DE69813573T2

DE69813573T2 - Verbesserungen der oder in bezug auf die regulierung der t-zellaktivation

Info

Publication number: DE69813573T2
Application number: DE69813573T
Authority: DE
Inventors: Luis Alvarez-Vallina; James Stephen RUSSELL; Robert Prestbury HAWKINS; Siamak Agha-Mohammadi
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1997-09-06
Filing date: 1998-09-07
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2018-09-08
Also published as: JP2001515873A; AU747045B2; EP1009442A1; AU8992698A; ATE237360T1; WO1999012573A1; EP1015036A1; DE69813573D1; JP2001515709A; AU734877B2; AU8879998A; WO1999012574A1; CA2303618A1; EP1009442B1; CA2303617A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft u.a. ein Verfahren zur Veränderung der Sensitivität eines Leukozyten gegenüber einem Zielantigen.
Hintergrund der Erfindung
Im Gegensatz zu Antikörpermolekülen können T-Zellen aktiv und wirksam durch mikrovaskulare Wände durchtreten, was es ihnen erlaubt, den Kern eines soliden Tumors zu penetrieren, bevor sie ihre zytolytische Funktion ausüben. Die ex vivo Expansion und Reinfusion von autologen Tumor-reaktiven T-Zellen wird als experimenteller Ansatz der Krebstherapie untersucht. Zirkulierenden T-Zellen aus peripherem Blut fehlt jedoch die Spezifität für Tumorantigene (1), und es ist oft nicht praktizierbar oder unmöglich, eine hinreichende Anzahl Tumor-infiltrierender Lymphozyten zu erhalten (2). Um diese Probleme zu überwinden, sind neue Ansätze entwickelt worden, wobei die Antikörper-Spezifität mit wirksamen Zielführungseigenschaften und Effektorfunktionen von T-Zellen kombiniert werden kann. Mehrere Berichte haben gezeigt, dass die Transfektion von kultivierten T-Zellen mit Genen, die chimere Rezeptoren codieren, in denen Einzelketten-Antikörperdomänen (scFv) mit verschiedenen Signalteilen des TCR/CD3/ξ-Komplexes kombiniert sind, ein durchführbarer Ansatz ist, um Ziel-T-Zellen auf native Antigene zielen zu lassen (3–6). Es scheint jedoch, dass der langfristige klinische Erfolg dieses "T-Körper"-Ansatzes von der Entwicklung von Lösungen für eine Anzahl von Problemen abhängt.
Das vielleicht signifikanteste Problem besteht darin, dass aufgrund der Tatsache, dass nur wenige "Krebsantigene" wirklich tumorspezifisch sind (7), eine erfolgreiche Therapie mit tumorreaktiven T-Körpern mit einem signifikanten Collateralschaden für normale Gewebe einhergehen könnte, die niedrige Konzentrationen des Antigens exprimieren. Es ist daher wünschenswert, Strategien zu entwickeln, nach denen T-Zellen eine temporäre oder permanente Anergie gegenüber dem Zielantigen verliehen werden kann, oder eine differenzielle Sensitivität gegenüber verschiedenen Oberflächendichten des Antigens auf den Zielzellmembranen.
Es sind zwar verschiedene Strategien entwickelt worden, um die Transgenexpression in eukaryotischen Zellen zu regulieren (8), das Tetracyclinregulierbare System (TRS) vermeidet jedoch die im Zusammenhang mit vielen dieser Systeme auftretenden Probleme, indem eine substantielle Regulierung der Transgenexpression als Reaktion auf Konzentrationen von Tetracyclin erfolgt, die nur sehr wenig oder keine Toxizität in Säugetierzellen zeigen (9, 10).
Miller & Whelan (1997 Hum. Gene Therapy 8, 803–815) haben kürzlich einen Übersichtsartikel geschrieben, der den Fortschritt in Bezug auf die Entwicklung von regulierbaren Vektoren für die Gentherapie beschreibt. Unter den beschriebenen Vektoren finden sich auch diejenigen, die TRS einsetzen.
Bei dem ursprünglich von Gossen & Bujard (1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 554–5551) beschriebenen TRS wurde das Tetracyclinrepressorprotein mit der Herpes Simplex Virus (HSV) VP-16-aktivierende Domäne fusioniert, um ein chimeres Tetracyclin-reprimierbares transaktivierendes (tTA) Polypeptid zu erzeugen, das an DNA bindet, die die tet Operatorsequenz umfasst, wodurch eine transkriptionale Aktivierung der codierenden Sequenzen stromabwärts des Operators hervorgerufen wird. Das Vorliegen von Tetracyclin oder Analogen davon (wie Doxycyclin, Anhydrotetracyclin, Minocyclin und xytetracyclin) inhibiert die transkriptionale Aktivierung, da diese Verbindungen an das tTA Polypeptid binden, wodurch die Konformation verändert und die Bindung an die tet Operatorsequenz verhindert wird.
Varianten des Original-TSR sind nunmehr beschrieben worden (WO 96/01313), in denen eine mutante Form des tet Repressorproteins in Gegenwart, aber nicht in Abwesenheit von Tetracyclin oder seinen Analogen an DNA bindet. Daher wird in diesen Systemen die Expression des tet Operator-verbundenen Gens in Gegenwart von Tetracyclin oder seiner Analogen positiv reguliert.
Bei der Anwendung des TRS gibt es jedoch noch eine Anzahl von Schwierigkeiten und/oder Unsicherheiten. Zum Beispiel haben Cooke et al. (1997 J. Gen. Virol. 78, 381-392) gefunden, dass TRS zur Regulierung der Expression des nef Gens in der humanen T-Zelllinie Jurkat E6-1 nicht verwendet werden konnte. Darüber hinaus ist die HSV VP16 Domäne mit einem toxischen "Brems"-Effekt verbunden, so dass hohe Regulationsgrade bislang nicht erreicht werden konnten. In einem kürzlich veröffentlichten Übersichtsartikel (Miller & Whelan 1997 Hum. Gene Ther. 8, 803–815) wurde festgestellt, dass TRS "möglicherweise nicht bei allen Zelllinien anwendbar ist" (wobei die Arbeit von Ackland-Berglund & Leib 1995 BioTechniques 18, 196–200; und Howe et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 14168-14174 zitiert wurde).
WO 96/40892 offenbart die Verwendung eines Tetracyclinrepressor/Operator/Induzierersystems, um die Genexpression in prokaryotischen Zellen zu regulieren oder die Expression eines therapeutischen Gens in Gentherapieanwendungen zu modulieren. Dieses Dokument erwähnt nicht explicit, dass transformierte Zellen zur Verwendung in Gentherapieanwendungen Leukozyten sein sollten, und darüber hinaus wird darin weder gelehrt noch in irgendeiner Weise nahegelegt, dass das tet Expressionssystem verwendet werden könnte, um die Reaktivität eines Leukozyten zu regulieren, um zwischen Ziel- und Nichtziel-Zellen zu unterscheiden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Leukozyten, die gegenüber verschiedenen Dichten von Leukozyten-stimulierenden Molekülen, die auf der Oberfläche einer Zelle vorliegen, differenziell reaktiv sind, wobei der Leukozyt durch die Wechselwirkung zwischen dem Leukozytstimulierenden Molekül auf der Zelle und einem Leukozyt-aktivierenden Molekül aktiviert wird, das auf der Oberfläche des Leukozyten vorliegt, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren des Leukozyten mit einer Nucleinsäuresequenz, die die Expression des Leukozyten-aktivierenden Moleküls in einer Art steuert, die gegenüber der Konzentration eines exogenen Mittels sensitiv ist; und Verändern der Konzentration des exogenen Mittels, gegenüber dem der Leukozyt exponiert wird. Typischerweise ist das exogene Mittel ein "regulatorisches Arzneimittel", wie unten beschrieben, und die Nucleinsäuresequenz, die die Expression des Leukozyten-aktivierenden Moleküls steuert, ist mit einem Arzneimittel-regulierbaren Promotor operabel verbunden.
Das exogene Mittel kann irgendein beliebiges Mittel sein, das die Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls beeinflusst, vorzugsweise in einer selektiven spezifischen Art. Vorzugsweise ist das exogene Mittel eines, das einem menschlichen Patienten in einer pharmakologischen Art verabreicht werden kann: das heißt, das Mittel übt eine geeignete Wirkung auf die Expression des Leukozytaktivierenden Moleküls in einer Konzentration aus, die niedriger ist als die, die irgendeinen signifikanten toxischen Effekt auf den Patienten hervorrufen würde. Zum Beispiel wird das Leukozyt-aktivierende Molekül vorzugsweise in einer regulatorischen Art exprimiert (z. B. unter Verwendung einer tet O-Sequenz und eines tet-sensitiven Transaktivators), im wesentlichen wie unten beschrieben. In dieser Ausführungsform kann das exogene Mittel Tetracyclin oder ein Analog davon sein.
Ein zweckmäßiger Weg, um die Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls in eine Sensitivität gegenüber der Konzentration des exogenen Mittels zu bringen, besteht darin, als exogenes Mittel ein geeignetes "regulatorisches Arzneimittel" zu wählen und die Sequenz, die das Leukozyt-aktivierende Molekül codiert, unter die Kontrolle eines Arzneimittel-regulierbaren Promotors zu bringen, dessen Aktivität direkt oder indirekt durch die Konzentration des Arzneimittels gesteuert wird. Der Begriff "Arzneimittel-regulierbarer Promotor" soll so verstanden werden, dass er auf Nucleinsäureabschnitte bezogen ist (z. B. Enhancer oder stärker bevorzugt Promotoren), die die Expression der codierenden Regionen von Nucleinsäure regulieren, und zwar als Reaktion auf das Vorliegen einer Substanz (des "regulatorischen Arzneimittels"), die gegenüber der Zelle exogen ist.
