CN101005760A - 改变cd4/cd8和进入肿瘤的单核细胞浸润液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液的方法，其导致浸润性免疫细胞的显著调节，如CD8+T细胞减少和肿瘤浸润性CD4+T细胞显著增加所证明的。以800IU/天IL－2的剂量给予白细胞白介素注射液(LI)，每周5次，持续4周导致典范转移，所述白细胞白介素注射液是由细胞因子IL－1β、TNF－α、IFN－γ和GM－CSF与白介素2(IL－2)以特定比率构成的无血清且无促分裂原的混合物。所述典范转移被定义为癌细胞巢中显著CD4+T细胞浸润液和抗原呈递细胞如树突细胞和炎症细胞，特别是嗜中性粒细胞的密度和定位的清楚且特异改变。
Description
本专利或者申请含有至少一张彩色附图，当请求并付给必要的费用后，由专利局提供含有彩色附图的该申请或者专利申请的副本。
介绍
本发明设计改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液的方法。用白细胞白介素注射液(Leukocyte Interleukin Injection，LI)以800IU/天IL-2进行每周5天剂量的治疗总共3周，CD8+T细胞减少，并且肿瘤浸润性CD4+T细胞显著增加，表明对浸润性免疫细胞的显著调节。由于LI治疗，在口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者的对照非治疗组中看到的低CD4/CD8比率在基质和上皮内显著增加。800IU/天IL-2的剂量进行每周5天为期3周的新佐剂LI治疗晚期原发性OSCC患者也导致典范转移，该典范转移被定义为显著的CD4+T细胞浸润液和癌细胞巢中抗原呈递细胞，如树突细胞和炎症细胞，尤其嗜中性粒细胞的密度和定位的特异改变。
白细胞白介素注射液(LI)是由细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF与白介素2(IL-2)以特定比率构成的无血清并且无促分裂原的混合物。LI在诱导癌性细胞进入增殖性细胞周期状态从而增加它们对化学疗法、放射疗法和免疫疗法的易损性中也是有效的。LI可以单独或者与其他药物组合使用，用于治疗癌症，从而增加癌症治疗的成功率和癌症患者的无疾病存活率，如2003年7月3日申请的美国专利申请号10/611,914，将其完整引入本文作为参考。
发明背景
肿瘤-宿主相互作用是肿瘤发展的复杂特征并且是抗癌治疗的日益重要的靶标(Tímár等人，″Molecular pathology of tumor metastasisIII.Target array and combinatorial therapies″Pathol Oncol Res 9：49(2003))。癌细胞、免疫效应细胞、炎症细胞、肿瘤脉管系统和基质之间的细胞相互作用显示出复杂的多方面的相互作用。该复杂的相互作用网络的各个成员的功能的治疗调节可以导致更大的肿瘤控制。
成功的免疫治疗抗癌效果通常导致目标肿瘤细胞上肿瘤抗原和MHC抗原的表达，癌细胞对效应机制的敏感性，和抗癌效应机制的诱导的/增加的活性(Whiteside，″Immunobiology and immunotherapy ofhead and neck cancer″，Current Oncol Rep 3：46(2001)；Whiteside等人，″Evidence for local and systemic activation of immune cells byperitumoral injections of interleukin 2 inpatients with advancedsquamous cell carcinoma of the head and neck″，Cancer Res 53：5654(1993))。通过使用细胞因子增强免疫效应机制，由几种可能的免疫策略可以实现这些目标。直到最近，口腔鳞状细胞癌(OSCC)才被认为是免疫治疗靶标，但是Whiteside和其他人的开创性研究提出免疫治疗方法有理由是处理该高度侵入性癌的新方法。
早期的结果证明了局部给药rhIL-2的高度易变的应答率(6-65％)(Vlock等人，″Phase Ib trial of the effect of peritumoral andintranodal injections of interleukin-2 in patients with advancedsquamous cell carcinoma of the head and neck：an eastern cooperativeoncology group trial″，J Immunother 15：134(1994)；Cortesina等人，″Interleukin-2 injected around tumor-draining lymph nodes in headand neck cancer″，Head Neck 13：125(1991))。三期试验涉及对OSCC患者局部给药rhIL-2，导致无疾病存活率以及总体存活率的显著增加(p＜0.03)(De Stefani等人，″Treatment of oral cavity and oropharynxsquamous cell carcinoma with perilymphatic interleukin-2：clinical andpathologic correlations″，J Immunother 19：125(1996)；De Stefani等人，″Improved survival with perilymphatic interleukin-2 in patients withrespectable squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx″，Cancer 95：90(2002))。从rhIL-2治疗的OSCC患者得到的肿瘤组织的组织学检查表明在局灶性坏死中CD25+/HLADR+/CD3+T细胞的富集(Valente等人，″Infiltrating leukocyte populations and T-lymphocytesubsets in head and neck squamous cell carcinoma from patientsreceiving perilymphatic injections of recombinant interleukin 2″，Modern Pathol 3：702(1990)。
使用天然IL-2以及天然发生的细胞因子的混合物进行的临床试验提供了30％到53.3％的应答率(Hadden等人，″Interleukins andcontrasuppression induce immune regression of head and neck cancer″，Arch Otolaryngol Head Neck Surg 120：395(1994)；Verastegui等人，″Anatural cytokine mixture(IRX-2)and interference with immunesuppression induce immune mobilization and regression of head andneck cancer″，Int J Immunopharmac 19：619(1997)；Meneses等人，″Histologic findings in patients with head and neck squamous cellcarcinoma receiving perilymphatic natural cytokine mixture(IRX-2)prior to surgery″，Arch Pathol Lab Med 122：447(1998)；Barrera等人，″Combination Immunotherapy of squamous cell carcinoma of the headand neck″，Arch.(2000))。组织病理学分析表明天然的细胞因子混合物诱导肿瘤的显性剂量依赖的T淋巴细胞浸润和肿瘤破碎。
另一方面，由细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF与白介素2(IL-2)以特定比率组成的无血清并且无促分裂原的白细胞白介素注射液(LI)混合物诱导肿瘤细胞巢的CD3+、CD25+T淋巴细胞浸润以及癌细胞进入细胞周期模式(Tímár等人，″The Effect of LeukocyteInterleukin Injection(Multikine)Treatment on Peritumoral andIntratumoral Subpopulation of Mononuclear Cells and on TumorEpithelia：A Possible New Approach to Augmenting Sensitivity toRadiation Therapy and Chemotherapy in Oral Cancer″，Laryngoscope113：2206(2003))。
如Tímár等人报导的，将白细胞白介素(LI)注射液沿肿瘤外周给药，在2周内每周3次，以约20IU到1600IU或者特别以400IU或者800IU给药，或者进一步每周5次，以约20IU到1600IU或者以400IU或者800IU给药，其中IU代表世界卫生组织首次国际标准关于人IL-2，86/504(World Health Organization IS International Standardfor Human IL-2，86/504)的国际单位。在常规治疗前，将剂量作为第一线治疗给药晚期原发性OSCC患者并在浸润性免疫细胞而非炎症细胞中诱导肿瘤内的改变。如通过增加的CD25+表达所证明的，迁移到癌细胞巢中的T细胞群体和浸润性CD8+T细胞被激活。
