusion SYT-SSX2, TA 90, TAG, factor antiapoptotico TGF-p1, TGF-pRII, tiroglobulina, TRAG-3, triosa fosfato isomerasa, TRP2, TRP2-INT2, protema tumoral D52, tirosinasa, WT1, fragmentos de los mismos, derivados de los mismos, y sus combinaciones. Tambien se puede utilizar cualquier otro antfgeno adecuado.
Los antfgenos estan codificados en un vector vmco, es decir, un vector de acido nucleico. En este caso, el antfgeno esta codificado en material de acido nucleico, como ADN o ARN. Los vectores vmcos comunes usados para codificar el acido nucleico incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus del herpes, y virus de la viruela. Ejemplos de virus de la viruela incluyen la vacuna, la vacuna Ankara modificada (MA), NYVAC, virus de la viruela aviar, TROVAX, viruela de aves de corral y viruela del canario. Ejemplos espedficos de viruela del canario incluyen ALVAC y ALVAC(2). Un experto en la tecnica puede codificar los antfgenos en el vector deseado.
La composicion puede incluir tambien moleculas co-estimuladoras para estimular las celulas T. Las celulas T requieren dos senales diferentes para ser completamente activadas. La primera senal es espedfica de antfgeno y viene del receptor de celulas T que interactua con las moleculas MHC del peptido en la membrana de las celulas presentadoras de antfgeno. La segunda senal, que es la senal co-estimuladora, es antfgeno no espedfico y se logra
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mediante la interaccion entre moleculas co-estimuladoras expresadas en la membrana de las celulas presentadoras de antigeno y la celula T. Las moleculas co-estimuladoras se pueden encontrar de forma natural en el cuerpo; sin embargo, en un paciente inmunodeprimido, pueden administrate moleculas adicionales. Ejemplos de moleculas co- estimuladoras incluyen abatacept, belatacept, CD28-SuperMAB, moleculas co-estimuladoras B7/CD28, moleculas co-estimuladoras de la superfamilia TNF, moleculas co-estimuladoras de la familia SLAM, asf como otras.
La composicion puede incluir tambien peptidos sinteticos largos como se ha descrito anteriormente. Esta combinacion es un ejemplo de combinar una vacuna que tiene un mecanismo de accion novedoso con la composicion de la presente invencion para obtener una respuesta sinergica debido al mecanismo combinado de accion de los dos componentes.
La composicion tambien puede incluir compuestos para el bloqueo de mecanismos inmunitarios supresores o reguladores negativos, tales como anti-CTLA-4, anti-PD-1 o anti-PDL-1. La familia de receptores CTLA-4 (Antigeno 4 de linfocitos T citotoxicos), cuando se acoplaba, inhibe la activacion de celulas T, promueve la detencion del ciclo celular, y disminrna la produccion de citocinas. Esta es una funcion importante en un sistema inmunitario que funciona normalmente para prevenir respuestas inmunitarias excesivas. Sin embargo, se desea la inhibicion del receptor CTLA-4 en un paciente inmunodeprimido para eliminar algo de la supresion y estimular la activacion de celulas T.
La composicion puede incluir ademas una molecula que elimina las Treg. Las Treg, o celulas T reguladoras, distinguen entre los auto-antfgenos y los no auto-antfgenos e inhiben activamente la activacion inmunitaria. El agotamiento de las Treg puede reducir la supresion del sistema inmunitario en un paciente inmunodeprimido. Este agotamiento se puede lograr administrando una molecula que agote las Treg como, pero sin limitarse a, denileucina difitox (ONTAK ®, Eisai Inc.).
La composicion puede incluir antfgenos asociados a la angiogenesis con el fin de prevenir o inhibir los procesos angiogenicos que ocurren cerca o dentro de los tumores. Los antfgenos asociados a angiogenesis pueden incluir, pero no se limitan a, VEGF, receptor de VEGF, EGFR, bFGF, PDGF-B, PD-ECGF, los TGF que incluyen TGF-a, endoglina, protemas Id, varias proteasas, oxido rntrico sintasa, aminopeptidasa, trombospondinas, k-ras, Wnt, cinasas dependientes de ciclina, microtubulos, protemas de choque termico, factores de union a heparina, sintasas, receptores de colageno, integrinas y proteoglicanos NG2 de superficie.
La composicion puede incluir ademas agentes potenciadores CD80, ICAM-1, y LFA-3, tambien conocido como TRICOM, para mejorar el efecto del biologico derivado de celulas primarias y de la vacuna contra el cancer, asf como otros componentes descritos anteriormente. Otras combinaciones de agentes potenciadores incluyen IL-12 y GM-CSF; IL-12, GM-CSF y TNF-a; CD80 e IL-12; y CD86, GM-CSF e IL-12.
La presente divulgacion tambien se refiere tambien a una composicion que incluye el biologico derivado de celulas primarias segun lo descrito anteriormente, que de por sf actua como adyuvante, y al menos otro adyuvante para estimular el sistema inmunitario de un paciente. Los antfgenos exogenos, como en las vacunas contra el cancer y los demas componentes descritos anteriormente, tambien pueden incluirse en la composicion. En otras palabras, la composicion es una composicion multi-adyuvante que realza adicionalmente el efecto de los antfgenos. Ademas, el biologico derivado de celulas primarias no solo mejora el efecto de los antfgenos descritos anteriormente, sino tambien el efecto de los adyuvantes, es decir, el biologico derivado de celulas primarias actua de forma sinergica con los adyuvantes.
Hay dos clases diferentes de adyuvantes: los independientes de receptor tipo peaje (TLR) y los dependientes de TLR. Los adyuvantes independientes de TLR actuan como sistemas de entrega y colaboran para concentrar los antfgenos, dirigirlos a las celulas de presentacion de antfgenos, y localizar conjuntamente antfgenos y potenciadores inmunitarios. Los adyuvantes dependientes de TLR estimulan directamente el sistema inmunitario a traves de la activacion de los TLR. La composicion de la presente invencion se puede utilizar con un adyuvante independiente de TLR, un adyuvante dependiente de TLR, o combinaciones de los mismos. El uso de cada tipo de adyuvante puede estimular diferentes partes del sistema inmunologico a la vez. Por ejemplo, un adyuvante independiente de TLR puede poner en circulacion el antfgeno y los adyuvantes dependientes del TLR hacia las APC para estimular la captacion y estabilidad del antfgeno, mientras que el adyuvante dependiente de TLR realza directamente la inmunidad a traves de la activacion de la senalizacion de TLR y reduce la potencial toxicidad de la administracion de adyuvantes dependientes de TLR por su cuenta. Ademas, el uso de multiples adyuvantes dependientes de TLR puede dar como resultado un efecto sinergico de los adyuvantes.
Los adyuvantes pueden ser, pero no se limitan a, los siguientes adyuvantes. Adyuvantes independientes de TLR: Alumbre (fosfato/hidroxido de aluminio) es una sal mineral con varias indicaciones. AS03 (GSK; escualeno (10,68 mg), DL-alfa-tocoferol (11,86 mg) y polisorbato 80 (4,85 mg) es una emulsion de aceite en agua que se utiliza para la gripe pandemica. MF59 (Novartis; 4-5 % p/v de escualeno, 0,5 % p/v de Tween 80, 0,5 % de Span 85, opcionalmente: cantidades variables de muramul tripeptido fosfatidil-etanolamina (MTP-PE)) es una emulsion de aceite en agua utilizada para la gripe. Provax (Biogen Idee; escualeno mas pluronic L121) es una emulsion de aceite en agua. Montanide (Seppic SA; Bioven; Cancervax; oleato de mannida y aceite mineral) es una emulsion de agua en aceite que se utiliza en el tratamiento de la malaria y del cancer. TiterMax (CytRx; escualeno mas CRL-8941) es
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una emulsion de agua en aceite. Advax (Vaxine Pty; partfculas nanocristalinas de inulina) es un biopoKmero que se utiliza en vacunas contra la Hepatitis B (profilactica y terapeutica), gripe, antrax, shigella, encefalitis japonesa, rabia, veneno de abeja, alergia, e inmunoterapia del cancer. QS21 (Antigenicos; fraccion de Quil A) es una composicion de origen vegetal que se utiliza en el tratamiento del melanoma, la malaria, el VIH y la gripe. Quil A (Statens Serum Institute; fraccion purificada de Quillaja Saponaria) es una composicion de origen vegetal utilizada en varios tratamientos. ISCOM (CSL; Isconova; saponina mas esterol mas, opcionalmente, fosfolfpido) es una composicion de origen vegetal que se utiliza en varios tratamientos que incluyen la gripe. Se utilizan liposomas (Crucell; Nasvax; esferas de fosfolfpido sintetico que consisten en lfpido) en el tratamiento de varias enfermedades.
Adyuvantes dependientes de TLR: Ampligen (Hemispherx; regiones de desapareamiento que aparecen regularmente que contiene ARN de doble cadena configurado espedficamente sintetico) trabaja activando TLR3 y se utiliza como una vacuna contra la gripe pandemica. AS01 (GSK; MPL, liposomas y QS-21) trabaja activando con MPL TLR4, los liposomas proporcionan una entrega del antfgeno realzada a las APC, QS-21 proporciona la mejora de la presentacion del antfgeno a la APC y la induccion de celulas T citotoxicas, y esto se utiliza como una vacuna contra la malaria y la tuberculosis. AS02 (GSK; MPL, emulsion de aceite en agua, y QS-21) trabaja activando con MPL TLR4, la emulsion de aceite en agua proporciona respuestas inflamatorias innatas, reclutamiento y activacion de APC, mejora de la persistencia del antfgeno en el sitio de la inyeccion, presentacion a celulas inmunocompetentes, provocacion de diversos patrones de citocinas, y el QS-21 proporciona el mejora de la presentacion del antfgeno a las APC y a la induccion de las celulas T citotoxicas, y esto se utiliza como vacuna contra la malaria, la tuberculosis, el HBV, y el HIV. AS04 (GSK; MPL, hidroxido de aluminio/fosfato de aluminio) trabaja activando con MPL TLR4, el alumbre proporciona un efecto de deposito, inflamacion local, y aumento de la captacion de antfgeno por las APC, y esto se utiliza como una vacuna para HBV, HPV, HSV, RSV, y EBV. MPL RC- 529 (Dynavax; MPL) trabaja activando TLR4 y se utiliza como vacuna contra el HBV. E6020 (Eisa/Sanofi Pasteur; dfmero fosfolfpido sintetico) trabaja activando TLR4. La tecnologfa TLR (Vaxinnate; antfgeno y flagelina) trabaja activando TLR5 y se utiliza en vacunas contra la gripe. PF-3512676 (CpG 7909) (Coley/Pfizer/Novartis; oligonucleotido sintetico inmunomodulante) trabaja activando TLR9 y se utiliza en vacunas contra el HBV, la gripe, la malaria y el antrax. ISS (Dynavax; secuencias cortas de ADN) trabaja activando TLR9 y se usa en vacunas contra el HBV y la gripe. IC31 (Intercell; peptido y oligonucleotido) trabaja activando TLR9, formacion de un deposito en el sitio de la inyeccion, y la mejora de la captacion del antfgeno en las APC y se utiliza como vacuna contra la gripe, la tuberculosis, la malaria, la meningitis, la alergia, y los indicios de cancer.
Debe entenderse tambien que las combinaciones de biologico derivado de celulas primarias y adyuvantes se pueden utilizar para otros indicios que los recomendados actualmente para los adyuvantes anteriores, y se pueden utilizar especialmente en indicios de cancer como se describe en el presente documento. Asf, la combinacion de biologico derivado de celulas primarias y adyuvante se puede utilizar para mejorar el sistema inmunitario y tratar cualquiera de las enfermedades indicadas espedficamente para los adyuvantes o para cualquier otra enfermedad descrita en el presente documento.
Ademas, la presente divulgacion incluye el biologico derivado de celulas primarias y otro adyuvante segun lo descrito anteriormente que tiene un diferente mecanismo de accion que el del biologico derivado de celulas primarias. El biologico derivado de celulas primarias actua para "activar" eficazmente el sistema inmunitario madurando celulas dendnticas inmaduras, estimular la produccion de celulas T sin tratamiento previo y presentar eficazmente el antfgeno a las celulas T sin tratamiento previo. El mecanismo de accion se describe adicionalmente a continuacion. Cuando se combina con un adyuvante que actua en otra area del sistema inmunitario, el biologico derivado de celulas primarias y el adyuvante pueden producir una respuesta sinergica en el sistema inmunitario estimulando multiples areas del sistema inmunitario a la vez.
La presente invencion proporciona composiciones para uso en el tratamiento del cancer, que comprende la composicion descrita anteriormente que incluye el biologico derivado de celulas primarias que incluye las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, e IFN-y, y una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica al menos un antfgeno en un vector vmco. La composicion es eficaz en el tratamiento del cancer porque el biologico derivado de celulas primarias y los antfgenos interactuan de manera sinergica para presentar antfgenos a las celulas T y activar el sistema inmunologico. En general, el biologico derivado de celulas primarias actua para estimular la produccion de celulas T sin tratamiento previo, madurar las celulas dendnticas inmaduras y permitir la presentacion mediante las celulas dendnticas maduras resultantes de los antfgenos exogenos en la vacuna contra el cancer a las celulas T sin tratamiento previo. El mecanismo de accion se describe adicionalmente a continuacion. En otras palabras, sin la accion del biologico derivado de celulas primarias, la vacuna contra el cancer no sena tan eficaz en la generacion de inmunidad al cancer en el paciente porque el sistema inmunologico permanecena deprimido. El paso de la administracion se puede alcanzar como se describe adicionalmente a continuacion, y preferiblemente por inyeccion perilinfatica una vez al dfa.
Las celulas T en el paciente pueden tambien ser co-estimuladas administrando moleculas co-estimuladoras como se ha descrito anteriormente para generar las senales no espedficas del antfgeno a las celulas T. La inhibicion de las celulas T puede estar restringida por la administracion de anti-CTLA-4 como se ha descrito anteriormente con el fin de estimular adicionalmente las celulas T como se ha descrito anteriormente. Las Treg se pueden agotar administrando moleculas que agotan las Treg para reducir adicionalmente la supresion del sistema inmunitario como se ha descrito anteriormente. La induccion y el desarrollo continuado de los vasos sangumeos en tumores se
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pueden impedir administrando antigenos asociados a angiogenesis como se ha descrito anteriormente. Se pueden administrar agentes potenciadores que mejoran el efecto de los componentes de la composicion como se ha descrito anteriormente.
Los usos medicos de la composicion para tratar el cancer pueden incluir adicionalmente la realizacion de una terapia tal como quimioterapia, radiacion, terapia anti-angiogenica, y combinaciones de las mismas. Cada una de estas terapias es mas eficaz cuando se realiza en combinacion con la composicion de la presente invencion que cuando se realiza sola.
La presente divulgacion tambien describe para un procedimiento de revertir la inmunosupresion y ganar inmunidad al cancer administrando la composicion descrita anteriormente que incluye cantidades sinergicas del biologico derivado de celulas primarias que incluye citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN-y, y una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica un antfgeno, estimulando la produccion de celulas T sin tratamiento previo, madurando las celulas dendnticas inmaduras, y permitiendo la presentacion de celulas dendnticas maduras resultantes de los antfgenos exogenos en la vacuna contra el cancer a las celulas T sin tratamiento previo, revirtiendo con ello la inmunosupresion y adquiriendo inmunidad al cancer. En otras palabras, el biologico derivado de celulas primarias y la vacuna contra el cancer trabajan juntos con el fin de activar eficazmente el sistema inmunologico en el paciente inmunodeprimido y estimular la inmunidad al cancer basado en los antfgenos exogenos.
Como en el procedimiento anterior, las celulas T en el paciente pueden tambien ser co-estimuladas administrando moleculas co-estimuladoras segun lo descrito anteriormente para generar las senales no espedficas del antfgeno a las celulas T. La inhibicion de las celulas T puede ser prohibida mediante la administracion de anti-CTLA-4 como se ha descrito anteriormente con el fin de estimular adicionalmente las celulas T como se ha descrito anteriormente. Las Treg pueden agotarse administrando moleculas que agotan Treg para reducir adicionalmente la supresion del sistema inmunitario segun lo descrito anteriormente. La induccion y el desarrollo continuado de los vasos sangumeos en tumores se pueden impedir administrando antfgenos asociados a angiogenesis como se ha descrito anteriormente. Se pueden administrar agentes potenciadores que mejoran el efecto de los componentes de la composicion como se ha descrito anteriormente.
El procedimiento de revertir la inmunosupresion y ganar inmunidad al cancer puede incluir adicionalmente la realizacion de una terapia como la quimioterapia, la radiacion, la terapia anti-angiogenica y las combinaciones de las mismas. Cada una de estas terapias es mas eficaz cuando se realiza en combinacion con la composicion de la presente invencion que cuando se realiza sola.
La presente divulgacion tambien describe para un procedimiento de producir una respuesta inmunitaria a un antfgeno exogeno en un paciente, administrar un adyuvante de un biologico derivado de celulas primarias que incluye las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN-y, y al menos un antfgeno exogeno, en donde el antfgeno exogeno no produce normalmente una respuesta inmunitaria y producir una respuesta inmunitaria en el paciente. Los antfgenos exogenos pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente que normalmente no producen una respuesta inmunitaria en un paciente. El ejemplo 12 muestra que el IRX-2 es eficaz para producir una respuesta inmunitaria con peptidos PSMA que, normalmente, no son eficaces. Este procedimiento puede ser adicionalmente combinado con cualquiera de los pasos o compuestos descritos anteriormente.
La presente divulgacion describe un procedimiento para mejorar una respuesta inmunitaria en un paciente, al administrar el biologico derivado de celulas primarias que incluye las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN-y, en combinacion con al menos un adyuvante. El biologico derivado de celulas primarias se ha descrito anteriormente. El adyuvante o adyuvantes puede ser un adyuvante independiente de TLR, un adyuvante dependiente de TLR, o combinaciones de los mismos. El procedimiento puede despues incluir el paso de entregar y concentrar los antfgenos, dirigir los antfgenos a las celulas de presentacion a antfgeno, y localizar conjuntamente los antfgenos y potenciadores inmunitarios al administrar un adyuvante independiente de TLR. El procedimiento puede incluir tambien el paso de estimular directamente el sistema inmunitario activando los TLR al administrar un adyuvante dependiente de TLR. Como se ha descrito anteriormente, el biologico derivado de celulas primarias actua sinergicamente con los otros adyuvantes para estimular mas eficazmente el sistema inmunitario en respuesta a los antfgenos. Preferiblemente, los antfgenos exogenos se administran tambien, como se ha descrito anteriormente, como en la vacuna contra el cancer. Este procedimiento se puede combinar ademas con cualquiera de los pasos o compuestos descritos anteriormente. El adyuvante puede tener un mecanismo de accion diferente al biologico derivado de celulas primarias como se ha descrito anteriormente.
La presente divulgacion describe adicionalmente un procedimiento de aumentar la funcion de un sistema inmunitario administrando el biologico derivado de celulas primarias que incluye las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN- y, en combinacion con al menos un adyuvante, en donde el adyuvante tiene un mecanismo de accion que es diferente del mecanismo de accion del biologico derivado de celulas primarias, y que aumenta la funcion de la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el biologico derivado de celulas primarias y el adyudante interactuan sinergicamente para aumentar la funcion inmunitaria mas alla de lo que resultana del biologico derivado de celulas primarias o el adyuvante por separado porque cada componente esta "activando” un area diferente del sistema inmunitario, para producir una mayor respuesta inmunitaria. Este procedimiento se puede combinar ademas con
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cualquiera de los pasos o compuestos descritos anteriormente.
El mecanismo de accion de IRX-2
Como se ha definido anteriormente, el biologico derivado de celulas primarias de la invencion actua como un adyuvante, es decir, estimula o realza la respuesta inmunitaria de un paciente a un antigeno particular. Por otra parte, las composiciones IRX-2 y los procedimientos de la divulgacion se adaptan particularmente para estimular respuestas inmunitarias mediadas por celulas T. Las respuestas inmunitarias promovidas por las composiciones y los procedimientos de la divulgacion incluyen la induccion o generacion de celulas T sin tratamiento previo, la diferenciacion y la maduracion de celulas dendnticas, permitiendo la presentacion apropiada de antigeno a las celulas T (p. ej., en los ganglios linfaticos), y la activacion de monocitos y macrofagos. Espedficamente, en pacientes con cancer, las respuestas inmunitarias promovidas por las composiciones y los procedimientos de la divulgacion incluyen la infiltracion del tumor por linfocitos, la fragmentacion del tumor y la regresion, asf como una reduccion en histiocitosis sinusal (si esta presente). Esencialmente, el biologico derivado de celulas primarias induce la produccion inmunitaria y bloquea la destruccion inmunitaria. El mecanismo de la accion del biologico derivado de celulas primarias se describe mas a posteriori en la solicitud de patente de los EE.UU. N.° 12/323.595 (US7993660) de los Solicitantes.
Mas espedficamente, las composiciones y procedimientos de la presente divulgacion ayudan a superar la depresion/inmunosupresion en pacientes induciendo la produccion de celulas T sin tratamiento previo. La expresion celulas T "sin tratamiento previo”, como se definen en el presente documento, indica celulas T recien producidas, cuyas celulas T no se han expuesto al antfgeno. Tales celulas T no son espedficas, con todo son capaces de llegar a ser espedficas tras la presentacion del antfgeno por una celula dendntica madura que tiene antfgeno, como los peptidos tumorales, expuestos en dicho lugar. Asf, las composiciones y procedimientos de la divulgacion reponen o generan nuevas celulas T (veanse los Ejemplos 2 y 8 de mas adelante).
Ademas, particularmente en pacientes con cancer con tumores, las presentes composiciones y procedimientos permiten la infiltracion de linfocitos en los tumores con la fragmentacion y regresion significativas del tumor. Veanse, p. ej., los Ejemplos 2-7 a continuacion. Esta infiltracion es importante para maximizar la respuesta clfnica y para un mayor aumento de la tasa de supervivencia. Por ejemplo, linfocito:granulocito o infiltracion de macrofagos de una relacion 90:10 es optima y la infiltracion de celulas T y/o B es preferentemente difusa e intensa y no periferica. La reduccion y fragmentacion del tumor en muestras histologicas reflejan una buena respuesta inmunitaria y es indicativo de un efecto adyuvante mediante las composiciones de la invencion.
