KR20080091772A - 암환자의 면역치료를 위한 종양 반응성 ｔ－림프구의개선된 증식방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 종양 반응성 T-림프구, 특히 CD4+ 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 및 활성화를 위한 개선된 방법을 개시한다. 상기 방법은 짧은 기간 내에 대규모의 종양 반응성 T-림프구를 제공하며, 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 성장을 특정 아집단으로 유도할 수 있는 가능성을 제공한다. 상기 방법은, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 생존을 촉진하기 위하여, 종양 유래의 항원 및 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질로 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구를 자극하는 제1 단계; 및 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 성장을 활성화하고 촉진하는 제2 단계를 포함하되, 상기 제2단계는 CD25 세포 표면 표지자(즉, IL-2R 표지자)가 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구 상에서 하향 조절될 때 개시된다.
종양 반응성 T-림프구, CD4+ T 보조 림프구, CD8+ T-림프구, 종양, 암
Description
본 발명은 종양 반응성 림프구, 특히 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 개선된 증식 및 활성화 방법에 관한 것이다. 상기 T-림프구는 CD4+ CD25+Hi 림프구는 아니며, 다시 말해, 본 발명은 조절 T-림프구를 커버하지는 않는다. 상기 림프구는 암 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
면역감시가설에 따르면, 면역 시스템은 성장하는 종양에 대해 계속적으로 감작하는데, 실험적인 증거는 이러한 개념을 강력히 뒷받침한다. 특정 종양 항원의 동정은 종양 면역요법에 대해 새로운 가능성을 열었고 많은 면역치료 시도가 현재 임상적으로 진행 중이다. 이들 가운데, 종양 항원-특이적 림프구의 입양전달(adoptive transfer)이 특히 유망해 보인다. 지금까지 이들 시도는 말초 혈관으로부터의 단핵 세포 또는 신규 종양 피검체로부터의 종양 침윤 림프구(TIL: tumour infiltrating lymphocyte)에 주로 근거하였다. 최근 악성흑색종 환자의 치료 시도에서, 증식된 TIL의 자가 전달 치료 시도는 51%까지의 객관적 반응률을 보인다고 보고되었다. TIL 세포는 수가 적으며, 종양으로부터의 면역억제 메커니즘으로 인하여 자주 무력(anergic)하게 되므로 증식이 일어나는데 오랜 주기(수 개월)가 걸린다. 또한, 상기 프로토콜은 CD8+ 세포독성 T 세포의 증식을 목표로 하는 것이며, 상기 세포는 미리 화학요법을 처리 받은 환자에 재주입되어야 하고, 또한, 상기 환자는 CD8+ T 세포의 생존을 위해 고 약량의 인터루킨-2도 처리되어야 하였다.
본 발명의 발명자들은 이전에 감시 림프절(sentinel lymph node)(이하, 간단히 "감시절"이라고도 칭함)과 같은 2차 림프 기관의 매우 한정된 미세환경 내에서 나이브(naive) T-세포의 활성화가 일어남을 밝혔다. 다시 말해, 상기 감시절은 면역 시스템이 종양 항원을 만나는 1차 장소라고 간주될 수 있다.
본 발명자들은 이전에 감시 림프절로부터 종양 반응성 T-림프구를 증식하는 일반적인 방법을 개시하였는데, 감시 림프절로부터 수득된 T-림프구를 배양하여 종양 반응성 T-림프구를 배양할 수 있음을 보였다. 상기 종양 반응성 T 림프구를 감시절이 제거된 환자에게 유효량을 투여함으로써 암을 치료하는데 사용할 수 있다.
종양 반응성 T-림프구의 투여를 포함하는 암 치료의 성공 여부는, 증식 단계 후에 수득된 종양 반응성 T-림프구의 양, 다시 말해, 환자에 주입 가능한 종양 반응성 T-림프구의 양, 상기 종양 반응성 T-림프구의 유효량을 수득하는데 필요한 시간 및 상기 증식 방법에 의해 수득된 종양 반응성 T-림프구의 특정 아집단(subpopulation)의 농도 및 비율과 같은 변수들에 달려있다.
따라서, 본 발명은 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 개선된 증식 방법을 개시하는데, 가능한 가장 짧은 시간 범위 내에서 높은 수의 종양 반응성 T-림프구를 수득하기 위하여 특정 배양 조건을 결정하고 최적화하였으며, T-림프구 상 및 배지 내에서의 특정 표지자(marker)를 증식 단계에서 관찰하였다. 또한, 본 발명은 특정 아집단으로 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 성장을 유도하는 방법도 동시에 제공한다. 상기 T-림프구는 CD4+CD25+Hi 림프구가 아니며 즉, 본 발명은 조절 T-림프구는 다루지 않는다.
전사인자 FoxP3를 발현하는 CD4+CD25Hi T-림프구는 조절 T 세포(Treg)로 간주된다. 상기 Treg은 T 보조 및 T 세포독성 세포의 활성화 및 증식을 억제함으로써 이들을 조절하는 특성을 가질 뿐만 아니라, Treg은 IFN-γ와 같은 유용한 Th1 사이토카인의 생성 및 방출을 억제한다. 따라서, 본 명세서에 제공되는 방법은 T 보조 세포 및 T 세포독성 T 세포의 증식을 촉진하고 Treg 세포의 증식을 억제하기 위하여 개발되었다.
본 방법에 의하여 가장 많이 생성되는 종양 반응성 T-림프구는 CD4+ 보조 T-림프구이다. 본 증식 방법의 목적 중 하나는 일부 관점에서 환자 자신의 면역 시스템의 자연적인 경로를 모방하는 것이며, 어느 정도 환자의 면역 시스템의 구성 성분들로 하여금, 항원이 MCHⅠ 또는 MCHⅡ에 의해 제공되느냐에 따라 우선 CD4+ 보조 T-림프구 또는 CD8+ T-림프구가 생성될지를 결정하도록 한다. 대부분의 경우, CD4+ 보조 T-림프구의 생성을 유도하는 클래스 Ⅱ MCH 분자에 의해 항원이 제공된다. 그러나, 일부 경우에 CD8+ T-림프구가 생성된다. 만일 CD4+ 보조 T-림프구가 생성된다면, 본 명세서에 기술된 바대로 더욱 증식될 것이지만, 본 방법은 또한 CD8+ 세포를 증식하는데에도 사용될 수 있다. 본 발명자들은 2개의 다른 단계를 포함하는 증식 방법이 비교적 짧은 시간 범위 내에서 높은 수의 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구를 수득하는데 특히 유용함을 확인하였는데, 상기 방법은 이하의 2 단계:
i) 종양 반응성 T-림프구의 생존을 촉진하기 위하여, 종양 유래의 항원 및 IL-2 수용체에 대한 효능 활성(agonistic activity)을 갖는 하나 이상의 물질로 종양 반응성 T-림프구를 자극하는 제1 단계; 및
ⅱ) 종양 반응성 T-림프구의 성장을 활성화하고 촉진하는 제2 단계를 포함하되,
상기 ii) 단계는 CD25 세포 표면 표지자(IL-2R 표지자)가 T-림프구 상에서 하향 조절(down regulation)될 때 개시된다.
또한, 상기 증식 방법은 환자로부터 분리된 단핵세포(monocyte)를 항원 특이적 세포로 사용하여 증식될 수 있다. 상기 단핵세포는, IL-4, GM_CSF 및 IL-3와 같은 사이토카인을 사용하여 성숙된 수지상 세포(dendritic cell)로 분화되고, 리포다당류와 같은 톨 유사 수용체(Toll like receptor) 자극제를 첨가하여 상기 수지상 세포가 활성화될 때 환자에 투여된다. 성숙하고 활성화된 수지상 세포를 항원 특이적 집단으로 이용하면 T 보조 세포 및 T 세포독성 T 세포의 증식을 촉진하고 강화할 수 있다.
용어의 정의
"종양 반응성 T-림프구(tumour-reactive T-lymphocyte)"란 종양 항원에 특이적이며 이를 인식하는 T 세포 수용체를 갖는 T-림프구를 의미한다.
"T 보조 세포(T helper cell)"란 활성화되는 경우에 후천성 면역 반응을 촉진하는 T-림프구를 의미한다.
"Th1 세포"란 활성화되는 경우에 IFN-γ와 같은 사이토카인을 사용하여 세포 매개 면역 반응을 촉진하는 T 보조 세포를 의미한다.
"Th2 세포"란 활성화되는 경우에 IL-4와 같은 사이토카인을 사용하여 체액성 면역 반응을 촉진하는 T 보조 세포를 의미한다.
"CD4+ 보조 T-림프구"란 CD4를 발현하지만 전사인자 FoxP3를 발현하지 않는 T-림프구를 의미한다.
"CD8+ T-림프구"란 CD8을 발현하는 T-림프구를 의미한다.
"조절 T-림프구(regulatory T-lymphocyte)"란 전사인자 FoxP3를 발현하여 후천성 면역 반응을 억제하는 T-림프구를 의미한다.
T-림프구의 "특이적 활성화(specific activation)"란 항원 특이적이며 MHC 제한적인 T-세포 수용체 매개의 활성화를 의미한다. 이와 대조적으로, T-림프구의 "비특이적 활성화"란 T-세포 수용체 특이성에 관계없는, 모든 T-세포들의 일반적인 활성화를 의미한다.
"종양 유래의 항원(tumour-derived antigen)"이란 종양 세포, 균질화될 수 있는 종양의 균질화물 또는 예를 들어, 정제, 천연, 합성 및/또는 재조합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 형태인 종양 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 망라한다. 상기 종양 유래의 항원은 원형상태 분자(intact molecule), 그의 단편 또는 원형상태 분자 및/또는 단편들의 다량체 또는 응집체일 수 있다. 적절한 폴리펩티드 및 펩티드의 예들은 약 5 내지 약 30 아미노산, 예를 들어, 약 10 내지 25 아미노산, 약 10 내지 20 아미노산 또는 약 12 내지 18 아미노산을 포함하는 것들이다. 만일 펩티드가 사용된다면, 배지 내의 최종 몰 농도는 약 0.1 내지 약 5.0μM, 예를 들어 약 0.1 내지 약 4.0μM, 약 0.2 내지 약 3.0μM, 약 0.3 내지 약 2.0μM 또는 약 0.3 내지 1.0μM이 사용될 수 있다. 상기 종양 유래의 항원은 자가의 것 또는 이종의 것일 수 있는데, 즉, 치료받을 환자의 것일 수도 있고 암으로 고통받는 다른 환자로부터 수득된 것일 수도 있다. 본 발명의 실시예에서, 발명자들은 자가의 변성된 종양 추출물을 사용하지만, 상술한 바와 같이 다른 공급원의 종양 유래 항원도 본 발명에 따른 방법에서 사용할 수 있다.
"제1 단계의 1일" 또는 예를 들어 "제2 단계의 5일"이란 다음과 같이 이해하여야 한다: 림프구가 회수(harvest)된 날을 0일로 기록한다. 제1 단계의 1일이란 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 적어도 하나의 물질과, 배지 및/또는 종양 유래의 항원을 첨가함으로써 증식이 개시된 날로 정의한다. 증식 단계 i)은 0일 또는 림프구 회수 후 2일째 내에 개시될 수 있다. 종양 유래 항원의 첨가에 의해 제2 단계가 개시된 날은 본 명세서에서 "제2 단계의 1일"로 기술한다.
