RU2399382C2 - Улучшенный способ увеличения числа опухоле-реактивных т-лимфоцитов в иммунотерапии онкологических больных - Google Patents
Улучшенный способ увеличения числа опухоле-реактивных т-лимфоцитов в иммунотерапии онкологических больных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2399382C2 RU2399382C2 RU2008129788/13A RU2008129788A RU2399382C2 RU 2399382 C2 RU2399382 C2 RU 2399382C2 RU 2008129788/13 A RU2008129788/13 A RU 2008129788/13A RU 2008129788 A RU2008129788 A RU 2008129788A RU 2399382 C2 RU2399382 C2 RU 2399382C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lymphocytes
- tumor
- phase
- cells
- reactive
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 301
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 262
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 136
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title description 5
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 title description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 137
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 84
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 76
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 53
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 73
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 claims description 41
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 40
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 34
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 33
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 33
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 28
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 28
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 26
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 19
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 19
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 18
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 17
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 17
- 108040003610 interleukin-12 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 15
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 claims description 15
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 15
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 14
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 14
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 13
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 12
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 12
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 6
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 26
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 abstract description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 4
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 58
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 35
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 32
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 27
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 17
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 14
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 14
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 8
- 210000005005 sentinel lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 7
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 7
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 5
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 102100032700 Keratin, type I cytoskeletal 20 Human genes 0.000 description 3
- 108010066370 Keratin-20 Proteins 0.000 description 3
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 208000034179 Neoplasms, Glandular and Epithelial Diseases 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 2
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000007453 hemicolectomy Methods 0.000 description 2
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 201000008806 mesenchymal cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002151 serous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000006478 Cecal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 206010061819 Disease recurrence Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010016807 Fluid retention Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000617830 Homo sapiens Sterol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940124753 IL-2 agonist Drugs 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004527 Interleukin-21 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017411 Interleukin-21 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- SJEYSFABYSGQBG-UHFFFAOYSA-M Patent blue Chemical compound [Na+].C1=CC(N(CC)CC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 SJEYSFABYSGQBG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010034650 Peritoneal adhesions Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000697584 Streptomyces lavendulae Streptothricin acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001815 ascending colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001731 descending colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006057 immunotolerant effect Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 229940087463 proleukin Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/50—Colon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0651—Lymph nodes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой улучшенный способ увеличения числа и активации опухоле-реактивных лимфоцитов, в частности CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, который может быть применен в лечении и/или профилактике рака. Способ включает первую фазу стимуляции опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов опухолевым антигеном вместе, по меньшей мере, с одним веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, для увеличения жизнеспособности опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов; и вторую фазу активации и усиления роста опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, где вторую фазу инициируют при подавлении на CD4+ Т-хелперах и/или CD8+Т-лимфоцитах маркера клеточной поверхности CD25 (или маркера IL-2R). С помощью данного способа за короткий промежуток времени получают большое количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, и создается возможность направленного развития опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов в сторону специфических субпопуляций. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 табл., 28 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к улучшенному способу увеличения числа и активации опухоле-реактивных лимфоцитов, в частности CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты отличаются от CD4+ CD25+Hi лимфоцитов, т.е. настоящее изобретение не охватывает регуляторные Т-лимфоциты. Лимфоциты могут быть использованы для лечения и/или профилактики рака.
Уровень техники
Согласно гипотезе иммунологического надзора иммунная система постоянно сенсибилизируется к воздействию прогрессирующих опухолей, причем экспериментальные данные в значительной степени подтверждают данное мнение. Идентификация специфических опухолевых антигенов открыла новые возможности для иммунотерапии опухолей, и многие иммунотерапевтические подходы в настоящее время переходят на стадию клинических испытаний. Среди них особенно перспективным представляется адоптивный перенос лимфоцитов, специфичных к опухолевым антигенам. Попытки сделать это до сих пор, как правило, основывались либо на использовании мононуклеарных клеток периферической крови, либо инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), выделенных из свежих образцов опухоли. Во время недавно проведенных испытаний, при которых лечение пациентов со злокачественной меланомой осуществляли переносом аутологичных количественно увеличенных TIL, сообщалось о фактических показателях ответной реакции вплоть до 51%. Клетки TIL немногочисленны, часто они являются нереагирующими (анергическими) до появления количественно увеличенных клеток (несколько месяцев) вследствие механизмов иммуносупрессии из-за длительных периодов созревания опухоли. Более того, протоколы были нацелены на размножение CD8+ цитотоксических Т-клеток, и данные клетки вновь были введены пациентам, предварительно получившим химиотерапию, и, кроме того, для обеспечения жизнеспособности CD8+ Т-клеток пациенты получили высокие дозы интерлейкина-2.
Описание изобретения
Авторами настоящего изобретения предварительно было показано, что активация наивных Т-клеток может возникнуть в высоко специализированном микроокружении вторичных лимфоидных органов, таких как сторожевой лимфатический узел. Другими словами, сторожевой узел может считаться первичным сайтом иммунной системы при встрече с опухолевыми антигенами.
Изобретатели предварительно описали общий способ увеличения числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных из сторожевых лимфатических узлов, показав возможность культивирования Т-лимфоцитов, полученных из сторожевых лимфатических узлов, для получения культуры опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть использованы в лечении рака путем введения эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов пациентам, у которых были удалены сторожевые узлы.
Успех лечения рака, включающего введение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, определяется факторами, такими как, например, количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных после стадии размножения, т.е. количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, пригодных для инфузии пациенту, время, требуемое для получения эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, и концентрация и соотношение конкретных субпопуляций опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных способом размножения.
Соответственно, настоящее изобретение относится к улучшенному способу увеличения числа опухоле-реактивных CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, в котором были определены и оптимизированы специфические условия культивирования и в котором в продолжение всей фазы размножения наблюдают специфические маркеры на Т-лимфоцитах и в культуральной среде, для получения большого числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов в кратчайший возможный период времени. Более того, изобретение в то же время относится к способу, направленному на развитие опухоле-реактивных CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов в отношении специфических субпопуляций. Т-лимфоциты отличаются от CD4+ CD25+Hi лимфоцитов, т.е. настоящее изобретение не охватывает регуляторные Т-лимфоциты.
CD4+ CD25+Hi Т-лимфоциты, экспрессирующие фактор транскрипции FoxP3, относятся к регуляторным Т-клеткам (Тreg). Treg обладают свойством регулировать Т-хелперы и Т-цитотоксические клетки путем ингибирования активации и пролиферации и, кроме того, Treg ингибируют продукцию и высвобождение полезных Th1-цитокинов, таких как IFN-гамма. Таким образом, представленный в данном документе способ разработан с целью стимуляции размножения Т-хелперных клеток и цитотоксических Т-клеток и предотвращения размножения клеток Treg.
Опухоле-реактивные Т-лимфоциты, чаще всего получаемые по настоящему способу, представляют собой CD4+ хелперные Т-лимфоциты. Одной из целей представленного способа размножения является в некотором смысле имитация естественного пути собственной иммунной системы пациента, и, в некотором отношении вводя компоненты иммунной системы пациента, определяют, образуются ли, прежде всего, CD4+ хелперы или CD8+ Т-лимфоциты в зависимости от того, представляется ли антиген молекулами MCHI или MCHII. В большинстве случаев антигены должны быть представлены молекулой MCH класса II, что приводит к получению CD4+ хелперных Т-лимфоцитов. Однако в некоторых случаях образуются CD8+ Т-лимфоциты. Если образуются CD4+ хелперные Т-лимфоциты, они должны быть дополнительно количественно увеличены, как описано в данном документе, однако способ также может быть использован для размножения CD8+ клеток. Изобретатели обнаружили, что способ размножения, включающий две различные фазы, можно использовать, в частности, для получения большого числа опухоле-реактивных CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов в относительно короткий промежуток времени, причем две фазы представляют собой
i) первую фазу стимуляции опухоле-реактивных Т-лимфоцитов полученным из опухоли антигеном совместно, по меньшей мере, с одним веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, для увеличения жизнеспособности опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, и
ii) вторую фазу активации и стимуляции роста опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, где вторую фазу ii) инициируют, когда на Т-лимфоцитах подавляется маркер клеточной поверхности CD25 (маркер IL-2R).
Этот способ размножения также можно осуществить, используя в качестве антиген-специфических клеток моноциты, выделенные у пациентов. Моноциты должны быть введены пациенту, когда дифференцируются в дендритные клетки путем использования зрелых цитокинов, таких как IL-4, GM-CSF и IL-3, с последующей активацией дендритных клеток добавлением Toll-подобного рецептора, стимулируя агенты, такие как липополисахарид. Использование в качестве антиген-специфической популяции зрелых активированных дендритных клеток может стимулировать и усиливать размножение Т-хелперных клеток и цитотоксических Т-клеток.
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к нижеследующим объектам.
1. Способ увеличения количества опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, причем способ содержит
i) первую фазу стимуляции опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов полученным из опухоли антигеном наряду, по меньшей мере, с одним веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, для увеличения жизнеспособности опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов; и
ii) вторую фазу активации и усиления роста опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, где вторую фазу ii) инициируют, когда на CD4+ Т-хелперах и/или CD8+ Т-лимфоцитах подавляется маркер клеточной поверхности CD25 (или маркер IL-2R), где подавление определяют как то, что 5% или менее популяции Т-лимфоцитов экспрессирует CD25, и где фазу ii) инициируют добавлением к Т-лимфоцитам полученного из опухоли антигена для активации опухоле-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов.
2. Способ по п.1, в котором Т-лимфоциты находятся в культуральной среде.
3. Способ по п.2, в котором культуральная среда является бессывороточной средой, такой как, например, среда AIMV.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первую фазу i) инициируют добавлением, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2.
5. Способ по п.4, в котором веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, является IL-2.
6. Способ по п.5, в котором IL-2 добавляют в низкой дозе, такой как, например, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 700 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 600 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 500 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 400 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды и от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 200 МЕ/мл культуральной среды.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дополнительное количество, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют регулярно на протяжении фазы i), например каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы i).
8. Способ по п.7, в котором веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, является IL-2.
9. Способ по п.8, в котором концентрация добавляемого IL-2 составляет от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 700 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 600 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 500 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 400 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды и от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 200 МЕ/мл культуральной среды.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген добавляют с дня 2 по день 5 включительно первой фазы i), например в день 2, в день 3, в день 4 или в день 5.
11. Способ по любому из пп.1-9, в котором полученный из опухоли антиген добавляют, по существу, одновременно с инициацией фазы i) или самое большее до 3 дня после этого.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой денатурированный гомогенат опухоли.
13. Способ по п.12, в котором полученный из опухоли антиген является аутологичным.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой белок, полипептид или пептид.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторую фазу ii) инициируют с дня 17 по день 23 включительно первой фазы i), например, в день 17, в день 18, в день 19, в день 20, в день 21, в день 22 или в день 23.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген является аутологичным.
17. Способ по п.16, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой денатурированный гомогенат опухоли.
18. Способ по п.16, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой белок, полипептид или пептид.
19. Способ по любому из пп.16-18, который дополнительно включает добавление к Т-лимфоцитам антиген-представляющих клеток вместе с полученным из опухоли антигеном.
20. Способ по п.19, в котором антиген-представляющими клетками являются облученные лейкоциты периферической крови, содержащие антиген-представляющие В-клетки и/или моноциты.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая фаза ii) включает введение, по меньшей мере, одного вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
22. Способ по п.21, в котором веществом(ами), способным(и) активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, является вещество(а), обладающее(ие) агонистической активностью в отношении рецептора интерферона.
23. Способ по п.22, в котором вещество(а), обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, представляет собой интерферон.
24. Способ по п.23, в котором вещество(а), обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, представляет собой интерферон-α.
25. Способ по любому из пп.21-24, в котором вещество(а), способное активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, такое как, например, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, добавляют, когда уровень IL-12, по меньшей мере, 1-кратно, например, по меньшей мере, 2-кратно, по меньшей мере, 3-кратно, по меньшей мере, 4-кратно или, по меньшей мере, 5-кратно увеличен по сравнению с уровнем IL-12 в день 1 фазы ii).
26. Способ по любому из пп.21-25, в котором вещество, способное активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, такое как, например, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, добавляют с дня 2 по день 4 включительно после инициации второй фазы ii), например в день 2, в день 3 или в день 4.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая фаза ii) включает введение одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2.
28. Способ по п.27, в котором одним или более веществами, способными противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, являются одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета.
29. Способ по п.28, в котором одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, представляют собой антитело против IL-4, антитело против IL-5 и/или антитело против IL-10.
30. Способ по любому из пп.27-29, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют в день 1 второй фазы ii).
31. Способ по любому из пп.27-29, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют на следующей стадии после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
32. Способ по п.31, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют на следующий день после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дополнительное количество одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одного или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют регулярно на протяжении всей фазы ii).
