ES2565578T3

ES2565578T3 - Vacunas contra el cáncer que contienen epítopos de antígeno oncofetal

Info

Publication number: ES2565578T3
Application number: ES03767221.9T
Authority: ES
Inventors: Joseph H. Coggin, Jr.; James W. Rohrer; Adel L. Barsoum
Original assignee: South Alabama Medical Science Foundation
Current assignee: South Alabama Medical Science Foundation
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-08-04
Publication date: 2016-04-05
Anticipated expiration: 2023-08-04
Also published as: EP1538900A2; WO2004012681A2; CA2492938C; CA2492938A1; US8709405B2; US20100183643A1; WO2004012681A3; US7718762B2; EP1538900B1; AU2003258081A8; AU2003258081A1; US20060165709A1; EP1538900A4

Abstract

Una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de antígeno oncofetal (AOF) distintos, no superpuestos que contienen epítopos que estimulan de manera específica los linfocitos T citotóxicos en un mamífero, y un transportador, en la que dicha composición no comprende ningún epítopo de AOF que estimule de manera específica los linfocitos T supresores.

Description

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maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); materiales de relleno (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes

(p. ej., almidón de patata o almidón glicolato sódico); o agentes humectantes o (p. ej., laurilsulfato sódico). Los comprimidos pueden recubrirse por procedimientos bien conocidos en la materia. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse adecuadamente para obtener una liberación controlada del(los) análogo(s) de AOF. Dichas composiciones pueden tener forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los epítopos de AOF pueden administrarse convenientemente en forma de una presentación en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, utilizando un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo de los epítopos de AOF y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los epítopos de AOF pueden formularse para la administración parenteral por inyección, p. ej., mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria,

p. ej., en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Los complejos también pueden formularse en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, p. ej., que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descritas previamente, los epítopos de AOF también se pueden formular como una preparación de liberación prolongada. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por consiguiente, por ejemplo, los epítopos de AOF pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos apropiados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Micelas, liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o transportadores de administración para fármacos hidrófilos, y son vehículos de administración adecuados para los epítopos de AOF de la presente invención. Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen los complejos no covalentes. El envase puede comprender, por ejemplo una lámina metálica o de plástico, tal como un envase blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.

Las composiciones inmunogénicas o inmunoterapéuticas de la presente invención contienen un vehículo en el que los péptidos de AOF/PRLi pueden suspenderse y, en general, permiten una liberación lenta de AOF/PRLi que induce un periodo mayor de inmunización. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención contendrán también normalmente un adyuvante. En realizaciones preferentes, el transportador también funciona como un adyuvante. Se ha utilizado adyuvante de Freund (AFI) en la inmunoterapia humana contra el melanoma que implica la inmunización con el péptido gp 100 (Rosenberg, S. A., J. C. Yang, D. J. Schwartzentruber, y col. 1998, Nat. Med. 4:321)). Sin embargo, este adyuvante no se utiliza ampliamente en protocolos de vacunación humana debido a sus efectos secundarios indeseables, tales como eritema e induración en el sitio de inyección. Microfluidizado (MF) 59 es una emulsión que consiste en escualeno al 5 % (v/v), Tween 80 al 0,5 % (v/v), y Span 85 al 0,5 % (v/v) en agua. Se ha referido que la adición de la emulsión del adyuvante MF59 en una subunidad convencional de antígeno de la gripe provoca inmunogenicidad potenciada sin aumento clínicamente significativo alguno de la reactogenicidad (R. Gasparini. T. Pozzi, E. Montomoli 2001, 17, 135-40). Véase, también Podda, A. 2001, Vaccine 19:2673.