"감시 림프절(sentinel lymph node)"이란 종양으로부터 림프 배액(lymphatic drainage)을 수용하는 최초 림프절을 의미한다. "메티넬 림프절(metinel lymph node)"이란 전이(metastasis)로부터 림프 배액을 수용하는 최초 림프절을 의미한다.
단계 i)
제1 단계 i)의 목적은 실질적으로 높은 비율의 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구를 함유하는 배지를 수득하는 것이다. 제1 단계는 "보육 단계(nursing phase)"로 여겨지는데, 종양 반응성 T-림프구가 생존하고 분할하게 된다. T-림프구의 공급원(체외 증식법을 위한 초기 물질)에 따라 비교적 거친 환경, 예를 들어, 암 세포에 의해 분비되는 인자들에 의한 억제 및 저해와 같은 환경에 맞추도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 증식 방법에 사용되는 초기 물질은 예를 들어, 감시 림프절 또는 메티넬 림프절과 같은 1차 종양 및/또는 전이로부터의 림프절 배액에서 수득된 림프구들의 혼합물일 수 있다. 이들은 수술 동안, 종양 또는 전이의 주위나 내부에 추적 물질(tracer substance)과 같은 림프절 정위기(locator)의 주입 등으로 동정될 수 있다. 상기 추적 물질과 같은 림프절 정위기가 림프 모세관 내로 이송되고 감시/메티넬절에서 축적됨으로써 종양 또는 전이 배액 림프절을 동정한다. 본 발명자들은 최근에 종양으로부터 배액을 수용하는 최초 림프절이 체외 증식을 위한 자연적인 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구가 잠재적으로 풍부한 공급원임을 밝혔는데, 이러한 림프절은, 종양 항원에 대해 감작되고 림프절 내에서 체내 증식을 겪은 상당한 양의 T-림프구를 포함할 수 있기 때문이다.
CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 또 다른 공급원은 암환자의 혈액, 예를 들어 말초 혈액일 수 있다. 상기 환자는 오랜 기간 동안 병을 앓아왔던 치료받지 않은 환자거나 이미 치료받은 환자일 수 있으며, 상기 환자들로부터 종양에 대해 감작된 말초 T-림프구를 수득할 수 있다. 다른 적절한 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 공급원은 골수, 비장 조직과 종양들을 포함한다.
그러나, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 초기 물질은 감시 림프절 또는 메티넬 림프절로부터 수득된다.
배지 내에서 증식될 T-림프구는 치료받을 환자로부터 수득될 수 있는데, 즉, 투여를 위해 수득된 특정 종양 반응성 T-림프구는 자신의 세포일 수 있다. 그러나, T-림프구는 또한 치료받을 환자 외의 다른 공급원, 예를 들어 다른 암 환자로부터 수득될 수 있다. 이러한 경우, 수용자 및 증식된 종양 반응성 T-림프구는 면역적으로 거부반응이 일어나지 않는 것이 바람직하다(또는 수용자는 다른 방법으로 상기 증식된 종양 반응성 T-림프구에 대해 면역 내성이 형성된다).
초기 물질의 공급원에 따라, 이는 다양한 림프구, 예를 들어 T-림프구, B-림프구, 항원 제시 세포, 종양 반응성 T-림프구 및 비활성화된/비반응성의 T-림프구와 같은 림프구들의 혼합물을 포함할 것이다. 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및 CD8+ T-림프구의 생존을 특이적으로 촉진시키기 위하여, 종양 유래의 항원 및 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질을 첨가한다.
상술한 바와 같이, 상기 제1 단계 i)은 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질을 첨가함으로써 개시된다. 이러한 물질의 작용은 IL-2 수용체를 통해 T-림프구를 자극하여 T-림프구의 세포 분할을 촉진함으로써 세포 사멸을 방지하는 것이다.
항원 특이적이며 MHC 제한적인 T-림프구의 활성화는 종양 세포 인식에 특이적인 유용한 T-림프구 집단의 클론 증식을 촉진한다. 이와 반대로, T-림프구의 비특이적인 활성화는 종양 세포의 인식과는 아무 관련 없는 부적절한 펩티드를 인식하는 T-림프구 클론의 증식을 유도하는데, 이로써 비특이적으로 증식된 T-림프구의 대부분은 종양을 인식하지 못한다.
본 발명은 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및 CD8+ T-림프구의 특이적인 활성화 및 성장을 촉진하는데 목적을 두고 있다. 특정 종양 항원에 대한 특이적인 활성화는, T-림프구를 활성화시키는 동일 종류의 종양을 가진 암 환자에게 T-림프구가 투여될 때 치료효과를 나타낼 수 있다.
비특이적으로 활성화된 T-림프구의 투여는 종양 관계성 T-림프구의 수가 적기 때문에 어떤 암에 대한 치료효과를 가질 확률이 없거나 매우 낮다.
본 발명의 일 구현예에서, IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은 효능제(agonist)이다. 이러한 물질들의 예로는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 어피바디(affibody) 및 이의 단편들, 융합 단백질, 작은 분자와 같은 합성 및/또는 유기 분자 및 자연적인 리간드를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 물질은 IL-2 수용체의 자연적인 리간드인 IL-2이다.
만일 IL-2가 사용된다면, 림프구의 자기사멸(apoptosis)을 줄이고 CD4+ 보조 종양 반응성 T-림프구의 집단을 증가시키기 위하여 저 약량(low dose)으로 첨가되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구현예에서, IL-2의 저 약량은 배지 내의 농도로 약 100IU/㎖ 내지 약 700IU/㎖, 예를 들어, 약 100IU/㎖ 내지 약 600IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 500IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 400IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 300IU/㎖ 및 약 100IU/㎖ 내지 약 200IU/㎖의 범위이다. 일 구현예에서, 첨가된 IL-2의 양은 240IU/㎖이다.
IL-2 이외의 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 다른 물질이 사용되는 경우, 이들 특정 약량은 IL-2의 상술한 약량에 의해 수득되는 효과와 상응하는 효과를 가져올 정도가 되어야 한다.
IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질의 추가적인 양이 세포 분할을 촉진하기 위한 최적 환경을 유지하기 위하여, 단계 i) 동안, 예를 들어, 단계 i)의 2일째, 3일째 또는 4일째마다 규칙적으로 첨가될 수 있다. '2일째, 3일째 또는 4일째마다'란, IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질이 최초로 첨가된 후, 즉, 단계 i)이 개시된 후 2일째, 3일째 또는 4일째에 시작하여 단계 i) 동안 2일째, 3일째 또는 4일째마다 첨가되는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 단계 i) 동안 규칙적으로 첨가될 수 있는 물질은 IL-2의 효능제이다. 바람직한 일 구현예에서 상기 물질은 IL-2이다.
IL-2와 같이, IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질들의 추가적인 약량은, 예를 들어 상술한 기간 내에서 2일째, 3일째 또는 4일째마다 규칙적으로 첨가될 수 있다.
상기 증식의 제1 단계 i) 내에서 보다 더 중요한 단계는 종양 항원을 인식하는 T-림프구 수용체를 발현하는 T-림프구, 즉 종양 반응성 T-림프구의 세포 분할을 촉진하기 위하여 종양 유래의 항원을 첨가하는 단계이다.
종양 항원을 첨가하는 최적의 시기는 림프구의 공급원에 따라 좌우된다. 상기 림프구가 감시 림프절과 같은 림프절 또는 종양으로부터 유래된 경우, 상기 림프구는 종양 세포와 아주 가까이에 위치하여 면역-억제를 받았을 가능성이 있어, 종양 항원 제시시의 증식에 반응하는 T-림프구의 능력을 촉진하기 위하여 IL-2와 같은 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질과 함께 수일간 배양할 필요가 있다. 따라서, 이런 경우 종양 유래의 항원은 상기 제1 단계 i)의 2일째 내지 5일째를 포함하는 날 내에, 예를 들어, 2일째, 3일째, 4일째 또는 5일째에 첨가되는 것이 바람직하다.
만일 림프구가 혈액으로부터 유래한 것이라면, 종양 유래의 항원은 제1 단계 i)이 개시될 때, IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질과 함께 첨가될 수 있는데, T-림프구가 종양 세포에 의해 상술한 바와 같은 면역-억제를 받지 않았기 때문이다. 따라서, 혈액이 사용되는 경우, 종양 유래의 항원은 단계 i)이 개시됨과 동시에 필수적으로 첨가되거나 개시 후 최대 2일 내에 첨가된다.
종양 균질화물과 같은 종양 유래의 항원은 B-림프구, 수지상 세포 및 대식세포와 같은 초기 물질 내에 존재하는 항원 제시 세포에 의하여 엔도시토시스(endocytosis)되어 처리될 가능성이 높다. 대부분의 경우, 상기 종양 유래의 항원은 CD4+ 보조 종양 반응성 T-림프구의 세포 분할을 유도하는 클래스 Ⅱ MCH 분자들에 의해 제시될 것이다. 그러나, 교차 제시(cross presentation)에 의하여, 엔도시토시스로 세포 내 이입된 항원은 클래스 Ⅰ 포켓 내에서 처리되고 제시되어 CD8+ T-림프구의 활성화를 가져올 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 증식 방법의 목적 중 하나는 일부 관점에서 환자 자신의 면역 시스템의 자연적인 경로를 모방하는 것이고, 어느 정도 환자의 면역 시스템의 구성 성분들로 하여금, 항원이 MCHⅠ 또는 MCHⅡ에 의하여 제시됨에 따라, CD4+ 또는 CD8+ 림프구의 생성을 결정하도록 하는 것이다. 대부분의 경우, CD4+ T-림프구의 생성을 유도하는 클래스 Ⅱ MCH에 의하여 항원이 제시될 것이지만, 일부 경우에는 CD8+ T-림프구가 생성된다.
단계 ⅱ)
제2 단계 ⅱ)의 목적은 단계 i)에 의하여 수득된 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구를 활성화시키고 증식시키는 것이며, 그들을 원하는 경로로 유도함으로써 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 특정 아집단을 수득하는 것이다.
본 발명자들은 단계 ⅱ)를 개시하는 최적의 시기를 결정하는 한 방법은, T-림프구가 재자극을 수용하기에 충분한 시기를 정확히 판단하기 위하여, T-림프구 상의 CD25 세포 표면 표지자의 발현을 관찰하는 것임을 발견하였다. 본 발명자들은 T-림프구 상의 CD25 발현이 하향 조절될 때 단계 ⅱ)가 개시되어야 하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. CD25는 림프구가 활성화 신호를 받아들였음을 알려주는 활성화 표지자이다. 만일 림프구가 이미 신호를 받아들였음을 의미하는 T-림프구 상의 CD25 발현이 높을 때 제2 단계가 개시된다면 세포 사멸이 일어날 수 있다.
CD25의 하향 조절이란 상당수의 T-림프구 집단이 극소수의 CD25 표지자를 발현하거나 실질적으로 CD25표지자를 발현하지 않는 것으로 정의된다. 바람직한 실시예에서, CD25의 하향 조절이란 5% 미만의 T-림프구 집단이 CD25를 발현하는 것, 즉, 배지 내 95% 이상의 T-림프구가 CD25를 전혀 발현하지 않는 것으로 정의된다. CD25를 발현하는 5% 이하의 T-림프구는 대개 조절 CD4+ T-림프구인데, 이는 CD25를 매우 지속적으로 발현한다. 또한, T-림프구 집단은 조절 T-림프구의 특이적 표지자인 Foxp3 표지자를 거의 발현하지 않거나 실질적으로 발현하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 일 구현예에서, Foxp3의 하향 조절이란 5% 미만의 T-림프구 집단이 Foxp3를 발현하는 것, 즉, 배지 내 95% 이상의 T-림프구가 Foxp3를 전혀 발현하지 않는 것으로 정의된다.
