JP2008501697A - Cd4/cd8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法 - Google Patents
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Abstract
CD8+ T細胞の減少、及び腫瘍浸潤CD4+ T細胞の相当な増加による、浸潤免疫細胞の相当な変化をもたらす、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法。特定の比率で、サイトカインIL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの混合物である白血球インターロイキン注射剤(LI)を、800IU/日(IL−2に換算)の用量で週5日、3週間投与すると、パラダイムシフトが生じた。このパラダイムシフトは、CD4+ T細胞の著明な浸潤、並びに癌巣中の抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)及び炎症細胞(特に、好中球)の密度及び局所分布の明白且つ特異的な変化によって規定される。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
[1] 本特許又は出願は、カラーを用いて作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を有する本出願又は特許出願公報のコピーは、請求及び必要な料金の支払いにより、特許庁より提供される。
[2] 本発明は、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法に関する。800IU/日(IL−2に換算)を週5日投与する白血球インターロイキン注射剤(LI)治療を合計3週間行うと、CD8+ T細胞の減少、及び腫瘍浸潤CD4+ T細胞の相当な増加による、浸潤免疫細胞の相当な変化が見られる。口腔扁平上皮癌(OSCC)患者の対照無処置群で見られる低いCD4/CD8比は、LI治療により、間質内及び上皮内で劇的に上昇した。また、進行した原発性OSCC患者に、800IU/日(IL−2に換算)を週5日投与するネオアジュバントLI治療を3週間行った結果、パラダイムシフトが生じた。このパラダイムシフトは、CD4+ T細胞の著明な浸潤、並びに癌巣中の抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)及び炎症細胞(特に、好中球)の密度及び局所分布の明白且つ特異的な変化によって規定される。
[3] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、特定の比率で、サイトカインIL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの混合物である。LIは、癌細胞が細胞周期増殖期に入るのを誘導し、それによって化学療法、放射線療法及び免疫療法に対する感受性を高めるのにも有効である。2003年7月3日出願の米国特許出願10/611914(参照されることにより、本明細書にそのまま組み込まれる。)に記載のように、LIは、癌治療のために単独で、又は他剤と組み合わせて使用することができ、それによって癌治療の成功率、及び癌患者の無病生存率を増加させる。
[4] 腫瘍宿主相互作用は腫瘍発達の複雑な機構であり、抗癌治療のためのますます重要な標的となっている(Timarら、「Molecular pathology of tumor metastasis III.Target array and combinatorial therapies」、Pathol Oncol Res 9:49(2003))。癌細胞、免疫エフェクター細胞、炎症細胞、腫瘍脈管構造及び間質の間の細胞間相互作用は、複雑で多面的な相互作用を示す。この複雑な双方向性ネットワークの個々のメンバーの機能の治療的調整は、より強い腫瘍制御をもたらすと考えられる。
[5] 良好な免疫療法の抗癌作用は、一般に、標的腫瘍細胞上の腫瘍抗原及びMHC抗原の発現、エフェクター機構への癌細胞の感受性、並びに抗癌エフェクター機構の活性の誘導/増大をもたらす(Whiteside、「Immunobiology and immunotherapy of head and neck cancer」、Current Oncol Rep 3:46(2001);Whitesideら、「Evidence for local and systemic activation of immune cells by peritumoral injections of interleukin 2 in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck」、Cancer Res 53:5654(1993))。サイトカインを用いて免疫エフェクター機構を強化することにより上記目標を達成する、実行可能な免疫戦略がいくつか存在する。口腔扁平上皮癌(OSCC)は最近まで免疫療法の標的とは考えられていなかったが、Whitesideらによる先駆的な研究は、免疫療法的アプローチが、この極めて攻撃的な癌を管理する新たな方法となりうることを示唆した。
[6] 初期の結果は、rhIL−2の局所投与に関して、奏効率の変動が大きい(6〜65%)ことを示した(Vlockら、「Phase Ib trial of the effect of peritumoral and intranodal injections of interleukin−2 in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck:an eastern cooperative oncology group trial」、J Immunother 15:134(1994);Cortesinaら、「Interleukin−2 injected around tumor−draining lymph nodes in head and neck cancer」、Head Neck 13:125(1991))。OSCC患者へのrhIL−2の局所投与を含む第3相試験の結果、全生存率と同様に無病生存率が有意に(p<0.03)上昇した(De Stefaniら、「Treatment of oral cavity and oropharynx squamous cell carcinoma with perilymphatic interleukin−2:clinical and pathologic correlations」、J Immunother 19:125(1996);De Stefaniら、「Improved survival with perilymphatic interleukin−2 in patients with respectable squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx」、Cancer 95:90(2002))。rhIL−2で治療されたOSCC患者から得られた腫瘍組織の組織学的検査では、巣状壊死を有するCD25+/HLADR+/CD3+T細胞の増加が示された(Valenteら、「Infiltrating leukocyte populations and T−lymphocyte subsets in head and neck squamous cell carcinoma from patients receiving perilymphatic injections of recombinant interleukin 2」、Modern Pathol 3:702(1990)。
[7] 天然のサイトカインの混合物と天然のIL−2とを用いた臨床試験は、30%〜53.3%の奏効率を示した(Haddenら、「Interleukins and contrasuppression induce immune regression of head and neck cancer」、Arch Otolaryngol Head Neck Surg 120:395(1994);Verasteguiら、「A natural cytokine mixture(IRX−2)and interference with immune suppression induce immune mobilization and regression of head and neck cancer」、Int J Immunopharmac 19:619(1997);Menesesら、「Histologic findings in patients with head and neck squamous cell carcinoma receiving perilymphatic natural cytokine mixture(IRX−2)prior to surgery」、Arch Pathol Lab Med 122:447(1998);Barreraら、「Combination Immunotherapy of squamous cell carcinoma of the head and neck」、Arch.(2000))。組織病理学的分析は、天然のサイトカイン混合物が、腫瘍の顕著な用量依存性Tリンパ球浸潤及び腫瘍断片化を誘導することを示した。
[8] 他方、特定の比率で、サイトカインIL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの白血球インターロイキン注射剤(LI)混合物は、CD3+、CD25+Tリンパ球が腫瘍細胞巣に浸潤すること、及び癌細胞が細胞周期モードに入ることを誘導した(Timarら、「The Effect of Leukocyte Interleukin Injection(Multikine(登録商標))Treatment on Peritumoral and Intratumoral Subpopulation of Mononuclear Cells and on Tumor Epithelia:A Possible New Approach to Augmenting Sensitivity to Radiation Therapy and Chemotherapy in Oral Cancer」、Laryngoscope 113:2206(2003))。
[9] Timarらに報告されているように、約20IU〜1600IU、又は特に400IU若しくは800IUの白血球インターロイキン(LI)注射が、2週間に渡って、週3回、腫瘍周囲に投与され、或いは、約20IU〜1600IU、又は特に400IU若しくは800IUが、週5回投与された(ここで、IUは、ヒトIL−2に関する世界保健機関第1次国際標準、86/504で規定されている、インターロイキン2に関する国際単位を表す)。これらの用量を、従来の療法より前の第1選択の治療として、進行した原発性OSCCの患者に投与すると、炎症細胞ではなく浸潤免疫細胞において腫瘍内変化が誘導された。CD25+発現の増加によって明らかなように、癌巣に移動したT細胞集団、及び浸潤CD8+ T細胞が活性化された。