Los dinucleótidos CpG no metilados, en un contexto de base determinado (motivos CpG) contenidos en oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN) estimulan los linfocitos B y los linfocitos CN (Krieg, A. M., A. K. Yi, S. Matson, T. J. Waldschmidt, y col.1995 CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374: 546)). También activan las células dendríticas (CDs) e inducen la maduración de las CD en células presentadoras de antígeno profesionales (CPAs) (Sparwasser, T., E. S. Koch, R. M. Vabulas, y col. 1998. Eur. J. Immunol. 28:2045; Hartmann, G., G. J. Weiner, A. M. Krieg. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 96:9305; Sparwasser, T., R. M. Vabulas, B. Villmow, y col. 2000, Eur. J. Immunol. 30:3591; Vabulas, R. M., H. Pircher, G. B. Lipford, y col. 2000, Immunol. 164:2372), potenciando así su capacidad para estimular los linfocitos T reactivos de antígeno in vitro e in vivo. Los motivos CpG que contienen ODN (referidos como CpG ODN) también estimulan los macrófagos para secretar citoquinas Th1, que son importantes en el desarrollo de una respuesta de LTC (Carson, D. A., E. Raz. 1997, 186:1621). Además, CpG ODN ha demostrado comportarse como un adyuvante de Ab y una respuesta de LTC se dirige contra la proteína completa atrapada en liposomas o péptidos restringidos por la clase I (Lipford, G. B., M. Bauer, C. Blank, y col. 1997. Eur. J. Immunol. 27:2340). La administración repetida de CpG ODN potencia la respuesta de LTC contra el péptido de LTC o proteína emulsionada en AFI y favorece la supervivencia en respuesta a la exposición al tumor en los dos protocolos de vacunación profiláctica y terapéutica (Davila, E., E. Celis. 2000, J. Immunol. 165:539). Se ha indicado la evidencia de la inducción de una respuesta de LTC específica contra un péptido de linfocitos T CD8+ en presencia de CpG ODN sin adyuvante adicional mediante la evaluación de la

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actividad citolítica de las células de los ganglios linfáticos tras la estimulación in vitro (Vabulas, R. M., H. Pircher, G.

B. Lipford, y col. 2000, J. Immunol. 164:2372).

Las citoquinas, tales como el ligando de la tirosina quinasa 3 de hígado fetal (ligando tq3hf o LF) que movilizan las CDs in vivo también expandirán diversos subgrupos de CDs in vivo (Pulendran, B., J. L. Smith, G. Caspary, y col. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 96:1036; Shurin, M. R., P. P. Pandharipande, T. D. Zorina, y col. 1997. Cell. Immunol. 179:174). Se ha demostrado que LF expande subconjuntos de CD distintas en ratones y aumenta en gran medida las respuestas de linfocitos T y B específicos de antígeno contra los antígenos solubles y tumores (Pulendran, B., J. L. Smith, M. Jenkins, y col. 1998, J. Exp. Med. 188:2075; Lynch, D. H., E. Andreasen, E. Maraskovsky, y col. 1997, Nat. Med. 3:625). Las células dendríticas poseen una capacidad única para estimular los linfocitos T vírgenes. La evidencia reciente sugiere que los distintos subconjuntos de CD dirigen diferentes clases de respuestas inmunitarias in vitro e in vivo. En los seres humanos, las CDs CD11c+ derivadas de monocitos inducen los linfocitos T para que produzcan citoquinas Th1 in vitro, mientras que las CDs derivadas de linfocitos T plasmocitoides CD11c-provocan la producción de citoquinas Th2. La administración del ligando tq3hf (LF) o factor estimulante de colonias de granulocitos (FEC-G) en voluntarios humanos sanos aumenta radicalmente los subconjuntos de CD distintos o precursores de CD en la sangre. LF aumenta tanto el subconjunto de CD CD11c+ (48 veces) como los precursores de CD CD11c-IL-3R+ (13 veces). Por el contrario, FEC-G solo aumenta los precursores de CD11c-(p. ej., superior a 7 veces). Los linfocitos recién clasificados CD11c+ pero no CD11c-estimulan los linfocitos T CD4+ en una RLM alogénica, mientras que solo los linfocitos CD11c-pueden inducirse para secretar altos niveles de IFN-alfa en respuesta al virus de la gripe. Los linfocitos CD11c+ y CD11c-pueden madurar in vitro con FEC-G + FNT-alfa o con ligando IL-3 + CD40, respectivamente. Estos dos subconjuntos aumentan las moléculas coestimuladoras del CMH de clase II así como la maduración de CD de la proteína de membrana asociada al lisosoma por el marcador de CD. Además, estimulan los linfocitos T CD4+ alogénicos vírgenes. Estos dos subconjuntos de CD provocan que los perfiles de citoquinas distintos en los linfocitos T CD4+, con el subconjunto CD11c-induzcan niveles mayores de la citoquina Th2 IL-10. La movilización diferencial de subconjuntos de CD distintos o precursores de CD mediante la administración in vivo de citoquinas tales como LF y FEC-G también resulta útil para manipular las respuestas inmunitarias en los seres humanos (B. Pulendran, y col., J. Immunol 165:566-572 (2000)).