CD25 이외에, 제2 단계를 개시하는 최적의 시기를 결정하기 위하여 그 발현을 관찰하기에 적절한 다른 표지자들도 있다.
이러한 표지자들의 예로는 초기 활성화 표지자 CD69 및 T-림프구에 대한 활성화 표지자인 MCHⅡ를 들 수 있다. CD69 및 MCHⅡ의 발현은 T-림프구의 "활성화 프로그램"이 이미 가동되었으며 세포들은 추가적인 자극에 반응할 수 없음을 의미하기 때문에, 이들 두 표지자들은 제2 단계가 개시되기 전에 하향 조절되어야 함이 바람직하다. 하향 조절이란 5% 내지 10% 미만의 T-림프구 집단이 CD69 및/또는 MCHⅡ를 발현하는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 증식 방법의 단계 ⅱ)의 증식에서, 항-CD4 항체가 T 보조 세포를 배지 내의 종양 세포들로부터 가능한 한 분리하기 위하여 사용된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 다이나비드(Dynabeads(등록상표))와 같은 제품들이 상기 증식 방법의 단계 ⅱ)의 증식을 촉진하기 위하여 사용된다. 다이나비드(등록상표) CD3/CD28의 사용은 활성화 신호를 갖는 림프구를 제공하며 또한 배지 내의 종양 세포들로부터 가능한 한 분리를 위하여 사용될 수 있다. 다이나비드(등록상표) CD3/CD28은 단계 i) 동안 항원 특이적으로 증식된 T-림프구에 결합하는데, 이들 세포들은 이제 자기적으로(magnetically) 농축될 수 있다. 초기 항원 특이적 활성화가 T-림프구 클론 증식을 개시하고 유발한 이후, 단계 i)이 비특이적 T-림프구 클론의 활성화를 제공하지 못하므로 다이나비드(등록상표) CD3/CD28 재자극이 추가로 클론 증식을 촉진할 것이다.
단계 ⅱ)의 정확한 개시점은 림프구가 특정 표지자들의 바람직한 발현을 획득한 시기에 따라 다를 수 있겠지만, 제2 단계 ⅱ)는 대개 제1 단계 i)의 17일째부터 23일째를 포함하는 날 내에, 예를 들어, 17일째, 18일째, 19일째, 20일째, 21일째, 22일째 또는 23일째에 대개 개시된다. 다시 말해, 림프구가 표지자들의 바람직한 양과 조합을 발현하는 시기는 대개 제1 단계 i)의 17일째부터 23일째를 포함하는 날 내에서 관찰된다.
T-림프구의 증식, 즉, 단계 i) 및 ⅱ)는 적절한 배지 내에서 주로 일어난다. 환자에게 질환들이 전달되는 위험을 제거하기 위하여 무혈청 배지 또는 자가 혈청을 이용하는 것이 바람직하다. 적절한 표준 배지의 예들은 AIMV 배지, RPMI 1640, DMEM 및 MEM을 포함한다. 그러나, 아미노산, 스테로이드, 비타민, 성장 인자, 사이토카인 및 미네랄을 포함하는 다른 배지들도 사용될 수 있다.
상기 증식의 두 단계들 동안, 상기 세포들은 배지 내의 적절한 세포 밀도를 유지하기 위하여 수 개의 배양 용기로 분할될 수 있다. 증식 단계에서의 T-림프구의 배지 내 밀도는, 약 300만 내지 약 600만 세포/㎖인 것이 바람직하다.
증식 동안, 배지 조절(conditioning)이라고 불리는, 배지를 새로운 배지로 교체하는 단계가 또한 요구될 수 있다. 배지를 분할하고 배지를 조절하는 시기는, 세포의 형태 및 세포 배지 밀도(약 600만 세포/㎖를 초과해서는 안된다) 또는 적절한 지시약, 예를 들어 페놀 지시약 등을 포함하는 배지에 기초하여 결정될 수 있다. 배지 내에 지시약이 포함된 경우, 배지를 분할하고 조절하는 시기는 배지의 색에 기초하여 결정될 수 있다. 만일 페놀레드가 지시약으로 사용된다면, 배지의 색이 황색으로 변하는 시기, 즉, 배지의 pH가 산성으로 바뀌고 있는 중임을 알려주는 시기에 배지를 분할하거나 조절하여야 한다. 본 발명에 사용되는 배지를 조절하는 적절한 계획은 배지의 1/4 내지 1/2, 예를 들어 배지의 1/3을 3 내지 9일마다, 가령 l주일에 한번 교체하는 것이다.
본 명세서에 기술된 특정 조건들 이외에 다른 변수들은 림프구 배지의 성장을 위한 표준적인 조건들, 예를 들어 37℃의 온도 및 5%의 CO2 등과 같은 조건들이 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 제2 단계 ⅱ)는 종양 반응성 T-림프구의 클론 증식을 촉진하기 위하여, 상기에서 정의한 바와 같은 종양 유래의 항원을 종양 반응성 CD25 음성 T-림프구를 활성화하기 위한 T-림프구에 첨가함으로써 개시된다.
본 발명의 일 구현예에서, 항원 제시 세포(APC)가 종양 유래의 항원과 함께 T-림프구에 첨가된다. 항원 제시 세포(APC)는 단핵세포와 같은 백혈구, 대식세포 및 B 세포와 같은 림프구를 포함한다. 이들 다양한 종류의 세포들은 특정 T-림프구 수용체에 의해 인식되는 형태로 항원을 제시하는 능력을 공통으로 가진다. 백혈구는 치료될 환자로부터 수득된 혈액, 림프액, 골수, 림프기관 조직 또는 조직 배양액 등으로부터 단리된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 APC 세포는 항원 제시 B-세포 및/또는 단핵세포를 포함하는, 방사광으로 조사된 말초혈액 백혈구이다. 첨가되는 APC의 양은 림프구 배지 내 농도로, 약 50만 APC/㎖ 내지 약 500만 APC/㎖ 범위 내에 있으며, 예를 들어 약 100만 APC/㎖ 내지 약 400만 APC/㎖, 약 100만 APC/㎖ 내지 약 300만 APC/㎖, 또는 약 100만 APC/㎖ 내지 약 200만 APC/㎖의 범위를 가진다.
종양 반응성 T-림프구의 클론 증식을 촉진하기 위하여 종양 유래의 항원을 T-림프구에 첨가하는 것 이외에, 상기 제2 단계 ⅱ)는 종양 반응성 T-림프구의 증식을 원하는 아집단으로 유도하는 기능을 갖는 특정 구성성분의 첨가를 포함한다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구의 생성을 위한 방법을 제공한다. CD4+ 보조 T-림프구는 항원이 주조직적합성 복합체 클래스 Ⅱ 분자에 결합된 경우에 종양 항원을 인식하고 결합한다. 활성화된 CD4+ 보조 T-림프구는 면역 시스템의 다른 세포들, 가령 다른 림프구들을 자극하는 사이토카인, 단백질 및/또는 펩티드를 분비한다. 가장 흔히 분비되는 사이토카인은 인터루킨-2(IL-2)인데, 이는 강력한 T-림프구 성장 인자이다. 활성화되고 증식된 CD4+ 보조 T-림프구는 2개의 주요 아형 세포, Th1 및 Th2 세포들로 분화할 수 있는데, 이들은 생성되는 특정 사이토카인에 기초하여 정의된다. Th1 세포는 인터페론-감마 및 인터루킨 12(IL-12)를 생성하고, 반면에 Th2 세포는 인터루킨-4, 인터루킨-5 및 인터루킨-13을 생성한다. Th1 T-림프구는 세포독성 T 림프구(Tc), NK 세포, 대식세포 및 단핵세포의 활성화를 촉진한다고 알려져 있는데, 이들 모두는 암세포를 공격하고 종양에 대하여 일반적으로 방어할 수 있다.
Th1 및 Th2형의 T-보조(CD4+) 림프구는 기억 세포(memory cell) 및 효과기 세포(effector cell)로 분화될 수 있다. 기억 T-보조(CD4+) 림프구는 최초로 마주친 항원에 특이적이며, 2차 면역 반응시 소환되어 종양 항원에 대해 보다 신속하고 광범위한 반응을 일으킬 수 있다. 인간에 있어, 림프구가 적어도 20년간; 아마도 평생 존속한다는 증거가 있다. 효과기 CD4+ T-림프구는 사이토카인 및 INF-감마를 생성하는 활성 세포이다.
효과적인 암 치료를 위하여, Th1형의 종양 반응성 T-림프구의 투여는 특히 유용한데, 상기 Th1형은 세포독성 T 림프구(Tc), NK 세포, 대식세포 및 단핵세포의 활성화를 촉진한다고 알려져 있으며, 이들 모두는 암 세포를 공격하고 종양에 대해 일반적으로 방어할 수 있기 때문이다. 다시 말해, 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구를 생성하기 위한 방법에 관한 본 발명의 일 구현예 및 추가의 구현예에서, 본 방법에 의해 생성된 Th2형의 T-림프구 비율은 30% 이하, 예를 들어 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 0%인데, 즉, 종양 반응성 CD4+ 보조 T-림프구의 최소 70%는 Th1형이며, 예를 들어, 최소 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95% 또는 100%이다.
따라서, 제2 단계는 T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 상기 IL-12R의 상향 조절은 T 세포의 IL-12에 대한 수용 편이성을 증대시키고 IL-12 사이토카인 활성화를 최적화시켜 최대의 STAT-4 신호를 가능하게 함으로써 림프구를 Th1 세포로 편향되게 유도하여 IFN-γ가 생성되도록 한다.
T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질은 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은 효능제이다. 이러한 물질들의 예로는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 어피바디 및 이들의 단편들, 융합 단백질, 작은 분자와 같은 합성 및/또는 유기 분자들 및 자연적인 리간드들을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 물질은 인터페론 수용체의 자연적인 리간드, 즉, 인터페론-α와 같은 인터페론이다.
T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질, 예를 들어, 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질을 첨가하는 최적 시기는 배지 내 IL-12의 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 상기 물질은, IL-12의 농도가 단계 ⅱ)의 1일째의 IL-12의 농도와 비교하여 최소 1배, 예를 들어, 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배 또는 최소 5배가 증가된 경우에 첨가하는 것이 바람직하다. 대부분의 경우, IL-12의 상기와 같은 농도 증가는 제2 단계 ⅱ)를 개시한 후 2일째부터 4일째를 포함하는 날 내에, 예를 들어, 2일째, 3일째 또는 4일째에 관찰될 것이다.
Th2형의 종양 반응성 T-림프구의 생성을 실질적으로 회피하기 위하여, 상기 제2 단계는 Th2 형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 물질들의 예는 인터루킨 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β(후자는 인터루킨이 아님)를 중화할 수 있는 물질인데, 이들 4개 모두는 Th2 사이토카인 특성을 확립하고, Th1 사이토카인 생성의 하향 조절을 하는데 요구되는 것들이다.
이러한 물질들의 예로는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 가용성 수용체, 항체, 어피바디 및 이들의 단편들, 융합 단백질, 작은 분자와 같은 합성 및/또는 유기 분자, 및 자연적인 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 물질은 인터루킨과 결합하여 이를 중화하는 항체, 예를 들어, 항 IL-4 항체, 항 IL-5 항체 및/또는 항 IL-10 항체, 및 TGF-β의 가용성 수용체(예를 들어, TGF-β 수용체 Ⅰ 및 Ⅱ)와 TGF-β의 결합 단백질(예를 들어, LAP 및/또는 LTBP)로부터 선택된다.
Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어, IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질은 제2 단계 ⅱ)의 1일째에 첨가될 수 있다. 그러나, 항체들이 고가이기 때문에 항체의 첨가는, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질이 첨가된 후에 후속 단계로 진행될 수도 있는데, 예를 들어, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질의 첨가 후 1일째, 2일째 또는 3일째 등에 첨가될 수도 있다.
상기 중화 물질은 인터루킨을 중화하기에 충분한 양, 예를 들어, 중화될 인터루킨의 양보다 10 내지 100배(몰비) 많은 양으로 첨가되어야 한다. 항체를 사용할 경우에는 통상적으로 배지 내 최종 농도가 약 2 내지 약 4ng/㎖이 되어야 한다. 다른 종류의 중화 물질에 있어서는, 항체에 대해 상술한 농도와 동일한 효과를 나타내는 최종 농도가 사용되어야 한다.
Th2형 T-림프구의 성장 억제를 유지하기 위하여, Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어, IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질의 추가적인 양을 단계 ⅱ) 동안 규칙적으로 첨가할 수 있는데, 예를 들어, 단계 ⅱ)의 2일째, 3일째 또는 4일째마다 첨가할 수 있다. '2일째, 3일째 또는 4일째마다'라는 의미는 Th2 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질이 최초 첨가된 후 2일째, 3일째 또는 4일째에 시작하여, 단계 ⅱ) 동안 Th2 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질을 2일째, 3일째 또는 4일째마다 첨가한다는 의미이다.
또한, 단계 i)에서 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질, 예를 들어 효능제와 같은 물질의 추가적인 양을 세포 분화를 촉진하는 최적 조건을 유지하기 위하여 단계 ⅱ) 동안 규칙적으로, 예를 들어, 단계 ⅱ)의 2일째 내지 4일째마다, 즉, 2일째, 3일째 또는 4일째마다 첨가할 수 있다. 규칙적으로 첨가될 상기 물질의 투여량은 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질, 가령 IL-2의 첨가를 위하여 단계 i)에서 언급한 최적 범위 내에 있다.
Th1형 종양 반응성 T-림프구의 생성을 유리하도록 하기 위하여, 제2 단계 ⅱ)는 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 물질들의 예로는 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질들을 들 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 물질들은 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능제일 수 있다. 이러한 효능제들의 예들은 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 어피바디 및 이들의 단편들, 융합 단백질, 작은 분자와 같은 합성 및/또는 유기 분자 및 자연적인 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 물질들은 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체의 자연적인 리간드, 예를 들어, 각각 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21이다.
IL-12의 효과는 IL-12R을 자극하여 STAT 경로를 유도하는 IFN-γ를 활성함으로써 Th1 림프구의 활성화를 촉진하는 것이다. IL-21의 기능은 T-림프구의 Th1형으로의 증식, 활성화 및 성장을 강화하는 것이다.
IL-7 및 IL-15 모두는 T-림프구의 항상성 증식을 촉진함으로써 활성화된 Th1으로 조정된 T-림프구의 수를 증가시키는 작용을 한다.
Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질을 첨가하는 최적 시기는 T-림프구가 변형이 가능한 시기이다. 만일 T-림프구가 변형이 가능하지 않은 시기에 상기 물질이 첨가된다면, 첨가로 인한 효과는 없을 것이며, 즉, Th1형 T-림프구의 성장은 지지되지 않을 것이다. Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 물질들, 예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질들을 첨가하기 위한 최적 시기를 결정하기 위하여, T-림프구에 의한 INF-γ 생성이 관찰될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질, 예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질은 IFN-γ의 농도가 제2 단계 ⅱ) 개시의 IFN-γ의 농도와 비교하여 증가하였을 때 첨가되어야 한다.
일 구현예에서, IFN-γ 농도의 증가는, 제2 단계 ⅱ) 개시의 IFN-γ 농도와 비교하였을 때, IFN-γ 농도가 최소 1배, 예를 들어, 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배 증가한 경우에 증가하였다고 판단될 수 있다. 간혹 이러한 증가는 배지 내의 IFN-γ의 함유량이 배지 1㎖ 당 최소 100pg(피코그램), 예를 들어, 최소 150pg/㎖, 최소 200pg/㎖ 또는 최소 250pg/㎖인 경우와 관련이 있을 수 있다.
Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 물질, 예를 들어, IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질을 첨가하는 최적 시기를 결정하는 경우, CD4+ T-림프구 상에 우선적으로 상향 조절되는 활성화 표지자인 CD25 및 CD69의 발현을 관찰하는 방법도 가능하다. 여기서 상향 조절이란, T-림프구가 활성화 신호를 받았음을 나타내는, CD4+ T-림프구 상의 CD25 및 CD69의 발현이 단계 ⅱ)의 1일째와 비교하였을 때, 최소 약 40% 내지 약 60% 또는 그 이상의 CD4+ T-림프구가 CD25 및 CD69를 발현함을 의미한다.
일반적으로, Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 물질을 첨가하는 최적 시기는, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질 및 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 물질을 첨가하는 단계들 뒤에 위치한다. Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 물질을 첨가하는 보다 구체적인 최적 시기는 제2 단계 ⅱ)를 개시한 후 5일째 내지 8일째 사이, 예를 들어, 5일째, 6일째, 7일째 또는 8일째이다.
IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21이 첨가되는 경우, 배지 내의 이들 각 물질의 농도는 예를 들어 250IU/㎖와 같이, 약 150IU/㎖ 내지 약 300IU/㎖의 범위 내에 있어야 한다. 상술한 특정 물질들 이외의 다른 물질들이 사용되는 경우, 그 최종 농도는 상술한 범위 내의 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21의 첨가가 가져오는 동일한 효과를 일으키는 최종 농도로 배지 내에 첨가되어야 한다.
상술한 바와 같이, Th1형의 CD4+ 종양 반응성 T-림프구를 수득하기 위한 T-림프구의 증식에 있어서는 본 발명의 방법이 우선적으로 사용된다. 본 발명의 또 다른 관점은 종양 반응성 T-림프구를 증식하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법을 사용함으로써 비교적 높은 양의 기억형 T-림프구가 수득될 것이라는 점이다. 암 치료에 있어서, 치료받을 환자가 높은 양의 효과기 종양 반응성 CD4+ T-림프구를 얻는 것이 물론 중요한데, 왜냐하면 이들은 -상술한 바와 같이- 암세포를 공격하고 종양에 대하여 대개 방어할 수 있는 세포독성 T-림프구(Tc), NK 세포, 대식세포 및 단핵세포의 활성화를 촉진하기 때문이다.
그러나, 상당한 양의 기억 종양 반응성 CD4+ T-림프구를 동시에 투여함으로써 환자는 종양의 재발 또는 1차 종양의 전이에 대하여 평생 보호될 수 있다.
따라서, 본 발명은 기억 T-림프구의 제조 방법에 관한 것이다. 통상적으로, 본 발명에 따른 종양 반응성 T-림프구의 배양이 증식될 때, 약 35% 내지 약 90%의 기억형 종양 반응성 T-림프구, 예를 들어, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80% 또는 약 60% 내지 약 70%의 기억형 종양 반응성 T-림프구를 수득한다. 본 발명자들은 단계 i)의 림프구가 종양 항원이 첨가되기 전에 재생되도록 한 점 및 증식 속도가 비교적 느린 점이 효과기 림프구에 비해 높은 비율의 기억 림프구 형성을 유도한다고 추측한다.
상술한 바와 같이, T-림프구 상의 세포 표면 활성화 표지자 CD25 및 CD69의 발현이 본 방법의 중요 단계를 언제 개시할지, 예를 들어 제2 단계 ⅱ)를 언제 개시할지를 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 단계 i) 및 단계 ⅱ) 동안 CD25 및 CD69의 발현을 연속적으로, 예를 들어, 2일째, 3일째 또는 4일째마다 관찰하는 것이 유리할 것이다.
본 방법의 목적 중 하나는 환자에게 투여하는데 사용될 수 있는 다수의 특정 CD4+ 종양 반응성 T-림프구를 수득하는 것이기 때문에, 종양 반응성 T-림프구는 증식 단계의 종료로 접어드는 어느 시점에서 회수될 수 있다. 종양 반응성 T-림프구를 회수하는 최적 시기는 T-림프구 상의 CD25 발현이 하향 조절될 때이며, 여기서 하향 조절이란 5% 이하의 CD4+ T-림프구 집단이 CD25를 발현하는 것으로 정의된다. 또한 회수할 최적 시기는 생성된 IFN-γ의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. IFN-γ 생성은 초기 IFN-γ 생성과 비교하여 최소 2배 증가, 예를 들어 최소 3배, 최소 4배 또는 최소 5배 증가되어야 하며, 이는 일반적으로 배지 내에서 최소 100pg/㎖의 IFN-γ 농도에 해당된다.
통상적으로, 상기 작업은 제2 단계 ⅱ)가 개시된 후 10일째 내지 14일째를 포함하는 날 내에 실시되는데, 즉, 통상적으로 세포들을 제2 단계 ⅱ)가 개시된 후 10일째 내지 14일째를 포함하는 날 내에 회수한다.
따라서, 본 발명에 따른 종양 반응성 T-림프구의 증식을 위한 전체 공정은 일반적으로 약 25일 내지 약 45일이 소요되는데, 예를 들어, 약 26일 내지 약 44일, 약 27일 내지 약 43일, 약 27일 내지 약 42일, 약 27일 내지 약 41일 및 약 27일 내지 약 40일이 소요된다.
CD25 표지자가 하향 조절되는 시점에서 종양 반응성 T-림프구를 회수하는 대신에, 단계 ⅱ)의 과정을 추가적으로 한번 이상 더 실시할 수 있다. 이는 발현 방법에 의해 수득된 종양 반응성 T-림프구의 양이 암 환자에 투여될 만큼의 유효량이 아니라고 판단되거나, 환자가 화학요법으로 치료받는 중이라면 화학요법 치료가 종료되기까지 T-림프구의 투여를 연기하는 것이 득이 된다고 판단되는 경우라면 실시하는 것이 유리할 수 있다. 종양 반응성 T-림프구가 단계 ⅱ)를 한번 이상 추가적으로 반복해야 할지를 결정하기 위하여, 생성된 IFN-γ의 농도 및/또는 수득된 종양 반응성 T-림프구의 전체 수 및/또는 CD25의 발현을 조사해 볼 수 있다. 배지 내의 IFN-γ 농도가 30pg/㎖ 이하, 예를 들어 20pg/㎖ 이하인 경우 및/또는 전체 T 세포의 수가 불충분한 경우에, 단계 ⅱ)의 추가적인 반복은, 대다수의 T 세포가 CD25 음성(즉, T-림프구 집단의 5% 미만이 CD25를 발현)이어서 재자극을 받을 수 있을 때 개시될 수 있다.
세포를 회수한 후, 종양 반응성 T-림프구를 통상의 방법, 예를 들어 피콜 배지와 같은 밀도 구배 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 종양 반응성 T-림프구를 회수하고 정제한 후, 일부의 종양 반응성 T-림프구를 적절한 동결 배지에 동결하여 보관할 수 있다.