Por otra parte, los cambios espedficos del ganglio linfatico tambien indican una respuesta inmunitaria eficaz, tal como ampliacion del ganglio linfatico, es decir, no solo la inversion de la reduccion inducida del tamano del tumor sino el aumento global de tamano comparado con el tamano normal del ganglio, asf como el aumento de las areas T y B. Ademas, los ganglios linfaticos de los pacientes con cancer contienen a menudo una acumulacion intrasinusal de histiocitos grandes, tambien denominada histiocitosis sinusal (SH). Se cree que la SH es la acumulacion de celulas dendnticas inmaduras, que han ingerido y procesado antfgenos tumorales, pero no pueden madurar y presentar estos peptidos tumorales a las celulas T sin tratamiento previo. Sin la presentacion apropiada del antfgeno a las celulas T, estas celulas T son incapaces de estimular las celulas efectoras Th1 y Th2, cuya estimulacion conduce normalmente a la inmunidad mediada por celulas y mediada por anticuerpos, respectivamente, en el cuerpo. Como se indica en los Ejemplos 2-7 a continuacion, las composiciones de citocinas y los procedimientos de esta divulgacion redujeron la SH en los ganglios linfaticos de pacientes con cancer y produjeron los diferentes cambios linfaticos descritos anteriormente, indicando de nuevo un efecto adyuvante de las composiciones de la invencion.
Debido a que se sabe que las celulas dendnticas desempenan un papel clave en la presentacion del antfgeno en la produccion de una respuesta inmunitaria adecuada in vivo, un agente que tiene un efecto estimulador sobre la maduracion de las celulas dendnticas actuara como un adyuvante en la obtencion de una buena respuesta inmunitaria a un antfgeno. Como se ha demostrado en el Ejemplo 9 a continuacion, las composiciones de citocinas de la presente divulgacion promueven la maduracion de la celula dendntica. Ademas, los datos del Ejemplo 2 demuestran que las composiciones de citocinas de la divulgacion tambien desbloquean el defecto de la celula dendntica que conduce a SH, es decir, al promover la maduracion de las DC, y asf espedficamente, en pacientes con cancer, las composiciones de la invencion proporcionan multiples efectos adyuvantes, es decir, en el desbloqueo de las DC en SH en los ganglios linfaticos y en fomentar la maduracion de DC en general.
Las composiciones de citocinas de la invencion tambien proporcionan un efecto adyuvante adicional actuando como potentes activadores de monocitos/macrofagos. Los monocitos son precursores tanto de DC como macrofagos en el cuerpo y, por lo tanto, un agente que promueve la activacion de monocitos/macrofagos tiene un efecto adyuvante en las respuestas inmunitarias in vivo. Vease el Ejemplo 10 a continuacion.
El biologico derivado de celulas primarias tambien bloquea la destruccion inmunitaria protegiendo las celulas T activadas de apoptosis. Uno de los mecanismos de escape del tumor implica la eliminacion dirigida de las celulas T efectoras CD8+ a traves de apoptosis mediada por microvesfculas (MV) derivadas del tumor. Las MV inmunosupresoras se han encontrado en lesiones neoplasicas, sueros, ascitis y derrames pleurales obtenidos de
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pacientes de cancer y se han ligado a apoptosis y alteraciones del TCR en celulas T efectoras en estos pacientes. La eliminacion conducida por MV de celulas T efectoras, que son necesarias para la defensa antitumoral de las anfitrionas, contribuye al escape del tumor y a la progresion del cancer. Por lo tanto, la proteccion de las celulas efectoras antitumorales frente a alteraciones funcionales y muerte es un objetivo principal de la inmunoterapia. Los datos clmicos y experimentales muestran que ciertas citocinas, especialmente citocinas de la supervivencia que usan la cadena comun del receptor y, pueden proteger las celulas T activadas de muerte inducida por el tumor y mejorar su actividad anti-tumoral.
Mas espedficamente, hay varias maneras en las cuales el biologico derivado de celulas primarias protege las celulas T contra la apoptosis. La expresion de moleculas de senalizacion anti-apoptotica (es decir, JAK-3 y fosforo- Akt) es regulada al alza y la expresion de las moleculas pro-apoptotica (es decir, SOCS-2) es regulada a la baja. La activacion de caspasas en linfocitos T CD8+ y CD4+ disminuye y aumenta la expresion cFLIP. La inhibicion de la via de supervivencia PI3K/Akt es contrarrestada por IRX-2. Las celulas T se protegen tanto contra la apoptosis extrmseca (apoptosis inducida por MV e inducida por FasL) y apoptosis mitocondrial intrmseca.
La proteccion contra la apoptosis extrmseca inducida por MV se logra adicionalmente impidiendo la regulacion a la baja de JAK3, CD3-Z, y STAT5; inhibir la desfosforilacion de Akt-1/2; y mantener relaciones equilibradas de Bax/Bcl- 2, Bax-Bcl-xL, y Bim/Mcl-1. La proteccion contra la apoptosis inducida por MV se logra tambien impidiendo la induccion de la actividad de la caspasa-3 y de la caspasa-7. Mas espedficamente, la induccion de la forma segmentada activa de la caspasa-3 se bloquea, al igual que la perdida de potencial de la membrana mitocondrial. La fragmentacion de ADN nuclear se inhibe. La proteccion contra apoptosis intrmseca por el biologico derivado de celulas primarias se muestra por su proteccion de celulas T activadas contra la apoptosis inducida por estaurosporina.
De manera Importante, los citocinas del biologico derivado de celulas primarias protegen las celulas T activadas contra apoptosis de una manera sinergica. En otras palabras, la combinacion de las citocinas en el biologico derivado de celulas primarias produce un mayor efecto del que se observa administrando citocinas individuales solas.
En vista de lo anterior, las composiciones de la presente invencion estimulan el sistema inmunitario a traves de efectos multiples, que incluyen la maduracion in vivo de celulas dendnticas que dan como resultado la presentacion eficaz del antfgeno de peptido, asf como la activacion de monocitos y macrofagos y la produccion de celulas T no comprometidas sin tratamiento previo. La presentacion apropiada del antfgeno conduce a la expansion clonica de celulas T y B, creando inmunidad en el paciente. En el caso de los pacientes con cancer, los efectos resenados anteriormente dan como resultado la infiltracion, p. ej., de linfocitos, en los tumores (p. ej., a traves de la propagacion hematogena) y la reduccion y/o destruccion del tumor. El resultado, como se indica en los datos que se indican a continuacion, aumenta la supervivencia debida a la memoria inmunologica (vease, p. ej., el Ejemplo 3 de mas adelante).
Para cualquiera de las divulgaciones anteriores, se utilizan los siguientes detalles y/o protocolos de administracion para el tratamiento:
Preferiblemente, la composicion de citocinas de la presente divulgacion se inyecta alrededor de los linfaticos que drenan en los ganglios linfaticos regionales hacia una lesion, tal como un tumor u otras lesiones persistentes que son tratadas. Mas espedficamente, las inyecciones perilinfaticas locales u otras inyecciones que son conocidas por los expertos en la tecnica se administran para proporcionar la suficiente localizacion de la preparacion de inmunoterapia. En el caso de cancer de cabeza y cuello, las inyecciones se realizan en el cuello, pero se pueden aplicar en otros lugares segun lo requerido por la enfermedad que se tratara. Tal tratamiento indujo regresiones clmicas en un alto porcentaje de los pacientes de cancer de cabeza y cuello, que tambien mostraron la mayor supervivencia, sin reaparicion (Hadden, 1994; Meneses, 1998; Barrera, 2000; Whiteside, 1993). Por el contrario, la inyeccion intratumoral de interleucina-2 recombinante en pacientes con cancer de cabeza y cuello (Whiteside, y col. (Cancer Res., 53:5654-5662, 1993)) produjo un infiltrado de linfocitos de celulas T, pero sin respuestas clmicas significativas. De manera similar, la inyeccion peritumoral del Multikine (sitio Celsci en la Web) en combinacion con la inyeccion perilinfatica dio como resultado respuestas tumorales significativas (es decir, mayores del 50 % de reduccion del tumor) en solo 11 pacientes, haciendo su tasa de respuesta menor del 10%. Ademas, la inyeccion peritumoral e intratumoral se puede asociar con la progresion de la enfermedad, incluso en los pacientes que han tenido inicialmente una respuesta positiva al protocolo del citocinas, anulando su beneficio. La inyeccion peritumoral o intratumoral esta de ese modo contraindicada.
Se prefiere un esquema de inyeccion de diez (10) dfas para la administracion de las composiciones de la invencion, pero se puede utilizar un protocolo de inyeccion de veinte (20) dfas. Las inyecciones bilaterales son eficaces. Cuando se ha producido una diseccion radical del cuello, la inyeccion contralateral es eficaz.
En el caso de que se utilice un antfgeno exogeno, los antfgenos sinteticos o extrafdos proporcionados de forma exogena, como el antfgeno tumoral y peptidos (vease Bellone, 1998), pueden administrarse en el ganglio linfatico regional o distal pre-cebado o co-cebado, bien en una preparacion separada o como parte de la composicion de citocinas de la divulgacion.
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La supresion endogena de las celulas T, que puede ser causada por, p. ej., cancer u otras enfermedades inmunosupresoras, puede ser bloqueada por la administracion conjunta de ciclofosfamida en dosis bajas (CY) y un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) (es decir, en combinacion con las composiciones de citocinas de la divulgacion). El AINE es preferiblemente indometacina (INDO) pero tambien se pueden utilizar inhibidores de ibuprofeno o Coxll como celecoxib (CELEBREX®) o rofecoxib (VIOXX®) o combinaciones de los mismos. Los efectos secundarios de los AINE pueden tratarse agresivamente con inhibidores de protones y analogos de la prostaglandina E. Como agentes para ayudar a restaurar inmunidad de celulas T se pueden anadir tambien cinc y multivitaminas, pudiendo incluir la adicion de selenio. Preferiblemente, la dosis de cinc es de 15 a 75 mg. Se puede administrar un multivitaminas estandar. El zinc puede ser un gluconato disponible.
Las composiciones de citocinas se pueden administrar antes o despues de la cirugfa, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas. Las composiciones de la invencion se pueden administrar durante la reaparicion de los tumores, es decir, durante un penodo en el que el crecimiento del tumor esta ocurriendo otra vez despues de un penodo en el que se pensaba que los tumores habfan desaparecido o estaban en remision.
Las composiciones de citocinas se administran y se dosifican para promover una optima inmunizacion, teniendo en cuenta el estado clmico del paciente individual, el sitio y el procedimiento de administracion, el calendario de administracion, la edad, el sexo, y el peso corporal del paciente. La "cantidad farmaceuticamente eficaz” para los fines del presente documento se determina asf por las consideraciones que se conocen en la tecnica. La cantidad debe ser eficaz para fomentar la inmunizacion, conducir, p. ej., a una reduccion del tumor, a la fragmentacion del tumor e infiltracion de leucocitos, a un retardo en la reaparicion o a una mejor tasa de supervivencia, o a la mejora o eliminacion de los smtomas, que incluyen el aumento del recuento de celulas T.
En los procedimientos de la presente divulgacion, las composiciones de la presente divulgacion se pueden administrar de varias maneras. Debe senalarse que las citocinas o antfgenos exogenos utilizados en las composiciones de la divulgacion se pueden administrar en sus formas estandares o como derivados farmaceuticamente aceptables y pueden administrarse solas o como ingredientes activos en combinacion con portadores, diluyentes, adyuvantes y vehnculos farmaceuticamente aceptables. Ademas, las composiciones de la invencion se pueden administrar de forma intra- o sub-cutanea, o de forma peri- o intra-linfatica, de forma intraganglionar o intraesplenica o de forma intramuscular, intraperitoneal e intratoracica. El paciente que esta siendo tratado es un animal de sangre caliente y, en particular, mairnferos, incluido el hombre. Los portadores, diluyentes, adyuvantes y vehnculos farmaceuticamente aceptables, asf como los portadores de implante se refieren generalmente a cargas solidas o lfquidas inertes, no toxicas, diluyentes o a material de encapsulamiento que no reacciona con los ingredientes activos de la invencion.
Las dosis pueden ser dosis individuales o multiples dosis durante un penodo de varios dfas. Cuando se administran composiciones de la presente invencion, se formulan generalmente en una forma inyectable de dosis unitaria (p. ej., solucion, suspension o emulsion). Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para la inyeccion incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la reconstitucion en soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El portador puede ser un medio disolvente o dispersante que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, o aceites vegetales.
La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. Los vehnculos no acuosos como el aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de mafz, aceite de girasol o aceite y esteres de cacahuete, como el miristato de isopropilo, tambien pueden utilizarse como sistemas disolventes para las composiciones de la invencion. Ademas, se pueden anadir diversos aditivos que mejoran la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las composiciones, incluidos los conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevencion de la accion de los microorganismos puede asegurarse por varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, y similares. En muchos casos, es deseable incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, cloruro sodico, y similares. La absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede ser producida por el uso de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Segun la presente invencion, sin embargo, cualquier vehnculo, diluyente o aditivo utilizado tendna que ser compatible con las citocinas o antfgenos exogenos de la invencion.
Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando las citocinas o los antfgenos exogenos utilizados en la practica de la presente invencion en la cantidad requerida del disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes, segun se desee.
Una formulacion farmacologica de la presente invencion se puede administrar al paciente en una formulacion inyectable que contenga cualquier portador compatible, tal como varios vehnculos, aditivos y diluyentes; o las citocinas y/o los antfgenos exogenos utilizados en la presente invencion se pueden administrar de forma parenteral al paciente en la forma de implantes subcutaneos de liberacion lenta o sistemas de entrega dirigidos tal como anticuerpos monoclonales, entrega vectorizada, iontoforetica, matrices polimericas, liposomas y microesferas. Ejemplos de sistemas de entrega utiles en la presente invencion incluyen los divulgados en las patentes de EE.UU.
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N.° 5.225.182; 5.169.383; 5.167.616; 4.959.217; 4.925.678; 4.487.603; 4.486.194; 4.447.233; 4.447.224; 4.439.196; y 4.475.196. Otros muchos implantes, sistemas de entrega y modulos son muy conocidos por los expertos en la tecnica.
Debe ser evidente que las composiciones son utiles para el tratamiento de enfermedades productoras de antfgenos tal como el cancer, enfermedades infecciosas o lesiones persistentes, como se ha comentado anteriormente. Las composiciones promueven inmunizacion contra los antigenos producidos por estas enfermedades mediante la estimulacion de respuestas inmunitarias en pacientes in vivo, cuyas respuestas inmunitarias ayudan a aliviar o eliminar los smtomas y efectos de la enfermedad en el paciente.
La discusion anterior proporciona una base objetiva para el uso de la presente invencion. Las composiciones de la invencion para su uso en los servicios divulgados en el presente documento se pueden demostrar mediante los ejemplos siguientes no limitantes y las figuras que se adjuntan.
Los ejemplos expuestos a continuacion describen la preparacion de IRX-2, una mezcla del citocinas segun esta invencion, los datos de las pruebas clmicas que demuestran el uso de IRX-2 como un adyuvante con los antigenos endogenos del tumor para estimular respuestas inmunitarias en pacientes con cancer, asf como experimentos en ratones y seres humanos que demuestran que el uso de mezcla de citocinas de la invencion con antigenos exogenos estimulan respuestas inmunitarias in vivo.
Mas espedficamente, el Ejemplo 1 siguiente describe la produccion de IRX-2, una composicion de citocinas segun la presente divulgacion. La produccion de IRX-2 se divulga en su totalidad en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.632.983 y 5.698.194.
El Ejemplo 2 siguiente divulga datos de pruebas clmicas en donde los pacientes con H&N SCC tratados con IRX-2 (en combinacion con dosis bajas de ciclofosfamida (CY), indometacina (INDO) y cinc) mostraron respuestas clmicas y patologicas significativas, que incluyen cambios ganglionares que indican la inmunizacion (p. ej., aumenta el tamano de los ganglios y disminuye la histiocitosis sinusal), infiltracion tumoral con linfocitos, y reduccion y fragmentacion tumoral. Los Ejemplos 4-7 se refieren a pacientes con cancer adicional, es decir, con linfoma, cancer de cuello uterino, cancer de fugado, y carcinoma de celula escamosa del pene (asociado al virus del papiloma humano), todos ellos tratados con el IRX-2 y que mostraban respuestas clmicas significativas al tratamiento. El Ejemplo 3 proporciona datos sobre el aumento de la supervivencia (de hasta 2 anos) de los pacientes con cancer de estos estudios.
Como se ha demostrado en el Ejemplo 2, el tratamiento con IRX-2 tambien produjo considerables aumentos en el recuento de linfocitos T en pacientes linfocitopenicos T y un aumento correspondiente en celulas T sin tratamiento previo (celulas T recien producidas no expuestas a antfgeno). Ademas, segun lo indicado por los datos del Ejemplo 8 siguiente, los aumentos en celulas T observadas en estos estudios eran espedficamente debidos al tratamiento con la composicion de citocinas de la divulgacion. Mas espedficamente, el Ejemplo 8 proporciona datos del tratamiento de los pacientes linfocitopenicos con cancer H&N SCC con solo IRX-2 (sin la administracion de acompanamiento de CY y/o de INDO), en donde se obtuvieron aumentos significativos en recuentos de linfocitos totales, asf como en poblaciones subconjuntos espedficas de celulas T CD3+ y CD4+.
De manera similar, los datos del Ejemplo 9 demuestran que IRX-2 promueve la diferenciacion y maduracion de celulas dendnticas, medidas por criterios morfologicos, fenotfpicos y funcionales. Como se indico anteriormente, las celulas dendnticas (DC) se sabe que desempenan un papel cntico en la inmunizacion de los pacientes a los antfgenos, es decir, en la presentacion del antfgeno a la celula T apropiada. Mas espedficamente, el Ejemplo 9 demuestra que el IRX-2 promueve cambios morfologicos en las DC indicativos de maduracion. Tambien se demostro que IRX-2 regulaba a la baja la expresion del antfgeno CD1a en la superficie de la celula DC, regulaba al alza la expresion del antfgeno CD83 y MHC Il en la superficie de la celula DC, y aumentaba la expresion de las moleculas co-estimuladoras y de adherencia de las celulas T, p. ej., CD86, CD40 y CD54 (ICAM-1), en la superficie de celulas DC. Ademas, se demostro que IRX-2 regulaba a la baja la actividad endodtica de las DC (que es consistente con la maduracion de las DC), para mejorar la actividad estimuladora de celulas T de las DC (como se demuestra por una mayor actividad MLR) y aumentar la produccion de IL-12 a partir de las DC, siendo IL-12 de por sf un factor esencial en la diferenciacion de las celulas T cooperadoras CD4+ (en celulas Th1) sin tratamiento previo y la activacion y proliferacion de componentes celulares y fagodticos del sistema inmunitario. Finalmente, se demostro que IRX-2 reduda la apoptosis inducida por VEGF de las DC. Este efecto anti-apoptotico de IRX-2 puede desempenar un papel crucial en el mantenimiento de la supervivencia de las DC maduras dentro de un contexto tumoral, permitiendo la presentacion y activacion prolongadas del antfgeno de los linfocitos T citotoxicos espedficos del antfgeno tumoral.
Los datos del Ejemplo 10 siguiente demuestran adicionalmente que IRX-2 es un potente activador de monocitos y macrofagos. Por ejemplo, IRX-2 aumenta significativamente los marcadores de activacion de los monocitos/macrofagos, es decir, HLA-DR, CD86, CD40 y CD80. Ademas, se demostro que el IRX-2 era un activador mas potente de monocitos/macrofagos que TNF-a o LPS y el IRX-2 podfa continuar activando las celulas incluso en presencia de la citocina IL-10 inmunosupresora.
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El Ejemplo 11 siguiente demuestra la capacidad de IRX-2 de provocar respuestas inmunitarias, es dedr, en la forma de respuestas de la DTH, asf como respuestas de anticuerpos, en ratones despues de la administracion de la composicion de citocinas en combinacion con conjugados de antigeno exogeno del peptido de membrana espedfico de prostata (PSMA). El IRX-2 era tambien eficaz en estimular respuestas de la DTH a los peptidos de PSMA no conjugados en seres humanos con cancer de prostata avanzado.
El Ejemplo 12 siguiente demuestra adicionalmente la eficacia de IRX-2 en combinacion con el antigeno exogeno PSMA. Ademas, IRX-2 se administro en combinacion con un PSMA irradiado que expresaba la vacuna basada en celulas o una vacuna conjugada de peptido sintetico y podfa mejorar las respuestas inmunitarias de celulas T in vivo a estos antigenos.
El Ejemplo 13 siguiente demuestra la eficacia de IRX-2 en combinacion con peptidos y el adyuvante incompleto de Freund en mejorar las respuestas inmunitarias de celulas T in vivo a estos antigenos. Los resultados de los experimentos demuestran que el IRX-2 se puede combinar con eficacia con las vacunas contra el cancer de multi- antigenos, asf como las vacunas basadas en celulas.
El Ejemplo 14 siguiente demuestra adicionalmente la eficacia de IRX-2 en combinacion con otros adyuvantes que incluyen CpG, Poli I:C, IFN-y y el adyuvante incompleto de Freund. Ademas, IRX-2, en combinacion con estos otros adyuvantes, podfa mejorar respuestas de celulas T espedficas del antfgeno in vivo y la actividad citotoxica de las celulas T espedficas del antigeno. IRX-2, cuando se inclrna como parte de una vacuna que inclrna CpG, Poli I:C, IFN-y y el adyuvante incompleto de Freund era eficaz cuando se da como solo disparo en potenciar las respuestas espedficas del antfgeno de la celula de T.
El Ejemplo 15 siguiente demuestra la eficacia de IRX-2 en el aumento de las respuestas de celulas B y celulas T en combinacion con una vacuna basada en virus. Ademas, IRX-2 realza las respuestas de las celulas B y de las celulas T cuando se utilizaba en combinacion con una vacuna basada en virus que expresa la tnada TRICOM de moleculas co-estimuladoras.
Ejemplos
Todos los pasos relacionados con el cultivo celular se realizan en condiciones esteriles. Los procedimientos generales de inmunologfa celular no descritos en el presente documento se realizan como se describe en las referencias generales para tecnicas de inmunologfa celular como Mishell y Shiigi (Selected Methods in Cellular Immunology, 1981) y son bien conocidas por los expertos en la tecnica.
