DE69713336T2 - Verfahren zur Herstellung von aktivierten markierten tumorspezifischen T-Zellen und deren Verwendung in der Behandlung von Tumoren - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von aktivierten markierten tumorspezifischen T-Zellen und deren Verwendung in der Behandlung von Tumoren

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Herstellung von aktivierten, markierten, tumorspezifischen T-Zellen durch Cokultivierung von Tumorzellen aus einem Patienten mit T-Zellen aus diesem Patienten, auf eine therapeutische Zusammensetzung, welche die aktivierten T-Zellen enthält, sowie auf deren Verwendung bei der Tumortherapie.
  • Tumorspezifische T-Lymphozyten erkennen Peptide, die von Proteinen abstammen, welche von Tumorzellen synthetisiert werden und die an der Zelloberfläche durch MHC-Moleküle dargestellt werden (Lurquin et al., Cell 58 (1989), 293 und Hellström, K. h., et al., The Biologic Therapy of Cancer, J. B. Lippincot Co., Philadelphia (1991) S. 35). Die T-Zellen erfordern jedoch zwei Aktivierungssignale, um die vollen Effektorfunktionen zu exprimieren (Mueller, D. L., et al., Annu. Rev. Immunol. 7 (1989) 445). Das Signal 1 wird erzeugt, wenn der T-Zellrezeptor (TCR) mit dem MHC-Peptidkomplex interagiert. Das Signal 2 wird von co-stimulierenden Molekülen bereitgestellt, die von ausgebildeten das Antigen zeigende Zellen (APC) exprimiert werden. Viele Tumore, insbesondere solche mit einem nicht- hämatopoetischen Ursprung, exprimieren keine co-stimulierenden Moleküle und können so die tumorspezifischen T-Lymphozyten nicht aktivieren (Chen, L., et al., Immunol. Today 14 (1993) 483). Diese Erkenntnis bildet den Hintergrund für die Einführung von Genen, welche in Tumorzellen co-stimulierende Moleküle codieren, um so ihre Immunogenität und das Impfungspotential zu erhöhen.
  • Unter den unterschiedlichen co-stimulierenden Molekülen sind die B7 Proteine (z. B. B7-1, B7-2 und B7-3) von besonderem Interesse, da sie auf ausgebildeten APC exprimiert werden (Vandenberghe, P., et al., Int. Immunol. 3 (1993) 229, Guinan, E. C., et al., Blood 84 (1994) 3261-3282; WO 95/03408).
  • Diese co-stimulierenden Moleküle interagieren mit den CD28 und CTLA4 Gegenrezeptoren, die auf den meisten T-Zellen exprimiert werden, was zu einem deutlichen Anstieg der IL-2 Herstellung, Proliferation und Erwerb der Effektorfunktion in CD4&spplus; und. CD8&spplus; T-Zellen führt (Azuma, M., et al., J. Immunol. 115 (1993) 2091). Das Blockieren der Lilgation von B7 mit einem löslichen, chimären CTLA4-Ig Molekül führt zu einer in vitro Nicht-Reaktionsfähigkeit, was zu dramatischen unterdrückenden Effekten hinsichtlich der humoralen Reaktion und der Abstoßungsreaktion in vivo führt. Es wurde ferner gezeigt, dass die Transfektion des B7-1 Gens in unterschiedliche Maustumorlinien in einigen Fällen zu einer Primärabstoßung und der Etablierung einer Schutzimmunität führen kann (Chen, L., et al., J. Exp. Med. 179 (1994) 523 und Ramarathinam, L., et al., J. Exp. Med. 179 (1994) 1205). Diese Studien haben jedoch eine beschränkte Wirksamkeit der B7-1 Aktivität auf die T- Zellen-abhängige Tumorimmunität gezeigt.
  • Die Wirksamkeit der B7 Co-stimulation der Antitumor-T-Zellen wird durch die Kooperation zwischen B7 und ICAM-1 gefördert, wodurch eine effiziente, tumorspezifische Immunreaktion stimuliert wird. Dieser Effekt ist abhängig von dem Erwerb einer potenten entzündlichen Reaktion (Cavallo, F., et al., Eur. J. Immunol. 25 (1995) 1154-1162).
  • Die Moleküle der B7 Familie sind CD28 Gegenrezeptoren, die auf den APCs exprimiert werden. B7-1 wurde charakterisiert und sequenziert von Freeman, G. J., et al., J. Immunol. 143 (1989) 2714-2722. B7-2 und B7-3 wurden charakterisiert und sequenziert von Freemann, G. J., Science 262 (1993) 909-911 und WO 95/03408. Die B7 Moleküle sind Mitglieder der Ig Supergenfamilie mit zwei Ig-ähnlichen Domänen (IgV und IgC) und einer Transmembrandomäne. Es wird vermutet, dass die B7 Moleküle als Monomer oder als ein Homodimer auf der Zelloberfläche existieren, wobei wenige, falls überhaupt, Hinweise vorliegen, dass es ein Heterodimer mit CD28 bilden kann (Lindsten, T., et al., J. Immunol. 151 (1993) 3489). Die B7 Moleküle haben eine höhere Affinität für CTLA-4 als für CD28. Die Gene der B7-1 und B7-2 Moleküle wurden lokalisiert an den chromosomalen Regionen 3q13.3-3q21. Obgleich diese Moleküle nicht sehr stark homolog auf dem DNA-Niveau sind, besitzen sie die identische Struktur der Ig-Supergenfamilie sowie die Fähigkeit an CD28 und CTLA-4 zu binden, wie dies oben bereits erwähnt wurde.