치료 방법
상술한 바와 같은 개선된 증식 방법에 의하여 수득된 종양 반응성 T-림프구는 종양 원인 질환으로 고통받는 환자를 치료하거나 종양을 가진 환자에 있어 종양이 호전되는 방법에 사용될 수 있는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 종양 반응성 T-림프구의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법은 어떤 해부학상 위치 내의 상피, 중간엽 또는 배아 원인의 어떤 고형 종양, 예를 들어 상피 종양으로는 가령, 유방암, 대장암, 췌장암, 방광암, 소장암, 전립선암, 자궁경부암, 외음부암, 난소암을; 중간엽 종양으로는 예를 들어 관절, 뼈, 근육 및 힘줄에서의 육종, 및 림프종과 같은 혈액암을; 배아 종양으로는 예를 들어 기형종(teratoma)을 치료하는데 사용될 수 있다.
종양 반응성 T-림프구의 유효량은 특정 종류의 림프구, 효과기 T-림프구에 대한 기억 T-림프구의 비율 및 질환의 중증 정도에 따라 다르게 규정된다. 그러나, 평균적으로 최소 1000만, 예를 들어, 최소 2000만, 최소 3000만, 최소 4000만, 최소 5000만, 최소 6000만, 최소 7000만 또는 최소 8000만의 종양 반응성 T-림프구가 투여될 수 있다. 본 발명자들은 단일 투여로 투여되는 종양 반응성 T-림프구의 양에 대하여 최대량은 확인하지 않았다.
바람직한 일 구현예에서, 투여를 위한 종양 반응성 T-림프구는 효과기 T-림프구 및 기억 T-림프구의 조합을 포함한다. 보다 구체적으로, 기억형 종양 반응성 T-림프구의 양은 약 35% 내지 약 90%, 예를 들어 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80% 또는 약 60% 내지 약 70%이며, 효과기 T-림프구의 비율은 약 10% 내지 약 65%, 예를 들어 약 20% 내지 약 50% 또는 약 30% 내지 약 40%이다.
종양 반응성 T-림프구는 환자에게 비경구적 투여, 예를 들어 정맥, 동맥, 척추 또는 복강 내 투여를 하기에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
종양 반응성 T-림프구가 비경구적으로 투여될 때, 이들은 등장 매질(isotonic medium), 즉 혈액과 동일한 긴장성(tonicity)을 갖는 매질 내에서 제형화될 수 있으며, 상기 매질은 세포들의 응집을 방지하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 적절한 매질의 구체적인 예는 3%까지의 인간혈청알부민, 예를 들어 2%까지의 인간혈청알부민 또는 1%까지의 인간혈청알부민을 포함하는 0.9% NaCl 용액이다. 정맥 내 투여를 위해서는, 투여될 조성물 내의 종양 반응성 T-림프구의 매질 내 농도는 약 50만 림프구/㎖ 내지 약 400만 림프구/㎖, 예를 들어 약 50만 림프구/㎖ 내지 약 300만 림프구/㎖, 약 50만 림프구/㎖ 내지 약 200만 림프구/㎖ 또는 약 100만 림프구/㎖ 내지 약 200만 림프구/㎖의 범위 내에 있다.
종양 반응성 T-림프구를 포함하는 조성물은 단일 투여량 또는 복합 투여량으로 투여될 수 있다. 1 내지 2시간에 걸쳐 주입될 수 있다.
상기 치료 방법은 질환의 중증도에 따라 1회 또는 반복적으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 치료는 질환의 재발시 반복될 수 있다.
본 발명에 따른 치료는 다른 어떤 적절한 암 치료를 보충적으로 사용할 수 있다. 이러한 보충적 치료는 상기 림프구의 투여 전이나 투여와 동시에 또는 투여 후에 이루어질 수 있으며, 이러한 보충적 치료에 통상적으로 사용되는 주기마다 투여될 수 있다. 보충적 치료의 적절한 예로는 화학 요법 등을 들 수 있다.
키트
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 사용되는 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 T-림프구의 배양을 위한 배지를 포함한다. 상기 배지는 적절한 무혈청 배지, 예를 들어 AIMV, RPMI 1640, DMEM 또는 MEM일 수 있다.
또한, 상기 키트는 종양 반응성 T-림프구를 자극하고, 활성화하며 유도하기 위한 하나 이상의 물질들을 포함한다. 이러한 물질들의 예로는 종양 유래의 항원, IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질, Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 물질 및/또는 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 물질을 들 수 있다.
보다 구체적으로, 이러한 물질들은 IL-2, 인터페론-α, 항-IL-4 항체, 항-IL-5 항체, 항-IL-10 항체, IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21일 수 있다.
상기 키트는 또한 정맥 내 투여에 적절한 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 투여 전에 종양 반응성 T-림프구의 집단과 혼합될 수 있다.
상기 키트는 또한 상술한 것과 같은 림프절 정위기(locator)를 포함하는 하나 이상의 주사기를 포함할 수 있다.
상기 키트는 또한 사용 지침서, 예를 들어 컴퓨터 소프트웨어 형태의 지침서를 포함할 수 있다.
도 1은 감시절이 종양 항원에 대한 T 세포의 제시 및 T 세포 반응성의 활성화를 위한 자연적인 1차 장소임을 도시한 도면;
도 2는 초기에 감시절 림프구가 종양 항원 및 저 약량의 IL-2로 활성화됨으로써 활성화 표지자 CD25가 활성화되고 발현됨을 나타내고(윗 그래프), 활성화 단계인 단계 Ⅰ의 종료는 CD25를 발현하는 CD4+ T 세포의 수가 감소함에 따라 정해지며(아래 그래프), 5% 미만의 CD4+ T 세포가 CD25를 발현하는 경우, 단계 Ⅱ가 항원의 재자극으로 개시되는 것을 나타낸 도면;
도 3은 단계 Ⅰ 및 단계 Ⅱ의 활성화 결과 CD4+ T 보조 세포가 증식되고 농축되었음을 도시한 도면;
도 4는 단계 Ⅰ에서 대다수의 세포들이 나이브 CD62L+ 세포 또는 활성화된 CD69+CD62L+ 세포임을 도시한 것으로, 단계 Ⅱ 후에, 대다수의 세포들은 CD62L- 세포이며, 기억 및 효과기 CD4+ T 보조 세포들로 구성되고, CD62L-세포들은 우선적인 림프절 귀소 분자를 발현하지 않으며, 따라서 비림프기관 내의 염증 구역을 탐색하는 것을 나타냄;
도 5는 단계 Ⅰ에서 종양(종양 침윤 림프구:TIL), 감시절(SN) 및 관련 없는 림프절(LN)로부터 자극받은 초대 세포가 상당한 양의 IFN-γ를 생성함을 나타낸 도면;
도 6은 단계 ⅱ) 후의 증식 후에, 항원 의존적 IFN-γ 생성에 있어서 투여량 의존적인 증가가 있음을 예시한 도면;
도 7은 TCR Vβ 발현의 선택적인 농축으로 조사한 경우에, 증식 및 활성화 프로토콜이 항원 특이적 T 세포 클론의 증식을 촉진함을 예시한다.
도 8a 내지 8d는 환자 #5의 CT 스캔 사진으로, 종양 반응성 T-림프구의 주입 이후, 환자는 환자의 양쪽 간엽 사이에 위치한 간암 전이가 전체적으로 호전되었으며(간 수술로 치료 불가능 판정을 받은 암전이), CEA 농도가 정상화되었고, 복수가 사라졌으며 육체적으로 건강하고 규칙적으로 운동을 하고 있는 상태를 나타냄;
도 9a 내지 도 9f는 환자 #10의 스캔 사진으로, 종양 반응성 T-림프구의 주입 이후, 환자의 간암 전이와 복수액은 호전되었고, 환자는 매우 건강한 상태이며 추가의 사진은 안정적인 병변 상태임을 나타냄;
도 10a 내지 도 10h는 환자 #12의 스캔 사진으로, 종양 반응성 T-림프구의 주입 후 석 달이 지난 상태인데, 환자는 간 및 암에서의 전이가 호전되었고, CEA 농도도 5.9로 거의 정상치에 이르렀으며(정상: <4.0), 복수가 사라졌고, 환자는 임상적으로 건강한 상태를 나타냄;
도 11은 증식의 개시(A) 및 종료(B) 시점에서 CD25 및 전사인자 FoxP3의 발현을 위해 염색된, CD4+ 발현에 이른 T-림프구를 나타낸 도면으로, 초기(그래프 A)에, 4.8%의 CD4+ T-림프구가 FoxP3 및 높은 농도의 CD25를 발현하여 Treg으로 동정되고, 증식의 종료에서는 매우 적은 수의 Treg이 0.3%로 존재한 것(그래프 B)을 나타냄.
실시예
1
종양 반응성 T-림프구의 증식
감시절 기술을 사용하여 수술 전에 감시절을 동정하였다. 즉, 1㎖의 페이턴 트 블루 다이(Patent blue dye)(Guerbet, Paris)를 주사하여, 종양 주위의 장막(serosa) 내 표면에 분포되게 하였다. 5 내지 10분 내에, 1 내지 3개의 장간막 림프절이 청색으로 착색되었고, 이들 감시절을 봉합사(suture)로 표지하고 제거하였다(참조: 도 1). 또한, 종양으로부터 떨어진, 감시 장간막 림프절이 아닌 림프절 하나를 동정하고 대조구로 사용하기 위해 제거하였다.
감시절 및 비감시 림프절을 반으로 절개하고, 1㎜ 두께의 슬라이스를 중심 및 주변으로부터 취하였다. 상기 림프절의 나머지는 통상의 절차에 따른 조직병리학적 검사를 하기 위해 보내졌다. 또한, 가장자리가 침윤된 샘플을 포함하는 종양의 일부를 연구 목적으로 제거하였다.
세포 배양
단계 Ⅰ, 초기 활성화
감시절 재료를 얼음 상에 보관하고 즉시 AIMV(등록상표)(Invitrogen) 배지를 사용하여 계속적으로 조심히 다루었다. 루즈핏(loose fit) 글래스 균질기에서 가볍게 균질화하여 감시절 림프구의 단일 세포 현탁액을 수득하였으며, 다음에 균질화 세포들을 배지로 2번 세척하였다. 상기 감시절 림프구를 세포 배양 플라스크에 400만 세포/㎖의 농도로 두었으며, 인터루킨-2(IL-2)(Proleukin(등록상표), Chiron)를 240IU/㎖의 농도로 첨가하였다.
5부피(w/v)의 2×PBS를 넣은 울트라 투락스(Ultra Turrax)로 균질화하고 97℃에서 5분간 변성하여 자가 종양 추출물을 제조하였다. 상기 세포 배양 개시 후 3 내지 4일째에 자가 종양 추출물을 1/100의 농도로 첨가하였다. 장기간의 배양 동 안, 상기 세포를 37℃ 및 5% CO2 환경의 세포 배양기 내에 두었으며, 3 내지 4일마다 IL-2를 240IU/㎖ 첨가하였다.
단계 Ⅱ, 활성화 및 증식
18 내지 22일 후에, CD25 발현에 대하여 상기 세포 배양을 관찰하였다. CD25 발현 세포 수가 5% 이하로 감소되었을 때, 자가 종양 추출물을 1/100의 농도로 첨가함으로써 상기 세포를 단계 Ⅱ에서 재자극하였다(참조: 도 2). 효과적인 항원 제시를 위하여, Ficoll-Paque PLUS(American Biosciences, GE Healthcare)를 사용하여 자가 PBMC를 회수하고 2500 rad로 조사하여 상기 세포 배양에 첨가하였다. 재자극 후 3일째, 100-500IU/㎖ 농도의 인터페론-α(Introna) 및 2㎍/㎖ 농도의 항 IL-4 항체를 첨가하였다. 5 내지 8일 후, IFN-γ를 생성하는 Th1 세포의 유도를 촉진하기 위하여 증식에 IL-12(4ng/㎖)를 첨가하였다.