Ejemplo 1
Preparacion de biologico derivado de celulas primarias (IRX-2)
El procedimiento de elaborar el biologico derivado de celulas primarias se describe, en general, en la solicitud de patente provisional de EE.UU. N.° 61/044674. Las celulas mononucleares (MNC) se purifican para retirar las celulas contaminantes cargando leucocitos sobre el medio de separacion de linfocitos (LSM) y centrifugando el medio para obtener MNC purificados con un sistema automatizado de procesado y lavado de celulas. Las MNC se almacenan despues durante la noche en una bolsa de FEP de almacenaje de linfocitos. Una mezcla de induccion de las MNC se estimula con un mitogeno, preferiblemente fitohemaglutinina (PHA), y ciprofloxacina en un dispositivo desechable de cultivo celular y un biologico derivado de celulas primarias se produce a partir de MNC. El mitogeno se retira de la mezcla de induccion por filtracion y modo de filtracion de flujo tangencial, y despues la mezcla de induccion se incuba. La mezcla de induccion se clarifica filtrando para obtener un sobrenadante de biologico derivado de celulas primarias. Por ultimo, se elimina el sobrenadante biologico derivado de celulas primarias del ADN y agentes accidentales mediante la aplicacion de la cromatograffa de intercambio anionico y filtracion de 15 nanometros y, opcionalmente, la desactivacion posterior por ultravioleta C (UVC). El producto final puede entonces ser vializado y almacenado para la futura administracion a un paciente.
Ejemplo 2
Las inyecciones perilinfaticas locales en el cuello con IRX-2, ademas del tratamiento con dosis bajas de CY (de 300 mg/irr), INDO (25 mg por via oral tres veces al dfa), y cinc (65 mg de cinc elemental como sulfato por via oral una vez al dfa) han inducido regresiones clmicas en un alto porcentaje de pacientes con cancer de cabeza y cuello de celulas escamosas (H&NSCC) (Hadden, 1994; Meneses, 1998; Barrera, 2000; Hadden, 2003; Menesis, 2003) con evidencia de mayor supervivencia, sin reaparicion. En general, la inclusion de respuestas menores (25 %-50 %), la contraccion tumoral y la reduccion del tumor en espedmenes patologicos, mas del 90 % respondieron y la mayona tuvo una reduccion del tumor superior al 50 %.
Se especula con que estas respuestas eran mediadas por regresion inmunitaria dado que se observo que ambos linfocitos B y T se infiltraban en los tumores. La terapia no estaba asociada con una toxicidad significativa. El tratamiento de los pacientes con cancer linfocitopenico con la combinacion de IRX-2 ha dado lugar a la movilizacion de linfocitos marcados; cuando se analizaron, estos pacientes mostraron aumentos en las celulas T positivas CD45RA (es decir, celulas T sin tratamiento previo (vease la siguiente Tabla I)). Ademas, la inyeccion intratumoral o
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peritumoral de IRX-2 en pacientes con H&NSCC dio lugar a revertir la regresion del tumor inducida por inmunoterapia o a la progresion del tumor. El tumor no es, por ello, el sitio de la inmunizacion. En lugar de eso, el analisis de los ganglios linfaticos regionales revelo que el ganglio linfatico regional es el sitio de inmunizacion para los antfgenos de tumores propuestos (Meneses, 2003; veanse las Figuras 1-5). Ningunos de estos pacientes tratados con IRX-2 desarrollaron la metastasis que se habna esperado en el 15 % de los pacientes clmicamente y hasta el 50 % patologicamente. Estos resultados indican que se ha inducido inmunidad sistemica en lugar de la inmunidad simplemente local. Los pacientes fueron previamente examinados con una prueba cutanea a 0,1 ml de IRX-2 antes del tratamiento y mas del 90 % de aquellos con una prueba cutanea positiva (>0,3 mm a las 24 horas) tuvieron respuestas clmicas y patologicas robustas. Los pacientes con pruebas cutaneas negativas teman debil o ninguna respuesta. Asf, las pruebas cutaneas seleccionan a las personas con buena respuesta al tratamiento.
Los principales aumentos se observaron en los recuentos de linfocitos T (CD3) 752^1.020 en estos pacientes linfocitopenicos T (recuento de celulas T de 752 frente a 1.600 (normal)). Lo importante es que hubo un aumento correspondiente en celulas T positivas "sin tratamiento previo" CD45RA (532^782). Como se menciono anteriormente, en general no se piensa que estos aumentos aparezcan en adultos particularmente con una terapia farmacologica como IRX-2. Presumiblemente, estas celulas son recien llegados del timo y podnan ser consideradas una mayor nueva capacidad para responder a nuevos antfgenos como antfgenos tumorales. Las celulas positivas CD45RA preexistentes no respondieron a los antfgenos tumorales y pueden haber sido incapaces de hacerlo debido a la inmunosupresion inducida por el tumor (anergia).
Tabla I: Tratamiento de pacientes linfocitopenicos con H&NSCC con IRX-2. Aumentos de celulas T sin tratamiento previo en sangre (numero/mm)
MARCADOR DE CELULAS T SIN TRATAMIENTO PREVIO MARCADOR DE CELULAS PAN T
PACIENTE N.°
PRE POST AUMENTO PRE POST AUMENTO
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479 778 +299 704 1.171 +467
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938 1.309 +371 1.364 1.249 -115
3
98 139 +41 146 178 +32
4
341 438 +97 655 590 -65
5
567 652 +97 453 643 + 190
6
658 1.058 +400 1.118 1.714 +569
7
642 1.101 +459 822 1.601 +779
MEDIA
532 782 +250 752 1.020 +269
La documentacion (Hadden JW, Int'l J Immunopharmacol 11/12:629-644, 1997; Hadden JW, Int'l J Immunopharmacol 21:79-101, 1999) indica que para sCc y adenocarcinomas, los dos principales tipos de cancer, los ganglios linfaticos regionales reflejan anomalfas relacionadas con el tumor, que incluyen histiocitosis sinusal, agotamiento linfoide y, a menudo, la presencia de linfocitos asociados al tumor capaces de reaccionar con celulas tumorales (IL-2). Con metastasis, aparecen el agotamiento linfoide y la funcion deprimida. Un analisis no publicado de ganglios linfaticos de cuello uterino no implicados en 10 pacientes con H&NSCC mostraron reduccion en el tamano medio del ganglio linfatico y un aumento en la histiocitosis sinusal asociada a H&NSCC (veanse los controles de las Figuras 1-4A y B de la presente solicitud).
Despues del tratamiento con un ciclo del protocolo IRX-2 (Hadden, 1994; Meneses, 1998; Barrera, 2000), los ganglios linfaticos de cuello uterino no implicados mostraron los cambios indicados en las Figuras 1-4. En comparacion con los ganglios linfaticos regionales de pacientes con H&NSCC no tratados con IRX-2, estos ganglios mostraron significativos aumentos de tamano, area de celulas T y densidad, y disminuciones de histiocitosis sinusal y congestion. Los ganglios linfaticos de los pacientes tratados estaban todos estimulados y eran mayores que los ganglios de control con mayores areas de las celulas T y densidades. Estos ganglios eran asf no solo restaurados a
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la normalidad, sino que mostraron evidencia de predominio de celulas T, un positivo conocido que guarda relacion con la supervivencia en H&NSCC (Hadden, 1997).
Lo importante es que, cuando los cambios en los ganglios linfaticos relacionados con areas de celulas B y T se correlacionaron con los cambios en sus tumores que reflejan la infiltracion de celulas T y B, se obtuvo un alto grado de correlacion para las celulas T (p<0,01) y las celulas de B (<0,01) y presencia linfoide global (p<0,001) (Figura 5). A su vez, estos cambios se correlacionaron con la reduccion del tumor por criterios patologicos y clmicos. Estos hallazgos indican que las reacciones del tumor estan directa y positivamente correlacionadas con los cambios en los ganglios linfaticos y que la reaccion del tumor refleja los cambios en los ganglios linfaticos como variable dependiente. Estos hallazgos, junto con el conocimiento acerca de como trabaja el sistema inmunologico en general (Roitt, 1989) y siguiente transfeccion tumoral con un gene de citocinas (Maass, 1995), indican que el protocolo IRX-2 inmuniza a estos pacientes contra antfgenos tumorales endogenos a nivel de los ganglios linfaticos. Previamente, no se han presentado pruebas de los cambios en los ganglios linfaticos que reflejen inmunizacion con antfgenos tumorales autologos. Esto confirma que esta composicion puede inducir inmunizacion con antfgenos tumorales previamente ineficaces o poco eficaces en un efecto para producir la regresion de la metastasis a distancia.
Ejemplo 3
Analisis adicionales de los datos clmicos, patologicos y de supervivencia del estudio de las pruebas clmicas antes mencionadas ofrecen mas ideas sobre la naturaleza de las composiciones en lo que se refiere a la inmunizacion de pacientes con cancer con sus propios antfgenos tumorales autologos y la regresion inmunitaria resultante de sus tumores. La Figura 6 muestra que el tratamiento con el protocolo lRX-2 esta asociado con un aumento de la supervivencia en 48 meses (p<0,01). La Figura 7 muestra que las respuestas clmicas positivas se correlacionan con la supervivencia, es decir, los pacientes con respuestas completas (CR) o respuestas parciales (PR) (>50 % de reduccion tumoral) tienen una mejor supervivencia que aquellos con respuestas menores (MR) (<50 %, pero reduccion tumoral >25 %) o ninguna respuesta (NR) (<25 %) (p<0,01). La Figura 8 muestra que los pacientes con respuestas patologicas mas fuertes (mdice de 6-9) tienen una mejor supervivencia que aquellos con respuestas patologicas mas debiles (<6) (p<0,02). La Figura 9 muestra que la infiltracion linfoide en el tumor como una sola variable predice la supervivencia (p<0,01). La prueba de la ji al cuadrado de la relacion de la respuesta clinica a la respuesta patologica muestra una relacion muy significativa (p<0,01) que indica que los dos se correlacionan entre sf, asf como con la supervivencia, proporcionando de ese modo una triangulacion estadfstica de los datos que interrelacionan las respuestas clmicas, parametros de regresion inmunitaria y supervivencia. Nunca se han demostrado tales relaciones en la inmunoterapia de un cancer humano.
Por ultimo, la Figura 10 presenta una curva de respuesta a la dosis para el IRX-2 de la presente divulgacion, que relaciona la dosis con la supervivencia global a los veinticuatro meses. El tratamiento con IRX-2 tiene un impacto optimo sobre la supervivencia de aproximadamente 100-233 unidades internacionales de equivalencia de IL-2.
Ejemplo 4
Dos pacientes con linfoma de cabeza y cuello se trataron segun el protocolo que se describio anteriormente. Se siguio el siguiente esquema.
Antes del tratamiento, los pacientes se sometieron a pruebas cutaneas con IRX-2 de 0,1 ml inyectados por via subcutanea en el antebrazo, la region se marco, y 24 horas despues, se leyo la prueba. La prueba se consideraba positiva si la induccion y el eritema eran iguales o superiores a 3 mm.
Caso 1:
El paciente era un varon de 23 anos que presentaba antecedentes de una presencia de tres meses de un tumor en la region submaxilar izquierda, sin otros smtomas. En la sala de urgencias, se encontro que tema adenopatfa linfatica del triangulo submaxilar izquierdo de aproximadamente 6,5 cm de diametro de consistencia dura, parcialmente fijada a niveles profundos. El resto del examen ffsico era normal. La biopsia incisional mostro el linfoma de Hodgkin. La lesion era ECIIA escalonada. Se administro un tratamiento de un ciclo de IRX-2, obteniendo una respuesta menor, ya que la adenopatfa se redujo en tamano en 1 cm de diametro. El informe de la biopsia obtenido despues del tratamiento con IRX-2 mostro que el 60 % de la lesion mostraba una infiltracion linfocitica normal, y el resto de la neoplasia (40 %) mostraba necrosis. No se encontraron celulas Tumorales viables.
Despues de esto, el paciente recibio tratamiento de radiacion en el cuello de 3.600 rad. El paciente estaba libre de la enfermedad a los dos anos.
Caso 2
El paciente es un varon de 82 anos que presentaba un historial dos meses de una masa tumoral dolorosa a mitad del cuello, asf como una perdida de peso de 10 kg. En el examen ffsico, el paciente se presento con un tumor en la airngdala palatina derecha, que se agrandaba hasta aproximadamente 4 x 3 cm, con una ulcera en el centro de la airngdala. En el cuello, un ganglio linfatico submaxilar derecho media aproximadamente 2 x 2 cm y una masa del ganglio linfatico a niveles II y III de aproximadamente 5 x 5 cm. El resto del examen era normal. La biopsia incisional
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de la airngdala y uno de los ganglios linfaticos del cuello mostraron un linfoma no hodgkiniano definido mixto, de grado intermedio.
El paciente se sometio a dos ciclos de IRX-2 al final de los cuales se observo una reduccion de 1 cm en el diametro de la airngdala y adenopatfa del cuello. El informe patologico posterior al tratamiento con IRX-2 mostro 20 % de tumor vivo, 30 % de fragmentacion y necrosis tumoral, y 50 % de infiltracion normal de linfocitos.
El paciente recibio quimioterapia (CHOP) durante 6 ciclos y luego radioterapia (RT) externa a una dosis total de 4.600 rad. Reaparecio a los ocho meses despues de la RT con adenomegalia a nivel occipital. El paciente murio tres meses despues con evidencia de enfermedad en el cuello.
Ejemplo 5
Diez pacientes con cancer de cuello uterino en etapa temprana no tratado, estadificados clmicamente IB1, IB2 e IIA, fueron tratados con inyecciones perilinfaticas locales de IRX-2 (10 inyecciones diarias) seguidas de histerectoirna radical el dfa 21. Un dfa antes de comenzar el tratamiento con IRX-2, los pacientes recibieron una sola dosis IV de CY de 300 mg/m. Se administraron por via oral INDO o ibuprofeno y sulfato de zinc desde el dfa 1 al 21. Se evaluaron la respuesta clinica y patologica, la toxicidad y la supervivencia libre de la enfermedad.
Todos los pacientes completaron el tratamiento con IRX-2 y fueron evaluados en cuanto a su respuesta y toxicidad. La respuesta clinica se observo en el 50 % de los pacientes (3 respuestas parciales (PR), 2 respuestas menores (MR) (reduccion >25 %<50 %)). Siete pacientes fueron sometidos a cirugfa. Patologicamente, en cinco casos se encontro reduccion tumoral asociada con la fragmentacion tumoral. Habfa un patron heterogeneo de tipos de celulas que se infiltran en el tumor, que incluia linfocitos, celulas plasmaticas, neutrofilos, macrofagos y eosinofilos. El tratamiento era bien tolerado excepto por dolor leve y algo de sangrado durante la inyeccion e intolerancia gastrica a INDO. A los 24 meses de seguimiento, nueve pacientes estaban libres de la enfermedad.
Este estudio muestra que el tratamiento con IRX-2 induce la respuesta tumoral mediada por el sistema inmunitario en el carcinoma de cuello uterino en etapa temprana no tratado.
Ejemplo 6
Dos pacientes con metastasis hepatica de carcinoma hepatocelular primario se trataron con IRX-2 intraesplenico (1 o 3 inyecciones). El protocolo era como se describio anteriormente para los casos de H&NSCC, de cuello uterino o de linfoma. Un paciente con carcinoma hepatocelular avanzado tuvo una respuesta parcial confirmada por tomograffa. El otro tema una respuesta parcial confirmada por cirugfa. El examen histologico mostro una disminucion, fragmentacion e infiltracion linfoide del tumor.
Ejemplo 7
Cuatro pacientes con carcinoma de celula escamosa del pene (asociado al virus del papiloma humano) se trataron con el protocolo IRX-2 como se describio anteriormente; los cuatro teman respuestas parciales clmicamente y los espedmenes quirurgicos mostraron una disminucion y fragmentacion del tumor y caractensticas de infiltracion linfoide de los pacientes con cancer H&NSCC.
Ejemplo 8
Correccion por IRX-2 de linfocitopenia T
El objetivo del siguiente experimento era evaluar el efecto de un tratamiento de 10 inyecciones diarias de IRX-2 que contema las seis citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-y y TNF-a (115 unidades de equivalencia de IL-2/dia) en recuentos de linfocitos (LC) de pacientes linfocitopenicos. Estos pacientes se habfan recuperado de cirugfas y radioterapia previas del cancer de cabeza y cuello, y teman linfocitopenia persistente con recuentos medios de 441 celulas/mm3 Los niveles normales de LC son 2.000 celulas/mm3 Los pacientes estaban libres de cancer en el momento del tratamiento. Los LC se obtuvieron en el dfa 0 y el dfa 13. Los linfocitos T (CD3+) y los subconjuntos de celulas T (CD4+ o CD8+) se evaluaron mediante citofluorometna. La Tabla II presenta los datos de cinco pacientes con buena respuesta al tratamiento. Se observaron aumentos significativos de los LC, para las celulas T CD3+ y CD4+.
Tabla II
Numero del paciente
TLC* CD3* CD4* CD8
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100 83 28 40
2
136 62 52 55
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Numero del paciente
TLC* CD3* CD4* CD8*
3
100 63 24
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100 74 331 -20
5
100 166 173 -16
Media ± SEM
107 ± 7 90 ± 19 122 ± 59 12 ± 15
*Cambios en el numero de celulas por mm desde el d^a 0 al dfa 13.
Estos cambios se comparan favorablemente con los alcanzados por dosis mucho mas altas de interleucina 2 pegilada (3 x 106 unidades de IL-2 recombinante) en pacientes con SIDA linfocitopenicos (T. Merigan, comunicado personal) pero con menos toxicidad. Son menores a las alcanzadas con infusiones de 8 dfas de >10 x 106 unidadesMa de IL-2 en pacientes con SIDA; sin embargo, este ultimo requirio grandes gastos, inconvenientes y tema una toxicidad significativa (Kovaks, 1997). Estos resultados con IRX-2 se obtuvieron en ausencia de INDO y CY y, por ello, muestran que el efecto del regimen sobre LC es el de la composicion de IRX-2 de la divulgacion.
Ejemplo 9
IRX-2 estimula la maduracion y activacion de celulas dendnticas:
En experimentos previos, se aislaron ganglios linfaticos de cinco pacientes H&NSCC tratados con IRX-2 y cinco pacientes de control con H&NSCC no tratados y se analizaron los constituyentes celulares mediante citometna de flujo usando un panel de marcadores de superficie celular para celulas dendnticas (es decir, CD83+, CD86+, y CD68+). Como se indico anteriormente, la histiocitosis sinusal es una patologfa de los ganglios linfaticos que se observa en algunos pacientes con cancer que se caracteriza por la acumulacion en los ganglios linfaticos de histiocitos grandes que representan celulas dendnticas inmaduras. Como se demuestra en la Figura 11A, los pacientes con SH (SH+) tienen una acumulacion de las DC CD68+, CD83+, CD86- en sus ganglios linfaticos, mientras que aquellos sin SH perceptible tienen pocas celulas CD83+. Sin embargo, el tratamiento con IRX-2 dio como resultado un aumento de cinco veces en el numero de las DC CD86+ (simultaneo con CD68+, CD83+) en comparacion con controles de cancer no tratado, lo que indica una conversion a un fenotipo DC "activado". Los controles son pacientes con H&NSCC no tratado en comparacion con pacientes con cancer tratado con IRX-2 (vease la Figura 11B).
Dado que la histiocitosis sinusal representa una acumulacion de las DC parcialmente maduradas que supuestamente llevan peptidos tumorales endogenos, la maduracion y activacion completas con expresion del receptor coestimulador cD86 refleja el uso del IRX-2 de la presente divulgacion para corregir este defecto en la maduracion y permitir la presentacion eficaz del antfgeno a las celulas T. El IRX-2 de la presente divulgacion invierte, por ello, la histiocitosis sinusal y conduce a la inmunizacion eficaz de las celulas T sin tratamiento previo.
Los datos descritos anteriormente y los datos posteriores contenidos en Meneses et al. (2003) mostraron que el tratamiento de pacientes con H&NSCC utilizando IRX-2 perilinfatico, dosis bajas de CY e INDO revertfa la histiocitosis sinusal a menudo evidente en los ganglios linfaticos de este y otros canceres. Sin embargo, a partir de estos datos no era evidente cual de los agentes anteriores, IRX-2, CY y/o INDO, corregfa este defecto.
Los siguientes datos presentan evidencia de que IRX-2 que contiene las seis citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-y y TNF-a induce la maduracion y activacion de DC en ausencia de CY y/o INDO. El IRX-2 utilizado en estos experimentos contiene las seis citocinas enumeradas anteriormente o como se muestra en la Tabla III a continuacion. Para los fines de estos experimentos, las concentraciones de IRX-2 se expresan como la concentracion de la TNF-a contenida en IRX-2. La concentracion de citocina en IRX-2, incluido TNF-a, se midio mediante ELISA y la pureza de TNF-a recombinante es >95 %. Para todos los experimentos, excepto las titulaciones, se uso IRX-2 a una concentracion de 1 ng/ml.
Tabla III: Niveles de citocinas en la formulacion de IRX-2 Lote 041304 (ng/ml)
IL-1P IL-2 IFN-y TNF-a IL-8 IL-6 IL-10 G-CSF GM-CSF
0,3 4,2 2,2 1,0 25,2 0,7 0,03 0,06 0,4
El medio utilizado era RPMI 1640, complementado con 2 mM de L-glutamina, 50 pg/ml de estreptomicina, 50 U/ml
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de penicilina y 10 % de FBS (todos los reactivos adquiridos en Cellgro, Herndon, VA). GM-CSF, TNF-a y VEGF165 se compraron de Peprotech (Rocky Hill, NJ). X-VIVO 10 se adquirio de BioWhittaker (Walkersville, MD). LPS se adquirio de Sigma (St. Louis, MO). Todos los reactivos se analizaron para determinar la contaminacion por endotoxina con la prueba sensible de lisado de amebocitos de Limulus (ensayo LAL; BioWhittaker) segun las instrucciones del fabricante y resultaron negativos. Se descubrio que todas las soluciones conteman menos de 0,06 EU/ml, el Kmite de deteccion mas bajo. Ademas, todos los artfculos de plastico estaban exentos de pirogenos.
Las PBMC usadas en estos experimentos se obtuvieron a partir de 30 ml de capa leucocitaria de donantes sanos enriquecida en leucocitos mediante centrifugacion con centrifugacion Ficoll-Hypaque (Cellgro, Herndon, VA), y se recupero la fraccion de ligera densidad de la interfaz 42,5-50 %. Las celulas se volvieron a suspender en medio de cultivo y se dejaron adherir a placas de 6 pocillos (Costar, Cambridge, MA). Despues de 2 horas a 370 °C, las celulas no adherentes se eliminaron mediante lavado y celulas adherentes (~90 % de celulas CD14+, es decir, monocitos) se cultivaron en 3 ml de medio complementado con 50 ng/ml de GM-CSF (500 U/ml) y 50 ng/ml de IL-4 (500 U/ml).
