DE60218173T2

DE60218173T2 - Immuntherapie für Krebs

Info

Publication number: DE60218173T2
Application number: DE60218173T
Authority: DE
Inventors: Ola Winqvist; Magnus Thörn
Original assignee: Sentoclone AB
Current assignee: Sentoclone Stockholm Se AB
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2022-10-12
Also published as: EP1808200A3; JP5652984B2; AU2003269760A1; WO2004032951A1; NZ539843A; PT1408106E; EP1408106B1; ATE353954T1; AU2003269760B2; DE60218173D1; JP2012197260A; EP1408106A1; ES2282355T3; US20070141026A1; US8709404B2; DK1408106T3; JP5946282B2; JP2006507262A; EP1808200A2; CY1106573T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren zur Krebsimmuntherapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen von Lymphozyten, die aus Wächter-Lymphknoten eines Krebspatienten erhalten werden, und ein Expandieren derselben in vitro.
Krebs, ein Begriff der häufig verwendet wird, um einen beliebigen der verschiedenen Typen von malignen Neoplasmen bzw. Geschwulsten anzuzeigen, ist eine der Haupttodesursachen beim Menschen. Gegenwärtig verursacht Krebs ungefähr 23% aller weltweiten Todesfälle, wobei lediglich kardiovaskuläre Erkrankungen mehr Leben fordern. Krebs kann sich während des Lebens eines Individuums in einem beliebigen Gewebe eines beliebigen Organs und in einem beliebigen Alter entwickeln, wobei die transformierten Zellen in umgebendes Gewebe eindringen oder in verschiedene Stellen des Körpers metastasieren. Gegenwärtig gibt es wachsende Anzeichen dafür, dass außer endogenen Faktoren ebenfalls bestimmte Aktivitäten und Umgebungsbedingungen, wie Rauchen, Aussetzen an spezifische Verbindungen, die in Nahrungsmitteln enthalten sind oder durch industrielle Verfahren freigesetzt werden, die Entwicklung von und die Steigerung des Risikos für bestimmte Typen von Krebsen und Tumoren begründen.
Sobald ein Krebs diagnostiziert wurde, werden Behandlungsentscheidungen vorrangig. In der Vergangenheit wurden sowohl lokale als auch regionale Therapien angewendet, insbesondere ein chirurgischer Eingriff bzw. eine Operation und/oder Bestrahlung, die üblicherweise mit einer systemischen Therapie, d.h. Verabreichen von anti-neoplastischen Arzneimitteln, kombiniert werden.
Ein chirurgischer Eingriff stellt die älteste Form einer Krebstherapie dar, besitzt jedoch verschiedene Schwächen. Er ist lediglich erfolgreich, wenn der Tumor in einem frühen Entwicklungsstadium nachgewiesen wird, in dem die Zellen des primären Tumors bzw. des Primärtumors nicht begonnen haben, sich bereits zu verbreiten, und wobei der Behandlungserfolg stark zwischen den Lagen bzw. Stellen des Krebs variiert. Eine Bestrahlung wird zusätzlich zu einem chirurgischen Eingriff oder alleine in den Fällen verwendet, in denen es schwierig ist, durch chirurgische Mittel auf den primären Tumor zuzugreifen, wie in nodulären und diffusen Non/Nicht-Hodkin-Lymphomen, squamösen Zellkarzinom des Kopfes und Halses, mediastinale Keimzelltumore, Prostatakrebs oder Brustkrebs im frühen Stadium.
Zusammen mit einem beliebigen dieser zwei vorstehend aufgeführten Behandlungsregimen werden an einen Krebspatienten anti-neoplastische Arzneimittel verabreicht, die eine Zellteilung oder ein Verbreiten neoplastischer Zellen verhindern (chemotherapeutische Behandlung). Obwohl diese Agenzien für im Wesentlichen alle schnell proliferierenden Zellen toxisch sind, kann eine Chemotherapie in der Adjuvanzeinstellung, eine begrenzte Verbesserung bewirken, die die Sterblichkeit, beispielsweise bei Darmkarzinom bzw. Darmkrebs von 51% auf 40% nach mehr als fünf folgenden Jahren, verringert.
In jüngster Zeit wurden zwei weitere Behandlungsregime entwickelt, die photodynamische Therapie und die Tumorimmuntherapie.
Bei der photodynamischen Therapie werden photosensibilisierende Verbindungen und Laser verwendet, um eine Tumornekrose zu erzeugen. An einen Patienten werden Tumorlokalisierende, photosensibilisierende Verbindungen systemisch verabreicht und nachfolgend durch einen Laser aktiviert. Nach Absorption von Licht der geeigneten Wellenlänge wird der Sensibilisator in einen angeregten Zustand mit einer Cytotoxizität umgewandelt, welche durch die Wechselwirkung zwischen dem Sensibilisator und molekularem Sauerstoff in dem zu behandelnden Gewebe vermittelt wird, um cytotoxischen Singulett-Sauerstoff zu erzeugen.
Andererseits versucht eine Tumorimmuntherapie einen Vorteil aus der inhärenten Aufgabe zu ziehen, die das Immunsystem in dem Individuum als ein Instrument zum Erhalten der physischen Integrität des Körpers erfüllt.