환자에게 주입하기 전날에, 상기 배지 내의 생존 세포를 회수하기 위하여 세포 배지를 Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences, GE Healthcare)를 사용하여 정제하였다. 주입 당일, 상기 세포를 생리 식염수(Natriumklorid Baxter Viaflo 9mg/㎖, Baxter)로 2번 세척한 후, 100-200㎖의 생리 식염수 및 1% 인간혈청알부민(Baxter)을 포함하는 이송용 백에 옮겼다. 주입 전에 미생물의 존재 유무를 검사하였다. 전문적인 의료 감독하에서 1-2시간에 걸쳐 세포를 주입하였다.
면역학적 평가
추가의 면역학적 평가를 삼중수소로 표지된 티미딘이 혼입된 증식 분석법을 사용하여 수행하였다. 이를 위해, 감시절 림프구를 분주한 액을 준비하였으며, 루즈핏 글래스 균질기 내에서 약한 압력으로 비-감시절 림프구의 단일 세포 현탁액을 수득하였고, 말초 혈액 백혈구를 Ficoll-Paque PLUS(American Biosciences, GE Healthcare)로 정제하였다.
각 세포들을 잘 섞어주고 2.5% 우태아 혈청(FCS)(Life technologies)을 포함하는 RPMI 1640(Life technologies)으로 2번 세척하였다. 최종적으로, 각 세포들을 10% 인간 AB 혈청(Sigma), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Sigma) 및 1% 글루타민(Sigma)을 포함하는 RPMI 1640 증식 배지로 잘 섞어주었다. 림프절 세포 및 정제된 PBL은 96웰 플레이트 내에서 3×105 세포/웰의 농도로 사용되었으며, 종양 균질화물을 1/100, 1/10로 희석한 것 또는 Con A 10㎍/㎖(Sigma)로 자극하고, 이를 3회 반복하였다. 세포를 회수하기 18시간 전에 1μCi의 3H-티미딘/웰(Amersham)을 첨가하여 5일째, 6일째 및 7일째에 증식을 측정하였다. 샘플들을 신틸레이션 계수기에 넣어 측정하였다.
세포 배양 초기에, IFN-γ 분비의 측정을 위하여, 림프절 세포 및 PBL을 3×105 세포/웰의 농도로 96웰 플레이트 내에 준비하고, 종양 균질화물을 1/10 및 1/100로 희석한 것 또는 Con A 10㎍/㎖(Sigma)으로 자극하고 이를 3회 반복하였다. 분비된 IFN-γ의 양은, 각 3회씩의 수집된 샘플 내의 배양 상등액 상에서 ELISA(인간 IFN-γ Duoset, R&D Systems)로 측정되었다(참조: 도 5). 세포 배양이 종료되었을 때, 샘플의 상등액을 제거하고 IFN-γ 및 IL-4 분비를 ELISA(인간 IFN-Duoset 및 인간 IL-4 Duoset, R&D Systems)로 3회 반복하여 측정하였다(참조: 도 6a 및 6b).
유세포
분석
감시절, 비-감시절, PBMC 및 종양으로부터의 세포에 대하여 초기에 유세포 분석기(Flow cytometry)를 사용하여 세포 특성을 분석하였다. 유세포 분석을 위하여, 배지 내의 감시절로부터 획득된 림프구 샘플을 2주 내지 3주마다 취하였다. 세포들을 2% FCS와 0.05% NaN3(FACS 완충액), 및 면역 세포 아집단과 림프구 활성화를 위한 표지자에 대한 항체가 첨가된 PBS 내에 30분간 배양하였다(도 3, 도 4 및 도 5 참조). CD69, HLA-DR, CD45RA, CD25 표지자들에 대해선, 형광의 이소티오시아네이트(FITC)가 결합된 항체들이 사용되었으며; CD62L, CD19, CD45RO, CD56 표지자들에 대해선, 피코에리트린(PE)이 결합된 항체가 사용되었고; CD8, CD3 표지자들에 대해선, 페리디닌-클로로필-단백질(PerCP)이 결합된 항체가 사용되었으며; CD4, CD14, CD8 표지자들에 대해선, 알로피코시아닌(APC)이 결합된 항체가 사용되었다.
Vβ-레퍼토리를 베타 마크 키트(Beta mark kit)(Beckman Coulter)를 사용하여 조사하였는데, 5×105 세포수/튜브가, FITC, PE 및 이중색의 FITC-PE가 결합된 TCR Vβ 항체들의 혼합물을 포함하는 각 8개의 10㎕ 바이알 내에서 착색되었으며, 각 튜브에 CD8 PerCP 및 CD4 APC를 첨가하였다(참조: 도 7).
실시예
2
종양 반응성 T-림프구의 투여로 인한 대장암의 치료
대장암 환자로부터의 감시 림프절 및
메티넬
림프절의 동정 및 제거
대장암 진단을 받은 평균 연령이 62세인 6명의 여자 및 10명의 남자, 즉 총 16명의 환자를 조사하였다. 환자들은 조직병리학적으로 Duke's C 또는 D로 분류되었다. 또한, 궤양, 혈관이나 주위 신경조직으로의 침투와 같은 공격적인 종양 특성을 갖는 Duke'B에 해당되는 환자도 5명이 있었다. 환자 #7 및 #14는 이전에 대장암으로 인해 외과수술로 치료받았으나 현재 재발되어 간으로 전이된 상태이다. 지방 윤리 위원회가 본 조사를 승인하였으며, 각 환자들은 충분한 설명에 입각한 동의를 표시하였다.
감시절 또는 메티넬절의 동정은 외과수술시에 이루어졌다. 종양 및 장간막의 검사를 용이하게 하기 위하여, 복강 유착을 분할하여 대장 종양 장소를 이동가능하도록 하였다. 페이턴트 블루 다이(Guerbet, Paris)를 주입하니 종양 주위의 장막 내에 표면적으로 분포되었다. 5분 이내에, 1 내지 3개의 장간막 림프절이 청색으로 착색되었으며, 이들 감시절을 봉합사로 표시하고 절제가 완료되었을 때 떼어내었다. 종양으로부터 떨어진, 비-감시 장간막 림프절도 동일한 방법으로 실험하였다.
감시 림프절 및 비-감시 림프절을 반으로 절단하고 1mm 두께의 슬라이스를 중심 및 주변으로부터 취하였다. 림프절의 나머지는 통상적인 방법에 따른 조직병리학 검사를 위해 보내졌다. 가장자리가 침윤된 일부를 포함하는 종양 한편을 항원 제조에 사용하였다.
그 후, 림프절로부터 수득된 림프구를 실시예 1에 기술된 바와 같이 증식하였다.
종양 반응성 T-림프구의 투여
16명의 환자들에게 실시예 1에 기술된 바와 같이 증식된 자가 림프구를 주입하여 치료하였다. 평균적으로 7470만 개의 활성화되고 클론에 의하여 증식된 T 세포를 주입하는 방법으로 투여하였다. 발열, 오한, 무기력, 중증의 수액정체, 폐부종 또는 호흡 곤란과 같은 독성의 부작용은 발견되지 않았다.
사후 평가(
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사후 평가는 3 내지 6개월마다 실시하는 임상 검사 및 CEA 농도 조절을 포함하였다. III기 내지 IV기의 환자들은 추가로 흉부 및 복부의 컴퓨터 단층촬영으로 검사받았다. 환자들은 평균 13개월(범위: 5-20개월) 동안 정기적으로 방문하였는데, 사후 평가 시간의 중앙값(median)은 13.5개월이었다. 자가 림프구 주입으로 치료받은 16명의 환자들 중 8명은 진단에서 원격 전이(distant metastasis) 판정을 받은 환자들이었다. 4명의 환자들은 재발로 인하여 주입 시술을 받았으며, 그들 중 3명은 현재 재발의 징후가 없다. 1명의 환자는 고립성 간암 전이로 인하여 수술을 받았으며 그 후로 현재까지 재발이 없는 상태이다. 도 8 내지 도 9에 도시되었듯이, 양측 간엽에 위치한 간암 전이를 가진 1명의 환자(간의 외과수술에 의한 치료불가 판정을 받은 환자)는 종양 반응성 T-림프구의 주입 이후에 간암 전이가 전체적으로 호전되었으며 또한 CEA 농도도 정상화되었고, 복수도 사라졌으며 현재 육체적으로 건강하며 규칙적으로 운동을 하고 있는 상태이다. 또 다른 간암 전이 환자 1명도 주입 이후에 간암 전이 및 복수액이 호전되었다(도 10, 도 11 및 도 12 참조). 한 환자는 주입 후 3개월째에 간 및 폐에서의 전이가 호전되었으며( 도 13, 도 14, 도 15 및 도 16 참조), CEA 농도도 5.9로 거의 정상화되었고(정상: <4.0), 복수도 사라졌으며 현재 임상적으로 건강한 상태이다.
결과
대장암 또는 고립성 대장암 간 전이를 가진 16명의 환자들은 남부 스톡홀름 종합 병원에서 수술받았으며 본 연구에 포함되었다. 종양의 최초 장소는 맹장에 3개, 상부 대장에 4개, 하부 대장에 1개, S상 결장에 7개 및 직장에 1개이었다. 7명은 우측 반결장 절제술을, 1명은 좌측 반결장 절제술을, 7명은 S상 결장 절제술을, 그리고 1명은 직장 절제술을 시술받았다. 2명의 환자들은 이전에 직장 절제술 및 S상 결장 절제술로 수술받았는데; 현재 이들은 간암 전이로 인한 부분적인 간 절제술을 받았다. 1명의 환자는 2군데의 복부 위치에 재발이 일어났었으며 이전에 맹장에서의 종양으로 인해 수술을 받았었다. 우리의 수술에서, 전이를 림프관으로 배액하는 두 감시절이 동정되었는 데, 하나는 대장 장간막에, 다른 하나는 소장의 장간막에 있었다. 장간막이 있는 연결된 회장과 결장 사이의 구역을 추가적으로 절제하였다.
모든 환자에 있어, 종양 주변에 페이턴트 블루를 주입함으로써 수술시에 1 내지 3개(평균: 2.1개)의 감시절이 동정되었다. 1차 결장 절제를 한 환자들로부터는 평균 15.8개의 림프절이 각 표본으로부터 회수되었다. 이들 림프절의 조직병리학적 검사 이후에 5명의 환자들은 Duke's C로, 5명의 환자들은 Duke's B로 분류되었는데, 이들 모두는 병리해부학상의 검사에서 신경 및 혈관 내부를 따라 종양 세포가 성장하므로 고위험 종양으로 분류되었다. 5명의 환자들은 원격 전이를 갖고 있었으며, 암전이 절제시에 Duke's D로 분류되었다. 이들 중 2명의 환자는 고립성 간 전이를 갖고 있었다. 또한, 미세전이의 검출을 위하여, 감시절을 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 및 대장암 종양에 의해 발현되는 사이토케라틴 20에 대한 항체로 분석하였다. 유세포 분석기에 의한 림프절의 사이토케라틴 20 분석은 한 경우를 제외하고는 병리해부학적 진단(도시 생략)과 일치하였는데, 상기 제외된 한 경우는, (조직병리학적 분석에 따른) 거짓 음성의 감시절이 사이토케라틴 20 FACS 분석에서는 양성으로 나왔던 경우였다.