Para el analisis de marcadores de superficie, se usaron los siguientes mAb conjugados con fluorocromos (todos de BD Pharmingen, San Diego, CA): CD86-PE, CD80-FITC, CD54-APC, CD83-PE, HLA-DR-FITC, CD1a-APC, CD40- FITC y el analisis inmunofenotfpico con controles de isotipo apropiados, se realizo usando FACS. Las celulas (0,25 x 106) se lavaron en PBS complementado con 2 % de FBS y 0,1 % de NaN3 (tampon de lavado FACS) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con mAb conjugados con APC, PE o FITC o con el mAb emparejado con el isotipo correspondiente. El exceso de mAb se elimino mediante lavado en tampon de lavado FACs. Los resultados se expresaron como intensidad media de fluorescencia o porcentaje de celulas que expresaban el antfgeno especificado. El analisis de fluorescencia se realizo en un citometro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Rockville, MD) despues de la adquisicion de 10.000 episodios y se analizo con el software CellQuest de BD Biosciences (Rockville, MD).
Como se demuestra en la Figura 12, la composicion de IRX-2 de la divulgacion aumento el numero de las DC que llevan el antfgeno CD83, un marcador clave de la maduracion de las DC. Mas espedficamente, se cultivaron PBMc adherentes durante 7 dfas en presencia de GM-CSF e IL-4 como se ha descrito anteriormente y luego se estimularon con cantidades crecientes ya sea de TNF-a recombinante (PeproTech) o de IRX-2. Despues de 48 horas, las celulas se lavaron y se analizaron para determinar la expresion de CD83 por citometna de flujo. La Figura 12 indica que IRX-2 es activo para inducir la maduracion de las DC, como se evidencia por un aumento en las celulas CD83+. Ademas, IRX-2 era mas activo en la induccion de la maduracion de las DC que una dosis equivalente de TNF-a solo. Los datos en la Figura 12 se representan como la media de 5 experimentos individuales ± SEM (p<0,0001, mediante ANOVA).
Estos datos indican que IRX-2 promueve la maduracion de las DC y lo hace de una manera que no puede explicarse por ninguna citocina aislada contenida en la mezcla de IRX-2 que se sabe que actua sobre la maduracion de las DC. Por ejemplo, la diferenciacion normal in vitro de PBMC requiere la presencia de 100-500 U/ml de GM-CSF (aproximadamente 10-50 ng/ml) y 500-1.000 U/ml de IL-4 (50-100 ng/ml). Esto genera una poblacion de celulas comprometidas con el linaje de las DC, pero en un estado relativamente inmaduro (expresion baja/moderada de CD86, CD40, HLA-DR, nula para CD83). El IRX-2 no diluido tiene cantidades indetectables de IL-4 y contiene concentraciones 10 a 50 veces menores de GM-CSF (aproximadamente 1,1 ng/ml) que las que se requieren para la diferenciacion in vitro de las DC. Por ello, las citocinas individuales de IL-4 y GM-CSF en el IRX-2 no pueden dar cuenta de las celulas CD83+ producidas en los cultivos de la Figura 12.
El TNF-a puede inducir tales celulas, pero a concentraciones muy superiores a las contenidas en el IRX-2 de la divulgacion (vease la Figura 12). Por ejemplo, despues del compromiso inicial con el linaje de celulas dendnticas (mediante varios dfas de GM-CSF + IL-4 in vitro), la adicion posterior de una "senal de peligro" como la derivada de un patogeno (por ejemplo, LPS) induce un fenotipo de celula dendntica completamente madura que incluye una expresion alta/fuerte de CD86, Cd40, HLA-DR y la presencia de CD83. El TNF-a en el intervalo de 20-50 ng/ml puede imitar en gran medida dicha senal de peligro derivada del patogeno, dando como resultado una regulacion al alza de los mismos marcadores. Sin embargo, la mezcla de IRX-2 no diluida tiene solo 2,8 ng/ml de TNF-a de promedio, muy por debajo de las concentraciones de TNF-a requeridas para la completa maduracion de las DC. Por ello, los resultados representados en la Figura 12 muestran claramente que, a las concentraciones equivalentes de TNF-a utilizadas en este experimento, la induccion del marcador CD83 por IRX-2 no puede deberse unicamente a la presencia del TNF-a en la mezcla IRX-2.
Dado que se sabe que las DC experimentan cambios morfologicos distintos a medida que progresan desde celulas inmaduras a maduras, las DC inmaduras se trataron con IRX-2 para determinar si el tratamiento con IRX-2 cambiaba la morfologfa de las celulas. Mas espedficamente, se cultivaron PBMC adherentes en presencia de GM- CSF (500 U/ml) e IL-4 (500 U/ml) durante 4 dfas como se ha descrito anteriormente (cuyo tratamiento se sabe que produce DC inmaduras) y luego se trataron con IRX-2 o se dejaron sin tratamiento, como controles. Despues de 3 dfas, las celulas se visualizaron mediante tincion y microscopfa Wright. Como se muestra en la Figura 13, las celulas tratadas con IRX-2 (Figura 13B) presentaron proyecciones celulares caractensticas y motilidad de las DC maduras, y extendieron y retrajeron continuamente sus procesos y velos celulares. Estas celulas teman grandes nucleos con forma irregular, numerosas vesfculas, relativamente pocos granulos citoplasmaticos, y proyecciones celulares
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perceptibles y abundantes en comparacion con los controles no tratados (Figura 13A). Por ello, el tratamiento con IRX-2 dio como resultado DC que posefan una t^pica morfolog^a de DC maduras.
Ademas, se sabe que la transicion prototfpica de las DC desde inmaduras a maduras da como resultado aumentos y disminuciones bien caracterizados en ciertos antigenos de la superficie celular. Por ejemplo, las DC inmaduras expresan altos niveles de CD1a, y despues de encontrarse con estimulos tales como citocinas o productos bacterianos, este marcador es regulado a la baja. Por ello, para determinar si el tratamiento con IRX-2 daba como resultado la ganancia o perdida de marcadores de superficie celular asociados con la activacion y maduracion de DC, se cultivaron PBMC (monocitos) adherentes tratados con GM-CSF e IL-4 (como se describio anteriormente) durante 7 dfas y luego se incubaron durante 48 horas con o sin IRX-2. La expresion de CD1a, HLA-DR, CD86, CD40 y CD54 se examino mediante citometna de flujo y se expreso como intensidad media de fluorescencia.
Como se demuestra por los histogramas de la Figura 14, el tratamiento con IRX-2 de las DC inmaduras (indicado por lmeas continuas en los histogramas) dio como resultado la regulacion a la baja de la expresion de CD1a (147 frente a 62) asf como la regulacion al alza de la expresion de MHCII (455 frente a 662). Ademas, el tratamiento con IRX-2 condujo a un aumento en el tamano de las celulas y una disminucion en la granularidad (datos no mostrados). Los controles no tratados se indican mediante lmeas discontinuas en cada histograma. Los valores medios para las DC no tratadas se muestran en la esquina superior izquierda de los paneles; los valores respectivos para las DC tratadas con IRX-2 se muestran en la esquina superior derecha. Los histogramas que se muestran son de un experimento representativo y los valores representan los resultados medios de al menos 10 experimentos individuales (* = p<0,05, ** = p<0,002, *** = p<0,00005, prueba t de Student pareada). Tal como se indica adicionalmente en la Figura l4, el tratamiento con IRX-2 mejoraba la expresion de moleculas superficiales coestimuladoras CD86 (tambien conocido como B7-2) (193 frente a 390), CD40 (46 frente a 75) y CD54 (tambien conocido como molecula de adhesion intercelular 1 o ICAM-1) (1.840 frente a 3.779). Todos estos cambios en la expresion del marcador de superficie indican que el IRX-2 es un potente efector de la activacion de las DC.
Segun su papel como celulas presentadoras de antfgeno, las DC inmaduras tienen una alta actividad endodtica y captan activamente antfgenos. Tras la maduracion, esta actividad se regula a la baja, con lo cual la DC se involucra en el procesamiento y presentacion del antfgeno. En condiciones fisiologicas, la regulacion a la baja de la endocitosis de APC se asocia con un aumento en los complejos peptido/MHC en la superficie que conduce a una estimulacion mejorada de las celulas T. Para probar la influencia de IRX-2 en la endocitosis, las DC se incubaron con cantidades crecientes de IRX-2 y se determino la capacidad de internalizar FITC-dextrano. Mas espedficamente, los PBMC (monocitos) adherentes se trataron con GM-CSF e IL-4 (como se describio anteriormente) durante cuatro dfas y luego se estimularon con TNF-a (a 1 pg/ml) o con concentraciones crecientes de IRX-2 (IRX-2) hasta el equivalente de 1 ng/ml de TNF-a. Despues de 18 horas, las celulas se incubaron con FITC-dextrano (Sigma, St. Louis, MO), que se anadio hasta una concentracion final de 1 mg/ml. Las celulas se cultivaron durante 30 minutos a 370 C. Despues de la incubacion, las celulas se lavaron cuatro veces con PBS enfriado con hielo y se analizaron mediante citometna de flujo como se describio anteriormente.
Como se muestra en la Figura 15, las DC inmaduras incubadas con IRX-2 (drculos en negro) regularon a la baja la endocitosis de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con TNF-a (drculos en blanco) a la dosis correspondiente encontrada en el IRX-2 tema mmimos efectos. El tratamiento de DC inmaduras con mayores cantidades de TNF-a (10-25 ng/ml) dio como resultado la regulacion a la baja de la actividad endodtica como se esperaba (datos no mostrados). Los datos de la Figura 15 se muestran como el porcentaje de intensidad media de la fluorescencia de las DC estimuladas frente a las no estimuladas y son la media de 4 experimentos independientes ± SEM (p<0,00001, mediante ANOVA). Estos experimentos indican que el IRX-2 de la divulgacion regula a la baja la actividad endoctica de las DC, una indicacion de la maduracion de las DC.
A continuacion, se evaluo la capacidad de IRX-2 para mejorar la capacidad estimuladora de las celulas T de las DC. Las DC activadas y maduras son potentes estimuladores de las celulas T sin tratamiento previo. Para demostrar que el tratamiento con IRX-2 se tradujo en efectos funcionales, asf como en los cambios fenotfpicos y morfologicos resenados anteriormente, se evaluo la influencia de IRX-2 en la capacidad estimuladora de las celulas T de las DC en un ensayo de proliferacion de la reaccion de linfocitos mixtos (MLR).
Mas espedficamente, los PBMC (monocitos) adherentes se trataron primero con GM-CSF e IL-4 (como se ha descrito anteriormente) durante siete dfas y luego se estimularon con o sin IRX-2. Despues de 48 horas, las DC tratadas con IRX-2 o no tratadas se recogieron y ensayaron en una MLR de la siguiente manera: las DC purificadas se cultivaron conjuntamente con 1 x 105 celulas T de un donante no relacionado en proporciones de DC:celulas T de 1:5, 1:10, 1:30 y 1:100. Se prepararon celulas T alogenicas pasando PBMC purificadas de capas leucocitarias mediante centrifugacion en gradiente de Ficoll-Hypaque sobre una columna de lana de nailon. Los ensayos se realizaron por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Nada de IRX-2 estaba presente durante el ensayo de MLR. Despues de 5 dfas de cultivo conjunto de celulas DC-T, los pocillos se pulsaron durante 18 horas con BrDU. La incorporacion de BrDU se midio usando un ensayo colorimetrico de incorporacion de BrDU (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
Como se muestra en la Figura 16, las DC expuestas a IRX-2 (cuadrados en negro) dos dfas antes del cultivo conjunto eran mas potentes para inducir una respuesta de proliferacion de celulas T que las DC no tratadas (drculos
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en blanco), confirmando que las DC tratadas con IRX-2 son funcionalmente competentes. Los datos de la Figura 16 se expresan como mdice de estimulacion que se define como ((d.o. de DC estimuladas con celulas T - d.o. de DC solas)/(d.o. de celulas T en reposo) ± sEm y son el resultado medio de 4 experimented individuales (p<0,05, mediante ANOVA).
Es importante senalar que no hada IRX-2 en los cultivo conjuntos y que el aumento observado en la estimulacion de las celulas T se deda a los efectos estimuladoras de IRX-2 en las DC, en lugar de a un efecto directo del IRX-2 en las celulas T. Asf, el IRX-2 de la divulgacion mejora la actividad estimuladora de las celulas T de las DC, como se muestra por la mayor proliferacion en reacciones alogenicas de MLR. Ademas, anteriormente se demostro que IRX- 2 aumentaba la expresion de ICAM-1 (CD54). Se ha demostrado que este ligando accesorio de la superficie celular esta implicado en la senalizacion a traves de LFA-1 y da como resultado un sesgo hacia un fenotipo Th1 (Rogers, 2000). En un contexto oncologico, la consecuencia funcional de estos efectos es que las DC tratadas con IRX-2 polarizanan la respuesta de las celulas T hacia un fenotipo Th1 y favorecenan la activacion de la actividad CTL espedfica de tumor, promoviendo asf el rechazo tumoral.
Nuestros datos tambien demuestran que IRX-2 estimula la produccion de IL-12 a partir de DC. IL-12 es una potente citocina polarizante de Th1 secretada por las DC en respuesta a los patogenos durante la infeccion. Sin embargo, una de las funciones mas importantes de las DC en la mediacion del rechazo tumoral es estimular eficaz y eficientemente las respuestas de celulas T antitumorales sesgadas por Th1 y una de las citocinas cnticas para dirigir esta respuesta es la IL-12. La IL-12 es producida por DC activadas y es un factor esencial involucrado en la diferenciacion de las celulas T cooperadoras CD4+ sin tratamiento previo en celulas Th1. Las celulas Th1 secretan IFN-y e IL-2 y estas citocinas junto con IL-12 median en la activacion y proliferacion de los componentes celulares y fagodticos del sistema inmunitario, tal como los linfocitos T citotoxicos CD8+ (CTL).
Para determinar si IRX-2 puede inducir la produccion de IL-12 en las DC, los monocitos cultivados con GM-CSF/IL-4 fueron estimulados con IRX-2 durante 18 horas y ensayados para la produccion intracelular de IL-12 p70. Mas espedficamente, se cultivaron PBMC adherentes durante 4 dfas en GM-CSF e IL-4 (como se describio anteriormente) y luego se trataron con o sin IRX-2 o LPS durante 18 horas. Se anadio Brefeldin A (BFA; 10 pg/ml; Sigma, St. Louis, MO) durante las ultimas 4 horas para acumular la mayor parte de la citocina en el complejo de Golgi. Las celulas se fijaron y permeabilizaron usando Fix y Perm (Caltag, Burlingame, CA), segun las instrucciones del fabricante, y luego se marcaron con mAb marcado con FITC contra IL-12 p70 (BD Pharmingen, San Diego, CA) o el control de isotipo apropiado (BD Pharmingen, San Diego, CA). Las celulas se analizaron por citometna de flujo.
Como se muestra en la Figura 17A, IRX-2 aumento el porcentaje de DC que producen IL-12 desde 4,5 % positivo a 22,5 % de promedio. LPS, un estimulador de la produccion de IL-12 en las DC, se utilizo como control positivo y dio niveles similares de induccion en relacion con IRX-2 (27 % ± 11). Los datos de la Figura 17A son la media de 4 experimentos independientes y se expresan como el porcentaje de celulas que tinen positivamente para IL-12 ± SEM (p<0,05, prueba t de Student). Para confirmar que la produccion intracelular aumentada de IL-12 correspondfa a una secrecion aumentada de IL-12 bioactiva, se midio la concentracion de IL-12 bioactiva en el sobrenadante de las DC tratadas con IRX-2 (cultivadas inicialmente durante 4 dfas con GM-CSF e IL-4, como se describio anteriormente, e incubadas con IRX-2 durante 48 horas) usando un kit ELISA comercial (R & D Systems, Minneapolis, MN) que detecta el heterodfmero p70 bioactivo. Por ello, como se muestra en la Figura 17B, 48 horas despues de la exposicion a IRX-2, los sobrenadantes de DC conteman significativamente mas IL-12 bioactiva que las DC tratadas con el control. Los datos de la Figura 17B son medias (± SEM) de 6 experimentos independientes (p<0,05, prueba t de Student).
Por ultimo, nuestros datos indicaban que IRX-2 reduce la apoptosis inducida por VEGF en las DC. El VEGF es un inhibidor de la maduracion de DC y se ha demostrado que aumenta los niveles de apoptosis en la maduracion de DC. Para determinar si IRX-2 era capaz de mitigar los efectos de VEGF, las DC se trataron con VEGF con o sin IRX- 2 y el nivel de apoptosis se determino por union de FITC-Anexina V. Mas espedficamente, los PBMC adherentes se trataron con GM-CSF e IL-4 durante 7 dfas y luego se incubaron en presencia o ausencia de VEGF (100 ng/ml) con o sin IRX-2 (1:3) durante 2 dfas adicionales. Las celulas se recogieron y se lavaron 2 veces en PBS enfriado con hielo y se volvieron a suspender en tampon de union a Anexina (BD Pharmingen, San Diego, CA). FITC-Anexina V (BD Pharmingen, San Diego, CA) y yoduro de propidio se anadieron y las celulas se incubaron a 40 C durante 30 minutos. Las celulas se analizaron por citometna de flujo.
Como se muestra en la Figura 18, los niveles de apoptosis aumentaron en las celulas tratadas con VEGF en comparacion con los controles; sin embargo, IRX-2 reduda el nivel de apoptosis en celulas tratadas con VEGF. Los datos de la Figura 18 son el resultado de 4 experimentos independientes y se expresan como el porcentaje de celulas que se tinen positivamente para FITC-Anexina V (± SEM). Los datos sugieren que, ademas de su capacidad estimuladora, el IRX-2 tambien tiene un efecto protector en DC maduras. Ademas, la funcion y el numero de DC defectuosas pueden ser mediadas en parte por la expresion aberrante de VEGF por el tumor (Gabrilovich, 1996b, Saito, 1999, Takahashi, 2004). Se demostro que la produccion de VEGF por los tumores es un indicador de mal pronostico en varios canceres incluidos H&NSCc, cancer de pulmon, cancer gastrico y osteosarcoma (Gallo, 2001; Kaya, 2000; Miyake, 1992; Saito, 1998; Smith, 2000). Los datos contenidos en el presente documento indican que IRX-2 puede revertir la apoptosis mediada por VEGF de las DC, promoviendo asf la supervivencia de DC maduras dentro de un entorno tumoral y permitiendo la presentacion y la activacion prolongadas del antfgeno de linfocitos T
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citotoxicos espedficos del antigeno tumoral.
Estudios previos con DC han empleado mezclas de citocinas naturales tales como medios acondicionados con monocitos (MCM) o mezclas de citocinas inflamatorias recombinantes que contienen TNF-a, IL-1p, IL-6 y PGE2 para madurar las DC para uso en vacunas contra el cancer basadas en DC generadas ex vivo (Romani, 1996; Bender, 1996; Sorg, 2003). Una diferencia critica entre IRX-2 y las mezclas de citocinas utilizadas en otros estudios es que el nivel de citocinas utilizado en este estudio era 10-100 veces menor, lo que sugiere un sinergismo significativo entre los componentes de citocina unicos de IRX-2. Ademas, existen problemas significativos relacionados con el uso de DC maduradas por estas otras mezclas. Por ejemplo, las DC maduradas en presencia de TNF-a, IL-1p, IL-6 y PGE2 tienen una baja o ausente produccion de IL-12 y, si se activan indebidamente, pueden ser tolerogenicas (Steinman, 2002; Langenkamp, 2000). Ademas, existe la preocupacion de que las DC completamente maduras generadas ex vivo podnan "agotarse" y no poder cebar de forma eficiente una respuesta de celulas T eficaz (Kalinski, 2001). Los bajos niveles de respuestas clmicas observadas en pacientes tratados con DC maduradas por el procedimiento ex vivo presta apoyo a estos problemas (Holtl, 2002; Schuler-Thurner, 2002; Thurner, 1999).
La evidencia presentada en el presente documento confirma que IRX-2 es un potente activador de celulas dendnticas. Este dato combinado con los conocidos efectos de IRX-2 sobre las celulas T (Hadden, 1995b) sugiere que IRX-2 es capaz de superar los defectos de APC y celulas T encontrados en pacientes con cancer y proporciona una explicacion mecanicista de los resultados clmicos satisfactorios observados en las pruebas clmicas de los Solicitantes. Mientras que las DC son ahora reconocidas como piezas clave en la inmunoterapia dirigida al cancer, es cada vez mas evidente que manipular elementos individuales del sistema inmunitario de forma individual, p. ej., estrategias de vacunacion de celulas T espedficas del tumor o la reintroduccion de DC pulsadas con antfgeno del tumor, no esta consiguiendo producir mejoras clmicas significativas en los pacientes (Ridgway, 2003; Rosenberg, 2004). Un plan de tratamiento mas beneficioso puede ser mejorar simultaneamente las actividades de varios tipos de celulas de coordinacion, p. ej., celulas T y DC, que permiten reforzar las interacciones y una mayor probabilidad de que las cascadas funcionales se perpetuen en lugar de que se bloqueen por las diversas estrategias inmunosupresoras del tumor. En este contexto, el IRX-2 de la divulgacion puede estar actuando para estimular tanto las DC endogenas cargadas con antfgeno del tumor como las celulas T citotoxicas espedficas del antfgeno del tumor, dando como resultado una respuesta inmunitaria eficaz y un rechazo del tumor. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la composicion de citocinas de la presente divulgacion puede ser una herramienta clinica poderosa para provocar una respuesta inmunitaria contra antfgenos tumorales endogenos o podna usarse junto con antfgenos tumorales anadidos de forma exogena en un contexto de vacuna contra el cancer.
