DE69910362T2

DE69910362T2 - Anwendung der mesenchymalen stammzellen als immunsuppressiva

Info

Publication number: DE69910362T2
Application number: DE69910362T
Authority: DE
Inventors: D. Joseph MOSCA; R. Kevin McINTOSH
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2019-03-13
Also published as: WO1999051275A2; EP1066060A2; CA2326838A1; US20020044923A1; PT1066060E; WO1999051275A3; JP2002510655A; ATE246938T1; DE69910362D1; EP1066060B1; DK1066060T3; ES2205792T3; US6797269B2; AU2999199A; CA2326838C

Description

Die Erfindung basiert auf der US-Provisional Application SN 60/080,678 vom 3. April 1998 und beansprucht deren Priorität.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Induktion von Immunosuppression durch Verwendung von mesenchymalen Stammzellen zur Hemmung der T-Zellaktivierung gegen Antigene.
Hintergrund der Erfindung
Bei einer normalen Immunantwort werden T-Zellen durch ein erstes, antigenspezifisches Signal, das T-Zellen über den T-Zell-Antigenrezeptor stimuliert und der Immunantwort Antigenspezifität verleiht, und ein zweites, kostimulierendes Signal, das von kostimulierenden Molekülen, die auf der Oberfläche von ein Antigen präsentierenden Zellen auftreten, aktiviert. Beide Signale sind zur Induktion der T-Zellproliferation ertorderlich. Wenn das zweite kostimulierende Signal nicht erfolgt oder wenn der Kostimulationsweg blockiert oder heruntergeregelt wird, so wird die Aktivierung von T-Zellen verringert oder beseitigt. Dies führt zu einer Hyporeaktivität der T-Zellen auf Antigen und kann einen Zustand von T-Zellen-Anergie oder T-Zellen-Nichtreaktivität hervorrufen, wobei sich die T-Zellen nicht vermehren, wenn ihnen ein Antigen präsentiert wird. Die am besten charakterisierten kostimulierenden Moleküle an Antigenpräsentierenden Zellen sind die strukturell verwandten Glycoproteine B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86). Es handelt sich um homodimere Mitglieder der Immunoglobulin-Oberfamilie, die ausschließlich auf der Oberfläche von Zellen, die zur Befähigung des T-Zell-Wachstums befähigt sind, auftreten. Beim Rezeptor für B7-Moleküle an der T-Zelle handelt es sich um CD28, ein weiteres Mitglied der Immunoglobulin- Oberfamilie. Eine Ligation von CD28 durch B7-1 oder B7-2 oder durch anti-CD28-Antikörper führt zur Kostimulation des Wachstums von nativen T-Zellen, während Antikörper gegen B7-Moleküle, die die B7-Bindung an CD28 hemmen, die T-Zell-Reaktionen hemmen.
Die Funktion des Immunsystems besteht in der Beseitigung von fremden Zellen, die Pathogene enthalten können, wobei die Nichtreaktivität oder Toleranz gegen Selbstantigene aufrechterhalten wird. Die Toleranz zeigt sich durch T-Zell-Anergie, gekennzeichnet durch das Überleben der T-Zellen, die aber eine nicht-reaktive Beschaffenheit aufweisen. Jedoch kann das Immunsystem eigene Bestandteile angreifen, was zu einer Autoimmunerkrankung führt. Man nimmt an, dass Autoimmunerkrankungen auf eine abnormale Immunreaktion auf Selbstantigene zurückzuführen sind, entweder aufgrund einer Veränderung von Selbstantigenen oder einer Belastung durch kreuzreaktive Antigene. Zu Autoimmunerkrankungen, die durch antikörpervermittelte Immunreaktionen auf Selbstantigene verursacht werden, gehören Krankheiten, wie rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus und entzündliche Darmerkrankungen.
Es besteht der Wunsch, die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten für Autoimmunkrankheiten oder andere unerwünschte Immunreaktionen, bei denen man allgemeine immunosuppressive Mittel, wie Corticosteroide, Azathioprin oder Cyclosporin A, verwendet, zu verbessern. Diese Behandlungen sind nicht-selektiv und unterscheiden nicht zwischen normalen und abnormalen Immunreaktionen. Diese Arzneistoffe haben häufig nachteilige Nebenwirkungen, unter Einschluss einer allgemeinen Suppression des Immunsystems mit der Gefahr von Infektionen und Neoplasien sowie Entwicklung von Krankheiten, wie Diabetes, Osteoporose, Leukopenie und Hochdruck.