Das regulatorische Arzneimittel ist so gewählt, dass es die Modifikation der Aktivität des Arzneimittel-regulierbaren Promotors bei einer Konzentration hervorruft, die gegenüber der Zelle nicht lethal ist, in der die Nucleinsäure vorliegt. Vorzugsweise ist die Wirkung des regulatorischen Arzneimittels im wesentlichen für den Arzneimittel-regulierbaren Promotor spezifisch, so dass, sollte die Notwendigkeit bestehen, das Arzneimittel dem Patienten zu verabreichen, dies keine weitreichenden Wirkungen auf andere Gewebe oder Zelltypen hervorruft. Eine solche Spezifität wird am einfachsten durch Verwendung eines synthetischen regulatorischen Arzneimittels und eines entsprechenden Arzneimittel-regulierbaren Promotors erzielt, der normalerweise in dem Subjekt nicht vorliegt. Der Arzneimittel-regulierbare Promotor kann direkt Arzneimittel-regulierbar sein oder typischerweise indirekt Arzneimittel-regulierbar. Ein Beispiel für ein System, das einen indirekt Arzneimittel-regulierbaren Promotor umfasst, ist ein System, in dem ein Arzneimittel-regulierbarer Operator eine regulatorische Wirkung auf einem Promotor ausübt, wobei die Wirkung von der Konzentration eines regulatorischen Arzneimittels abhängt.
Eine Anzahl von geeigneten Arzneimittel-regulierbaren Promotoren und entsprechenden regulatorischen Arzneimitteln ist bekannt (siehe z. B. Miller & Whelan, Hum. Gene Ther. 8, 803–815) und dies schließt Promotoren ein, die durch Gluccocorticoidsteroide, Sexualhormonsteroide, Lipopolysaccharide (LPS) und Isopropyl-thiogalactosid (IPTG) reguliert werden. Geeignete Konzentrationen der entsprechenden Arzneimittel sind für den Fachmann offensichtlich. Als allgemeine Richtlinie kann gelten, dass bei Kultivierung von Zellen in vitro in Gegenwart von Steroiden eine bevorzugte Konzentration der Steroide 1 nM bis 1 mM ist. Wenn das Steroid-Arzneimittel einem menschlichen oder tierischen Subjekt in vivo verabreicht wird, wird die Dosierung wünschenswerterweise so eingestellt, dass eine Serumkonzentration zwischen etwa 0,05 und 10,0 μg/kg erreicht wird. Beim Kultivieren von Zellen in Gegenwart von IPTG liegt die Dosis vorzugsweise im Bereich von 1 μM bis 100 mM, oder stärker bevorzugt im Bereich von 100 μM bis 1 mM. Beim Kultivieren von Zellen in Gegenwart von LPS liegt die Dosis zweckmäßigerweise im Bereich von 0,1 nM bis 1 mM, stärker bevorzugt im Bereich von 100 μM bis 1 mM.
Ein anderes System, das zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung besonders verwendbar ist, ist das Tetracyclin-regulierbare System (TRS), das umfassend untersucht worden ist und von dem mehrere Varianten entwickelt worden sind, die das TRS extrem adaptierbar machen. Zum Beispiel verursacht in Abwesenheit von Tetracyclin das Wildtyp-bakterielle tet Repressorprotein eine negative Regulation des bakteriellen Tetracyclinresistenzgens: Tetracyclin bindet an das Repressorprotein und hindert es daran, an die tet perator-DNA-Sequenz zu binden, wodurch die Expression des Resistenzgens ermöglicht wird. Umgekehrt verursacht ein chimeres Polypeptid, das einen Teil des tet Repressors und die HSV VP16-transaktivierende Domäne umfasst, eine positive Regulation (transkriptionale Aktivität) der codierenden Sequenzen. Andere transaktivierende Domänen sind dem Fachmann bekannt (z. B. die Aminosäurereste 753–881 von GAL4; die Aminosäurereste 399–499 von CTF/NF1; und die von ITF1 oder ITF2) und es ist vorstellbar, dass diese verwendet werden können, um ein chimeres Tetracyclin-sensitives Polypeptid zu bilden.
Zusätzlich zu den im Stand der Technik beschriebenen chimeren Polypeptiden (z. B. Gossen & Bujard 1992, wie oben zitiert), die einen Teil des Wildtyp-tet-Repressorproteins umfassen, sind andere Polypeptide bekannt (offenbart in WO 96/01313), die eine mutierte Form des tet Repressorproteins umfassen, das an die tet Operatorsequenz in Anwesenheit, aber nicht in Abwesenheit von Tetracyclin bindet.
Demgemäss dient in einigen Ausführungsformen der Erfindung das Vorliegen von Tetracyclin zur Inhibierung der Expression einer Tetracyclinoperator (tet O)verbundenen codierenden Sequenz (d. h. der Sequenz, die die immunogenen Polypeptide codiert), während in anderen Ausführungsformen das Vorliegen von Tetracyclin zur Verstärkung der Expression der tet O-verbundenen Sequenz dient.
Dem Fachmann ist klar, dass eine Anzahl von Analogen des Tetracyclins bekannt sind, die das Tetracyclin in dem erfindungsgemäßen Verfahren einfach ersetzen können. Tatsächlich könnten einige Analoge sogar dem Tetracyclin vorgezogen werden, da sie unter Umständen höhere Bindungsaffinitäten aufweisen (für das Tetracyclin-sensitive Polypeptid) und so bei niedrigeren Konzentrationen einen regulatorischen Effekt ausüben. Tetracyclin-Analog ist so zu verstehen, dass ein Molekül gemeint ist, das strukturell mit Tetracyclin verwandt ist und dass an den Tet-Repressor mit einer K_a von mindestens etwa 10⁶ M^– ¹, bevorzugt 10⁹ M¹ oder darüber, bindet. Bevorzugte Analoge sind Doxycyclin und Anhydrotetracyclin. Andere Analoge schließen Minocyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Epoxytetracyclin und Cyanotetracyclin ein. Andere Analoge von Tetracyclin werden von Hlavka & Boothe ("The Tetracyclines" in "Handbook of Experimental Pharmacology 78, Blackwood et al. (Herausgeber) Springer Verlag 1985) beschrieben.
Die tet Operator (tet O)-Sequenz ist nunmehr dem Fachmann gut bekannt. Für einen Übersichtsartikel wird der Leser auf Hillen & Wissmann (1989) in Protein-Nucleic Acid Interaction. "Topics in Molecular and Structural Biology", Herausgeber Saenger & Heinemann (Macmillan, London), Band 10, S. 143–162, verwiesen. Typischerweise wird diese das Leukozyt-aktivierende Molekül codierende Nucleinsäuresequenz stromabwärts von einer Mehrzahl von tet O-Sequenzen platziert: im allgemeinen werden 5 bis 10 solcher tet O-Sequenzen verwendet, in direkten Wiederholungen.
Zweckmäßigerweise werden die tet O-Sequenzen im wesentlichen angrenzend (d. h. innerhalb 100 bp, vorzugsweise innerhalb 50 bp) mit einem "minimalen" (d. h. Enhancer-losen) eukaryotischen Promotor fusioniert (wie dem minimalen CMV Immediate Early Promoter, der vorhergehend beschrieben worden ist [Gossen & Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547]), so dass die Bindung des transaktivierenden Tetracyclin-sensitiven Polypeptids an die tet O-Sequenz eine verstärkte Expression der tet O-verbundenen codierenden Sequenzen hervorruft.
Konstrukte, die zum Einführen der Sequenz, die das Leukozyt-aktivierende Molekül und/oder einen Arzneimittel-regulierbaren Promotor codieren, besonders geeignet sind, sind allgemein bekannt und sind vorhergehend offenbart worden (z. B. Baron et al., 1995 Nucl. Acids Res. 23, 3605–3606; Schultze et al. 1996 Nature Biotechnology 14, 499–503). Ein besonders bevorzugtes Konstrukt (in dem Tetracyclin oder ein Analog davon das regulatorische Arzneimittel ist), von dem gefunden wurde, dass es sehr hohe Regulations- und Expressionsgrade der tet O-verbundenen Sequenzen ermöglicht, wird von Mohaminadi et al. offenbart (1997 Gene Therapy 4, 991–997); 1998 Gene Therapy 5, 76–84) sowie von Alvarez-Vallina et al., (J. Immunol. 5889–5895).
Das Verfahren ist wünschenswerterweise eines, bei dem es die Regulation der Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls dem Leukozyten ermöglicht, vorzugsweise mit den Zielzellen in Wechselwirkung zu treten, die eine relativ hohe Dichte der Leukozyt-stimulierenden Moleküle exprimieren, im Vergleich zu Nichtzielzellen, die einen relativ niedrige Dichte der Leukozyt-stimulierenden Moleküle exprimieren.
Der Leukozyt ist vorzugsweise ein Monozyt, ein Makrophage oder ein Lymphozyt, am meisten bevorzugt ein T-Lymphozyt. Für T-Lymphozyten (oder T-Zellen) ist das Leukozyt-stimulierende Molekül zweckmäßigerweise ein "fremdes" Antigen oder ein Tumor-assoziiertes Antigen (z. B. CEA), während das Leukozytaktivierende Molekül vorzugsweise die intrazelluläre (zytoplasmatische) Signaldomäne von mindestens einer der Ketten des T-Zellrezeptor(TCR) CD3-Komplexes umfasst oder die intrazelluläre Signaldomäne eines costimulatorischen Moleküls wie CD28, CD4 oder CD8.
Viele Tumor-assoziierte Antigene sind nicht auf Tumorzellen beschränkt: sie werden in relativ hohen Dichten auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert, aber sie können auch in niedrigeren Dichten auf der Oberfläche von bestimmten Nichttumorzelltypen in einem Patienten exprimiert werden. Dementsprechend resultieren viele therapeutische Verfahren, die den Versuch unternehmen, zytotoxische Mittel auf Tumoren über ein Tumor-assoziiertes Antigen zielgerecht einzusetzen oder Immunantworten darauf abzurichten, oftmals zu einem Collateralschaden für Nichttumorzellen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum zielgerechten Einsetzen von therapeutischen Wirkungen spezifisch auf Zellen, die eine hohe Dichte eines z. B. Tumor-assoziierten Antigens exprimieren. Die Expression des Leukozytaktivierenden Moleküls auf der Oberfläche des Leukozyten (der die therapeutische Wirkung verursacht oder vermittelt) kann reguliert werden, wodurch die Dichte des Leukozyt-stimulierenden Moleküls (z. B. des Tumor-assoziierten Antigens) verändert wird, die notwendig ist, um den Schwellenwert der Wechselwirkung zu erreichen, bei dem der Leukozyt aktiviert wird.