34. Способ по п.33, в котором дополнительное количество одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одного или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы ii).
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дополнительное количество вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют регулярно на протяжении всей фазы ii).
36. Способ по п.35, в котором вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы ii), например каждый 3-й день.
37. Способ по п.35 или 36, в котором веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, является IL-2.
38. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая фаза ii) включает введение одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
39. Способ по п.38, в котором одним или более веществами, стимулирующими развитие Т-лимфоцитов типа Th1, являются вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
40. Способ по п.39, в котором одно или более веществ выбирают из IL-7, IL-12, IL-15 и IL-21.
41. Способ по любому из пп.38-40, в котором одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, добавляют, когда уровень IFN-гамма увеличивается по сравнению с уровнем IFN-гамма, наблюдавшимся при инициации второй фазы ii).
42. Способ по п.41, в котором повышенный уровень IFN-гамма определяют как, по меньшей мере, 1-кратное повышение уровня IFN-гамма, например, по меньшей мере, 2-кратное, по меньшей мере, 3-кратное, по меньшей мере, 4-кратное повышение по сравнению с уровнем IFN-гамма, наблюдавшимся при инициации второй фазы ii).
43. Способ по любому из пп.38-42, в котором одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-12, IL-15 и/или IL-21, добавляют при подавлении CD25 и/или CD69.
44. Способ по любому из пп.38-43, в котором концентрация каждого из добавленных одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, составляет от приблизительно 150 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды, например, 250 МЕ/мл культуральной среды.
45. Способ по любому из пп.38-44, в котором одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-12, IL-15 и/или IL-21, добавляют с дня 5 по день 8 включительно после инициации второй фазы ii), то есть в день 5, день 6, день 7 или день 8.
46. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение CD4+ хелперных Т-лимфоцитов.
47. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение эффекторных Т-лимфоцитов.
48. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение Т-лимфоцитов памяти.
49. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение Т-лимфоцитов типа Th1.
50. Способ по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно включает мониторинг экспрессии маркеров клеточной поверхности, таких как, например, CD25 и/или CD69 на Т-лимфоцитах непрерывно во время первой фазы i) и второй фазы ii).
51. Способ по п.50, в котором Т-лимфоциты собирают при подавлении CD25 на Т-лимфоцитах во второй фазе ii).
52. Способ по п.51, в котором Т-лимфоциты подвергают, по меньшей мере, одному дополнительному циклу фазы ii) при подавлении CD25 на Т-лимфоцитах.
53. Способ по п.51 или 52, в котором подавление определяют так, что 5% или менее популяции CD4-позитивных Т-лимфоцитов экспрессируют CD25.
54. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты собирают с дня 10 по день 14 включительно после инициации второй фазы ii).
55. Способ по п.54, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты после сбора очищают.
56. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию замораживания опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных во второй фазе ii).
57. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Т-лимфоциты получают из лимфатических узлов, куда оттекает лимфа от первичной опухоли и/или метастаза, или их получают из крови.
58. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит, полученный по способу, определенному в любом из пп.1-57.
59. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по п.58, который представляет собой CD4+ Т-лимфоцит.
60. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по п.58 или 59, который представляет собой эффекторный Т-лимфоцит.
61. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по любому из пп.58-60, который представляет собой Т-лимфоцит памяти.
62. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по любому из пп.58-61, который представляет собой Т-лимфоцит типа Th1.
63. Фармацевтическая композиция, содержащая опухоле-реактивные Т-лимфоциты по любому из пп.58-62.
64. Способ лечения индивида, страдающего заболеванием неопластического происхождения, причем способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, как они определены в любом из пп.58-63.
65. Способ осуществления регрессии опухоли у индивида, имеющего опухоль, причем способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, как они определены в любом из пп.58-63.
66. Способ по п.64 или 65, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты вводят внутривенно, внутриартериально, интратекально или внутрибрюшинно.
67. Способ по любому из пп.64-66, в котором количество вводимых опухоле-реактивных Т-лимфоцитов составляет, по меньшей мере, 10 миллионов, например, по меньшей мере, 20 миллионов, по меньшей мере, 30 миллионов, по меньшей мере, 40 миллионов, по меньшей мере, 50 миллионов, по меньшей мере, 60 миллионов, по меньшей мере, 70 миллионов или, по меньшей мере, 80 миллионов.
68. Способ по любому из пп.64-67, в котором вводимые опухоле-реактивные Т-лимфоциты представляют собой комбинацию эффекторных Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов памяти.
69. Способ по п.68, в котором процентное содержание эффекторных Т-лимфоцитов составляет от приблизительно 10% до приблизительно 65%, например, от приблизительно 20% до приблизительно 50% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%.
70. Способ по любому из пп.64-69, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты являются аутологичными.
71. Способ по любому из пп.64-69, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты не являются аутологичными.
72. Способ по любому из пп.64-71, в котором неопластическое заболевание выбирают из любой солидной неоплазмы эпителиального, мезенхимального или эмбриологического происхождения в любом анатомическом расположении, таком как для эпителиальных неоплазм, например карцином в молочных железах, толстом кишечнике, поджелудочной железе, мочевом пузыре, тонком кишечнике, простате, шейке матки, вульве, яичниках; для мезенхимальных неоплазм, например сарком в суставах, костях, мышцах и сухожилиях, и некоторых гематологических, таких как лимфомы; для эмбриологических неоплазм, например тератомы.
73. Применение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных по любому из пп.1-57, для получения лекарственного средства для лечения заболевания неопластического происхождения.
74. Набор для применения в способе по любому из пп.1-57 или 64-72, причем набор содержит среду для культивирования Т-лимфоцитов.
75. Набор по п.74, дополнительно содержащий одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
76. Набор по п.74 или 75, в котором средой является бессывороточная среда, такая как, например, AIMV, RPMI 1640, DMEM или MEM.
77. Набор по любому из пп.74-76, в котором одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов выбирают из полученного из опухоли антигена, веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, веществ, способных активировать IL-2R на Т-лимфоцитах, веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, и веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
78. Набор по любому из пп.74-77, в котором одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов выбирают из группы, содержащей IL-2, интерферон-альфа, антитело против IL-4, антитело против IL-5, антитело против IL-10, IL-7, IL-12, IL-15 и IL-21.
79. Набор по любому из пп.74-78, содержащий фармацевтическую композицию, подходящую для внутривенного введения.
80. Набор по любому из пп.74-79, дополнительно содержащий шприц, содержащий локатор лимфатического узла.
81. Набор по любому из пп.74-80, дополнительно содержащий инструкции по применению.
82. Набор по п.81, в котором инструкции представлены в форме компьютерной программы.
Определения
Под термином «опухоле-реактивные Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, несущие Т-клеточный рецептор, специфичный к опухолевому антигену и распознающий его.
Под термином «Т-хелперные клетки» понимают Т-лимфоциты, которые при активации стимулируют адаптивные иммунные реакции.
Под термином «клетки Th1» понимают Т-хелперные клетки, которые стимулируют клеточно-опосредованные иммунные реакции при активации, используя цитокины, такие как IFN-гамма.
Под термином «клетки Th2» понимают Т-хелперные клетки, стимулирующие гуморальные иммунные реакции при активации, используя цитокины, такие как IL-4.
Под термином «CD4+ хелперные Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, которые экспрессируют CD4, но не экспрессируют фактор транскрипции FoxP3.
Под термином «CD8+ Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, которые экспрессируют CD8.
Под термином «регуляторные Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, которые подавляют адаптивные иммунные реакции, экспрессируя фактор транскрипции FoxP3.
Под термином «специфическая активация» Т-лимфоцитов понимают антиген-специфическую и ограниченную по МНС активацию, опосредованную Т-клеточным рецептором. Наоборот, термин «неспецифическая активация» Т-лимфоцитов означает общую активацию всех Т-клеток независимо от специфичности Т-клеточного рецептора.
Термин «полученный из опухоли антиген» охватывает опухолевые клетки, гомогенат опухоли, причем гомогенат может быть денатурированным, или белки опухоли, полипептиды или пептиды, например, в форме очищенного, природного, синтетического и/или рекомбинантного белка, полипептида или пептида. Полученный из опухоли антиген может представлять собой интактные молекулы, их фрагменты или мультимеры, или агрегаты интактных молекул и/или фрагментов. Примерами подходящих полипептидов и пептидов являются такие пептиды и полипептиды, которые содержат от приблизительно 5 до приблизительно 30 аминокислот, например, от приблизительно 10 до 25 аминокислот, от приблизительно 10 до 20 аминокислот или от приблизительно 12 до 18 аминокислот. При использовании пептидов может быть использована конечная молярная концентрация в культуре от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0 мкМ, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4,0 мкМ, от приблизительно 0,2 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,3 до приблизительно 2,0 мкМ или от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,0 мкМ. Полученный из опухоли антиген может быть аутологичным или гетерологичным, т.е. происходить от пациента, нуждающегося в лечении, или быть полученным от другого субъекта, страдающего раком. В представленных примерах изобретатели используют денатурированный экстракт аутологичной опухоли, однако, как упомянуто выше, также могут быть приемлемы для использования в способе по изобретению другие источники полученного из опухоли антигена.
Под термином «день 1 первой фазы» или, например, «день 5 второй фазы» нужно понимать следующее: под днем 0 (zero) понимают день, когда лимфоциты собирают. День 1 первой фазы определяют как день, когда размножение инициируют добавлением, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью по отношению к рецептору IL-2, и, возможно, культуральной среды и/или полученного из опухоли антигена. Фаза размножения i) может быть инициирована в день 0 (zero) или не позднее 2 дней после сбора лимфоцитов. День, когда инициируют вторую фазу добавлением полученного из опухоли антигена, во всем тексте описывается как «день 1 второй фазы».
Под термином «сторожевой лимфатический узел» понимают первый(ые) лимфатический(ие) узел(ы), принимающий(ие) отток лимфы от опухоли. Термин «первый от метастаза лимфатический узел» относится к первому(ым) лимфатическому(им) узлу(ам), принимающему(им) отток лимфы от метастаза.
Фаза i)
Целью первой фазы i) является получение культуры, содержащей, по существу, высокий процент опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов. Первую фазу необходимо рассматривать как «фазу кормления», где опухоле-реактивные Т-лимфоциты вынуждены выживать и размножаться. В зависимости от источника Т-лимфоцитов (исходный материал для способа размножения in vitro), их можно фазировать в соответствии с неблагоприятными условиями, такими как, например, супрессия и ингибирование факторами, секретируемыми раковыми клетками.
Исходный материал для использования в способе размножения по изобретению может представлять собой смесь лимфоцитов, полученных из лимфатических узлов, принимающих отток лимфы от первичной опухоли и/или метастаза, таких как, например, сторожевой лимфатический узел или первый от метастаза лимфатический узел. Их можно идентифицировать в процессе хирургической операции, например, введением локатора лимфатического узла, такого как, например, индикаторное вещество, вокруг или внутрь опухоли или метастаза. Локатор лимфатического узла, такой как, например, индикатор, переносится в лимфатические капилляры и аккумулируется в сторожевом/первом от метастаза узле(ах), таким образом, идентифицируя опухоль или метастаз с оттоком лимфы в лимфатический узел(ы). Изобретатели недавно показали, что первые лимфатические узлы, принимающие отток лимфы от опухоли, представляют собой потенциальный богатый источник природных опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов для размножения in vitro, поскольку такие узлы могут содержать значительное количество Т-лимфоцитов, которые обладают повышенной чувствительностью к опухолевым антигенам, и они подверглись размножению in vivo в лимфатических узлах.
Альтернативным источником CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов может быть кровь индивида, страдающего онкологическим заболеванием, такая как, например, периферическая кровь. Индивид может быть пациентом, не получавшим лечения, с длительно протекающим заболеванием, или уже получавшим лечение пациентом, у которого могут быть получены периферические Т-лимфоциты с повышенной чувствительностью к опухоли. Другие подходящие источники CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов включают костный мозг, ткань селезенки и опухоли.
Однако в предпочтительных вариантах осуществления изобретения исходный материал получают из сторожевых или первых от метастаза лимфатических узлов.
Т-лимфоциты для количественного увеличения в культуре могут быть получены от индивида, нуждающегося в лечении, т.е. полученные специфические опухоле-реактивные Т-лимфоциты для введения могут быть аутологичными. Однако Т-лимфоциты также могут быть получены из источника, отличного от индивида, нуждающегося в лечении, такого как, например, другой индивид, страдающий онкологическим заболеванием. В таком случае реципиент и количественно увеличенные опухоле-реактивные Т-лимфоциты предпочтительно являются иммунологически совместимыми (или же реципиента делают иммунотолерантным к количественно увеличенным опухоле-реактивным Т-лимфоцитам).