Ejemplo 10
IRX-2 estimula la activacion de monocitos/macrofagos
El IRX-2 de la divulgacion que contiene las citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IFN-y y TNF-a es tambien un potente activador de monocitos/macrofagos. Mas espedficamente, se cultivaron PBMC adherentes (~90 % de monocitos) durante la noche en medio X-VIVO 10 (BioWhittaker Bioproducts), se estimularon durante 24 horas con IRX-2 (a una concentracion final de 1:3) y se ensayaron para la expresion de varios marcadores de activacion tfpicamente encontrados en macrofagos activados por citometna de flujo. Como control, las celulas se incubaron durante 24 horas en medios que carecen de IRX-2. Como se demuestra en la Figura 19, el tratamiento de las celulas con IRX-2 frente a citocinas sin la adicion produjo un aumento estadfstico en el porcentaje de celulas tenidas positivamente (Figura 19A) y un aumento en el mdice de fluorescencia media (MFI) (Figura 19B) para HLA-CR, CD86, CD40 y CD80, todos los marcadores de activacion de monocitos/macrofagos (p<,03). Los datos que se muestran en la Figura 19 representan el valor medio ± SEM a partir de tres experimentos/donantes independientes.
Ademas, se encontro que el IRX-2 de la divulgacion activa los monocitos en un grado mayor que el TNF-a. Mas espedficamente, los PBMC adherentes se estimularon con IRX-2 (IRX-2) (a una concentracion final de 1:3, aproximadamente 1 ng/ml de TNF-a) o con TNF-a (10 ng/ml) y se ensayaron para la expresion de marcadores de activacion por citometna de flujo. Como se muestra en la Figura 20, IRX-2 indujo una expresion estadfsticamente mayor de HlA-DR, CD86, Cd40 y CD80 que TNF-a (p<,03). Los datos mostrados en la Figura 20 representan el valor medio ± SEM de tres experimentos/donantes independientes.
De forma similar, los estudios realizados usando LPS en dosis moderadas (activadoras pero no maximas) tambien indicaron que IRX-2 era una senal de activacion comparativamente mas fuerte. Mas espedficamente, se estimularon PBMC adherentes en ausencia o presencia de IL-10 (5 ng/ml) con IRX-2 (IRX-2) (a una concentracion final de 1:3) o con LPS (10 ng/ml) y se ensayo para la expresion de marcadores de activacion por citometna de flujo. Como se muestra en la Figura 21, el IRX-2 causo un aumento mayor en la expresion de los marcadores de maduracion de monocitos/macrofagos HLA-DR, CD86 y CD40 que el LPS. Ademas, en presencia de citocina inmunosupresora, IL-10, el IRX-2 todavfa podfa estimular los monocitos, mientras que el LPS no lo hada (p<,02). Los datos que se muestran en la Figura 21 representan el valor medio ± SEM de tres experimentos/donantes independientes.
Finalmente, se sabe que los monocitos secretan TNF-a en respuesta a senales de activacion, cuya secrecion esta asociada con la actividad de destruccion no espedfica de los monocitos/macrofagos. Los datos mostrados en la Figura 22 demuestran que el IRX-2 de la divulgacion estimula la produccion de TNF-a a partir de monocitos y supera
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los efectos inmunosupresores de IL-10. Mas espedficamente, se estimularon PBMC adherentes en ausencia o presencia de IL-10 (5 ng/ml) con IRX-2 (IRX-2) (a una concentracion final de 1:3) o con LPS (10 ng/ml) y se ensayaron para la produccion de TNF-a mediante tincion intracelular y citometna de flujo. Como se muestra en la Figura 22, IRX-2 causo un mayor aumento en la produccion de TNF-a que el LPS o los controles. En presencia de IL-10, el IRX-2 todavfa podfa estimular los monocitos para producir TNF-a, mientras que el LPS ya no podfa hacerlo (p<,05). Los datos que se muestran en la Figura 22 representan el valor medio ± SEM de cinco experimentos/donantes independientes.
Ejemplo 11
Los experimentos detallados a continuacion demuestran la capacidad de la composicion de IRX-2 de la divulgacion para actuar en combinacion con antfgenos exogenos para provocar una respuesta inmunitaria realzada (tanto celular como basada en anticuerpos) contra el antigeno en ratones.
Administracion de antfgenos tumorales exogenos
Ratones:
El procedimiento era inmunizar ratones con peptidos de antfgeno de la membrana espedfica de la prostata (PSMA) basados en epitopes de las celulas T mencionadas de PSMA (LLH y ALF) (100 pg@) se conjugaron con ovoalbumina (OVA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). Los intentos previos con peptidos no conjugados aislados no tuvieron exito en ratones. Se administro IRX-2 (0,1 ml) como una unica inmunizacion con ambos antfgenos conjugados, precedida de dosis bajas de CY (400 pg/raton) y se siguio con 9 inyecciones diarias de IRX-2 (0,1 ml) sin antfgenos, mientras que CpG, alumbre, o los adyuvantes de RIBI-Corixa fueron una sola inmunizacion primaria con el conjugado de oVa. A cada grupo de ratones se administraron dos inmunizaciones de refuerzo (conjugado mas adyuvante como anteriormente) los dfas 21 y 28. La reaccion de la DTH con los peptidos de las celulas T se midio 9 dfas despues del refuerzo final y se tomo suero en el sacrificio los dfas 15-21.
La Figura 23 muestra los resultados de la DTH para el ensayo cutaneo de ratones, usando los peptidos individuales ALF y LLH (10 pg@), es decir, sin conjugado, como exposicion al antfgeno. Como se indica en la Figura, el IRX-2 induce respuestas de la DTH significativas a los antfgenos despues de la inmunizacion con ambos conjugados y tambien cuando se administran con alumbre para el conjugado de OVA. Alumbre, RIBI-Corixa y CpG mostraron una actividad insignificante.
Resultados de anticuerpos en suero:
Se diluyo el suero como se indico y se anadio a los pocillos de una microplaca recubierta con peptido (ALF o LLH) o con ovoalbumina. Los resultados se expresan como la DO media a 405 para 5 grupos de ratones. Los datos se presentan en la Tabla IV a continuacion.
Mas espedficamente, los ratones inmunizados con el conjugado KLH en combinacion con IRX-2 fueron negativos para anticuerpos de ovoalbumina, pero positivos para los peptidos. Los ratones inmunizados con los conjugados de OVA e IRX-2 fueron positivos para anticuerpos tanto para OVA como para los peptidos, mientras que los inmunizados con el conjugado de OVA + CpG fueron positivos solo para OVA. Estos resultados indican que IRX-2 actua como un adyuvante para mejorar la capacidad de los peptidos de PSMA conjugados para estimular tanto las respuestas de la DTH como de IgG espedficas de los peptidos, mientras que otros adyuvantes como alumbre, RIBI- Corixa y CpG son inactivos o poco activos.
Tabla IV A: IgG serica con peptido ALF Dilucion

IRX-2 OVA-PSMA IRX-2

1/200 0,929

1/400 0,989

1/800 0,695

1/1.600 0,309
Tabla IV B: IgG serica con peptido LLH

1/200 0,950
KLH-PSMA-IRX-2
0,692
0,518
0,351
0,191
OVA-PSMA-CpG
0,241
0,208
0,144
0,120
0,720
0,277
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1,013 0,502 0,200
1/800
0,607 0,327 0,157
1/1.600
0,316 0,201 0,125
Tabla IV C:
IgG serica con ovoalbumina
1/500
0,920 0,269 1,050
1/1.500
0,632 0,185 0,955
1/3.000
0,457 0,146 0,813
1/6.000
0,259 0,104 0,537
Se realizaron experimentos adicionales para confirmar los resultados anteriores y demostrar que la composicion de IRX-2 de la divulgacion mejora las respuestas inmunitarias espedficas de celulas T en ratones tanto jovenes como adultos. En los experimentos descritos a continuacion, se usaron los siguientes procedimientos y materiales:
Reactivos:
Peptidos de antigeno de membrana espedfico de prostata (Peptido 1: Leu-Leu-His-Glu-Thr-Asp-Ser-Ala-Val; Peptido 2: Ala-Leu-Phe-Asp-Ile-Glu-Ser-Lys-Val) fueron sintetizados por BioSynthesis Inc. (Lewisville, Tx). La ovoalbumina y la ciclofosfamida se obtuvieron de Sigma y KLH de Pierce Biochemicals. El sistema adyuvante RIBI (R-700), tambien denominado RAS, se adquirio de Corixa y el alumbre (40 mg/ml cada uno de hidroxido de aluminio y de hidroxido de magnesio) se adquirio de Pierce Chemicals. RAS consistfa en lfpido monofosforil A (0,5 mg) y trehalosa dicorinomicolato sintetico (0,5 mg), y 44 pl de escualeno y Tween-80. Los oligonucleotidos CpG (secuencia espedfica de raton) fueron sintetizados por Biosynthesis. La secuencia CpG era TCCATGACGTTCCTGACGTT y era el derivado fosfotionato. La bioactividad de CpG en el raton se confirmo midiendo la proliferacion de celulas de bazo de raton y la produccion de TNF-a mediante celulas adherentes de raton (datos no mostrados).
El IRX-2 (tambien referido aqm como IRX-2) es una mezcla definida de citocinas producidas durante un penodo de 24 horas despues de la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana mediante PHA y ciprofloxacina. El PHA se elimina antes de recoger el sobrenadante que contiene las citocinas. Se incluyen dos pasos de eliminacion de virus en el procesamiento posterior (intercambio de iones y nanofiltracion dual). La prueba rigurosa de control de calidad (QC) que incluye tanto el bioensayo como la determinacion por ELISA de los niveles de citocinas asegura la consistencia del IRX-2 (IRX-2). El ensayo de seguridad con respecto a la esterilidad, ADN, micoplasma, endotoxina y ensayo de virus para CMV y EBV tambien son parte del proceso. Se usaron varios lotes de iRX-2 en el transcurso de estos estudios. El nivel de varias citocinas contenidas en los lotes de IRX-2 (IRX-2) se enumera en la Tabla V a continuacion. En la tabla, * representa el nivel medio de citocinas para los 5 lotes de IRX-2 utilizados en estos estudios y ** representa los niveles no medidos en todos los lotes, pero solo para el lote mas reciente. Las citocinas adicionales presentes en los intervalos de pg/ml incluyen G-CSF, IL-12 e IL-10. No estan presentes las citocinas tfpicas de desviacion de Th2 tal como IL-3, IL-4, IL-5, IL-7 e IFN-a. Cuando se probaron dos lotes en el mismo experimento, siempre fueron de similar actividad (datos no mostrados).
Tabla V: Niveles de citocinas en IRX-2
Citocinas (pg/ml)
Media* (n=5)
IL-2
4,72
IL-1
0,45
IFN-y
1,28
TNF-a
1,5
IL-8**
53,5
Citocinas (pg/ml)
Media* (n=5)
IL-6**
1,1
GM-CSF**
0,58
Conjugacion de peptidos de antfgenos:
Los peptidos 1 y 2 descritos anteriormente se conjugaron con una molecula portadora tal como portadoras de ovoalbumina o de KLH como se ha descrito anteriormente. Ambos peptidos se conjugaron con cada portadora, es 5 decir, como un unico agente. Por ejemplo, el conjugado OVA-PSMa o el conjugado KLH-PSMA usado en estos estudios conteman ambos peptidos vinculados a la molecula portadora. Los peptidos se conjugaron con las respectivas portadoras usando el procedimiento de carbodiimida (ODC; kit 77502 de Pierce EDC, Rockford, IL ). En los primeros estudios, se utilizo glutaraldelmdo (Sigma, St. Louis, Mo) pero no hubo diferencias en la inmunogenicidad entre los dos procedimientos (datos no mostrados), por lo que el acoplamiento de carbodiimida se 10 eligio para estudios posteriores como el procedimiento mas controlado. La conjugacion se caracterizo midiendo la DO a 280 y 215 en fracciones de una columna de purificacion de Sephadex. El maximo de DO a 280 de las columnas representa el conjugado de ovoalbumina o de KLH y se recogio como el conjugado. La dosificacion se baso en la concentracion de portadora recuperada de la columna. La monitorizacion de la de 215 mostro un maximo en la cola que representa los peptidos libres y proporciono la confirmacion de que estaba presente un exceso de 15 peptido durante el procedimiento de conjugacion.
Inmunizacion
Se adquirieron ratones Balb/c de Charles River o de Harlan y estuvieron bajo el cuidado de las Instalaciones para animales del Cold Spring Harbor (CSHL). Todos los procedimientos fueron aprobados por el comite ALAC de CSHL. En varios experimentos, se inyecto ciclofosfamida (400 o 2.000 pg/100 pl, IP) tres dfas antes del tratamiento con 20 IRX-2. Estudios posteriores demostraron que la ciclofosfamida no tema un efecto estadfsticamente significativo sobre la mejora del IRX-2 (IRX-2) de la respuesta en ratones (datos no mostrados). Las inmunizaciones se realizaron de la siguiente manera: 200 pl/raton que conteman 100 pg de PSMA conjugado con 100 pl de adyuvante, p. ej., IRX-2 o alumbre, o se inyecto PBS subcutaneamente en la base de la cola para proporcionar un rapido drenaje a los ganglios linfaticos regionales. Nueve inyecciones adicionales de IRX-2 (100 pl = 6-8 UI de equivalencia 25 de IL-2) siempre siguieron a la inmunizacion primaria (en los dfas 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 y 12). A diferencia de alumbre o RIBi, incluso las inyecciones repetidas de IRX-2 (IRX-2) en el mismo sitio no dieron como resultado una inflamacion significativa en el sitio (observacion no publicada). Se realizaron dos inmunizaciones de refuerzo con conjugado mas adyuvante (en los dfas 14 y 28) antes de evaluar la actividad de DTH. No se administro IRX-2 adicional en las inmunizaciones de refuerzo.
30 En los estudios adyuvantes comparativos en ratones jovenes, el RAS (R-700 = MPL + TDM en escualeno/Tween 80) se reconstituyo con 1 ml de pBs (segun el protocolo recomendado) y luego se mezclo con 1 ml de conjugado (1 mg/ml). El alumbre se mezclo 1:1 con antfgeno. Los oligonucleotidos CpG se mezclaron con el conjugado segun los protocolos publicados para ratones (100 pg de conjugado con 20 pg de CpG por raton).
Ensayo de DTH:
35 El desaffo con antfgeno in vivo para el ensayo de la DTH era con una mezcla de los dos peptidos de PSMA (sin portadora) (100 pg en 20 pl) o con portadora solo (ovoalbumina o KLH) (50-100 pg en 20 pl). Los ratones recibieron inyecciones subcutaneas del antfgeno de prueba en el cojinete plantar izquierdo y PBS en el cojinete plantar derecho 9 dfas despues de la inmunizacion de refuerzo. Despues de 24 horas, se midieron los espesores de los cojinetes plantares de los patas derecha e izquierda usando un calibre de lectura digital (Preisser DlGl-MET Modelo 40 18314, Stofiting Co., Wooddale, IL). La respuesta de hinchamiento se calculo restando el espesor del cojinete
plantar derecho (lmea de referencia) del espesor del cojinete plantar izquierdo (respuesta experimental). Los datos se expresaron como hinchamiento individual de los ratones asf como media ± desviacion estandar de la media. El analisis estadfstico era a traves de la prueba t de Student o ANOVA.
Produccion y medicion de citocinas inducida por antigenos/mitogenos:
45 Para estos estudios, los bazos se recogieron 14-21 dfas despues de la inmunizacion de refuerzo y se aislaron mediante dispersion a traves de una malla de alambre. Las celulas adherentes se obtuvieron tomando celulas del bazo y dejandolas adherirse al plastico durante 90 minutos. Las celulas adherentes aisladas se agruparon antes de la adicion a los cultivos para proporcionar celulas presentadoras de antfgeno adicionales. Aproximadamente 6 x 105 linfocitos por pocillo se complementaron con 2 x 104 celulas adherentes.
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La liberacion de citocinas de la activacion de linfocitos inducida por antigeno o mitogeno se midio en sobrenadantes utilizando reactivos de ELISA Duo-Sets de R y D Systems (Minn., MN). El dfa optimo para recoger los sobrenadantes de las celulas estimuladas con antfgeno era el d^a 6 (para IFN-y), mientras que la produccion de IL-2 estimulada por PHA era optima el dfa 3 (datos no mostrados).
Anticuerpos sericos con ovoalbumina y peptidos:
El suero en el sacrificio se congelo para uso posterior en ensayos de ELISA. Las placas de ELISA (Immunolon-4, Nunc, Dinamarca) se recubrieron con el antfgeno de interes (ovoalbumina, KLH, peptidos conjugados o individuales) durante la noche. Diluciones de suero se anadieron a los pozos bloqueados y lavados y se incubaron durante la noche. Se anadieron secuencialmente biotina anti-raton y biotina-fosfatasa alcalina (Southern BioTech, Birmingham, AL) y despues de la adicion de sustrato pNPP, la DO se midio y registro frente a la dilucion del suero.
Los resultados de estos estudios como se detalla a continuacion demuestran que el IRX-2 de la divulgacion estimula las respuestas inmunitarias espedficas de antigeno del tumor en ratones tanto jovenes como adultos in vivo. Mas espedficamente, en los experimentos descritos a continuacion, se utilizo el ensayo de la DTH (hipersensibilidad de tipo retardado) in vivo como un indicador de la activacion de las celulas T. La respuesta de la dTh a antigenos de cancer se correlaciona bien con la eliminacion de tumor en modelos animales y pruebas clmicas, y proporciona asf una correlacion in vivo util de respuestas inmunitarias de celulas T (veanse, por ejemplo, Stuart, 1987; Sweat, 1998). Como se demuestra por los presentes experimentos, la composicion de IRX-2 de la divulgacion actua como un adyuvante con antfgenos tumorales espedficos de prostata en la estimulacion de respuestas inmunitarias de celulas T en ratones jovenes in vivo. Ademas, los presentes experimentos demuestran que IRX-2 no solo aumenta la respuesta inmunitaria a peptidos de celulas T en ratones jovenes sino que tambien restablece las respuestas inmunitarias de celulas T en ratones adultos con alteracion de las celulas T. Asf, en los experimentos detallados a continuacion, los ratones adultos se usaron como un modelo de disfuncion inmunitaria, una disminucion relacionada con la edad en la funcion inmunitaria que aparece tanto en ratones como en hombres. Ademas, se cree que esta disfuncion inmunitaria es una de las principales razones del aumento de la incidencia del cancer que aparece con el aumento de la edad en los humanos.
Mejora con IRX-2 de la respuesta de la DTH espedfica de peptido en ratones jovenes:
Se inmunizaron ratones jovenes con IRX-2 (o PBS como control negativo) en combinacion con un conjugado OVA- PSMA o KLH-PSMA como se describio anteriormente (p. ej., 200 jl/raton, que contiene 100 |jg de conjugado con 100 jl de IRX-2 o PBS). Las inmunizaciones se administraron como inyecciones subcutaneas en la base de la cola para proporcionar un drenaje rapido a un ganglio linfatico regional. Los ratones se enfrentaron posteriormente en un ensayo de la DTH como se ha descrito anteriormente, usando los peptidos de PSMA (Figura 24A) o la portadora usada en las respectivas inmunizaciones conjugadas (Figura 24B) como el antfgeno de desaffo.
Como se demuestra en la Figura 24A, la inmunizacion de ratones jovenes (6-8 semanas de edad) con IRX-2 (IRX-2) en combinacion con un conjugado OVA-PSMA o KLH-PSMA mejoraba la respuesta de DTH espedfica del peptido, independientemente de la portadora. Cuando los peptidos se administraron conjuntamente con IRX-2 pero sin conjugacion, no se midio ninguna respuesta de la dTh espedfica de peptido (datos no mostrados). La respuesta de DTH a las portadoras (ovoalbumina o KLH) era mas fuerte que para el peptido, y la administracion con IRX-2 no mejoraba la actividad de la DTH (Figura 24B). La adicion de alumbre a la inmunizacion del conjugado peptido-IRX-2 no modifico la respuesta positiva de la DTH espedfica del peptido (datos no mostrados).
Los estudios iniciales usaron IRX-2 (IRX-2) en combinacion con un pretratamiento unico con ciclofosfamida tres dfas antes de la inmunizacion. Mas espedficamente, se inmunizaron ratones con el conjugado OVA-PSMA e IRX-2 (IRX-
2) con o sin la administracion de ciclofosfamida (400 jg/raton o 2 mg/raton) 3 dfas antes de la inmunizacion primaria. Despues de dos refuerzos (en los dfas 14 y 28), se realizo un ensayo de DTH como se describio anteriormente.
Como se muestra en la Figura 25, el pretratamiento con ciclofosfamida no se requirio para la respuesta espedfica del peptido y no se uso en experimentos posteriores. Ademas, este experimento confirmaba que el tratamiento con IRX-2 en combinacion con el conjugado del peptido mejoraba la respuesta de DTH espedfica del peptido en una extension significativamente mayor (p<0,05) que el uso de alumbre o PBS, independientemente de si los ratones eran tratados previamente con ciclofosfamida o no. Los resultados de este ensayo se expresaron como hinchamiento promedio (barras en la Figura 25) y como hinchamiento para ratones individuales (puntos de datos con forma de diamante en la Figura 25). Ademas, todos los resultados de estos estudios con ratones utilizaron 9 dfas de inyecciones adicionales de IRX-2 (IRX-2) despues de la inmunizacion primaria, aunque 4 tratamientos adicionales no eran estadfsticamente diferentes de los 9 (datos no mostrados).
Ademas, la capacidad de IRX-2 para estimular una respuesta inmunitaria espedfica del peptido a los conjugados de PSMA se comparo con la de otros tres adyuvantes: alumbre, el Sistema Adyuvante RIBI (o RAS) y CpG. Mas espedficamente, los ratones se inmunizaron con el conjugado OVA-peptido en combinacion con estos diferentes adyuvantes. Despues de dos refuerzos (en los dfas 14 y 28), se realizo un ensayo de DTH como se describio anteriormente (en el dfa 9 despues del refuerzo). Los resultados de este estudio se indican en la Figura 26 y se expresan como el hinchamiento medio (barras) y como el hinchamiento para ratones individuales (puntos de datos
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con forma de diamante).
Como se representa en la Figura 26, el efecto adyuvante de IRX-2 (IRX-2) era mayor que los de los otros adyuvantes ensayados (p<0,001). Aunque todos los adyuvantes mejoraban la respuesta a la protema portadora en comparacion con los ratones sin tratamiento previo (datos no mostrados), solo IRX-2 (IRX-2) mejoraba la respuesta inmunitaria espedfica del peptido del tumor.