Im Prinzip weist das Immunsystem der Säuger zwei generelle Mechanismen auf, um den Körper zu schützen, die nicht-spezifische oder angeborene Immunantwort und die spezifische oder erworbene Immunantwort. Im Gegensatz zu der angeborenen Immunantwort, die unspezifisch ein beliebiges fremdes, eindringendes Material bekämpft, ist die spezifische Antwort auf eine bestimmte Substanz (Antigen) zugeschnitten, wobei sie durch klonale Selektion bewirkt wird. Eine erworbene Immunität wird durch spezialisierte Zellen vermittelt, die B-Zellen, die Antikörper als Effektormoleküle erzeugen (Implementieren der humoralen Immunantwort) und die T-Zellen, die ihre Wirksamkeit durch die Zelle als solche vermitteln (zellvermittelte Immunität).
Die Zellen des spezifischen Immunsystem bekämpfen allgemein und zerstören jede Einheit, die als nicht zum Körper gehörend, d. h. als fremd oder "nicht-selbst", erkannt wurde, während sie gleichzeitig von jedem Angriff auf Substanzen/Antigene ablässt, von denen bekannt ist, dass sie ein "selbst" bestimmen. Somit wird eine beliebige exogene, biologische und nicht-biologische Einheit, die in den Körper des Individuums eintritt/eindringt, angegriffen, jedoch ebenfalls eine beliebige endogene Materie, von der das Immunsystem niemals gelernt hat, dass sie ein "selbst" darstellt und erkennt sie als fremd.
Das Immunsystem stellt in einem Individuum üblicherweise eine immunologische Überwachung bereit und verhindert die Entwicklung von Krebs. Eine Krebsimmunität wird hauptsächlich durch T-Zellen und NK-Zellen vermittelt, wobei transformierte Tumorzellen zerstört werden, nachdem sie als (tumorassoziiertes) fremdes Material erkannt wurden, d.h. Antigene von denen nicht bekannt ist, dass sie zum "selbst" gehören, (T-Zellen) oder denen eine MHC-Klasse-I-Expression fehlt (NK-Zellen).
Die Medizin hat versucht, diese Mechanismen in der Behandlung von Krebs auszunutzen und hat soweit zwei generelle Verfahren in der Tumorimmuntherapie angewendet. Gemäß eines ersten Verfahrens wird die angeborene Immunantwort durch Verabreichen von Substanzen, wie Interleukin-2, Tumornekrosefaktor oder Interferon, an Tumorpatienten stimuliert. Jedoch hat sich dieser Ansatz als nicht ganz erfolgreich erwiesen, weil er starke Nebenwirkungen, aufgrund der hohen Toxizität zeigt, die die verabreichten Substanzen in den wirksamen Konzentrationen zeigen.
Ein anderer Schwerpunkt wurde auf das spezifische Immunsystem gerichtet, wobei die endogene Fähigkeit des Immunsystems ausgenutzt wurde, zwischen "selbst" und "nichtselbst" zu unterscheiden. Im Allgemeinen greift das Immunsystem transformierte Zellen an, da sie Antigene zeigen, die als fremd oder als "nicht-selbst" erkannt werden. Jedoch können unter einigen Umständen Tumorzellen dem Immunsystem in vivo entkommen, da das Tumorassoziierte Antigen zum Teil nicht in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, oder nicht in der Lage ist, eine ausreichende Stimulierung von T-Zellen zu bewirken, oder aus dem Grund, dass die Tumorzellen Faktoren erzeugen, die die Immunantwort in vivo herunterregulieren.
Um das Immunsystem zu unterstützen, seine endogene Aufgabe auszuführen, wurden mononukleare Zellen von einem Krebspatienten aus peripherem Blut isoliert und in eine Kultur überführt, in der sie stimuliert und expandiert wurden. Nach Expansion wurden sie zurück in den Patienten infundiert, wobei sich lediglich Erfolgsantwortraten von bis zu 35% ergaben. Eines der Nachteile liegt darin, dass peripheres Blut lediglich geringe Mengen an Lymphozyten mit funktionsfähiger Aktivität gegen Tumorantigene umfasst.
Um diesen Mangel zu begegnen, wurde eine Variation eines derartigen Verfahrens vorgeschlagen, welches ein Isolieren und Expandieren von Lymphozyten-Populationen umfasst, die Tumore in vivo infiltriert haben, sogenannte Tumor-infiltrierende Lymphozyten. Jedoch besitzt dieses Verfahren den Nachteil, dass es einen spezifischen Typ von Lymphozyten erfordert, welcher lediglich in einem ziemlich späten Stadium einer Tumorentwicklung und in geringen Anzahlen vorliegt. Weiterhin sind die Tumor-infiltrierenden Lymphozyten immunsuppressiven Substanzen von dem Tumor ausgesetzt, und schließlich stellt die Isolation derartiger Lymphozyten nicht immer eine einfach zu leistende Aufgabe dar.
Lind, D.S. et al. offenbart in Surgical Oncology 3 (1993), 273-282 Experimente, die die Expansion und Zytokin-Sekretion von Bryostatin-aktivierten Lymphozyten aus kryokonservierten Achsel-Lymphknoten von Krebspatienten betrifft. Es wird ein Cocktail aus Bryostatin zusammen mit Ionomycin verwendet, der anti-neoplastische Eigenschaften zeigt, wobei gezeigt wurde, dass er in der Lage ist, Tumorantigen zu ersetzen. In derartiger Art und Weise behandelte Lymphozyten sind in vitro nicht zytolytisch.