Zum Beispiel können T-Lymphozyten mit einer Nucleinsäuresequenz transformiert werden, die die Tetracyclin-sensitive Expression eines chimeren TCR-Moleküls mit spezifischer Bindungsaktivität für ein Tumor-assoziiertes Antigen steuert. Die Einstellung der Menge des Tetracyclins (oder des Analogs davon), die dem Patienten verabreicht wird, kann so erfolgen, dass die Dichte des Tumorassoziierten Antigens auf den Tumorzellen hinreichend ist, um die Aktivierung der T-Zelle zu erreichen, während die Dichte des Tumor-assoziierten Antigens auf Nichttumorzellen zu niedrig ist, wodurch der Collateralschaden minimiert wird. Die erwünschte Einstellung der Tetracyclinkonzentration im Patienten kann durch ein Versuch-und-Irrtum-Verfahren erfolgen, indem klinische Symptome oder Marker analysiert werden. Andere regulierbare Systeme, die zur Regulierung der Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls verwendet werden können, sind z .B. von Miller & Whelan (1997 Hum. Gene Ther. 8, 803–815) offenbart.
Daher wird das Leukozyt-stimulierende Molekül in bestimmten Ausführungsformen, in denen das Leukozyt-stimulierende Molekül ein Tumorassoziiertes Antigen ist, in relativ hoher Dichte auf der Tumorzielzelle exprimiert, und zwar mit relativ niedriger Dichte auf den Nichttumor-Nichtzielzellen, so dass das Durchführen des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zu einem Leukozyten führt, der in der Lage ist, Tumorzielzellen vorzugsweise zu erkennen und anzugreifen, der jedoch Nichttumorzellen im wesentlichen nicht angreift.
Das Leukozyt-aktivierende Molekül ist zweckmäßigerweise membrangebunden, typischerweise umfassend eine intrazelluläre (zytoplasmatische) Domäne, eine Transmembrandomäne und eine extrazelluläre Domäne. Wünschenswerterweise weist die extrazelluläre Domäne eine Bindungsspezifität für das Leukozytstimulierende Molekül auf. Das Leukozyt-stimulierende und/oder das Leukozytaktivierende Molekül kann monomer oder polymer (z. B. dimer, trimer usw.) sein.
Vorteilhafterweise ist das Leukozyt-aktivierende Molekül ein chimeres Polypeptid. Zum Beispiel kann der Leukozyt mit einer Sequenz transformiert werden, der die Arzneimittel-regulierbare Expression eines TCR-Moleküls steuert oder eines chimeren TCR-Moleküls, das mindestens eine funktionale Domäne (vorzugsweise die zytoplasmatische Signaldomäne) des TCR-Moleküls umfasst. Wenn das Leukozyt-aktivierende Molekül ein chimerer TCR ist, kann die Transmembrandomäne (die notwendig ist, um das Molekül auf der Oberfläche der T-Zelle zu verankern) aus dem Wildtyp TCR-Molekül stammen, oder es kann eine Transmembran (TM)-Domäne aus irgendeinem anderen Molekül umfassen, das auf der Oberfläche einer eukaryotischen Zelle vorliegt, oder es kann eine "synthetische", nicht natürlich vorkommende Transmembrandomäne sein. Vorzugsweise stammt die TM-Domäne von einem Mitglied der Immunglobulinfamilie von Polypeptiden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die extrazelluläre Domäne Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment (wie z. B. scFv, Fab oder ähnliches) oder ist von diesen abgeleitet. In besonderen Ausführungsformen umfasst das Leukozytaktivierende Molekül eine extrazelluläre Domäne mit Bindungsaffinität für ein Leukozyt-stimulierendes Molekül, das ein Tumor-assoziiertes Antigen ist (wie z. B. beschrieben von Pardoll, Referenz 7).
Andere Ausführungsformen der Erfindung (z. B. bezugnehmend auf die Antigendichte spezifische Aktivierung von B Lymphozyten) sind für den Fachmann offensichtlich.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung einen Leukozyten bereit, der mit einer Nucleinsäuresequenz transformiert ist, die ein Leukozyt-aktivierendes Molekül auf eine Art exprimiert, die in Bezug auf die Konzentration eines exogenen Mittels sensitiv ist, wobei der Leukozyt durch Interaktion zwischen dem Leukozytaktivierenden Molekül und einem Leukozyt-stimulierenden Moleküle aktiviert wird, das auf der Oberfläche einer Zelle vorliegt, wobei der Leukozyt in Bezug auf verschiedene Dichten dieser Leukozyt-stimulierenden Moleküle differenziell reaktiv ist und zwischen Zielzellen, die relativ hohe Dichten der Leukozytstimulierenden Moleküle aufweisen, und Nichtzielzellen, die relativ niedrige Dichten der Leukozyt-stimulierenden Molekülen aufweisen, unterscheidet. Der Leukozyt ist typischerweise einer, der nach dem oben offenbarten Verfahren behandelt worden ist.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren bereit, wobei die Zusammensetzung eine Mehrzahl von Leukozyten gemäß dem ersten Aspekt der oben definierten Erfindung umfasst und einen physiologisch aktzeptablen Verdünner. Die Erfindung stellt darüber hinaus in einem dritten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen bereit, wobei das Verfahren umfasst: das Nehmen einer Leukozytenprobe, vorzugsweise erhalten von einem Subjekt, das behandelt werden soll; Transformieren der Leukozyten mit einer Nucleinsäuresequenz, die die Expression eines Leukozyt-aktivierenden Moleküls in einer Art steuert, die gegenüber der Konzentration eines exogenen Mittels sensitiv ist; und Mischen der Leukozyten mit einem physiologisch akzeptablen Verdünner (wie z. B. Saline, Phosphat-gepufferte Saline, Gewebekulturmedium usw.).
Zusätzlich offenbart die Beschreibung die Verwendung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Behandlung eines humanen oder tierischen Subjekts, wobei das Verfahren die Herstellung einer Zusammensetzung wie oben definiert umfasst, das Verabreichen der Zusammensetzung gegenüber einem Subjekt und, falls notwendig, das Verabreichen einer exogenen Substanz gegenüber dem Subjekt, um den Grad der Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls in den verabreichten Leukozyten zu verändern.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung finden in einer Anzahl von Gebieten Anwendung, aber insbesondere bei der Behandlung von Tumoren und anderen neoplastischen Krankheiten oder im Zusammenhang mit diesen.
Üblicherweise werden die relevanten Nucleinsäuresequenzen in vitro in den Leukozyten eingeführt. Verschiedene Verfahren zum Einführen von Nucleinsäuresequenzen in eukaryotische Zellen sind bekannt, einschließlich Transfektion, Tranduktion, Elektroporation, Zellfusion und ähnliches. Alle diese Verfahren können erfindungsgemäß verwendet werden und können allgemein als Transformation bezeichnet werden.
In ähnlicher Weise sind die Verfahren zum Einführen von transformierten Leukozyten in ein Subjekt allgemein bekannt. Zweckmäßigerweise erfolgt dies durch Infusion oder Injektion in den Blutstrom des Subjekts. Typischerweise werden zwischen 10⁵- und 10⁸-Zellen (vorzugsweise zwischen 10⁶ und 10⁷) in den Blutstrom des Subjekts eingeführt. Es ist klar, dass das Einführen von fremden Zellen in ein Subjekt wahrscheinlich eine Immunantwort gegen fremde Antigene auf den Zellen hervorruft, so dass die Leukozyten im allgemeinen eine Gewebeübereinstimmung mit dem Empfängersubjekt aufweisen. Am zweckmäßigsten handelt es sich bei den Zellen um autologe Zellen, die ursprünglich von dem Subjekt erhalten wurden (z. B. aus peripherem Blut oder aus Knochenmark), die in vitro mit den relevanten Nucleinsäuresequenzen transformiert und dann wieder in das Subjekt eingeführt wurden. Typischerweise umfassen die in vitro-Stadien des Verfahrens allgemein ein Selektionsverfahren zur Selektion von Zellen, die erfolgreich transformiert sind, und eine Wachstumsphase, um die Anzahl der transformierten Zellen zu erhöhen. Verfahren zur Selektion und zum Wachstum von Zellen sind dem Fachmann allgemein bekannt und stellen nicht einen Teil der Erfindung dar.
Es ist möglich, dass das Leukozyt-aktivierende Molekül in dem Subjekt immunogen ist. Wenn die Erfindung die Regulierung der Expression des potenziell immunogenen Leukozyt-aktivierenden Moleküls beinhaltet, ist es wünschenswert, eine Verzögerung bei der Expression des Moleküls zu verursachen, nachdem die Zelle in das Subjekt eingeführt worden ist, und zwar aus Gründen, die unten stärker detailliert beschrieben werden. Demgemäss wird die Zelle im allgemeinen aus in vitro-Bedingungen, in denen die Expression des immunogenen Polypeptids vollständig unterdrückt ist, in in vivo-Bedingungen in das Subjekt transferiert, in dem die Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls nicht länger nach unten reguliert ist. Die Erfindung ist jedoch so, dass ein gewisser Zeitraum notwendig ist (möglicherweise 2 bis 10 Tage, vorzugsweise 4 Tage oder länger), damit die Zelle aus dem vollständig reprimierten Zustand in den voll-exprimierenden Zustand übergeht.