Mejora con IRX-2 de la respuesta inmunitaria espedfica del peptido en el envejecimiento de ratones
En primer lugar, se confirmo que la respuesta inmunitaria de las celulas T en ratones adultos (>18 meses de edad) era deficiente en comparacion con la respuesta en ratones jovenes (8-16 semanas de edad) demostrando que las celulas de bazo de los ratones adultos estimuladas con mitogeno (PHA) se alteraban con respecto a la secrecion de dos citocinas de celulas T primarias, IL-2 e IFN-y, en comparacion con la respuesta de ratones jovenes (IL-2: 285 frente a 75 pg/ml e IFN-y: 1.535 frente a 128 pg/ml).
Luego se ensayo la respuesta DTH en ratones adultos frente a jovenes que habfan sido inmunizados con conjugados de PSMA y con IRX-2 o alumbre como adyuvante, seguido de desaffo con antigeno utilizando el ensayo DTH descrito anteriormente. Mas espedficamente, se inmunizaron ratones adultos (18-20 meses al inicio del estudio) y ratones jovenes (6-8 semanas al inicio del estudio) con el conjugado de PSMA, OVA-PSMA, en combinacion con IRX-2 o alumbre como adyuvante, como se describio anteriormente. A continuacion, los ratones se desafiaron con antfgeno segun el ensayo de DTH descrito anteriormente.
Como se indica en la Figura 27A, IRX-2 (IRX-2) restablecio la actividad inmunitaria de ratones adultos a la de ratones jovenes con respecto a la respuesta DTH espedfica de peptido. Los resultados se expresan como la diferencia en el hinchamiento entre una pata inyectada con PBS y una pata inyectada con antfgeno para la media de 9-15 ratones por grupo. El hinchamiento promedio para los grupos de adultos y jovenes tratados con IRX-2 no era estadfsticamente diferente con respecto a la respuesta espedfica del peptido. Sin embargo, las respuestas de DTH tanto de los grupos IRX-2-jovenes como de los IRX-2-adultos fueron significativamente mayores que las observadas en los ratones tratados con alumbre (* p<0,005, prueba t de Student).
Con respecto a la respuesta de DTH espedfica de la portadora OVA, la Figura 27B demuestra que los ratones adultos eran deficientes en comparacion con los ratones jovenes para esta respuesta (p<0,05) pero el tratamiento IRX-2 restablecio la respuesta de DTH espedfica de ovoalbumina en el raton adulto (Figura 27B). La respuesta de los ratones jovenes a la ovoalbumina era optima en alumbre y, por lo tanto, no mejoraba con IRX-2.
Estos experimentos demostraron el efecto adyuvante de la composicion de IRX-2 de la divulgacion en la estimulacion de respuestas inmunitarias de celulas T de antfgeno antitumoral espedfico en ratones tanto adultos como jovenes in vivo. De hecho, el IRX-2 de la divulgacion proporciono una mayor respuesta inmunitaria de celulas T espedficas de antfgeno tumoral en comparacion con otros adyuvantes ensayados.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales, como se describe a continuacion, para medir el efecto del tratamiento con IRX-2 sobre la produccion de la citocina de celulas T, IFN-y, cuya produccion es otro indicador de estimulacion inmunitaria.
Efecto de IRX-2 en la respuesta ex vivo de las celulas T del bazo
De este modo, el efecto adyuvante del tratamiento con IRX-2 en ratones inmunizados con IRX-2 y un conjugado de PSMA se determino midiendo la secrecion de IFN-y por celulas de bazo de los ratones inmunizados. Mas espedficamente, las celulas del bazo de ratones inmunizados con el conjugado KLH-PSMA (como se describio anteriormente) e IRX-2 (IRX-2) se recogieron e incubaron ex vivo con el conjugado (KLH-PSMA), el portador (KLH) o los peptidos (PSMA). Los sobrenadantes de las celulas del bazo se recogieron despues de 6 dfas de cultivo y se midio la secrecion de IFN-y como se describe en la seccion anterior de procedimientos y materiales. Como se muestra en la Figura 28, la respuesta de las celulas T, en forma de produccion de IFN-y (en pg/ml), era mayor para los tres antfgenos en los ratones inmunizados con el conjugado e IRX-2 en comparacion con los ratones no tratados previamente.
Efecto de los adyuvantes en el tttulo de anticuerpos en suero
Ademas, se realizaron experimentos para determinar si el tratamiento con IRX-2 tema un efecto adyuvante sobre la produccion de anticuerpos in vivo. Mas espedficamente, se inmunizaron ratones con los conjugados de PSMA como se describio anteriormente y los siguientes adyuvantes: IRX-2, alumbre o CpG. PBS se uso como un control negativo para el adyuvante. El suero de los ratones se obtuvo en el sacrificio, o 15 dfas despues de la tercera inmunizacion (datos representados en la Figura 29A y B) o a los 8 y 15 dfas despues del tercer refuerzo (datos de la Figura 29C)). El suero se ensayo para detectar anticuerpos mediante ELISA y los resultados se expresaron como dilucion frente a densidad optica (Figura 29A y B) o como densidad optica a la dilucion optima, 1/400 (Figura 29C).
Se midieron los tttulos de anticuerpos en suero para la portadora (ya sea ovoalbumina o KLH) e indicaron que IRX-2 (IRX-2), alumbre y CpG indujeron tftulos similares a la ovoalbumina, siendo la respuesta: CpG>alumbre>IRX-2 (IRX-
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2) (Figura 29A y datos no mostrados). Los ratones inmunizados con el conjugado KLH, como se predijo, no generaban tftulos para la ovoalbumina, lo que confirma la especificidad del ensayo ELISA (vease, por ejemplo, la Figura 29A). Sin embargo, en cuanto a la respuesta de anticuerpos espedficos de peptidos como se representa en la Figura 29B, el IRX-2 en combinacion con el conjugado del peptido OVA-PSMA indujo anticuerpos en suero para ambos peptidos, en contraste con alumbre y CpG. Los datos en la Figura 29B son para el peptido ALF con una p<0,05 por ANOVA para IRX-2 frente a alumbre y CpG. Se midieron respuestas similares para el peptido LLH (datos no mostrados). Como se representa en la Figura 29C, cuando se uso KLH en el conjugado como portadora para los peptidos, IRX-2 (IRX-2) indujo una respuesta del anticuerpo del peptido mayor que ningun adyuvante (PBS) o alumbre (p<0,001 para IRX-2 frente a alumbre y PBS). Los marcadores en la Figura 29C indican ratones individuales. La respuesta del anticuerpo se midio en una placa de ELISA revestida con ambos peptidos en el procedimiento de ensayo como se ha descrito anteriormente.
Los estudios descritos anteriormente indican que el IRX-2 de la divulgacion mejora la respuesta de DTH espedfica del peptido de celulas T in vivo y la respuesta de celulas T de celulas de bazo ex vivo en un modelo prototipo de vacuna de peptido de prostata. La naturaleza cntica de la mezcla de citocinas (en oposicion a la actividad de solo unas pocas) se confirma por la observacion de que las preparaciones realizadas a partir de cultivos celulares que carecen de monocitos y, por lo tanto, deficientes en citocinas derivadas de monocitos no lograron mejorar la respuesta de DTH espedfica del peptido o la respuesta de celulas T in vitro de las celulas del bazo. La naturaleza novedosa del IRX-2 se demostro adicionalmente comparandola con otros adyuvantes seleccionados para representar diversos mecanismos de accion. Por ejemplo, CpG es un agonista de TLR para APC y es representativo de adyuvantes activadores de TLR, mientras que el sistema RAS es representativo de adyuvantes con componentes de aceite y bacterianos, y es una alternativa mas segura al adyuvante de Freund en modelos de raton. El alumbre es el adyuvante utilizado en la mayona de las vacunas aprobadas por la FDA. En los presentes estudios, el IRX-2 mejoraba la respuesta de DTH espedfica del peptido, pero alumbre, CpG y RAS no lo hicieron. Ademas, la mejora con IRX-2 de la respuesta de DTH espedfica del peptido de las celulas T in vivo se correlaciono con una respuesta de celulas T mejorada por celulas del bazo ex vivo como se define por la secrecion espedfica de antfgeno de IFN-y. Por ultimo, aunque todos los adyuvantes mejoraban la respuesta del anticuerpo a la portadora (en comparacion con PBS), solo el IRX-2 mejoraba la respuesta del anticuerpo a los peptidos conjugados con la portadora.
El mecanismo o mecanismos a traves de los cuales las citocinas en IRX-2 actuan para mejorar la respuesta inmunitaria espedfica del peptido segun se define por el ensayo de DTH es el mas complejo probablemente ya que el reclutamiento, envolvimiento, proliferacion, activacion, maduracion y migracion de las APC y reclutamiento, proliferacion, diferenciacion y maduracion de las celulas T estan todas influenciadas por las citocinas. Sin embargo, se cree que la naturaleza espedfica del peptido de la respuesta DTH observada en estos estudios es el resultado de la influencia de IRX-2 en la presentacion del antfgeno, asf como la posterior proliferacion y migracion de celulas T a la periferia. Tambien se cree que las citocinas del IRX-2 cambian la tolerancia de las DC o el equilibrio regulador de T hacia la activacion de la respuesta a epitopes de celulas T. IRX-2 puede tambien estar mejorando los epitopes cooperadores de celulas T en la portadora proporcionando estimulacion adicional del desarrollo de una respuesta inmunitaria eficaz de las celulas T. Como se demuestra en el presente documento (veanse los Ejemplos 9 y 10), el IRX-2 de la divulgacion estimula la maduracion y activacion de las celulas dendnticas, lo que promueve la presentacion del antfgeno y la secrecion de IL-12 (por las celulas dendnticas), siendo IL-12 una potente citocina polarizante Th1. El IRX-2 tambien es un potente activador de monocitos y macrofagos.
El IRX-2 tiene efectos adicionales sobre las celulas T basados en la influencia conocida de las citocinas presentes en el IRX-2. Como se muestra en los Ejemplos 2 y 8 anteriores, el IRX-2 de la divulgacion aumenta los recuentos de linfocitos T en pacientes linfocitopenicos, incluida la produccion de celulas T sin tratamiento previo. Ademas, se sabe que la IL-1 (presente en el IRX-2) es un quimioatrayente para linfocitos, asf como un estimulador de la produccion de otras citocinas. Las actividades conocidas incluyen un aumento en la proliferacion y activacion de las celulas T en reposo al inducir la secrecion de IL-2 y, mas importante aun, la actividad de IRX-2, la regulacion al alza del receptor de IL-2. Ademas, el TNF-a (tambien presente en IRX-2) mejora la actividad de IL-1 como hacen otras citocinas tal como IL-8 y los CSF. IL-8 actua tambien como un quimioatrayente para multiples celulas, incluidas las celulas T, basofilos y neutrofilos. La IL-2 actua mejorando la proliferacion de las celulas activadas no solo estimulando a traves del receptor, sino tambien regulando al alza los receptores de IL-2 adicionales, asf como los receptores de citocinas adicionales. De este modo, las citocinas de las composiciones de IRX-2 de la divulgacion son pleotropicas, que influyen en los monocitos, las celulas dendnticas y las celulas T.
El sitio de actividad para las citocinas, presente en niveles fisiologicos en el IRX-2 de la divulgacion, es local e incluye tanto el sitio de inyeccion como tambien los ganglios linfaticos asociados con el sitio de inyeccion. Como el IRX-2 se puede administrar diariamente, se pueden mantener niveles locales elevados de todas las citocinas. La naturaleza espedfica del peptido de la respuesta de DTH usando el IRX-2 de la divulgacion como un adyuvante aboga por el uso del IRX-2 en futuras vacunas de celulas T.
Ademas, los presentes estudios indican que el IRX-2 de la divulgacion corrige un deficit de citocinas de celulas T en ratones envejecidos. Es importante tener en cuenta que el cancer aparece con mayor frecuencia en individuos mas adultos que se sabe que tienen un sistema inmunitario en declive. Ademas, muchas de las terapias actuales para tumores (irradiacion y quimioterapia) pueden ser por sf mismas inmunodepresoras, lo que reduce aun mas la competencia inmunitaria del paciente. Asf, una vacuna contra el cancer para muchos pacientes puede beneficiarse
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de un agente con el potencial de restablecer la inmunodeficiencia asociada con el envejecimiento, los tratamientos contra el cancer y los mecanismos de defensa contra el cancer. Teniendo en cuenta este posible obstaculo para el uso de una vacuna en los ancianos, se evaluo IRX-2 en los presentes estudios para conocer la eficacia en el envejecimiento, asf como en los ratones inmunocompetentes jovenes. En primer lugar, se determino que las celulas del bazo de los ratones adultos eran deficientes en la produccion de citocinas tanto de IL-2 como de IFN-y cuando se comparaba con los ratones jovenes. La respuesta de DTH tambien se vio alterada con respecto a la ovoalbumina. La composicion de IRX-2 de la divulgacion no solo era capaz de restablecer la debil respuesta a la portadora, sino que tambien era eficaz en restablecer la respuesta espedfica del peptido a niveles similares a la de los ratones jovenes.
El protocolo para el uso de IRX-2 en un modelo de vacuna se basa en estudios clmicos de fase I/II usando el IRX-2 (IRX-2) en pacientes con cancer de cabeza y cuello, y la cinetica conocida de la respuesta inmunitaria (vease, p. ej., Meneses, 2003; Hillman, 1995). En las pruebas clmicas, tomar como diana el ganglio linfatico de drenaje del tumor combinado con una inyeccion previa de baja dosis de ciclofosfamida y una administracion de 10 dfas con IRX-2 (IRX-2) da como resultado la mejora de la infiltracion linfocitica del tumor, la fragmentacion de la arquitectura del tumor y la reduccion del tamano del tumor (veanse los Ejemplos 2-7 anteriores). Como se describio anteriormente, en el modelo de vacuna en ratones, los estudios iniciales utilizaron una inyeccion previa con ciclofosfamida, pero estudios posteriores confirmaron que esto no era necesario en ratones sanos que no portan tumor (Figura 25). Ademas, la administracion diaria de IRX-2 despues de la inmunizacion primaria (durante 4-9 dfas) parece ser importante porque asegura que el sitio de la inyeccion y, posteriormente, los ganglios linfaticos de drenaje tienen suficientes niveles de citocinas para la estimulacion optima de la respuesta inmunitaria de celulas T durante la activacion al penodo de transicion de la memoria. Dado que los niveles de las citocinas son bajos, no hay respuesta inflamatoria manifiesta en el sitio de la inyeccion. Esto contrasta tanto con el alumbre como con el Sistema Adyuvante RIBI, donde se observaron hinchamiento e inflamacion en el sitio de la inyeccion (observacion no publicada).
La vacuna propuesta de portadora-peptido descrita en el presente documento tiene un compromiso clinico significativo como vacuna terapeutica basada en los datos informados de los estudios de Fase I/II usando los peptidos de PSMA sin conjugacion con una portadora (Toja, 2000; O'Hagan, 2001; Katsuyuki, 2000 y Naylor, 1991). Los dos peptidos son epitopes de celulas T basados tanto en modelos informaticos como en la respuesta de linfocitos de pacientes con cancer de prostata. Cuando los pacientes fueron tratados con peptidos solos o con celulas dendnticas pulsadas con peptido, se observaron respuestas mejoradas clmicas y de celulas T en las pruebas de Fase I/II. Sin embargo, en las pruebas de fase I, los peptidos sin un adyuvante eran menos eficaces que las celulas dendnticas pulsadas con peptido. Dada la respuesta mejorada espedfica del peptido, observada cuando se administro IRX-2 con el conjugado del peptido y la seguridad de los conjugados de KLH en una amplia variedad de pruebas clmicas, las pruebas clmicas con los peptidos e IRX-2 (IRX-2) estan garantizadas.
Los estudios presentados en el presente documento que usan un modelo de raton de vacuna de peptido contra el cancer y los datos clmicos humanos que muestran una respuesta antitumoral energica a antfgenos endogenos que usan el IRX-2 de la divulgacion, apoyan el uso de la composicion de IRX-2 de la divulgacion en una vacuna tumoral para la generacion de una respuesta inmunitaria suficiente para mediar en la destruccion espedfica del tumor. Ademas, dado que IRX-2 actua para mejorar las respuestas de celulas T espedficas en ratones jovenes y adultos, IRX-2 es un candidato para la inclusion en cualquier vacuna contra el cancer, especialmente para pacientes de edad avanzada con cancer, que tiene como objetivo la mejora de respuestas inmunitarias de las celulas T.
Humanos:
Tres pacientes con cancer de prostata avanzado recibieron peptidos de ALF y LLH no conjugados (100 |jg @) con IRX-2 (1 ml-100 unidades de equivalencia de IL-2) precedidos por bajas dosis de CY (300 mg/m2) y a diario INDO (25 mg tres veces al dfa) mas 9 inyecciones adicionales de IRX-2 (1 ml). El dfa 15, se administro un refuerzo de IRX-2 mas peptidos. Un paciente adicional (n.° 4) recibio peptidos conjugados con OVA en este regimen. Las reacciones de hipersensibilidad retardada (DTH) se midieron con IRX-2 (0,1 ml), ALF o LLH (10 jg) mediante una prueba cutanea intradermica lefda a las 24 horas en centfmetros de eritema y en duracion. Los resultados se presentan en la Tabla VI.
Tabla VI: DTH con peptidos de PSMA e IRX-2
Momento 0 1 mes
IRX-2
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Momento 0 1 mes

4) 0,3 0,3

Peptido ALF 1) 0 0,5

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3) 1,0 1,0

4) 0 0,4

Peptido LHH 1) 0 0,5

2) 0 0,3

3) 1,5 2,0

4) 0 0,5
Estos datos indican que el regimen con IRX-2 es eficaz para inducir reacciones de DTH a peptidos de PSMA, no conjugados y conjugados, en humanos con cancer de prostata avanzado. Este resultado es diferente de los resultados de la mayona de los intentos anteriores que han fracasado con peptidos aislados.
Otros experimented demostraron la capacidad del IRX-2 de la divulgacion para actuar como un adyuvante con antigenos de peptidos de PSMA, dando como resultado la estabilizacion de la enfermedad. Mas espedficamente, tres varones positivos para HLA-A2 con cancer de prostata avanzado se trataron con IRX-2 (IRX-2) (115 unidades de equivalencia de IL-2) y los dos peptidos de PSMa descritos anteriormente (100 |jg cada uno). La inmunizacion inicial era mediante inyeccion en el cuello, seguida de nueve inyecciones de IRX-2 (IRX-2) (mas dosis bajas de ciclofosfamida, indometacina y zinc como en el protocolo del Ejemplo 2 anterior), y luego seguidas de cinco refuerzos mensuales de IRX-2 mas los dos peptidos.
La Tabla VII resume brevemente la historia clmica (Hx) y las respuestas a la terapia (Rx). Los tres pacientes hadan recibido prostatectoirna y orquiectoirna unos 4 a 10 anos antes (ademas de otros medicamentos) y hadan recafdo. Todos se encontraban en una fase de duplicacion del aumento de PSA que variaba entre 4 y unos estimados 6 meses. Dos teman smtomas de dolor oseo. La inmunizacion con IRX-2 mas peptidos y el seguimiento con inyecciones de refuerzo no indujeron smtomas.
Los dos pacientes con dolor oseo tuvieron un alivio del dolor. Los tres pacientes se mantuvieron estables clmicamente (excepto el paciente n.° 2 que sufrio una fractura de femur con un agravamiento temporal). Los tres desarrollaron reactividad dermica temporal a las pruebas cutaneas con los peptidos de PSMA aislados (A y B; 10 jg cada uno). Los tres mostraron un aumento de la reactividad para pruebas cutaneas con IRX-2 o pHa. Estos resultados indican que el IRX-2 de la divulgacion inmunizaba estos pacientes con los peptidos de PSMA y estabilizaba la enfermedad durante el pertedo de inmunizacion y refuerzo. Vease tambien la Figura 30, que representa la estabilizacion de los niveles del antfgeno PSA en estos tres pacientes durante un pertedo de seis meses. El paciente adicional n.° 4 descrito anteriormente mostro estabilizacion de PSA temporal y clmica, pero la informacion clmica esta incompleta. Otro paciente adicional con una reaparicion temprana del nivel de PSA (7) mostraba reversion hasta un nivel normal que ha persistido durante dos anos de seguimiento sin terapia adicional (una respuesta completa).
Tabla VII
Prostata Rx PSA Hx IRX-4 Rx Respuesta clmica
Paciente 1
Prostatectoirna 1999 Orquiectoirna 2002 Metastasis osea aumento 2x en los ultimos 6 meses (est.) Ultimo PSA 24 2003 PSA estable en 5 meses; 29 al final Prueba cutanea de IRX-2 0,4 1.0cm Peptido A 0 ^ 0,2 cm Peptido B 0 ^ 0,1 cm Estable clmicamente en 6 meses
Paciente 2
Prostatectomfa 1998 Orquiectomfa 1998 Anti-androgenos 1999 aumento 4x en los ultimos 12 meses Ultimo PSA 160 2003 PSA estable en 7 meses; 131 al final Prueba cutanea de IRX-2 1,0 1,0cm Peptido A 0 ^ 0,2 cm Peptido B 0 ^ 1,0 cm Dolor disminuido Estable clmicamente en 6 meses
Paciente 3
Prostatectomfa 1993 Orquiectomfa 1993 15x en los ultimos 20 meses 2x en los ultimos 4 meses Ultimo PSA 35 2003 PSA estable en 7 meses; 44 al final Prueba cutanea de IRX-2 0,0 0,5 cm Peptido A 0 ^ 0,5 cm Peptido B 0 ^ 0,5 cm Dolor disminuido Estable clmicamente en 6 meses
Ejemplo 12
En el siguiente estudio, se demostro que IRX-2 amplifica la respuesta de celulas T a dos peptidos espedficos de celulas T a partir del antfgeno de membrana espedfico de prostata (PSMA). IRX-2 mejoraba la respuesta de “DTH” 5 de hipersensibilidad de tipo retardada espedfica del peptido PSMA de ratones inmunizados con celulas 3T3 irradiadas que expresan PSMA (vacuna basada en celulas) asf como a una vacuna conjugada de peptido-portadora. Esto contrastaba con adyuvantes tales como alumbre, Sistema Adyuvante RIBI (RAS®, RIBI ImmunoChem Research, Inc.) y CpG que no eran activos en la generacion de respuestas de celulas T a los peptidos de PSMA. La actividad in vivo espedfica de celulas T se confirmo demostrando aumentos espedficos del peptido en la secrecion 10 de IFN-Y por celulas de bazo recogidas de ratones inmunizados. IRX-2 en contraste con otros adyuvantes tambien mejoraba las respuestas de las celulas B a los peptidos.