  • Es wurde jedoch gefunden, dass B7-1 und B7-2 hinsichtlich ihres Auftretens nach einer B- Zellaktivierung unterschiedlich sind. B7-2 erscheint auf der Zelloberfläche innerhalb von 24 Stunden nach einer B-Zellaktivierung, während B7-1 später erscheint (Boussiotis, V. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19 (1993) 11059). Es wurde ferner gefunden, dass in unstimulierten, menschlichen Monozyten B7-2 konstitutiv exprimiert wird, während die B7-1 Expression nach Aktivierung induziert wird (Azuma, M., et al., Nature 366 (1993) 76). B7-2 ist auch beschrieben in Boussiotis et al. B7-3 wurde bisher noch nicht molekular kloniert.
  • In der WO 95/03408 wird vorgeschlagen, eine Tumorzelle hinsichtlich der Expression von B7-2 und/oder B7-3 durch eine Transfektion der Tumorzelle mit einer Nukleinsäure, die für B7 kodiert, in einer Form zu modifizieren, die für die Expression von B7 auf der Tumorzelloberfläche geeignet ist. Alternativ wird die Tumorzelle durch Kontakt mit einem Mittel modifiziert, welches die Expression von B7 auf der Tumorzelloberfläche induziert oder verstärkt. Es wurde ferner vorgeschlagen, B7-2 und/oder B7-3 an die Oberfläche der Tumorzelle zu koppeln, um eine modifizierte Tumorzelle herzustellen. Der Ausdruck "koppeln", so wie er in der WO 95/03408 verwendet wird, bezieht sich auf ein chemisches, enzymatisches oder ein anderes Mittel (z. B. ein Antikörper), mit dem B7-2 und/oder B7-3 mit einer Tumorzelle verbunden wird, so dass das co-stimulierende Molekül (B7) auf der Oberfläche der Tumorzelle vorhanden ist und ein co-stimulierendes Signal in den T-Zellen triggern kann. Es wurde ferner vorgeschlagen, B7 chemisch mit der Tumoroberfläche zu vernetzen unter Verwendung von kommerziell verfügbaren Vernetzungsmitteln. Ein anderer Ansatz besteht in der Kopplung von B7-2 und/oder B7-3 mit einer Tumorzelle durch einen B7-spezifischen Antikörper, der an das co-stimulierende Molekül B7 und an ein Zelloberflächenmolekül auf der Tumorzelle bindet.
  • Die Herstellung von aktivierten tumorspezifischen T-Zellen kann durchgeführt werden durch Cokultivierung von Tumorzellen aus einem Patienten, wobei die Tumorzellen auf ihren Oberflächen solch ein co-stimulierendes Molekül tragen, mit T-Zellen von diesem Patienten. Die Modifikation von solchen Tumorzellen mit B7 gemäß dem bekannten Verfahren führt zu einer Reihe von Nachteilen und ist für eine Routinetherapie nicht geeignet. Die Transfektion der Tumorzellen mit der Nukleinsäure, die für ein co-stimulierendes Molekül codiert, ist im allgemeinen nicht sehr wirksam. Es ist ferner notwendig, dass die transfizierten und die nicht- transfizierten Zellen in einem mühsamen Verfahren vor der Cokultivierung mit den aktivierten T-Zellen getrennt werden. McHugh, R. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8059-8063 schlagen vor, B7-1 auf die Oberfläche von Tumorzellen durch die Verwendung eines gereinigten GPI (Glycosylphosphatidylinnosit) verankerten B7-1 Moleküls (GPI-B-7) einzuführen, welches fähig ist, seinen verwandten Liganden CD28 zu binden und sich selbst in die Tumorzellmembran nach einer kurzen Inkubation einzulagern. Die Stabilität von GPI-B-7 auf den Oberflächen von bestrahlten Tumorzellen ist jedoch beschränkt und die Zellen behalten nur eine minimale Anwesenheit von B7, was zur effektiven Bindung von CD28 in der Lage ist.
  • Das Koppeln von B7 an eine Tumorzelle unter Verwendung eines B7-spezifischen Antikörpers, der sowohl an das co-stimulierende Molekül als auch an das Zelloberflächenmolekül des Tumors bindet, hat ernsthafte Nachteile. Die B7-Antikörper, die im Stand der Technik beschrieben sind, binden an B7 unglücklicherweise in solch einer Weise, dass die Bindung von B7 an CD28 dramatisch abnimmt oder vollständig gehemmt wird. Der Grund dafür besteht darin, dass alle bekannten Anti-B7-1 und Anti-B7-2 monoklonalen Antikörper mit CD28 interagieren und so die T-Zellantwort hemmen (Azuma, M., et ab, J. Exp. Med. 175 (1992) 353-360; Azuma, M., et al., J. Immunol. 149 (1992) 1115; Azuma, M., et al., J. Exp. Med. 177 (1993) 845; Caux, C. et al., J. Exp. Med. 180 (1995) 1841-1847).
  • Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von aktivierten tumorspezifischen T-Zellen bereitzustellen, welches in einer einfachen Weise durchgeführt werden kann und eine hohe Wirksamkeit zeigt.