Die Zelle kann sich in einem Zustand befinden, in dem die Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls in vitro vollständig reprimiert ist, indem sie geeigneten (nicht-toxischen) Konzentration des regulatorischen Arzneimittels (Tetracyclin oder ein Analog davon) ausgesetzt wird und bei Einführen in das Subjekt, das frei von dem regulatorischen Arzneimittel ist, in einen Zustand eintritt, in dem das Leukozyt-aktivierende Molekül exprimiert wird. Alternativ kann aufgrund der Vielseitigkeit des TRS und seiner Varianten und anderer durch Arzneimittel regulierbarer Promotorsysteme, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, der Leukozyt in vitro in Abwesenheit des regulatorischen Arzneimittels in einem vollständig reprimierten Zustand gehalten werden und dann in ein Subjekt eingeführt werden, das geeignete Dosen des regulatorischen Arzneimittels erhält, um die Expression (nach einer geeigneten Verzögerung) des Leukozytaktivierenden Moleküls hervorzurufen.
Im allgemeinen, aber nicht essentiell, ist es bevorzugt, dass das Vorliegen eines regulatorischen Arzneimittels die Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls inhibiert, da das anschließende Entfernen der Zelle aus der Exponiertheit gegenüber dem regulatorischen Arzneimittel normalerweise zu einer längeren Ruhephase bzw. einer längeren Verzögerung führt, bevor die Induktion der Expression des Leukozyt-aktivierenden Moleküls erfolgt.
Die Effizienz des Tumorangriffes durch die eingeführten Leukozyten kann verstärkt werden, indem eine Expression von Zieleinheiten durch die Zellen auf ihrer Zelloberfläche hervorgerufen wird (siehe z. B. Eshar et Acad. Sci. USA 90, 720; Hwu et al. 1993, J. Exp. Med. 178, 361; Stancovski et al. 1993 J. Immunol. 151, 6577; und Brocker et al. 1996, Eur. J. Immunol. 26, 1770). Sobald sie sich innerhalb des Tumors befinden, können die Leukozyten ihren therapeutischen Effekt (z. B. die zytotoxische Wirkung oder die Rekrutierung von Makrophagen und Lymphozyten) ausüben.
Jeder solide Tumor, der zugänglich ist für aus dem Blut stammende Leukozyten, kann zur Behandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein. Zweckmäßigerweise umfasst der Leukozyt, der in das Subjekt eingeführt wird, auch eine Zelloberflächenkomponente, die den Leukozyten auf einen Marker zielen lässt, der auf der Oberfläche der Tumorzellen exprimiert wird. Diese können z. B. chimere "T-Körper"-Zielkomponenten sein, die dem Fachmann bekannt sind (siehe Offenbarungen von Eshar et al., Hwu et al., Stancovski et al., und Brocker et al., wie oben zitiert).
Das Abzielen der eingeführten Leukozyten auf den Tumor benötigt jedoch einige Zeit. Daher wird die Expression von immunogenen Polypeptiden während dieser Zeit vorzugsweise vermieden, da diese verursachen kann: (a) einen Collateralschaden für nicht mehr lebende Zellen und/oder b) eine Wechselwirkung des immunogenen Proteins mit Komponenten aus dem Immunsystem des Subjektes (insbesondere zirkulierenden Antikörpern). Der letztgenannte Punkt ist besonders relevant, falls eine wiederholte Verabreichung der Leukozyten erforderlich ist, da dies eine effiziente Induktion der Immunantworten gegenüber dem immunogenen Polypeptid verursachen würde, was zu einer Tendenz zur Wechselwirkung mit den verabreichten Leukozyten führen würde und sie daran hindern würde, den Zieltumor zu erreichen. Diese Probleme können nach den hierin offenbarten Verfahren überwunden werden, in dem man das potentiell immunogene Leukozyt-aktivierende Molekül erst nach einer signifikanten zeitlichen Verzögerung in hohen Graden exprimieren lässt, wobei zu diesem Zeitpunkt die verabreichten Leukozyten den Zieltumor penetriert haben, wodurch ein Abfangen durch das Immunsystem verhindert wird und der Collateralschaden für nicht maligne Zellen minimiert wird. Demgemäss kann das hierin offenbarte Verfahren in einem Subjekt durchgeführt werden, in dem bereits eine Immunantwort gegenüber den Leukozyt-aktivierendem Molekül erfolgt ist und das, z. B., zirkulierende Antikörper aufweist, die mit dem Leukozyt-aktivierenden Molekül reagieren oder immunokompetente Memory-Zellen, die dafür spezifisch sind.
Es kann wünschenswert sein, die Komponenten des Arzneimittel-regulierbaren Promotorsystem, das in dem Verfahren eingesetzt wird, zu modifizieren, um deren Immunogenizität zu reduzieren (z. B. durch Modifikation eines oder mehrerer DNA-bindender Proteine, um bestimmte Epitope zu entfernen). Das DNA-Protein, falls ein solches vorliegt, umfasst zweckmäßigerweise ein nucleates Lokalisierungssignal (NLS), um die Menge zu minimieren, die möglicherweise gegenüber dem Immunsystem des Subjekts präsentiert wird. Andere verwendbare Techniken sind in W 96/01313 offenbart.
Ein anderer Vorteil, der durch die Erfindung erzielt wird, liegt natürlich in der Fähigkeit, die Konzentration des exogenen Mittels zu steuern, gegenüber dem der Leukozyt exponiert wird, wodurch der Grad der Expression des Leukozytaktivierenden Moleküls im Leukozyten gesteuert wird. Dies wiederum steuert die Dichte der Leukozyt stimulierenden Moleküle, die erforderlich ist, um die Aktivierung des Leukozyten hervorzurufen. Die Erfinder haben gefunden, dass der Leukozyt durch Steuerung der Menge des Leukozyt-aktivierenden Moleküls auf dem Leukozyten dazu gebracht werden kann, eine bestimmte Schwellenwertdichte des Leukozyt-stimulierenden Moleküls auf einer Zelle zu erfordern, damit der Leukozyt aktiviert wird: Falls die Zelle nicht die hinreichende Dichte des Leukozyt-stimulierenden Moleküls aufweist, wird keine Aktivierung des Leukozyten hervorgerufen und die Zelle wird nicht durch den Leukozyten angegriffen. Falls die Zelle umgekehrt eine Dichte des Leukozyt-stimulierenden Moleküls über der Schwellenwertdichte aufweist, werden Leukozyten, die der Zelle begegnen, aktiviert und sie greifen die Zelle an.
In den meisten Ausführungsformen wird das regulatorische Arzneimittel toleriert, wenn es dem Subjekt verabreicht wird. Dementsprechend kann, falls erwünscht, in den Situationen, in denen die transformierten Zellen in vitro dem regulatorischen Arzneimittel ausgesetzt werden, um die Expression des Leukozyten-aktivierenden Moleküls zu inhibieren, das regulatorische Arzneimittel dem Patienten vor, während oder nach Einführen der transformierten Zellen verabreicht werden. Dies kann zur Verlängerung des Verzögerungsintervalls wünschenswert sein, oder zur Exposition der Zellen gegenüber mittleren Konzentrationen regulatorischer Arzneimittel, um die Expression des Leukozytaktivierenden Moleküls zu regulieren oder, falls der Patient während der Expression des Leuktozyt-aktivierenden Moleküls eine ungünstige Reaktion feststellen sollte, kann das regulatorische Arzneimittel in einer hinreichenden Dosis verabreicht werden, um dessen weitere Expression zu vermeiden.
Verfahren, mit denen dem Subjekt das regulatorische Arzneimittel verabreicht wird (falls erforderlich), sind dem Fachmann gut bekannt und schließen orale Verabreichung (in jeder Form), Pellets zur langsamen Freisetzung und Implantation einer Diffusionspumpe ein, sowie konventionellere Verfahren wie Injektion, Infusion, Inhallation oder Einnehmen. Falls z. B. Tetracyclin oder ein Tetracyclin-Analog dem Subject verabreicht werden, wird die Dosierung üblicherweise so eingestellt, dass eine Serumkonzentration zwischen etwa 0,05 und 1,0 μg/ml erzielt werden.
Auf diese Art wird die Schwellenwertdichte der Leukozyt-stimulierenden Moleküle, die zur Aktivierung des Leukozyten erforderlich ist, von der Konzentration des exogenen Mittels (oder des regulatorischen Arzneimittels) abhängen, denen der Leukozyt ausgesetzt wird. Daher kann durch Anpassen der Konzentration des exogenen Mittels auf das erwünschte Niveau erreicht werden, dass in das Subjekt eingeführte transformierte Leukozyten zwischen den Zielzellen (z. B. Tumorzellen), die eine relativ hohe Dichte des Leukozyt-stimulierenden Moleküls (z. B. Tumorassoziierten Antigens) exprimieren, und Nichtzielzellen (z. B. Nichttumorzellen), die eine relativ niedrige Dichte Leukozyten-stimulierender Zellen exprimieren, unterscheiden. Auf diese Art werden nur Zielzellen eine Aktivierung der Leukozyten erreichen, wodurch der "Collateralschaden" für Nichtzielzellen minimiert wird.