C.S. Chin und H.D. Bear beschreiben ein Verfahren zum Identifizieren von Vakzineableitender Lymphknoten (Annals of Surgical Oncology 9 (2002), 94-103). Mäusen wurden an zwei Stellen, dem Fettpolster und der Flanke, Tumorzellen injiziert und es wurden Achsel-, Leisten- oder Kniekehlen-Lymphknoten gesammelt.
Deshalb besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, die vorstehend aufgeführten Nachteile des Stands der Technik zu überwinden und ein neues und verbessertes Verfahren zur Immuntherapie bereitzustellen.
Dieses Problem wurde durch ein Verfahren zum Behandeln und/oder zum Vorbeugen bzw. Verhindern des Wiederauftretens von Krebs gelöst, welches die Schritte eines Bereitstellen von Lymphozyten umfasst, die aus Wächter-Lymphknoten erhalten werden, und eines Aktivierens und Expandierens der so erhaltenen Lymphozyten in vitro.
In den Figuren,
zeigt 1 die Ergebnisse einer peroperativen Identifizierung eines/von Wächter-Knoten. Die Identifizierung von Wächter-Knoten wurde durch subseröse Injektion von Patentblau-Farbstoff (A) an vier Stellen um den Tumor (B) durchgeführt. Normalerweise erscheint/erscheinen innerhalb von fünf Minuten ein oder mehrere blau gefärbte Lymphknoten in dem Gekröse bzw. Mesenterium (C).
zeigt 2 die von einer Charakterisierung der Lymphozyten erhaltenen Ergebnisse und die Daten von einem Patienten mit Dukes B bzw. Dukes B-Stadium (A) und Dukes C (B). Proben aus dem Tumor (CC), einem Wächter-Knoten (SN) und einem Nicht-Wächter-Knoten (LN) wurden mit Hematoxylin-Eosin (linke Felder) gefärbt (40x). Die Pfeile zeigen das Vorliegen metastatischer Darmkarzinom-Zellen in einem Wächter-Knoten an (B, linkes Feld, SN). Lymphozyten aus dem Tumor (CC), einem Wächter-Knoten (SN), nichtableitender Lymphknoten (LN) wurden mit Antikörpern gegen CD4 und den Aktivierungsmarker CD69 gefärbt und unter Verwendung von Durchflusszytometrie analysiert (mittlere Felder), wobei die Prozentsätze an doppelt positiv aktivierten CD4-T-Helferzellen in der oberen, rechten Ecke angegeben sind. Zellen aus dem Tumor (CC), einem Wächter-Knoten bzw. Sentinel-Knoten (SN) und einem Lymphknoten (LN) wurden mit einer 10- oder 100-fachen Verdünnung eines autologen Darmkarzinom bzw. Darmkrebs-Extrakts in einer Zeitreihenstudie von 5 bis 7 Tagen inkubiert. Die Zellen wurden 16 Stunden vor einem Ernten mit 1 μCi 3H-Thymidin gepulst. Eine Proliferationsspitze trat an Tag 5 (rechte Felder) auf.
zeigen 3 die Ergebnisse einer unspezifischen Aktivierung und intrazellulärer FACS-Analysen für eine Metastase und Proliferationsantworten gegen Concanavalin A-Stimulierung (A) und intrazellulären, Cytokeratin-20-Antikörper verwendenden FACS-Analysen (B). In einem Zeitreihen-Proliferationsassay wurden Zellen des peripheren Bluts (PBL), des Tumors (CC), eines Wächter-Knoten (SN) und eines Lymphknoten (LN) untersucht, wobei sie mit 10 μg/ml Concanavalin A (A) stimuliert wurden. Zellen des Tumors (CC), eines Wächter-Knotens (SN) und eines Lymphknoten (LN) wurden mit Saponin permeabilisiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem anti-Cytokeratin-20-Antikörper und Nachweis mit einem anti-Maus-IgG-FITC-konjugierten Antikörper (B). Die gestrichelte Linie stellt Kontrollproben dar, die lediglich mit einem sekundären Antikörper inkubiert wurden, und wobei in der Überlagerungsdarstellung sowohl die primären als auch die sekundären Antikörper in die Inkubationen eingeschlossen wurden. Die Zahlen zeigen den Prozentsatz von Cytokeratin-20-positiven Tumorzellen an.