  • Der Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung von aktivierten tumorspezifischen T-Zellen durch die Cokultivierung, ex vivo, von Tumorzellen aus einem Patienten mit T-Zellen von diesem Patienten, wobei das Verfahren die Schritte umfasst
  • i) Inkubieren der Tumorzellen mit einem ersten Fusionsprotein, das aus einem B7 Protein und einem Partner eines biologischen Bindungspaares erzielt wurde, und einem zweiten Fusionsprotein, das von einem Antikörper gegen ein Zelloberflächen-Antigen und dem anderen Partner des biologischen Bindungspaares erzielt wurde;
  • ii) Hemmen der Proliferation der Tumorzellen vor oder nach dieser Inkubation;
  • iii) Cokultivieren der Tumorzellen mit den zu aktivierenden T-Zellen, bis die Aktivierung der T-Zellen erzielt ist;
  • iv) Abtrennen der aktivierten T-Zellen von den Tumorzellen.
  • T-Zellen eines Patienten werden von peripheren Blutlymphozyten (PBMC) isoliert, die aus der Leukozyten- und Trombozytenschicht (buffy coat) von normalen menschlichen Blutproben erzielt wurden (Dellabona, P., et al., 3. Exp. Med. 177 (1993) 1763-1771). Nach Zentrifugation werden die einkernigen Zellen gesammelt und vermehrt (Dellabona, P., et al., J. Exp. Med. 177 (1993) 1763-1771). Aus dieser Zubereitung werden die CD4&spplus; und CD8&spplus; Lymphozyten durch die magnetische, aktivierte Zellsortierung (MACS) isoliert.
  • Die T-Zellen, die für die Aktivierung verwendet werden, können aus einem Patienten gemäß bekannten Verfahren gewonnen werden, vorzugsweise durch eine einfache Passage von PBMC durch eine Nylonwolle-Säule, wodurch die B-Zellen und die Monozyten ausgeschlossen werden (Julius, M. H., et al., Eur. J. Immunol. 3 (1973) 645). Die CD8&spplus; (mit oder ohne CD4&spplus;) T-Zellen werden aus dem peripheren Blut des Patienten in vitro durch ein Sortierverfahren gereinigt, vorzugsweise durch eine immunomagnetische Sortierung. Es ist ferner bevorzugt, eine gemischte Population von Tumorinfiltrierenden T-Zellen (TIL) und gereinigten CD8&spplus; T-Zellen zu verwenden, die von einer chirurgischen Tumorprobe gemäß Anichini, A., et al., J. Exp. Med. 177 (1993) 989 erzielt werden.
  • Der Ausdruck "aktivierte tumorspezifische T-Zelle" bezeichnet vorzugsweise tumorspezifische T-Zellen, die in der Lage sind, in spezifischer und beschränkter Weise die Tumorzellen abzutöten, die ursprünglich dazu verwendet wurden, sie zu aktivieren. Diese Aktivierung ist MHC-beschränkt im Sinne von Townsend, A., und Bodmer, H., Ann. Rev. Immunol. (198) 601.
  • Erzeugung von tumorspezifischen T-Zellen: Gesamt-PBMC oder gereinigte CD8&spplus; T-Zellen werden in Platten mit 24 Vertiefungen in einem Verhältnis von 10 : 1 bis 5 : 1 mit nicht- replizierenden Tumorzellen (bestrahlt oder mit C behandelt oder beides), die entweder autolog oder semi-allogen sind, in 2 ml eines RPMI-Standardmediums bei 37ºC kultiviert, welches 5% menschliches Serum enthält. Multiple Kulturen, die 2 bis 5 Millionen PBMC oder 1 bis 2 Millionen CD8&spplus; T-Zellen enthalten, können angelegt werden. Die Tumorzellen wurden zuvor mit einer gesättigten Konzentration (zu bestimmen in Abhängigkeit von den verschiedenen Arten an Konstrukten) von löslichen B7-1 oder B7-2 Ig · Antitumor mAb vorgepulst. Rekombinantes, menschliches IL-2 wird der Kultur mit 5 U/ml am Tag +5 der Kultur zugesetzt und bis zum Tag +10 aufrechtgehalten, wobei anschließend die Konzentration auf 10 U/ml angehoben wird. Am Tag +15 der Kultur werden die lebenden T- Zellen aus der Kultur mittels einer Zentrifugation über einen Ficoll-Gradienten gewonnen und re-stimuliert unter Verwendung der glichen, nicht-replizierenden Tumorzellen, die mit rekombinantem B7-1 oder B7-2 Ig · Antitumor mAb in einem Verhältnis von T-Zelle/Tumor von 2 : 1 vorgepulst waren, wobei eine Konzentration von 1 Million T-Zellen pro ml erreicht wird. Dieser Restimulationsschritt wird in Platten mit 24 Vertiefungen durchgeführt, wobei ein RPMI-Standardmedium verwendet wird, welches menschliches Serum enthält, das mit 2 U/ml rekombinantem, menschlichen IL-2 ergänzt ist. Am Tag +5 wird die Konzentration von rhIL-2 auf 10 U/ml angehoben und bis zum Tag +15 aufrechterhalten.