尽管在科学文献中通常所认可的，CD8+细胞毒性T细胞是肿瘤破坏所需的，但是OSCC中赘生细胞上I类HLA表达的缺少似乎排除了在OSCC中CD8+细胞的靶定。因此，对OSCC的成功的免疫应答可能需要逆转低的肿瘤内CD4/CD8比率。
值得注意地，在肿瘤和周围基质内幼稚的未治疗的OSCC患者中CD4+T细胞相对于CD4+T细胞的优势不是OSCC特异性的并且可以在许多其他实体瘤中看到。已经在基底细胞癌、子宫颈癌和乳腺癌中检测到类似的低CD4/CD8比率，提示这些肿瘤诱导的患者的获得免疫抑制状态(Rohrbach等人，″Immunology and growth characteristics ofocular basal cell carcinoma″，Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 239：35(2001)；Santin等人，″Tumor-infiltrating lymphocytes contain highernumbers of 1 cytokine expressors and DR+T cells compared withlymphocytes from tumor draining lymph nodes and peripheral blood inpatients with cancer of the uterine cervix″，Gynecol Oncol 81：424(2001)；Ben-Hur等人，″The role of lymphocytes and macrophages inhuman breast tumorigenesis：an immunohistochemical andmorphometric study″，Anticancer Res 22(2B)：1231(2002))。
这些研究和观察综合起来表明用天然细胞因子的混合物进行局部治疗是OSCC治疗的可行的方法。然而，没有评估肿瘤的细胞浸润液的改变、肿瘤组织学的改变和临床确定的应答之间的关系。
因此，在癌细胞巢中抗原呈递细胞(树突细胞)和炎症细胞，特别在嗜中性粒细胞的密度和定位需要特定调节。还需要肿瘤免疫细胞浸润液组成的偏移以逆转肿瘤内CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液结合给药LI以增加对残留的肿瘤细胞的放射疗法的敏化。
还需要诱导肿瘤细胞进入细胞周期的方法，所述细胞周期选自(细胞周期的不同期)G1、S、G2和M，其中该新方法可以与化学疗法、免疫疗法和放射疗法协同应用，并通过改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液。
一般而言，还需要预敏化癌肿瘤以及需要由IL-1β与IL-2、TNF-α与IL-2、IFN-γ与IL-2和GM-CSF与IL-2以特定比率构成的无血清并且无促分裂原的混合物，其通过改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液出乎预料地证明超过已知组合物或方法的功效。
发明概述
本发明部分地基于用由IL-1β与IL-2、TNF-α与IL-2、IFN-γ与IL-2和GM-CSF与IL-2以特定比率组成的无血清并且无促分裂原的白细胞白介素注射液(LI)混合物改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液。本发明还使得开发用作药物或者作为佐剂与治疗性癌症治疗如化学疗法、免疫疗法和放射疗法结合使用的组合物。
在本发明的实施方案中，公开了用无血清并且无促分裂原的细胞因子混合物改变免疫系统的赘生物或者疾病中CD4/CD8比率的方法。该方法提供了用于与放射疗法或者肿瘤细胞杀伤的其他物理方式结合来治疗癌症的预敏化步骤。还预期诱导肿瘤细胞进入选自(细胞周期的不同阶段)G1、S、G2和M的易损的细胞周期阶段的方法。本发明不限于任何特定类型的癌症并且可以包括任何类型的癌症。
特定应用包括在肿瘤周围给药总日剂量的一半的白细胞白介素注射液(LI)和沿淋巴外周给药另外一半的总日剂量，五(5)次每周，为期三(3)周。总日剂量为800IU/mL IL-2，其中IU代表世界卫生组织首次国际标准关于人IL-2，86/504的国际单位。半总剂量是肿瘤外周剂量。因此，将400IU沿肿瘤外周注射到肿瘤块的四个不同部位。将四分之一(1/4)的肿瘤外周剂量注射到每个肿瘤部位使得每个部位接受大约100IU/mL IL-2。将LI皮内给药于可见的/可触知的肿瘤块的周围边缘。将400IU的总剂量的剩余一半沿淋巴管外周同侧顺序给药于相同的肿瘤部位。沿淋巴管外周注射给药于注射的肿瘤块同侧的颈部淋巴管链区域中的后下颌区域。
本发明的另一实施方案包括白细胞白介素注射液(LI)，其具有如下特定比率的细胞因子与白介素2(IL-2)：IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5，优选0.7+/-0.1(IL-1β/IL-2)、TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9，优选9.5+/-1.8(TNF-α/IL-2)、IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9，优选6.0+/-1.1(IFN-γ/IL-2)，和GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8，优选4.0+/-0.5(GM-CSF/IL-2)。
在其他特定实施方案中，无血清并且无促分裂原的细胞因子制剂或者药物组合物具有不同的细胞因子和其他小生物活性分子，其中每种小生物活性分子与IL-2的比率如下：IL-3与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15，IL-6与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9，IL-8与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6，IL-1α与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19，IL-10与IL-2的比率为2.82-3.22，优选3.0+/-0.18，IL-16与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68，G-CSF与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81，TNF-β与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63，MIP-1α与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0，MIP-1β与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7，RANTES与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13，EGF与IL-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008，PGE2与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87，TxB2与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83。
在下面的说明书中阐明了本发明的其他目的和优点。附图和表组成公开的一部分，阐明，并且与说明书一起解释本发明的原理。本领域普通技术人员将理解当参照附图和下面的详细描述时，本发明的其他方面将变得显而易见。
附图简述
现在将通过下面的描述和特定实施方案借助附图更详细地解释本发明：
图1代表在LI-处理的、应答者(对于处理)亚组和对照中每个HPF(高倍视野)下细胞数目的CD4和CD8浸润细胞密度，表达为平均值±SEM(与对照比较CD4+T细胞密度增加，p＜0.05，与对照比较CD8+T细胞减少p＜005)。
图2代表在OSCC(口腔鳞状细胞癌)肿瘤(上皮内的和基质)中检测到的LI-处理的和对照中CD4/CD8比。与对照相比CD4/CD8比颠倒(在对照中CD4/CD8比＜1，在LI-1处理的肿瘤中CD4/CD8比＞2.5)。
图3代表如在OSCC(口腔鳞状细胞癌)肿瘤(上皮内的和基质)中检测到的在LI-处理的(应答者亚组)和对照中CD4/CD8比。与对照相比CD4/CD8比颠倒(在对照中CD4/CD8比＜1，在LI-1处理的应答者亚组中CD4/CD8比＞3.5)。
图4代表在OSCC(口腔鳞状细胞癌)、肿瘤表面(R1)、肿瘤中心(R2)和肿瘤基质界面(R3)中树突(CD1a)细胞浸润和定位。在LI处理的和对照中HPF(高倍视野)中CD1a+细胞数，表达为平均值±SEM。
图5代表在OSCC(口腔鳞状细胞癌)、肿瘤基质和肿瘤上皮中巨噬细胞(CD68)细胞浸润(与对照(上皮内的)相比，在IL-1处理的肿瘤中巨噬细胞减少，p＜0.002)。
图6代表在OSCC(口腔鳞状细胞癌)、肿瘤表面(R1)、肿瘤中心(R2)和肿瘤基质界面(R3)中嗜中性粒细胞(MPX，髓过氧化物酶)细胞浸润和定位。在LI处理的和对照中，HPF(高倍视野)中MPX+细胞数，表达为平均值±SEM。