Die Erfindung wird im Weiteren durch illustrative Beispiele in Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen genauer beschreiben, in denen:
1A und 1B schematische Darstellungen der Nucleinsäurekonstrukte sind, auf die im Beispiel unten Bezug genommen wird;
2A und 2B und 3 repräsentative FACS-Daten zeigen;
4 ein Graph ist, der die Expression eines chimeren Polypeptids (prozentuale Expression in Kontrollzellen) gegen die Zeit zeigt;
5A und 5B Balkendiagramme sind, die den Grad der IL-2-Produktion (in Pikogramm/ml) durch T-Lymphozyten zeigen, die verschiedenen Konzentrationen von Tetracyclin oder dem Tetracyclin-Analog Doxycyclin ausgesetzt wurden;
6A ein Graph der mittleren Fluoreszenzintensität gegen [Tetracyclin] in ng/ml ist, der die Expression eines chimeren TCR-Leukozyt-aktivierenden Moleküls zeigt, das durch die Konzentration eines exogenen Mittels reguliert wird;
6B die FACS-Profile von zwei Leukozytenclonen zeigt;
7A ein Graph der OD (bei 450 nm) gegen die Konzentration von NIP₁₀-BSA (in ng/ml) ist, die zum Beschichten einer Mikrotiterplatte verwendet wurde;
7B ein Graph der T-Zeltaktivierung ist, wie durch IL-2-Produktion (pg/ml) gemessen, gegen die Konzentration von NIP₁₀-BSA (in ng/ml), die zum Beschichten einer Mikrotiterplatte verwendet wurde;
7C ein Graph für die % lebenden Zellen gegen die Konzentration von NIP₁₀ -BSA (in ng/ml), die zum Beschichten einer Mikrotiterplatte verwendet wurde;
7D ein Graph von % Annexin V-Bindung gegen die Konzentration von NIP₁₀-BSA (in ng/ml) ist, die zur Beschichtung einer Mikrotiterplatte verwendet wurde;
8A und 8B kartografische Karten der IL-2-Produktion (pg/ml) bei verschiedenen Zielantigen (NIP₁₀-BASA)-Dichten und verschie denen chTCR-Dichten (wie gemessen durch Fluoreszenzintensität, MFI) sind;
9 die FACS-Profile von HeLa S3-Zellen mit (1–4) oder ohne ("con")-Markierung mit NIP-enthaltendem Hapten zeigt, gefolgt von Markierung mit einem Anti-NIP-Antikörper scFv-Fragment (B1.8) und einem FITC-konjugiertem Ziegeantiserum gegen Maus-λ-Kette; und
10 eine Serie von drei Tafeln ist, die die IL-2-Produktion (pg/ml) durch NIP-responsive T-Zellen nach der Stimulierung durch HeLa S3-Zielzellen zeigen, beschichtet mit NIP-enthaltendem Hapten bei 1,5 oder 10 μg/ml (10A, B bzw. C) bei verschiedenen Effektor: Zielverhältnissen. Der hinterste Balken zeigt die Ergebnisse für T-Zellen ohne Tetracyclin-Repression, der mittlere Balken zeigt die Ergebnisse, die durch Tetracyclin-induzierte Repression erhalten werden und der vorderste Balken zeigt die mangelnde Reaktion der Zellen der Negativkontrolle, die den NIP-spezifischen chimeren T-Zellrezeptor nicht exprimieren.
Detaillierte Beschreibung einer Ausführungsform der Erfindung
Beispiel 1
Die Erfinder haben die Verwendbarkeit des Tetracyclin-gesteuerten Transaktivatorsystems als Mittel zur temporären Regulation zur Expression eines Oberflächenmoleküls in einer humanen T-Zeltlinie untersucht. Unter Verwendung eines Vektors, der sowohl die Transaktivator- als auch die Expressionsgeneinheit enthält, waren wir in der Lage, stabil transfizierte Jurkat-T-Zeltlinien zu erzeugen, in denen die Expression eines chimeren TCR (chTCR)-Moleküls wirksam reguliert werden konnte. In Abhängigkeit vom verwendeten Tetracyclinanalog und seiner Konzentration kann die Induktion von chTCR im stärkeren oder weniger stärkeren Ausmaß reversibel reprimiert werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass vollständig reprimierte T-Zellen nicht zur Produktion von IL-2 über diesen chimeren Rezeptor aktiviert werden können, wodurch gezeigt wird, dass eine reversible funktinnale Inaktivierung von redirigierten T-Zellen möglich ist.
Der Zeitablauf zur Repression der Genexpression auf basales Niveau war wesentlich kürzer als der Zeitablauf bis zum Erreichen des Maximalniveaus der Expression nach Entfernen des Arzneimittels und die Verzögerung bei der Wiederaufnahme der Promotoraktivität variierte in Abhängigkeit von der Konzentration des Doxycyclins (ein Tetracyclinanalog), das für die Repression verwendet wurde, wesentlich. Die Relevanz dieser Daten in Bezug auf die gegenwärtigen Vorstellungen der T-Zellen vermittelten Immunotherapie werden diskutiert.
Material und Methoden
Reagenzien. Die verwendeten mAbs schlossen SPvT3b (Maus IgG2A) (11) und YTH913.12 (Ratte IgG2b) (Serotex Ltd., Oxford, UK) ein, spezifisch für humane CD3ε bzw. CD28-Moleküle. Zur direkten Färbung würden die folgenden FITCkonjugierten Antikörper verwendet: UCHT-1 (Anti-CD3ε, ein Maus IgG1 Serotec; Ziege-polyclonale Antiseren gegen Maus λ-leichte Kette (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL); und Ziege-polyclonale Antiseren für Maus IgG (γ-Ketten spezifisch) (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO). Rinderserum Albumin (BSA) wurde mit 4-Hydroxy-5-iod-3-nitrophenylacetyl (NIP) (Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK) in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 (NIP₁₀-BSA) konjugiert (12). Tetracyclinhydrochlorid (Sigma) wurde bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Kulturmedium gelöst. Doxycyclinhydrochlorid ("Dox") (Sigma) wurde in 0,02N HCl bei einer Konzentration von 1 mg/ml verdünnt und weiter im Kulturmedium verdünnt. Die Antibiotikalösungen wurden am Tag der Verwendung frisch hergestellt und in die geeigneten Konzentrationen verdünnt.
Vektorkonstuktion. Die Plasmide pUHD 15–1, enthaltend das tTA-Transaktivatorgen, transkribiert aus dem humanen CMV Immediate Early (CMV IE) Promotor/Enhancer und pUHD 10–3, enthaltend einen tTA-responsiven Promotor (TRP, heptamerisierte tetO-Sequenzen (TetO) 7, fusioniert mit einem humanen CMV Immediate Early Minimalpromotor [PhCMV*–1]), wurden freundlicherweise von N. Bujard zur Verfügung gestellt (9). Das Plasmid pCS wurde durch Entfernen eines 1308 bp Sal I-Fragmentes hergestellt, enthaltend den CMV IE-Promotor, die multiple Clonierungsstelle und das SV40 Polyadenylierungssignal aus einem pCEP4-Gerüst (Invitrogen, San Diego, CA). Ein 6723 bp Nru I-Cla I verdautes Fragment aus pCS wurde mit Klenow (Cambio, Cambridge, UK) in stumpfe Enden überführt und in die Xho I-Stelle des Plasmides pUHD 15–1 insertiert, nach Behandlung dieser Stelle mit Klenow und Kälberintestinaler alkalischer Phosphatase (CIP, Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland). Das resultierende Plasmid, enthaltend sowohl tTA als auch Hygromycintranskriptionseinheiten in gegensätzlichen Richtungen, wurde pCRAZY genannt.
Das chimere NIP-spezifische scFv-TCR ζ Molekül wurde wie vorhergehend beschrieben (12) konstruiert und in das Plasmid pUHD 10–3 cloniert. Um dies zu erreichen, wurde die Hind III-Stelle aus pUHD 10–3 durch Spaltung mit Hind III entfernt, gefolgt von einem Klenow Auffüllen und einer Ligation mit stumpfen Enden, was zu pLAV5 führte. Um pLAV6 zu konstruieren, wurde ein 1342 bP EcoR I-Xba I-Fragement, abgeleitet aus dem Plasmid pVAC1.aNIP.TCR ζ (beschrieben in der Referenz 12), enthaltend eine humane VH1-Leadersequenz und ein chimeres NIP-spezifisches TCR ζ-Molekül, in die EcoR I-Xba I-Polylinkerstelle des pLAV5 cloniert. Das 91 bp EcoR I-Hind III-Fragment, enthaltend eine Rous Sarcoma Virus (RSV)-Promotorteilsequenz, wurde durch Verdau mit EcoRI und Hind III aus pLAV6 entfernt und unter Erzeugen des Plasmids pLAV7 Klenowaufgefüllt und über stumpfe Enden ligiert. Ein Polylinker, enthaltend das zu dem Vektorkonstrukt einzigartigen Restriktionsstellen HindIII-BgIII-EcoRV-Cla I, (5826: 5'-CATCGATCGAACTGATATCAGCAGATCTCAGAAGCTTAAT-3' Seq. ID Nr. 1 und 5827: 5'-ATTAAGCTTCTGAGATCTGCTGATATCAGTTCGATCGATGACGT-3' Seq. ID Nr. 2) wurde in die Ssp I AatII-Stelle des pLAV7 ligiert, was zu pLAV8 führte. Um ein Einzelplasmid mit sowohl dem tTA-Transaktivatorgen als auch dem chimeren NIP-spezifischen scFv-TCR ζ-Gen unter der Kontrolle des TRP in Antisense-Orientierung (relativ zu tTA-Transkriptionseinheit) zu erzeugen, wurde das Plasmid pCRAZY mit einem Xmn I- und Bg/ II-Linker (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) an dieser Stelle eingeführt. Nach Verdau mit Bg/ II und Hind III wurde ein 9386 bp-Fragment in die Bg/ II-Hind III-Stelle des pLAV8 insertiert. Das resultierende Plasmid wurde als pLAV12 (1A) bezeichnet.
Zellkultur und Transfektionen. Die Jurkat T-Zelllinie (Clon E6-1) wurde in RPMI 1640 gehalten, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 25 mM HEPES-Puffer (alle von GIBCO-BRL, Gaitersburg, MD), bezeichnet als Komplettmedium (CM). Zum Erzeugen von stabilen Zelllinien wurden Jurkat-Zellen mit linearisierter Plasmid-DNA (10 μg) durch Elektroporation bei 250 mV und 960 μF, wie vorhergehend beschrieben (13) transfiziert. Die Transfektanten wurden in CM, supplementiert mit 0,4 mg/ml Hygromycin B (Calbiochem, San Diego, CA) selektiert. Stabile Zelllinien wurden nach 3–4 Wochen etabliert und durch FACS auf Expression des chTCR analysiert. Um eine Population von chTCR ζ exprimierenden Zellen zu selektieren, wurden stabile Jurkat-Zellen mit den linearisierten pLAV12A oder pCEP4.aNIP.TCR ζ abgeleiteten Plasmidfragmenten durch FACS sortiert (siehe unten). Die resultierenden Populationen wurden zweifach durch Grenzverdünnungen cloniert und durch Durchflusszytometrie auf Proteinexpression gescreent.