Se ha demostrado además que la coadministración del interferón (IFN) de tipo I con una vacuna humana (gripe), causa un potente efecto adyuvante, induciendo un tipo Th1 de la respuesta inmunitaria y protección contra la exposición al virus (E. Proietti, y col., J. Immunol. 169:375-383 (2002)). Cuando se administra por vía intramuscular, el IFN de tipo I era muy superior al alumbre y era equivalente al adyuvante completo de Freund (ACF), considerado uno de los adyuvantes más potentes en modelos animales, así como a MF59.

Otros adyuvantes contienen ácido poliinosínico-ácido policitidílico (poli(I-C)). Se ha indicado el efecto de este adyuvante en la expresión de CD de IL-15 así como la capacidad de IL-15 para utilizarse como un activador de CD en Mattei, y col., J. Immunol. 167:1179-1187 (2000). La inyección de poli(I:C) en ratones induce el aumento en la expresión tanto de IL-15 como IL-15R alfa por las CD esplénicas. Además, el tratamiento de IL-15 potenció la expresión de los marcadores coestimuladores en CDs, así como su capacidad para estimular la proliferación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Asimismo, la secreción de IFN gamma por las CD esplénicas aumentó notablemente tras el tratamiento con IL-15, lo que sugiere que IL-15 modula la capacidad de las CD para polarizar las respuestas de los linfocitos T.

Resulta preferente asimismo que el transportador contenga un agente que active (y por consiguiente provoque la maduración de) las células dendríticas para la presentación óptima de los péptidos de AOF/PRLi en los linfocitos T. El adyuvante puede poseer esta propiedad. Como se ha descrito previamente, los oligodesoxinucleótidos CpG no metilados y poli(I:C) cumplen con ese fin. El peptidoglicano bacteriano y los lipopolisacáridos activan también las células dendríticas. Sin embargo, tienen que aislarse y purificarse a partir de las bacterias. Por consiguiente, para este fin resultan preferentes los oligodesoxinucleótidos CpG metilados o el ácido poliinosínico:ácido policitidílico, puesto que como transportadores químicamente sintéticos, activarán las células dendríticas para que puedan presentar de manera óptima los péptidos de AOF/PRLi presentes en el transportador a los linfocitos T sin tener una desventaja potencial desde el punto de vista de la contaminación microbiana.

Como se ha descrito previamente, los liposomas son vehículos de administración adecuados para los epítopos y derivados de AOF de la presente invención. Los liposomas compuestos por ésteres fosfolípidos naturales o sintéticos (liposomas convencionales) se conocen por ser eficaces como inmunoadyuvantes y como transportadores de vacunas (White, y col., Vaccine 13:1111-1122 (1995): Guan y col., Bioconjugate Chem. 9:451-458 (1998)). Se ha autorizado una vacuna para uso humano basada en liposomas contra la hepatitis A (Ambrosch, y col., Vaccine 15:1209-1213 (1997)). Los liposomas catiónicos estéricamente estabilizados (LCEE) se han utilizado para potenciar significativamente la eficacia terapéutica de CpG ODN mediante el aumento de la biodisponibilidad y duración de la acción de CpG ODN. La encapsulación de CpG ODN en liposomas catiónicos estéricamente estabilizados proporciona una protección de nucleasas séricas al tiempo que facilita la captación por los linfocitos B, células dendríticas y macrófagos. En un modelo de inmunización, la coencapsulación de CpG ODN con antígeno de proteína (Ag) aumenta el IFN-gamma específico de Ag y las respuestas de IgG en 15-40 veces en comparación con solamente Ag más CpG ODN (Gursel, y col., J. Immunol. 167:3324-3328 (2001)).

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antígenos de linfocitos T, la incorporación de BrdU obtuvo valores A450 aproximadamente 10 veces mayores que los controles negativos (p. ej., aproximadamente 0,2 frente a 0,02), pero aproximadamente 5 veces inferiores que los clones Th1 o Tc (p. ej., normalmente aproximadamente 0,9). La determinación de la parte de la proteína o péptido de PRLi/AOF truncado reaccionó en un clon obtenido realizado por el análisis del patrón de proliferación en las 5 diversas proteínas o péptidos truncados. Se determinó entonces qué secuencia de aminoácidos se compartió por estas proteínas o péptidos truncados por PRLi que estimularon la proliferación de un clon de linfocitos T. La Tabla 2 muestra a continuación la distribución de los epítopos de los diversos tipos de clones de linfocitos T establecidos, deducidos a partir de la respuesta máxima. A pesar de que los linfocitos T citotóxicos (Tc) y los linfocitos Ts que secretan IL-10 son linfocitos T CD8 y están restringidos en el CMH de clase I, estos dos tipos de linfocitos T

10 reconocen epítopos distintos en AOF.