В зависимости от источника исходного материала, он будет содержать смесь различных лимфоцитов, таких как, например, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, антиген-представляющие клетки, опухоле-реактивные Т-лимфоциты и неактивированные/нереактивные Т-лимфоциты. Для стимуляции жизнеспособности конкретно опухоле-реактивных CD4+ хелперов и CD8+ Т-лимфоцитов добавляют опухолевый антиген и одно или несколько веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2.
Как упомянуто выше, первую фазу i) инициируют добавлением, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2. Функцией таких веществ является стимуляция Т-лимфоцитов посредством рецептора IL-2 к усилению клеточного деления Т-лимфоцитов, тем самым предотвращая клеточную гибель.
Антиген-специфическая ограниченная по МНС активация Т-лимфоцитов стимулирует размножение клона используемой популяции Т-лимфоцитов, специфичной для распознавания клеток опухоли. Наоборот, неспецифическая активация Т-лимфоцитов будет приводить к размножению клонов Т-лимфоцитов, распознающих пептиды, не имеющих какого-либо отношения к распознаванию клеток опухоли, таким образом, большинство неспецифически количественно увеличенных Т-лимфоцитов не будут распознавать опухоль.
Изобретение относится к стимуляции специфической активации и роста опухоле-реактивных CD4+ хелперов и CD8+ Т-лимфоцитов. Специфическая активация в отношении определенного антигена опухоли дает Т-лимфоцитам возможность обладать терапевтическим эффектом при введении онкологическому больному с тем же типом опухоли, против которого активируются Т-лимфоциты.
Введение неспецифически активированных Т-лимфоцитов не имело бы терапевтического эффекта в отношении какого-либо вида рака или имело крайне низкую вероятность этого благодаря небольшому количеству Т-лимфоцитов, имеющих отношение к опухоли.
В одном из вариантов осуществления изобретения вещества, обладающие агонистической активностью к рецептору IL-2, являются агонистами. Примеры таких веществ включают белки, полипептиды, пептиды, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В предпочтительном варианте осуществления вещество представляет собой природный лиганд рецептора IL-2, то есть IL-2.
При использовании IL-2 его предпочтительно добавляют в низкой дозе для снижения апоптоза лимфоцитов и возрастания популяции CD4-позитивных хелперных опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. В определенном варианте осуществления изобретения низкая доза IL-2 составляет от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 700 МЕ/мл культуральной среды, например, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 600 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 500 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 400 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды и от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 200 МЕ/мл культуральной среды. В конкретном варианте осуществления количество добавляемого IL-2 составляет 240 МЕ/мл.
В случае веществ, отличных от IL-2, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, используют их специфические дозы, которые должны быть такими, чтобы приводить к эффекту, соответствующему эффекту, полученному при введении вышеупомянутых доз IL-2.
С целью поддержания оптимальных условий для стимуляции клеточного деления можно регулярно добавлять на протяжении фазы i), например, каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы i) дополнительное количество, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2. Под термином «каждый 2-й, 3-й или 4-й» понимают тот факт, что, по меньшей мере, одно вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют на протяжении фазы i) каждый 2-й, 3-й или 4-й день, начиная со 2-го, 3-го или 4-го дня после первого добавления, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, т.е. после инициации фазы i).
В одном из вариантов осуществления веществом, регулярно добавляемым на протяжении фазы i), является агонист IL-2. В предпочтительном варианте осуществления вещество представляет собой IL-2.
Дополнительная доза веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, таких как, например, IL-2, регулярно добавляемых, например, каждый 2-й, 3-й или 4-й день, находится в вышеуказанных диапазонах.
Дополнительной важной стадией первой фазы i) размножения является добавление полученного из опухоли антигена с целью стимуляции клеточного размножения Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы Т-лимфоцитов, распознающие опухолевые антигены, т.е. опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
Оптимальное время добавления опухолевого антигена зависит от источника лимфоцитов. Если лимфоциты происходят из лимфатических узлов, таких как, например, сторожевые лимфатические узлы, или из опухолей, лимфоциты могут подвергнуться влиянию непосредственной близости и иммуносупрессии клетками опухоли, и потребуется инкубация с использованием вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, такого как, например, IL-2, в течение нескольких дней для усиления способности Т-лимфоцитов отвечать пролиферацией на представление антигена опухоли. Соответственно, в таком случае полученный из опухоли антиген добавляют предпочтительно со 2 дня до 5 дня включительно первой фазы i), например на 2 день, на 3 день, на 4 день или на 5 день.
Если лимфоциты происходят из крови, полученный из опухоли антиген может быть добавлен уже при инициации первой фазы i), т.е. вместе с веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, поскольку Т-лимфоциты не подвергались вышеупомянутой иммуносупрессии клетками опухоли. Соответственно, при использовании крови полученный из опухоли антиген добавляют фактически одновременно с инициацией фазы i) или не позднее 2 дней после этого.
Полученный из опухоли антиген, такой как, например, гомогенат опухоли, по-видимому, захватывается эндоцитозом и процессируется антиген-представляющими клетками, присутствующими в исходном материале, такими как, например, В-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги. В большинстве случаев полученный из опухоли антиген должен быть представлен молекулами MCH класса II, что приводит к размножению клеток CD4+ хелперных опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Однако посредством перекрестного представления антигены, захваченные эндоцитозом, могут быть процессированы и представлены в «карман» класса I, приводя к активации CD8+ Т-лимфоцитов. Как указано выше, одной из целей способа размножения является в некотором смысле повторение природного пути собственной иммунной системы пациентов, и, в определенном отношении вводя компоненты иммунной системы пациентов, определяют, образуются ли CD4+ или CD8+ лимфоциты, в зависимости от того, представляется ли антиген MCHI или MCHII. В большинстве случаев антигены будут представляться молекулой MCH класса II, приводя к образованию CD4+ Т-лимфоцитов, однако в некоторых случаях образуются CD8+ Т-лимфоциты.
Фаза ii)
Целью второй фазы ii) является активация и увеличение числа опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов, полученных в фазе i), и получение специфической субпопуляции опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов путем направления их на желаемый путь.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одним из способов определения оптимального времени для инициации фазы ii) является мониторинг экспрессии на Т-лимфоцитах маркера клеточной поверхности CD25 с целью определения, когда конкретно Т-лимфоциты будут восприимчивы к рестимуляции. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вторая фаза ii) предпочтительно должна быть инициирована, когда экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах будет подавлена. CD25 является маркером активации, указывающим, что лимфоциты получили активирующий сигнал. Если бы вторую фазу инициировали при высокой экспрессии CD25 на Т-лимфоцитах, это означало бы, что лимфоциты уже получили сигнал, наблюдалась бы смерть клетки.
Подавление CD25 определяют как тот факт, что существенная часть популяции Т-лимфоцитов экспрессирует очень мало или, по существу, не экспрессирует маркеры CD25. В предпочтительном варианте осуществления подавление CD25 определяют так, что менее 5% популяции Т-лимфоцитов экспрессируют CD25, т.е. 95% или более Т-лимфоцитов в культуре вообще не экспрессируют CD25. 5% или менее Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD25, являются наиболее подходящими регуляторными CD4+ Т-лимфоцитами, которые имеют высокую постоянную экспрессию CD25. Кроме того, популяция Т-лимфоцитов предпочтительно должна экспрессировать очень мало или, по существу, не экспрессировать маркеры Foxp3, которые являются специфическими маркерами регуляторных Т-лимфоцитов. В предпочтительном варианте осуществления подавление Foxp3 определяют как тот факт, что менее 5% популяции Т-лимфоцитов экспрессируют Foxp3, т.е. 95% или более Т-лимфоцитов в культуре вообще не экспрессируют Foxp3.
Помимо CD25 существуют также и другие маркеры, экспрессия которых значима при наблюдении с целью определения оптимального времени для инициации второй фазы. Примерами таких маркеров являются маркер ранней активации CD69 и MCHII, который является маркером активации Т-лимфоцитов. Поскольку экспрессия CD69 и MCHII указывает, что «программа активации» Т-лимфоцитов уже включилась, это означает, что клетки не способны отвечать на дополнительные стимулы, оба этих маркера предпочтительно должны быть подавлены перед инициацией второй фазы. Термин подавление может быть определен как тот факт, что менее 5-10% популяции Т-лимфоцитов экспрессируют CD69 и/или MCHII.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для отделения Т-хелперных клеток от возможных клеток опухоли в культуре при размножении в фазе ii) способа размножения используют антитела против CD4.
В дополнительном или еще одном варианте осуществления настоящего изобретения для стимуляции размножения в фазе ii) способа размножения используют продукты, такие как Dynabeads® c антителами против CD3 и CD28. При использовании Dynabeads® CD3/CD28 будут получаться лимфоциты с сигналами активации, что также могло бы использоваться для отделения от возможных клеток опухоли в культуре. Во время фазы i) Dynabeads® CD3/CD28 будут связываться с Т-лимфоцитами, количественно увеличенными антиген-специфическим образом, причем эти клетки теперь могут быть обогащены посредством магнита. После того как исходная антиген-специфическая активация инициировала и привела к клональной экспансии Т-лимфоцитов, рестимуляция с помощью Dynabeads® CD3/CD28 будет дополнительно стимулировать клональную экспансию, поскольку фаза i) не способствует активации неспецифических клонов Т-лимфоцитов.
Несмотря на то что точная точка начала фазы ii) будет меняться в зависимости от того, когда лимфоциты приобрели предпочтительную экспрессию специфических маркеров, вторую фазу ii) чаще всего инициируют со дня 17 по день 23 включительно первой фазы i), например на день 17, на день 18, на день 19, на день 20, на день 21, на день 22 или на день 23. Другими словами, чаще всего полагают, что время, когда лимфоциты экспрессируют предпочтительное количество и сочетание маркеров, находится между днем 17 и днем 23 первой фазы i).
Увеличение числа Т-лимфоцитов, т.е. фаза i) и ii), чаще всего должно проходить в подходящей культуральной среде. Чтобы избежать риска распространения заболеваний у пациента, предпочтительно используют бессывороточную среду или аутологичную сыворотку. Примеры подходящих стандартных сред включают среду AIMV, RPMI 1640, DMEM и MEM. Однако также могут быть использованы другие среды, содержащие подходящую смесь аминокислот, стероидов, витаминов, факторов роста, цитокинов и минералов.
Во время двух фаз размножения клетки могут быть распределены по нескольким пробиркам для культивирования, чтобы поддержать подходящую плотность клеток в культурах. Плотность Т-лимфоцитов в фазах размножения предпочтительно должна быть от приблизительно 3 до приблизительно 6 миллионов клеток/мл культуральной среды.
В процессе размножения также может понадобиться замена культуральной среды свежей средой, стадия, которая называется установлением требуемого состояния среды. Время распределения культур и установления требуемого состояния среды может быть определено на основании морфологии клеток и плотности клеточной культуры (которая не должна превышать приблизительно 6 миллионов клеток/мл), или среда может содержать подходящий индикатор, такой как, например, феноловый индикатор. В случае, когда индикатор включен в среду, выбор времени распределения культур или установления требуемого состояния среды может быть основан на цвете среды. При использовании фенолового красного индикатора клетки должны быть распределены или приведены к требуемому состоянию, когда среда станет желтой, указывая на то, что рН культуры оказывается кислым. Подходящая схема приведения среды, используемой в настоящем изобретении, к требуемому состоянию может представлять собой замену от 1/4 до 1/2, например 1/3 среды, каждые 3-9 дней, например раз в неделю.
Кроме конкретных условий, упомянутых в данном документе, для других параметров должны быть использованы стандартные условия роста культур лимфоцитов, такие как температура 37°С и 5% СО2.
Как упомянуто выше, вторую фазу ii) инициируют добавлением полученного из опухоли антигена, определенного выше, к Т-лимфоцитам для активации опухоле-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов с целью стимулировать клональную экспансию опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
В конкретном варианте осуществления изобретения вместе с полученным из опухоли антигеном к Т-лимфоцитам добавляют антиген-представляющие клетки (АРС). Антиген-представляющие клетки (АРС) включают лейкоциты, такие как, например, моноциты, макрофаги и лимфоциты, такие как, например, В-клетки. Эти несхожие типы клеток обладают общей способностью представлять антиген в форме, которая распознается специфическими рецепторами Т-лимфоцитов. Препарат лейкоцитов выделяют, например, из крови, лимфы, костного мозга, ткани лимфатического органа или жидкости тканевой культуры, полученных от пациента, нуждающегося в лечении. В предпочтительном варианте осуществления клетки АРС представляют собой облученные лейкоциты периферической крови, содержащие антиген-представляющие В-клетки и/или моноциты. Количество добавляемых АРС находится в диапазоне от приблизительно 0,5 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 5 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов, например, от приблизительно 1 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 4 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов, от приблизительно 1 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 3 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов или от приблизительно 1 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 2 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов.