Materiales y procedimientos
Reactivos y celulas
Peptidos de antigeno de membrana espedficos de prostata (Peptido 1 = Leu-Leu-His-Glu-Thr-Asp-Ser-Ala-Val (SEQ 15 ID NO: 1); Peptido 2 = Ala-Leu-Phe-Asp-Ile-Glu-Ser-Lys-Val (SEQ ID NO: 2)) fueron sintetizados por Biosynthesis Inc. (Lewisville, TX). Ovoalbumina, ciclofosfamida y sistema adyuvante RIBI (RAS; R-700) se adquirio de Sigma (St Louis, MO). KLH y alumbre (40 mg/ml cada uno de hidroxido de aluminio y de hidroxido de magnesio) eran de Pierce Biotechnology (Rockford, IL). El RAS consistio en lfpido monofosforil A (MPL; 0,5 mg) y Trehalosa Dimicolato sintetico (TDM; 0,5 mg) y 44 ul de escualeno y Tween-80. Los oligonucleotidos CpG (secuencia espedfica de raton)
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se sintetizaron por BioSynthesis (Lewisville, TX). La secuencia de CpG era TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 3) y era el derivado fosfotionato. La bioactividad de CpG en el raton se confirmo midiendo la proliferacion de celulas de bazo de raton y la produccion de TNF-a mediante celulas adherentes de raton (datos no mostrados).
Se cultivaron celulas NIH 3T3 que se transfectaron de manera estable con un inserto de PSMA con MEM complementado con 10% de FBS. La expresion del inserto se confirmo demostrando resistencia a geneticina y expresion de PSMA mediante inmunohistoqmmica y citometffa de flujo. Las celulas se irradiaron con 800 Gy usando una fuente de Cesio y se congelaron a -20 C hasta su uso como una vacuna basada en celulas.
IRX-2 es un biologico derivado de celulas primarias que consiste en multiples citocinas activas como se describio anteriormente. La dosificacion de IRX-2 se baso en el contenido de IL-2. Cuando se analizaron dos lotes con contenido equivalente de IL-2 en el mismo experimento, siempre tuvieron la misma actividad (datos no mostrados). Se usaron varios lotes de IRX-2 en el transcurso de estos estudios. Los niveles medios de las citocinas que mejoran el potencial inmunitario en los lotes de IRX-2 utilizados en estos estudios fueron IL-2 (5,5 ng/ml), IL-1 (0,5 ng/ml), IFN-y (1,5 ng/ml), TNF-a (2,7 ng/ml), IL-6 (1 ng/ml) e IL-8 (46,2 ng/ml).
Conjugacion
Los peptidos se conjugaron con ovoalbumina o KLH usando el procedimiento de la carbodiimida (ODC; kit 77502 de Pierce EDC, Rockford, IL). La conjugacion se caracterizo midiendo la densidad optica a 280 nm y 215 nm en fracciones de una columna de purificacion de Sephadex. El maximo a 280 nm de las columnas identifica a la portadora y se recolecto como el conjugado. El control de la densidad optica a 215 nm mostro un maximo residual que representa los peptidos libres y proporciono la confirmacion de que estaba presente un exceso de peptido durante el procedimiento de conjugacion. La dosificacion se baso en la concentracion de portadora recuperada de la columna.
Inmunizacion
Se adquirieron ratones hembra Balb/c (6-8 semanas de edad) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) y se mantuvieron bajo el cuidado de la Instalacion para animales del Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) (certificado de aseguramiento del bienestar de los animales numero A3280-01). Todos los procedimientos fueron aprobados por el comite ALAC de la CSHL. Las inmunizaciones (200 ul/raton conteniendo 100 ug de conjugado con 100 ul de adyuvante o PBS) se administraron por via subcutanea en la base de la cola para proporcionar un drenaje rapido a los ganglios linfaticos regionales. Nueve inyecciones adicionales de IRX-2 siguieron a la inmunizacion primaria (Dfas 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 y 12). A diferencia de alumbre o RIBI, donde una sola inyeccion causaba inflamacion en el sitio, las inyecciones repetidas de IRX-2 en el mismo sitio no provocaron ninguna inflamacion significativa en el sitio (observacion no publicada). Se realizaron inmunizaciones de refuerzo con conjugado mas adyuvante (Dfas 14 y 28) antes de evaluar la actividad de DTH. No se administraron inyecciones diarias adicionales de IRX-2 despues de las inmunizaciones de refuerzo. Cuando se usaron celulas irradiadas como vacuna, las celulas se suspendieron en PBS o IRX-2 y se inyectaron por via subcutanea usando dosis entre 103 y 105 celulas/raton. El calendario de inmunizacion era identico al utilizado para la vacuna de conjugado del peptido.
En los estudios adyuvantes comparativos en ratones, el RAS (R 700 = MPL + TDM en escualeno/Tween 80) se reconstituyo con 1 ml de PBS (segun el protocolo recomendado) y luego se mezclo con 1 ml de conjugado (1 mg/ml). El alumbre se mezclo 1:1 con anffgeno. Los oligonucleotidos CpG se mezclaron con el conjugado del peptido siguiendo los protocolos publicados para ratones (100 ug de conjugado con 20 ug de CpG por raton).
Ensayo de DTH
El desaffo al anffgeno in vivo para el ensayo de DTH se evaluo 9 dfas despues de la inmunizacion de refuerzo. Los ratones recibieron inyecciones subcutaneas del anffgeno de desaffo en el cojinete plantar izquierdo y PBS en el cojinete plantar derecho. El anffgeno de desaffo era peptido (100 |jg en 20 jl) o portadora (ovoalbumina o KLH) (50 |jg en 20 jl). Despues de 24 horas, se midieron los grosores del cojinete plantar derecho e izquierdo usando un calibre de lectura digital (Preisser DIGI-MET Modelo 18314, Stofiting Co, Wooddale, IL). La respuesta del hinchamiento se calculo restando el grosor del cojinete plantar derecho (lmea de referencia) del grosor del cojinete plantar izquierdo (respuesta experimental). Los datos se expresan como media ± desviacion estandar de la media. El analisis estadfstico se realizo a traves de la prueba t de Student.
Ensayo de IFN-y estimulado por anffgenos
Se recogieron los bazos 7-14 dfas despues de la segunda inmunizacion de refuerzo y se aislaron dispersandolos a traves de un tamiz de malla de alambre. Las celulas adherentes se obtuvieron tomando celulas del bazo y dejandolas adherirse al plastico durante 90 minutos. Las celulas adherentes aisladas se anadieron a los cultivos para proporcionar celulas presentadoras de anffgeno adicionales (6 x 105 linfocitos por pocillo se complementaron con 2 x 104 celulas adherentes). La liberacion de IFN-y por activacion de linfocitos inducida por anffgeno se midio en los sobrenadantes cosechados el dfa seis usando reactivos ELISA Duo-Sets de R&D Systems (Minneapolis, MN).
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Anticuerpos sericos con portadora y peptidos
Se obtuvo suero entre los dfas 7 y 21 despues de la tercera inmunizacion de refuerzo y se congelo para uso posterior en ensayos ELISA. Las placas de ELISA (Immunolon-4, Nunc, Dinamarca) se recubrieron con el anffgeno de interes (ovoalbumina, KLH, conjugado o peptidos) durante la noche. Se anadieron diluciones de suero a los pozos bloqueados y lavados, y se incubaron durante la noche. IgG anti-raton marcada con biotina y avidina- fosfatasa alcalina (Southern BioTech, Birmingham, AL) se anadieron secuencialmente y despues de la adicion de sustrato de pNPP, se midio la DO y se represento graficamente frente a la dilucion de suero.
Resultados
IRX-2 aumenta la respuesta inmunitaria a una vacuna basada en celulas enteras
Se usaron celulas 3T3 transfectadas con PSMA para inmunizar ratones y confirmar el procesamiento y la presentacion de los peptidos de PSMA. La respuesta inmunitaria a los peptidos se evaluo mediante el ensayo de Hipersensibilidad de Tipo Retardado (DTH). Como se muestra en la Figura 31, las celulas que expresaban PSMA irradiadas generaron una respuesta de DTH en ratones cuando se desafiaron con los dos peptidos de PSMA. Los ratones se vacunaron con dosis de celulas 3T3 irradiadas que expresan PSMA e IRX-2 (azul) o sin adyuvante (PBS, magenta) y la respuesta de DTH despues del desaffo al peptido se midio 9 dfas despues de la segunda inmunizacion de refuerzo. Los resultados se expresan como media (± SEM) para los grupos de 5-15 ratones. El aumento en el hinchamiento de los cojinetes plantares era una funcion de la dosis de celulas irradiadas y se administro IRX-2 en comparacion con los ratones sin adyuvante (PBS). La determinacion de la diferencia estadfstica entre el IRX y los grupos sin adyuvante (PBS) se evaluo mediante la prueba t de Student. La significancia de dos colas era = p<0,001 para 104 y 105 celulas/raton y la significancia de una cola era p<0,05 para 10. La respuesta se relaciono con la dosis y se mejoraba cuando la vacuna se administro con IRX-2 en comparacion con la de sin adyuvante.
Mejora con IRX-2 de la DTH espedfica del peptido en ratones inmunizados con el conjugado de PSMA: Dosificacion de conjugado y de IRX-2
Los ratones se inmunizaron con dosis variables de los peptidos solos o peptidos conjugados con la portadora hemocianina de lapa californiana (KLH) con y sin IRX-2. La respuesta de las celulas T despues del desaffo con peptido o conjugado se evaluo para definir la dosis optima de anffgeno. Hubo una respuesta dependiente de la dosis para la respuesta de la DTH espedfica del peptido, pero la respuesta a la portadora no se vio influenciada por la dosis del conjugado (Figura 32). La Figura 32 presenta la respuesta de dTh de los ratones inmunizados con el peptido (lado izquierdo) o KLH (portador, lado derecho). La respuesta se expresa como la media ± SEM para 5-10 ratones por grupo. No adyuvante indica que la respuesta se midio en ratones inmunizados con la dosis optima de conjugado y pBs. La respuesta del peptido estaba relacionada con la dosis, pero la respuesta al portador no lo estaba. Las diferencias de no adyuvante para la respuesta espedfica del peptido a las dosis de conjugado de PSMA-KLH de 100 ug y 25 ug eran significativamente diferentes de las de no adyuvante de p<0,05 para la prueba t de Student. La dosis mas alta de conjugado probado sin adyuvante no era activa en el ensayo espedfico del peptido en comparacion con la respuesta de KLH, que era similar a la respuesta con IRX-2. Cuando los peptidos sin conjugacion se administraron conjuntamente con IRX-2, no se observo respuesta de DTH espedfica del peptido (datos no mostrados).
IRX-2 aumenta la respuesta al anffgeno en una forma dependiente de la dosis
Se evaluo la dosis de IRX-2 requerida para generar la respuesta optima de DTH espedfica del peptido (Figuras 33A y 33B). Los ratones se inmunizaron con la vacuna conjugada optima (100 ug/raton) y varias dosis de IRX-2. Dado que IRX-2 contiene multiples citocinas, la dosis de IRX-2 se representa graficamente como la concentracion de IL-2 en IRX-2 por raton. La concentracion de IL-2 esta representada por dos mediciones inter-convertibles (UI = unidades internacionales o pg/ml basadas en un patron recombinante puro). La respuesta del peptido espedfico de las celulas T se evaluo mediante el ensayo de DTH y se representa como el aumento del hinchamiento (± desviacion estandar de la media) debido al desaffo del peptido. La diferencia entre la respuesta para las dosis optimas (entre 200 y 800 pg/raton, 4-16 UI/raton) era estadfsticamente significativa (p<0,05 mediante la prueba de la t de Student) de no IRX- 2 (0), asf como la dosis mas baja (70 pg/ml) y la dosis mas alta (2.100 pg/ml) analizadas en el ensayo. La dosificacion de IRX-2 se definio mediante los niveles de IL-2 medidos por ELISA. Las dosis entre 200 y 800 pg de equivalentes de IL-2 por raton eran eficaces para mejorar la respuesta de las celulas T en el ensayo de DTH.
Inyecciones multiples de IRX-2 mejoran la respuesta inmunitaria al anffgeno
Con respecto a la mejora de la DTH espedfica del peptido eran similares 4 o 9 inyecciones adicionales de IRX-2, pero una unica administracion sin inyecciones posteriores del IRX-2 en solitario no mejoraba la respuesta espedfica de las celulas T al anffgeno (Figuras 33A y 33B y los datos no se muestran).
IRX-2 es superior a otros adyuvantes en la mediacion de una respuesta de celulas T al anffgeno
Tres adyuvantes con diferentes mecanismos de accion se seleccionaron para comparar con IRX-2. Alumbre (el
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adyuvante utilizado en la mayona de las vacunas aprobadas por la FDA), Sistema Adyuvante Ribi (representante de adyuvantes con aceite y componentes bacterianos) y CpG (representante de los adyuvantes que activan receptores de tipo peaje (TLR)) se administraron segun los protocolos publicados. La mejora con lRX-2 de la respuesta espedfica del peptido a celulas T era superior a los adyuvantes Alumbre, Ribi® o CpG (Figura 34). Los ratones se inmunizaron con el conjugado del peptido de PSMA y los adyuvantes indicados. Despues de dos refuerzos (Dfa 14 y Dfa 28), el ensayo de DTH se realizo 9 dfas despues del refuerzo final. Los resultados se expresan como el aumento promedio en hinchamiento para el peptido inyectado frente a la pata de control (± SEM). La respuesta de IRX-2 era mayor que todas las demas a p<0,0oi (prueba de la t de Student).
IRX-2 aumenta la produccion de IFN-y en respuesta al antfgeno del peptido
Los ratones se inmunizaron con varias dosis del conjugado KLH-PSMA e IRX-2. Las celulas del bazo de ratones inmunizados se evaluaron ex vivo para la respuesta a la estimulacion por los peptidos midiendo la secrecion de IFN- Y. IRX-2 aumento la secrecion espedfica del peptido del IFN-y por las celulas del bazo y la respuesta era dependiente de la dosis con respecto a la concentracion del conjugado utilizada para la inmunizacion y la mejora era significativamente diferente de los ratones tratados sin adyuvante ((PBS) Figura 35). Se midio el IFN-y en los sobrenadantes despues de 6 dfas de cultivo y los resultados se expresaron como promedio (=/- SEM) para los ratones a una dosis dada de la vacuna conjugada. Los aumentos para el conjugado de 25 y 100 ug fueron estadfsticamente significativos (P<0,05) frente al control sin adyuvante (PBS). Para fines comparativos, el panel inferior representa la respuesta de la DTH espedfica del peptido para dosis similares de conjugado.
IRX-2 mejora la respuesta de anticuerpos al antfgeno del peptido
Los ratones inmunizados con la vacuna basada en celulas irradiadas muestran anticuerpos sericos para los peptidos y la respuesta de anticuerpos de ratones inmunizados se mejoraba mediante IRX-2 en dosis menores de la vacuna (Figura 36). Anticuerpos sericos espedficos del peptido de ratones inmunizados con vacuna de celulas irradiadas. Las respuestas de anticuerpos en suero se midieron como densidad optica a diluciones de suero usando un anticuerpo espedfico de IgG de raton en el ensayo de ELISA como se describe en los procedimientos. Los ratones inmunizados con la vacuna mas el IRX-2 tienen una respuesta mejorada espedfica del peptido cuando la dosis de la vacuna era suboptima sin adyuvante. La respuesta era tambien significativamente diferente con IRX-2 para diluciones menores del suero a dosis mayores de la vacuna. Cuando se evaluo la vacuna conjugada con peptido KLH, IRX-2 tambien mejoraba la respuesta espedfica del peptido en comparacion tanto con el alumbre como sin adyuvante (datos no mostrados).
IRX-2 es superior a otros adyuvantes en la estimulacion de una respuesta de anticuerpos a peptidos conjugados
El IRX-2 administrado con conjugados de peptido-ovoalbumina dio como resultado anticuerpos con los peptidos, mientras que ni CpG ni alumbre administrados con el conjugado dieron como resultado anticuerpos con los peptidos (Figura 37). Los datos son para el peptido con la secuencia que comienza con ALF y la significancia era p<0,05 por ANOVA para IRX-2 frente a alumbre y CpG. Estos resultados son consistentes con el estudio de comparacion de adyuvantes de celulas T donde solo iRX-2 administrado con la vacuna conjugada dio como resultado una respuesta de DTH espedfica del peptido (vease la Figura 34 para comparacion).
Ejemplo 13
En el siguiente estudio, se demostro que IRX-2 amplifica la respuesta de celulas T a un epitope de PSMA dominante de raton en una vacuna que incluye adyuvante incompleto de Freund. IRX-2 mejoraba la respuesta de IFN-y espedfica del peptido de PSMA de ratones inmunizados con un peptido de PSMA en adyuvante incompleto de Freund. La actividad in vivo espedfica de celulas T se confirmo demostrando los aumentos totales en la secrecion de IFN-y espedfica de peptido por celulas del bazo recogidas de ratones inmunizados, asf como el numero de celulas T espedficas del antfgeno. IRX-2 en contraste con otros adyuvantes tambien mejoraba las respuestas de las celulas B a los peptidos.
Materiales y procedimientos
Reactivos y celulas
El peptido NFT utilizado en estos estudios era sintetizado por Biosynthesis Inc (Lewisville Tx). La secuencia del peptido NFT era NFTQIPHLAGTEQNF que es de protema humana. El PSMA de raton tiene una secuencia similar (NFTRTPHLAGTQNNF) pero la no identidad indicada por los aminoacidos que no estan en negrita significa que estos estudios no estan disenados espedficamente para demostrar la ruptura de la tolerancia. El peptido de inmunizacion de control negativo para estos estudios era un epitope de gripe clase II para ratones C57bl/6 (NGSLQCRICI). La ovoalbumina, el Adyuvante incompleto de Freund (IFA) y el adyuvante de combinacion (MPL + TDM en escualeno/Tween 80, tambien llamado Sistema Adyuvante Ribi o Sistema Adyuvante Sigma Numero de Catalogo S6322) se adquirieron de Sigma (St Louis, MO). El adyuvante de combinacion consistio en lfpido monofosforil A (MPL; 0,5 mg) y Trehalosa Dimicolato sintetico (TDM; 0,5 mg), y 44 ul de escualeno y 200 ul de Tween-80 en un volumen final de 1 ml de PBS (es decir, aceite en agua). El adyuvante incompleto de Freund consiste en aceite de parafina combinado con monooleato de mannida (0,85 ml de aceite de parafina y 0,15 ml de
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monooleato de mannida). El adyuvante se selecciono porque esta disponible comercialmente y es similar al adyuvante completo de Freund, pero sin toxicidad.
Inmunizacion
Ratones hembra Balb/c (6-8 semanas de edad) se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) o de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) y se mantuvieron bajo el cuidado de la Instalacion de Animales del Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) (Certificado de Aseguramiento del Bienestar Animal numero A3280-01). Todos los procedimientos fueron aprobados por el comite ALAC del CSHL. Las inmunizaciones (200 ul/raton que contienen tipicamente 100 ug de antigeno con 100 ul de adyuvante, PBS o medio X-Vivo 10) se administraron por via subcutanea en la base de la cola para proporcionar un drenaje rapido hacia los ganglios linfaticos regionales. Excepto donde se indicara lo contrario, nueve inyecciones adicionales de IRX-2 tambien en la base de la cola siguieron a la inmunizacion primaria (designada como Dfa 0), por lo que IRX-2 sin antigeno se administro los dfas 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 y 11. Los ratones que no recibieron el IRX-2 recibieron PBS o medio X-Vivo 10 los dfas 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 y 11, para controlar el posible estres en la manipulacion de los ratones. Tanto PBS como X-Vivo, cuando se administraron con antfgeno, no fueron estimuladores en comparacion con IRX-2. En el texto y las figuras, los ratones que reciben antfgeno mas PBS o X-Vivo se conocen como ratones "control" o sin adyuvante. La dosificacion se define basada en los niveles de IL-2 en IRX-2 y, a menos que se indique lo contrario, era de 700 pg/raton (15 UI/raton). Se administraron inmunizaciones de refuerzo con antfgeno mas adyuvante el dfa 14 y para el ensayo de la DTH se repitio el 28. No se administraron inyecciones diarias adicionales de IRX-2 despues de las inmunizaciones de refuerzo. Cuando se usaron celulas irradiadas como vacuna, las celulas se suspendieron en PBS o IRX-2 y se inyectaron por via subcutanea usando dosis entre 103 y 106 celulas/raton.
El IFA se mezclo como 1 parte de peptido (1 mg/ml), 1 parte de IFA y 1 parte de IRX-2 o PBS/X-VIVO. Despues de emulsionar por paso a traves de un conector luer-lock hembra:hembra que conecta dos jeringas, cada raton recibio 300 ul por via subcutanea. El adyuvante de combinacion (MPL + TDM en escualeno/Tween 80 se reconstituyo con 2 ml de PBS (segun el protocolo recomendado) y luego se mezclo con 2 ml de conjugado (1 mg/ml) y 2 ml de IRX-2 o de control. El adyuvante de combinacion se mezclo con IRX-2 mediante agitacion vorticial y cada raton recibio 300 ul por via subcutanea para dar cuenta del volumen adicional de IFA.
Ensayo de IFN-y estimulado por antfgenos
Se recogieron nodulos linfaticos y bazos en los momentos indicados (3-24 dfas despues de la primera inmunizacion de refuerzo) y se aislaron las celulas dispersandolas a traves de un tamiz de malla de alambre. Los globulos rojos en los bazos se lisaron usando tampon de lisado de cloruro de amonio (Quality Biological Inc, Gaithersburg, MD)). Las celulas adherentes para la adicion a los cultivos de celulas de los ganglios linfaticos se obtuvieron sometiendo en placas las celulas del bazo y dejandolas adherirse al plastico durante 90 minutos. Las celulas adherentes aisladas se anadieron a los cultivos para proporcionar celulas presentadoras de antfgeno adicionales (se complementaron 2-6 x 105 linfocitos por pocillo con 2-4 x 104 celulas adherentes). La liberacion de IFN-y por activacion de linfocitos inducida por antfgeno se midio en los sobrenadantes recogidos el dfa seis usando reactivos ELISA Duo-Sets de R&D Systems (Mineapolis, MN).