Demgemäß kann unter bestimmten Umständen, z. B. bei einer Autoimmunerkrankung, eine bestimmte Immunreaktion unerwünscht sein. Alternative Wege zur Behandlung dieser Zustände sind für Patienten notwendig, die eine herkömmliche chronische, nicht-spezifische Arzneistofftherapie nicht vertragen oder darauf nicht ansprechen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass humane mesenchymale Stammzellen zur Abgabe von Antigenen an das Immunsystem herangezogen werden können, so dass eine Immunantwort auf das Antigen gehemmt wird, d. h. beseitigt, verringert oder gebessert wird. Die Verringerung oder Beseitigung einer Immunantwort durch mesenchymale Stammzellen, wie sie hier beschrieben wird, kann bei einem Empfänger zur Besserung einer Immunantwort gegen eine Autoimmunerkrankung verwendet werden.
Demzufolge eignen sich die erfindungsgemäßen Verwendungsmöglichkeiten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 insbesondere zur Beseitigung, Verringerung oder Besserung von unerwünschten oder abnormalen T-Zell-Immunantworten. Gemäß einem Aspekt beinhaltet die Verwendung die Verabreichung von mesenchymalen Stammzellen, die so modifiziert worden sind, dass sie ein Antigen tragen, an ein Tier. Wenn das Antigen der T-Zelle in Abwesenheit eines kostimulierenden Signals der T-Zelle präsentiert wird, wird ein antigenspezifischer Zustand von Hyporeaktivität oder sogar Nichtreaktivität oder Anergie in der T-Zelle gegenüber einer anschließenden Belastung der T-Zelle durch das Antigen induziert. Auf diese Weise wird eine Immunantwort verringert oder beseitigt. Die Beseitigung, Verringerung oder Besserung einer Immunantwort gemäß den hier gemachten Ausführungen kann zur Behandlung oder Hemmung einer unerwünschten oder abnormalen Immunantwort, wie sie bei Autoimmunkrankheiten auftritt, herangezogen werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können mesenchymale Stammzellen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, um dem Immunsystem Moleküle zu präsentieren, die die Kostimulationswege blockieren, die zur Herbeiführung einer Immunantwort erforderlich sind. Die Beseitigung, Verringerung oder Besserung einer Immunantwort gemäß den hier gemachten Ausführungen kann dazu herangezogen werden, eine unerwünschte oder abnormale Immunantwort, wie sie bei Autoimmunkrankheiten auftritt, zu behandeln oder zu hemmen. Die Blockierung des kostimulierenden Signals hemmt die T-Zell-Aktivierung durch antigenspezifische Signale, die durch Antigen-präsentierende Zellen, die sich in der Nähe der T-Zellen befinden können, präsentiert werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die mesenchymalen Stammzellen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, um an die T-Zellen ein Antigen und ein Molekül, das die Abgabe eines Kostimulationssignals an die T-Zellen hemmt, abzugeben. Die Abgabe eines spezifischen Antigens in zielgerichteter Weise an T-Zellen in Verbindung mit der Blockierung des kostimulierenden Signals hemmt eine spezifische T-Zell-Aktivierung in Gegenwart eines antigenspezifischen Signals, das durch die Antigen-präsentierende mesenchymale Stammzelle präsentiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Moleküle, die die T-Zell-Kostimulation blockieren, unter CTLA-4 (zytotoxisches, mit T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4) oder CTLA-4Ig, ein Fusionsprotein von CTLA-4 und der konstanten Region von humanem IgG-1, ausgewählt.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt eine Verminderung der proliferativen Reaktion von auf Tetanus-Toxoid spezifischen T-Zellen zur Restimulation unter Verwendung von mononuklearen Peripherblut-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen nach gemeinsamer Züchtung von T-Zellen mit mesenchymalen Stammzellen, die mit Tetanus-Toxoid behandelt worden sind.
2 zeigt fließzytometrische Analysen von humanen mesenchymalen Stammzellen zur Bestätigung der Transduktion der Zellen mit CTLA-4 (membrangebunden) (2A) und der löslichen Form CTLA4-Ig (2B).
3 zeigt die Hemmung der T-Zell-Stimulation durch humane mesenchymale Stammzellen bei Transduktion mit CTLA-4.
4 zeigt die Hemmung der T-Zell-Stimulation durch humane mesenchymale Stammzellen bei Transduktion mit CTLA4-Ig.
Ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft Verwendungsmöglichkeiten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur in vivo-Verringerung, -Hemmung oder -Besserung einer Immunantwort auf ein spezifisches Antigen unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen als ein Antigen präsentierende Zellen, um dem Tier ein Antigen zu präsentieren. Die mesenchymalen Stammzellen bessern, hemmen oder verringern die T-Zell-Reaktion auf das Antigen, da die mesenchymalen Stammzellen das kostimulierende Signal, das zur Aktivierung der T-Zellen erforderlich ist, nicht oder nicht in ausreichenden Mengen bilden. Statt dessen induzieren die mesenchymalen Stammzellen eine Hyporeaktivität einer Ziel-T-Zellpopulation auf ein Antigen, d. h. eine T-Zell-Immunantwort auf das Antigen wird dann, wenn anschließend das Antigen der T-Zelle präsentiert wird, gebessert, gehemmt oder verringert.
Demzufolge lassen sich die mesenchymalen Stammzellen so modifizieren, dass sie ein Antigen einer Ziel-T-Zellpopulation präsentieren, die T-Zellen mit Rezeptoren für das spezifische Antigen umfassen. Gemäß einer Ausführungsform werden die mesenchymalen Stammzellen durch einen in vitro-Kontakt mit Antigen modifiziert. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die mesenchymalen Stammzellen gentechnisch manipuliert, so dass sie ein antigenes Molekül exprimieren. Die mesenchymalen Zellen sind vorzugsweise in Bezug zum Empfänger der mesenchymalen Stammzellen autolog.
Der Ausdruck "Antigen" wird hier in dem Sinn verwendet, dass er ein Protein, Polypeptid, Lipid, Glycoprotein oder dergl. umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden die mesenchymalen Stammzellen so modifiziert, dass sie mindestens ein exogenes Antigenfragment aufweisen, das an ein primäres Oberflächenmolekül der Zelle gebunden ist, so dass mindestens ein Antigenfragment präsentiert wird, um die proliferative Reaktion von Lymphozyten zu hemmen oder zu verringern. Gemäß einer Ausführungsform wird die mesenchymale Stammzelle mit mindestens einem Antigen in Kontakt gebracht (Antigen-Pulsen). Die mesenchymale Stammzelle verarbeitet das Antigen zu einem Antigenfragment zur Präsentation durch die mesenchymalen Stammzellen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird die mesenchymale Stammzelle gentechnisch manipuliert, so dass sie ein antigenes Molekül exprimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kommt es in Betracht, dass die mesenchymalen Stammzellen so modifiziert werden, dass sie ein spezifisches Autoantigen exprimieren, insbesondere ein Autoantigen, das die Immunantwort bei Autoimmunerkrankungen vermittelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendungsmöglichkeiten nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung, Besserung oder Verringerung einer T-Zellreaktion auf ein spezifisches Antigen, indem man in vivo mesenchymale Stammzellen, die als ein Antigen präsentierende Zellen verwendet werden, verabreicht, wobei die mesenchymalen Stammzellen ferner mit einem Molekül, das die Abgabe eines T-Zell-Kostimulationssignals an die Ziel-T-Zelle blockiert, modifiziert sind. Die Ziel-T-Zellpopulation kann bereits einmal mit Antigen in Kontakt gekommen sein oder nicht. Somit bewirken die mesenchymalen Stammzellen zusätzlich zu einer Induktion einer Hyporeaktivität auf die T-Zellen gegenüber einer Belastung durch das Antigen ferner eine Besserung, Hemmung oder Verringerung der T-Zell-Immunantwort durch Blockieren von kostimulierenden Signalen auf die T-Zelle, die durch eine ein Antigen präsentierende Zelle bereitgestellt werden können. Diese Behandlung hemmt eine vollständige Aktivierung der T-Zellen und führt zu einer Hyporeaktivität oder auch zu einer Nichtreaktivität der T-Zellen.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann es sich bei den das Antigen präsentierenden Zellen, die den T-Zellen Kostimulationssignale bereitstellen, um endogene, ein Antigen präsentierende Zellen oder um die ein Antigen präsentierenden mesenchymalen Stammzellen handeln. Für den Fall, dass mesenchymale Stammzellen, die das für die Aktivierung von T-Zellen erforderliche Kostimulationssignal exprimieren, verwendet werden, werden diese mesenchymalen Stammzellen ferner mit einem Molekül modifiziert, das die Abgabe des Kostimulationssignals blockiert.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kommt es in Betracht, dass die mesenchymalen Stammzellen so modifiziert werden, dass sie ein spezifisches Autoantigen exprimieren, insbesondere ein Autoantigen, das die Immunantwort bei Autoimmunerkrankungen vermittelt.