감시절은 종양을 림프관으로 배액하는 최초 림프절이므로 림프절 전이의 1차 장소이지만(Dahl et al), 상기 감시절은 또한 면역 시스템의 활성화를 위한 1차 장소이다. 종양 세포, 세포 잔해, 괴사 세포 및 항원 제시 세포들이 상기 감시절에 축적되고, 이곳에서 종양에 대하여 유도되는 T 세포의 제시, 활성화 및 클론 증식이 일어난다. 본 발명자들은 감시절로부터 획득된 림프구의 체내 증식된 T 세포 집단을 체외 세포 배양, 증식 및 주입을 위하여 이용하였다.
감시절로부터 획득된 림프구는 외과수술 동안 효과적으로 회수될 수 있는, 종양 항원에 대하여 활성화되고 클론에 의하여 증식된 T 세포의 집단이다. 세포독성 T 세포에 초점을 맞추고 있는 최근의 면역치료 시도와는 대조적으로, 본 발명자들의 목적은 체내에서 T 보조 세포의 클론 증식이 개시된 것을 체외에서 강화시키기 위한 프로토콜을 만드는 것이었다. T 보조 세포는 세포독성 T 세포의 효과적인 기능 및 기억 세포의 형성을 위하여 필요하다고 생각된다. 또한, 섬세포(islet cell) 항원을 대상으로 하는 T 세포 수용체 형질전환 시스템에서, Th1 세포를 주입 하면 β 세포가 파괴되고 당뇨를 일으키기에 충분하다는 것이 확인되었다. 감시절로부터 획득된 림프구를 체외 배양하여 Th1 활성화 및 T 보조 세포의 클론 증식이란 결과를 얻었는데, 이는 특징적인 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 높은 생성과 제한된 TCR Vβ 레퍼토리의 증가에 의하여 알 수 있다. T 세포를 증식하는데 사용된 종양 균질화물은, CD4+ T 보조 세포의 활성화를 일으키는 클래스 II 제시를 위한 항원 제시 세포에 의해 엔도시토시스되고 처리될 것이며 T 보조 세포 증식을 돕는다. 교차 제시에 의하여, 엔도시토시스로 세포 내 이입된 항원은 클래스 Ⅰ 포켓 내에서 처리되고 제시되어 CD8+ 세포독성 T 세포의 활성화를 가져올 수 있다. 흥미롭게도, 일부 경우에서 본 발명자들은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 클론 증식을 발견하였다.
감시절로부터 획득된 림프구의 증식 초기에서의 평균 세포 수는 1억740만 개였다(범위: 360만-5억900만, 중앙값: 7000만). 세포들은 유세포 분석기에 의하여 분석되었다. CD4+ 및 CD8+ 세포의 초기 비율은 평균 4.9(범위: 0.36-10, 중앙값: 5.4)였는데, 이는 말초 혈액에서의 CD4/CD8 비율(통상 범위: 1.0-2.5)과 비교하여 감시절에서 CD4+ T 보조 세포가 증식함을 나타낸다(참조: 도 2). 또한, B 림프구(CD19) 및 자연 살해(NK) 세포(CD56)가 감시절에 존재하였다(도시 생략). 세포들은 배지 내에 평균 36.1일(범위: 23-58일, 중앙값: 33일)간 놓여졌다. 세포들을 유세포 분석기를 사용하여 최소 매주 단위로 면밀히 관찰하였다. 초기에 세포들의 총 수가 감소하였다. B 세포 및 NK 세포들이 거의 완전히 사라졌으며 CD8+ T 살해 세 포의 수는 감소하였다. 상기 사용된 배양 절차는 CD4/CD8의 평균 비율이 92.5인 이후에는 주로 T 보조 세포의 증식을 촉진하였다. 자가 종양 항원으로 재자극을 하여 종양 반응성 T 세포의 클론 증식을 얻었는데, 이는 체외 배양 전후에 감시절로부터 획득된 림프구의 T 세포 수용체 Vβ 레퍼토리를 검사함으로써 평가되었다.
주입 전에, 증식된 T 세포를, Th1 사이토카인 IFN-γ 및 Th2 사이토카인 IL-4의 활성화 및 사이토카인 생성을 측정함으로써 자가 종양 항원에 대하여 기능적으로 테스트하였다. 체외 증식된, 감시절로부터 획득된 림프구가 종양 항원에 의한 자극에 대하여 반응하여 IFN-γ를 생성하고 IL-4를 생성하지 않거나 거의 미량만을 생성한다는 사실은 증식된 T 세포는 기능적이며 Th1 반응형임을 말해준다.
본 연구에서 Duke's D에 해당되는 환자 6명이 치료되었다. 2명의 환자들은 간 및 폐로의 전이로 인해 수술을 받은 Duke's D 단계였으며, 각각 표시된 간은 질환이 호전됨을 보여주었다(pat 5 및 12). 림프구의 주입 이후, 첫째 환자는, 양쪽 간엽 내에 위치한 간암 전이가 전체적으로 호전되었고(간의 외과수술에 의한 치료불가 판정을 받은 상태)(참조: 도 3), CEA 농도가 정상화되었으며, 복수가 사라지고 현재 건강한 상태이다. 환자 #12는 간 및 폐에서의 전이가 이전 상태로 회복되었음을 보여주며, CEA 농도가 거의 정상 상태인 5.9를 기록하였고(정상: <4.0), 복수가 사라졌으며 현재 임상적으로 건강한 상태이다. 여성 환자 #1은 간암 전이의 크기가 줄어들었으며, 초기에 CEA 농도가 감소하였고 복수가 사라졌으며 폐색전증으로 보이는 사인에 의하여 갑작스레 사망하였을 때(191일째) 아주 양호한 모습이었다. 2명의 Duke's D 환자들은 전이가 진행되지도 않고 CEA 농도도 증가하지 않는 안정적인 병변 상태를 보여준다. 본 연구에서 최고령의 여성 환자 #7은 5개월 동안 안정적인 병변 상태를 보여주었으나, 그 후 CEA 농도가 증가하기 시작하였으며 83세의 나이로 사망하였다. 부검은 실시하지 않았다. 한 환자는 Duke's C로서 수술받은 상태였지만 곧 간과 폐로 전이가 발전하였는데(Duke's D), 그러나 후속의 주입 치료 및 화학요법으로 인하여 폐 및 간의 전이가 호전되었음을 볼 수 있었으며 단지 CEA 농도만 약간 올라갔었다. Duke's C로 분류된 환자들 모두는 정상적인 CEA 농도를 가지며, 방사선학상으로나 임상학상으로 질환의 재발 징후는 찾아볼 수 없다. 4명의 Duke's B 환자들은 정상적인 CEA 농도를 가진 건강한 상태이며 질환의 재발 징후는 없다. 그러나, 공격적인 종양 성장을 갖는 Duke's B로 분류된 환자 #9는 질환 재발의 징후를 보이는데, CEA 농도(67)가 증가하였으며 간암 전이의 징후가 발견되었다.
주입된 T 세포의 존재를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 말초 혈액 내의 종양 추출물에 대한 T 세포 증식을 분석하였다. 상술한 바와 같이, 주입 전에 어떤 환자에서도 자가 종양 항원에 대한 말초 혈액 내의 T 세포 반응성을 증명할 수는 없었다. 그러나, 본 발명자들은 주입 후 10개월까지, 모든 조사된 환자들의 말초 혈액 내의 자가 종양 항원에 대한 T 세포 증식을 검출할 수 있었는데, 이는 클론에 의하여 증식된 순환하는 종양 반응성 T-림프구의 존재를 보여준다.
환자 특성의 요약
이하의 표는 본 조사의 모든 참가자들에 대한 것으로, 수술시의 Duke 분류를 따라 분류하였다.
| 참가자 특성 | ||||||
| 연령/ 성별 | Duke 분류 | 주입된 세포(×106) | CD4/ CD8a | IFN-γ (pg/㎖) | 생존기간 (개월) | 반응 |
| 67/M | B | 4 | 92/0.2 | ND | 31 | SD |
| 67/F | B | 8 | 15/51 | ND | 30 | SD |
| 71/M | B | 50 | 74/15 | 2091 | 29 | SD |
| 74/M | B | 63 | 64/22 | ND | 29 | SD |
| 66/M | B | 152 | 82/1.5 | 1411 | 27 | SD |
| 64/F | C | 110 | 64/25 | ND | 34 | SD |
| 58/F | C | 16 | 77/18 | 417 | 23 | SD |
| 61/F | D | 1 | 3.7/35 | ND | 6 | SD |
| 47/M | D | 80 | 24/16 | ND | 36 | CR |
| 54/M | D | 40 | 37/24 | ND | 36 | SD |
| 65/M | D | 270 | 82/15 | ND | 36 | CR |
| 42/F | D | 80 | 66/11 | ND | 33 | CR |
| 82/F | D | 40 | 98/0.1 | ND | 6 | SD |
| 74/M | D | 130 | 73/22 | 142 | 30 | CR |
| 33/M | D | 72 | 72/1.5 | 908 | 12 | PR |
| 66/M | D | 25 | 37/27 | 764 | 26 | PR |
| a) 숫자는 FACS으로 검출된 CD4+ 및 CD8+ 세포들의 백분율을 나타낸다. | ||||||
논의
본 발명자들이 알고 있는 바에 의하면, 대장암 환자에 있어서 감시절 또는 메티넬절에 기초한 면역요법은 지금까지 제시된 적이 없었다. 따라서, 본 발명이 감시절 또는 메티넬절로부터 획득된 림프구를 치료에 사용한 최초 시도이다. 본 연구와 예를 들어 고 약량의 IL-2를 사용한 치료(Rosenberg)와는 몇 가지 주요한 차이가 있다. 우선, 자가 종양 균질화물 및 APC에 의해 체외 자극된, 감시절로부터 획득된 림프구의 사용은 종양에 대한 매우 특이적인 세포 면역 반응을 일으킨다. 주입 전까지 1차 종양에 대해 높은 친화성을 갖는 T 세포만이 생존할 것이다. 환자에게 고 약량의 IL-2를 정맥 주사로 투여하는 체계적이고 일반적인 치료에 있어서는, 모든 림프구들이 동일하게 자극을 받을 것이므로 당연하게도 그들 중 매우 소량의 비율만이 종양 특이적이다. 본 발명자들은 감시절이 종양을 림프관으로 배액 하는 최초 림프절이기 때문에 종양 특이적인 림프구들이 과도하게 축적되어 있을 것으로 믿는다. 진성 종양을 인식하는 T 세포의 증식 및 주입은 대규모의 특이적 반응을 형성할 것이다. 둘째로, 고 약량의 IL-2 치료방법은 높은 독성 및 중증의 합병증과 장기간의 치료 기간 및 고비용을 야기한다. 본 발명에 따른 주입 방법은 합병증 없이 한 시간 정도면 치료가 끝나고 환자는 당일 날 퇴원하기도 한다. 셋째로, 본 프로토콜은 종양 침윤성 림프구로서 회수되는 세포독성 T 세포의 증식과는 대조적으로, 감시절로부터 T 보조 세포를 증식하는 방향으로 그 목적을 둔다.