TABLA 2

Clon de linfocito T específico para PRLi: Tipo de linfocito T Región del aminoácido del epítopo de PRLi Secuencia del epítopo de PRLi

M3: Tc 53-60 RTWEKLLL

L6: Tc 81-88 NTGQRAVL

L5: Tc 148-155 CNTDSPLR

L4: Tc 156-163 YVDIAIPC

L2: Tc 229-236 GEWTAPAP

L1: Ts 17-24 KLLAAGTH

H5: Ts 37-44 YIYKRKSD

M11: Ts 97-104 TPIAGRFT

H2: Ts 140-147 VNLPTIAL

H4: Ts 140-147 VNLPTIAL

H3: Th1 152-161 SPLRYVDIAI

NC1: Th1 229-238 GEWTAPAPEF

L3: Th1 241-250 AQPEVADWSE

M2: Th1 253-262 QVPSVPIQQF

H1: Th1 277-286 SAAPTAQATE

NC4: Th1 285-294 TEWVGATTDW

Análisis de la especificidad de diversos tipos de clones de linfocitos T reactivos en PRLi

Especificidad del clon Ts L1 que utiliza péptidos N-terminal Se produjo el solapamiento de péptidos 12-mer de los

15 primeros 25 aminoácidos de PRLi murina. Por consiguiente, los péptidos 1-4 corresponden a los restos de aminoácidos 1-12, 5-16, 9-20 y 17-28 de PRLi murina. L1 es un clon Ts CD8 de ratón BALB/c que se estableció a partir de bazos de ratones inmunizados dos veces en intervalos de 2 semanas con partículas de nitrocelulosa conjugadas con AOF/PRLi (es decir, una dosis total de AOF/PRLi en cada inyección IP de 1 mcg). Los bazos se recogieron 2 semanas después de la última inmunización y las células del bazo se molieron y se lavaron por

20 centrifugación, luego se cultivaron con 105 células tumorales de fibrosarcoma MCA1315 irradiadas durante dos semanas en presencia de IL-2, IL-6, e interferón gamma. Las células se clonaron limitando la dilución a 0,2 linfocitos T reactivos del tumor/pocillo en presencia de 105 células del bazo singénicas irradiadas y 105 células de fibrosarcoma MCA1315 singénicas irradiadas en un medio que contiene IL-2 murina recombinante, IL-6 murina recombinante e IFN-gamma murino recombinante al utilizar el procedimiento descrito en Rohrer y col., 1995, J.

25 Immunol. 154:2266. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

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resultados del ensayo de proliferación de estos dos clones en el péptido 12-mer de PRLi que abarcan la región del aminoácido 62-135 se llevó a cabo para definir los epítopos de cada clon y para determinar si una vez más los linfocitos Tc y Ts reconocieron distintos epítopos. Los resultados se muestran en la Tabla 5, y en la Tabla 6 se muestran los epítopos deducidos de los diversos clones.

Tabla 5

Clones de linfocitos T CD8 específicos de PRLi

Estimulante: L6 (Tc) M11 (Ts)