Помимо добавления полученного из опухоли антигена к Т-лимфоцитам с целью стимуляции клональной экспансии опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, вторая фаза ii) включает добавление специфических компонентов, функцией которых является направлять увеличение числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов в сторону желаемой субпопуляции.
Как упомянуто выше, настоящее изобретение относится к способу получения опухоле-реактивных CD4+ хелперных Т-лимфоцитов. CD4+ хелперные Т-лимфоциты распознают и связывают опухолевый антиген, если антиген связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости класса II. Активированные CD4+ хелперные Т-лимфоциты секретируют цитокины, белки и/или пептиды, которые стимулируют другие клетки иммунной системы, такие как другие лимфоциты. Самым обычным секретируемым цитокином является интерлейкин-2 (IL-2), который представляет собой потенциальный фактор роста Т-лимфоцитов. Активированные, пролиферирующие CD4+ хелперные Т-лимфоциты могут дифференцировать в два главных подтипа клеток, клетки Th1 и Th2, которые определяют на основе продуцируемых специфических цитокинов. Клетки Th1 продуцируют интерферон-гамма и интерлейкин 12 (IL-12), тогда как клетки Th2 продуцируют интерлейкин-4, интерлейкин-5 и интерлейкин-13. Полагают, что Т-лимфоциты Th1 усиливают активацию цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс), NK-клеток, макрофагов и моноцитов, все они могут поражать раковые клетки и вообще защищать против опухолей.
Т-хелперные (CD4+) лимфоциты типа Th1 и Th2 могут дифференцироваться в клетки памяти и эффекторные клетки. Т-хелперные (CD4+) лимфоциты памяти специфичны к антигену, они первыми встречаются и могут быть привлечены в процессе вторичного иммунного ответа, вызывая более быстрый и больший ответ на опухолевые антигены. Установлено на людях, что лимфоциты сохраняют жизнеспособность, по меньшей мере, 20 лет, возможно, в течение жизни. Эффекторные CD4+ Т-лимфоциты представляют собой активированные клетки, продуцирующие цитокины и INF-гамма. Для эффективного лечения рака особенно эффективным является введение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа Th1, поскольку полагают, что этот тип усиливает активацию цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс), NK-клеток, макрофагов и моноцитов, все они могут поражать раковые клетки и вообще защищать против опухолей, т.е. в конкретном варианте осуществления изобретения, относящегося к способу получения опухоле-реактивных CD4+ хелперных Т-лимфоцитов, и в дополнительном варианте осуществления процентное содержание Т-лимфоцитов типа Th2, полученных представленным способом, составляет 30% или менее, например 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, или 0%, т.е., по меньшей мере, 70% опухоле-реактивных CD4+ Т-лимфоцитов представляют собой тип Th1, например, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% или 100%.
Соответственно, вторая фаза может включать введение вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах. Активирование IL-12R будет увеличивать готовность Т-клеток воспринять и оптимизировать активацию цитокином IL-12, что приводит к максимальной передаче сигнала STAT-4 и, таким образом, подталкивает лимфоциты к дифференцировке в клетки Th1 и продукции IFN-γ.
Веществом(ами), способным(и) активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, может быть вещество(а), обладающее(ие) агонистической активностью в отношении рецептора интерферона. В одном из вариантов осуществления изобретения вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, являются агонистами. Примеры таких веществ включают белки, полипептиды, пептиды, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В конкретном варианте осуществления это вещество представляет собой природный лиганд рецептора интерферона, а именно интерферон, такой как интерферон-α.
Оптимальное время добавления вещества(в), способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, такого как, например, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, может быть определено измерением уровня IL-12 в культуральной среде. Вещество(а) предпочтительно нужно добавлять, когда уровень IL-12 увеличивается, по меньшей мере, 1-кратно, например, по меньшей мере, 2-кратно, по меньшей мере, 3-кратно, по меньшей мере, 4-кратно или, по меньшей мере, 5-кратно по сравнению с уровнем IL-12 на день 1 фазы ii). В большинстве случаев такое увеличение уровня IL-12 будет заметно со дня 2 до дня 4 включительно после инициации второй фазы ii), например на день 2, на день 3 или на день 4.
Для того чтобы в значительной степени избежать образования опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа Th2, вторая фаза может дополнительно включать введение одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2. Примерами таких веществ являются вещества, способные нейтрализовать интерлейкины IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета (последний не является интерлейкином), все четверо из которых необходимы для установления цитокинового профиля Th2 и для снижения продукции цитокинов клетками Th1.
Примеры таких веществ включают белки, полипептиды, пептиды, растворимые рецепторы, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В конкретном варианте осуществления вещества выбирают из антител, которые связываются с интерлейкинами, таким образом, нейтрализуя их, таких как, например, антитела против IL-4, антитела против IL-5 и/или антитела против IL-10, наряду с растворимыми рецепторами (такими как, например, рецептор TGF-бета I и II) и связывающими белками для TGF-бета (такими как, например, LAP и/или LTBP).
Одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, таких как, например, одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, могут быть добавлены на день 1 второй фазы ii). Однако поскольку антитела стоят дорого, добавление антител также можно осуществлять на следующей стадии после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, например, в первый день, второй день или третий день после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
Нейтрализующие вещества должны быть добавлены в количестве, достаточном для нейтрализации интерлейкинов, таком как, например, 10-100-кратный (по молям) избыток количества нейтрализуемого интерлейкина. При использовании антител обычно потребуется конечная концентрация от приблизительно 2 до приблизительно 4 нг/мл культуральной среды. Для других типов нейтрализующих веществ должна быть использована конечная концентрация, дающая тот же эффект, что и концентрация, указанная для антител.
Для поддержания супрессии развития Т-лимфоцитов типа Th2 дополнительное количество одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, таких как, например, одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, можно регулярно добавлять на протяжении всей фазы ii), например каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы ii). Должно быть понятно, что термин каждый 2-й, 3-й или 4-й день означает, что, по меньшей мере, одно вещество, способное противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, добавляют на протяжении всей фазы i) каждый 2-й, 3-й или 4-й день, начиная со 2-го, 3-го или 4-го дня после первого добавления, по меньшей мере, одного вещества, способного противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2.
Более того, относительно фазы i) дополнительное количество вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, такого как, например, агонист, можно регулярно добавлять на протяжении всей фазы ii), например, каждый день со 2-го по 4-й фазы ii), т.е. на 2-й, 3-й или 4-й день, с целью поддержания оптимальных условий, стимулирующих размножение клеток. Доза регулярно добавляемого вещества лежит в оптимальных диапазонах, указанных для фазы i) в отношении добавления веществ, обладающих агонистической активностью к рецептору IL-2, таких как, например, IL-2.
Для преимущественного получения опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа Th1 вторая фаза ii) может включать добавление одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1. Примерами таких веществ являются вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21. Более конкретно, эти вещества могут быть агонистами рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21. Примеры таких агонистов включают белки, полипептиды, пептиды, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В конкретном варианте осуществления эти вещества представляют собой природные лиганды рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, соответственно, такие как IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
Влияние IL-12 активирует IFN-гамма, индуцируя путь STAT путем стимуляции IL-12R, тем самым усиливая активацию лимфоцитов Th1. Функцией IL-21 является усиление пролиферации, активации и развития в направлении Т-лимфоцитов типа Th1.
Как IL-7, так и IL-15 действуют путем стимуляции увеличения числа Т-лимфоцитов для обеспечения гомеостаза, увеличивая регистрацию активированных Т-лимфоцитов, запрограммированных на путь Th1.
Оптимальным временем добавления одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, является время, когда Т-лимфоциты восприимчивы к модификации. При добавлении веществ, когда Т-лимфоциты не восприимчивы к модификации, добавление не будет эффективным, т.е. не будет преимущественного развития Т-лимфоцитов типа Th1. Для определения оптимального времени добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, таких как, например, вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, можно наблюдать за продукцией IFN-γ Т-лимфоцитами. В предпочтительном варианте осуществления одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, таких как, например, вещества, обладающие агонистической активностью к рецептору IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, должны быть добавлены, когда уровень IFN-гамма увеличивается по сравнению с уровнем IFN-гамма при инициации второй фазы ii).
В конкретном варианте осуществления увеличение уровня IFN-гамма может быть определено как, по меньшей мере, 1-кратное увеличение уровня IFN-гамма, такое как, например, по меньшей мере, 2-кратное, по меньшей мере, 3-кратное, по меньшей мере, 4-кратное увеличение по сравнению с уровнем IFN-гамма при инициации второй фазы ii). Часто стремление к такому увеличению может коррелировать с тем, что содержание IFN-гамма в культуральной среде должно быть, по меньшей мере, 100 пг/мл культуральной среды, например, по меньшей мере, 150 пг/мл культуральной среды, по меньшей мере, 200 пг/мл культуральной среды или, по меньшей мере, 250 пг/мл культуральной среды.
При определении оптимального времени добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, таких как, например, вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, можно дополнительно рассмотреть экспрессию маркеров активации CD25 и CD69 на CD4+ Т-лимфоцитах, причем маркеры предпочтительно должны быть активированы. Под активированием понимают тот факт, что, по меньшей мере, от приблизительно 40% до приблизительно 60% или более CD4+ Т-лимфоцитов должны экспрессировать CD25 и CD69 по сравнению с экспрессией CD25 и CD69 на Т-лимфоцитах в день 1 фазы ii), показывая, что Т-лимфоциты получили сигнал активации.
Обычно оптимальное время добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, будет последовательно снижаться для стадии добавления веществ, способных активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, и веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2. Более конкретно, оптимальное время добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, будет снижаться в промежутке между днем 5 и днем 8 после инициации второй фазы ii), например на день 5, день 6, день 7 или день 8.
В случае добавления IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, концентрация каждого из этих веществ в культуральной среде должна лежать в диапазоне от приблизительно 150 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды, например 250 МЕ/мл культуральной среды. При использовании веществ, отличных от упомянутых конкретных веществ, их нужно добавлять в культуру в конечной концентрации, которая приводит к тому же эффекту, который будет давать добавление IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21 в упомянутых конкретных диапазонах.
Как указано выше, представленный способ предпочтительно используют для увеличения числа Т-лимфоцитов, чтобы получить CD4+ опухоле-реактивные Т-лимфоциты типа Th1. Один из дополнительных аспектов изобретения заключается в том, что, используя описанный в данном документе способ увеличения числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, будут получать относительно большое количество Т-лимфоцитов памяти. В лечении рака, конечно, важно, чтобы пациент, нуждающийся в лечении, получал значительное количество эффекторных опухоле-реактивных CD4+ Т-лимфоцитов, подобных лимфоцитам, как указано выше, усиливающим активацию цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс), NK-клеток, макрофагов и моноцитов, все они могут противодействовать раковым клеткам и, в целом, защищать против опухолей.
Однако вводя в то же время значительное количество опухоле-реактивных CD4+ Т-лимфоцитов памяти, пациент до конца жизни получает длительную защиту против рецидива опухоли или метастаза первичной опухоли.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу получения Т-лимфоцитов памяти. Как правило, при количественном увеличении культуры опухоле-реактивных Т-лимфоцитов по настоящему изобретению будет получаться от приблизительно 35% до приблизительно 90% опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа клеток памяти, например, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 80% или от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Авторы настоящего изобретения делают предположение, что тот факт, что лимфоцитам в фазе i) дают возможность регенерировать перед добавлением опухолевого антигена, наряду с относительно медленной фазой размножения, приводит к получению большого значения отношения лимфоцитов памяти к эффекторным лимфоцитам.
Как указано выше, экспрессия маркеров активации клеточной поверхности CD25 и CD69 на Т-лимфоцитах может быть использована для определения, когда инициировать важные стадии представленного способа, например когда инициировать вторую фазу ii). Соответственно, может быть полезно непрерывно наблюдать за экспрессией CD25 и CD69 на протяжении всей фазы i) и фазы ii), например, каждый 2-й, каждый 3-й или каждый 4-й день.
Одной из целей представленного способа является получение большого числа специфических CD4+ опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, которые могут быть использованы для введения пациенту, причем опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть собраны в некоторой временной точке, что приведет к окончанию стадии размножения. Оптимальным временем сбора опухоле-реактивных Т-лимфоцитов является время, когда экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах подавляется, причем подавление определяется как такое, когда 5% или менее популяции CD4+ Т-лимфоцитов экспрессирует CD25. Оптимальное время сбора также можно определить на основании измерения количества продуцированного IFN-гамма. Продукция IFN-гамма должна быть увеличена, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 4 раза или, по меньшей мере, в 5 раз по сравнению с исходной продукцией IFN-гамма, которая обычно соответствует уровню IFN-гамма, по меньшей мере, 100 пг/мл культуральной среды.