zeigt 4 ein hypothetisches Schema, wie antigenisches Material von dem Tumor durch die Lymphgefäße zu dem ableitenden Lymphknoten, der durch einen Tracerfarbstoff identifiziert wird, transportiert wird, wo eine Präsentation von antigenischen Peptiden und eine Aktivierung von T-Zellen stattfindet. Hypothetisches Schema Dukes B (A). In dem Tumor liegt ein schneller Umsatz von Zellen vor, und ein Mangel an Sauerstoff und Nährstoffen verursacht eine feindliche Umgebung, die Makrophagen und dendritische Zellen anzieht. Trümmer der Tumorzellen werden durch diese gelernten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) phagozytiert und durch die Lymphgefäße zu dem ableitenden Wächter-Knoten transportiert, der peroperativ durch peritumorale Injektion von Patentblau nachgewiesen werden kann. In dem Wächter-Knoten laden die APCs Peptide, die in dem endosomalen/lysosomalen Stoffwechselweg prozessiert wurden und von Tumorantigenen abgeleitet wurden, hauptsächlich in die HLA-Klasse-II-Tasche. Der Klasse-II-Tumorpeptid-Komplex wird auf die Oberfläche der APC transportiert und durch CD4+-T-Helferzellen erkannt, welche das erste Aktivierungssignal bereitstellen. Das zweite Aktivierungssignal wird durch costimulierende Moleküle wie B7.1, B7.2 und ICAM-1 bereitgestellt, die auf der APC mit hohen Spiegeln exprimiert werden. Somit wird die CD4+-T-Helferzelle eine aktivierte Effektorzelle und verlässt den Lymphknoten, um über den Ductus thoracicus in den Blutstrom zurückzukehren. Die aktivierte CD4+-T-Helferzelle verlässt den Blutstrom in Gebieten mit einer Entzündung und neuer Gefäßbildung, wie in einem Tumor oder in Metastasen. Die Zelle wird jetzt eine Tumor-infiltrierende Lymphozyte (TIL). Aufgrund der örtlichen feindlichen Umgebung in dem Tumor und möglicherweise durch immunsuppressive Zytokine bzw. Cytokine, die von dem Tumor freigesetzt werden, werden die TIL-Zellen jedoch häufig immunsupprimiert und unreaktiv (anergisch (anergic)).
Dukes C (B): Liegen in einem Wächter-Knoten metastastische Zellen vor, wird beobachtet, dass Lymphozyten nicht in der Lage sind, weder gegen Tumorextrakt noch gegen einen unspezifischen Aktivator, wie Concanavalin A, zu proliferieren. Wahrscheinlich liegen APCs mit phagozytierten Tumortrümmern vor und die Zellen scheinen aktiviert zu sein. Eine Erklärung ist, das Metastasenzellen immunsuppressive Faktoren erzeugen. Eine andere Erklärung ist, das Dukes C (Vorliegen von Lymphknotenmestastasen) lediglich in Patienten mit einer Immunstörung, die den Tumor nicht als fremd erkennt, auftritt. Somit eine ähnliche Situation, wie sie in verschiedenen Mäusestämmen beobachtet wurde, die sich einer Leishmaniase stellen mussten, wobei einige Stämme die Infektion beseitigten, während andere aufgrund von Unterschieden im genetischen Hintergrund unterlagen.
Während der umfassenden Studien, die zu der gegenwärtigen Erfindung führten, haben die Erfinder das Immunprofil von Patienten analysiert, die an einem Kolorektal-Karzinom bzw. Darmkarzinom (colorectal cancer) litten, und es wurde überraschenderweise festgestellt, dass obwohl Lymphknoten, die aus peripherem Blut oder allgemein aus dem Lymphsystem der Patienten isoliert wurden, gegen den Tumor unempfindlich waren, wobei Wächter-Lymphknoten der Patienten Lymphozyten beherbergten, die eine Aktivität gegen Tumorzellen zeigten. Basierend auf dieser Erkenntnis wurde die Erfindung ausgeführt und es wird ein nützliches Werkzeug in einer zellulären Immuntherapie bereitgestellt.
Wird das Verfahren, wie hier offenbart, durchgeführt, müssen zunächst Wächter-Knoten lokalisiert werden. Wächter-Lymphknoten sind im Allgemeinen definiert als der/die erste(n) Lymphknoten in dem lymphatischen System, der/die lymphatische Drainage aus einem primären Tumorgebiet empfängt. Dies kann in geeigneter Weise während einer Operation des/der primären Tumors/Tumore geleistet werden, beispielsweise durch Einführen einer Tracersubstanz um oder in die Peripherie bzw. den Umfang der Tumorstelle, vorzugsweise vor dem operativen Entfernen des primären Tumors. Der Tracer wird in die Lymphkapillaren transportiert und akkumuliert über Phagozytose durch Makrophagen in den Lymphknoten, die stromabwärts lokalisiert sind. Üblicherweise können die Wächter-Lymphknoten nach einigen Minuten nach Applizieren der Tracersubstanz optisch durch Überprüfen von Lymphknoten, die zuerst oder mehr intensiv gefärbt sind, bestimmt werden.
Als eine Tracersubstanz kann beispielsweise Patentblau-Farbstoff, Lymphazurin-Blau oder 99 Tc markiertes Albumin verwendet werden.
Sobald die Wächter-Lymphknoten identifiziert wurden, werden sie durch chirurgische Mittel isoliert und ihr histologischer Status kann in repräsentativen Scheiben von den Knoten beurteilt werden.
In einem nächsten Schritt werden Lymphozyten, die in dem verbleibenden Wächter-Knotenmaterial vorliegen, gesammelt und in eine in vitro-Kultur überführt. Dies kann beispielsweise durch Pressen bzw. Drücken der Lymphknoten, mit oder ohne der Gegenwart von Kollagenase, geleistet werden, so dass sie ihren Inhalt freisetzten.
Die so erhaltenen Zellen werden nachfolgend einer in vitro-Kultur unterzogen.