본 연구는 신규로 단리된 감시절로부터 획득된 림프구가 자가 종양 균질화물에 대하여 체외에서 증식 능력을 가지며, 합병증 없이 환자에게 양자 면역요법으로서 주입될 수 있음을 보여준다. 본 연구는 증식된 감시절로부터 획득된 림프구를 사용한 치료는 여러 종류의 고형암 환자뿐만 아니라 위험성이 높거나 다발성의 대장암 환자의 치료 결과를 개선시킬 수 있다는 강한 암시를 준다.
Claims (84)
- i) 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 생존을 촉진하기 위하여, 종양 유래의 항원 및 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질로 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구를 자극하는 제1 단계; 및ⅱ) 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 성장을 활성화하고 촉진하는 제2 단계를 포함하되,상기 제2 단계는 CD25 세포 표면 표지자(즉, IL-2R 표지자)가 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구 상에서 하향 조절될 때 개시되는, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하향 조절은 5% 이하의 T-림프구 집단이 CD25를 발현하는 것으로 정의되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 T-림프구는 배지에 존재하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 배지는 AIMV 배지와 같은 무혈청 배지인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 단계 i)는 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질을 첨가함으로써 개시되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은 IL-2인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 IL-2는 저 약량, 예를 들어 배지 내의 농도로 약 100IU/㎖ 내지 약 700IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 600IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 500IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 400IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 300IU/㎖ 및 약 100IU/㎖ 내지 약 200IU/㎖로 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질의 추가적인 양은 단계 i) 동안 규칙적으로, 예를 들어, 단계 i)의 2일째, 3일째 또는 4일째마다 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은 IL-2인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제9항에 있어서, 첨가되는 상기 IL-2의 배지 내 농도는 약 100IU/㎖ 내지 약 700IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 600IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 500IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 400IU/㎖, 약 100IU/㎖ 내지 약 300IU/㎖ 및 약 100IU/㎖ 내지 약 200IU/㎖인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 제1 단계 i)의 2일째 내지 5일째를 포함하는 날에, 예를 들어, 2일째, 3일째, 4일째 또는 5일째에 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 단계 i)이 개시된 날 또는 그 후 최대 3일 내에 필수적으로 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 변성된 종양 균질화물인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구 의 증식 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 자가(autologous) 항원인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단계 ⅱ)는 제1 단계 i)의 17일째 내지 23일째를 포함하는 날에, 예를 들어, 17일째, 18일째, 19일째, 20일째, 21일째, 22일째 또는 23일째에 개시되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단계는 종양 반응성 CD25 음성 T-림프구를 활성화하기 위하여 T-림프구에 종양 유래의 항원을 첨가함으로써 개시되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 자가 항원인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 변성된 종양 균질화물인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 종양 유래의 항원은 종양 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, T-림프구에 종양 유래의 항원과 함께 항원 제시 세포를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 항원 제시 B-세포 및/또는 단핵세포를 포함하는 방사선 조사된 말초 혈액 백혈구인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단계 ⅱ)는 T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 하나 이상의 물질을 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질(들)은 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질(들)인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질(들)은 인터페론인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질(들)은 인터페론-α인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질, 예를 들어 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은, IL-12의 농도가 단계 ⅱ)의 1일째의 IL-12 농도와 비교하여 최소 1배, 예를 들어 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배 또는 최소 5배 증가될 때 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질, 예를 들어 인터페론 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은, 제2 단계 ⅱ)를 개시한 후 2일째 내지 4일째를 포함하는 날에, 예를 들어 2일째, 3일째 또는 4일째에 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단계 ⅱ)는 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질을 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질은 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질은 항 IL-4 항체, 항 IL-5 항체 및/또는 항 IL-10 항체인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질은 제2 단계 ⅱ)의 1일째에 첨가되는 방법.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질은, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질의 첨가 후에 후속 단계에서 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질은, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질의 첨가 후 특정한 날에 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질의 추가적인 양은 단계 ⅱ) 동안에 규칙적으로 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 하나 이상 의 물질, 예를 들어 IL-4, IL-5, IL-10 및/또는 TGF-β를 중화할 수 있는 하나 이상의 물질의 추가적인 양은 단계 ⅱ)의 2일째, 3일째 또는 4일째마다 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질의 추가적인 양은 단계 ⅱ) 동안에 규칙적으로 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은 단계 ⅱ)의 2일째, 3일째 또는 4일째마다, 예를 들어 3일째 마다 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질은 IL-2인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단계 ⅱ)는 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질을 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제40항에 있어서, Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질은 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 하나 이상의 물질은 IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-21로부터 선택되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질은, IFN-γ의 농도가 제2 단계 ⅱ)의 개시시의 IFN-γ 농도와 비교하여 증가하였을 때 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 IFN-γ의 농도가 증가하였다고 판단되는 경우는, 제2 단계 ⅱ)의 개시시의 IFN-γ 농도와 비교하여 IFN-γ의 농도가 최소 1배, 예를 들어 최소 2배, 최소 3배, 최소 4배 증가한 경우인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질은, CD25 및/또는 CD69가 하향 조절될 때 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 배지 내에 첨가되는 상기 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-7, IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질 각각의 농도는 약 150IU/㎖ 내지 약 300IU/㎖, 예를 들어 약 250IU/㎖인 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 하나 이상의 물질, 예를 들어 IL-12, IL-15 및/또는 IL-21 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 하나 이상의 물질은 제2 단계 ⅱ)의 개시 후 5일째 내지 8일째를 포함하는 날에, 예를 들어 5일째, 6일째, 7일째 또는 8일째에 첨가되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ 보조 T-림프구를 제조하기 위한 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T-림프구를 제조하기 위 한 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 기억 T-림프구를 제조하기 위한 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, Th1형 T-림프구를 제조하기 위한 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단계 i) 및 제2 단계 ⅱ) 동안, T-림프구 상의 세포 표면 표지자, 예를 들어 CD25 및/또는 CD69의 발현을 계속적으로 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제52항에 있어서, 제2 단계 ⅱ)에서 T-림프구 상의 CD25가 하향 조절될 때 T-림프구를 회수(harvest)하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제53항에 있어서, T-림프구 상의 CD25가 하향 조절되는 경우, T-림프구로 하여금 단계 ⅱ)를 추가적으로 한번 이상 더 실시하게 하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 하향 조절은 5% 이하의 CD4 양성 T-림프구 집단이 CD25를 발현하는 것으로 정의되는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구를 제2 단계 ⅱ)의 개시 후 10일째 내지 14일째를 포함하는 날에 회수하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구를 회수한 후 정제하는 것인, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계 ⅱ)에서 수득된 종양 반응성 T-림프구를 동결하는 단계를 추가로 포함하는, 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-림프구는 1차 종양 및/또는 전이를 림프관으로 배액하는 림프절로부터 유래된 것이거나 상기 T-림프구는 혈액으로부터 유래된 것인 종양 반응성 CD4+ T 보조 림프구 및/또는 CD8+ T-림프구의 증식 방법.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 따라 제조된 종양 반응성 T-림프구.
- 제60항에 있어서, CD4+ T-림프구인 종양 반응성 T-림프구.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 효과기 T-림프구인 종양 반응성 T-림프구.
- 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 기억 T-림프구인 종양 반응성 T-림프구.
- 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, Th1형 T-림프구인 종양 반응성 T-림프구.
- 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 따른 종양 반응성 T-림프구를 포함하는 약제학적 조성물.
- 종양 원인의 질환으로 고통받는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 종양 반응성 T-림프구의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 종양이 있는 환자에 종양이 호전되는 효과를 주기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 종양 반응성 T-림프구의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구는 정맥, 동맥, 척추 또는 복강 내 투여되는 것인 방법.
- 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여되는 종양 반응성 T-림프구의 양은 최소 1000만 개, 예를 들어, 최소 2000만 개, 최소 3000만 개, 최소 4000만 개, 최소 5000만 개, 최소 6000만 개, 최소 7000만 개 또는 최소 8000만 개인 것인 방법.
- 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여되는 종양 반응성 T-림프구는 효과기 T-림프구 및 기억 T-림프구의 조합인 것인 방법.
- 제70항에 있어서, 상기 효과기 T-림프구의 비율은 약 10% 내지 약 65%, 예를 들어 약 20% 내지 약 50% 또는 약 30% 내지 약 40%인 것인 방법.
- 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구는 자가 T-림프구인 것인 방법.
- 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구는 비자가(non-autologous) T-림프구인 것인 방법.
- 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 질환은 특정 해부학상 위치 내의 상피, 중간엽 또는 배아 원인의 특정 고형 종양으로부터 선택되며, 예를 들어 유방암, 대장암, 췌장암, 방광암, 소장암, 전립선암, 자궁경부암, 외음부암, 난소암과 같은 상피 종양; 관절, 뼈, 근육 및 힘줄에서의 육종, 및 림프종 등의 혈액암과 같은 중간엽 종양; 기형종(teratoma)과 같은 배아 종양으로부터 선택되는 것인 방법.
- 종양 원인의 질환 치료용 약물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따라 제조된 종양 반응성 T-림프구의 용도.
- T-림프구 배양을 위한 배지를 포함하는, 제1항 내지 제59항 및 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 키트.
- 제76항에 있어서, 종양 반응성 T-림프구를 자극하고 활성화하며 유도하기 위한 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 키트.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 배지는 AIMV, RPMI 1640, DMEM 또는 MEM과 같은 무혈청 배지인 것인 키트.
- 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구를 자극하고 활성화하며 유도하기 위한 하나 이상의 물질은, 종양 유래의 항원, IL-2 수용체에 대한 효능 활성을 갖는 물질, T-림프구 상의 IL-12R을 상향 조절할 수 있는 물질, Th2형 T-림프구의 성장을 길항할 수 있는 물질 및 Th1형 T-림프구의 성장을 촉진하는 물질로부터 선택되는 것인 키트.
- 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 반응성 T-림프구를 자극하고, 활성화하며 유도하기 위한 하나 이상의 물질은 IL-2, 인터페론-α, 항 IL-4 항체, 항 IL-5 항체, 항 IL-10 항체, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
- 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥 내 투여를 하기에 적절한 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
- 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 림프절 정위기를 포함하는 주사기를 추가로 포함하는 키트.
- 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 지침서를 추가로 포함하는 키트.
- 제83항에 있어서, 상기 지침서는 컴퓨터 소프트웨어 형태인 것인 키트.
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| US20020182730A1 (en) * | 1995-07-26 | 2002-12-05 | Micheal L. Gruenberg | Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease |
| IL126843A (en) | 1996-05-23 | 2007-06-17 | Scripps Research Inst | Mhc class ii antigen-presenting systems and methods for activating cd4+t cells in vitro |
| NZ507829A (en) | 1998-04-23 | 2004-03-26 | Arch Dev Corp | Vaccine adjuvants for immunotherapy of melanoma |
| AU4603499A (en) | 1998-06-26 | 2000-01-17 | Joergen Agnholt | Methods of expanding and selecting disease associated t-cells |
| AU5905400A (en) | 1999-07-14 | 2001-02-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for delivery and retention of active agents to lymph nodes |
| GB0007088D0 (en) * | 2000-03-23 | 2000-05-17 | Torsana A S | Detection of immunological memory determining the position of loci of pathologyand therapeutic t-cell conjugates |
| AU2001274934A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-12-03 | Nexell Therapeutics Inc. | Human circulating dendritic cell compositions and methods |
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| US20030228635A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-12-11 | Renovar, Inc. | Cell proliferation assays and methods |
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| Moviglia | Doctorate of Medicine Thesis | |
| Bågenholm | Local immune modulation for the treatment of malignant melanoma | |
| Ellebaek et al. | Journal of Translational Medicine |
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