图7代表OSCC中坏死的组织学外观(H&E染色)。图“A”-对照显示了在OSCC的上皮内巢中没有坏死，和图“B”-LI处理的，显示完整的癌巢为坏死的，充满碎屑和白细胞。
图8代表在LI-处理组和对照组中，处理对OSCC(口腔鳞状细胞癌)中癌巢的比率的影响(如通过形态测定分析确定)。与对照相比，LI-处理组中癌巢的比率减小，p＜0.005)。
图9代表白细胞白介素注射液(LI)的免疫活化。LI含有细胞因子、趋化因子和淋巴组织增生性淋巴因子，它们一起引起对体内肿瘤的协同的免疫攻击。将LI注射在肿瘤和局部淋巴结附近。首先，坏死因子如TNF-α导致肿瘤细胞死亡，释放肿瘤抗原。其次，肿瘤基质界面的抗原呈递细胞，如树突细胞将这些肿瘤抗原处理并呈递给CD4+T细胞。第三，淋巴组织增生性淋巴因子如IL-2导致局部淋巴结和肿瘤部位T细胞增殖。第四，LI中的趋化因子如IL-6、IL-8和其他趋化因子引导肿瘤特异免疫细胞和炎性细胞到达肿瘤部位以影响免疫细胞向肿瘤的浸润并且导致对肿瘤的炎症应答，最后导致肿瘤破坏。
发明详述和优选实施方案
本发明一般涉及预敏化癌症的方法和由IL-1β与IL-2、TNF-α与IL-2、IFN-γ与IL-2和GM-CSF与IL-2以特定比率组成的无血清并且无促分裂原的混合物。一种此类新颖的细胞因子混合物是白细胞白介素注射液(LI)，其已经证明具有免疫调节能力。癌症患者中免疫抑制的临床重要性出乎意料地影响在治疗性治疗尤其在肿瘤细胞进入细胞周期阶段前预敏化癌症的方法。
此外，每周5次，持续三周沿肿瘤外周给药400IU/mL白细胞白介素注射液(LI)和沿淋巴管外周给药400IU/mL改变了CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液。通过向肿瘤块周围四个不同部位注射相当于400IU/mL IL-2的肿瘤外周剂量。四个部位的每一个用全部400IU/mL 肿瘤外周剂量的四分之一(1/4)注射，使得每个部位接受约大约100IU/mL的IL-2。相当于800IU/mL IL-2的总剂量的剩余一半在沿淋巴管外周同侧顺序给药于肿瘤部位并且在相同的部位。淋巴管外周注射液给药于注射的肿瘤块同侧的颈部淋巴管链区域中的下颌后区域。IU代表世界卫生组织首次国际标准关于人IL-2，86/504的国际单位。
白细胞白介素注射液(LI)是从包括T细胞、B细胞和巨噬细胞的外周血单核细胞产生的无血清、无促分裂原、无抗生素的制剂。在LI中有三个“家族”的细胞因子，它们一起对于LI的独特生物活性是重要的。它们包括直接细胞毒性的/抑制细胞的和杀病毒/抑制病毒的细胞因子，如TNF-α和IFN-γ、淋巴组织增生性细胞因子，如IL-1和IL-2和趋化细胞因子如IL-6、IL-8和MIP-1α。此外，组成LI的不同细胞因子和小生物分子都来自人外周血单核细胞(包括T细胞、B细胞和巨噬细胞)的凝集素(PHA)体外刺激。在菲可帕克梯度上离心将白细胞(包括T细胞、B细胞和巨噬细胞)与供体白细胞分离，并且一系列洗涤(在生理缓冲介质)促进了淋巴细胞的分离以及红细胞、细胞碎屑和其他不想要的细胞组分与全供体血液的分离的白细胞组分的分离。
LI含有其中每种细胞因子与白介素2(IL-2)以以下的特定比率存在的细胞因子：IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5，优选0.7+/-0.1(IL-1β/IL-2)、TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9，优选9.5+/-1.8(TNF-α/IL-2)、IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9，优选6.0+/-1.1(IFN-γ/IL-2)，和GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8，优选4.0+/-0.5(GM-CSF/IL-2)。
LI中不同细胞因子的剩余部分与其他小生物活性分子也存在于每种制备物内，其中每种小生物活性分子与IL-2的比率如下：IL-3与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15，IL-6与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9，IL-8与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6，IL-1α与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19，IL-10与IL-2的比率为2.82-3.22，优选3.0+/-0.18，IL-16与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68，G-CSF与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81，TNF-β与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63，MIP-1α与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0，MIP-1β与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7，RANTES与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13，EGF与IL-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008，PGE2与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87，TxB2与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83。
用表征方案对白细胞白介素注射液(LI)进行测试并且该注射液不含有下面的细胞因子和其他生物活性小分子：IL-4、IL-7、和IL-15、TfR、sICAM、PDGF-AB、IFN-α、EPO、LTC4、TGF-β2、FGF basic、血管生成素、sE-选择蛋白、SCF和LIF。LI仅含有痕量(仅高于该测定法的检测水平)的IL-12和LTB4。
在所述生产方法中，将单核细胞通过分级梯度离心与从人供者“血沉棕黄层”分离并与PHA一起培养以增强从培养的供者白细胞产生和分泌IL-2和其他细胞因子，如美国专利5,093,479、4,390,623、4,388,309、4,406,830、4,661,447、4,681,844和4,464,355描述，将它们都引入本文作为参考。随后，无菌收获培养物上清液，将其澄清，并进行商业化病毒排阻方法。然后将上清液进一步通过超速离心和微滤浓缩约10倍。
此时，加入人血清白蛋白Inj.USP并将浓缩物缓冲到生理pH并按照标签说明要求将调节到靶IL-2浓度(例如400IU/mL)。然后将浓缩物进行再次微滤(0.22微米级滤器)并无菌分散到无菌血清型小瓶中并通过其IL-2含量标记。通过细胞毒性T淋巴样细胞系(CTLL-2)掺入对放射性标记的胸苷来测量产物效价。通过ELISA进一步测试最终的可注射试剂中如下五种标志细胞因子的存在：IL-2、IL-1β、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。
定义
IL-2-白介素2(IL-2)：由CD4+辅助T淋巴细胞合成的15.5kD的糖蛋白(以前称作T细胞生长因子)。IL-2对产生它的CD4+T淋巴细胞和免疫系统的其他细胞(包括B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK[自然杀伤细胞]细胞和其他的)具有自分泌效应。
1L-Iβ-白介素1β(1L-Iβ)：由活化的单核吞噬细胞合成的17kD细胞因子，其以游离形式在循环系统中存在并且介导炎症应答。它作用于CD4+T淋巴细胞以帮助促进它们的增殖，并且作为生长和分化因子作用于B淋巴细胞。它还诱导单核吞噬细胞的IL-6合成。
TNF-α-肿瘤坏死因子α(TNF-α)：由受刺激的单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞等合成的157个氨基酸(氨基酸)残基的蛋白质，以三聚体形式在循环系统中存在。TNF介导直接抗肿瘤作用，导致肿瘤细胞裂解，促进白细胞募集，诱导血管发生并促进成纤维细胞增殖。
IFN-γ-γ干扰素(IFN-γ)：由活化的T淋巴细胞和NK细胞合成的21-24-kD糖蛋白同型二聚体，是单核细胞的强烈活化剂，增加单核细胞破坏细胞内微生物和肿瘤细胞的能力。它具有直接的抗病毒和抗增殖活性，并且导致许多细胞类型表达II型MHC(主要组织相容性复合体)细胞表面分子复合体，以及增加I类MHC的表达。
GM-CSF-粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)：在循环中作为单体发现的127个氨基酸的蛋白质，由巨噬细胞和T淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。它是造血细胞的生长因子，并且刺激造血单核细胞谱系的生长和分化。
IL-3-白介素-3(IL-3)：由活化的CD4+T辅助细胞合成的20-kD淋巴因子，其通过促进一些造血细胞的增殖和促进T淋巴细胞的增殖和分化而充当集落刺激因子。
IL-6-白介素-6(IL-6)：由活化的T淋巴细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生的26-kD细胞因子。它作用于许多细胞并且在使得活化的B淋巴细胞分化成分泌抗体的浆细胞中有特殊功能，并且诱导肝细胞形成急性期蛋白质(参与炎症反应)以及血纤蛋白原。