Duchflusszytometrie und Zellsortierung. Die Expression von Zelloberflächenproteinen wurde durch Standarddirektimmunofluoreszenz, wie in (14) beschrieben, unter Verwendung von sättigenden Mengen FITC-konjugierter Antikörper durchgeführt. Tote Zellen wurden unter Verwendung einer Kombination von Propidiumiodid und vorwärtsgerichteter Lichtstreuung aussortiert. Geeignete FITC-Isotyp-abgeglichene irrelevante Abs wurden in allen Experimenten verwendet. Die Proben wurden mit einem FACScan^(R) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. Ein Minimum von 20.000 Zellen wurde für jede Probe analysiert. Eine anschließende erneute Analyse der Daten wurde unter Verwendung der CELLQuest Software (Version 1.2) (Becton Dickinson) durchgeführt. Zusätzlich wurden Zellen mit FITC-konjugiertem Ziege-Antiserum gegen Maus λ leichte Kette unter sterilen Bedingungen auf einem Zellsorter (FACScalibur, Becton Dickinson) sortiert.
Assay zu IL-2-Freisetzung. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 5×10⁵/ml für 48 h in CM in Abwesenheit oder Anwesenheit von Tetracyclin oder Doxycyclin in den angegebenen Konzentrationen vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, gezählt und stimuliert (10⁵/Napf), dreifach mit Plastik-immobilisiertem NIP10-BSA-Konjugaten (iNIP10-BSA) oder Plastikimmobilisiertem Anti-Cε mAb (Anti-CD3) in frischem CM allein oder in Gegenwart der Arzneimittel (12). Die Platten wurden bei 37°C in 5% Co₂ inkubiert. Nach 20 h wurden die Überstände geerntet und unter Verwendung eines ELISA Kit einem Assay auf IL-2 Aktivität unterzogen (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA).
Ergebnisse
Entwurf des tet-regulierbaren Vektors.
Zur Bestimmung, ob die Expression eines chTCR in T-Zellen pharmakologisch reguliert werden kann, haben die Erfinder die Plasmide pLAV12 und pCEP4a.NIP.TCR ζ konstruiert (1 und Alvarez-Vallina et al., 1997 ). Immunol. 159, 5889). Die 1A und 1B sind schematische Karten representativer Plasmidfagmente, wie sie in den Experimenten verwendet werden, und die nach Ingration in das Wirtsgenom die vorhergesagte Struktur zeigen: (A) pLAV12 bzw. (B) pCEP4.aNIP.TCR (. Die Richtung der Transkription wird durch Pfeile angezeigt.
Beide Konstrukte codieren ein chimeres TCR-Molekül, das vorhergehend beschrieben worden ist (12) und die Antigen-kombinierende Stelle des Haptenspezifischen (NIP) mAb B1.8 (15), fusioniert an die transmembran- und zytoplasmatischen Regionen der humanen TCR (-Kette (16), umfasst. pLAV12 (1A) ist ein Tetracylin-regulierbares Konstrukt, das alle Komponenten des TRS enthält, mit dem tTA-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven CMV IE-Promotors und dem Gen, das für chTCR codiert, insertiert unter Kontrolle des tTA-responsiven Promotors. In einem Versuch, die potenzielle cis-regulatorische Verstärkung der TRP-Aktivität aufgrund der Nähe zu den anderen Enhancer- und Promotorelementen, die in dem Vektor vorliegen, zu reduzieren, wurde die tTAabhängige Kassette von den anderen transkriptionalen Einheiten durch ein 2500 bp-Fragment getrennt, das den pUC-abgeleiteten ColEl-Replikationsursprung und das ß-Lactamasegen (1A) enthält. In dem Kontrollkonstrukt pCEP4.aNIP.TCR (war das chTCR-Molekül unter der Kontrolle des konstitutiven CMV IE-Promotors (1B).
Beide Konstrukte codieren ein Hygromycinresistenzmarkergen, transkribiert durch einen konstitutiven Promotor. Um die stabile Integration dieser DNA-Konstrukte in der entworfenen Konfiguration in transfizierte T-Zellen zu erleichtern, wurde ein linearisiertes Avr II-Sap I 9975 bp DNA-Fragment (1A) aus dem Plasmid pLAV12 und ein lineariertes Avr II-EcoRV 7551 bp-Fragment (1B), abgeleitet aus dem Plasmid pCEP4.aNIP.TCR ζ, denen beide der EBV-Replikationsursprung und das EBNA-1 Gen (1) fehlt, zur Transfektion der Jurkat-Zellen verwendet.
tTA-abhängige Expression des chimeren scFv-Genkonstrukts.
Jurket E6-1-Zellen wurden mit linearisierten Fragmenten von pLAV12 und pCEP4.aNIP.TCR ( transfiziert. Um auf höhere Expression von chTCR zu selektieren, wurden die stabil transfizierten Hygromycin-resistenten Zellen nach Färben mit FITC-markiertem Ziegeantimaus λ leichte Kette Antiserum durch FACS sortiert. Die meisten isolierten pLAV12-Transfektanten (JLAVI2S) und pCEP4.aNIP.TCR ζ-Transfektanten (JN3S-Zellen) exprimierten das chTCR, obwohl eine erhebliche Heterogenität in den absoluten Expressionsniveaus vorlag ( 2A, 2B).
2 zeigte repräsentative Ergebnisse, die die Regulation der chTCR-Genexpression durch Tetracyclinanaloge bestätigen. In 2A wurden stabil transfizierte nicht-clonierte JLAVI2S (linke Seite) und JN3S Jurkat (rechte Seite) Zellpopuiationen für 48 h in Tetracyclin-freiem Medium kultiviert (CM, obere Reihe der Tafel) oder in Gegenwart von 1 μg/ml Tet (durchbrochene Linie) oder Dox (durchgezogene Linie) (untere Reife der Tafeln) kultiviert und die Oberflächenexpression von chTCRs wurde nach Färben mit FITC-konjugiertem Ziegeantiserum gegen Maus λ leichte Kette untersucht. 28 zeigt einen zeitlichen Verlauf der Inaktivierung der chTCR-Genexpression in JLAVI2S-Zellen null Stunden (oben links), 8 h (oben rechts), 12 h (unten links) oder 24 h (unten rechts) nach Zugabe von Dox bei 1 μg/ml. In beiden 2A und 2B wurden Negativkontrollen (FITC-konjugiertes Ziegeantiserum gegen Maus IgG) überlagert (gefüllte Kurve). Die Nummer des Fluoreszenzkanals ist entlang der x-Achse aufgetragen und die y-Achse repräsentiert die relative Zellzahl.
Die ausgewählte Population von pLAV12-Transfektanten (JLAVI2S) wurde dann durch Grenzverdünnung cloniert und zwei Subclone, die chTCR bei niedrigen (2E11) und mittleren (1F5)-Graden (3) exprimieren, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Regulation der chimeren scFv-TCR Genexpression.
Um zu bestimmen, ob die Expression des chTCR durch Tetracycline unterdrückt werden kann, wurden JLAVI2S und JN3S-Zellen (5 × 10⁵/ml) für 48 h in Gegenwart von 1 μg/ml Tetracyclin (Tet) oder seinem Analog Doxycyclin (Dox) inkubiert. Bei dieser Konzentration wurden die meisten Oberflächen chTCRs (90%) in JLAVI2S-Zelien herunterreguliert, aber in JN3S-Zellen (2A) waren sie nicht betroffen. Darüber hinaus zeigte eine Oberflächenfärbung mit CD3ε mABs, dass die Menge des TCR/CD-Komplexes in beiden Zellpopulationen konstant blieb (nicht gezeigt). Bei dieser Konzentration wurden keine Änderungen in der Zellviabilität beobachtet, der Assay darauf erfolgte unter Verwendung einer Trypan Blau-Färbung (Daten nicht gezeigt).
Um den zeitlichen Verlauf der Inaktivierung der Genexpression zu untersuchen, wurden JLAVI2S-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe der Antibiotika bei 1 μg/ml analysiert (2B). Eine leichte Reduktion wurde innerhalb von 8 h der Exposion gegenüber den Arzneimitteln beobachtet und eine maximale Repression wurde innerhalb von 24 h erzielt, wobei zu diesem Zeitpunkt die Expression der chTCR auf weniger als 10% des Niveaus fiel, das in Abwesenheit von Tetracyclinen zum gleichen Zeitpunkt beobachtet wurde (Fig.
2B). Ähnliche Ergebnisse wurden in 1E5 und 2E11-Clonen beobachtet, wobei das Niveau des chTCR auf etwa 10% (1E5) und 20% (2E11) seiner maximalen Expression reduziert wurde (3). Der zeitliche Verlauf der Genrepression war als Reaktion auf beide Antibiotika (Tet oder Dox) in allen analysierten Populationen sehr ähnlich. Es ist wichtig festzustellen, dass der prozentuale Anteil der Zellen, in denen Tetracycline die Expression von chTCRs nicht herunterregulierten, bei <0,5% lag, was keinen Einfluss auf die Gesamtregulierung der gesamten Population von JLAVI2S-Zellen hatte (2A).
Eine Dosis-Antwortkurve der Genrepression wurde unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Tet oder Dox bestimmt. Nach 48 h Behandlung wurden die Zellen geerntet und die Expression der chTCR wurde durch FACS-Analyse untersucht. Typische Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Stabil transfizierte unclonierte (JLAVI2S, linke Spalte) und clonierte (1F5, mittlere Spalte; und 2E11, rechte Spalte) Jurkat-Zellpopulationen wurden für 48 h in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen (0 ng/ml obere Reihe, 0,1 ng/ml 2. Reihe, 1 ng/ml 3. Reihe und 10 ng/ml untere Reihe) Tet (gestrichelte Linie) oder Dox (durchgezogene Linie) kultiviert und die Oberflächenexpression von scFv-TCR (-Molekülen wurde untersucht. Negativ-Kontrollen (FITC-konjugierte Ziegeantiseren gegen Maus IgG) sind darüber gelegt (gefüllte Kurven). Die Nummer des Fluoreszenzkanals ist entlang der x-Achse gedruckt und die y-Achse repräsentiert die relative Zellzahl.