Как правило, это событие произойдет со дня 10 по день 14 включительно после инициации второй фазы ii), т.е. обычно клетки должны быть собраны со дня 10 по день 14 включительно после инициации второй фазы ii).
Соответственно, полный процесс увеличения числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов по изобретению может в целом занять от приблизительно 25 дней до приблизительно 45 дней включительно, например, от приблизительно 26 дней до приблизительно 44 дней включительно, от приблизительно 27 дней до приблизительно 43 дней включительно, от приблизительно 27 дней до приблизительно 42 дней включительно, от приблизительно 27 дней до приблизительно 41 дня включительно и от приблизительно 27 дней до приблизительно 40 дней включительно.
При подавлении маркера CD25 вместо того, чтобы собирать опухоле-реактивные Т-лимфоциты, их можно подвергнуть одному или более дополнительным циклам фазы ii). Это может быть полезно сделать, если количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных способом размножения, не считают эффективным количеством для введения пациенту, страдающему онкологическим заболеванием, или, если пациент получает химиотерапию, может быть лучше отложить введение Т-лимфоцитов до окончания химиотерапии. Чтобы определить, нужно ли подвергать опухоле-реактивные Т-лимфоциты одному или более дополнительным циклам фазы ii), можно посмотреть на уровень продуцируемого IFN-гамма и/или общее количество полученных опухоле-реактивных Т-лимфоцитов и/или экспрессию CD25. В случае, если уровни IFN-γ составляют 30 пг/мл культуральной среды или менее, например 20 пг/мл культуральной среды или менее, и/или общее количество Т-клеток является недостаточным, можно инициировать дополнительные циклы фазы ii), начиная, когда большинство Т-клеток являются CD25-негативными (т.е. менее 5% популяции Т-лимфоцитов экспрессирует CD25) и поэтому восприимчивыми к рестимуляции.
После сбора опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть очищены любыми общепринятыми способами, такими как, например, способы с использованием градиента плотности, например, среды с фиколлом. Часть опухоле-реактивных Т-лимфоцитов после сбора и очистки можно сохранять замораживанием в подходящей для заморозки среде.
Способ лечения
Опухоле-реактивные Т-лимфоциты, полученные улучшенным способом размножения, описанным выше, могут использоваться в способе лечения индивида, страдающего неопластическим заболеванием, или эффективной регрессии опухоли у индивида, имеющего опухоль, причем способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов по изобретению.
Способ, описанный в данном документе, может быть использован в лечении любой солидной неоплазмы эпителиального, мезенхимального или эмбриологического происхождения любой анатомической локализации, такой как, например, для эпителиальных неоплазм, например карцином в молочной железе, ободочной кишке, поджелудочной железе, мочевом пузыре, тонком кишечнике, простате, шейке матки, вульве, яичниках; для мезенхимальных неоплазм, например сарком в суставах, костях, мышцах и сухожилиях, и некоторых гематологических неоплазм, таких как лимфомы; для эмбриологических неоплазм, например тератомы.
Определение эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов зависит от конкретного типа лимфоцитов, отношения клеток памяти к эффекторным Т-лимфоцитам и от тяжести заболевания. Однако в среднем можно вводить как минимум, по меньшей мере, 10 миллионов, например, по меньшей мере, 20 миллионов, по меньшей мере, 30 миллионов, по меньшей мере, 40 миллионов, по меньшей мере, 50 миллионов, по меньшей мере, 60 миллионов, по меньшей мере, 70 миллионов или, по меньшей мере, 80 миллионов опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Авторы представленного изобретения не нашли никакой верхней границы в отношении количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, вводимых в одной дозе.
В предпочтительном варианте осуществления вводимые опухоле-реактивные Т-лимфоциты содержат комбинацию эффекторных Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов памяти. Более конкретно, количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа клеток памяти может составлять от приблизительно 35% до приблизительно 90%, например, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 80% или от приблизительно 60% до приблизительно 70%, а процентное содержание эффекторных Т-лимфоцитов - от приблизительно 10% до приблизительно 65%, например, от приблизительно 20% до приблизительно 50% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%.
Опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть составлены в виде фармацевтической композиции, подходящей для парентерального введения пациенту, такого как, например, внутривенное, внутриартериальное, интратекальное или внутрибрюшинное введение.
При парентеральном введении опухоле-реактивных Т-лимфоцитов они могут быть составлены в изотонической среде, т.е. в среде, имеющей такую же тоничность, как и кровь, и содержащей одно или более веществ, предотвращающих агрегацию клеток. Конкретным примером подходящей среды является 0,9% раствор NaCl, содержащий до 3% сывороточного альбумина человека, например, до 2% сывороточного альбумина человека или до 1% сывороточного альбумина человека. Для внутривенного введения концентрация опухоле-реактивных Т-лимфоцитов во вводимой композиции обычно находится в диапазоне от приблизительно 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до приблизительно 4 миллионов лимфоцитов/мл среды, например, от приблизительно 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до приблизительно 3 миллионов лимфоцитов/мл среды, от приблизительно 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до приблизительно 2 миллионов лимфоцитов/мл среды или от приблизительно 1 миллиона лимфоцитов/мл среды до приблизительно 2 миллионов лимфоцитов/мл среды.
Композиция, содержащая опухоле-реактивные Т-лимфоциты, может быть введена в виде разовой дозы или многократных доз. Ее можно вливать в течение от 1 до 2 часов.
Способ лечения можно осуществить один раз или повторить в зависимости от тяжести заболевания. Кроме того, лечение можно повторить при рецидиве заболевания.
Лечение по настоящему изобретению может быть дополнено любым другим подходящим способом лечения рака. Такой дополнительный способ лечения можно провести перед, одновременно или после введения лимфоцитов и его можно провести с периодичностью, обычно используемой для таких способов лечения. Подходящим примером дополнительного способа лечения является химиотерапия и тому подобное.
Наборы
Изобретение дополнительно относится к наборам, используемым в способе по изобретению, причем набор содержит среду для культивирования Т-лимфоцитов. Средой может быть любая подходящая бессывороточная среда, такая как, например, AIMV, RPMI 1640, DMEM или MEM.
Набор может дополнительно содержать одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Примерами таких веществ могут быть полученный из опухоли антиген, вещества, обладающие агонистической активностью по отношению к рецептору IL-2, вещества, способные активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, вещества, способные противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, и/или вещества, стимулирующие развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
Более конкретно, такими веществами могут быть IL-2, интерферон-альфа, антитело против IL-4, антитело против IL-5, антитело против IL-10, IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
Набор также может содержать фармацевтическую композицию, подходящую для внутривенного введения. Фармацевтическая композиция перед введением может быть смешана с популяцией опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
Набор также может содержать один или более шприцов, содержащих локализатор лимфатических узлов, такой как, например, упоминаемый выше.
Наборы также могут содержать инструкции по применению, например инструкции в форме компьютерной программы.
Описание чертежей
На фиг.1 показано, что сторожевой узел является природным первичным сайтом представления и активации реактивности Т-клеток в отношении опухолевого антигена.
На фиг.2 показано, что сначала лимфоциты сторожевого узла активируют опухолевым антигеном и низкой дозой IL-2, что приводит к активации и экспрессии маркера активации CD25 (верхний рисунок). Конец фазы I, фазы активации, определяют по снижению количества CD4+ Т-клеток, экспрессирующих CD25 (нижний рисунок). Если менее 5% CD4+ Т-клеток экспрессирует CD25, то фазу II инициируют повторной стимуляцией антигеном.
На фиг.3 показано, что активация фазы I и фазы II приводит к увеличению количества и обогащению CD4+ Т-хелперных клеток.
На фиг.4 показано, что в фазе I большинство клеток представляют собой наивные CD62L+ клетки или активированные CD69+ CD62L+ клетки. После фазы II большинство клеток представляют собой CD62L- и составлены из CD4+ Т-хелперных клеток памяти и эффекторных CD4+ Т-хелперных клеток. CD62L- Т-клетки не экспрессируют предпочтительную молекулу возврата в лимфатический узел, таким образом, они отыскивают зоны воспаления в нелимфатических органах.
На фиг.5 показано, что основные клетки, стимулированные в фазе I, происходящие из опухоли (лимфоциты, инфильтрирующие опухоль), сторожевых узлов (SN) и отличного от них лимфатического узла (LN), приводят к немалой продукции IFN-γ.
На фиг.6 показано, что после размножения после фазы ii) существует дозозависимое увеличение антиген-зависимой продукции IFN-γ.
На фиг.7 показано, что протокол размножения и активации стимулирует размножение антиген-специфических клонов Т-клеток, как изучено путем селективного обогащения экспрессии Vβ TCR.
На фиг.8 А-D представлены данные КТ сканирования пациента #5. После трансфузии опухоле-реактивных лимфоцитов у пациента наблюдалась полная регрессия метастазов в печень, локализованных в обеих долях (которые посчитали неоперабельными), нормализация уровней СЕА, исчезновение асцита, и он был в хорошем физическом состоянии, тренируясь постоянно.
На фиг.9 А-F представлены данные КТ сканирования пациента #10. После трансфузии у пациента наблюдалась регрессия метастазов в печень и асцитической жидкости. В известной мере он хорошо себя чувствовал, и дальнейшее сканирование показало стабилизацию заболевания.
На фиг.10 А-Н представлены данные КТ сканирования пациента #12. Через три месяца после трансфузии у него наблюдалась регрессия метастазов в печень и легкие с почти полностью нормализованным уровнем СЕА 5,9 (норма <4,0), исчезновение асцита, и он выглядел клинически здоровым.
На фиг.11 показаны Т-лимфоциты, дающие сигнал выше порогового значения в отношении экспрессии CD4+, которые окрашивали в отношении экспрессии CD25 и фактора транскрипции FoxP3 в начале (А) и в конце (В) размножения. Исходно (рисунок А) FoxP3 и высокие уровни CD25 экспрессировали 4,8% CD4+ Т-лимфоцитов, таким образом, их идентифицировали как Treg. В конце размножения присутствовало крайне незначительное количество Treg 0,3% (рисунок В).
Примеры
Пример 1
Увеличение числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов
Идентификацию сторожевых узлов осуществляли во время операции, используя методику сторожевого узла. Кратко, вводили 1 мл красителя патентованного синего (Guerbet, Paris) и распределяли по поверхности серозной оболочки вокруг опухоли. За пять-десять минут в синий цвет окрашивались от одного до трех лимфатических узлов брыжейки, эти сторожевые узлы отмечали шовным материалом и удаляли (см. фиг.1). В качестве контрольного также идентифицировали и удаляли один отличный от сторожевого лимфатический узел брыжейки, удаленный от опухоли.
Сторожевые и отличные от сторожевых лимфатические узлы разрезали пополам и срезы толщиной 1 мм брали из центра и с периферии. Остальную часть лимфатических узлов отправляли для гистологического исследования согласно принятой методике. Часть опухоли, включающую образец инвазивного края, также оставляли для научных целей.
Культура клеток
Фаза I, начальная активация
Материал сторожевого узла помещали на лед и обращались с осторожностью, все время используя среду AIM V® (Invitrogen). Суспензии единичных клеток лимфоцитов сторожевого узла получали путем осторожной гомогенизации в стеклянном гомогенизаторе с неплотным соединением, а затем гомогенизированные клетки дважды отмывали в среде. Лимфоциты сторожевого узла помещали во флаконы для культивирования клеток в концентрации 4 миллиона клеток/мл и добавляли интерлейкин-2 (IL-2) (Proleukin®, Chiron) до концентрации 240 МЕ/мл среды.
Экстракт аутологичной опухоли получали гомогенизацией с Ultra Turrax в 5 объемах (масса/объем) 2×PBS c последующей денатурацией в течение 5 минут при 97°С. Через три-четыре дня после инициации культуры клеток добавляли экстракт аутологичной опухоли в концентрации 1/100. Для длительного культивирования клетки помещали в инкубатор клеток при 37°С и 5% СО2 и каждые 3-4 дня добавляли 240 МЕ IL-2/мл среды.
Фаза II, активация и размножение
Через 18-22 дня клеточные культуры наблюдали в отношении экспрессии CD25. Если количество клеток, экспрессирующих CD25, снижалось ниже 5%, клетки вновь стимулировали в фазе II (фиг.2) добавлением экстракта аутологичной опухоли при концентрации 1/100. Для эффективного представления антигена собирали аутологичные PBMC, используя Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), облучали дозой 2500 рад и добавляли к клеточным культурам. Через три дня после рестимуляции добавляли интерферон-α (Introna) в концентрации 100-500 МЕ/мл и антитело против IL-4 до концентрации 2 мкг/мл. Через 5-8 дней добавляли IL-12 (4 нг/мл) для размножения с целью усилить индукцию клеток Th1, продуцирующих IFN-γ.