IL-8-白介素-8(IL-8)：由巨噬细胞和内皮细胞产生的8-kD蛋白质。它是嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的强烈的趋化因子，并且促进嗜中性粒细胞附着到内皮细胞。
IL-1α-白介素1α(IL-1α)：17-kD细胞因子(比如IL-1β)从33-kD前体分子切除，由活化的单核吞噬细胞合成的很少在循环中以游离形式发现并且作为膜结合的物质。它帮助IL-1β介导炎症反应。
IL-10-白介素-10(IL-10)：由CD4+和CD8+淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和活化的B淋巴细胞和角质化细胞产生的18-kD多肽。它抑制巨噬细胞独特地向TH-1型细胞呈递抗原和分泌IL-6和TNF的能力。
IL-16-白介素-16(IL-16)：由CD8+T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和呼吸上皮细胞产生的14-kD四聚体蛋白。它对于CD4+T淋巴细胞和单核细胞具有强有力的化学引诱性质。
G-CSF-单核细胞集落刺激因子(G-CSF)：由巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和基质细胞产生的22-25kD同型二聚体糖蛋白。它增加骨髓中的粒细胞祖细胞，并且维持血液嗜中性粒细胞的增加。它还增强嗜中性粒细胞显示增强的超氧化物产生的能力，超氧化物生产被认为在微生物感染的细胞和肿瘤细胞的破坏中是重要的。
TNF-β-肿瘤坏死因子β(TNF-β)：活化的淋巴细胞产生的25-kD蛋白质。它可以杀死培养的肿瘤细胞，并刺激成纤维细胞增殖。此外，它模拟TNF-α的多数其他作用。
MIP-1α-巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1α)：巨噬细胞和其他细胞产生的66个氨基酸的单体蛋白质。它是单核细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱剂。
RANTES由T淋巴细胞产生的8kD蛋白质并且是单核细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱剂，并且促进炎症。
EGF-表皮生长因子(EGF)：55个氨基酸残基的三硫酸化的多肽。EGF是酪氨酸激酶家族成员，并且具有多种功能，包括刺激促有丝分裂应答和帮助伤口愈合。
PGE2-前列腺素E2(PGE2)：PGE2属于通过环加氧酶酶促反应从花生四烯酸衍生的生物活性脂类的家族。它由活化的单核细胞释放并且阻断淋巴细胞和巨噬细胞上MHC II类的表达。
TxB2-血栓烷B2(TxB2)：TxB2是通过前列腺素的异构化和内过氧化物酶PGH2经由血栓烷合成酶从不饱和脂肪酸衍生的生物活性化合物的成员。TxB2在血栓栓塞性疾病和过敏性反应中具有生理作用。
CD25+细胞-CD25是单链糖蛋白，通常称作白介素-2-受体(IL-2R)或者Tac-抗原的α链，其具有55kDa的分子量并且存在于活化的T细胞和B细胞以及活化的巨噬细胞上。它作为IL2的受体。CD25抗原与IL-2R的β链一起形成IL-2的高亲和性受体复合物。
CTLL-2(细胞系)-从C57B1/6小鼠得到的小鼠细胞毒性T淋巴细胞的细胞系。该T细胞系依赖于外源IL-2进行生长和增殖。
Fas-FasL-Fas/Fas配体系统。Fas抗原，一种介导细胞凋亡的细胞表面跨膜蛋白质，和嗜中性粒细胞上补体Fas活化的细胞因子的组合，其将细胞凋亡信号转导到细胞中。Fas是属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的I型膜蛋白，FasL是TNF家族的成员。FAS配体是31kDa(千道尔顿)的膜结合的蛋白质(278个氨基酸)。Fas-Fas配体系统在许多生物过程，包括自体反应性淋巴样细胞的清除中起重要作用。Fas配体主要在活化的T淋巴细胞中表达并且是细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的主要效应分子。
HLA-DR+淋巴细胞-含有人白细胞抗原(HLA)-DR抗原的淋巴细胞，HLA-DR抗原是由位于6号染色体上的白细胞基因座中发现的胶序列确定的一组多态性糖蛋白，所述基因座是人中主要的组织相容性基因座。
IU(国际单位)-通过与特定重量和强度的国际参照标准相比，如与人IL-2，86/504的WHO首次国际标准相比，生物制剂的效价的测量单位。国际单位是所公布的报导生物活性单位的唯一公认的和标准化的方法，并且是国际共同研究努力的结果。
U(对生物活性的测量单位)-多种称为“单位”的速记法，每个实验室得到“单位”作为参照，其对于进行工作的实验室是独特的。每个“单位”在一个实验室与另一个实验室之间是不同的，并且不在全世界上公认为标准，如国际单位(IU)。
单核浸润-单核细胞、浆细胞和淋巴细胞存在于它们“通常”不存在的组织中；或者这些细胞以大数目或者丰度成簇存在于它们通常仅以小数目存在的地方。
TCRζ链-T细胞受体ζ链。该ζ亚基是TCR复合体的部分并且靶向TCR细胞表面受体与其配体(抗原)的相互作用。当T细胞活化时延伸到细胞质(胞质溶胶)的ζ亚基在它的酪氨酸残基处磷酸化并且在TCR连接后参与信号转导。
TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)-从肿瘤分离的T淋巴细胞，它们是浸润性的。肿瘤浸润淋巴细胞有很小的或者没有细胞毒性。TIL主要包括CD4+CD8+T细胞，并且可以通过在IL-2存在下培养在体外扩增。这些细胞通过IL-2的处理活化并且经常对它们所分离自的肿瘤比对正常淋巴因子活化的细胞更具攻击性。TIL的细胞毒性活性可以通过IFN-γ增强。可以通过TGF-β在体内阻断TIL的抗肿瘤活性。
ZAP 70-与TCRζ链结合的70 kDζ结合的蛋白质，其是胞质溶胶中存在的酪氨酸激酶。认为ζ参与保持T淋巴细胞受体信号传递，介导信号转导，其最终产生IL-2。ZAP70基因在T细胞和自然杀伤细胞中表达并且定位于人类染色体2q 12。
ζ(Zeta)链-见TCRζ链-ζ链基因位于人的1号染色体上。该蛋白质的细胞外结构域长为9个氨基酸，而跨膜结构域含有带负电荷的天冬氨酸残基，细胞质结构域长为113个氨基酸。细胞质尾含有在CD3链的细胞质尾中发现的3个抗原识别基序。ζ链还结合其他受体，如Fc(片段，结晶的)-NK细胞的γ受体。
USP-美国药典专著。
P-“p＜0.01”：数理统计学中的一个术语，表示在预置条件下一种事件发生的概率水平。
ANOVA(方差分析)-如在统计学和数学教科书，例如，″Handbookof Statistical Methods for Engineers and Scientists″，Harrison M.Wadsworth，Jr.，Ed.，McGraw Hill 1990，和″Statistical OperationsAnalysis of Health Research Data″，Robert P.Hirsch and Richard K.Riegelman，Eds.Blackwell Science Inc.，1996中描述的单因子分析。
LI的作用方式和表征
白细胞白介素注射液(LI)是在本文描述的设定条件下产生的天然来源的和天然发生的人细胞因子的具有生物活性、最小毒性的免疫调节混合物。LI可以用作抗癌和抗病毒治疗或者作为新辅助疗法，对于癌症、感染性疾病和其他应答免疫调节的疾病状态有广谱应用。
动物研究表明“混合的白介素”在体外具有免疫调节和免疫刺激活性(Hadden等人，″Mixed Interleukins and Thymosin Fraction VSynergistically Induce T Lymphocyte Development in Hydrocortisone-Treated Aged Mice″，Cell.Immunol.144：228-236(1992))。不被任何理论束缚，假定“混合的白介素”的局部/区域注射克服了免疫抑制。随后，发生对肿瘤抗原的耐受性的打破并且允许发生有效的局部抗肿瘤免疫应答。已知在肿瘤的区域中局部滴注白介素或者向肿瘤中实际转染白介素基因显著增强了抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤消退，如Golumbek等人，″Treatment of Established Renal Cancer by TumorCells Engineered to Secrete Interleukin-4″，Science 254：713-716(1991)报导