  • Die T-Zellen können ein drittes Mal, wie oben beschrieben, restimuliert werden, bevor sie in einem konventionellen Cytotoxizitätstest (Lanzavecchia, A., Nature 319 (1986) 765-767) gegen die Tumorzellen, die für die Restimulation in vitro verwendet wurden, getestet werden, wobei nicht-verwandte Tumorzellen als Kontrolle dienen. Die Spezifität der T-Zelllinie für den Tumor wird gemäß dem Ausmaß der in dem Test gezeigten Cytotoxizität beurteilt. Eine spezifische Abtötungsaktivität von etwa 30-40% kann als relevant für ein therapeutisches Interesse betrachtet werden. In diesem Fall kann die tumorspezifische, polyklonale T-Zelllinie unter Verwendung eines polyklonalen Aktivators expandiert werden: PHA in Gegenwart von bestrahlten, allogenen Feeder-Zellen (allogen PBMC) und 10 U/ml von rhIL-2, oder Anti- CD3 mAb + B7-1 IgM und 10 U/ml von rhIL-2. Am 15. Tag der Restimulation wird rhIL-2 auf 20 U/ml für 5 Tage angehoben und dann auf 50 U/ml für weitere 5 Tage. Durch verschiedene Kreisläufe der Restimulation ist es möglich, die gewünschte Zahl an aktivierten T-Zellen, die dem Patienten wieder zugeführt werden, zu erreichen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Proliferation der Tumorzellen vor oder nach der Inkubation gemäß dem Schritt i) gehemmt. Dies kann beispielsweise mittels Bestrahlung oder durch die Verwendung von Mitomycin C erzielt werden. Bei der Bestrahlung werden vorzugsweise 3000-5000 Rad verwendet, während für die Hemmung mit Mitomycin C vorzugsweise 50-100 ug/l Million Zellen verwendet werden. Mitomycin C ist für die Hemmung bevorzugt, da es das Überleben der Tumorzellen während der Restimulation der T-Zellen verlängert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung werden die aktivierten T- Zellen markiert, vorzugsweise nach Aktivierung. Solch ein Marker ist vorzugsweise ein Molekül, das auf der Oberfläche der markierten Zelle vorhanden ist. Es ist somit insbesondere bevorzugt, die T-Zellen mit einer Nukleinsäure zu transformieren, die für ein Protein codiert, welches auf der Oberfläche dieser Zelle vorhanden ist. Solche Zelloberflächenproteine oder Antigene sind beispielsweise CD24 (J. Cell, Biochemistry Supplement 17E, Seite 203, Abstract S 210), LDL oder NGF Rezeptor (WO 95/06723).
  • Nach einer autologen Transplantation dieser aktivierten T-Zellen, die mit solch einem Genprodukt markiert sind, ist es möglich, diese Zellen direkt nach Transplantation in den Patienten zu verfolgen. Diese Genmarkierung erlaubt die Überwachung und den Vergleich der Wirksamkeit der Therapie mit den aktivierten tumorspezifischen T-Zellen.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die T-Zellen ferner mit einem Suizidgen transferiert werden. Solch ein Gen führt direkt oder durch Mediatoren zum Tod der infizierten Zellen (s. WO 92/08796 und PCT/EP 94/01573) für eine in vivo spezifische Eliminierung dieser Zellen nach einer erfolgreichen therapeutischen Behandlung. Für diesen Zweck wird bevorzugt das Thymidinkinasegen angewandt, welches den transduzierten aktivierten T-Zellen eine in vivo Empfindlichkeit gegenüber Gancyclovir für die in vivo spezifische Eliminierung der Zellen verleiht. Wenn beispielsweise der Patient Anzeichen für eine akute Inkompatabilität für die aktivierten T-Zellen zeigt, z. B. eine Reaktion des Empfängers gegen das Transplantat (GVHD), begleitet mit zunehmenden Leberfunktionsenzymen und einer positiven Hautbiopsie, ist es bevorzugt, zwei i. v. Dosen von etwa 10 mg/kg von Gancyclovir zu verabreichen. Dies führt zu einen Reduktion der markierten, aktivierten T-Zellen, ohne dass eine nennenswerte Reduktion der anderen Lymphozyten auftritt.
  • Das Diphtherie-Toxingen ist auch ein bevorzugtes Suizidgen, welches beschrieben ist in WO 92/05262. Für die in vivo spezifische Eliminierung der aktivierten T-Zellen ist es auch möglich, eine Zellapoptose zu induzieren. Es ist somit bevorzugt, einen modizifierten FAS- Rezeptor und eine Dosis eines verwandten Liganden zu verwenden.
  • Die Tumorzellen des Patienten werden aus einer chirurgische Probe entnommen. Ein Aliquot der Tumorzellen kann für die nachfolgende Stimulation der T-Zellen zur Regeneration einer Tumorzelllinie verwendet werden, wobei dies entweder in vitro oder in vivo in immundefizienten Mäusen geschehen kann. Der Rest der frischen Tumorzellen wird für die direkte Stimulation der T-Zellen verwendet. Solche Tumorzellen stammen beispielsweise von einem Melanom, Carcinom (z. B. Brust, Cervix, Kopf und Nacken, Dickdarm, Lunge, Niere, Magen), Sarcom, Lymphom oder von einer Leukämie.
  • Der Ausdruck "biologisches Bindungspaar" soll eine Kombination von zwei Molekülen kennzeichnen, die eine hohe spezifische Bindungskapazität zueinander besitzen. Solche Bindungspaare sind beispielsweise Biotin/Avidin (oder Streptavidin/Neutravidin), oder Zucker/Concanavalin A. Die Affinitätskonstante der Bindung beträgt vorzugsweise kd < 1 nmol/l. Vorzugsweise werden höhere Affinitätskonstanten verwendet. Aus diesem Grund ist die Biotin/Avidin oder Streptavidin-Interaktion aufgrund ihrer hohen Affinität bevorzugt. Diese Interaktion ist stärker als jeder andere Rezeptorligand in einem Körper. Deshalb kann sie in vivo für die Konjugation von zwei Komponenten eines bifunktionalen Reagenz benutzt werden. Die Verfahren für die Biotinylierung sind beschrieben in Harlow, E. und Lane, D., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 341. Die Biotinylierung oder die Vernetzung mit Avidin oder Streptavidin oder Neutravidin wird gemäß den Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, durchgeführt.