Medio: ,007; ,008 ,006; ,008

P3 (33-44): ,016; ,017 ,015; ,014

PRLi intacta: ,95; ,96 ,21; ,19

P10 (aa 61-72): ,017; ,017 -

P11 (aa 65-76): ,015; ,016 -

P12 (aa 69-80): ,02; ,015 -

P13 (aa 73-84): ,016; ,018 -

P14 (aa 77-88): ,96; ,94 ,015; ,017

P15 (aa 81-92): ,95; ,92 ,015; ,016

P16 (aa 85-96): ,02; ,017 ,014; ,017

P17 (aa 89-100): ,015; ,017 ,015; ,016

P18 (aa 93-104): ,017; ,02 ,21; ,18

P19 (aa 97-108): ,015; ,014 ,23; ,15

P20 (aa 101-112): ,016; ,018 ,017; ,02

P21 (aa 105-116): ,02; ,017 ,017; ,014

P22 (aa 109-120): ,02; ,015 ,014; ,016

P23 (aa 113-124): ,015; ,016 ,015; ,016

P24 (aa 117-128): ,016; ,017 ,015; ,017

P25 (aa 121-132): ,017; ,016 ,017; ,015

P26 (aa 125-136): ,016; ,015 ,015; ,018

Tabla 6

Péptidos de PRLi que inducen la proliferación del clon de los linfocitos T

P3 (aa 33-44): QMEQYIYKRKSD

P4 (aa 37-48): YIYKRKSDGIYI

P7 (aa 49-60): INLKRTWEKLLL

P8 (aa 53-64): RTWEKLLLAARA

P14 (aa 77-88): ISSRNTGQRAVL

P15 (aa 81-92): NTGQRAVLKFAA

P18 (aa 93-104): ATGATPIAGRFT

P19 (aa 97-108): TPIAGRFTPGTF

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El clon H5 (un clon Ts) proliferó por igual en los péptidos 3 y 4 de PRLi. La secuencia común en esos péptidos es YIYKRKSD (aminoácidos 37-44). Por lo tanto, se dedujo que el clon H5 reconoce que el epítopo de PRLi de 8 aminoácidos se expuso por una proteína del CMH de clase I H-2d.

El clon M3 (un clon Tc) proliferó por igual en los péptidos 7 y 8 de PRLi. La secuencia común en esos péptidos es RTWEKLLL (aminoácidos 53-60). Por lo tanto, se dedujo que la secuencia de 8 aminoácidos es el epítopo expuesto por una proteína del CMH de clase I H-2d que se reconoce por el clon M3 Tc. M3 debe tener un RALT de baja afinidad, ya que no proliferó mejor en PRLi de lo que hicieron los clones Ts.

El clon L6 (un clon Tc) proliferó por igual en los péptidos 14 y 15 de PRLi. La secuencia común de esos péptidos es NTGQRAVL (aminoácidos 81-88). Por lo tanto, se dedujo que esa secuencia de 8 aminoácidos es el epítopo de PRLi expuesto por una proteína del CMH de clase I H-2d que se reconoce por el clon L6 Tc.

El clon M11 (un clon Ts) proliferó por igual en los péptidos 18 y 19 de PRLi. La secuencia común de esos péptidos es TPIAGRFT (aminoácidos 97-104). Por lo tanto, se dedujo que esa secuencia de 8 aminoácidos es el epítopo de PRLi expuesto por una proteína del CMH de clase I H-2d que se reconoce por el clon M11 Ts. Se planteó la pregunta de si los clones que parecen ser específicos para unos epítopos contenidos entre los aminoácidos 136 y 166 responden mediante la proliferación de células presentadoras de antígeno que presentan 30-mer procesado que tiene la secuencia de aa 136-166 de PRLi. Para responder a esta pregunta, el ensayo de proliferación se realizó como se ha indicado previamente excepto que se utilizaron los clones H3 (Th1), H2 y H4 (Ts), y L4 y L5 (Tc). Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7

Incorporación de BrdU (A450) de clones específicos para PRLi determinados de forma deductiva para que sean reactivos en epítopos de aa 136-166 cuando se estimulan por esa secuencia o controles.

Clon: Medio Proteína 13 de PRLi truncada (aa 242-95) PRLi intacta Péptido de PRLi (aa 136-166)

H3 (Th1): ,008 ,017 ,94 ,91

H2 (Ts): ,008 ,015 ,26 ,24

H4 (Ts): ,008 ,016 ,23 ,21

L4 (Tc): ,007 ,017 ,89 ,90

L5 (Tc): ,008 ,015 ,92 ,87

Los clones cuyos patrones de reactividad en las diversas proteínas de PRLi truncada sugirieron una especificidad en los aminoácidos 136-166, proliferan en el péptido 30-mer que es la secuencia de aa 136-166 (EASYVNLPTIALCNTDSPLRYVDIAIPCNNK). Aunque hubo una diferencia de aproximadamente 4,5 veces entre la incorporación de BrdU del clon Th1 o Tc y los clones Ts, los datos para el clon Ts son 10 veces superiores que el péptido de PRLi irrelevante inducido en cualquiera de los clones. La diferencia entre la proliferación de los clones Th1 o Tc y Ts se debía probablemente a la afinidad del receptor de antígeno de linfocitos T para PRLi: autoCMH. En experimentos anteriores, utilizando 75-100 ng/pocillo de proteína de PRLi/AOF para estimular la proliferación, una dosis estaba próxima a la meseta de la dosis-respuesta para los clones Th1 y Tc portadores del receptor de alta afinidad, pero apenas es capaz de inducir la proliferación medible (3H-timidina o incorporación de BrdU) de los linfocitos T portadores del receptor de baja afinidad (compuesta por algunos de los clones Th1 y Tc y todos los clones Ts que secretan IL-10.