[10] 腫瘍破壊のためにCD8+ 細胞傷害性T細胞が必要であることが科学文献で一般に認められているが、OSCCの腫瘍細胞上のHLAクラス1の発現の欠如は、OSCCにおけるCD8+ 細胞ターゲッティングを排除しているようである。従って、OSCCへの良好な免疫応答のためには、腫瘍中の低いCD4/CD8比を逆転させる必要がある。
[11] 特に、ナイーヴな無処置のOSCC患者における腫瘍及びその周囲の間質中の、CD4+ T細胞に対するCD8+ T細胞の優勢は、OSCCに特異的なものではなく、他の多くの固形腫瘍で見られる。同様に、低いCD4/CD8比が基底細胞癌、子宮頸癌及び乳癌で検出されているが、これは、それらの腫瘍によって、患者において後天的な免疫抑制状態が誘導されることを示唆している(Rohrbachら、「Immunology and growth characteristics of ocular basal cell carcinoma」、Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 239:35(2001);Santinら、「Tumor−inflitrating lymphocytes contain higher numbers of 1 cytokine expressors and DR+T cells compared with lymphocytes from tumor draining lymph nodes and peripheral blood in patients with cancer of the uterine cervix」、Gynecol Oncol 81:424(2001);Ben−Hurら、「The role of lymphocytes and macrophages in human breast tumorigenesis: an immunohistochemical and morphometric study」、Anticancer Res 22(2B):1231(2002))。
[12] 総合すると、これらの研究及び観察は、天然のサイトカインの混合物による局所療法が、OSCCの治療への実行可能なアプローチであることを示している。しかし、誘導された、腫瘍における細胞浸潤の変化、腫瘍組織学的変化、並びに、臨床的に測定された反応の間の関係は評価されなかった。
[13] 従って、癌巣内の抗原提示細胞(樹状細胞)及び炎症細胞(特に、好中球)の密度及び局所分布を特異的に調整する必要がある。また、腫瘍免疫細胞浸潤の構成を変化させて、腫瘍内CD4/CD8比を逆転させる必要がある。また、LIの投与と組み合わせて、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させて、残存腫瘍細胞の放射線療法に対する感受性を高める方法を提供する必要がある。
[14] G1期、S期、G2期及びM期からなる(細胞周期の異なる相の)群から選択される細胞周期へ腫瘍細胞を誘導する方法も必要である。この新たな方法は、化学療法、免疫療法及び放射線療法と共に、また、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させることにより、相乗的に適用することができる。
[15] CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させることにより、公知の組成物又は方法に優る予想外の効果を示す、特定の比率で、IL−1β及びIL−2、TNF−α及びIL−2、IFN−γ及びIL−2、並びにGM−CSF及びIL−2、を含有する、新規の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物が必要であるのみならず、癌腫瘍一般を前感作することも必要である。
[16] 本発明の一部は、特定の比率で、サイトカインIL−1β及びIL−2、TNF−α及びIL−2、IFN−γ及びIL−2、並びにGM−CSF及びIL−2を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの白血球インターロイキン注射剤(LI)混合物を用いて、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法に基づく。本発明は、医薬として、或いは、癌治療(例えば、化学療法、免疫療法及び放射線療法)と共に用いるアジュバントとして有用な組成物の開発も可能にする。
[17] 本発明の実施形態では、新生物又は免疫系疾患において、無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を用いてCD4/CD8比を変化させる方法が開示される。このような方法は、腫瘍細胞を殺傷する放射線療法又は他の物理療法と併用する、癌治療のための前感作ステップを提供する。G1期、S期、G2期及びM期からなる(細胞周期の異なる相の)群から選択される感受性細胞周期相に腫瘍細胞を誘導する方法も企図される。本発明は、特定の1種の癌に限定されず、いかなる種類の癌も包含する。
[18] 具体的な適用例としては、白血球インターロイキン注射剤(LI)の総日用量の半量を腫瘍周囲に投与し、総日用量の他の半量を3週間に渡って、週5回、外リンパに投与することが挙げられる。総日用量は、IL−2に換算して800IU/mL(ここで、IUは、ヒトIL−2に関する世界保健機関第1次国際標準、86/504で規定されている、インターロイキン2に関する国際単位を表す。)である。全用量の半分は、腫瘍周囲用量である。すなわち、400IUは、腫瘍塊周囲の4つの異なる部位に注射する。各部位に約100IU/mL(IL−2に換算)が投与されるように、腫瘍周囲用量の1/4ずつを4つの部位の各々に注射する。LIは、可視的/触知可能な腫瘍塊の周縁部に皮内投与する。400IU(IL−2に換算)の全用量の残りの半分は、同一受診時に、腫瘍周囲への投与に続いて、腫瘍部位と同側の外リンパに投与する。外リンパへの注射は、注射された腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う。
[19] 本発明の他の実施形態は、以下の特定比率のサイトカイン及びインターロイキン2(IL−2)を含有する白血球インターロイキン注射剤(LI)を包含する。IL−1βのIL−2に対する比率(IL−1β/IL−2)が0.4〜1.5、好ましくは0.7±0.1;TNF−αのIL−2に対する比率(TNF−α/IL−2)が3.2〜10.9、好ましくは9.5±1.8;IFN−γのIL−2に対する比率(IFN−γ/IL−2)が1.5〜10.9、好ましくは6.0±1.1;GM−CSFのIL−2に対する比率(GM−CSF/IL−2)が2.2〜4.8、好ましくは4.0±0.5。
[20] 他の具体的な適用例では、無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン製剤又は医薬組成物は、他の異なるサイトカイン及び他の生物活性小分子を含有し、生物活性小分子及びIL−2の比率は以下の通りである。IL−3のIL−2に対する比率が0.38〜0.68、好ましくは0.53±0.15;IL−6のIL−2に対する比率が37.2〜53.8、好ましくは46±5.9;IL−8のIL−2に対する比率が261〜561.5、好ましくは411±10.6;IL−1αのIL−2に対する比率が0.56〜0.94、好ましくは0.75±0.19;IL−10のIL−2に対する比率が2.82〜3.22、好ましくは3.0±0.18;IL−16のIL−2に対する比率が1.16〜2.84、好ましくは1.84±0.68;G−CSFのIL−2に対する比率が2.16〜3.78、好ましくは2.97±0.81;TNF−βのIL−2に対する比率が1.17〜2.43、好ましくは1.8±0.63;MIP−1αのIL−2に対する比率が15.7〜37.16、好ましくは22.7±7.0;MIP−1βのIL−2に対する比率が17.1〜28.5、好ましくは22.8±5.7;RANTESのIL−2に対する比率が2.3〜2.7、好ましくは2.5±0.13;EGFのIL−2に対する比率が0.267〜0.283、好ましくは0.275±0.008;PGE2のIL−2に対する比率が3.63〜5.42、好ましくは4.5±0.87;TxB2のIL−2に対する比率が23.47〜25.13、好ましくは24.3±0.83。
[21] 本発明の他の目的及び利点は、以下で説明する。開示の一部を構成する添付図面及び表は、本発明の原理を例示し、また、明細書と共にそれを説明する。当業者には、本発明の他の態様が、添付図面及び以下の詳細な説明を参考にすれば明白になることが理解されよう。
[22] 本発明を、以下の説明及び具体的な実施形態により、また、添付図面も用いて、より詳細に説明する。
[32] 本発明は、癌腫瘍一般を前感作する方法、並びに、特定の比率で、IL−1β及びIL−2、TNF−α及びIL−2、IFN−γ及びIL−2、並びにGM−CSF及びIL−2、を含有する、新規の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物に関する。そのような新規サイトカイン混合物の1つは、白血球インターロイキン注射剤(LI)であり、免疫調整能力を示している。癌患者における免疫抑制の臨床的重要性は、意外なことに、治療前、特に細胞周期相への腫瘍細胞の突入前に癌を前感作する方法に影響を及ぼす。
[33] 更に、週5回、3週間の、腫瘍周囲への400IU/mLの白血球インターロイキン注射剤(LI)の投与、及び外リンパへの400IU/mLの投与は、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させた。腫瘍周囲への投与は、腫瘍塊周囲の4つの異なる部位に100IU/mL(IL−2に換算)を注射することによって行う。各部位に約100IU/mL(IL−2に換算)が投与されるように、全腫瘍周囲用量の1/4ずつを4つの部位の各々に注射する。800IU(IL−2に換算)の全用量の残りの半分は、同一受診時に、腫瘍周囲への投与に続いて、腫瘍部位と同側の外リンパに投与する。外リンパへの注射は、注射された腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う。IUは、ヒトIL−2に関する世界保健機関第1次国際標準、86/504で規定されている、インターロイキン2に関する国際単位を表す。
[34] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、T細胞、B細胞及びマクロファージを含むヒト末梢血単核細胞から産生される、無血清、マイトジェンフリー且つ抗生物質フリーの製剤である。LIには、一体としてLI固有の生物活性にとって重要な3つのサイトカイン「ファミリー」が存在する。それらには、直接的細胞傷害性/細胞増殖抑制性及び殺ウイルス性/ウイルス増殖抑制性のサイトカイン(TNF−α、IFN−γ等)、リンパ球増殖性サイトカイン(IL−1、IL−2等)、並びに走化性サイトカイン(IL−6、IL−8、MIP−1α等)が含まれる。更に、LIを構成する異なるサイトカイン及び生体小分子のすべては、T細胞、B細胞及びマクロファージを含むヒト末梢血単核細胞のレクチン(PHA)in vitro刺激に由来する。Ficoll−Paque勾配による遠心分離は、供与体全血から白血球(T細胞、B細胞及びマクロファージを含む。)を分離し、一連の洗浄(生理緩衝液中)は、リンパ球の単離、並びに供与体全血の単離白血球成分からの赤血球、細胞破片及び他の不要な細胞成分の除去を促進する。