  • Eine bevorzugte Technik für die Paarung von zwei Proteinmolekülen ist die chemische Vernetzung, die eine stabile kovalente Brücke ausbildet. Viele bifunktionelle Vernetzer sind kommerziell verfügbar. Der SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat)-Vernetzer ist besonders bevorzugt.
  • Als B7 Protein können Teile oder alle von B7 verwendet werden, vorzugsweise B7-1, B7-2 oder B7-3. Vorzugsweise werden Teile von B7 Proteinen verwendet, welche wenigstens die N-terminale, variable Domäne umfassen. Die B7-1 oder B7-2 Proteine und Derivate, die in WO 95/03408 beschrieben sind, wobei diese Publikation hiermit durch Referenz eingeführt ist, sind besonders bevorzugt. Da die Bindung des B7 Fusionsproteins an die Zelloberfläche effektiv durch eine Interaktion zwischen dem biologischen Bindungspaar und der Bindung des Antioberflächen-Antigen-Antikörpers bewirkt wird, ist es notwendig, dass das B7 Molekül noch die Transmembrandomäne enthält.
  • Das zweite Fusionsprotein enthält einen Antikörper gegen ein Zelloberflächen-Antigen und den anderen Partner des biologischen Bindungspaares. Als Antikörper können solche Antikörper verwendet werden, die gegen eine große Zahl von Zelloberflächen-Antigene gerichtet sind. Diese Zelloberflächen-Antigene brauchen nicht notwendigerweise Tumorzellspezifische Oberflächenantigene zu sein. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, Antikörper gegen Oberflächenantigene zu verwenden, die in einem großen Ausmaß auf den Zelloberflächen auftreten, wie ERB B2 oder der Transferinrezeptor. Es ist jedoch auch möglich, Antikörper gegen geeignete Tumor-assoziierte Antigene zu verwenden, wie CEA für Dickdarmkarzinom, Lungenkarzinom, Brustkarzinom; CD33 für Knochenmarkleukämie; CD19/CD20 CALLA und CD38 für B-Zell-Leukämie, Lymphom, Myelom; Met für Magenkarzinoms; OVCA (MOV-18) für Eierstock-Karzinom; oder Melanom-spezifische Antigene.
  • Die Cokultivierung der aktivierten Tumorzellen mit den T-Zellen wird vorzugsweise in Gegenwart einer geringen Dosis an Lymphokinen (IL-2, IL-6, IL-7) durchgeführt, die zusätzlich in der Lage sind, die T-Zellen zu stimulieren. Verschiedene Runden der Restimulierung sind bevorzugt, um eine große Zahl an Tumor-spezifischen Effektor-T-Zellen zu erzielen. Drei bis vier Tage nach der letzten Restimulierung in vitro werden die Tumoreffektor-T-Zellen intravenös in den Patienten wieder eingeführt. Die Zahl der T-Zellen, die dem Patienten zugeführt werden muss, ist variabel und kann gemäß etablierten Protokollen herausgefunden werden. Vorzugsweise wird eine i.v.-Infusion für vier Wochen verwendet, die besteht aus 10&sup7;-10&sup9;-Zellen/cm² des Körperoberflächenbereiches. Etablierte Protokolle sind beispielsweise beschrieben in Greenberg, P. D., Adv. Immunol. 49 (1991) 281-355 und Riddel, R. R., et. al., Science 257 (1992) 238-241. Zum Zeitpunkt der passiven Immunisierung können die Patienten mit immunogenen Tumorzellen geimpft sowie mit löslichen, rekombinanten, tumorspezifischen B-Zellmolekülen behandelt werden, um die weitere Restimulierung in vivo zu erzielen. Dies kann durch intravenöse Injektion in den Patienten mit einer vorbestimmten Menge des löslichen B7-Konjugates erreicht werden, wobei das mAb an die Oberfläche der Zellen des diagnostizierten Tumors bindet. Wenn der Tumor mehr als einen geeigneten Marker exprimiert, können mehr als ein B7 · Antitumor mAb-Molekül in den Patienten injiziert werden. Die Menge des löslichen Reagenz und der Plan für die Injektionen kann während den preklinischen und klinischen Versuchen bestimmt werden, wobei beispielsweise radiomarkierte Proteine verwendet werden, um ihre Clearance und die Wirksamkeit des gezielten Einsatzes in die Tumormasse zu überwachen. Alle wichtigen Parameter für diese Art der Behandlung müssen von der konventionellen Erfahrung der pharmakologischen und nuklearen Medizin abgeleitet werden und sind nicht schwierig herauszufinden. Es wird auch wichtig sein, die Reaktion der Neutralisierung der Antikörper zu überwachen, welche die Patienten gegen die rekombinanten Proteine aufbringen können.
  • Wie oben erwähnt, ist es bevorzugt, die aktivierten T-Zellen in vivo nach der Anwendung zu überwachen. In diesem Fall basiert die passive Immuntherapie auf der ex vivo Expansion der tumorspezifischen T-Zellen, die vorzugsweise mit LNGFR markiert sind, und der Wiedereinführung des Impfmaterials in einen Patienten, vorzugsweise zusammen mit dem tumorspezifischen, löslichen B7 Konjugat. In diesem Fall wird das lösliche B7 Konjugat die transferierten tumorspezifischen Effektor-T-Zellen an dem Ort der restlichen Tumormasse restimulieren, was eine optimale Vermehrung in vivo der Immunreaktion erlaubt. In Abwesenheit der löslichen B7 Konjugate (oder in Abwesenheit einer anderen adäquaten Co- Stimulierung) werden die übertragenen Antitumor-T-Zellen weniger Kreisläufe des Abtötens leisten, wobei sie anschließend funktional inaktiviert oder durch programmierten Zelltod physikalisch eliminiert werden können. Das Markieren der tumorspezifischen T-Zellen, die während der passiven Immuntherapie übertragen werden, erlaubt die Überwachung der Wirksamkeit dieses Verfahrens durch die Bestimmung der Persistenz der übertragenen T- Zellen in den Patienten.