Análisis de las regiones adicionales de PRLi murina:identificación de los epítopos contenidos entre los aminoácidos 136 y 166

Se utilizó el ensayo por incorporación de BrdU para la proliferación descrita en los ensayos previos. Los clones H3, H2, H4, L4, y L5 proliferan en respuesta al péptido 30-mer de PRLi 136-166 expuesto en las células del bazo singénicas irradiadas por rayos x en presencia de 100 U/ml de IL-2 murina recombinante, se ensayaron para su proliferación superponiendo péptidos 12-mer que incluyen la secuencia de aminoácidos del péptido de PRLi 136

166. Los resultados y los péptidos utilizados en los experimentos se muestran en las Tablas 8 y 9, respectivamente.

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Tabla 8

Incorporación de BrdU (A450) de los clones de linfocitos T específicos para el péptido de PRLi 136-166 en varios péptidos que abarcan esa parte de la proteína de PRLi

Clon delinfocito T: Estímulo

MDMI: Proteína 13 dePRLi truncada(242-295) Proteína dePRLi intacta(1-295) Péptido de PRLi31-1 (136-147) Péptido de PRLi31-2 (140-151) Péptido de PRLi(31-3 (144-155) Péptido de PRLi31-4 (148-159) Péptido de PRLi31-5 (152-163) Péptido de PRLi31-6 (156-167)

H3(Th1): ,007 ,015 ,88 ,016 ,015 ,016 ,81 ,95 ,03

H2(Ts): ,008 ,017 ,20 ,023 ,22 ,015 ,016 ,016 ,015

H4(Ts): ,008 ,018 ,21 ,022 ,24 ,017 ,016 ,016 ,016

L4(Tc): ,009 ,017 ,89 ,015 ,018 ,016 ,023 ,91 ,90

L5(Tc): ,007 ,016 ,90 ,017 ,016 ,90 ,89 ,024 ,015

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BrdU y el cultivo continuó durante otras 24 horas, momento en que las células se recogieron y se ensayaron para la incorporación de BrdU según las instrucciones del sistema de proliferación celular ELISA Biotrak. Los datos presentados a continuación en la Tabla 11 son las lecturas de A450 en los pocillos tras haberse completado el ensayo. Los epítopos de AOF se muestran en la Tabla 11a.

Tabla 11

Resultados de proliferación del clon NC1 Th1 y clon L2 Tc en péptidos de PRLi

Estimulante: Clon NC1 Th1 Clon L2 Tc

Medio: ,07; ,008 ,008; ,009

P32 (aa 285-295): ,015; ,017 ,016; ,02

PRLi intacta: ,24; ,27 ,93; ,91

P1 (161-172): ,016; ,015 ,015; ,019

P2 (165-176): ,017; ,014 ,02; ,018

P3 (169-180): ,016; ,014 ,017; ,014

P4 (173-184): ,015; ,017 ,018; ,02

P5 (177-188): ,017; ,016 ,014; ,017

P6 (181-192): ,015; ,018 ,015; ,016

P7 (185-196): ,014; ,017 ,016; ,02

P8 (189-200): ,015; ,016 ,014; ,02

P9 (193-204): ,016; ,018 ,017; ,019

P10 (197-208): ,014; ,018 ,015; ,017

P11 (201-212): ,014; ,017 ,014; ,016

P12 (205-216): ,018; ,015 ,017; ,015

P13 (209-220): ,017; ,015 ,017; ,02

P14 (213-224): ,015; ,017 ,014; ,016

P15 (217-228): ,014; ,016 ,015; ,017

P16 (221-232): ,016; ,015 ,017; ,02

P16 (221-232): ,016; ,015 ,017; ,02

P17 (225-236): ,16; ,17 ,96; ,94

P18 (229-240): ,25; ,28 ,95; ,97

P19 (233-244): ,015; ,017 ,016; ,018

Tabla 11a

Identificación de los clones NC1 y L2 de las secuencias peptídicas de PRLi

Péptido: Intervalo del aminoácido Secuencia

P17: aa 225-236 EEFQGEWTAPAP

P18: aa 229-240 GEWTAPAPEFTA

Los péptidos unidos al CMH de clase II tienden a variar en su longitud entre 8 y 30 aminoácidos. La mayoría de los