За день до трансфузии пациенту клеточные культуры подвергали очистке, используя Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), чтобы возвратить жизнеспособные клетки в культуру. В день трансфузии клетки дважды отмывали в физиологическом растворе (Natriumklorid Baxter Viaflo 9 мг/мл, Baxter) и затем переносили в емкость для переноса, содержащую 100-200 мл физиологического раствора и 1% сывороточного альбумина человека (Baxter). Перед трансфузией проводили исследования на наличие микроорганизмов. Вливания клеток осуществляли в течение 1-2 часов под наблюдением медицинского работника.
Иммунологическая оценка
Дополнительную иммунологическую оценку осуществляли, используя анализы пролиферации со встроенным тимидином, меченным тритием. С этой целью оставляли аликвоту лимфоцитов сторожевого узла, получали суспензию единичных клеток лимфоцитов узла, отличного от сторожевого, посредством осторожного давления в стеклянном гомогенизаторе с неплотным соединением, а лейкоциты периферической крови очищали с помощью Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare).
Клетки ресуспендировали и отмывали дважды в RPMI 1640 (Life technologies), содержащей 2,5% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Life technologies). В заключение клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, стимулирующей пролиферацию, содержащей 10% АВ сыворотку человека (Sigma), 1% пенициллин-стрептомицин (Sigma) и 1% глутамин (Sigma). Клетки лимфатического узла и очищенные PBL использовали при плотности 3×105 клеток/лунка в 96-луночном планшете и стимулировали гомогенатом опухоли, разбавленным 1/100, 1/10 или Con A 10 мкг/мл (Sigma), в трех повторах. Пролиферацию измеряли на 5, 6 и 7 день добавлением 1 мкКи 3Н-тимидина/лунка (Amersham) за 18 часов до сбора. Образцы подвергали подсчету количества сцинтилляций.
В начале культивирования клеток для измерения секреции IFN-γ осуществляли стимуляцию клеток лимфатического узла и PBL, помещенных в 96-луночные планшеты при плотности 3×105 клеток/лунка, в трех повторах гомогенатом опухоли, разбавленным 1/100, 1/10 или Con A 10 мкг/мл (Sigma). Количество секретируемого IFN-γ измеряли посредством ELISA (Human IFN-γ Duoset, R&D Systems) в культуральных супернатантах в объединенных образцах тройных повторов (фиг.5). В конце культивирования клеток образцы супернатанта удаляли и измеряли секрецию IFN-γ и IL-4 в трех повторах посредством ELISA (Human IFN-γ Duoset и Human IL-4 Duoset, R&D Systems) (фиг.6A и 6B).
Анализы проточной цитометрии
Характеристику клеток осуществляли, используя проточную цитометрию сначала клеток сторожевого узла, узла, отличного от сторожевого, РВМС и опухоли. Для проведения анализа проточной цитометрии каждые две-три недели брали образцы культуры лимфоцитов, полученных из сторожевого узла. Клетки инкубировали в течение 30 минут в PBS, дополненной 2% FCS и 0,05% NaN3 (буфер FACS) с антителами против маркеров субпопуляций иммунных клеток и активации лимфоцитов (фиг.3, 4 и 5). Были использованы антитела, конъюгированные с флуоресцеин-изотиацианатом (FITC), против следующих маркеров: CD69, HLA-DR, CD45RA, CD25, конъюгированные с фикоэритрином (РЕ): CD62L, CD19, CD45RO, CD56, конъюгированные с перидинин-хлорофилл-протеином (PerCP): CD8, CD3, конъюгированные с аллофикоцианином (АРС): CD4, CD14, CD8.
Vβ-репертуар оценивали, используя набор Beta mark (Beckman Coulter), 5×105 клеток/пробирка окрашивали, помещая в 8 различных флаконов, содержащих в объеме 10 мкл смеси FITC, PE и двухцветного FITC-РЕ, конъюгированных с антителами Vβ TCR и с добавлением в каждую пробирку CD8 PerCP и CD4 APC (фиг.7).
Пример 2
Способ лечения колоректального рака введением опухоле-реактивных Т-лимфоцитов
Идентификация и иссечение сторожевого и первого от метастаза лимфатических узлов у пациентов, страдающих колоректальным раком:
Были изучены шестнадцать пациентов с диагнозом колоректальный рак, шесть женщин и десять мужчин, средний возраст которых составлял 62 года. Пациентов классифицировали на основании гистопатологического анализа как Duke's C или D. Также было 5 пациентов, классифицированных как Duke's В, с агрессивными характеристиками опухоли, такими как язвы, сосудистая или периневральная инвазия. Однако пациентам 7 и 14 ранее проводили хирургическое лечение колоректального рака и в настоящее время у них наблюдался рецидив заболевания с метастазами в печень. Местный этический комитет одобрил исследование, и каждый пациент дал информированное согласие.
Идентификация сторожевых и первых от метастаза узлов была проведена во время хирургического вмешательства. С целью облегчения осмотра опухоли и брыжейки осуществляли мобилизацию сайта опухоли толстой кишки путем отделения перитонеальных спаек. Инъекции красителя патентованного синего (Guerbet, Paris) распределяли поверхностно на серозной оболочке вокруг опухоли. В течение пяти минут в синий цвет окрашивались от одного до трех лимфатических узлов брыжейки, эти сторожевые узлы отмечали шовным материалом и удаляли по окончании резекции. Так же поступали с одним отличным от сторожевого лимфатическим узлом брыжейки, удаленным от опухоли.
Сторожевые и отличные от сторожевых лимфатические узлы разрезали пополам и брали срез 1 мм в толщину из центра и с периферии. Оставшуюся часть лимфатических узлов отправляли для проведения гистопатологического исследования согласно стандартной методике. Часть опухоли, включающую участок инвазивного края, использовали для получения антигена.
Лимфоциты, полученные из лимфатических узлов, затем количественно увеличивали, как описано в примере 1.
Введение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов:
16 пациентов подвергали инфузии аутологичных лимфоцитов, количественно увеличенных, как описано в примере 1. В среднем 74,7 миллиона активированных и подвергнутых клональной экспансии Т-клеток вводили в виде трансфузии. Токсических побочных эффектов, подобных лихорадке, ознобу, чувству дискомфорта, задержке жидкости тяжелой степени, отеку легкого или дыхательной недостаточности, обнаружено не было.
Последующие анализы
Последующие мероприятия включали клиническую оценку каждые три-шесть месяцев и контроль уровней СЕА. Всех пациентов, имеющих III и IV стадии заболевания, в дополнение исследовали с помощью компьютерной томографии грудной клетки и брюшной полости. Пациентов обследовали во время регулярных посещений в среднем через 13 месяцев (диапазон 5-20), в среднем через 131/2 месяцев. Из 16 пациентов, которые были пролечены инфузией аутологичных лимфоцитов, восемь узнали при диагностике об отдаленных метастазах. Четверо пациентов получили трансфузии по поводу известных рецидивов, а у троих из них еще не было признаков рецидивов. Одного пациента оперировали по поводу солитарных метастазов в печень, и с тех пор у него не было рецидивов. Как понятно из фиг.8A-D, у одного пациента с метастазами в печень, локализованными в обеих долях (которые посчитали неоперабельными), после трансфузии опухоле-реактивных Т-лимфоцитов наблюдалась полная регрессия метастазов в печень и, более того, нормализация уровней СЕА, исчезновение асцита и хорошее физическое самочувствие и регулярные тренировки. У одного дополнительного пациента с метастазами в печень после трансфузии наблюдалась регрессия метастазов в печень и асцитической жидкости (см. фиг.9A-F). У одного пациента через три месяца после трансфузии наблюдалась регрессия метастазов в печень и легкие (см. фиг.10A-H) с почти нормализовавшимся уровнем СЕА 5,9 (норма <4,0), исчезновение асцита, и он выглядел клинически здоровым.
Результаты
Было прооперировано в госпитале South Stockholm General Hospital и включено в исследование шестнадцать пациентов с колоректальным раком или солитарными метастазами колоректального рака в печень. Первичной локализацией опухолей являлись в трех случаях слепая кишка, в 4 - восходящая ободочная кишка, в 1 - нисходящая ободочная кишка, в 7 - сигмовидная кишка и в 1 - прямая кишка. Было проведено семь операций правосторонней гемиколэктомии, 1 левосторонняя гемиколэктомия, 7 операций резекции сигмовидной кишки и 1 ампутация прямой кишки. Двоих пациентов ранее оперировали по поводу ампутации прямой кишки и резекции сигмовидной кишки; в настоящий момент они перенесли частичную резекцию печени по поводу метастазов в печень. У одного пациента наблюдались рецидивы в два участка брюшной полости, а ранее он был оперирован по поводу опухоли слепой кишки. Во время операции были идентифицированы два сторожевых узла с оттоком от метастаза, один в брыжейке кишечника и один в брыжейке тонкого кишечника. Была проведена расширенная резекция области соединения тонкого и толстого кишечника с брыжейкой.
У всех пациентов во время операции было идентифицировано путем инъекций патентованного синего около опухолей от одного до трех (в среднем 2,1) сторожевых узлов. Среди пациентов с первичной резекцией кишечника было извлечено у каждого индивида в среднем 15,8 лимфатических узлов. После гистопатологического изучения этих лимфатических узлов пятерых пациентов классифицировали как Duke's C и 5 пациентов как Duke's В, все они при патологоанатомическом исследовании были отнесены к группе с высоким риском развития опухолей вследствие роста опухолевых клеток вдоль нервов и в сосуды. У пяти пациентов имелись отдаленные метастазы, и во время резекции метастазов их классифицировали как Duke's D. У двоих из этих пациентов имелись солитарные метастазы в печень. Кроме того, с целью детекции микрометастазов сторожевые узлы также анализировали с помощью FACS (клеточный сортер с активацией флуоресценции) и антител против цитокератина 20, который экспрессируется колоректальными раковыми опухолями. Анализы на наличие в лимфатических узлах цитокератина 20 посредством проточной цитометрии соответствовали патологоанатомическому диагнозу (не показан), за исключением одного случая, когда ложноотрицательный сторожевой узел (в соответствии с гистопатологическим анализом) оказался положительным в анализе с использованием FACS и цитокератина 20.
Сторожевой узел является первым лимфатическим узлом при оттоке лимфы от опухоли и поэтому является первым сайтом метастаза в лимфатический узел (Dahl et al.), но сторожевой узел является также первичным сайтом активации иммунной системы. В сторожевом узле аккумулируются клетки опухоли, дебрис, некротические клетки и антиген-представляющие клетки, здесь происходит представление, активация и клональная экспансия Т-клеток, направленных против возникновения опухоли. Авторы настоящего изобретения показали преимущество этой популяции среди in vivo увеличенной Т-клеточной популяции лимфоцитов, полученных в сторожевом узле, для in vitro культивирования клеток, увеличения количества и трансфузии.
Полученные в сторожевом узле лимфоциты представляют собой популяцию Т-клеток, активированных и подвергнутых клональной экспансии против антигенов опухоли, которые могут быть эффективным образом собраны в процессе хирургической операции. В противовес последним испытаниям в области иммунотерапии, сфокусированным на цитотоксических Т-клетках, целью авторов настоящего изобретения являлось создание протокола для in vitro усиления in vivo инициированной клональной экспансии Т-хелперных клеток. Т-хелперные клетки оказались необходимыми для эффективного функционирования цитотоксических Т-клеток и для создания клеток памяти. Более того, в трансгенной системе Т-клеточного рецептора, нацеливающего антиген островковых клеток, было обнаружено, что трансфузии клеток Th1 должно быть достаточно для разрушения β-клеток и развития сахарного диабета. In vitro культивирование лимфоцитов, полученных из сторожевого узла, приводит к активации Th1 и клональной экспансии Т-хелперных клеток, на что указывает преобладающая продукция цитокина IFN-γ, являющегося отличительным признаком Th1, и обогащение ограниченного набора Vβ-цепей TCR. Гомогенат опухоли, используемый для увеличения количества Т-клеток, подходит для эндоцитоза и процессирования антиген-представляющими клетками для представления классу II, приводя к активации CD4+ Т-хелперных клеток, что приводит к увеличению количества предпочтительных Т-хелперных клеток. Путем перекрестной презентации антигены, захваченные эпдоцитозом, могут быть процессированы и представлены в «карман» класса I, что приводит к активации CD8+ цитотоксических Т-клеток. Интересно, что в некоторых случаях изобретатели обнаружили клональную экспансию как CD4+, так и CD8+ Т-клеток.