然而，LI诱导恶性细胞进入细胞周期阶段而不导致肿瘤的活跃增殖或者改变CD4/CD8比率和单核细胞向肿瘤的细胞浸润对于这样的组合物在以前还是未知的，所述组合物以如下的特定比率含有细胞因子与白介素2(IL-2)：IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5，优选0.7+/-0.1(IL-1β/IL-2)、TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9，优选9.5+/-1.8(TNF-α/IL-2)、IFN-γ与IL-2比率为1.5-10.9，优选6.0+/-1.1(IFN-γ/IL-2)，和GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8，优选4.0+/-0.5(GM-CSF/IL-2)，还具有不同的细胞因子和其他生物小活性分子，其中每种生物小活性分子与IL-2的比率如下：IL-3与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15，IL-6与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9，IL-8与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6，IL-1α与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19，IL-10与IL-2的比率为2.82-3.22，优选3.0+/-0.18，IL-16与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68，G-CSF与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81，TNF-β与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63，MIP-1α与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0，MIP-1β与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7，RANTES与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13，EGF与IL-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008，PGE2与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87，TxB2与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83，白细胞白介素注射液(LI)。
手术前给药LI导致细胞周期阶段中肿瘤细胞的增加，而不像从现有技术预测的那样增加更快生长和更快复发的肿瘤的风险。LI还改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液。诱导肿瘤细胞进入细胞周期的能力是LI特有的并且可以是由于该试验药中存在的不同细胞因子的协同作用和这些细胞因子对宿主免疫系统和肿瘤细胞的差别作用。从LI的依赖剂量的给药也看到典范转移(paradigm shift)，改变CD4/CD8比率和进入肿瘤的单核细胞浸润液。
患者
表1和表2中提供了关于白细胞白介素注射液(LI)治疗的和对照患者组的信息。在表1和表2中分别给出了治疗组和对照组的肿瘤的原发部位。包括41名患者，但是仅仅39名是可评估的。这些对照标本基于患者的肿瘤大小、肿瘤的部位、肿瘤阶段、性别和年龄与对照组匹配。
表1
白细胞白介素注射液治疗组：患者信息
| 患者# | 性别 | 年龄(岁) | 肿瘤定位 |
| 1 | 女 | 65 | 舌根 |
| 2 | 男 | 40 | 舌头 |
| 3 | 男 | 51 | 牙龈 |
| 4 | 男 | 73 | 底部(口) |
| 5 | 男 | 66 | 唇 |
| 6 | 男 | 54 | 底部(口) |
| 7 | 女 | 59 | 底部(口) |
| 8 | 男 | 72 | 底部(口) |
| 9 | 男 | 60 | 底部(口) |
| 10 | 男 | 59 | 舌头 |
| 11 | 女 | 54 | 底部(口) |
| 12 | 女 | 57 | 颊 |
| 13 | 女 | 87 | 底部(口) |
| 14 | 男 | 54 | 口咽 |
| 15 | 男 | 48 | 底部(口) |
| 16 | 男 | 60 | 舌头 |
| 17 | 男 | 54 | 底部(口) |
| 18 | 男 | 57 | 底部(口) |
| 19 | 男 | 59 | 底部(口) |
表2：患者数据，对照组：患者信息
| 患者# | 性别 | 年龄(岁) | 肿瘤定位 |
| 1 | 女 | 65 | 底部(口) |
| 2 | 男 | 52 | 舌头 |
| 3 | 男 | 52 | 舌头 |
| 4 | 男 | 57 | 舌根 |
| 5 | 男 | 40 | 舌头 |
| 6 | 男 | 59 | 舌头 |
| 7 | 男 | 43 | 底部(口) |
| 8 | 男 | 53 | 舌根 |
| 9 | 男 | 45 | 舌头 |
| 10 | 女 | 50 | 舌头 |
| 11 | 男 | 66 | 唇 |
| 12 | 男 | 75 | 唇 |
| 13 | 男 | 67 | 唇 |
| 14 | 男 | 55 | 舌头 |
| 15 | 男 | 58 | 舌根 |
| 16 | 女 | 53 | 舌头 |
| 17 | 男 | 46 | 舌头 |
| 18 | 男 | 75 | 唇 |
| 19 | 男 | 77 | 唇 |
| 20 | 男 | 61 | 底部(口) |
入选标准
在LI治疗组中包括患有以前未治疗的头和颈癌(口腔鳞状细胞癌，OSCC)的21名患者。入选标准是18岁或者以上，患有组织学上确证的头和颈的鳞状细胞癌，没有已知的转移疾病并且预期存活大于6个月，并且以前没有对OSCC进行治疗或者进行任何其他免疫治疗。排除怀孕、以前对LI给药部位进行了放射治疗、存在十二指肠溃疡或者胃溃疡的患者、和哮喘患者。
可评估的患者
总共选择了41名患者，39名是可评估的。LI治疗组由21名患者组成，19名患者可评估。LI治疗组患者中的两名随后证实患有(1)腭垂的未分化癌和(2)口底部的腺癌。给予这两名患者全程治疗，包括给予试验药，但是他们不是组织病理学/免疫组织化学分析的部分，因为他们不满足患有口腔鳞状细胞癌的标准。对照组由20名患者组成，活组织检查证实了口腔鳞状细胞癌，肿瘤位于相同的口腔区域并且肿瘤和疾病阶段与试验药(LI)治疗组的相似。
治疗方案
以下面的方式进行白细胞白介素注射液(LI)的给药：在三周内将一半的(400IU)总日剂量(800IU/mL，按照IL-2)沿肿瘤外周注射(1/4的肿瘤外周剂量[约100IU]在肿瘤块周围的四个部位的每一个)，另一半(400IU，以IL-2表示)的总日剂量在淋巴管周同侧给药于肿瘤部位(顺序地并且相同部位)，每周5次，为期三周。将LI皮内给药于可见的/可触诊的肿瘤块的圆周边缘。沿淋巴管外周注射给药于所注射的肿瘤块同侧的颈动脉淋巴链的下颌区后部。
在第一次LI给药前三天，给予环磷酰胺的单次静脉内输注，注射300mg/m2。自己口服(与食物一起)吲哚美辛(25mg)，每天三次，总的日剂量为75mg，在环磷酰胺给药后3天开始，并且直到手术前24小时。在环磷酰胺给药后3天开始自己给药硫酸锌(500mg，按照元素锌)和多种维生素补充物，每天一次，直到手术前24小时。
所有患者(LI治疗的和对照患者)在最后的LI剂量后1-2周都接受手术，然后在手术后1-4周进行放射疗法。LI预治疗没有不利地影响该患者群体中的伤口愈合。
患者检查
包括在该试验前，对患者进行了总体评估。还检查他们的医疗史。一旦参加完全的体检，就进行血液学、血液化学诊断检查、胸部心脏放射线照相术和心电图。进行原发肿瘤部位的可能的成像以得到基线图像。对于所有患者，都通过测量两个主要垂直直径对他们的原发肿瘤进行基线双二维测量。在每个后来的就诊时检查患者并使用合格的调查表调查生命质量(例如，痛苦水平、舌灵活程度，等等)。在每次就诊时治疗医生评估毒性。
白细胞白介素注射液(LI)
从美国红十字会(US Red Cross)得到的所选人外周血单核细胞通过FDA要求的所有输血测试后，用促分裂原培养后制备白细胞白介素注射液(LI)。没有允许首次供者。然后将无血清的培养物上清液无菌收获，澄清，进行商业病毒排阻过程，离心，并微滤。向浓缩物加入人血清白蛋白注射液(USP)并将所得溶液缓冲到生理pH，达到目标IL-2浓度，并进行二次微滤。将所配制的药物溶液无菌分配到无菌血清型小瓶中并通过其IL-2含量标记。通过使用细胞毒性T淋巴样(CTLL-2)、IL-2依赖的细胞系通过放射标记的胸苷(体外)的掺入测量产物效价。通过ELISA进一步测试或者通过五种标记细胞因子：IL-2、IL-1β、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的存在来测试最终可注射试剂。将LI进一步进行质量控制测试以检查无菌性、细菌内毒素、pH和总蛋白质浓度和进行其他物理-化学测试。
在硼硅玻璃血清小瓶中提供冷冻的白细胞白介素注射液(LI)，小瓶含有2.2mL药物，标签声明为IL-2(400IU/ml)，用于肿瘤外周、肿瘤内、淋巴管外周或者皮下给药。将LI进行质量控制测试以检查身份、无菌性、细菌内毒素、pH和总蛋白质浓度。检查每个小瓶的微粒污染和外观。该制剂的总蛋白质含量为3mg/mL，其中提供的物质是无菌且无致热原的。将LI的过期日期指定为当药物在-20℃时，从生产日期开始24个月。
环磷酰胺
提供环磷酰胺注射液USP(Bristol-Myers-Squibb，UK)，其为无菌粉剂，每100mg环磷酰胺含有45mg氯化钠，75mg甘露醇或者约82mg碳酸氢钠，在静脉内输注前进行重构。
吲哚美辛
吲哚美辛USP(Sanofi-Synthelabo，France)以25mg片剂提供，与食物一起自己进行口服给药。
硫酸锌和多种维生素
由诊所为每名患者提供硫酸锌(50mg元素锌，R.P.SchererCorporation，Clearwater，Florida，USA)和OTC多种维生素用于自己给药。
病理学