Ensayo ELISpot (ensayo de puntos de inmunoadsorcion ligada a enzimas)
Las celulas se sometieron en placas a 2 x 105 linfocitos por pocillo para celulas del bazo o 3 x 105 linfocitos por pocillo para celulas de los ganglios linfaticos. Las placas ELISpot (Millipore, Billerica, MA) se recubrieron con anticuerpo de captura (MAB-18 de MabTech (Mariemont, OH) en PBS durante la noche. Las placas se lavaron, se anadieron el antfgeno y las celulas, y luego se incubaron durante 18 horas a 37 °C. Los pocillos se lavaron a fondo con PBS para eliminar las celulas y se anadio un segundo anticuerpo biotinilado (MabTech) para una incubacion adicional de 18 h. Las placas se desarrollaron usando sustrato secuencial de biotina-AP y DAB. Las placas se leyeron utilizando un microscopio con software de conversion digital de ZellNet (Fort Lee, Nueva Jersey)
Resultados
Inmunizacion de peptido de celulas T en IFA para definir la actividad de IRX-2
Las respuestas de las celulas T a los epitopes dominantes de peptidos de los antfgenos proteicos se evaluan tipicamente administrando los peptidos en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA). El IFA es eficaz como resultado de su efecto de deposito y su potencial para generar reacciones inflamatorias en el sitio. Los ratones inmunizados con el peptido NFT dominante en IFA, montaron una respuesta inmunitaria que se mejoraba mediante el tratamiento con IRX-2 segun se midio mediante el ensayo ELISpot para ganglios linfaticos y celulas del bazo (Figura 38A). El peptido sin IFA con o sin IRX-2 no era significativamente diferente de los ratones sin tratamiento previo (datos no mostrados). La Figura 38B confirma que el aumento inducido por IRX-2 en la respuesta ELISpot a celulas del bazo tambien se reflejo en el ensayo de secrecion de IFN-y. Las Figuras 39A y 39B presentan el desarrollo temporal de la respuesta de celulas T tal como se define mediante el ensayo ELISpot de celulas recogidas de ratones a lo largo del tiempo despues de la inmunizacion de refuerzo. IRX-2 aumenta la respuesta inmunitaria en comparacion con el control solo de antfgeno en el ganglio linfatico en todos los puntos temporales. En las celulas del bazo, la respuesta se mejoraba solo en los dfas 17-19. El ensayo ELISpot con NFT en iFa tambien se uso para medir la dosificacion
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optima de IRX-2. Como se muestra en la Figura 40A, la dosis optima de IRX-2 era de 700 pg de equivalentes de IL- 2/raton administrados diariamente durante 10 dfas. Usando la dosis optima, se encontro que tanto 9 como 4 dosis adicionales de IRX-2 eran similares (figura 40B). Una unica administracion de IRX-2 no es suficiente para mejorar la respuesta de celulas T (figura 40B). Se obtuvieron resultados similares usando conjugados de peptidos como el inmunogeno en los ensayos ELISpot y DTH (datos no mostrados).
IRX-2 mejora preferentemente las respuestas de las celulas T
Se comparo IRX-2 con un adyuvante de combinacion comercialmente disponible (MPL + TDM + escualeno + Tween 80) usando conjugados de peptido NFT y se evaluo midiendo la respuesta de celulas T a NFT y la respuesta de celulas B a ovoalbumina o KLH, que fueron utilizados como portadoras. El adyuvante basado en MPL + TDM esta disponible comercialmente de SIGMa y es similar al adyuvante RIBI previamente disponible de RIBI Adjuvant Company y posteriormente vendido por Sigma Chemical Company. Se considera que el adyuvante es el ejemplo prototfpico de un adyuvante fuerte, ya que es equivalente al adyuvante de Freund clasico pero sin los efectos secundarios toxicos. El tttulo de anticuerpos para KLH a la dosis de 100 ug/ml utilizada con el conjugado no aumentaba con el adyuvante debido a la potente actividad de KLH (datos no mostrados). Para estos estudios, la respuesta a la ovoalbumina se uso para evaluar la actividad de las celulas B de los adyuvantes. El aumento en la respuesta de celulas T para el conjugado de NFT el dfa 3 despues de la inmunizacion de refuerzo era positivo para IRX-2 y el adyuvante de combinacion (figura 41A) aunque IRX-2 era superior al adyuvante de combinacion. Por el contrario, IRX-2 mejoraba la respuesta de celulas B, pero no era tan eficaz como el adyuvante de combinacion con respecto a los tttulos de anticuerpos en suero (figura 4lB).
Estudios profilacticos de vacunas tumorales
Estudios previos demostraron que los ratones inmunizados con una dosis mas alta de celulas 3T3 irradiadas que expresan hPSMA (P-3T3) que las utilizadas en nuestros estudios estaban protegidos frente al desaffo tumoral con celulas RENCA que expresan PSMA (P-RENCA) en comparacion con ratones inmunizados con celulas 3T3 que contienen solo el neo-vector. Se confirmaron y ampliaron estos estudios utilizando celulas 3T3 que expresan hPSMA con o sin tratamiento con IRX-2 y posteriormente se desafiaron con celulas P-RENCA. Como se informo anteriormente, los ratones que se inmunizaron con una alta dosis de celulas (>106 celulas/raton) estaban completamente protegidos incluso sin adyuvante (datos no mostrados). Los ratones inmunizados con una dosis inferior de 105 celulas/raton tuvieron un retraso en el crecimiento tumoral y el IRX-2 mejoraba la proteccion (figura 42). Hubo una mejor supervivencia con IRX-2, pero solo unos pocos ratones no desarrollaron tumores en el grupo IRX-2. Para evaluar si el epitope dominante era protector, los ratones se inmunizaron con el conjugado NFT-KLh (con o sin IRX-2). Se inmunizo un conjunto de ratones control solo con KLH (con o sin IRX-2). Como se muestra en la figura 42A-C, los ratones inmunizados con NFT-KLH mas IRX-2 tuvieron un retraso temprano en el crecimiento del tumor en comparacion con los otros tres grupos (NFT-KLH sin adyuvante o KLH con o sin IRX-2). Ninguno de los ratones rechazo completamente el tumor y la proteccion temprana definida por el crecimiento del tumor, no se tradujo en una mayor supervivencia.
IRX-2 es superior a otros adyuvantes en un sistema de vacuna conjugada con peptido
Ratones de 8-10 semanas de edad (5-8 por grupo) se inmunizaron con el conjugado NFT-KLH y con IRX-2, un adyuvante de combinacion lfpido monofosforil A (MPL) + trehalosa dicornimicolato (TDM) en escualeno/Tween 8 o control. La respuesta ELISpot espedfica de NFT se midio usando celulas de ganglios linfaticos obtenidas 3 dfas despues de la inmunizacion de refuerzo. Como se muestra en la figura 43, era superior a la vacuna de MPL y TDM en la mejora de respuestas de celulas T espedficas de antfgeno in vivo, como se midio mediante celulas secretoras de IFN-y. Los datos se expresan como el aumento en ELISpots espedficos de NFT (media ± SEM).
Ejemplo 14
El desarrollo de vacunas de subunidades que consisten en antfgenos definidos derivados de organismos infecciosos o tumores se ha visto obstaculizado en gran medida por la falta de adyuvantes de celulas T CD8 eficaces e inductores de Th1. Estas respuestas colaboran para mediar en la inmunidad eficaz mediada por celulas, lo que da como resultado la eliminacion de celulas anfitrionas infectadas o malignas. De hecho, la mayona de las vacunas que se utilizan actualmente consisten todavfa en organismos vivos atenuados, que pueden ser diffciles de preparar y tienen potenciales problemas de seguridad y de almacenamiento. Adyuvantes tales como aceite mineral, micobacterias y alumbre se necesitan con frecuencia para amplificar la inmunidad adquirida. Se considera que el mas eficaz es generalmente CFA, que solo se puede usar en animales y puede causar una inflamacion danina de la piel. Estos estudios descritos a continuacion demuestran que el IRX-2 anadido a una vacuna multi-adyuvante que consiste en adyuvantes dependientes, e independientes, de TLR induce niveles extremadamente altos de inmunidad en celulas T espedficas de antfgeno.
El siguiente ejemplo demuestra que IRX-2 mejora las vacunas de peptidos en combinacion con otros adyuvantes que funcionan con mecanismos tanto dependientes como independientes de TLR. Ademas, IRX-2 mejoraba el numero de celulas T espedficas de antfgeno in vivo despues de la vacunacion con una vacuna multicomponente asf como la actividad citotoxica de las celulas T espedficas de antfgeno.
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Materiales y procedimientos
Combinaciones de adyuvantes y procedimientos de vacunacion
Ratones C57BL/6 o BALB/c (Harlan) se inmunizaron por via intradermica (i.d.) con combinaciones de los siguientes reactivos en PBS (por raton): peptido OVA257-264 (SIINFEKL) (100 |jg; Prolmmune), IFN-y (100 ng, Peprotech), emulsion de Ifpido monofosforil A (MPL) mas trehalosa 6,6'-dimicolato (TDM) (adyuvante Ribi, utilizado segun las instrucciones del fabricante; Sigma-Aldrich), CpG 1826 (25 jg; VH Bio), poli-inosinico: acido policitidflico (poli l:C; 50 jg; Sigma-Aldrich), MPL (50 jg; InvivoGen), los volumenes de vacuna final fueron 200 jl (100 jl/flanco); las vacunas se calentaron a 37 °C y se agitaron energicamente antes de la inyeccion. Los ratones se cebaron el dfa 0 y se reforzaron en los dfas 9-11 con las mismas dosis de Ag/adyuvante a menos que se indicara lo contrario. Los adyuvantes combinados que contienen MPL mas TDM, un agonista de TLR adicional, IFN-y, y o peptido de clase II anti-CD40, o protema completa se denominan adyuvante combinado para la activacion sinergica de la inmunidad celular (CASAC). Se extrajeron muestras de sangre para analisis pentamero en los dfas 19 a 21 a menos que se indicara lo contrario. Los ensayos de CTL in vivo se realizaron en los dfas 20-22, a menos que se indicara lo contrario.
Ensayos de citotoxicidad in vivo
Los esplenocitos de ratones C57BL/6 no cebados se pulsaron con 10 jg/ml de peptido antigenico en cultivo durante 1 h. Estas celulas se lavaron luego dos veces en pBs y se marcaron con CFSE 0,3 jM durante 10 minutos. Las celulas de control se cultivaron en un medio por separado y marcadas con CFSE 3 jM. Las celulas control y diana (107 cada una) se mezclaron y se transfirieron por via intravenosa en receptores inmunizados o de control. Dieciocho horas mas tarde se recogieron los bazos y se analizaron con CFSE mediante citometna de flujo. Los numeros de celulas diana (CFSEbajo) frente a control (CFSEalto) recuperadas se usaron para calcular el porcentaje de muerte con la siguiente formula: muerte (%) = 1 - [(n.° de dianas/n.° de celulas de control en animales inmunizados)/(n° de dianas/n° de celulas de control en el animal de control)] x 100.
Resultados
IRX-2 tiene un efecto sinergico con otros adyuvantes en vacunas de peptidos
Como se muestra en la figura 44, IRX-2 en combinacion con una preparacion multi-adyuvante (CpG, poli I:C, IFN-g en emulsion de aceite) es superior a la combinacion de adyuvantes en solitario en la creacion de celulas T espedficas de antfgeno. El porcentaje de celulas T espedficas de antfgeno despues de la vacunacion como se muestra en la figura 44A se incrementaba cuando a la vacuna se anadfa IRX-2. Ademas, el numero de moleculas MHC espedficas de antfgeno por celula T se incrementaba cuando se anadfa IRX-2 a la vacuna como se muestra en la Figura 44B.
IRX-2 aumenta la citotoxicidad de las celulas T espedficas de antfgeno cuando se anade a una vacuna de peptidos que contiene adyuvantes dependientes e independientes de TLR.
Como se muestra en la figura 45, IRX-2 en combinacion con una preparacion multi-adyuvante (CpG, poli I:C, IFN-y en emulsion de aceite) es superior a la combinacion de adyuvante en solitario en la mejora de la actividad citotoxica de las celulas T espedficas de antfgeno que se crearon mediante la vacunacion con la vacuna. Ademas, se mostro en la Figura 45 que cuando se anadfa IRX-2 a la vacuna multi-adyuvante solo se necesitaba una unica inyeccion.
Ejemplo 15
Mejora con IRX-2 de la respuesta inmunitaria a la ovoalbumina expresada por un vector vmco de la viruela del canario (ALVAC)
El siguiente ejemplo demuestra la capacidad de IRX-2 para mejorar las respuestas de las celulas T a un antfgeno expresado en una vacuna basada en virus. Ademas, se demostro que IRX-2 mejoraba las respuestas de las celulas T a una base vmca que se mejoraba aun mas con TRICOM, una tnada de moleculas estimuladoras.
OVA-ALVAC es un virus de la viruela del canario que se ha "modificado por ingeniena genetica" para expresar la protema ovoalbumina. Una supuesta ventaja de la construccion es que el virus debe generar una "respuesta inflamatoria" que elimina la necesidad de un adyuvante de TLR. OVA-ALVAC infecta todas las celulas en el sitio, incluidas las celulas (DC) presentadoras de antfgeno que contemplan la presentacion del antfgeno procesado sin un requisito de presentacion cruzada. Los ganglios linfaticos que drenan el sitio reciben tanto la ovoalbumina secretada por las celulas infectadas como las DC que han migrado desde el sitio de la inflamacion. La APC que ingresa al ganglio es la principal impulsora de las celulas T (T cooperadoras y T citotoxica) y la ovoalbumina que drena desde el sitio al ganglio es necesaria para generar las celulas productoras de Anticuerpos. Dos diferentes construcciones que expresan ovoalbumina estaban disponibles para la evaluacion: OVA-ALVAC y OVA-TriCom-ALVAC. La construccion de TriCom se modifico por ingeniena genetica para expresar LFA-1, ICAM-1 y B7.1 ademas de la ovoalbumina. Se supone que estas tres protemas mejoran la respuesta inmunitaria al contemplar una sobreexpresion de importantes protemas coestimuladoras.
Materiales y procedimientos
El modelo para evaluar la respuesta inmunitaria era la inmunizacion primaria seguida de una inmunizacion de refuerzo el dia 14. IRX-2 se administro con las construcciones ALVAC en ambos d^as. Se administro IRX-2 adicional durante 9 dfas despues de la inmunizacion primaria. Los ratones fueron sacrificados o se les extrajo sangre en los 5 dfas indicados en las figuras que se adjuntan en este informe. Se usaron tres dosis de OVA-ALVAc en el estudio (3x107 (dosis estandar), 3x106, 3x105, ufp por raton). Dos dosis de OVA-TriCom-A ALVAC- tambien se evaluaron en el estudio (3 x 106 (dosis estandar) y 3x105 ufp por raton). La respuesta de celulas T en los ganglios linfaticos y en los bazos se midio mediante ELISpot usando el epitope dominante de raton (SIINFEKL). La respuesta de las celulas B se midio por ELISA usando placas revestidas con ovoalbumina y suero de ratones inmunizados.
10 Resultados
IRX-2 aumenta la respuesta de anticuerpos despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus.
Como se muestra en la Figura 46, la respuesta de anticuerpos despues de la vacunacion con una vacuna vmca se mejoraba mediante la adicion de IRX-2. IRX-2 aumento consistentemente la respuesta de celulas T espedficas del peptido en comparacion con el control en todos los puntos temporales.
15 IRX-2 aumenta la respuesta de celulas T despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus.
Como se muestra en la figura 47, IRX-2 mejoraba la respuesta de celulas T espedficas de antigeno despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus.
IRX-2 mejora las respuestas de las celulas T despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus que expresa TRICOM.
20 IRX-2 mejoraba las respuestas de las celulas T al hielo inmunizadas con las dosis mas bajas de la construccion OVA-TriCom-ALVAC. La respuesta de las celulas T era dependiente de la dosis ya que la dosis mas baja de OVA- TriCom-ALVAC daba una menor respuesta de las celulas T. Como se muestra en la figura 48, IRX-2 mejoraba la respuesta de las celulas T en comparacion con el control para ratones inmunizados con 3 x105 ufp por raton pero no ratones inmunizados con una dosis mas alta de OVA-TriCom-ALVAC (3 x 106 ufp por raton).
25 IRX-2 Mejora la expansion de celulas T de memoria espedficas de antfgeno despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus
Como se muestra en la figura 49, IRX-2 mejoraba las celulas T con memoria positiva para el peptido en comparacion con el control. Tanto los ratones inmunizados con 106 ufp como con 105 ufp tuvieron una respuesta mas fuerte cuando se incluyo IRX-2 en la vacuna. La diferencia entre la respuesta primaria y la respuesta de expansion para la 30 dosis mas alta de vacuna puede deberse a que la respuesta primaria mide las celulas T activas mientras que la respuesta de expansion se concentra en las celulas de memoria.
IRX-2 mejora las respuestas de anticuerpos IgM despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus.
Como se muestra en la Figura 50, IRX-2 mejora la respuesta para el anticuerpo IgM espedfico de ovoalbumina en todo momento y las dosis de OVA-ALVAC.
35 IRX-2 mejora las respuestas de anticuerpos IgGi e IgG2A despues de la vacunacion con una vacuna basada en virus
Como se muestra en la figura 51, la respuesta de IgGi y la respuesta de IgG2A fueron mayores en ratones inmunizados con IRX-2 en comparacion con el control cuando se representaron graficamente como dilucion de suero frente a DO.
Discusion
40 Los resultados de este estudio apuntan a IRX-2 como una terapia poderosa que puede usarse para iniciar una respuesta inmunitaria celular contra antfgenos tumorales administrados de forma exogena en una vacuna contra el cancer o contra una enfermedad infecciosa. El IRX-2 administrado con una vacuna basada en celulas irradiadas que expresan PSMA o una vacuna conjugada de peptido sintetico era capaz de mejorar las respuestas inmunitarias de celulas T in vivo a estos antfgenos. La naturaleza novedosa de la actividad de iRX-2 se confirmo comparando IRX-2 45 con otros adyuvantes, que se seleccionaron para representar diversos mecanismos de accion. Alumbre se evaluo porque es un adyuvante aprobado por la FDA ampliamente utilizado, CpG porque es un agonista de TLR que se dirige a las celulas presentadoras de antfgenos y el Sistema Adyuvante RIBI (RAS) porque contiene multiples actividades adyuvantes y es una alternativa mas segura que el adyuvante de Freund en modelos murinos. IRX-2 mejoraba la respuesta de DTH espedfica del peptido a la vacuna conjugada, pero alumbre, CpG o RAS no lo 50 hicieron. La mejora con IRX-2 de la respuesta de DTH espedfica del peptido de celulas T in vivo iba acompanada por respuestas de celulas T mejoradas de celulas del bazo ex vivo a antfgeno espedfico medidas por la secrecion de IFN-y. Estos resultados tambien ponen en paralelo la respuesta de anticuerpos con los peptidos. Si bien todos los adyuvantes mejoraban la respuesta de anticuerpos asf como la respuesta de DTH al portador de las protemas (en
comparacion con PBS), solo IRX-2 mejoraba la respuesta de anticuerpos con los peptidos que estaban conjugados con la portadora. IRX-2 tambien mejoraba la respuesta de anticuerpos espedficos del peptido cuando se usaron celulas irradiadas que expresan PSMA como el inmunogeno. Estas observaciones son importantes porque existe una homolog^a del 80 % entre la protema humana y la de raton y muestra que la tolerancia a los peptidos se puede 5 superar mediante IRX-2 en comparacion con otros adyuvantes.
Los estudios informados aqu proporcionan datos preclmicos importantes que muestran que IRX-2 mejora las respuestas inmunitarias de las celulas T frente a antfgenos exogenos y pueden usarse en combinacion con multiples tipos de antfgenos en vacunas terapeuticas contra el cancer. La naturaleza unica de la respuesta espedfica del peptido de las celulas T tanto a la celula irradiada como a la vacuna conjugada es el resultado del modo de accion 10 de multiples dianas del IRX-2 y la sinergia entre las citocinas. IRX-2 proporciona una plataforma adyuvante de celulas T que da como resultado una vacuna con actividades multiples que incluyen no solo una mayor presentacion de antfgenos sino tambien la estimulacion de la diferenciacion, proliferacion y migracion posteriores de las celulas T a la periferia. Las citocinas tambien cambian la tolerancia de las DC o el equilibrio de las celulas T reguladoras hacia la activacion de la respuesta a epitopes de celulas T y mejoran la produccion de celulas T de memoria. El IRX-2 15 tambien mejora los epitopes de celulas T cooperadoras en la portadora o en las celulas irradiadas que proporcionan la estimulacion adicional del desarrollo de una respuesta eficaz de las celulas T.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende un biologico derivado de celulas primarias que comprende interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), factor a de necrosis tumoral (TNF-a) y Y-interferon (IFN-y), y una vacuna contra el cancer que comprende al menos un acido nucleico que codifica un antigeno en un
    5 vector vmco.
  2. 2. Una composicion segun la reivindicacion 1, en donde el vector vmco es un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus del herpes o virus de la viruela.
  3. 3. Una composicion segun la reivindicacion 2, en donde el virus de la viruela es una vacuna, vacuna modificada Ankara (MA), NYVAC, viruela aviar, TROVAX, viruela de aves de corral o viruela del canario.
    10 4. Una composicion segun la reivindicacion 3, en donde la viruela del canario es ALVAC o ALVAC(2).
  4. 5. Una composicion segun la reivindicacion 1, que incluye adicionalmente un adyuvante independiente del receptor tipo peaje y/o un adyuvante dependiente del receptor tipo peaje.
  5. 6. Una composicion segun la reivindicacion 1, en donde el biologico derivado de celulas primarias comprende 60
  6. 6.000 pcg/ml de IL-1, 600-60.000 pcg/ml de IL-2, 60-6.000 pcg/ml de IL-6, 6.000-600.000 pcg/ml de IL-8, 20015 200.000 pcg/ml de TNF-a y 200-200.000 pcg/ml de IFN-y.
  7. 7. La composicion de la reivindicacion 1, para uso en el tratamiento del cancer.
  8. 8. Una composicion que comprende un biologico derivado de celulas primarias que comprende IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a e IFN-y, para uso en un procedimiento de vacunacion, comprendiendo dicho procedimiento administrar dicha composicion y una vacuna que comprende al menos un acido nucleico que codifica un antfgeno en un vector vmco.
    20 9. Una composicion para uso segun la reivindicacion 8, en donde la vacuna es una vacuna contra el cancer.
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