[35] LIは、以下の特定比率のサイトカイン及びインターロイキン2(IL−2)を含有する。IL−1βのIL−2に対する比率(IL−1β/IL−2)が0.4〜1.5、好ましくは0.7±0.1;TNF−αのIL−2に対する比率(TNF−α/IL−2)が3.2〜10.9、好ましくは9.5±1.8;IFN−γのIL−2に対する比率(IFN−γ/IL−2)が1.5〜10.9、好ましくは6.0±1.1;GM−CSFのIL−2に対する比率(GM−CSF/IL−2)が2.2〜4.8、好ましくは4.0±0.5。
[36] 各製剤中には、LI内の他の異なるサイトカイン及び他の生物活性小分子も存在し、生物活性小分子及びIL−2の比率は以下の通りである。IL−3のIL−2に対する比率が0.38〜0.68、好ましくは0.53±0.15;IL−6のIL−2に対する比率が37.2〜53.8、好ましくは46±5.9;IL−8のIL−2に対する比率が261〜561.5、好ましくは411±10.6;IL−1αのIL−2に対する比率が0.56〜0.94、好ましくは0.75±0.19;IL−10のIL−2に対する比率が2.82〜3.22、好ましくは3.0±0.18;IL−16のIL−2に対する比率が1.16〜2.84、好ましくは1.84±0.68;G−CSFのIL−2に対する比率が2.16〜3.78、好ましくは2.97±0.81;TNF−βのIL−2に対する比率が1.17〜2.43、好ましくは1.8±0.63;MIP−1αのIL−2に対する比率が15.7〜37.16、好ましくは22.7±7.0;MIP−1βのIL−2に対する比率が17.1〜28.5、好ましくは22.8±5.7;RANTESのIL−2に対する比率が2.3〜2.7、好ましくは2.5±0.13;EGFのIL−2に対する比率が0.267〜0.283、好ましくは0.275±0.008;PGE2のIL−2に対する比率が3.63〜5.42、好ましくは4.5±0.87;TxB2のIL−2に対する比率が23.47〜25.13、好ましくは24.3±0.83。
[37] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、特性評価プロトコルを用いて試験したが、以下のサイトカイン及び他の生物活性小分子を含有しない。IL−4、IL−7及びIL−15、TfR、sICAM、PDGF−AB、IFN−α、EPO、LTC4、TGF−β2、FGFベーシック、アンギオゲニン、sE−セレクチン、SCF及びLIF。LIは、IL−12及びLTB4を微量(アッセイの検出レベルより少し多い。)しか含有しない。
[38] 米国特許第5093479号、4390623号、4388309号、4406830号、4661447号、4681844号及び4464355号(すべて、参照されることにより、本明細書に組み込まれる。)で開示されているように、製造過程では、単核細胞を、段階密度勾配遠心分離によってヒト供与体の「バフィーコート」から分離し、培養物中の供与体白血球からのIL−2及び他のサイトカインの産生及び分泌を高めるためにPHAと共に培養する。その後、培養上清を無菌的に収集、清澄化し、通常のウイルス排除工程に付する。次に、上清を、限外濾過及び微量濾過により更に約10倍濃縮する。
[39] この時点で、ヒト血清アルブミン注射剤USPを加え、更に緩衝液を加えて濃縮物を生理的pHにして、表示量(例えば、400IU/mL)に従う標的IL−2濃度にする。次に、濃縮物を第2の微量濾過(定格0.22ミクロンフィルター)で濾過し、無菌の血清型バイアルに無菌的に分配し、そのIL−2含量に従ってラベル表示する。製品の効力は、細胞傷害性Tリンパ球系(CTLL−2)による放射性標識チミジンの取込みによって測定する。最終的な注射剤は、5つのマーカーサイトカインIL−2、IL−1β、GM−CSF、IFN−γ及びTNF−αの存在について、ELISAにより更に試験する。
(定義)
[40] IL−2: インターロイキン2(IL−2)。CD4+ ヘルパーTリンパ球(正式には、T細胞増殖因子として知られる。)によって合成される15.5kDの糖タンパク質。IL−2は、それを産生するCD4+ Tリンパ球及び他の免疫系細胞(Bリンパ球、CD8+ Tリンパ球、NK(ナチュラルキラー)細胞等を含む。)に作用するオートクリン作用を有する。
[40] IL−2: インターロイキン2(IL−2)。CD4+ ヘルパーTリンパ球(正式には、T細胞増殖因子として知られる。)によって合成される15.5kDの糖タンパク質。IL−2は、それを産生するCD4+ Tリンパ球及び他の免疫系細胞(Bリンパ球、CD8+ Tリンパ球、NK(ナチュラルキラー)細胞等を含む。)に作用するオートクリン作用を有する。
[41] IL−1β: インターロイキン1ベータ(IL−1β)。活性化された単核貪食細胞によって合成され、循環中に遊離型で存在し、炎症反応を媒介する17kDのサイトカイン。CD4+ Tリンパ球に作用してそれらの増殖を促進し、また、増殖因子及び分化因子としてBリンパ球に作用する。また、単核貪食細胞によるIL−6の合成を誘導する。
[42] TNF−α: 腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)。刺激された単球、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球、NK細胞によって合成され、循環中に三量体で存在する、157アミノ酸(aa)残基のタンパク質。TNFは、直接的抗腫瘍作用を媒介し、腫瘍細胞溶解を引き起こし、白血球の動員を促進し、血管形成を誘導し、線維芽細胞増殖を促進する。
[43] IFN−γ: インターフェロンガンマ(IFN−γ)。活性化されたTリンパ球及びNK細胞によって合成され、細胞内微生物及び腫瘍細胞を破壊する単球の能力を高める、単球の強力な活性化剤である、21〜24kDの糖タンパク質ホモ二量体。直接的抗ウイルス活性及び増殖抑制活性を有し、多くの細胞型にMHC(主要組織適合遺伝子複合体)クラスII細胞表面分子複合体を発現させ、また、MHCクラスIの発現を増加させる。
[44] GM−CSF: 顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)。循環中に単量体として存在し、マクロファージ及びTリンパ球、線維芽細胞及び内皮細胞によって産生される127aaタンパク質。造血細胞のための成長因子であり、骨髄単球系の増殖及び分化を刺激する。
[45] IL−3: インターロイキン−3(IL−3)。活性化されたCD4+ Tヘルパーリンパ球によって合成され、一部の造血細胞の増殖を促進してTリンパ球の増殖及び分化を促進することによりコロニー刺激因子の作用を行う、20kDのリンホカイン。
[46] IL−6: インターロイキン−6(IL−6)。活性化されたTリンパ球、単核の貪食細胞、内皮細胞及び線維芽細胞によって産生される26kDのサイトカイン。多くの細胞に作用するが、活性化されたBリンパ球の抗体分泌形質細胞への分化を可能にする特殊機能を有し、また、肝細胞を誘導して急性期タンパク質(炎症反応への関与が示唆されている。)及びフィブリノーゲンを形成させる。
[47] IL−8: インターロイキン−8(IL−8)。マクロファージ及び内皮細胞によって産生される8kDのタンパク質。好中球及びTリンパ球のための強力な走化性因子であり、内皮細胞への好中球の付着を促進する。
[48] IL−1α: インターロイキン1α(IL−1α)。33kDの前駆体分子から切断され、活性化された単核貪食細胞によって合成され、循環中では遊離型が稀にしか見られず、膜関連物質の作用を行う17kDのサイトカイン(IL−1βに類似)。IL−1βによる炎症反応の媒介を補助する。
[49] IL−10: インターロイキン−10(IL−10)。CD4+及びCD8+ Tリンパ球、単球、マクロファージ、活性化されたBリンパ球及びケラチノサイトによって産生される18kDのポリペプチド。抗原を特にTH1型の細胞に提示し、且つIL−6及びTNFを分泌する、マクロファージの能力を抑制する。
[50] IL−16: インターロイキン−16(IL−16)。CD8+ Tリンパ球、好酸球、肥満細胞及び呼吸上皮細胞によって産生される14kDの四量体タンパク質。CD4+ Tリンパ球及び単球に対する強い化学誘引性を有する。
[51] G−CSF: 顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)。マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞及び間質細胞によって産生される、22〜25kDのホモ二量体糖タンパク質。髄内の顆粒球前駆細胞を増加させ、血中好中球の増加を持続させる。微生物感染細胞及び腫瘍細胞の破壊において重要であると考えられるスーパーオキシド産生を増大させる好中球の能力を強化する。
[52] TNF−β: 腫瘍壊死因子ベータ(TNF−β)。活性化されたリンパ球によって産生される25kDのタンパク質。培養中の腫瘍細胞を殺傷し、線維芽細胞の増殖を刺激することができる。更に、TNF−αの他の大部分の作用と類似の作用を有する。
[53] MIP−1α: マクロファージ炎症性タンパク質−1アルファ(MIP−1α)。マクロファージ及び他の細胞によって産生される66aa単量体タンパク質。単球、Tリンパ球及び好酸球に対する化学誘引物質である。
[54] RANTES: Tリンパ球によって産生され、単球、Tリンパ球及び好酸球に対する化学誘引物質であり、炎症を促進する8kDタンパク質。
[55] EGF: 上皮成長因子(EGF)。53aa残基の三硫酸化ポリペプチド。EGFはチロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、分裂応答の刺激及び創傷治癒の補助を含む複数の機能を有する。
[56] PGE2: プロスタグランジンE2(PGE2)。PGE2は、シクロオキシゲナーゼ酵素反応を介してアラキドン酸から導かれる生物活性脂質のファミリーに属する。活性化された単球によって放出され、Tリンパ球及びマクロファージ上のMHCクラスIIの発現をブロックする。
[57] TxB2: トロンボキサンB2(TxB2)。TxB2は、酵素トロンボキサンシンテターゼを介するプロスタグランジン及びエンドペルオキシダーゼPGH2の異性化により、多価不飽和脂肪酸から導かれる生物活性化合物のメンバーである。TxB2は、血栓塞栓性疾患及びアナフィラキシー反応で生理的役割を果たす。
[58] CD25+細胞: CD25は、インターロイキン2受容体(IL−2R)のα鎖、又はTac抗原と称されることも多く、55kDの分子量を有し、活性化されたT細胞及びB細胞並びに活性化マクロファージ上に存在する単鎖糖タンパク質である。IL2受容体として機能する。CD25抗原は、IL−2Rのβ鎖と共に、IL−2に対する高親和性受容体複合体を形成する。