Sollen nicht gewollte Zellen von der Kultur entfernt werden und/oder soll eine spezifische Unterpopulation von T-Zellen, beispielsweise CD4, CD8, CD69, CD62L selektioniert werden, können positive oder negative Selektionstechniken angewendet werden, wie Antikörper, die auf für die ausgewählten Zellen einzigartige Oberflächenmarker gerichtet sind. Ein Beispiel für derartige Techniken ist eine magnetische Immunoadhäsion, wobei monoklonale Antikörper, die gegen Zelloberflächenmarker, die auf den auszuwählenden Zellen vorliegen, an einen Träger gebunden werden. Eine Auswahl an Zellen kann ebenfalls durch Flusszytometrie-unterstütztes Zellsortieren unter sterilen Bedingungen geleistet werden.
Die Zellen können unter herkömmlichen Bedingungen in einem beliebigen Medium kultiviert werden, das für ein Wachstum von Lymphozyten-Zellen geeignet ist, umfassend ein Minimal Essential Medium (minimal essential media) oder RPMI-Medium 1640. Um das Wachstum der Zellen zu fördern, können Faktoren, die für deren Proliferation und Lebensfähigkeit notwendig sind, zugesetzt werden, umfassend Serum, beispielsweise fetales Kälberserum oder menschliches Serum und Antibiotika, beispielsweise Penicillin Streptomycin. Die Lymphozyten werden unter Bedingungen gehalten, die zum Unterstützen eines Wachstums nötig sind, beispielsweise eine geeignete Temperatur um 37 °C und eine Atmosphäre, beispielsweise Luft plus 5% CO₂.
Während der Kultur werden die Lymphozyten stimulierenden Agenzien zur Expansion ausgesetzt und wahlweise ebenfalls an zusätzliche Aktivierungssignale.
Eine Expansion von Lymphozyten kann durch Kontaktieren der Zellen mit anti-CD3-Antikörpern geleistet werden, oder durch ein Kontaktieren von diesen mit einem Proteinkinase C-Aktivator (Phorbolester) in Verbindung mit einem Calciumionophor. Für eine Stimulierung eines akzessorischen Moleküls an der Oberfläche der T-Zellen, kann ein Ligand, der das akzessorische Molekül bindet, eingesetzt werden. Beispielsweise können T-Zellen unter Bedingungen, die geeignet sind ein Proliferation der T-Zellen zu stimulieren, mit einem anti-CD3-Antikörper und einem anti-CD28-Antikörper aktiviert werden.
Das primäre und das costimulierende Signal kann durch verschiedene Protokolle bereitgestellt werden. So können die Agenzien, die jedes Signal bereitstellen, beispielsweise in Lösung sein oder an eine Festphasenoberfläche, beispielsweise den Kulturbehälter gekoppelt sein. Im Fall einer Kopplung an eine Festephasenoberfläche, können die Agenzien an die selbe Festphasenoberfläche gekoppelt sein (d.h. in "cis"-Formation) oder an getrennte Oberflächen (d.h. in "trans"-Formation). Ebenfalls kann ein Agens an eine Festphasenoberfläche gekoppelt sein und das andere Agens kann in Lösung vorliegen.
Um eine Stimulierung einer Population von T-Zellen nach Stimulation für einen langen Zeitraum beizubehalten, werden die T-Zellen nachfolgend von dem Stimulus getrennt. Jedoch können die T-Zellen über die Kulturdauer in Kontakt mit dem costimulierenden Liganden gehalten werden. Die Rate der T-Zell-Proliferation wird periodisch beobachtet (beispielsweise täglich), beispielsweise durch Überprüfen der Größe oder durch Erfassen des Volumens der T-Zellen. Nimmt der mittlere T-Zell-Durchmesser nach einer Spitze ab, werden sie reaktiviert und restimuliert, um eine weitere Proliferation zu induzieren. Alternativ kann die Rate der T-Zell-Proliferation und der Zeitpunkt für eine Restimulierung der T-Zellen durch Testen des Vorliegens von Zelloberflächen-Molekülen, wie CD25, CD69, CD62L und MHC-Klasse-II, die auf aktivieren T-Zellen moduliert sind, beobachtet werden. Um eine Stimulierung einer Population von CD4- oder CD8-T-Zellen für eine lange Zeit zu induzieren, kann es nötig sein die T-Zellen mit einem anti-CD3-Antikörper und einem anti-CD28-Antikörper mehrmals zu reaktivieren und zu restimulieren.
Zusätzlich können die von den Wächter-Lymphknoten erhaltenen T-Zellen durch die Zugabe von Zytokinen stimuliert werden, wie IL-2 zum Beibehalten und Expandieren, und IL-12, INF-α und anti-IL-4-Antikörper, um CD4+-T-Helferzellen in Richtung IFN-γ produzierender Th1-Effektorzellen zu aktivieren. Die Menge an Zytokine, die zu der T-Zell-Kultur zugesetzt werden soll, um eine Expansion in einem ausreichenden Ausmaß zu erhalten, kann durch den Fachmann leicht bestimmt werden. Das Zytokin wird vom ersten Tag an der Kultur zugesetzt, und jeden weiteren Tag in Kultur in Mengen zugesetzt, die ausreichend sind eine Proliferation der T-Zellen beizubehalten. So kann beispielsweise IL-2 zu den Kulturen zugesetzt werden, um eine Endkonzentration von ungefähr 100 U/ml zu erhalten und wird jeden weiteren Tag zu der Kultur zugesetzt, wie jeden zweiten oder dritten Tag, wenn zu der Zellkultur neues Medium zugesetzt wird.