10 epítopos del péptido unidos al CMH de clase II poseen 9-11 aminoácidos de longitud; la longitud del epítopo reconocida por el clon NC1 Th1 era de 10 aminoácidos. Debido a que el clon respondió mejor en el péptido 18, pero de forma significativa en el péptido 17, se dedujo que el clon NC1 reconoció el epítopo GEWTAPAPEF. El péptido

28

17 posee todo eso, excepto los dos últimos aminoácidos E y F. La proliferación incluso en estos péptidos así como en PRLi intacta fue menor a la observada habitualmente con linfocitos Th. Sin embargo, el clon NC1 se obtuvo a partir de un ratón que nunca se había inmunizado con PRLi, pero solo tenía este clon presente en su bazo. Por lo tanto, era un linfocito T virgen, no un linfocito T de memoria, por lo que reconoció que su receptor de antígeno de

5 linfocitos T tuvo una reacción de afinidad menor con el péptido de PRLi. Ya que el clon L2 Tc CD8 proliferó de forma idéntica en los péptidos 17 y 18, el epítopo deducido para el clon L2 Tc era la secuencia de 8 aminoácidos común a esos péptidos, a saber, GEWTAPAP.

Análisis de la especificidad de los clones de linfocitos Th1 específicos para PRLi reactivos en el péptido de PRLi que abarca los aminoácidos 243-295

10 Como había ocurrido anteriormente, se realizaron ensayos de proliferación que utilizan la medición ELISA por incorporación de BrdU para medir la proliferación de los linfocitos T cultivados con diversos péptidos de PRLi y células de bazo singénicas irradiadas deplecionadas por linfocitos T como células presentadoras de antígeno, se realizó todo en un medio que contenía 100 U/ml de IL-2. Las células clonadas se cultivaron con células presentadoras de antígeno y 100 ng/pocillo de un péptido de PRLi irrelevante como control negativo, la proteína de

15 PRLi intacta como control positivo, o la superposición de péptidos 12-mer de PRLi que abarcaban la región 243-295. Tras 24 horas, se añadió BrdU y el cultivo continuó durante otras 24 horas, momento en que las células se recogieron y se ensayaron para la incorporación de BrdU según las instrucciones del sistema de proliferación celular ELISA Biotrak. Los datos presentados a continuación en la Tabla 12 son las lecturas de A450 en los pocillos tras haberse completado el ensayo. Los epítopos deducidos se exponen en la Tabla 13.

20 Tabla 12

Resultados de proliferación (A450) de los clones Th1 en péptidos de PRLi

Clones Th1

Estimulante: NC4 M2 H1 L3

Medio: ,005; ,08 ,007; ,008 ,007; ,005 ,008; ,009

P1 (161-172): ,017; ,015 ,017; ,018 ,015; ,02 ,02; ,015

PRLi intacta: ,23; ,27 ,87; ,91 ,95; ,96 ,95; ,98

P19 (233-244): ,017; ,014 ,017; ,02 ,018; ,02 ,019; ,015

P20 (237-248): ,015; ,016 ,015; ,019 ,019; ,018 ,85; ,83

P21 (241-252): ,015; ,016 ,018; ,017 ,02; ,02 ,96; ,98

P22 (245-256): ,015; ,017 ,017; ,016 ,019; ,017 ,018; ,02

P23 (249-260): ,018; ,014 ,81; ,83 ,017; ,016 ,02; ,016

P24 (253-264): ,017; ,015 ,93; ,95 ,016; ,02 ,017; ,016

P25 (257-268): ,018; ,014 ,018; ,02 ,016; ,02 ,017; ,02

P26 (261-272): ,015; ,017 ,02; ,015 ,02; ,015 ,016; ,019

P27 (265-276): ,017; ,014 ,015; ,018 ,017; ,015 ,015; ,018

P28 (269-280): ,015; ,016 ,019; ,02 ,016; ,017 ,016; ,018

P29 (273-284): ,014; ,016 ,02; ,017 ,85; ,83 ,014; ,017

P30 (277-288): ,015; ,018 ,016; ,017 ,96; ,98 ,014; ,02

P31 (281-292): ,17; ,15 ,016; ,018 ,015; ,019 ,02; ,02

P32 (285-295): ,28; ,26 ,016; ,02 ,02; ,017 ,017; ,018

Tabla 13

Identificación de los clones N4, M2, H1 y L3 de las secuencias peptídicas de PRLi

Péptido: Intervalo del aminoácido Secuencia

29

(continuación)