[59] CTLL−2(細胞系): C57B1/6マウスから得られるマウス細胞傷害性Tリンパ球の系統。このT細胞系は、成長及び増殖をIL−2の外来性供与源に依存する。
[60] Fas−FasL: Fas/Fasリガンド系。Fas抗原、アポトーシスを媒介する細胞表面膜貫通タンパク質、及びアポトーシスのシグナルを細胞に伝達する好中球上の相補性Fas活性化サイトカインの組合せ。Fasは、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーに属するI型の膜タンパク質であり、FasLはTNFファミリーのメンバーである。FASリガンドは、31kDa(キロダルトン)(278アミノ酸)の膜結合型タンパク質である。Fas−Fasリガンド系は、自己反応性リンパ球系細胞の排除を含む多くの生物過程で重要な役割を果たす。Fasリガンドは、主に、活性化されたTリンパ球で発現し、細胞傷害性Tリンパ球及びナチュラルキラー細胞の主たるエフェクター分子の1つである。
[61] HLA−DR+リンパ球: ヒト白血球抗原(HLA)−DR抗原(ヒトの主要組織適合遺伝子領域である第6染色体上の白血球領域で見られるグルー配列(glue sequence)により決定される一群の多形性糖タンパク質)を含むリンパ球。
[62] IU(国際単位): 比重及び力価の国際標準(例えば、ヒトIL−2のためのWHO第1次国際標準、86/504)との比較に基づく、生物学的製剤の効力の測定単位。国際単位は、生物活性単位を報告するための、公表されている、公認の標準化された唯一の方法であり、国際的な共同研究の産物である。
[63] U(生物活性の尺度としての単位): 種々の名称付き「単位(unit)」の短縮形。各研究所は参照として導き出すが、これは当該研究を実施している研究所に固有のものである。各「単位(unit)」は研究所によって異なり、国際単位(IU)のような国際的に認められた標準ではない。
[64] 単核浸潤: それらが「通常は」存在しない組織における単球、形質細胞及びリンパ球の存在。又は、それらが本来は少数しか存在しないクラスターにおける上記細胞の多数の、又は豊富な存在。
[65] TCRζ鎖: T細胞受容体−ゼータ鎖。ゼータサブユニットはTCR複合体の一部であり、TCR細胞表面受容体とリガンド(抗原)との相互作用を標的とする。細胞質(細胞質ゾル)内に伸長するゼータサブユニットでは、T細胞活性化によりチロシン残基がリン酸化されるが、これは、TCRライゲーション後のシグナル伝達との関係を示唆する。
[66] TIL(腫瘍浸潤リンパ球): それらが浸潤する腫瘍から単離されたTリンパ球。腫瘍浸潤リンパ球は、細胞傷害性を殆どないし全く有しない。TILは、主にCD4+、CD8+のT細胞を含み、IL−2存在下の培養によりin vitroで増殖することができる。これらの細胞はIL−2による処理で活性化され、それらが単離された腫瘍に対して、通常のリンホカイン活性化細胞よりも攻撃的であることが多い。TILの細胞毒性活性は、IFN−γによって強化することができる。TILのin vivo抗腫瘍活性は、TGF−βによってブロックすることができる。
[67] ZAP70: サイトゾルに存在するチロシンキナーゼであるTCRζ鎖と関連する70kDのゼータ関連タンパク質。ZAP70は、Tリンパ球受容体情報伝達の維持に関与し、最終的にIL−2を産生するシグナル伝達を媒介すると考えられる。ZAP70遺伝子はT細胞及びナチュラルキラー細胞で発現し、ヒト染色体2q12にマッピングされている。
[68] ζ(ゼータ)鎖: TCRζ鎖を参照。ゼータ鎖遺伝子は、ヒト第1染色体上に位置する。このタンパク質の細胞外ドメインは9アミノ酸の長さを有し、膜貫通ドメインは、負に荷電したアスパラギン酸残基を含み、細胞質内ドメインは113アミノ酸の長さを有する。細胞質内のテールは、CD3鎖の細胞質内のテールで見られる抗原認識モチーフのうちの3つを含む。ゼータ鎖は、NK細胞のFc(断片、結晶性)−γ受容体等の他の受容体とも関連する。
[69] USP: 米国薬局方各条。
[70] P: 「p<0.01」。所定の条件下で起こる事象の確率の水準を意味する数理統計学用語。
[71] ANOVA(分散分析): 統計及び数学の教科書(例えば、「Handbook of Statistical Methods for Engineers and Scientists」、Harrison M.Wadsworth,Jr.編、McGraw Hill 1990、及び「Statistical Operations Analysis of Health Research Data」、Robert P.Hirsch and Richard K.Riegelman編、Blackwell Science Inc.,1996)に記載されているような単一因子分析。
(LIの作用様式及び特性評価)
[72] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、本明細書に記載のように、所定の条件下で産生される天然かつ自然発生のヒトサイトカインの、生物学的に活性で、毒性が最小限の免疫調節性混合物である。LIは、抗癌及び抗ウイルス療法において、或いは、癌、感染症、及び免疫調節に応答する他の疾患のために広範に適用可能なネオアジュバント療法において使用することができる。
[72] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、本明細書に記載のように、所定の条件下で産生される天然かつ自然発生のヒトサイトカインの、生物学的に活性で、毒性が最小限の免疫調節性混合物である。LIは、抗癌及び抗ウイルス療法において、或いは、癌、感染症、及び免疫調節に応答する他の疾患のために広範に適用可能なネオアジュバント療法において使用することができる。
[73] 動物試験では、「混合したインターロイキン」がin vitroで免疫調節活性及び免疫賦活活性を有することが示されている(Haddenら、「Mixed Interleukins and Thymosin Fraction V Synergistically Induce T Lymphocyte Development in Hydrocortisone−Treated Aged Mice」、Cell.Immunol.144:228〜236(1992))。「混合したインターロイキン」の局所/領域注射は局所の免疫抑制を克服すると仮定する(但し、いかなる理論にも限定されるものではない)。その後、腫瘍抗原に対する破壊寛容が生じ、有効な局所抗腫瘍免疫応答の発生を可能にする。Golumbekら、「Treatment of Established Renal Cancer by Tumor Cells Engineered to Secrete Interleukin−4」、Science 254:713〜716(1991)が報告しているように、腫瘍領域へのインターロイキンの局所注入、又は腫瘍へのインターロイキン遺伝子のトランスフェクションは、抗腫瘍免疫応答を著しく高め、結果として腫瘍退縮をもたらすことも知られている。
[74] しかし、腫瘍の活発な増殖を引き起こすことなく悪性細胞を細胞周期相に誘導すること、並びにCD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させるというLIの効果は、以下の特定比率で、サイトカイン及びインターロイキン2(IL−2)を含有し、或いは、以下の特定比率(対IL−2)で、他の異なるサイトカイン及び他の生物活性小分子を更に含有する組成物、例えば、白血球インターロイキン注射剤(LI)については、これまで知られていなかった。IL−1βのIL−2に対する比率(IL−1β/IL−2)が0.4〜1.5、好ましくは0.7±0.1;TNF−αのIL−2に対する比率(TNF−α/IL−2)が3.2〜10.9、好ましくは9.5±1.8;IFN−γのIL−2に対する比率(IFN−γ/IL−2)が1.5〜10.9、好ましくは6.0±1.1;GM−CSFのIL−2に対する比率(GM−CSF/IL−2)が2.2〜4.8、好ましくは4.0±0.5。IL−3のIL−2に対する比率が0.38〜0.68、好ましくは0.53±0.15;IL−6のIL−2に対する比率が37.2〜53.8、好ましくは46±5.9;IL−8のIL−2に対する比率が261〜561.5、好ましくは411±10.6;IL−1αのIL−2に対する比率が0.56〜0.94、好ましくは0.75±0.19;IL−10のIL−2に対する比率が2.82〜3.22、好ましくは3.0±0.18;IL−16のIL−2に対する比率が1.16〜2.84、好ましくは1.84±0.68;G−CSFのIL−2に対する比率が2.16〜3.78、好ましくは2.97±0.81;TNF−βのIL−2に対する比率が1.17〜2.43、好ましくは1.8±0.63;MIP−1αのIL−2に対する比率が15.7〜37.16、好ましくは22.7±7.0;MIP−1βのIL−2に対する比率が17.1〜28.5、好ましくは22.8±5.7;RANTESのIL−2に対する比率が2.3〜2.7、好ましくは2.5±0.13;EGFのIL−2に対する比率が0.267〜0.283、好ましくは0.275±0.008;PGE2のIL−2に対する比率が3.63〜5.42、好ましくは4.5±0.87;TxB2のIL−2に対する比率が23.47〜25.13、好ましくは24.3±0.83。
[75] LIの手術前の投与は、当技術分野から予測されるような、腫瘍がより速く成長し、より速く再発するリスクを増加させることなく、細胞周期相にある腫瘍細胞数を増加させる。LIはまた、CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる。腫瘍細胞を細胞周期に誘導する能力はLIに固有のものであり、この治験薬に存在する異なるサイトカインの相乗効果、並びに宿主の免疫系及び腫瘍細胞に及ぼす上記サイトカインの差別的影響によるものである。CD4/CD8比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させるLIの用量依存性投与からも、パラダイムシフトが分かる。
(患者)
[76] 白血球インターロイキン注射剤(LI)治療群及び対照患者群に関する情報は、表1及び2に示す。治療群及び対照群の腫瘍の原発部位は、それぞれ表1及び2に示す。41人の患者を対象としたが、評価可能であったのは39人のみである。これらの対照被験者は、患者の腫瘍の大きさ、腫瘍部位、腫瘍段階、性別及び年齢に基づいて治療群と一致させた。
[76] 白血球インターロイキン注射剤(LI)治療群及び対照患者群に関する情報は、表1及び2に示す。治療群及び対照群の腫瘍の原発部位は、それぞれ表1及び2に示す。41人の患者を対象としたが、評価可能であったのは39人のみである。これらの対照被験者は、患者の腫瘍の大きさ、腫瘍部位、腫瘍段階、性別及び年齢に基づいて治療群と一致させた。
(患者組入基準)
[77] これまで未治療の頭頸部癌(口腔扁平上皮癌、OSCC)患者21人がLI投与群に含まれる。患者組入基準は、既知の転移性疾患がなく、6カ月を超える予想生存期間を有し、OSCCの治療又は他の免疫療法を受けたことがなく、組織学的に確定された頭頸部扁平上皮癌を有する18才以上の患者である。妊娠している患者、LI投与部位に放射線治療を施した患者、十二指腸潰瘍若しくは胃潰瘍の患者、又は喘息患者は除外される。