一种病理学方案描述了手术切除的样品的制备和固定和总量、目视和显微镜检查、组织学和免疫生物化学步骤，如本文描述。对可疑的损伤的切除活组织检查诊断口腔损害。将癌症分类为T2-3N0-2M0。仅选择满足所有其他标准的T2-3N0-2M0用于免疫疗法。在LI治疗方案结束时且在患者的肿瘤切除方案之前通过二维/三维测量评估肿瘤应答。将切除的组织置于装有盐水缓冲的福尔马林的预先标记的容器中，过夜固定，然后石蜡包埋并制备薄切片用于苏木精-伊红(H&E)染色、免疫组织化学和肿瘤应答的病理学评估。
组织学
对三种不同的肿瘤区：表面(区1)、中心(区2)和肿瘤基质界面(区3)进行组织病理学分析。从HE染色的切片确定组织学和AJCC分级和坏死肿瘤细胞的发生。通过如下两种方法确定肿瘤中肿瘤上皮组分相对于基质的百分数：根据Mallory染色的结缔组织(毛状体染色)和(2)通过ImagePro分析软件(MediaCibernetics，Silver Spring，MD)测量切片的癌细胞巢(肿瘤上皮)的面积。用DAKO(Glostrup，Denmark)的泛-细胞角蛋白(pan-cytokeratine)抗体来检测含有切除的组织的载玻片标记中的细胞角蛋白，所述抗体标记癌细胞。将载玻片在显微镜下检查并用ImagePro分析软件分析。
单核细胞浸润的表征
通过免疫组织化学(从石蜡切片)确定肿瘤细胞巢附近中存在的单核细胞。将切片脱蜡并用微波处理以恢复抗原性。仅给药商业抗体，以前证明这些抗体始终如一地对脱蜡的石蜡切片染色。用抗髓过氧化物酶抗体(DAKO的小鼠单克隆抗体)标记嗜中性粒细胞，用小鼠单克隆抗-CD34抗体(DAKO)标记造血干细胞，通过CD68抗原的表达(小鼠单克隆抗-CD68)鉴定巨噬细胞群体，通过CD1a标记的表达(小鼠单克隆抗-CD1a，Immunotech，Paris，France)鉴定树突细胞。通过LCA抗原表达(小鼠单克隆抗-CD45，DAKO)鉴定淋巴样细胞。通过小鼠单克隆抗-CD3抗体(DAKO)鉴定T细胞。通过抗-CD8细胞毒性T细胞抗体(DAKO)测定CD8的表达来鉴定细胞毒性T细胞。给药抗-CD4+T细胞抗体(Novocastra，Newcastle Upon Tyne，UK)鉴定效应CD4 T细胞。使用来自Novocastra的CD56/CD57抗原小鼠单克隆抗-CD56和抗-CD57抗体鉴定NK细胞。在所有情况中，制备并评估合适的抗体(相同同种型抗体)阳性和阴性对照载玻片。使用针对IL-2R的小鼠单克隆抗体CD25(Novocastra)鉴定肿瘤上皮和基质内表达IL-2R的细胞。在所有情况中，使用对目的靶标非特异的同种型匹配的单克隆抗体来制备阴性对照载玻片。
所有免疫化学(IHC)标记都用DAKO LSAB-2试剂盒进行，使用生物素化的抗-小鼠/抗兔IgG连接体和链霉抗生物素蛋白-HRP来显现特异结合的抗体。所用的发色团是AEC(红色)标记。用苏木精对切片复染以显示细胞核。
热点技术
基于“热点”技术测定单核细胞的密度。在最高的肿瘤浸润单核细胞密度区测量每个研究的肿瘤区密度。该方法使得组织中细胞浸润的极端不均匀性变得最小。
病理学评估
采用HE使用肿瘤的显微外观评估来自LI治疗组和对照的肿瘤活组织检查。还进行CD3、CD4、CD8、CD1a和CD25标记，条件是肿瘤的大小允许进行所有5种标记步骤。对对照组和LI治疗组使用完整的分析程序。用30倍放大倍数来选择载玻片用于观察。在组织学分析中使用100倍放大倍数。通过对该研究不知情的3个独立病理学家(JT、CSF和BD)进行组织切片的病理学和组织学评估和形态测量。如本领域已知的，可以使用其他病理学和组织学评估。
统计学分析
通过单因子ANOVA分析病理学数据，认为“p”值＜0.05(α＝0.05)是统计学显著的。
组织学评估
在表3和4中列出了所有LI-处理的(19)和对照(20)患者的组织学诊断、Brodes得分和TNM(肿瘤结节转移)。如表3和4中显示，LI处理的和对照在组织学上并且在角化(Brodes得分)或者TNM阶段方面都没有不同(Odell等人，″The Progostic Value of IndividualHistologic Grading Parameters in Small Lingual Squamous CellCarcinomas；The Importance of the Pattern of Invasion″，Cancer 74：789(1994))。这得到了细胞角蛋白免疫染色模式的证实，表明了两个组中CK-19和pan-CK的高度异质表达。
表3组织学，对照组
| 患者# | Dg | 等级 | pTNM | 坏死类型 |
| 1 | cc.刺细胞 | BR3 | PT2N0 | - |
| 2 | CPC | BR2 | PT2N0 | +肉眼可见的 |
| 3 | CPC | BR3 | PT2N1 | - |
| 4 | CPC | BR3 | PT2N0 | +单细胞的 |
| 5 | CPC | BR2 | PT2N0 | - |
| 6 | CPC | BR3 | PT2N2 | +肉眼可见的 |
| 7 | CPC | BR2 | PT2N0 | - |
| 8 | CPC | BR3 | PT3N0 | +肉眼可见的 |
| 9 | CPC | BR3 | PT2N0 | - |
| 10 | CPC | BR3 | PT2N0 | - |
| 11 | CPC | BR1 | PT2N0 | +微中心 |
| 12 | CPC | BR1 | PT2N0 | - |
| 13 | CPC | BR1 | PT3N0 | - |
| 14 | CPC | BR3 | PT2N0 | - |
| 15 | CPC | BR1 | PT2N0 | +肉眼可见的 |
| 16 | CPC | BR3 | PT3N0 | - |
| 17 | CPC | BR1 | PT2N0 | +中心微 |
| 18 | CPC | BR2 | PT2N0 | - |
| 19 | CPC | BR1 | PT2N0 | - |
| 20 | CPC | BR1 | PT2N0 | +单细胞的 |
表4组织学和病理学；白细胞白介素注射液治疗组
| 患者# | Dg | 等级 | pTNM | 临床反应* | 坏死类型 |
| 1 | CPC | BR3 | T2N0M0 | 小的，多病灶 | |
| 2 | CPC | BR1 | T2N0M0 | 无 | |
| 3 | CPC基底细胞样的 | BR3 | T2N0M0 | 小的，多病灶 | |
| 4 | CPC | BR3 | T2N0M0 | MR(40％) | 小的，多病灶 |
| 5 | 纤维状 基质 | CR(100％) | 无 | ||
| 6 | CPC | BR3 | T3N0M0 | MR(35％) | 无 |
| 7 | CPC | BR2 | T1N0M0 | PR(66％) | 小的，多病灶 |
| 8 | CPC | BR2 | T2N0M0 | 无 | |
| 9 | CPC | BR2 | T2N0M0 | MR(30％) | 无 |
| 10 | CPC | BR2 | T2N0M0 | 小的，多病灶 | |
| 11 | CPC | BR2 | T2N0M0 | 小的，多病灶 | |
| 12 | CPC | BR3 | T2N2M0 | MR(35％) | 小的，多病灶 |
| 13 | CPC | BR3 | T2N1M0 | 无 | |
| 14 | 发育异常 | CR(100％) | 无 | ||
| 15 | CPC | BR3 | T2N0M0 | 无 | |
| 16 | CPC | BR2 | T2N0M0 | 小的，多病灶 | |
| 17 | CPC | BR1 | T2N0M0 | 小的，坏死 | |
| 18 | CPC | BR1 | T2N0M0 | PR(61％) | 无 |
| 19 | CPC | BR1 | T2N0M0 | 小的，多病灶 |
-如通过病理学测定(Therasse等人″New Guidelines to Evaluate theResponse to Treatment in Solid Tumors″，JNat Can Inst 92(2000)。
19名LI治疗的患者中的两名在切除的肿瘤中没有癌组织。认为这两名患者对LI是完全临床应答者，每名显示出如表4中所示的100％肿瘤减少。两个其他病例具有大于50％的组织学证实的肿瘤体积减少并且被认为具有部分(主要)应答。四名额外的患者具有大于30％但是小于50％的体积减小并且被认为具有次要应答。该试验中LI治疗组中的客观应答率为21％，在19名患者中的8名中测量的总体应答为42％，如表4和5中所示的病理学测定。
表5
癌症(对治疗的应答)类别的病理分级*
| 分级 | 肿瘤体积/面积减少 | 应答类别 |
| I | ＜30％ | 无应答 |
| H | ＜30-49％ | 次要应答 |
| III | ＞50-99％ | 主要应答(部分应答) |
| IV | 100％ | 完全应答 |
*如通过病理学测定的(Therasse等人″New Guidelines to EvaluatetheResponse to Treatment in Solid Tumors″，JNat Can Inst 92(2000)。
肿瘤浸润性淋巴细胞
OSCC中的淋巴样细胞浸润液由T细胞占优势，特别是肿瘤基质中。在对照(非LI治疗的)组中，浸润肿瘤和基质的CD8+T细胞数超过CD4+T细胞数(2∶1)，如图1所示。结果，在研究的所有肿瘤区域中，对照(非LI治疗的)组中CD4/CD8比率都大大低于1(约0.5)，如图2所示。另一方面，LI治疗导致基质和肿瘤上皮巢中CD4+T细胞的密度和数目的显著(p＜0.05)增加和CD8+T细胞密度的显著(p＜0.05)减小(图2)。当将相同分析仅用于治疗应答组时，该趋势得以保持(图1和3)。结果，LI治疗导致OSCC肿瘤的细胞浸润液组成中从低(＜1)CD4/CD8比率到高(＞2.5-3.5)CD4/CD8比率的显著偏移(图2和3)。