Da gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens Lymphozyten verwendet werden, die bereits in vivo vorbereitet bzw. instruiert (primed) wurden und eine Spezifität gegen Tumor antigene aufweisen, ist prinzipiell keine weitere Aktivierung/Vorbereitung (priming) erforderlich, da eine klonale Expansion bereits stattgefunden hat.
Jedoch kann in Patienten mit Tumoren, die immunsuppressive Substanzen erzeugen, die Lymphozyten-Kultur mit einem Tumorantigen in einer Art und Weise stimuliert werden, die geeignet ist ein zusätzliches Aktivierungssignal in den T-Zellen auszulösen, d.h. das Antigen wird den T-Zellen so präsentiert, dass in der T-Zelle ein Signal durch den TCR/CD3- Komplex ausgelöst wird. So kann das Antigen der T-Zelle beispielsweise durch eine Antigen-präsentierende Zelle, wie eine B-Zelle, einen Makrophagen, eine Monozyte, eine dendritische Zelle, eine Langerhans-Zelle in Verbindung mit einem MHC-Molekül, präsentiert werden. Zu diesem Zweck werden zu der Lymphozyten-Kultur Tumorzellen, ein autologer Tumorextrakt und/oder rekombinantes Tumorantigen zugesetzt und für eine Zeit inkubiert, die für ein zusätzliches Vorbereiten ausreichend ist. In gleicher Weise kann eine Zelle, die mit einem Pathogen, beispielsweise einem Virus, der Antigene des Pathogens präsentiert, mit den Lymphozyten inkubiert werden. Nach einer Antigen-spezifischen Aktivierung einer Population von T-Zellen, können die Zellen gemäß der hier beschriebenen Verfahren weiter expandiert werden. In Hinblick auf die Patientensicherheit wird die Verwendung eines autologen Tumorextrakts bevorzugt, da der Schritt eines Entfernens von Tumorzellen und/oder rekombinanten Zellen weggelassen werden kann.
Weiterhin wurde festgestellt, dass bei Vorliegen von Tumorzellen in den Wächter-Lymphknoten, die davon erhaltenen Lymphozyten eine geringere Aktivität und/oder Spezifität gegen die Tumorzellen zeigen, verglichen mit Lymphozyten, die von Tumorzellfreien Wächter-Lymphknoten erhalten wurden. Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, dass dies wahrscheinlich durch die Fähigkeit des Tumors einer Immunsuppression bedingt ist, d.h. ein funktioneller Status einer Anergie aufgrund des Vorliegens von Tumorzellen.
Wurde die Lymphozyten-Kultur zu einem gewünschten Ausmaß expandiert und stimuliert, werden die Lymphozyten gesammelt, wahlweise von beliebigem Material gesäubert, welches für die Patientengesundheit nachteilig ist, und zurück in den Patienten überführt. Dies kann durch intravenöse Infusion über einen Zeitraum von ungefähr 1 bis 6 Stunden geleistet werden, wobei die Anzahl an mononuklearen Zellen, die verabreicht wird, einzig von der Anzahl der Zellen abhängig ist, die während des Proliferationsschritts erzeugt wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt klare Vorteile gegenüber dem Stand der Technik bereit. Da die Lymphozyten aus Wächter-Lymphknoten gesammelt werden, werden speziell solche Lymphozyten expandiert, die bereits eine gegen Tumorantigene gerichtete Aktivität und Spezifität aufweisen. Diese Spezifität kann in vitro durch Kultivieren der Lymphozyten in der Gegenwart eines autologen Tumorextrakts gesteigert werden, um eine klonale Selektion und Expansion zu fördern. In Wächter-Knoten können T-Zellen mit spezifischer Reaktivität gegen den primären Tumor identifiziert werden, und wobei diese Zellen spezifisch für eine spätere Verwendung in einer zellulären Immuntherapie expandiert werden können.
Die Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht begrenzend sind, sondern lediglich zur Erläuterung dienen.
Beispiel 1
Sammeln und Herstellen von Zellen
In der Studie wurden fünf Patienten mit Darmkarzinom, ohne Anzeichen ferner Metastasen oder einer Lymphknotenbeteiligung, vor einem chirurgischen Eingriff einbezogen (Tabelle 1). Die Studie wurde durch das örtliche ethische Komitee bewilligt und von den Patienten wurde eine Einverständniserklärung abgegeben.
Die Stelle des Darmtumors wurde durch Trennung einer peritonealen Adhäsion mobilisiert, um eine Beobachtung zu erleichtern. In die Peripherie des Tumors wurde ein Milliliter Patentblau-Farbstoff (Guerbert, Paris) oberflächlich injiziert. Innerhalb von fünf Minuten wurden ein bis drei blau gefärbte Mesenterial-Lymphknoten makroskopisch als Wächter-Knoten identifiziert und sie wurden mit Nähten (sutures) markiert.