[77] これまで未治療の頭頸部癌(口腔扁平上皮癌、OSCC)患者21人がLI投与群に含まれる。患者組入基準は、既知の転移性疾患がなく、6カ月を超える予想生存期間を有し、OSCCの治療又は他の免疫療法を受けたことがなく、組織学的に確定された頭頸部扁平上皮癌を有する18才以上の患者である。妊娠している患者、LI投与部位に放射線治療を施した患者、十二指腸潰瘍若しくは胃潰瘍の患者、又は喘息患者は除外される。
(評価可能な患者)
[78] 合計41人の患者が選択され、評価可能な患者は39人である。LI治療群は21人の患者から構成され、評価可能な患者は19人である。LI治療群患者のうちの2人は、その後、(1)口蓋垂の未分化癌、及び(2)口腔底の腺癌を有することが確認される。これらの2人の患者は、治験薬の投与を含む療法の全コースを受けるが、口腔の扁平上皮癌の基準を満たさなかったため、組織病理/免疫組織化学分析の一部を行わない。対照群は、生検で確定された口腔扁平上皮癌を有し、腫瘍は口腔内の同じ領域にあり、腫瘍の大きさ及び疾患段階が治験薬(LI)処置群と類似した患者20人で構成された。
[78] 合計41人の患者が選択され、評価可能な患者は39人である。LI治療群は21人の患者から構成され、評価可能な患者は19人である。LI治療群患者のうちの2人は、その後、(1)口蓋垂の未分化癌、及び(2)口腔底の腺癌を有することが確認される。これらの2人の患者は、治験薬の投与を含む療法の全コースを受けるが、口腔の扁平上皮癌の基準を満たさなかったため、組織病理/免疫組織化学分析の一部を行わない。対照群は、生検で確定された口腔扁平上皮癌を有し、腫瘍は口腔内の同じ領域にあり、腫瘍の大きさ及び疾患段階が治験薬(LI)処置群と類似した患者20人で構成された。
(治療プロトコル)
[79] 白血球インターロイキン注射剤(LI)投与は、以下の方法で実施する。総日用量(IL−2に換算して800IU/mL)の半分(400IU)を腫瘍周囲に(腫瘍周囲用量の1/4(約100IU)を腫瘍塊周囲の4つの各部位に)注射して、総日用量の半分(IL−2に換算して400IU)を、3週間に渡って週5回、腫瘍部位と同側に(引き続き、また、同一受診時に)外リンパに投与する。LIは、可視的/触知可能な腫瘍塊の周縁に皮内投与する。外リンパへの注射は、注射した腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に投与する。
[79] 白血球インターロイキン注射剤(LI)投与は、以下の方法で実施する。総日用量(IL−2に換算して800IU/mL)の半分(400IU)を腫瘍周囲に(腫瘍周囲用量の1/4(約100IU)を腫瘍塊周囲の4つの各部位に)注射して、総日用量の半分(IL−2に換算して400IU)を、3週間に渡って週5回、腫瘍部位と同側に(引き続き、また、同一受診時に)外リンパに投与する。LIは、可視的/触知可能な腫瘍塊の周縁に皮内投与する。外リンパへの注射は、注射した腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に投与する。
[80] シクロホスファミド300mg/m2注射液の単回静脈内注入を、最初のLI投与の3日前に行う。インドメタシン(25mg)を、シクロホスファミド投与の3日後から外科手術の24時間前まで、1日3回、総日用量75mgで経口的に(食物と一緒に)自己投与する。硫酸亜鉛(亜鉛元素に換算して50mg)及び総合ビタミン剤を、シクロホスファミド投与の3日後から外科手術の24時間前まで、1日1回自己投与する。
[81] すべての患者(LI処置群及び対照群)は、最後のLI投与の1〜2週後に外科手術を受け、次いで、手術の1〜4週後に放射線療法を受ける。LI前処理は、この患者集団では創傷治癒に悪影響を与えなかった。
(患者検査)
[82] 試験に組み入れる前に、患者の一般評価を行った。既往歴も調査した。登録した後、完全な身体検診、血液検査、血液生化学精密検査、胸部心臓X線撮影及び心電図検査を実施した。可能であれば、ベースライン画像を得るために原発腫瘍部位の画像化を行った。すべての患者に、垂直な2つの外径の計測による、原発腫瘍のベースライン2次元測定を行う。患者は、以降の各診察で面接を受け、適当なアンケートを用いて生活の質(例えば、疼痛の程度、舌運動性の程度、等)について質問される。治療にあたる医師が、各診察時に毒性を評価した。
[82] 試験に組み入れる前に、患者の一般評価を行った。既往歴も調査した。登録した後、完全な身体検診、血液検査、血液生化学精密検査、胸部心臓X線撮影及び心電図検査を実施した。可能であれば、ベースライン画像を得るために原発腫瘍部位の画像化を行った。すべての患者に、垂直な2つの外径の計測による、原発腫瘍のベースライン2次元測定を行う。患者は、以降の各診察で面接を受け、適当なアンケートを用いて生活の質(例えば、疼痛の程度、舌運動性の程度、等)について質問される。治療にあたる医師が、各診察時に毒性を評価した。
(白血球インターロイキン注射剤(LI))
[83] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、マイトジェンと共に培養した輸血用血液に関してFDAが要求する検査に合格した後に米国赤十字から得た、選択されたヒト末梢血単核細胞から調製する。初回ドナーは認めない。その後、無血清培養上清を無菌的に収集、清澄化し、通常のウイルス排除工程に付し、濃縮、微量濾過する。ヒト血清アルブミン注射剤USPを濃縮物に加え、得られた溶液を生理的pHに調整し、標的IL−2濃度にし、第2の微量濾過を実施する。製剤化された薬液を無菌の血清型バイアルに無菌的に分配し、IL−2の含量に従ってラベル表示する。製品の効力は、IL−2依存性細胞系である細胞傷害性Tリンパ球系(CTLL−2)の使用による放射性標識チミジンの(in vitro)取込みによって測定する。最終的な注射剤は、ELISAにより、或いは、5つのマーカーサイトカインIL−2、IL−1β、GM−CSF、IFN−γ及びTNF−αの存在により更に試験する。LIについては、無菌性、細菌内毒素、pH及び総タンパク質濃度に関する品質管理試験、並びに他の物理化学的試験を更に実施する。
[83] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、マイトジェンと共に培養した輸血用血液に関してFDAが要求する検査に合格した後に米国赤十字から得た、選択されたヒト末梢血単核細胞から調製する。初回ドナーは認めない。その後、無血清培養上清を無菌的に収集、清澄化し、通常のウイルス排除工程に付し、濃縮、微量濾過する。ヒト血清アルブミン注射剤USPを濃縮物に加え、得られた溶液を生理的pHに調整し、標的IL−2濃度にし、第2の微量濾過を実施する。製剤化された薬液を無菌の血清型バイアルに無菌的に分配し、IL−2の含量に従ってラベル表示する。製品の効力は、IL−2依存性細胞系である細胞傷害性Tリンパ球系(CTLL−2)の使用による放射性標識チミジンの(in vitro)取込みによって測定する。最終的な注射剤は、ELISAにより、或いは、5つのマーカーサイトカインIL−2、IL−1β、GM−CSF、IFN−γ及びTNF−αの存在により更に試験する。LIについては、無菌性、細菌内毒素、pH及び総タンパク質濃度に関する品質管理試験、並びに他の物理化学的試験を更に実施する。
[84] 白血球インターロイキン注射剤(LI)は、腫瘍周囲、腫瘍内、外リンパ又は皮下への投与のための、2.2mLの薬剤を含むホウ珪酸ガラス血清バイアル(IL−2(400IU/mL)と表示されている。)中で凍結された状態で提供される。LIについては、同一性、無菌性、細菌内毒素、pH及び総タンパク質濃度に関する品質管理試験を実施する。各バイアルは、微粒子汚染及び外観を検査する。製剤は3mg/mLの総タンパク質含量を有し、材料は無菌及びパイロジェン(pyrogen)フリーで提供される。LIは、−20℃で保存した場合、製造年月日から24カ月の指定有効期間を有する。
(シクロホスファミド)
[85] シクロホスファミド注射剤USP(Bristol−Myers−Squibb、UK)は、シクロホスファミド100mg当たり塩化ナトリウム45mg、マンニトール75mg又は重炭酸ナトリウム約82mgを含有する無菌の散剤として提供され、静脈内注射の前に再構成する。
[85] シクロホスファミド注射剤USP(Bristol−Myers−Squibb、UK)は、シクロホスファミド100mg当たり塩化ナトリウム45mg、マンニトール75mg又は重炭酸ナトリウム約82mgを含有する無菌の散剤として提供され、静脈内注射の前に再構成する。
(インドメタシン)
[86] インドメタシンUSP(Sanofi−Synthelabo、France)は、食物と同時摂取する経口自己投与用25mg錠剤として提供される。
[86] インドメタシンUSP(Sanofi−Synthelabo、France)は、食物と同時摂取する経口自己投与用25mg錠剤として提供される。
(硫酸亜鉛及び総合ビタミン)
[87] 硫酸亜鉛(亜鉛元素に換算して50mg、R.P.Scherer Corporation、Clearwater、Florida、USA)及びOTC総合ビタミン剤は、クリニックから各患者に自己投与用に提供される。
[87] 硫酸亜鉛(亜鉛元素に換算して50mg、R.P.Scherer Corporation、Clearwater、Florida、USA)及びOTC総合ビタミン剤は、クリニックから各患者に自己投与用に提供される。
(病理学的検査)
[88] 単一の病理プロトコルには、本明細書に記載の、外科的に切除された検体の調製及び固定、並びに総体的、肉眼的及び顕微的検査、組織学及び免疫組織化学的処置が記載されている。口腔病変の診断は、疑われる病変の切除生検で決定する。この癌は、T2−3N0−2M0に分類されている。他のすべての患者組入基準を満たすT2−3N0−2M0患者のみを、免疫療法用に選択する。2次元/3次元測定で決定される腫瘍反応を、LI治療計画終了時に評価し、患者の腫瘍切除の予定を決定する。切除した組織は生食緩衝ホルマリンを含む前標識された容器に入れて、ヘマトキシリン−エオジン(H&E)染色、腫瘍反応の免疫組織化学及び病理学評価のために、パラフィン包埋及び薄い切片スライドの調製の前に一晩固定する。
[88] 単一の病理プロトコルには、本明細書に記載の、外科的に切除された検体の調製及び固定、並びに総体的、肉眼的及び顕微的検査、組織学及び免疫組織化学的処置が記載されている。口腔病変の診断は、疑われる病変の切除生検で決定する。この癌は、T2−3N0−2M0に分類されている。他のすべての患者組入基準を満たすT2−3N0−2M0患者のみを、免疫療法用に選択する。2次元/3次元測定で決定される腫瘍反応を、LI治療計画終了時に評価し、患者の腫瘍切除の予定を決定する。切除した組織は生食緩衝ホルマリンを含む前標識された容器に入れて、ヘマトキシリン−エオジン(H&E)染色、腫瘍反応の免疫組織化学及び病理学評価のために、パラフィン包埋及び薄い切片スライドの調製の前に一晩固定する。