不论肿瘤区域或者所研究的患者群体如何，在基质或者肿瘤上皮巢中没有发现CD34+单核细胞和CD56+NK细胞。在LI治疗的和对照OSCC患者中报导了类似的发现。
抗原呈递树突细胞(CD1a+)几乎唯一地定位于肿瘤上皮巢中并且在LI治疗组的肿瘤-基质界面中最丰富。观察了LI治疗对所研究的3个区域(表面(R1)；肿瘤中心(R2)；和肿瘤基质界面(R3)中树突(CD1a+)细胞的分布的差别影响。具体地，在肿瘤中心没有观察到改变；在肿瘤表面检测到CD1a+树突细胞减少和在肿瘤-基质界面处存在的CD1a+树突细胞增加，如图4所示。在临床应答者小组分析中，从肿瘤表面向CD1a+树突细胞的肿瘤-基质界面的偏移最显著，如图4所示。两名完全应答者没有可观察到的肿瘤组织，故没有进行免疫组织化学分析。
炎症细胞
通过分别对髓过氧化物酶(MPX)和CD68标记染色，确定切除的肿瘤样品中嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润液的存在。在肿瘤的三个区(表面(R1)；中心(R2)；和肿瘤基质界面(R3)中进行形态测定。
巨噬细胞密度的分析表明LI治疗不改变CD68+巨噬细胞的基质存在，但是在上皮内显著减少(p＜0.002)，如图5所示。
LI治疗显著(p＜0.005)增加了嗜中性粒细胞的上皮内密度，而与所分析的区域(R1、R2或者R3)无关，如图6所示。
肿瘤坏死
坏死的组织学外观显示了LI治疗组和对照组之间的显著差异，如图7所示。LI治疗组中多病灶微观坏死(10/17名治疗的患者)比对照组中(4/20名对照患者)显著更频繁。
表6
OSCC肿瘤样品中坏死的发生率
| 坏死形式 | 对照 | 白细胞白介素注射液 |
| 无 | 12/20 | 7/17 |
| 多病灶/微观 | 4/20 | 10/17 |
| 宏观 | 4/20 | 0/17 |
肿瘤基质/癌巢比率
癌细胞巢相对于肿瘤基质的百分数表明LI治疗对癌巢的选择性作用。用Mallory三色技术染色的所切除的组织样品的癌巢标记为粉红色，并通过形态测定法，使用ImagePro软件测定肿瘤组织中上皮巢的比例，如图8所示。LI治疗导致与对照(非LI治疗的)相比，肿瘤组织中癌细胞巢的比例显著降低(p＜0.005，ANOVA单因子分析)。
在对照和LI治疗的患者中上皮周围胶原性疾病是相似的，而LI治疗组中间质上皮内纤维质生成(10/19，或53％治疗患者)比对照组(2/20，或者10％的对照患者)显著(p＜0.01)更频繁，如表7所示。
表7
OSCC肿瘤样品中纤维质生成的发生率
| 纤维质生成 | 对照 | 白细胞白介素注射液 |
| 无 | 8/20 | 3/19 |
| 上皮周围 | 10/20 | 6/19 |
| 基质 | 2/20 | 10/19 |
在常规疗法之前作为第一线治疗给药于晚期原发性OSCC患者的白细胞白介素(LI)注射液诱导了浸润性免疫细胞而不是炎症细胞中的肿瘤内改变。T细胞群体迁移到癌巢。当将LI以约20IU到1600IU的范围或者特别地以400IU或者800IU沿肿瘤外周给药，一周三次，为期两周，或者以约20IU到1600IU或者以400IU或者800IU每周给药5次时，浸润性CD8+T细胞增加了CD25+表达。因为在2周治疗方案结束时，该治疗方案不导致肿瘤组织的大块坏死，所以结缔组织与肿瘤上皮组分的比率没有显著改变。
这与本文描述的方法形成对比，其中在手术然后放射疗法之前，用LI进行三周预先治疗后，与对照组相比，该方法导致LI治疗的OSCC患者的肿瘤块显著减小。该方法预期相当于800IU/天IL-2的LI预治疗剂量，每周5天，总共三周，从而诱导浸润性免疫细胞的显著调节。CD8+T细胞数目(p＜0.05)减小，肿瘤浸润性CD4+T细胞中相应地显著(p＜0.05)增加。这些改变导致肿瘤中CD4/CD8比率的根本改变。
由于LI治疗，在OSCC患者的对照非治疗组中看到的低CD4/CD8比率(＜1)在基质和上皮内显著增加(CD4/CD8比＞2到＞3.5)。从而，晚期原发性OSCC患者的高剂量(定义为：800IU/天IL-2，5天/周，为期3周)非佐剂LI治疗是显著的CD4+T细胞浸润液的典范转移。抗原呈递细胞(树突细胞)和炎症细胞，特别是嗜中性粒细胞的密度和定位的清除且特定的改变由图9的LI的宿主免疫活化的示意图显示。
还发生了抗肿瘤免疫应答如癌巢的多病灶坏死的肿瘤浸润性细胞组分的复杂改变和LI治疗的OSCC患者中检测的结缔组织比例的增加。这些改变反映了通过给药新佐剂LI诱导的针对OSCC的成功的抗肿瘤免疫应答。
对OSCC的成功的免疫应答需要逆转低的(＜1)肿瘤内CD4/CD8比率。首次用于实验的未处理的OSCC患者中CD8+T细胞相对于肿瘤和周围基质内CD4+T细胞的优势可以在许多其他实体瘤中看到并且不是OSCC特异的。类似地，已经在癌、宫颈癌和乳腺癌中检测到低的CD4/CD8比率，提示这些肿瘤诱导的患者(宿主)的获得性免疫抑制状态。
LI治疗诱导的OSCC中宿主免疫细胞的细胞浸润液的病理组织学改变导致LI预先治疗组中42％的总体应答率。客观应答率为21％，2个病理证实了19名可评估的LI治疗的患者中的完全应答。
LI治疗组与LI治疗的应答者小组中描述的那些(其中在19例的18例中观察到临床和病理消退)的组织病理学比较揭示从免疫细胞组成到炎症细胞密度的所有研究的参数和残留肿瘤的病理学在LI治疗患者的这两个小组中都高度相似。这些数据表明LI治疗组相对均匀地应答LI治疗，但是所得抗癌病理效果是不同的。该差异的似乎合理的解释可以是OSCC患者的差别免疫敏感性(Ir-基因和HLA的不同)和/或免疫活性水平(在研究进入时)，其导致在不同的LI治疗的患者中功能免疫应答损伤的不同。在目标癌细胞上MHC-I抗原、共同刺激分子的表达和他们的FAS-配体表达的缺乏或者TCR-ζ链异常和CD8+T细胞的细胞凋亡敏感性和CD34+细胞的存在都可以促进OSCC中受损的免疫应答(Cruz等人，″Lack of MHC class I surface expression onneoplastic cells and poor activation of the secretory pathway of cytotoxiccells in oral squamous cell carcinomas″，Br J Cancer 81：881(1999)；Lang等人，″Impairment of T-cell activation in head and neck cancer insitu and in vitro″，Arch Otolaryngol Head Neck Surg 125：82(1999)；Lutz等人，″Human leukocyte antigen class I expression on squamouscell regulates natural killer cell activity″，Cancer Res 59：5793(1999)；Hoffinann等人，″Spontaneous apoptosis of circulating T lymphocytes inpatients with head and neck cancer and its clinical importance″，ClinCancer Res 8：2553(2002)；Reichert等人，″The number ofintratumoral dendritic cells andξ-chain expression in T cells andprognostic and survival biomarkers in patients with oral carcinoma″，Cancer 91：2136(2001)；Kuss等人，″Effector CD8+CD45RO-CD27-Tcells have signaling detects patients with squamous cell carcinoma of thehead and neck″，Br J Cancer 88：223(2003)；Schmidt等人，″Mechanisms of immune suppression in patients with head and neckcancer：presence of CD34+cells which suppress immune functionswithin cancers that secrete granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor″，Clin Cancer Res 1：95(1999)；Rivoltini等人，″In vivointerleukin 2-induced activation of lymphokine-activated killer cells andtumor cytotoxic T-cells in cervical lymph nodes of patients with headand neck tumors″，Cancer Res 50：5551(1990)；Young等人，″Mechanisms of immune suppression in patients with head and neckcancer：influence on the immune infiltrate of the cancer″，Int J Cancer67：333(1996)。因此，惟一地靶定免疫系统而不同时试图调节癌细胞靶标的敏感性不可能导致对治疗的总体应答率的提高。