Die Wächter- und Nicht-Wächter-Knoten wurden in Hälften geschnitten. Von dem zentralen und umfänglichen Teil der Knoten wurden weniger als 1mm dicke Scheiben für Durchflusszytometrie- und Proliferationsanalysen abgeschnitten. Der Rest des Knotens wurde einer routinemäßigen, histopathologischen Untersuchung unterzogen. Tumore wurden histopathologisch als Dukes-Stadien A-C (11) klassifiziert (Tabelle 1).
Ein Teil des primären Tumors (umfassend einen Teil der invasiven Grenze) wurde für Durchflusszytometrie-Analysen und als eine Antigenquelle entfernt.
Venöses Blut, Wächter- und Nicht-Wächter-Lymphknoten und Tumore wurden unverzüglich versorgt, um die Bearbeitungszeit zu minimieren. Leukozyten des peripheren Bluts (PBL) wurden durch Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Amersham) gereinigt. Durch sanften Druck wurden Einzelzellsuspensionen von Lymphknoten-Zellen erhalten, wobei ein Glashomogenisator mit großem Spiel verwendet wurde. Die Zellen wurden resuspendiert und zweimal in DMEM gewaschen, das 2,5 % fetales Kälberserum (FCS) (Life Technologies) umfasste. Schließlich wurden die Zellen in RPMI-Proliferations-Medium resuspendiert, das 10 % humanes AB-Serum (Sigma), 1 % Penicillin-Streptomycin (Sigma) und 1 % Glutamin (Sigma) umfasste.
Tumorproben wurden unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators in fünf Volumen (Gew./Vol) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) homogenisiert, gefolgt von einer fünfminütigen Denaturierung bei 97 °C. Unter dem Mikroskop waren keine intakten Zellen mehr sichtbar. Tumorhomogenisate wurden in vollständigem Proliferations-Medium 1:10 und 1:100 verdünnt. Gereinigte PBL- und Lymphknoten-Zellen wurden mit 3 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einem Proliferationsassay bzw. -test gegen verdünntes Tumorhomogenisat, Concanavalin A 10 μg/ml (Sigma) oder karzinoembryonales Antigen 100 μg/ml (Sigma) in Dreifachbestimmungen verwendet. Eine Proliferation wurde an Tag 5, 6 und 7 durch Zugabe von 1 μCi ³H-Thymidin pro Vertiefung (Amersham) 16 Stunden vor Ernten erfasst. Die Proben wurden einem Scintillationszählen unterzogen.
PBL, Lymphknotenzellen und Tumorzellsuspensionen mit 1 × 10⁶ Zellen pro Probe wurden einer Untersuchung unter Verwendung von Durchflusszytometrie (FACS) unterzogen. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, das 2% FCS und 0,02% NaN₃ (FACS-Puffer) umfasste und direkt dreifach markiert, wobei Fluoreszenz-Zelloberflächenmarker gegen CD4 PE, CD8 PerCp und den sehr frühen Aktivierungsmarker CD 69 FITC verwendet wurden (Pharmingen). Für intrazelluläre FACS, wurden Zellen mit 0,3 % Saponin (Sigma) in FACS-Puffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchlässig gemacht bzw. permeabilisiert, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation mit Cytokeratin-20-Antikörper (Dakopatts). Nach Spülungen bzw. Waschungen wurden die Zellen mit einem anti-Maus-IgG-FITC-konjugierten (Jackson) Antikörper für 30 Minuten inkubiert. Als Kontrollen wurden Zellen verwendet, die ohne den primären Antikörper gefärbt wurden. Nach dem Färben wurden die Zellen unter Verwendung eines FACSscan (Becton Dickinson) untersucht und die Daten wurden unter Verwendung der Cellquest Computer Software (Becton Dickinson) analysiert.
Tabelle 1
Patientendaten, Lokalisation der Tumore, Einstufung, untersuchte Lymphknoten und Proliferationsantworten.

a. Am Tag 6 von mittleren Proliferationsantworten wurde bei einer Tumorextraktverdünnung 1/100 eine Spitze gesehen.

Beispiel 2
Peroperative Identifizierung eines Wächter-Knotens und pathologische Klassifikation
Es wurden ein bis drei Wächter-Knoten intraoperativ unter Verwendung einer Injektion von Patentblau in die Peripherie des Tumors nachgewiesen (1). Die Patientendaten und die Lokalisation der Tumore sind in Tabelle 1 dargestellt. Nach einer makroskopischen Unterteilung der entfernten Proben, wurden zwischen 18 und 29 Lymphknoten (Durchschnitt 22) identifiziert und zur histopathologischen Bewertung eingebettet (2A, 2B, linke Felder). Die Patienten 2 und 3 (Tabelle 1) wiesen eine metastastische Ausbreitung auf den Wächter-Knoten auf und wurden histopathologisch als Dukes C klassifiziert (2B, linkes Feld). Die anderen drei Patienten zeigten weder ein Anzeichen einer metastastischen Ausbreitung an (einen) Wächter-Knoten noch an andere Lymphknoten, obwohl die Tumore durch die Darmmuskelwand wuchsen (2A, linkes Feld). Sie wurden als Dukes B klassifiziert.