(組織学的検査)
[89] 組織病理分析は、3つの異なる腫瘍領域、すなわち表面(ゾーン1)、中心(ゾーン2)及び腫瘍・間質境界面(ゾーン3)で実施する。壊死腫瘍細胞の組織学的検査、AJCC類別、及び発生は、HE染色切片から判定される。腫瘍中の腫瘍上皮成分対間質の割合は、下記2つの方法で測定される。(1)結合組織をマロリー(三重染色)に従って染色し、(2)スライドを、ImagePro分析ソフトウェア(MediaCibernetics、Silver Spring、MD)により癌巣(腫瘍上皮)の面積について測定する。切除された組織を含むスライドは、癌細胞を標識する汎サイトケラチン抗体(A1A3+CK19)(DAKO(Glostrup、Denmark)製)を用いて、サイトケラチンを標識する。スライドは顕微鏡で検査し、ImagePro分析ソフトウェアを用いて分析する。
[89] 組織病理分析は、3つの異なる腫瘍領域、すなわち表面(ゾーン1)、中心(ゾーン2)及び腫瘍・間質境界面(ゾーン3)で実施する。壊死腫瘍細胞の組織学的検査、AJCC類別、及び発生は、HE染色切片から判定される。腫瘍中の腫瘍上皮成分対間質の割合は、下記2つの方法で測定される。(1)結合組織をマロリー(三重染色)に従って染色し、(2)スライドを、ImagePro分析ソフトウェア(MediaCibernetics、Silver Spring、MD)により癌巣(腫瘍上皮)の面積について測定する。切除された組織を含むスライドは、癌細胞を標識する汎サイトケラチン抗体(A1A3+CK19)(DAKO(Glostrup、Denmark)製)を用いて、サイトケラチンを標識する。スライドは顕微鏡で検査し、ImagePro分析ソフトウェアを用いて分析する。
(単核細胞浸潤の特性評価)
[90] 腫瘍細胞巣の近傍に存在する単核細胞を、免疫組織化学により(パラフィン切片から)測定する。抗原性を取り出すために、切片を脱蝋してマイクロ波で処理する。これまで一貫して、脱蝋されたパラフィン切片を染色することが実証されている、市販の抗体のみを用いる。好中球は、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体(DAKO製のマウスモノクローナル)を用いて標識し、造血幹細胞は、マウスモノクローナル抗CD34抗体(DAKO)で標識し、マクロファージ細胞集団は、CD68抗原(マウスモノクローナル抗CD68、DAKO)の発現により同定し、樹状細胞は、CD1aマーカー(マウスモノクローナル抗CD1a、Immunotech、Paris、France)の発現により同定する。リンパ球系細胞は、LCA抗原の発現(マウスモノクローナル抗CD45、DAKO)により同定する。T細胞は、マウスモノクローナル抗CD3抗体(DAKO)により同定する。細胞傷害性T細胞は、抗CD8細胞傷害性T細胞抗体(DAKO)によるCD8の発現によって同定する。エフェクターCD4T細胞は、抗CD4+ T細胞抗体(Novocastra、Newcastle Upon Tyne、UK)を用いて同定する。NK細胞は、Novocastra製のCD56/CD57抗原マウスモノクローナル抗CD56及び抗CD57抗体を用いて同定する。いずれの場合も、適当な抗体(同じアイソタイプの抗体)の陽性及び陰性対照スライドを調製して評価する。腫瘍上皮及び間質内のIL−2R発現細胞は、IL−2R、CD25に対するマウスモノクローナル抗体(Novocastra)を用いて同定する。いずれの場合も、陰性対照スライドは、目的の標的に非特異的である、アイソトープを一致させたモノクローナル抗体を用いて調製する。
[90] 腫瘍細胞巣の近傍に存在する単核細胞を、免疫組織化学により(パラフィン切片から)測定する。抗原性を取り出すために、切片を脱蝋してマイクロ波で処理する。これまで一貫して、脱蝋されたパラフィン切片を染色することが実証されている、市販の抗体のみを用いる。好中球は、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体(DAKO製のマウスモノクローナル)を用いて標識し、造血幹細胞は、マウスモノクローナル抗CD34抗体(DAKO)で標識し、マクロファージ細胞集団は、CD68抗原(マウスモノクローナル抗CD68、DAKO)の発現により同定し、樹状細胞は、CD1aマーカー(マウスモノクローナル抗CD1a、Immunotech、Paris、France)の発現により同定する。リンパ球系細胞は、LCA抗原の発現(マウスモノクローナル抗CD45、DAKO)により同定する。T細胞は、マウスモノクローナル抗CD3抗体(DAKO)により同定する。細胞傷害性T細胞は、抗CD8細胞傷害性T細胞抗体(DAKO)によるCD8の発現によって同定する。エフェクターCD4T細胞は、抗CD4+ T細胞抗体(Novocastra、Newcastle Upon Tyne、UK)を用いて同定する。NK細胞は、Novocastra製のCD56/CD57抗原マウスモノクローナル抗CD56及び抗CD57抗体を用いて同定する。いずれの場合も、適当な抗体(同じアイソタイプの抗体)の陽性及び陰性対照スライドを調製して評価する。腫瘍上皮及び間質内のIL−2R発現細胞は、IL−2R、CD25に対するマウスモノクローナル抗体(Novocastra)を用いて同定する。いずれの場合も、陰性対照スライドは、目的の標的に非特異的である、アイソトープを一致させたモノクローナル抗体を用いて調製する。
[91] すべての免疫組織化学的(IHC)標識を、ビオチン化抗マウス/抗ウサギIgGリンカー及びストレプトアビジン−HRPを用いて、特異的に結合した抗体を明らかにする、DAKO LSAB−2キットを用いて行う。用いるクロマゲンは、AEC(赤)標識である。切片は、ヘマトキシリンを用いて核を対比染色する。
(ホットスポット法)
[92] 単核細胞密度は、「ホットスポット」法に基づいて測定する。試験腫瘍面密度は、腫瘍浸潤単核細胞密度の最も高い領域で測定する。この方法は、組織内の細胞浸潤の極端な不均一性を最小化する。
[92] 単核細胞密度は、「ホットスポット」法に基づいて測定する。試験腫瘍面密度は、腫瘍浸潤単核細胞密度の最も高い領域で測定する。この方法は、組織内の細胞浸潤の極端な不均一性を最小化する。
(病理学的評価)
[93] LI治療群及び対照の腫瘍生検材料を、HE染色を用いて、腫瘍の顕微的所見により評価する。CD3、CD4、CD8、CD1a及びCD25の標識も実施するが、その場合、試料の大きさは5つの標識すべての実施を可能とするものとする。対照群及びLI治療群には、完全な分析プログラムを使用する。観察用スライドの選択は、30倍の拡大率を用いて行う。組織学的分析の間は、100倍の拡大率を用いる。組織切片の病理学的及び組織学的評価並びに形態測定は、試験のことを知らされていない3人の独立した病理学者(JT、CSF及びBD)が実施する。当技術分野で公知の、他の病理学的及び組織学的評価を用いることも可能である。
[93] LI治療群及び対照の腫瘍生検材料を、HE染色を用いて、腫瘍の顕微的所見により評価する。CD3、CD4、CD8、CD1a及びCD25の標識も実施するが、その場合、試料の大きさは5つの標識すべての実施を可能とするものとする。対照群及びLI治療群には、完全な分析プログラムを使用する。観察用スライドの選択は、30倍の拡大率を用いて行う。組織学的分析の間は、100倍の拡大率を用いる。組織切片の病理学的及び組織学的評価並びに形態測定は、試験のことを知らされていない3人の独立した病理学者(JT、CSF及びBD)が実施する。当技術分野で公知の、他の病理学的及び組織学的評価を用いることも可能である。
(統計分析)
[94] 病理学データはANOVA、単一因子分析によって分析し、<0.05(α=0.05)の「p」値を統計学的に有意と考える。
[94] 病理学データはANOVA、単一因子分析によって分析し、<0.05(α=0.05)の「p」値を統計学的に有意と考える。
(組織学的評価)
[95] すべてのLI治療患者(19)及び対照患者(20)の組織診、Brodesスコア及びTNM(腫瘍節転移)段階を表3及び4に示す。LI治療患者及び対照患者は、表3及び4に示すように、組織学的にも、また、ケラチン化(Brodesスコア)又はTNM段階に関しても異ならなかった(Odellら、「The Progostic Value of Individual Histologic Grading Parameters in Small Lingual Squamous Cell Carcinomas;The importance of the Pattern of Invasion」、Cancer 74:789(1994))。このことは、両群の腫瘍において、CK−19及び汎CKの、不均質性の高い発現を示すサイトケラチン免疫染色パターンから確認される。
[95] すべてのLI治療患者(19)及び対照患者(20)の組織診、Brodesスコア及びTNM(腫瘍節転移)段階を表3及び4に示す。LI治療患者及び対照患者は、表3及び4に示すように、組織学的にも、また、ケラチン化(Brodesスコア)又はTNM段階に関しても異ならなかった(Odellら、「The Progostic Value of Individual Histologic Grading Parameters in Small Lingual Squamous Cell Carcinomas;The importance of the Pattern of Invasion」、Cancer 74:789(1994))。このことは、両群の腫瘍において、CK−19及び汎CKの、不均質性の高い発現を示すサイトケラチン免疫染色パターンから確認される。
[96] LI治療患者19人のうちの2人は、切除された腫瘍内に癌組織を有していない。これらの2人の患者は、表4に示すように、100%の腫瘍減少を示す、LIに対する完全臨床奏効例であると考えられる。他の2症例は、組織学的に検証された50%を超える腫瘍体積の減少を示し、部分奏効(応答大)の例であると考えられる。更に別の患者4名は、30%を超え、50%未満の体積の減少を示し、応答小の例であると考えられる。表4及び5に示す病理学的判定によれば、この試験のLI治療群の客観的奏効率は21%であり、全体的には、19人の患者中8人、すなわち42%で応答が測定された。
(腫瘍浸潤リンパ球)
[97] OSCCにおけるリンパ球系細胞浸潤は、特に腫瘍間質においては、主としてT細胞によって占められる。図1に示すように、対照(非LI治療)群では、腫瘍及び間質に浸潤するCD8+ T細胞の数は、CD4+ T細胞よりも多かった(2:1)。その結果、対照(非LI治療)群のCD4/CD8比は、図2に示すように、試験した腫瘍のすべての領域(表面[R1]、中心[R2]及び腫瘍・間質境界面[R3])で1を大きく下回る(約0.5)。他方、LI治療は、間質及び腫瘍上皮巣の両方で、CD4+ T細胞の密度及び数の有意な(p<0.05)増加(図2)、並びにCD8+ T細胞の密度の有意な(p<0.05)減少を誘導する(図2)。この傾向は、同じ分析を治療応答群のみ(図1及び3)に適用する場合にも維持される。すなわち、LI治療は、OSCC腫瘍における細胞浸潤の構成において、低い(<1)CD4/CD8比から、高い(>2.5〜3.5)CD4/CD8比への顕著な変化をもたらした(図2及び3)。