Среднее количество лимфоцитов, полученных из сторожевого узла, в начале увеличения количества составляло 107,4 миллиона клеток (диапазон 3,6-509 миллионов, медиана 70 миллионов). Клетки были охарактеризованы путем проточной цитометрии. Соотношение между CD4+ и CD8+ клетками в начале составляло в среднем 4,9 (диапазон 0,36-10, медиана 5,4), указывая на увеличение количества CD4+ Т-хелперных клеток в сторожевых узлах по сравнению с соотношением CD4/CD8 в периферической крови (обычный диапазон 1,0-2,5) (фиг.2А). Кроме того, в сторожевых узлах присутствовали В-лимфоциты (CD 19) и природные киллеры (NK-клетки) (CD 56) (данные не представлены). Клетки оставляли в культуре в среднем на 36,1 день (диапазон 23-58 дней), медиана 33 дня. Клетки тщательно наблюдали с помощью проточной цитометрии, по меньшей мере, еженедельно. Сначала общее количество клеток снизилось. В-клетки и NK-клетки почти полностью исчезли, а количество CD8+ Т-киллеров уменьшилось. Используемая методика культивирования стимулировала главным образом, увеличение количества Т-хелперных клеток, поскольку среднее соотношение CD4/CD8 составило 92,5. Рестимуляция аутологичным опухолевым антигеном привела к клональной экспансии опухоле-реактивных Т-клеток, что оценивали, изучая Vβ-репертуар Т-клеточного рецептора лимфоцитов, полученных из сторожевого узла, перед и после культивирования in vitro.
Перед трансфузией количественно увеличенные Т-клетки тестировали в отношении функций против аутологичных опухолевых антигенов путем измерения активации и продукции цитокинов клетками Th1 (цитокин IFN-γ) и Th2 (цитокин IL-4). In vitro количественно увеличенные лимфоциты, полученные из сторожевого узла, отвечали на рестимуляцию опухолевым антигеном продукцией IFN-γ и отсутствием или незначительным количеством IL-4, указывая, что количественно увеличенные Т-клетки оказались эффективными и отвечающими подобно клеткам Th1.
В исследовании лечению подвергали шесть пациентов, относившихся по классификации Duke к группе D. У двух пациентов, отнесенных во время операции к группе D по Duke с метастазами в печень и легкие, соответственно наблюдали характерную регрессию заболевания (пациент 5 и 12). После трансфузии лимфоцитов у первого пациента наблюдали полную регрессию метастазов в печень, локализованных в обеих долях (которые посчитали не поддающимися хирургическому вмешательству в печень) (фиг.3), нормализацию уровней СЕА, исчезновение асцита, и он выглядел здоровым. У пациента 12 показана регрессия метастазов в печень и легкие с почти нормальным уровнем СЕА 5,9 (норма <4,0), исчезновение асцита, и он выглядел клинически здоровым. У пациента 1 наблюдали уменьшение размера метастаза в печень и исходно снижение уровней СЕА, исчезновение асцита, и он был в отличной форме, когда внезапно умер (на 191 день), как оказалось, по причине легочного эмбола. У двух пациентов, по классификации Duke относящихся к группе D, наблюдали стабилизацию заболевания без прогрессирования метастаза или увеличения уровней СЕА. У самого пожилого пациента, в исследовании имевшего № 7, наблюдали стабилизацию заболевания в течение пяти месяцев, но затем уровни СЕА начали повышаться, и он умер в возрасте 83 лет. Аутопсию не проводили. Одного пациента во время операции отнесли к группе С по классификации Duke, но вскоре у него появились метастазы в печень и легкие (по классификации Duke группа D), но благодаря последующей трансфузии и химиотерапии наблюдали регрессию метастазов в печень и легкие лишь с незначительно повышенными уровнями СЕА. Все пациенты, отнесенные по Duke к группе С, имели нормальные уровни СЕА, и у них не наблюдали каких-либо радиологических или клинических признаков рецидива заболевания. Четверо пациентов, относящихся по Duke к группе В, являются здоровыми с нормальными уровнями СЕА и у них нет признаков рецидивирующего заболевания. У пациента № 9, отнесенного к группе В по классификации Duke, но с активно растущей опухолью, показаны признаки рецидивирующего заболевания с повышенными уровнями СЕА (67) и признаками метастазов в печень.
Для изучения пути внутривенно влитых Т-клеток авторы настоящего изобретения проанализировали в периферической крови пролиферацию Т-клеток против экстракта опухоли. Как указано выше, перед трансфузией они не смогли показать в периферической крови никакой реактивности Т-клеток против аутологичных опухолевых антигенов у какого-либо пациента. Однако можно было определить пролиферацию Т-клеток против аутологичных опухолевых антигенов в периферической крови у всех исследованных пациентов вплоть до 10 месяцев после трансфузии, что указывает на наличие подвергнутых клональной экспансии циркулирующих опухоле-реактивных Т-клеток.
Краткое содержание характеристик пациентов
Ниже представлена таблица всех пациентов, принимавших участие в исследовании, распределенных во время операции по классификации Duke:
| Характеристики участников исследования | ||||||
| Возраст/пол | Классификация Duke | Количество влитых клеток (х106) | CD4/CD8∗ | IFN-γ (пг/мл) | Cуммарная выживаемость (месяцы) | Ответ |
| 67/М | B | 4 | 92/0,2 | ND | 31 | SD |
| 67/F | B | 8 | 15/51 | ND | 30 | SD |
| 71/M | B | 50 | 74/15 | 2091 | 29 | SD |
| 74/M | B | 63 | 64/22 | ND | 29 | SD |
| 66/M | B | 152 | 82/1,5 | 1411 | 27 | SD |
| 64/F | C | 110 | 64/25 | ND | 34 | SD |
| 58/F | C | 16 | 77/18 | 417 | 23 | SD |
| 61/F | D | 1 | 3,7/35 | ND | 6 | SD |
| 47/M | D | 80 | 24/16 | ND | 36 | CR |
| 54/M | D | 40 | 37/24 | ND | 36 | SD |
| 65/M | D | 270 | 82/15 | ND | 36 | CR |
| 42/F | D | 80 | 66/11 | ND | 33 | CR |
| 82/F | D | 40 | 98/0,1 | ND | 6 | SD |
| 74/M | D | 130 | 73/22 | 142 | 30 | CR |
| 33/M | D | 72 | 72/1,5 | 908 | 12 | PR |
| 66/M | D | 25 | 37/27 | 764 | 26 | PR |
| а) Количество, выражающее процентное содержание CD4 и CD8-позитивных клеток, определенных с помощью FACS. | ||||||
Обсуждение
По данным авторов настоящего изобретения пациентам с колоректальным раком ранее никогда не предлагали иммунотерапии, основанной на сторожевых или первых от метастаза узлах. Таким образом, это первая попытка использовать в лечении лимфоциты, полученные из сторожевых или первых от метастаза узлов. Существует несколько важных различий между настоящим исследованием и, например, лечением высокими дозами IL-2 (Rosenberg). Во-первых, использование лимфоцитов, полученных из сторожевых узлов, которые были стимулированы in vitro гомогенатом аутологичной опухоли и АРС, вызывает высоко специфичный клеточный иммунный ответ на опухоль. До трансфузии будут доживать лишь Т-клетки с высоким сродством к первичной опухоли. При системном генерализованном лечении высокими дозами IL-2, вводимыми пациентам внутривенно, будут стимулироваться в равной степени все лимфоциты, а опухоле-специфичной будет лишь очень небольшая их фракция. Авторы настоящего изобретения полагают, что поскольку сторожевой узел(ы) являются первыми лимфатическими узлами, принимающими отток лимфы от опухоли, там будет иметь место избыточная аккумуляция опухоле-специфичных лимфоцитов. Пролиферация и трансфузия Т-клеток, точно распознающих опухоль, должна создать массивную опухолеспецифическую реакцию. Во-вторых, схема лечения высокими дозами IL-2 приводит к высокой токсичности и тяжелым осложнениям, длительному лечению и высокой стоимости. Трансфузии по настоящему способу не давали осложнений в течение примерно одного часа, и пациентов часто отпускали из больницы в тот же день. В-третьих, настоящий протокол нацелен на увеличение числа Т-хелперов из сторожевых узлов, в отличие от увеличения числа цитотоксических Т-клеток, собираемых в виде лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль.
Настоящее исследование показывает, что свежевыделенные лимфоциты, полученные из сторожевого узла, обладают способностью к in vitro пролиферации против гомогената аутологической опухоли и могут быть влиты пациенту без осложнений в качестве адоптивной иммунотерапии. Существует определенное показание к тому, чтобы лечение количественно увеличенными лимфоцитами, полученными из сторожевого узла, могло улучшить исход болезни пациентов с высоким риском диссеминации или диссеминированным колоректальным раком, а также пациентов, страдающих различными типами солидного рака.
Claims (18)
1. Способ увеличения количества опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов in vitro, причем способ содержит i) первую фазу стимуляции опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов полученным из опухоли антигеном наряду с IL-2, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, где концентрация IL-2 составляет от 100 МЕ/мл до 700 МЕ/мл; и ii) вторую фазу активации и усиления роста опухоле-реактивных CD4+Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, где вторую фазу ii) инициируют, когда на CD4+ Т-хелперах и/или CD8+ Т-лимфоцитах подавляется маркер клеточной поверхности CD25, где подавление определяют как то, что 5% или менее популяции Т-лимфоцитов экспрессирует CD25, и где фазу ii) инициируют добавлением к Т-лимфоцитам указанного полученного из опухоли антигена для активации опухоле-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов.
2. Способ по п,1, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой денатурированный гомогенат опухоли.
3. Способ по п.2, в котором полученный из опухоли антиген является аутологичным.
4. Способ по п.1, который дополнительно включает добавление к Т-лимфоцитам антиген-представляющих клеток вместе с полученным из опухоли антигеном.
5. Способ по п.4, в котором антиген-представляющими клетками являются облученные лейкоциты периферической крови, содержащие антиген-представляющие В-клетки и/или моноциты.
6. Способ по п.1, в котором вторая фаза ii) включает введение, по меньшей мере, одного вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
7. Способ по п.1, в котором вторая фаза ii) включает введение одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2.
8. Способ по п.7, в котором одним или более веществами, способными противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, являются одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета.
9. Способ по п.8, в котором одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, представляют собой антитело против IL-4, антитело против IL-5 и/или антитело против IL-10.
10. Способ по любому из пп.1, 7 или 8, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, выбранные из одного или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют регулярно на протяжении всей фазы ii).
11. Способ по п.1, в котором вторая фаза ii) включает введение одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
12. Способ по п.11, в котором одним или более веществами, стимулирующими развитие Т-лимфоцитов типа Th1, являются вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
13. Способ по п.12, в котором одно или более веществ выбирают из IL-7, IL-12, IL-15 и IL-21.
14. Способ по п.1, направленный на получение Th1-лимфоцитов памяти и/или эффекторных Th1-лимфоцитов.
15. Способ по п.1, который дополнительно включает мониторинг экспрессии маркеров клеточной поверхности, выбранных из CD25, CD69 и их обоих, на Т-лимфоцитах непрерывно во время первой фазы i) и второй фазы ii),
в котором Т-лимфоциты собирают при подавлении CD25 на Т-лимфоцитах во второй фазе ii).
в котором Т-лимфоциты собирают при подавлении CD25 на Т-лимфоцитах во второй фазе ii).
16. Способ по п.15, в котором Т-лимфоциты подвергают, по меньшей мере, одному дополнительному циклу фазы ii), когда CD25 на Т-лимфоцитах подавляется.
17. Способ по п.1, в котором Т-лимфоциты получают из лимфатических узлов, куда оттекает лимфа от первичной опухоли и/или метастаза, или их получают из крови.