In Bezug auf 3 wurde in beiden clonalen Populationen (1E5 und 2E11) die Expression von chTCRs bei 100 pg/ml (0,1 ng/ml) Dox maximal reprimiert, wobei bei höheren Konzentrationen kein weiterer Zusatz im Niveau der Repression erzielt wurde. Eine partielle Aktivität des TRP wurde im Konzentrationsbereich von 1 pg/ml bis 100 pg/ml Dox beobachtet (Daten nicht gezeigt). In JLAVI2S-Zellen wurde eine maximale Repression bei Dox-Konzentrationen beobachtet, die größer oder gleich 1 ng/ml sind. Für Tetracyclin erfolgte die maximale Repression in allen analysierten Zelllinien bei Konzentrationen größer oder gleich 10 ng/ml. Die Induktion des chTCR-Gens wurde bei Tetracyclin-Konzentrationen von 100pg/ml bis 1 ng/ml nur teilweise reprimiert.
Um die Kinetik der Erholung der TRP-gesteuerten Genexpression nach Entfernen der Tetracycline zu untersuchen, wurden stabil transfizierte unclonierte JLAVI2S-Zellen für 48 h in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Dox (1 ng/ml bis 1 μg/ml) kultiviert. Nach drei Waschungen wurden die Zellen (5×10⁵/ml) in Tetracyclin-freiem CM in neuen Platten inkubiert und die Oberflächenexpression von chTCRs wurde alle 24–48 h nach Färben mit FITCkonjugierten Ziegeantiserum gegen Maus λ leichte Kette untersucht. Die Resultate sind in 4 gezeigt. Ähnliche Experimente wurden auch mit 1F5-Zellen durchgeführt (Daten nicht gezeigt).
Die 100%-Werte entsprechen der mittleren Fluoreszenz von unbehandelten Kontrollzellen nach Färbung mit FITC-konjugiertem Ziegeantiserum gegen Maus leichte Kette. Die Werte sind der prozentuale Anteil chimerer TCR ζ-Moleküle, die auf Tetracyclin behandelten Zellen exprimiert werden, wobei jede Zellpopulation mit der Menge der chimeren TCR ζ-Moleküle auf unbehandelten Kontrollzellen (als 100%) verglichen werden. In Bezug auf 4 war nach Behandlung der Zellen mit 1 μg/ml Dox (gefüllte Kreise) die Erholung der chTCR-Expression zum Zeitpunkt 192 h nach Entfernen des Arzneimittels nicht sichtbar, und sie wurde auf der Zelloberfläche nach 216 h erstmals selektiert, wobei die vollständige Erholung der Expression nach 288 h erfolgte. Im Gegensatz dazu verblieb TRP für lediglich 24 h nach Entfernen des Arzneimittels reprimiert, wenn die Zellen mit 1 μg/ml Tet vorbehandelt wurden, wobei ein maximales Niveau der chTCR-Expression nach 72 h erreicht wurde (Daten nicht gezeigt). Behandlung der Zellen mit niedrigeren Konzentrationen von Tet (nicht gezeigt) oder Dox (1ng/ml offene Rechtecke, 10 ng/ml – gefüllte Rechtecke, 100 ng/ml – offene Kreise) führte zu einer frühen Erholung der Aktivität des TRP.
Beispiel 2
Funktionale Untersuchung
Es ist vorhergehend gezeigt worden, dass der in dieser Untersuchung eingesetzte TCR fähig ist, die spezifische Erkennung seines verwandten Antigens (NIP, konjugiert an BSA), löslich oder auf Plastik immobilisiert, zu vermitteln, was zur Produktion von IL-2 durch die transfizierten T-Zellen (12) führt. In der vorliegenden Untersuchung hatten die Erfinder konsistent gefunden, dass die Stimulierung durch chTCR-exprimierende Zellen (JN3S, JLAVI2S, IF5 und 2E11) mit auf Plastik-immobilisierten NIP₁₀-BSA-Konjugaten eine IL-2-Sekretion induziert hat (Daten nicht gezeigt). Das Niveau der IL-2-Sekretion variierte zwischen verschiedenen transfizierten Zellpopulationen, im allgemeinen war es zudem in der gleichen Zellpopulation als Antwort auf standardisierte Stimulierung mit anti-CD3ε mAb, immobilisiert in Mikrotiter-Näpfen, ähnlich (nicht gezeigt).
Angesichts der Tatsache, dass für hohe Konzentrationen von Tetracyclin gezeigt wurde, dass sie in den Prozess der T-Zeltaktivierung eingreifen (17), haben die Erfinder die Wirkungen von steigenden Konzentrationen von Tet und Dox auf die anti-CD3ε-induzierte IL-2-Sekretion von Jurkat-Zellen untersucht. Die IL-2-Sekretion war durch 100 ng/ml oder niedrigeren Konzentrationen von Doxycyclin nicht beeinflusst, aber sie wurde bei einer Doxycyclin-Konzentration von 1 μg/ml zu 25% inhibiert (nicht gezeigt). Tetracyclin bei Konzentrationen von kleiner oder gleich 1 μg/ml hat die anti-CD3ε-induzierte IL-2-Sekretion nicht beeinflusst, was im Vergleich zu der in unbehandelten Zellen beobachten ähnlich war (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die maximale TRP-Repression bei Konzentrationen von Doxycyclin mehr als 1000-fach unter dem Schwellenwert zu induzieren, bei dem immunomodulierende Wirkungen auf humane T-Zellen erstmals auftreten.
Die Erfinder haben als Nächstes bestimmt, ob die Tetracyclin-vermittelte Suppression des chTCR einen reversiblen Zustand der Antigen-Unempfindlichkeit in den transfizierten Jurkat-Zellen induzieren kann. JLAVI2S und JN3S-Zellen wurden 48 h in ansteigenden Konzentrationen von Dox und Tet vorinkubiert und dann in immobiliertem NIP-BSA stimuliert, woraufhin ihre IL-2-Produktion gemessen wurde. In Situationen voller TRP-Repression wurden die JLAVI2S-Zellen in Bezug auf Oberflächen-chTCRs 90% herunterreguliert (siehe 3) und sie waren vollständig unempfindlich gegenüber einer Stimulierung mit iNIP10-BSA-Konjugaten (siehe 5A).
Die 5A und 5B sind Balkendiagramme, die die IL-2-Produktion (in pg/ml) durch transfizierte JLAVI2S (5A)- oder JN3S (5B)-Zellen zeigen, die mit iNIP10-BSA in Abwesenheit oder Anwesenheit von Tet oder Dox stimuliert wurden. Die Zellen wurden in einem Zeitraum von 48 h in Abwesenheit oder Anwesenheit der Arzneimittel präinkubiert (bei den angezeigten Konzentrationen in ng/ml), gewaschen und mit auf Plastik-immobilisierten NIP10-BSA-Konjugaten (50 μg/ml) stimuliert (10⁵/Napf), und zwar in frischem CM alleine (durchgezogener Balken) oder in Anwesenheit von Tet (schattierte Balken) oder Dox (offene Balken) in den angegebenen Konzentrationen. Eines aus zwei ähnlichen Experimenten ist gezeigt.
Die Herunterregulierung von etwa 75% der chTCRs war mit einer niedrigen IL-2-Produktion verbunden, wobei kein inhibitorischer Effekt beobachtet wurde, wenn das Niveau der chTCR-Expression etwa 50% von dem betrug, das in Abwesenheit von Tetracyclin beobachtet wurde (5A). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anzahl der Oberflächen-chTCR-Moleküle, die durch JLAVI2S-Zellen in Situationen vollständiger TRP-Repression exprimiert werden, nicht ausreicht, um den Aktivierungsschwellenwert zu erreichen, der für eine optimale T-Zellenfunktion erforderlich ist. Im Gegensatz dazu erfolgte bei Stimulierung von JN3S-Zellen mit iNIP10-BSA-Konjugaten keine inhibitorische Wirkung von Tetracyclin oder Doxycyclin bei Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml (5B).
Dieses Beispiel zeigt die Machbarkeit der Anwendung einer regulierten Expression von Leukozyt-aktivierenden Molekülen auf der Oberfläche von Leukozyten, um den Leukozyten eine differenzielle Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Dichten von Leukozyt-stimulierenden Molekülen (z. B. Antigenen) zu verleihen, die auf der Oberfläche einer Zielzelle vorliegen.
Beispiel 3
Jurkat E6-1 T-Zellen wurden stabil mit linearisiertem pLAV12 transfiziert und Clone (1D9 und 2D6) mit hohem Niveau einer Tetracyclin-reprimierbaren Expression wurden wie oben beschrieben ausgewählt. Das System ist für Rezeptordichte-Untersuchungen ideal, da es die transkriptionale Regulation der chTCR-Expression ohne Einbindung von TCR, der intrazelluläre Signale erzeugen und die Zellempfindlichkeit regulieren könnte (21), erlaubt. Unter Verwendung des geeigneten Bereichs von Tetracyclin-Konzentrationen konnten leicht fein regulierte Änderungen im Niveau der chTCR-Expression induziert und in stabiler Form auf einem bestimmten Niveau gehalten werden, indem kontinuierlich in einer festen Konzentration von Tetracyclin kultiviert wurde (6A und 6B).
6A zeigt die mittleren Flureszenzintensitätswerte von 1D9 (offene Kreise) und 2D6 (gefüllte Kreise)-Zellen für 48 h in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Tetracyclin, nachdem mit FITC-konjugiertem Antiserum gegen Maus λ leichte Kette gefärbt wurde.