根据本文描述的剂量，对晚期原发性OSCC患者进行LI新佐剂的预治疗导致浸润肿瘤的免疫细胞类型的典范转移(主要是CD4+T细胞而不是CD8+T细胞)。该典范转移导致肿瘤细胞坏死和与主要具有CD8+T细胞浸润并且很少有浸润性CD4+T细胞的对照组中微小的抗肿瘤应答相比，肿瘤块显著减小。与对照(未治疗的)OSCC患者相比，肿瘤免疫细胞浸润液组成典范转移(肿瘤内CD4/CD8比率的逆转)以及以前报导的临床发现，即LI治疗的患者显示出对残余肿瘤细胞的放射疗法的敏感性增加，和如通过延长复发的时间所测量的治疗的生物学效应和LI治疗的OSCC患者的复发率的减小一起得到了治疗OSCC和可能地其他实体瘤的新方法。
从而描述了本发明，显然可以在许多方面对本发明进行变通。此类变通方案不应认为是背离了本发明的精神范围并且所有此类修改都意在包括在下面的权利要求的范围内。
Claims (30)
1.改变肿瘤中CD4/CD8比率的方法，其包括
向肿瘤给予治疗活性量的无血清且无促分裂原的细胞因子混合物的步骤。
2.权利要求1的方法，其中以800IU/mL的量在三周期间内给药所述无血清且无促分裂原的细胞因子混合物，每周5次，其中IU代表在世界卫生组织第一次国际标准中针对人IL-2，86/50给出的白介素-2的国际单位。
3.权利要求2的方法，其中将所述800IU/mL无血清且无促分裂原的细胞因子混合物中的400IU/mL沿肿瘤周边注射到肿瘤块周围的四个不同部位，使得向所述四个部位中的每一个注射100IU/mL并且将400IU/mL沿淋巴管外周注射到肿瘤块的同侧。
4.权利要求3的方法，其中所述400IU/mL沿淋巴管外周的注射是在肿瘤块同侧的颈静脉淋巴管链的区域中的后下颌区处。
5.权利要求1的方法，其中所述无血清且无促分裂原的细胞因子混合物由选自由IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF构成的组的细胞因子与白介素-2(IL-2)以如下的特定比率构成：
IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；
TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；
IFN-γ与IL-2的比率为1.5-10.9；和
GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。
6.权利要求5的方法，其中所述细胞因子的特定比率如下：
IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；
TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；
IFN-γ与IL-2的比率为4.9-7.1；和
GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。
7.改变进入肿瘤的单核细胞浸润液的方法，其包括
向癌给予治疗活性量的无血清且无促分裂原的细胞因子混合物的步骤。
8.权利要求7的方法，其中以800IU/mL的量在三周期间内给药所述无血清且无促分裂原的细胞因子混合物，每周5次，其中IU代表在世界卫生组织第一次国际标准中针对人IL-2，86/50给出的白介素-2的国际单位。
9.权利要求8的方法，其中将所述800IU/mL无血清且无促分裂原的细胞因子混合物中的400IU/mL沿肿瘤外周注射到肿瘤块周围的四个不同部位，使得向所述四个部位中的每一个注射100IU/mL并且将400IU/mL沿淋巴管外周注射到肿瘤块的同侧。
10.权利要求9的方法，其中所述400IU/mL沿淋巴管外周的注射是在肿瘤块同侧的颈静脉淋巴管链的区域中的后下颌区处。
11.权利要求7的方法，其中所述无血清且无促分裂原的细胞因子混合物由选自由IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF构成的组的细胞因子与白介素-2(IL-2)以如下的特定比率构成：
IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；
TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；
IFN-γ与IL-2的比率为1.5-10.9；和
GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞因子的特定比率如下：
IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；
TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；
IFN-γ与IL-2的比率为4.9-7.1；和
GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。
13.无血清且无促分裂原的细胞因子混合物，其包含选自由IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF构成的组的细胞因子与白介素-2(IL-2)，所述细胞因子与白介素-2(IL-2)的特定比率如下：
IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；
TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；
IFN-γ与IL-2的比率为1.5-10.9；和
GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8。
14.权利要求13的无血清且无促分裂原的细胞因子混合物，其中所述细胞因子的特定比率如下：
IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；
TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；
IFN-γ与IL-2的比率为4.9-7.1；和
GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。
15.用于治疗癌症的药物组合物，其包含选自由IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF构成的组的细胞因子与白介素-2(IL-2)，所述细胞因子与白介素-2(IL-2)的特定比率如下：
IL-1β与IL-2的比率为0.4-1.5；
TNF-α与IL-2的比率为3.2-10.9；
IFN-γ与IL-2的比率为1.5-10.9；和
GM-CSF与IL-2的比率为2.2-4.8，
并且任选地与药学上可接受的赋形剂、载体或添加剂组合。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述细胞因子的特定比率如下：
IL-1β与IL-2的比率为0.6-0.8；
TNF-α与IL-2的比率为7.7-11.3；
IFN-γ与IL-2的比率为4.9-7.1；和
GM-CSF与IL-2的比率为3.5-4.5。
17.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为0.38-0.68，优选0.53+/-0.15的IL-3。
18.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为37.2-53.8，优选46+/-5.9的IL-6。
19.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为261-561.5，优选411+/-10.6的IL-8。
20.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为0.56-0.94，优选0.75+/-0.19的IL-1α。
21.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为2.87-3.22，优选3.0+/-0.18的IL-10。
22.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为1.16-2.84，优选1.84+/-0.68的IL-16。
23.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为2.16-3.78，优选2.97+/-0.81的G-CSF。
24.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为1.17-2.43，优选1.8+/-0.63的TNF-β。
25.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为15.7-37.16，优选22.7+/-7.0的MIP-1α。
26.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为17.1-28.5，优选22.8+/-5.7的MIP-1β。
27.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为2.3-2.7，优选2.5+/-0.13的RANTES。
28.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为0.267-0.283，优选0.275+/-0.008的EGF。
29.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为3.63-5.42，优选4.5+/-0.87的PGE2。
30.权利要求16的药物组合物，其还包含与IL-2的比率为23.47-25.13，优选24.3+/-0.83的TxB2。
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