[97] OSCCにおけるリンパ球系細胞浸潤は、特に腫瘍間質においては、主としてT細胞によって占められる。図1に示すように、対照(非LI治療)群では、腫瘍及び間質に浸潤するCD8+ T細胞の数は、CD4+ T細胞よりも多かった(2:1)。その結果、対照(非LI治療)群のCD4/CD8比は、図2に示すように、試験した腫瘍のすべての領域(表面[R1]、中心[R2]及び腫瘍・間質境界面[R3])で1を大きく下回る(約0.5)。他方、LI治療は、間質及び腫瘍上皮巣の両方で、CD4+ T細胞の密度及び数の有意な(p<0.05)増加(図2)、並びにCD8+ T細胞の密度の有意な(p<0.05)減少を誘導する(図2)。この傾向は、同じ分析を治療応答群のみ(図1及び3)に適用する場合にも維持される。すなわち、LI治療は、OSCC腫瘍における細胞浸潤の構成において、低い(<1)CD4/CD8比から、高い(>2.5〜3.5)CD4/CD8比への顕著な変化をもたらした(図2及び3)。
[98] CD34+ 単核細胞及びCD56+ NK細胞は、腫瘍面積又は検査対象の患者集団に関わりなく、間質及び腫瘍上皮巣では見られない。類似した所見が、LI治療群及び対照群のOSCC患者で報告されている。
[99] LI治療群では、抗原提示樹状細胞(CD1a+)は大部分腫瘍上皮巣に位置し、腫瘍間質の境界面で最も豊富である。調査した3領域(表面(R1)、腫瘍中心(R2)及び腫瘍・間質境界面(R3))における樹状(CD1a+)細胞の分布に及ぼす、LI治療の差別的影響が観察される。詳細には、図4に示すように、腫瘍中心では変化が観察されず、CD1a+ 樹状細胞の減少が腫瘍表面で検出され、その増加が腫瘍・間質境界面に存在する。図4に示すように、CD1a+ 樹状細胞の、腫瘍表面から腫瘍・間質境界面への移動は、臨床応答サブグループ分析においてより顕著である。2名の完全奏効例は、免疫組織化学分析を排除する観察可能な腫瘍組織を有しない。
(炎症細胞)
[100] 切除した腫瘍検体中の好中球及びマクロファージ浸潤の存在は、それぞれミエロペルオキシダーゼ(MPX)及びCD68マーカーの染色で測定する。形態計測は、腫瘍の3領域(表面[R1]、中心[R2]及び腫瘍・間質境界面[R3])で行う。
[100] 切除した腫瘍検体中の好中球及びマクロファージ浸潤の存在は、それぞれミエロペルオキシダーゼ(MPX)及びCD68マーカーの染色で測定する。形態計測は、腫瘍の3領域(表面[R1]、中心[R2]及び腫瘍・間質境界面[R3])で行う。
[101] 図5に示すように、マクロファージ密度の分析は、LI治療が間質内のCD68+ マクロファージの存在は変化させないが、上皮内では有意に(p<0.002)減少させることを示す。
[102] 図6に示すように、LI治療は、分析した領域(R1、R2又はR3)に関わりなく、好中球の上皮内密度を有意(p<0.005)に増加させる。
(腫瘍壊死)
[103] 図7に示すように、壊死の組織学的所見は、LI治療と対照との間で顕著な差を示す。表6に示すように、多巣性の顕微的壊死は、対照群(対照患者の4/20)に対して、LI治療群(治療患者の10/17)で著しく頻繁に起こる。
[103] 図7に示すように、壊死の組織学的所見は、LI治療と対照との間で顕著な差を示す。表6に示すように、多巣性の顕微的壊死は、対照群(対照患者の4/20)に対して、LI治療群(治療患者の10/17)で著しく頻繁に起こる。
(腫瘍間質/癌巣比率)
[104] 腫瘍間質に対する癌細胞巣の割合は、癌巣に対するLI治療の選択的作用を示す。Malloryトリクローム法で染色され、ピンクに標識された癌巣を有する切除組織試料、及び腫瘍組織内の上皮巣の割合は、図8に示すように、ImageProソフトウェアを用いて形態計測により測定する。LI治療は、対照(非LI治療)と比較して、腫瘍組織中の癌細胞巣の割合の有意な(p<0.005、ANOVA単一因子分析)減少を誘導する。
[104] 腫瘍間質に対する癌細胞巣の割合は、癌巣に対するLI治療の選択的作用を示す。Malloryトリクローム法で染色され、ピンクに標識された癌巣を有する切除組織試料、及び腫瘍組織内の上皮巣の割合は、図8に示すように、ImageProソフトウェアを用いて形態計測により測定する。LI治療は、対照(非LI治療)と比較して、腫瘍組織中の癌細胞巣の割合の有意な(p<0.005、ANOVA単一因子分析)減少を誘導する。
[105] 上皮周囲膠原病は、対照患者及びLI治療患者の両方で頻度の点で類似するが、間質性の上皮内線維症は、表7に示すように、対照群(対照患者の2/20、すなわち10%)と比較して、LI治療群(治療患者の10/19、すなわち53%)で有意(p<0.01)により頻繁に起こる。
[106] 従来の療法より前の第1選択の治療として、進行した原発性OSCCの患者に投与される白血球インターロイキン(LI)注射剤は、炎症細胞ではなく浸潤免疫細胞において腫瘍内変化を誘導する。T細胞集団は、癌巣に移動する。約20IU〜1600IU、又は特に400IU若しくは800IUのLIを2週間に渡って週3回、或いは、約20IU〜1600IU、又は特に400IU若しくは800IUを週5回、腫瘍周囲に投与すると、浸潤性のCD8+ T細胞はCD25+の発現を増加させる。本治療法は、2週間の治療計画終了時に腫瘍組織の大量壊死をもたらさないので、結合組織と腫瘍上皮成分との比率に顕著な変化は見られない。
[107] これは、本明細書で記載されている、手術前の3週間のLIによる前治療、及びその後の放射線療法の後に、対照群と比較して、LI治療されたOSCC患者の腫瘍重量の有意な減少をもたらす方法と対照的である。この方法では、週5日、合計3週間に渡って、800IU/日(IL−2に換算)のLIによる前処理を行うことが企図され、それによって浸潤性免疫細胞の相当な調整が誘導される。CD8+ T細胞数(p<0.05)は、腫瘍浸潤性CD4+ T細胞の有意(p<0.05)な増加に伴って減少する。これらの変化は、腫瘍中のCD4/CD8比の基本的な変化を導く。
[108] OSCC患者の対照無処置群で見られた低いCD4/CD8比(<1)は、LI治療の結果、間質及び上皮内で劇的に増加した(CD4/CD8比が>2から>3.5へ)。このように、進行した原発性OSCC患者の高用量(IL−2に換算して800IU/日を週5日、3週間)ネオアジュバントLI治療は、顕著なCD4+ T細胞浸潤のパラダイムシフトをもたらす。癌巣内の抗原提示細胞(樹状細胞)及び炎症細胞(特に、好中球)の密度及び局所分布の明瞭且つ特異的な変化は、図9のLIによる宿主免疫活性化の模式図に示される。
[109] 宿主抗腫瘍免疫応答の腫瘍浸潤細胞成分の複雑な変化(癌巣の多巣性壊死等)、及びLI治療OSCC患者で検出される結合組織の割合の増加も起こる。これらの変化は、ネオアジュバントLI投与によって誘導される、OSCCに対する抗腫瘍免疫応答が成功したことを示す。
[110] OSCCへの免疫応答の成功のためには、腫瘍中の低い(<1)CD4/CD8比を逆転させることが必要である。特に、ナイーヴな無処置OSCC患者における腫瘍及びその周囲の間質中でCD4+ T細胞に対してCD8+ T細胞が優勢であることは、OSCCに特異的なものではなく、他の多くの固形腫瘍でも見られる。同様に、低いCD4/CD8比が基底細胞癌、子宮頸癌及び乳癌において検出されるが、これは、それらの腫瘍によって、患者(宿主)において後天的な免疫抑制状態が誘導されることを示唆している。
[111] LI治療により誘導された、OSCCにおける宿主免疫細胞の細胞性浸潤の組織病理学的変化は、LI前治療群で42%の総合奏効率をもたらす。客観的奏効率は21%であり、評価可能な19人のLI治療患者中2名が病理検査で完全奏効と確認された。
[112] LI治療群と、臨床的及び病理学的退縮が19中8症例で観察されたLI治療奏効例サブグループに記載の者と、の組織病理学的比較は、免疫細胞組成から炎症性細胞密度及び残留腫瘍の組織学に至るすべての試験パラメータが、LI治療患者の上記2サブグループで非常に類似していることを示す。これらのデータは、LI治療群が比較的均一にLI治療に応答したが、抗癌病理学的効果が異なることを示唆する。この矛盾は、OSCC患者の免疫感受性(Ir遺伝子及びHLAの差)及び/又は免疫能レベル(試験参加時)が差別的であることによって説明することが可能である。それらは、異なるLI治療患者において、機能性免疫応答障害の強弱をもたらした可能性がある。MHC−I抗原、副刺激分子の標的癌細胞上の発現、及びそれらのFAS−リガンド発現の欠如、又はTCR−ζ鎖の異常、CD8+ T細胞のアポトーシス感受性、及びCD34+ 細胞の存在は、いずれもOSCCにおける免疫応答不全に寄与する(Cruzら、「Lack of MHC class I surface expression on neoplastic cells and poor activation of the secretory pathway of cytotoxic cells in oral squamous cell carcinomas」、Br J Cancer 81:881(1999);Langら、「Impairment of T−cell activation in head and neck cancer in situ and in vitro」、Arch Otolaryngol Head Neck Surg 125:82(1999);Lutzら、「Human leukocyte antigen class I expression on squamous cell regulates natural killer cell activity」、Cancer Res 59:5793(1999);Hoffmannら、「Spontaneous apoptosis of circulating T lymphocytes in patients with head and neck cancer and its clinical importance」、Clin Cancer Res 8:2553(2002);Reichertら、「The number of intratumoral dendritic cells and ζ−chain expression in T cells and prognostic and survival biomarkers in patients with oral carcinoma」、Cancer 91:2136(2001);Kussら、「Effector CD8+ CD45RO−CD27−T cells have signaling detects patients with squamous cell carcinoma of the head and neck」、Br J Cancer 88:223(2003);Schmidtら、「Mechanisms of immune suppression in patients with head and neck cancer:presence of CD34+ cells which suppress immune functions within cancers that secrete granulocyte−macrophage colony−stimulating factor」、Clin Cancer Res 1:95(1999);Rivoltiniら、「In vivo interleukin 2−induced activation of lymphokine−activated killer cells and tumor cytotoxic T−cells in cervical lymph nodes of patients with head and neck tumors」、Cancer Res 50:5551(1990);Youngら、「Mechanisms of immune suppression in patients with head and neck cancer:influence on the immune infiltrate of the cancer」、Int J Cancer 67:333(1996)。従って、癌細胞標的の感受性を並行して調整する試みなしに免疫系を排他的にターゲッティングすることは、治療の総合奏効率の改善にはつながらない。