Einzelzellsuspensionen von Lymphozyten, die getrennt aus peripherem Blut (PBL) (nicht gezeigt), dem Tumor, ableitenden Wächter-Lymphknoten und nicht-ableitenden Lymphknoten gesammelt wurde, wurden dreifach mit Antikörpern gefärbt, die den sehr frühen Aktivierungsmarker CD69 und die T-Zell-Marker CD4 (2A, 2B, mittleres Feld) und CD8 (nicht gezeigt) erkennen, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analysen (FACS). Sowohl in Wächter- als auch in Nicht-Wächter-Knoten wurden ungeachtet eines Vorliegens (2A, mittleres Feld) oder einer Abwesenheit von Metastasen (2B, mittleres Feld) ähnliche Zahlen von aktivierten CD4⁺-Lymphozyten gefunden. Alle untersuchten Tumore umfassten in verschiedenen Ausmaßen Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs) und die Mehrheit dieser TILs, die sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-Zellen waren, präsentierten und aktivierten einen CD69⁺-Phänotyp. In peripherem Blut lagen keine CD4⁺ CD69⁺-Lymphozyten vor (nicht gezeigt).
Der funktionelle Zustand der Lymphozyten wurde weiter in Zeitreihen-Proliferationsassays charakterisiert, wobei homogenisierte Tumorzellextrakte als Antigenquelle verwendet wurden (2A, 2B, rechte Felder). In keinem der Fälle bewirkte eine Stimulierung mit Patentblau-Farbstoff eine Proliferation (Daten nicht gezeigt). In allen Wächter-Lymphknoten ohne Metastasen (Dukes B-Fälle) proliferierten die Lymphozyten in einer Dosis abhängigen Art und Weise gegen einen autologen Tumorextrakt (2A, rechtes Feld). Eine Proliferationsspitze wurde regelmäßig am Tag 6 bei der höchsten Menge von Antigen gesehen (Tabelle 1). Unter Lymphozyten aus Nicht-Wächter-Knoten oder von TILs wurde keine Antigen-abhängige Proliferation erkannt. In den Dukes C-Fällen (Tabelle 1, 2B, rechtes Feld), in denen die Wächter-Knoten Metastasenzellen umfassten, wurde keine oder eine sehr schwache Proliferationsantworts identifiziert. Um den funktionellen Zustand bzw. Status der Lymphozyten weiter zu untersuchen, wurden T-Zellen nicht spezifisch mit Concanavalin A stimuliert, das die Aktivierung durch den T-Zell-Rezeptor umgeht. Alle PBLs und Nicht-Wächter-Knoten-Lymphozyten antworteten mit einer starken Proliferation, ebenso wie Wächter-Knoten-Lymphozyten aus den Dukes B-Patienten (3A). Jedoch antworteten die Wächter-Knoten-Lymphozyten aus den Dukes C-Patienten nicht mit einer Proliferation gegen bzw. aufgrund von Concanavalin A, noch taten es die TILs aus Dukes B oder C-Fällen. Eine Stimulierung von Wächter-Knoten-Lymphozyten aus einem Dukes B-Patienten mit 100 μg/ml karzinoembryonalem Antigen führte zu keiner proliferierenden Aktivität (Daten nicht gezeigt).
Lymphozyten mit einer spezifischen Aktivität gegen einen autologen Tumorextrakt wurden ausgewählt und in Langzeitkulturen gegeben. Die stimulierten Zellen umfassten überwiegend CD4⁺-T-Lymphozyten, wobei sie in der Gegenwart von IL-2 expandiert wurden und in vitro für mehrere Wochen überlebten.
Zellen aus den Tumoren, Wächter- und Nicht-Wächterknoten wurden nach einem intrazellulären Färben mit Cytokeratin-20, einem Marker epithelialer Krebse, durch FACS untersucht. Es wurde festgestellt, dass eine Permeabilisierung von Zellen mit Saponin einen Nachweis eines großen Anteils an Cytokeratin-20-positiven Zellen in den Tumoren ermöglichte (3B). Interessanterweise konnte eine geringe Zahl an Cytokeratin-20-positiven Zellen in einem Wächter-Knoten mit Mikrometastase nachgewiesen werden ( 3B, 2B, linkes Feld).

Claims

Verfahren zum Behandeln und/oder zum Vorbeugen des Wiederauftretens von Krebs, welches die Schritte umfasst von a) Bereitstellen von Lymphozyten, die aus Wächter-Lymphknoten eines Patienten erhalten werden; b) und Expandieren der Lymphozyten in vitro, wobei die Lymphozyten zur Wiedereinführung in den Patienten bestimmt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) Stimulieren der Lymphozyten in vitro durch die Zugabe von Zytokinen oder Antikörpern umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zytokine IL-2, INF-α, IL-12 sind und anti-IL4-Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Antikörper ein anti-CD3- und/oder ein anti-CD28-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Schritt (b) umfasst, dass die in Schritt a) bereitgestellten Lymphozyten einem zusätzlichen Aktivierungssignal ausgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Aktivierungssignal umfasst, dass die Lymphozyten einem autologen Tumorextrakt oder einem rekombinanten Antigen ausgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Aktivierung in der Gegenwart Antigen präsentierender Zellen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Antigen-präsentierende Zelle B-Zellen, Makrophagen, Monozyten, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Lymphozyten von einer menschlichen oder tierischen Quelle abgeleitet sind.