Entsprechend der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich bei einem Molekül, das die Abgabe eines Kostimulationssignals an eine T-Zelle hemmt, um ein Molekül, das den T-Zell-Kostimulationsweg so stört, dass die T-Zellen sich zur Bekämpfung des Antigens nicht vermehren, wie es bei einer normalen Immunantwort der Fall ist. Gemäß der hier verwendeten Terminologie wird ein T-Zell-Kostimulationssignal abgegeben, wenn ein kostimulierendes Molekül in Wechselwirkung mit seinem T-Zellrezeptor tritt. Demzufolge beinhaltet gemäß einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren die Expression eines Moleküls durch die mesenchymalen Stammzellen, die eine derartige Wechselwirkung blockieren oder stören. Durch Blockieren dieser Wechselwirkung an sensibilisierten T-Zellen (d. h. T-Zellen, die bereits mit dem ersten antigenspezifischen Signal in Kontakt gekommen sind) wird eine vollständige Aktivierung der T-Zellen durch die das Antigen präsentierenden Zellen gehemmt.
Die T-Zellen weisen eine Hyporeaktivität oder Nichtreaktivität gegenüber dem Antigen auf, was zu einer Besserung, Verringerung oder Beseitigung einer Immunantwort durch die T-Zellen gegen das Antigen führt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung handelt es sich bei den kostimulierenden Molekülen um B7-1 und B7-2 und beim T-Zellrezeptor um CD28. Gemäß dieser Ausführungsform ist die mesenchymale Stammzelle vorzugsweise gentechnisch so manipuliert, dass sie CTLA-4 oder CTLA4-Ig exprimiert. Sowohl CTLA-4 als auch CTLA4-Ig stören die Wechselwirkung von B7 und CD28, wodurch sie die Abgabe des kostimulierenden Signals durch das Antigen an die T-Zelle hemmen.
Aktivierte T-Zellen exprimieren den Rezeptor CTLA-4 (zusätzlich zu CD28), der B7-Moleküle mit höherer Affinität als CD28 bindet. CTLA-4 ist bezüglich seiner Sequenz CD28 sehr ähnlich. Die beiden Moleküle werden durch eng verknüpfte Gene kodiert. CTLA-4 ist ein kompetitiver Antagonist von CD28. CTLA-4 hemmt die Abgabe eines kostimulierenden Signals entweder durch Konkurrenz mit CD28 um die Bindung an B7 oder durch Herunterregulieren des Signals, was zur Hemmung der vollständigen Aktivierung und somit zur Vermehrung der dieses exprimierenden T-Zelle führt.
Bei einer löslichen Form von CTLA-4 handelt es sich um das Fusionsprotein CTLA4-Ig. Das CTLA-4-Molekül wird als Teil eines Fusionsproteins eingebaut, das eine Region enthält, die die Stabilität und Löslichkeit des Moleküls erhöht. Eine Blockierung der T-Zellaktivierung durch CTLA4-Ig, das B7-spezifische Fusionsprotein, wurde ebenfalls beschrieben (Kirk et al., PNAS, 1997).
Gemäß einem weiteren Aspekt bewirkt die erfindungsgemäße Verwendung in vivo eine Verringerung, Hemmung oder Besserung einer Immunantwort auf ein Antigen, indem man die mesenchymalen Stammzellen als Vehikel verwendet, um dem Immunsystem ein Molekül zu präsentieren, das die T-Zell-Kostimulation blockiert. Die mesenchymalen Stammzellen induzieren eine Hyporeaktivität oder Nichtreaktivität der T-Zelle auf ein Antigen durch Störung der Abgabe eines kostimulierenden Signals an die T-Zelle. Dies führt zu einer Verringerung, Besserung oder Beseitigung der T-Zell-Immunantwort auf ein Antigen, nachdem der T-Zelle das Antigen präsentiert worden ist.
Demzufolge lassen sich die mesenchymalen Stammzellen so modifizieren, dass sie dem Immunsystem ein Molekül präsentieren, was die Blockierung oder Störung der Abgabe eines kostimulierenden Signals an eine T-Zelle bewirkt, die bereits mit einem antigenspezifischen Signal aus einer endogenen, das Antigen präsentierenden Zelle sensibilisiert worden ist.