  • Die Fig. 1 beschreibt die Proliferation von menschlichen primären CD4&spplus;CD45RO&spplus; T-Zellen, die mit rekombinanten, löslichen B7-Ig-Molekülen co-stimuliert sind (A: anti-CD3; B: anti- CD3&spplus; B7-2IgG3; C: anti-CD3&spplus; B7-1IgG1).
  • Die Fig. 2 A beschreibt das Überleben der tumorspezifischen T-Zelllinien. Die autologe Antitumor-CTL-Linie kann in vitro nur durch B7-2 IgG3 gerichtete RMA-Thyl.1 Zellen induziert, erhalten und vermehrt werden, aber nicht durch gerichtete CD4-IgG1 Zellen als Kontrolle (a: Restimulierung; b: passive Immunisierung).
  • Die Fig. 2 B beschreibt eine spezifische, anti-RMA T-Zelllinie, aber keine anti-J558L T- Zelllinie, die effizient Mäuse heut, welche mit RMA Lymphomzellen beimpft wurden. Die CTL-Linien, die in vitro durch RMA-Thyl.1 Zellen, gerichtet mit B7-2-IgG3 Molekülen, induziert werden, haben eine 100% therapeutische Aktivität, wenn sie passiv in Mäuse, welche einen etablierten RMA-Tumor tragen, übertragen werden. 80% der geheilten Mäuse entwickeln eine systemische Immunität gegen einen nachfolgenden Immunitätstest mit RMA- Zellen (a: Immunitätstest mit Wildtyp-RMA; Mäuse sind behandelt mit PBS/IL-2 nur/CD8 anti-J558L +IL-2/CD8 anti-RMA + IL-2).
  • Die Fig. 3 A beschreibt das Überleben der Mäuse, die mit B7-2 IgG3 vorgerichteten RMA Thyl.1 lebenden Zellen beimpft wurden. Primäre Abstoßung bei 40% der Mäuse, die mit lebenden RMA-Thyl.1 Zellen behandelt wurden, vorgerichtet in vitro durch das dreistufige Verfahren mit B7-2-IgG3.
  • Die Fig. 3 B beschreibt die therapeutische Wirksamkeit von B7-2 IgG3 gerichteten, nicht- replizierenden RMA Thyl.1 Zellen. Nur die nicht-replizierenden RMA-Thyl.1 Zellen, vorgepulst in vitro durch drei Schritte mit B7-2-IgG3, können 60% der Mäuse heilen, die einen etablierten Tumor tragen.
    • Beispiel 1: Lösliches B7-1IgG1 und B7-2IgG2 co-stimulieren die Proliferation von primären CD4&spplus;CD45RO&spplus; menschlichen T-Zellen
  • Gereinigte, lösliche, rekombinante B7-1Ig und B7-2I g Moleküle (Traunecker, A., et al., Immunology Today 10 (1989) 29-31 und Traunecker, A., et al., Nature 331 (1988) 84-86) wurden auf ihre Fähigkeit getestet die Proliferation von hoch reinen, menschlichen, primären CD4&spplus;CD45RO&spplus; T-Lymphozyten zu co-stimulieren. Die T-Zellen wurden mit einer suboptimalen Konzentration des anti-CD3-spezifischen Antikörpers in Gegenwart einer zunehmenden Konzentration von löslichen B7-1Ig oder B7-21 g, die mit den Kunststoffvertiefungen vernetzt waren, aktiviert. Wie in der Fig. 1 dargestellt, co-stimulieren beide lösliche B7 Moleküle in einer Dosis-Wirkungs-Weise die Proliferation von menschlichen primären T-Zellen.
    • Beispiel 2: Lösliches B7-1IgG1 co-stimuliert den Erwerb der cytolytischen Aktivität in menschlichen primären CD8&spplus; T-Zellen gegen allogene Tumorzielzellen
  • Primäre menschliche CD8&spplus; T-Zellen werden unter Verwendung von anti-CD4&spplus; mAb und magnetischen Perlen durch negative Erschöpfung der CD4&spplus; T-Zellen auf Homogenität (Reinheit von 90%) gereinigt. Eine Million der gereinigten CD&spplus; T-Zellen werden in vitro mit fünf Millionen Jurkat-Lymphomzellen restimuliert, und zwar in Gegenwart von unlöslichen B7-1IgG1 Molekülen, B7-IIG1 und IL-2, IL-2 alleine oder in Gegenwart von dem chimären Kontrollmolekül CD4-IgG1. Nach fünf Tagen wurden die reagierenden T-Zellen auf einem Ficoll-Gradienten gereinigt und auf Cytotoxizität gegen Jurkat-Zellen mit verschiedenen Effektor/Ziel-Verhältnissen getestet. Die Fig. 2 zeigt, dass die in Gegenwart von B7-1IgG1 und IL-2 durch Jurkat-Zellen stimulierten CD8&spplus; T-Zellen das Ziel effizienter abtöten als IL-2 alleine. Lösliche B7-1Ig Moleküle sind somit in der Lage, den Erwerb der Effektorfunktion in CD8&spplus; T-Zellen zu induzieren.