Péptido: Intervalo del aminoácido Secuencia

P20: aa 237-248 EFTAAQPEVADW

P21: aa 241-252 AQPEVADWSEGV

P23: aa 249-260 SEGVQVPSVPIQ

P24: aa 253-264 QVPSVPIQQFPT

P29: aa 273-284 TEDWSAAPTAQA

P30: aa 277-288 SAAPTAQATEWV

P31: aa 281-292 TAQATEWVGATT

P32: aa 285-295 TEWVGATTDWS

Ya que el clon NC4 respondió mejor en el péptido 32, pero de manera significativa en el péptido 31, se dedujo que el clon NC4 reconoció el epítopo TEWVGATTDW (aminoácidos 285-294). El péptido 31 posee todo eso excepto los 5 dos últimos aminoácidos D y W. Al igual que la proliferación de NC1 en PRLi intacta o péptidos de PRLi apropiada, la proliferación de NC4 en estos péptidos así como en PRLi intacta fue inferior a lo que se observó con los otros linfocitos Th analizados. Esto se debe a que tanto NC1 como NC4 eran clones obtenidos a partir de ratones normales y por lo tanto, sin linfocitos T de memoria y así tuvieron una menor afinidad de unión a PRLi. Debido a que el clon M2 respondió mejor en el péptido 24, pero de manera significativa en el péptido 23, se dedujo que el clon M2 10 reconoció el epítopo QVPSVPIQQF (aminoácidos 253-262). El péptido 23 posee todo eso excepto los dos últimos aminoácidos Q y F. Ya que el clon H1 respondió mejor en el péptido 30, pero de manera significativa en el péptido 29, se dedujo que el clon H1 reconoció el epítopo SAAPTAQATE (aminoácidos 277-286). El péptido 29 posee todo eso excepto los dos últimos aminoácidos T y E. Ya que el clon L3 respondió mejor en el péptido 21, pero de manera significativa en el péptido 20, se dedujo que el clon L3 reconoció el epítopo AQPEVADWSE (aminoácidos 241-250).

15 El péptido 20 posee todo eso excepto los dos últimos aminoácidos S y E.

Confirmación de la unión del epítopo peptídico a las proteínas de clase I H-2d.

El uso de un programa informático desarrollado por la Universidad de Tubinga, disponible por internet para la identificación de la unión potencial de epítopos en base a los motivos particulares del CMH, se comprobó la secuencia de aminoácidos del péptido 30-mer de AOF/PRLi que contiene los aminoácidos 136-166 de los motivos

20 unidos a Ld. Véase la Tabla 14. Ya que los epítopos para los clones Ts y Tc han demostrado ser reactivos con esta región, los resultados del presente análisis muestran que los mismos epítopos reaccionarán con la molécula de clase I Ld.

Tabla 14

Clones de linfocitos T reactivos y motivo de anclaje H2-Ld

31-1 aa136-147 EASYVNLPTIAL Ts

31-2 aa140-151 VNLPTIALCNTD Ts

31-3 aa144-155 TIALCNTDSPLR Tc

31-4 aa148-159 CNTDSPLRYVDI Tc y TH1

31-5 aa152-163 SPLRYVDIAIPC Tc y TH1

31-6 aa156-167 YVDIAIPCNNKG Tc

Puntuación de unión

31-1 aa136-147 EASYVNLPTIAL2 Ts

EASYVNLPTIAL17 Ts

EASYVNLPTIAL1 Ts

30

imagen21

imagen22

imagen23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Una vez obtenidos estos datos, se recurre a la base de datos de motivos de anclaje de ALH para determinar qué proteína de ALH de clase I es responsable de la presentación de los péptidos que se desean utilizar. En este punto, se conocen el genotipo de ALH del paciente y la secuencia peptídica de AOF/PRLi que inducen la proliferación de linfocitos T y la secreción del interferón-γ. Una vez completada la realización de este análisis en bastantes pacientes, un banco de datos suficientemente extenso revela qué péptidos requeridos se acumulan para su utilización en la inmunización en un paciente con un haplotipo de ALH obtenido. Por consiguiente, para un haplotipo de ALH obtenido, existe un conjunto obtenido de péptidos de AOF/PRLi que induce la inmunoterapia eficaz del tumor.

Aplicabilidad industrial

La presente invención tiene aplicabilidad en la medicina y la investigación contra el cáncer.

Todas las publicaciones citadas en la memoria descriptiva (p. ej., el listado de citas a continuación) son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.

Listado de citas

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34

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Claims

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