Die mesenchymalen Stammzellen werden vorzugsweise so modifiziert, dass sie CTLA-4 oder CTLA4-Ig exprimieren. Gemäß einer Ausführungsform werden die mesenchymalen Stammzellen gentechnisch so manipuliert, dass sie die blockierenden Moleküle vor Kontakt mit den T-Zellen exprimieren. Gemäß diesem Aspekt führt das Verfahren nach Verabreichung der mesenchymalen Stammzellen zu einer Blockade der Kostimulation der T-Zellen durch das Antigen präsentierende Zellen, so dass anschließend eine verminderte T-Zell-Immunantworterzielt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung werden mesenchymale Stammzellen als Plattform verwendet, um zytotoxisches, mit T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) oder CTLA4-Ig, ein Fusionsprotein von CTLA-4 und der konstanten Region von humanem IgG1, Molekülen, die die T-Zell-Kostimulation blockieren, verwendet.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die Besserung, Verringerung oder Beseitigung einer unspezifischen Immunantwort ermöglicht. Die Verwendung ist nicht auf eine bestimmte antigenspezifische T-Zellpopulation beschränkt, sondern kann in Bezug auf beliebige antigenspezifische, durch T-Zellen vermittelte Immunantworten verwendet werden, um eine Besserung, Verringerung oder Beseitigung der Immunantwort zu erreichen. Bei dieser Ausführungsform werden die mesenchymalen Stammzellen vorzugsweise lokal verabreicht. Die mesenchymalen Stammzellen können in Bezug auf das Individuum, dem sie verabreicht werden, allogen oder autolog und vorzugsweise autolog sein.
Mesenchymale Stammzellen sind normalerweise im Knochenmark nur in winzigen Mengen vorhanden, es wurde jedoch ein Verfahren zur Isolierung, Reinigung und starken Vermehrung dieser Zellen in Kultur, d. h. in vitro, entwickelt; vergl. Caplan und Haynesworth, US-Patent 5 486 359.
Die humanen mesenchymalen Stammzellen können als Wirte für Fremdgene zur Expression der Genprodukte in systemischen oder lokalisierten Zielen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen mesenchymalen Stammzellen lassen sich mit genetischem Material von Interesse gentechnisch bearbeiten (transduzieren, transformieren oder transfizieren). Die gentechnisch bearbeiteten, humanen, mesenchymalen Stammzellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die in entsprechender Weise zur Aktivierung von Promotoren, Auswahl von Transformanten oder Amplifikation von exogenen Genen modifiziert worden sind. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und dergl., können den Bedingungen entsprechen, die herkömmlicherweise bei der gentechnischen Bearbeitung von humanen mesenchymalen Stammzellen herangezogen werden; vergl. beispielsweise Gerson et al., US-Patent 5 591 625. Mesenchymale Stammzellen können mit IFN-gamma behandelt werden, um die MHC-Präsentation durch die mesenchymalen Stammzellen zu stimulieren.
Sofern nichts anderes angegeben ist, werden gentechnische Manipulationen gemäß den Angaben von Sambrook und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, durchgeführt. Obgleich keine Beschränkung auf die Verwendungsmöglichkeiten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung besteht, können die mesenchymalen Stammzellen sowie die erfindungsgemäße Verwendung in entsprechender Weise auf Behandlungsstrategien angewandt werden, bei denen immunosuppressive Mittel erforderlich sind. Ferner kommen die in vitro- Modifikation und -Expansion von mesenchymalen Stammzellen zur Verwendung bei einer zellulären Immunotherapie und die in vivo-Verabreichung der immunosuppressiven mesenchymalen Stammzellen zur Therapie oder Prophylaxe von unerwünschten Immunantworten in Betracht. Ein Aspekt der Erfindung besteht darin, dass man die mesenchymalen Stammzellen zu einem Träger zur Abgabe von Hemmsignalen oder Antigenen zu einem Ziel einer spezifischen zellulären Antwort entwickelt und Impfstoffe mit den auf die vorstehend beschriebene Weise modifizierten mesenchymalen Stammzellen bereitstellt, um entweder eine zielspezifische oder systemische Immunosuppression bei der Prophylaxe und Therapie einer Krankheit zu erreichen.
Typischerweise muss bei der Prophylaxe oder Therapie von Krankheitszuständen der Empfänger in besonders bevorzugter Weise sich nur einer einzigen Verabreichung unterziehen, wonach eine Remission der Krankheit in permanenter Weise erreicht wird. Alternativ können in Abhängigkeit von Feststellungen bei der anschließenden Überwachung etwaige weitere Verabreichungen in höheren oder geringeren Dosen erfolgen. Derartige Vorgehenssweisen und Überwachungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Immunotherapie, der infektiösen Krankheiten, der Onkologie, der Epidemiologie und dergl. bekannt.