    • Beispiel 3: Biotinylierung der Antikörper
  • Die Biotinylierungen werden unter Verwendung eines Succinimidesters von Biotin durchgeführt. Das Koppeln wird durch die freien Aminosäuren an dem Antikörper oder einem anderen Protein, normalerweise Lysylreste, erzielt. Eine Lösung von N-Hydroxysuccinimid- Biotin mit 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid und einer Antikörperlösung von wenigstens 1-3 mg/ml Natriumboratpuffer (0,1 M, pH 8,8) wird hergestellt. Wenn die Antikörper in Natriumazid gelagert waren, muss das Azid vor dem Koppeln durch intensive Dialyse gegen den Boratpuffer entfernt werden. Der Biotinester wird dem Antikörper in einem Verhältnis von 25-250 ug Ester pro Milligram Antikörper zugegeben, gut gemischt und bei Raumtemperatur für vier Stunden inkubiert.
  • Hohe Konzentrationen des Biotinesters werden zu multiplen Bindungen der Biotingruppen an den Antikörper führen und die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass alle Antikörper markiert sind. Niedrigere Verhältnisse wird die Biotinylierung auf einem Minimum halten (25 ug Ester/mg Antikörper führt zu einem molaren Anfangsverhältnis von etwa 10 : 1). 20 ul von 1 M NH&sub4;Cl pro 250 ug Ester werden hinzugefügt und die Mischung wird für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Antikörperlösung wird gegen PBS oder einen anderen gewünschten Puffer dialysiert, um das nicht-gekoppelte Biotin zu entfernen. Das Biotin dialysiert langsamer als man es gemäß seiner Größe erwarten würde, so dass eine intensive Dialyse notwendig ist.
    • Beispiel 4: Plasmozytom-Zellen, die B7-1Ig oder B7-2I g Moleküle abgeben, induzieren eine wirksame Antitumor-Schutzimmunität in syngenen Mäusen
  • J558L Plasmozytom-Klone, die B7-1IgG1, B7-1IgM, B7-2IgG3, CD4IgG1, CD4IgM oder CTLA4IgG1 absondern, wurden in die rechte Flanke von syngenen Balb.c Mäusen injiziert und ihr Wachstum wurde beobachtet. Keine der Mäuse, die mit den Plasmozytom-Zellen, welche B7-1 oder B7-2 Moleküle abgeben, behandelt wurden, entwickelten eine Tumormasse, während sich Tumore in allen Mäusen entwickelten, die mit Zellen behandelt wurden, die Kontroll-CD4 oder CTLA4 Moleküle abgeben. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.
  • Ferner zeigen alle Mäuse, die B7 Ig Moleküle absondernde J558L Zellen abgestoßen haben, eine schützende zweite Reaktion gegen einen späteren Immunitätstest mit parentalen Plasmozytom-Zellen (Tabelle 1). Die löslichen chimären B7-1 und B7-2 Moleküle halten somit in vivo die Fähigkeit aufrecht, eine effiziente Antitumorimmunität zu verleihen und Tiere gegen Tumore zu impfen, auf die sie gerichtet sind. Tabelle 1: J558L Plasmozytom-Zellen, die menschliche B7-1Ig oder B7-2Ig absondern, können verwendet werden, um syngene Tiere für einen späteren Immunitätstest mit nicht-transfizierten, parentalen Zellen zu impfen.
    • Beispiel 5: Induktion von autologen CTLs
  • Das für das Thyl.1 Allel codierende Gen wurde in zwei Maustumor-Zelllinien (T Lymphom RMA und Brust-Adenokarzinom TS/A) transfiziert, die syngen zu Mäusestämmen waren, die das Thyl.2 Allel exprimieren (C57.B6 und Balb.c). Nach Einbringung der Tumorzellen in die Mäuse werden sie auf diesem Weg das einzige Gewebe der Maus darstellen, was den spezifischen Tumormarker exprimiert. Es ist auch bevorzugt, als Tumormarker die Allele Ly2.1 (CD8) und Ly5.1 (CD45) für die Verbesserung des Verhaltens auf der Tumorzelloberfläche (d. h. einfaches Capping, Internalisierung oder Sheeding) zu verwenden. Es werden mAbs verwendet, die spezifisch sind für den gewünschten allelen Tumonnarker, der den auf den Tumor gerichteten Arm darstellt. Sie werden so verwendet, wie sie sind, oder sie können auf ein -46ab' Fragment reduziert werden.
    • Priming mit RMA-Thyl.1+ (Dreifach-Schritt)
  • Nicht-replizierende (bestrahlt oder mit Mitomycin C behandelt) RMA oder TS/A Zellen, die Thyl.1 exprimieren, werden bei 4ºC mit einer sättigenden Dosis von einem biotinylierten, Thyl.1 spezifischen, monoklonalen Antikörper (mab 19E12) gepulst. Das überschüssige mab wird ausgewaschen und eine Überschußmenge von Neutravidin (NAv, rekombinantes Avidin von Pierce) wird hingefügt. Das NAv ist tetravalent und bindet an das biotinylierte 19E12 mab, wobei aber noch wenigstens eine freie Bindungsstele für ein anderes biotinyliertes Molekül freibleibt. Das überschüssige NAv wird herausgewaschen und das biotinylierte, rekombinante B7-1IgG1 oder das B7-2IgG3 wird hinzugefügt, um die Dreistufen-Brücke zu vervollständigen. Als Kontrolle wird ein Priming mit RMA Zellen, die mit Thyl. 1 transfiziert sind, verwendet. Nach sechs Tagen werden die überlebenden T-Zellen in einem Abtötungstest gegen parentale RMA Zellen überprüft.