18. Композиция, включающая опухоле-реактивный CD4+ Т-хелпер и/или CD8+ лимфоциты, полученные в соответствии со способом по любому из пп.1-17, и изотоническую среду для применения в способе лечения индивида, страдающего заболеванием неопластического происхождения, где композиция содержит от 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до 4 миллионов лимфоцитов/мл среды, и где изотоническая среда представляет собой 0,9% хлорид натрия, и среда дополнительно содержит до 3% сывороточного альбумина человека.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75282805P | 2005-12-21 | 2005-12-21 | |
| US60/752,828 | 2005-12-21 | ||
| DKPA200501810 | 2005-12-21 | ||
| DKPA200501810 | 2005-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008129788A RU2008129788A (ru) | 2010-01-27 |
| RU2399382C2 true RU2399382C2 (ru) | 2010-09-20 |
Family
ID=37856930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008129788/13A RU2399382C2 (ru) | 2005-12-21 | 2006-12-20 | Улучшенный способ увеличения числа опухоле-реактивных т-лимфоцитов в иммунотерапии онкологических больных |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8206702B2 (ru) |
| EP (1) | EP1966369B1 (ru) |
| JP (1) | JP5244610B2 (ru) |
| KR (1) | KR101391395B1 (ru) |
| AU (1) | AU2006328943B2 (ru) |
| CA (1) | CA2634167C (ru) |
| RU (1) | RU2399382C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007071388A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200805416B (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
| RU2603079C2 (ru) * | 2015-03-16 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Способ активации цитотоксических лимфоцитов человека |
| RU2820974C1 (ru) * | 2017-03-03 | 2024-06-14 | Ф1 Онколоджи, Инк. | Способы и композиции для трансдукции и экспансии лимфоцитов и регуляции их активности |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1408106B1 (en) * | 2002-10-11 | 2007-02-14 | Sentoclone Therapeutics AB | Cancer immuno-therapy |
| US8211424B2 (en) * | 2005-12-21 | 2012-07-03 | Sentoclone International Ab | Method for treating malignant melanoma |
| CA2634169C (en) * | 2005-12-21 | 2012-11-27 | Sentoclone Ab | Method for treating disseminated cancer |
| US8101173B2 (en) * | 2005-12-21 | 2012-01-24 | Sentoclone International Ab | Method for treating urinary bladder cancer |
| CA2700618A1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Inhibition of dendritic cell-driven regulatory t cell activation and potentiation of tumor antigen-specific t cell responses by interleukin-15 and map kinase inhibitor |
| CN102119214A (zh) * | 2008-07-18 | 2011-07-06 | 森托科隆国际公司 | 适合于癌症治疗的包含体外扩增的t淋巴细胞和血管形成抑制剂的组合物 |
| CN106103701B (zh) | 2014-01-03 | 2020-04-24 | 中央研究院 | 改造的自然杀手细胞及其组成与用途 |
| US20170044496A1 (en) | 2014-04-10 | 2017-02-16 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Enhanced Expansion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Adoptive Cell Therapy |
| US10469396B2 (en) | 2014-10-10 | 2019-11-05 | Pegasystems, Inc. | Event processing with enhanced throughput |
| EP3359182B1 (en) * | 2015-10-08 | 2023-04-19 | Nektar Therapeutics | Combination of an il-2rbeta-selective agonist and a long-acting il-15 agonist |
| WO2017176672A1 (en) * | 2016-04-04 | 2017-10-12 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods related to polycytotoxic t cells |
| TWI788307B (zh) | 2016-10-31 | 2023-01-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 |
| WO2018094167A1 (en) | 2016-11-17 | 2018-05-24 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Remnant tumor infiltrating lymphocytes and methods of preparing and using the same |
| WO2018129336A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tumor infiltrating lymphocytes with potassium channel agonists and therapeutic uses thereof |
| JOP20190224A1 (ar) | 2017-03-29 | 2019-09-26 | Iovance Biotherapeutics Inc | عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي |
| US11254913B1 (en) | 2017-03-29 | 2022-02-22 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
| CN111836887A (zh) | 2018-01-08 | 2020-10-27 | 艾欧凡斯生物治疗公司 | 产生富含肿瘤抗原特异性t细胞的til产品的方法 |
| KR102197723B1 (ko) * | 2019-03-08 | 2020-12-31 | 주식회사 네오젠티씨 | 림프구의 종양 반응성 예측용 마커 및 이의 용도 |
| EP4395835A1 (en) | 2021-08-30 | 2024-07-10 | CarryGenes Bioengineering, LLC | Synthetic chromosome encoding two or more chimeric antigen receptors binding to tumor associated antigens |
| WO2023201369A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4311688A (en) | 1979-10-29 | 1982-01-19 | Serono Laboratories Inc. | Composition and method for cancer detection in humans |
| WO1990005183A1 (en) | 1988-10-31 | 1990-05-17 | Immunex Corporation | Interleukin-4 receptors |
| US5814295A (en) | 1992-04-10 | 1998-09-29 | The Ohio State University Research Foundation | Determination of lymph nodes enriched in tumor reactive cells their proliferation and their use in adoptive cellular therapy |
| US20020182730A1 (en) | 1995-07-26 | 2002-12-05 | Micheal L. Gruenberg | Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease |
| AU723355B2 (en) | 1996-05-23 | 2000-08-24 | Scripps Research Institute, The | MHC class II antigen presenting systems and methods for activating CD4+ T cells |
| EP1071450A2 (en) | 1998-04-23 | 2001-01-31 | Arch Development Corporation | Combination of antigen pulsed apcs and interleukin 12 for tumour and viral therapy |
| WO2000000587A1 (en) | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Keld Kaltoft | Methods of expanding and selecting disease associated t-cells |
| WO2001005433A2 (en) | 1999-07-14 | 2001-01-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Delivery and retention of activity agents to lymph nodes |
| GB0007088D0 (en) | 2000-03-23 | 2000-05-17 | Torsana A S | Detection of immunological memory determining the position of loci of pathologyand therapeutic t-cell conjugates |
| AU2001274934A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-12-03 | Nexell Therapeutics Inc. | Human circulating dendritic cell compositions and methods |
| US7012098B2 (en) | 2001-03-23 | 2006-03-14 | Pharmacia Corporation | Inhibitors of inducible nitric oxide synthase for chemoprevention and treatment of cancers |
| JP2003000242A (ja) * | 2001-04-03 | 2003-01-07 | Takara Bio Inc | 細胞傷害性ｔリンパ球 |
| US20030228635A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-12-11 | Renovar, Inc. | Cell proliferation assays and methods |
| WO2004012681A2 (en) | 2002-08-02 | 2004-02-12 | South Alabama Medical Sciences Foundation | Cancer vaccines containing epitopes of oncofetal antigen |
| WO2004016154A2 (en) | 2002-08-16 | 2004-02-26 | John Wayne Cancer Institute | Molecular lymphatic mapping of sentinel lymph nodes |
| EP1408106B1 (en) | 2002-10-11 | 2007-02-14 | Sentoclone Therapeutics AB | Cancer immuno-therapy |
| US20060104950A1 (en) | 2002-10-24 | 2006-05-18 | Shinji Okano | Methods of Tranducing genes into T cells |
| EP1419787A1 (de) | 2002-11-18 | 2004-05-19 | Uwe Prof. Dr. Till | Lymphknoten-Kontrastmittel |
| EP1723970A4 (en) * | 2004-03-09 | 2009-08-12 | Univ Kyoto | MEDICAL COMPOSITION WITH CXCR3 INHIBITOR |
| CA2634169C (en) | 2005-12-21 | 2012-11-27 | Sentoclone Ab | Method for treating disseminated cancer |
| US8101173B2 (en) | 2005-12-21 | 2012-01-24 | Sentoclone International Ab | Method for treating urinary bladder cancer |
| US8211424B2 (en) | 2005-12-21 | 2012-07-03 | Sentoclone International Ab | Method for treating malignant melanoma |
| US8007785B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-08-30 | Sentoclone International Ab | Method for treating colon cancer with tumour-reactive T-lymphocytes |
| US7951365B2 (en) | 2007-06-27 | 2011-05-31 | Deifiera Falun Ab | Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types |
| CN102119214A (zh) | 2008-07-18 | 2011-07-06 | 森托科隆国际公司 | 适合于癌症治疗的包含体外扩增的t淋巴细胞和血管形成抑制剂的组合物 |
-
2006
- 2006-12-20 EP EP06841050A patent/EP1966369B1/en not_active Not-in-force
- 2006-12-20 US US12/158,686 patent/US8206702B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-20 RU RU2008129788/13A patent/RU2399382C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-20 CA CA2634167A patent/CA2634167C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-20 WO PCT/EP2006/012304 patent/WO2007071388A1/en active Application Filing
- 2006-12-20 AU AU2006328943A patent/AU2006328943B2/en not_active Ceased
- 2006-12-20 JP JP2008546243A patent/JP5244610B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-06-20 ZA ZA2008/05416A patent/ZA200805416B/en unknown
- 2008-07-17 KR KR1020087017480A patent/KR101391395B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MARITS Р. ЕТ AL. Detection of immune responses against urinary bladder cancer in sentinel lymph nodes. European urology. 2006 г. 49 (1), стр.: 59-70. SAKAGUCHI S. ЕТ AL. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+regulatory Т cells in immunological tolerance to self and non-self. Nature Immunology. 2005 г. 6 (4), с.345-352. MESEL-LEMOINE M. Initial depletion of regulatory Т cells: the missing solution to preserve the immune functions of Т lymphocytes designed for cell therapy. Blood. 2006 г. 107 (1), стр.: 381-388. ZHOU G. ET AL. Amplification of tumor-specific regulatory Т cells following therapeutic cancer vaccines. Blood. 2006 г. 107 (2), стр.: 628-636. TANAKA H. ET AL. Depletion of CD4+CD25+regulatory cells augments the generation of specific immune Т cells in tumor-draining lymph nodes. Journal of immunotherapy. 2002 г. 25 (3), стр.: 207-217. LIND D.S. ET AL. Expansion and tumour specific cytokine secretion of bryostatin-activated T-cells from cryopreserved axillary lymph nodes o * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458985C1 (ru) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью |
| RU2603079C2 (ru) * | 2015-03-16 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Способ активации цитотоксических лимфоцитов человека |
| RU2820974C1 (ru) * | 2017-03-03 | 2024-06-14 | Ф1 Онколоджи, Инк. | Способы и композиции для трансдукции и экспансии лимфоцитов и регуляции их активности |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2634167A1 (en) | 2007-06-28 |
| CA2634167C (en) | 2015-06-16 |
| US20090297489A1 (en) | 2009-12-03 |
| AU2006328943A1 (en) | 2007-06-28 |
| US8206702B2 (en) | 2012-06-26 |
| ZA200805416B (en) | 2012-03-28 |
| KR20080091772A (ko) | 2008-10-14 |
| KR101391395B1 (ko) | 2014-05-02 |
| WO2007071388A1 (en) | 2007-06-28 |
| RU2008129788A (ru) | 2010-01-27 |
| EP1966369A1 (en) | 2008-09-10 |
| JP5244610B2 (ja) | 2013-07-24 |
| EP1966369B1 (en) | 2010-10-06 |
| AU2006328943B2 (en) | 2011-07-21 |
| JP2009520477A (ja) | 2009-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2399382C2 (ru) | Улучшенный способ увеличения числа опухоле-реактивных т-лимфоцитов в иммунотерапии онкологических больных | |
| US8007785B2 (en) | Method for treating colon cancer with tumour-reactive T-lymphocytes | |
| US8211425B2 (en) | Method for treating disseminated cancer | |
| KR101518409B1 (ko) | 단핵세포 증량 방법 | |
| KR101909879B1 (ko) | 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물 | |
| US7951365B2 (en) | Method for expansion of tumour-reactive T-lymphocytes for immunotherapy of patients with specific cancer types | |
| KR20000049096A (ko) | 혼합 림프구와 조합된 종양세포를 사용하는 암 면역요법 | |
| AU2003261546A1 (en) | A cell therapy method for the treatment of tumors | |
| Khammari et al. | Adoptive T cell therapy combined with intralesional administrations of TG1042 (adenovirus expressing interferon-γ) in metastatic melanoma patients | |
| NZ569105A (en) | A method for the expansion of tumor-reactive CD4 positive T-helper and CD positive T-lymphocytes | |
| Rohrer et al. | Human breast carcinoma patients develop clonable oncofetal antigen-specific effector and regulatory T lymphocytes | |
| US8101173B2 (en) | Method for treating urinary bladder cancer | |
| Voutsas et al. | Ovarian malignant ascites-derived lymphocytes stimulated with prothymosin α or its immunoactive decapeptide lyse autologous tumour cells in vitro and retard tumour growth in SCID mice | |
| Ortegel et al. | Cytokine biosynthesis by tumor-infiltrating T lymphocytes from human non-small-cell lung carcinoma | |
| Ausiello et al. | Cytotoxic effectors in human peripheral blood mononuclear cells induced by a mannoprotein complex of Candida albicans: a comparison with interleukin 2-activated killer cells | |
| WO2011060205A1 (en) | Methods, compositions, and assays for determining the effect of an immune cell on a cell from an infectious or neoplastic disease | |
| Chakraborty et al. | Suppression of lymphokine-activated killer cell generation by tumor-infiltrating lymphocytes | |
| Karimine et al. | Lymphokine‐activated killer cell activity of peripheral blood, spleen, regional lymph node, and tumor infiltrating lymphocytes in gastric cancer patients | |
| Eisenthal et al. | Human tumor cells, modified by a novel pressure/crosslinking methodology, promote autologous lymphocyte proliferation and modulate cytokine secretion | |
| KR20210141411A (ko) | 지방조직에서 분리된 기질혈관분획의 수지상세포의 활성화 기능을 이용한 면역 반응 증진용 조성물 | |
| KAWAKAMI et al. | CD4+ T‐cell‐mediated cytotoxicity against staphylococcal enterotoxin B‐pulsed synovial cells | |
| Uchida | Clinical significance of autologous tumor killing (ATK) activity and its induction therapy in human cancer | |
| Levitskaya | The microenvironment of human neuroblastoma supports the activation of tumor-associated T lymphocytes | |
| Horiuchi et al. | Membrane‐associated Lymphotoxin Expression and Functional Analysis of Lymphokine‐activated Killer Cells Derived from Tumor‐infiltrating Lymphocytes | |
| Bågenholm | Local immune modulation for the treatment of malignant melanoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20110518 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161221 |