Die Dosierung der Wirkstoffe variiert innerhalb breiter Grenzen und wird selbstverständlich in jedem speziellen Fall an die individuellen Bedürfnisse angepasst. Im allgemeinen ist es im Fall einer parenteralen Verabreichung üblich, etwa 0,5 bis etwa 5 Millionen Zellen pro kg des Körpergewichts des Empfängers zu verabreichen. Die Anzahl der eingesetzten Zellen hängt vom Gewicht und dem Zustand des Empfängers und anderen variablen Größen, die dem Fachmann geläufig sind, ab. Die Zellen können auf einem Weg verabreicht werden, der sich zur Behandlung des speziellen Krankheitszustands eignet. Im Fall einer nichtspezifischen Induktion einer Hyporeaktivität der Immunantwort können mit CTLA-4 modifizierte mesenchymale Stammzellen beispielsweise systemisch, d. h. parenteral, intravenös oder durch Injektion, verabreicht werden. Im Fall der Induktion einer antigenspezifischen Hyporeaktivität können die mit dem Antigen modifizierten mesenchymalen Stammzellen zielgerichtet auf ein spezielles Gewebe oder Organ, z. B. Knochenmark, abgegeben werden.
Die Zellen können in einem geeigneten Verdünnungsmittel in einer Konzentration von etwa 5 × 106 bis etwa 50 × 106 Zellen/ml suspendiert werden. Bei geeigneten Trägerstoffen für Injektionslösungen handelt es sich um Produkte, die biologisch und physiologisch mit dem Empfänger verträglich sind, z. B. um gepufterte Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung für die Verabreichung soll sich in Bezug auf Sterilität, Stabilität und dergl. zur Verabreichung an ein Individuum eignen.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Anwendungsmöglichkeiten gegenüber herkömmlichen Behandlungen unerwünschter Immunreaktionen ist die Spezifität. Mesenchymale Stammzellen zielen auf eine Verringerung einer spezifischen Immunantwort ab, ohne andere Segmente des Immunsystems in nachteiliger Weise zu beeinträchtigen. Die Besserung, Verringerung oder Beseitigung einer antigenspezifischen Immunantwort ermöglicht die Therapie oder Prophylaxe einer unerwünschten oder abnormalen Immunantwort auf ein spezifisches Antigen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die mesenchymalen Stammzellen eine lokalisierte Expression eines Moleküls von Interesse bieten. Beispielsweise kann eine lokalisierte Expression eines Moleküls, das eine Kostimulation blockiert, z. B. CTLA4-Ig, zu einer verringerten Entzündung und geringeren Nebenwirkungen führen. Zu Beispielen für Krankheiten, die sich in besonderer Weise für die Behandlung mit den erfindungsgemäßen mesenchymalen Stammzellen eignen, gehören Thyroiditis, rheumatoide Arthritis und insulinabhängiger Diabetes mellitus. Die mesenchymalen Stammzellen können ferner eine kontinuierliche Zufuhr des Moleküls von Interesse bewirken.
Die erfindungsgemäßen Verwendungsmöglichkeiten eignen sich insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie einer Autoimmunkrankheit und sollen vorzugsweise die Reaktion auf ein Autoantigen spezifisch inaktivieren oder beseitigen, ohne andere Aspekte des Immunsystems zu beeinträchtigen.
Die Erfindung kann zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, bei denen eine Krankheitsvermittlung durch ein Autoantigen bekannt ist, herangezogen werden. Die Verwendung beinhaltet die gentechnische Manipulation von mesenchymalen Stammzellen, die vorzugsweise aus dem eigenen Knochenmark des Patienten isoliert worden sind, um ein Autoantigen zu exprimieren und dadurch eine spezifische Immunotherapie mit dem Ziel, abnormale Immunreaktionen zu inaktivieren oder zu beseitigen, einzuleiten, ohne dass andere Funktionen des Immunsystems gestört werden.
Die nachstehenden Beispiele erläutern weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung. Sie stellen jedoch in keiner Weise eine Beschränkung der Lehre oder Offenbarung der hier vorgestellten Erfindung dar.