  • Die Tumorzellen exprimieren nun an ihrer Oberfläche potente co-stimulierende Moleküle in Abwesenheit von jeder genetischen Manipulation.
  • Die dreistufig gepulsten Tumorzellen werden verwendet, um in vitro allogene, zytolytische CD8&spplus; T-Zellen zu restimulieren.
  • Nur Zellen, die funktionales B7-1 oder B7-2 auf ihrer Oberfläche exprimieren, können in vitro die autologe Effektorzelle primen Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 und in der Fig. 2 gezeigt. Tabelle 2: Das Abtöten ist spezifisch und es gibt kein NK-Töten auf NK-Zielen (YAK oder RMA-S Zellen)
  • E/T = Effektor/Ziel-Verhältnis
    • Beispiel 6: Induktion einer Schutzreaktion durch die dreistufig vorgepulsten Tumorzellen
  • Lebende Tumorzelle (z. B. RMA-Thyl.1), vorgepulst in vitro mit löslichem B7-1 oder B7-2 (z. B. B7-2IgG3) unter Verwendung des Dreistufen-Verfahrens, werden subcutan (s. c.) in syngene Mäuse eingebracht und auf Abstossung bewertet. Nicht-replizierende Tumorzellen, die in vitro mit dem dreifachen Schritt vorgepulst wurden, werden verwendet, um Mäuse bei einem zweiten Immunitätstest mit einer lethalen Dosis der parentalen Zellen (siehe die Ergebnisse in Fig. 3 A) zu impfen.
    • Beispiel 7: Induktion einer heilenden Immunität gegen eine minimale Tumorresterkrankung
  • Mäuse werden entweder s. c. oder intravenös (i. v.) mit verschiedenen Dosen von lebenden Tumorzellen, die das Thyl.1 Allel exprimieren (oder andere tumorspezifische Marker), behandelt. Die Tumore wachsen für einige Tage und werden da n mit nicht-replizierenden RMA-Thyl.1 Zellen behandelt, die in vivo durch drei Schritte mit B7-2-IgG3 vorausgerichtet wurden. Das nicht-replizierende, therapeutische Zellimpfmaterial wird zweimal s. c. pro Woche über einen Zeitraum von drei Wochen gegeben (siehe die Ergebnisse in der Fig. 3 B).
    • Beispiel 8: Induktion einer heilenden Immunität gegen eine minimale Tumorresterkrankung durch eine direkte, in vivo Dreistufen-Verabreichung von B7-Ig Molekülen
  • Die Mäuse werden entweder s. c. oder intravenös (i. v.) mit verschiedenen Dosen von lebenden Tumorzellen, die das Thy1.1 Allel (oder andere tumorspezifische Marker) exprimieren, behandelt. Die Tumore wachsen für einige Tage und werden dann in vivo mit dem Dreistufen-Verfahren behandelt. Zunächst erhalten Sie biotinylierte Anti-Thyl.1 mab,12 Stunden später NAv und 36 Stunden später das biotinylierte lösliche, rekombinante B7-1 B7- 2. Das Tumorwachstum wird dann ausgewertet. Das in vivo Dreistufen-Verfahren kann über die Zeit wiederholt werden und kann mit der Verwendung von rekombinanten, biotinylierten Lymphokinen verbunden werden, die am Ort der Tumormasse mit B7-1 oder B7-2 (IL-4, IL- 7, IL-10, IFN-gamma, IL-12) zusammenwirken können.
  • Die Induktion der heilenden Reaktion gegen die minimalen Tumorresterkrankungen durch die Kombination des Dreistufen-Verfahrens der löslichen B7-I oder B7-2 co-stimulierenden Moleküle mit der aktiven Immunisierung mit genetisch veränderten Tumorzellen und/oder der passiven Immunisierung mit tumorspezifischen T-Zelllinien erstreckt die in vitro Restimulierung auf eine in vivo Restimulierung.
  • Die veränderten Tumorzellen, die als Impfmaterial verwendet werden, können entweder durch Transfektion mit Genen, die für B7-1 oder für B7-2 codieren, oder durch das Dreistufen-Vorpulsverfahren erzeugt werden. In gleicher Weise können die tumorspezifischen T-Zellen durch das oben beschriebene Dreistufen-Protokoll induziert und ja vitro entwickelt werden.
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  • WO 92/08796
  • WO 95/03408
  • WO 95/06723

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von aktivierten Tumor-spezifischen T-Zellen durch ex- vivo-Co-Kultivierung von Tumorzellen aus einem Patienten mit T-Zellen aus diesem Patienten, umfassend die Schritte
i) Inkubieren der Tumorzellen mit einem ersten Fusionsprotein, das aus einem B7- Protein und einem Partner eines biologischen Bindungspaars erhalten wurde, und einem zweiten Fusionsprotein, das aus einem Antikörper gegen ein Zelloberflächen-Antigen und dem anderen Partner des biologischen Bindungspaars erhalten wurde;
ii) Inhibieren der Proliferation der Tumorzellen vor oder nach dieser Inkubation;
iii) Co-Kultivieren der Tumorzellen mit den zu aktivierenden T-Zellen, bis die Aktivierung der T-Zellen erzielt wird;
iv) Abtrennen der aktivierten T-Zellen von den Tumorzellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass die aktivierten T-Zellen vor oder nach der Aktivierung nach Schritt iii) markiert werden.
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