[113] 進行した原発性OSCC患者に対する、本明細書に記載の用量によるLIネオアジュバント前治療は、腫瘍を浸潤する免疫細胞の種類(CD8+ T細胞ではなく、主としてCD4+ T細胞)のパラダイムシフトをもたらす。このシフトは、CD8+ T細胞浸潤が優勢で、腫瘍浸潤CD4+ T細胞が殆ど存在しない対照群の僅かな抗腫瘍反応と比較して、腫瘍細胞壊死、及び腫瘍質量の顕著な減少をもたらす。腫瘍免疫細胞浸潤構成のパラダイムシフト(腫瘍内CD4/CD8比の逆転)は、LI治療患者が残留腫瘍細胞の放射線療法に対する感受性の増加を示した既報告の臨床所見、及び、LI治療のOSCC患者の再発までの時間の延長及び再発率の減少(対照(無処置)のOSCC患者と比較)で測定される治療の生物学的影響と相俟って、OSCC及び他の固形腫瘍の治療への新たなアプローチをもたらす。
[114] 本発明は以上の説明の通りであるが、本発明を様々に改変することができることは明らかであろう。そのような改変は、本発明の精神及び範囲から逸脱するものとみなされるべきではなく、そのような改変はすべて、特許請求の範囲に包含されるものとする。
Claims (30)
- 腫瘍中のCD4/CD8比を変化させる方法であって、
腫瘍に、治療有効量の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を投与するステップを含む方法。 - 800IU/mL(ここで、IUは、ヒトIL−2に関する世界保健機関第1次国際標準、86/504で規定されている、インターロイキン2に関する国際単位を表す。)の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を週5回、3週間に渡って投与する、請求項1に記載の方法。
- 800IU/mLの無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物のうちの400IU/mLを腫瘍塊周囲の4つの異なる部位に、100IU/mLが4つの部位の各々に注射されるように注射し、400IU/mLを腫瘍塊と同側の外リンパに注射する、請求項2に記載の方法。
- 外リンパへの400IU/mLの注射を、腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う、請求項3に記載の方法。
- 無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物が、下記特定比率で、IL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有する、請求項1に記載の方法。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.4〜1.5
TNF−αのIL−2に対する比率:3.2〜10.9
IFN−γのIL−2に対する比率:1.5〜10.9
GM−CSFのIL−2に対する比率:2.2〜4.8 - サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項5に記載の方法。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.6〜0.8
TNF−αのIL−2に対する比率:7.7〜11.3
IFN−γのIL−2に対する比率:4.9〜7.1
GM−CSFのIL−2に対する比率:3.5〜4.5 - 腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法であって、
癌に、治療有効量の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を投与するステップを含む方法。 - 800IU/mL(ここで、IUは、ヒトIL−2に関する世界保健機関第1次国際標準、86/504で規定されている、インターロイキン2に関する国際単位を表す。)の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を週5回、3週間に渡って投与する、請求項7に記載の方法。
- 800IU/mLの無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物のうちの400IU/mLを腫瘍塊周囲の4つの異なる部位に、100IU/mLが4つの部位の各々に注射されるように注射し、400IU/mLを腫瘍塊と同側の外リンパに注射する、請求項8に記載の方法。
- 外リンパへの400IU/mLの注射を、腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う、請求項9に記載の方法。
- 無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物が、下記特定比率で、IL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有する、請求項7に記載の方法。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.4〜1.5
TNF−αのIL−2に対する比率:3.2〜10.9
IFN−γのIL−2に対する比率:1.5〜10.9
GM−CSFのIL−2に対する比率:2.2〜4.8 - サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項11に記載の方法。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.6〜0.8
TNF−αのIL−2に対する比率:7.7〜11.3
IFN−γのIL−2に対する比率:4.9〜7.1
GM−CSFのIL−2に対する比率:3.5〜4.5 - 下記特定比率で、IL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.4〜1.5
TNF−αのIL−2に対する比率:3.2〜10.9
IFN−γのIL−2に対する比率:1.5〜10.9
GM−CSFのIL−2に対する比率:2.2〜4.8 - サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項13に記載の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.6〜0.8
TNF−αのIL−2に対する比率:7.7〜11.3
IFN−γのIL−2に対する比率:4.9〜7.1
GM−CSFのIL−2に対する比率:3.5〜4.5 - 下記特定比率で、IL−1β、TNF−α、IFN−γ及びGM−CSFからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン2(IL−2)と、を含有し、
薬学的に許容される賦形剤、担体又は添加剤を随意的に更に含有する、癌治療用の医薬組成物。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.4〜1.5
TNF−αのIL−2に対する比率:3.2〜10.9
IFN−γのIL−2に対する比率:1.5〜10.9
GM−CSFのIL−2に対する比率:2.2〜4.8 - サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項15に記載の医薬組成物。
IL−1βのIL−2に対する比率:0.6〜0.8
TNF−αのIL−2に対する比率:7.7〜11.3
IFN−γのIL−2に対する比率:4.9〜7.1
GM−CSFのIL−2に対する比率:3.5〜4.5 - IL−3を更に含有し、IL−3のIL−2に対する比率が、0.38〜0.68、好ましくは0.53±0.15である、請求項16に記載の医薬組成物。
- IL−6を更に含有し、IL−6のIL−2に対する比率が、37.2〜53.8、好ましくは46±5.9である、請求項16に記載の医薬組成物。
- IL−8を更に含有し、IL−8のIL−2に対する比率が、261〜561.5、好ましくは411±10.6である、請求項16に記載の医薬組成物。
- IL−1αを更に含有し、IL−1αのIL−2に対する比率が、0.56〜0.94、好ましくは0.75±0.19である、請求項16に記載の医薬組成物。
- IL−10を更に含有し、IL−10のIL−2に対する比率が、2.87〜3.22、好ましくは3.0±0.18である、請求項16に記載の医薬組成物。
- IL−16を更に含有し、IL−16のIL−2に対する比率が、1.16〜2.84、好ましくは1.84±0.68である、請求項16に記載の医薬組成物。
- G−CSFを更に含有し、G−CSFのIL−2に対する比率が、2.16〜3.78、好ましくは2.97±0.81である、請求項16に記載の医薬組成物。
- TNF−βを更に含有し、TNF−βのIL−2に対する比率が、1.17〜2.43、好ましくは1.8±0.63である、請求項16に記載の医薬組成物。
- MIP−1αを更に含有し、MIP−1αのIL−2に対する比率が、15.7〜37.16、好ましくは22.7±7.0である、請求項16に記載の医薬組成物。
- MIP−1βを更に含有し、MIP−1βのIL−2に対する比率が、17.1〜28.5、好ましくは22.8±5.7である、請求項16に記載の医薬組成物。
- RANTESを更に含有し、RANTESのIL−2に対する比率が、2.3〜2.7、好ましくは2.5±0.13である、請求項16に記載の医薬組成物。
- EGFを更に含有し、EGFのIL−2に対する比率が、0.267〜0.283、好ましくは0.275±0.008である、請求項16に記載の医薬組成物。
- PGE2を更に含有し、PGE2のIL−2に対する比率が、3.63〜5.42、好ましくは4.5±0.87である、請求項16に記載の医薬組成物。
- TxB2を更に含有し、TxB2のIL−2に対する比率が、23.47〜25.13、好ましくは24.3±0.83である、請求項16に記載の医薬組成物。
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