Beispiele
Materialien
CTLA-4 und CTLA4-Ig wurden in humanen mesenchymalen Stammzellen exprimiert, die mit der cDNA-CTLA-4-Sequenz (Hinterlegungsnummer bei der Genbank L15006) transduziert worden waren. Die Ig-Form wurde konstruiert, indem man den extrazellulären Bereich von CTLA-4 mit dem schweren Fc-Kettenbereich von humanem Ig über ein flexibles Gelenk von 4 Glycinresten und 2 Serinresten fusionierte. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) wurden durch Apherese der gleichen Spender der humanen mesenchymalen Stammzellen erhalten. Handelsübliches CTLA4-Ig wurde von der Fa. R & D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. Mäuse-Ly6A.2 wurde von Dr. Ethan Shevach erhalten und in einen retroviralen MuLVR-Vektor kloniert. Bezüglich Tetanus-Toxoid spezifische T-Zelllinien wurden durch 6-tägige Stimulation von PBMCs mit 1 μg/ml Tetanus-Toxoid (Connaught Laboratories, Toronto, Kanada) hergestellt. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen und erneut weitere 7 Tage mit 20 Einheiten/ml rekombinantem humanem 1L2 (Proleukin) gezüchtet, um bezüglich Tetanus-Toxoid spezifische T-Zellen zu vermehren. Die Zellen wurden geerntet. T-Zellen wurden durch Entfernung von B-Zellen und Monozyten unter Anwendung einer magnetischen Trennung gereinigt. Die Tetanus-Toxoid-T-Zelllinie wurde in Aliquotanteile aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Beispiel 1
Induktion einer T-Zellen-Hyporeaktivität auf Tetanus-Toxoid unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen
MSCs des Spenders 155 wurden in 4 T1852-Kolben ausgestrichen. Ein Kolben wurde mit 100 U/ml IFN-gamma behandelt. Nach 4 Tagen wurden die MSCs geerntet (sowohl mit IFN-gamma behandelt als auch unbehandelt). 3 × 105 MSCs wurden in einzelnen Vertiefungen einer 6 Vertiefungen aufweisenden Gewebekulturplatte ausgestrichen, und zwar eine Vertiefung mit MSCs, die mit IFN-gamma behandelt worden waren, und eine Vertiefung mit unbehandelten MSCs. Die mit IFN-gamma behandelten MSCs wurden über Nacht mit 50 μg/ml Tetanus-Toxoid gepulst. Sämtliche Vertiefungen wurden gründlich mit 1X gepufferter Hanks-Salzlösung gewaschen und pro Vertiefung mit 5 × 106 in Bezug auf Tetanus-Toxoid spezifischen, autologen T-Zellen (Tet-T-Zellen) (Spender 155) versetzt. Die Kulturen wurden 5 Tage inkubiert. Die geernteten T-Zellen wurden mit Tetanus-Toxoid (0, 0,2, 1,0 und 5,0 μ/ml) restimuliert. PBMCs (5 × 105/Vertiefung) wurden als APCs verwendet. Der Proliferationstest wurde 3 Tage inkubiert. Sodann wurden die Zellen mit 1 μCi[³H]-Thymidin über Nacht gepulst. 18 Stunden später wurde die Ernte durchgeführt.
Die in 1 dargestellten Ergebnisse (Kontrolle 0 μg/ml, Zählereignisse als Hintergrund subtrahiert) zeigen eine Abnahme (etwa 30–40%) der proliferativen Reaktion oder des Restimulationspotentials der Tet-T-Zellen nach 5-tägiger gemeinsamer Züchtung mit den IFN-gamma-Tetanus-Toxoid-behandelten MSCs im Vergleich mit der proliferativen Reaktion der Tet-T-Zellen bei gemeinsamer Züchtung mit unbehandelten MSCs.
Beispiel 2
Blockierung der T-Zellaktivierung durch Tetanus-Toxoid mit CTLA-4 (membrangebundenen)-transduzierten mesenchymalen Stammzellen Humane mesenchymale Stammzellen wurden entweder mit dem humanen CTLA-4-Gen von voller Länge oder mit einem Mäuse-Oberflächenmolekül (Mäuse-Ly6A.2) als Kontrolle transduziert. 2A zeigt die fließzytometrische Analyse der mit CTLA-4 transduzierten humanen mesenchymalen Stammzellen. Die Kontrolle und die mit CTLA-4 transduzierten humanen mesenchymalen Stammzellen wurden 3 Tage mit IFN-gamma behandelt, um die MHC-Klasse II-Expression zu erhöhen, und 1 Tag mit einer hohen Dosis (100 μg/ml) Tetanus-Toxoid gepulst. Nach Entfernung von IFN-gamma und Tetanus-Toxoid aus den Kulturen wurde eine Tetanus-Toxoid-spezifische T-Zelllinie (Tet-C) zu den humanen mesenchymalen Stammzellen gegeben. Die Kulturen wurden 3 Tage inkubiert. Die Lymphoproliferation der T-Zelllinie wurde durch Aufnahme von [³H]-Thymidin während der letzten 8 Stunden der Züchtungsdauer getestet.
Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die transduzierten humanen mesenchymalen Kontroll-Stammzellen den im PBMC-Präparat vorhandenen T- Zellen Tetanus-Toxoid präsentierten und zu einer T-Zellproliferation (18 000 cpms) führten, während die mit CTLA-4 transduzierten humanen mesenchymalen Stammzellen keine T-Zellreaktion (200 cpms) induzierten. Diese Ergebnisse belegen, dass die Expression des CTLA-4-Moleküls an humanen mesenchymalen Stammzellen die T-Zellreaktion unterdrückte.
Beispiel 3
Blockierung der T-Zellaktivierung durch Tetanus-Toxoid mit mesenchymalen Stammzellen, die mit CTLA4-Ig (lösliche Form) transduziert sind.
Humane mesenchymale Stammzellen wurden entweder mit der löslichen Form CTLA4-Ig, die aus dem extrazellulären Bereich des humanen CTLA-4-Gens unter Fusionierung mit der konstanten Region von humanem IgG1 zusammengesetzt ist, oder mit einem Mäuse-Oberflächenmolekül (Mäuse-Ly6A2) als Kontrolle transduziert. 2B zeigt die fließzytometrische Analyse der mit CTLA4-Ig transduzierten mesenchymalen Stammzellen. Zu subkonfluenten Kulturen der Kontrolle und der mit CTLA4-Ig transduzierten humanen mesenchymalen Stammzellen wurden Tetanus-Toxoid-Antigen (1 μg/ml) und periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) (100 000 Zellen/Vertiefung) gegeben. Die Lymphoproliferation der innerhalb des PBMC-Präparats vorhandenen T-Zellen wurde durch Aufnahme von [3H]-Thymidin während der letzten 8 Stunden der Züchtungsdauer bestimmt (4). Weitere Kontrollen wurden durchgeführt, wobei PBMCs dem Antigen in Gegenwart von handelsüblichem CTLA4-Ig-Protein in Abwesenheit von humanen mesenchymalen Stammzellen ausgesetzt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die mit CTLA4-Ig transduzierten humanen mesenchymalen Stammzellen eine 81 %ige Hemmung der Lymphoproliferation bewirkten (4000 cpms), während die mit der Kontrolle transduzierten humanen mesenchymalen Stammzellen die Proliferation von T-Zellen im PBMC-Präparat gegenüber Tetanus-Toxoid nicht hemmten (19 000 cpms). Die Hemmung (81 %) der Lymphoproliferation, die mit humanem mesenchymalen Stammzellen, die CTLA4-Ig exprimierten, beobachtet wurde, war größer als der Hemmgrad, der mit dem handelsüblichen CTLA4-Ig-Protein (5 μg/ml) beobachtet wurde, das die PBMC-Lymphoproliferation nur zu 51% hemmte. Somit unterdrückte die Expression des CTLA4-Ig-Moleküls an humanen mesenchymalen Stammzellen die T-Zellreaktionen auf Niveaus, die deutlich unter denen von handelsüblichem CTLA4-Ig lagen.

Claims

Verwendung von mesenchymalen Stammzellen, die so modifiziert sind, dass sie ein Antigen aufweisen, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung einer Reaktion von T-Zellen auf das Antigen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die mesenchymalen Stammzellen ferner ein Molekül exprimieren, das die Costimulation von T-Zellen blockiert.
Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen, die so modifiziert sind, dass sie ein Antigen aufweisen, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung einer Reaktion von T-Zellen auf das Antigen.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich beim Antigen um ein Autoantigen handelt.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die mesenchymalen Zellen autolog mit dem Wirt sind.
Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen, die ein Molekül exprimieren, das die Costimulation von T-Zellen blockiert, so dass die Reaktion von T-Zellen auf ein Antigen gehemmt wird, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung der Reaktion von T-Zellen auf ein Antigen.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Molekül membrangebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei es sich beim Molekül um CTLA-4 handelt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei es sich beim Molekül um ein zelllösliches Protein handelt.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei es sich beim Molekül um ein CTLA4-Ig-Fusionsprotein handelt.
Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen, die so modifiziert sind, dass sie (a) ein spezifisches Antigen und (b) ein Molekül, das die Co-Stimulation von T-Zellen hemmt, exprimieren, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung einer Reaktion von T-Zellen auf das Antigen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich beim Antigen um ein Autoantigen handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die mesenchymalen Zellen gegenüber dem Wirt autolog sind.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Molekül membrangebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich beim Molekül um CTLA-4 handelt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich beim Molekül um ein zelllösliches Protein handelt.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei es sich beim Molekül um ein CTLA4-Ig-Fusionsprotein handelt.