6B zeigt die FACS-Profile von 1D9 (obere Tafel) und 2D6 (untere Tafel)-Zellen, die für 48 h in Tetracyclin-freiem Medium (mit "unbehandelt" markierte Kurve) oder in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Tetracyclin im 0,1 bis 10 ng/ml-Bereich (offene Kurven zwischen "unbehandelt" und "Kontrolle" Profilen) kultiviert. Negativkontrollen (FITC-konjugiertes Ziegeantiserum gegen Maus IgG) sind darübergelegt (grau gefüllte Kurve in der linken Grafik).
Es wurde gefunden, dass die Clone 1D9 und 2D6 aktiviert werden konnten, bei Antigen-vermittelter Ligation ihres chTCR durch Plastik-immobilisierte NIP10-BSA-Konjugate (iNIP10-BSA) IL-2 zu sekretieren. Die Mikrotiterplatten wurden mit NIP10-BSA beschichtet und wie folgt überprüft:
Näpfe von 96-Napfplatten mit runden Böden, die für Gewebekultur behandelt waren, wurden passiv mit 100 μl von 10 Dreifachserien-Verdünnungen von NIP₁₀-BSA beschichtet, beginnend bei 100 μg/ml. Die relative Menge von NIP₁₀-BSA, die an die Näpfe gebunden war, wurde von der Verwendung von löslichem B1.8scFv-Antikörperfragment (15) abgeschätzt. Die Bindung wurde mit Ziegeantiserum gegen Maus λ Kette und Peroxidase-konjugiertem Antiziege/Schaf mAb GT-34 detektiert. Die Ergebnisse sind grafisch in 7A gezeigt.
Die Erfinder haben dann die Fähigkeit von NIP₁₀-BASA-beschichteten Platten untersucht, die IL-2-Produktion in 1D9 und 2D6-Zellen zu stimulieren. Etwa 5 × 10⁴ Zellen wurden in Tetracyclin-freiem Medium in 96-Napfplatten mit rundem Boden stimuliert, die mit verschiedenen Mengen von NIP₁₀-BSA-Konjugaten beschichtet waren. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment aus dreien und sind in 7B gezeigt. Die Standardabweichung für IL-2-Messungen war weniger als 15%. In der 7B sind Daten für 1D9-Zellen durch offene Kreise gezeigt und die für 2D6-Zellen sind durch gefüllte Rechtecke gezeichnet.
Die 7C und 7D zeigen die Ergebnisse von Experimenten, in denen die Clone 1D9 (offene Kreise) und 2D6 (gefüllte Rechtecke) gegenüber verschiedenen Mengen von iNIP10-BSA für 24 h exponiert wurden. In 7C ist die Anzahl der Zellen gezeigt, die lebendig blieben (zytofluorometrisch gemessen, wie von Boehme & Lenardo, 1993, Leukemia (Baltimore) 7, 845 beschrieben): der prozentuale Zellverlust wurde als 100 × [1-(Anzahl der lebendigen Zellen, die Antigenstimulation erfahren/Anzahl der lebenden Zellen ohne irgendeine Behandlung)] berechnet.
Die 7D zeigt eine Beurteilung der Apoptose, gemessen durch Annexin V-Bindung an apoptotische Zellen, wie von Vermes et al. (1995 ). Immunol. Methods 180, 39) beschrieben. Um Zellen zu unterscheiden, die ihre Membranintegrität verloren haben, wurde vor der Analyse Propidiumiodid bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugesetzt.
Die Erfinder haben gefunden, dass bei Exposition von Zellen gegenüber einem Bereich von verschiedenen Konzentrationen von iNIP10-BSA (7A) eine optimale IL2-Sekretion bei niedrigen oder mittleren Antigendichten beobachtet wurde und dass diese mit ansteigender Antigendichte über dieses Niveau hinaus abnahm (7B). Die Suppression der IL-2-Sekretion bei hoher Antigendichte war mit einem klaren Dosis-Antworteffekt in Bezug auf die Zellviabilität verbunden (7C). Annexin V-Färbung zeigte, dass die Apoptose ein Mechanismus ist, der diesem Verlust der Zellviabilität zugrundeliegt, wobei beide Clone ein ähnliches Dosis-Wirkungsverhältnis in Bezug auf die Apoptose zeigen (7D).
Um das Verhältnis zwischen chTCR-Rezeptordichte, Zielantigenkonzentration und T-Zell-Antwort weiter zu untersuchen, wurde die Sekretion von IL-2 durch 1D9-Zellen, die in verschiedenen Konzentrationen von Tetracyclin gehalten wurden (und daher verschiedene Dichten des chTCR exprimierten) in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von iNIP10-BSA bestimmt. Die Daten aus einem repräsentativen Experiment sind in 8 grafisch gezeigt, die eine Anzahl von interessanten Merkmalen zeigt.
Wie erwartet, besteht für Zellen, die eine hohe Dichte des chTCR exprimieren, eine Schwellwertkonzentration des Antigens, unterhalb derer es nicht möglich ist, eine maximale IL-2-Antwort zu induzieren. In ähnlicher Weise gibt es einen niedrigen Schwellenwert der chTCR-Rezeptordichte, unterhalb dessen es nicht möglich ist, die Sekretion von IL-2 zu induzieren, auch wenn die Zellen sehr hohen Konzentrationen von Antigen ausgesetzt werden. Zwischen diesen beiden Extremen besteht ein mittlerer Bereich der chTCR-Dichten, indem die Schwellenwert-Antigenkonzentration, die zur Stimulierung der IL-2-Sekretion erforderlich ist, mit steigendem Niveau der chTCR-Expression konstant abfällt. Bei einer gegebenen Konzentration von Antigen steigt die Größenordnung der IL-2 Antwort auf ein maximales Niveau, wenn die Oberflächendichte von chTCR auf der Zelle über ein bestimmtes Schwellenwertniveau steigt. Mit ansteigender Rezeptordichte über das Niveau hinaus, das eine maximale IL-2-Freisetzung erzeugt, erfolgt ein progressiver Abfall der T-Zellantwort, der mit einem Verlust an T-Zellviabilität assoziiert ist, vermutlich als Konsequenz einer exzessiven Signaltransduktion über chTCR. Eine Rezeptor-abhängige Suppression der IL-2-Antwort wurde bei niedrigen Antigen-Konzentrationen nicht beobachtet, selbst auf dem höchsten Niveau der TCR-Expression. 8 zeigt auch, dass für jede gegebene Antigenkonzentration, die zur optimalen Stimulierung der T-Zellen fähig ist, ein entsprechender schmaler Bereich der Rezeptordichte besteht, der mit der Induktion einer optimalen T-Zell-Antwort korreliert. Diese "ideale" Rezeptordichte ist bei einer niedrigen Antigenkonzentration hoch und verringert sich mit steigender Antigenkonzentration bis eine kritische minimale Rezeptordichte erreicht ist, unterhalb der eine maximale IL-2-Antwort nicht mehr verursacht werden kann, unabhängig von der Antigenkonzentration. Ein anderes interessantes Merkmal ist das Verhältnis zwischen der chTCR-Dichte und der Suppression der T-Zellantworten bei hoher Antigenkonzentration. Die Auftragung zeigt, dass mit fallender chTCR-Dichte, ein Bereich erreicht wird, in der die T-Zellantwort über einen großen Bereich hoher Antigenkonzentrationen optimal bleibt. Eine Antigen-vermittelte Suppression der Antwort wird bei diesen mittleren Dichten nicht erreicht, sogar bei der höchsten erzielbaren Antigenkonzentration. Diese Daten bestätigen, dass die TCR-Dichte eine Schwellenwertkonzentration des Antigens verursacht, die für die T-Zellaktivität erforderlich ist und liefert darüber hinaus einen Beleg dafür, dass eine exzessive TCR-Auslösung die T-Zellantwort unterdrückt (Critchfield et al., 1994 Science 263, 1139). Der wichtigste Befund dieser Untersuchung ist jedoch, dass es sich gezeigt hat, dass eine optimale T-Zeltaktivierung dann möglich ist, wenn die TCR-Dichte korrekt eingestellt ist, um in optimaler Weise auf die Konzentration des Antigens in der Umgebung zu reagieren. Die Daten verleihen daher der Hypothese, dass T-Zellen im Verlauf einer Immunantwort einer Reifung in Bezug auf die Rezeptordichte unterliegen, starke Unterstützung.
Zusätzlich zu ihrer wichtigen Relevanz für die Untersuchung der T-Zellbiologie haben unsere Beobachtungen Auswirkungen auf die Entwicklung therapeutischer Strategien, die einen adoptiven Transfer von T-Zellen einsetzen, die chimere Rezeptoren exprimieren, in denen Einzelketten-Antikörperdomänen mit verschiedenen Signalteilen des TCR/CD3/ζ-Komplexes als Mittel zum Abzielen von T-Zellen auf Krebsantigene verbunden sind (Eshar et al., 1993; Brocken et al., 1996, beide oben zitiert). Ein wichtiger theoretischer Einwand gegen diesen Ansatz besteht darin, dass die meisten Krebsantigene, obwohl sie auf Krebszellen in größerem Umfang exprimiert werden als auf Zellen normaler Gewebe, nicht wirklich tumorspezifisch sind. Unsere Daten legen es jedoch nahe, dass es möglich sein sollte, den Expressionsgrad eines chimeren TCRs so einzustellen, dass eine solchermaßen manipulierte T-Zelle durch Krebszellen, die eine hohe Dichte des Zielantigens exprimieren, optimal aktiviert wird und nicht von normalen Zellen, die das gleiche Antigen in niedrigerer Dichte exprimieren.
Beispiel 4
In diesem Beispiel haben die Erfinder die Fähigkeit von T-Zellen untersucht, die Tetracyclin-regulierbare chimere TCR-Moleküle exprimieren, durch Zielzellen (HeLa S3) stimuliert zu werden, die NIP-Hapten beschichtet waren.
Jurkat E6-1-Zellen wurden in RPMI 1640, supplementiert mit 10% FCS, 3mM L-Glutamin, Antibiotika, 25 mM HEPES-Puffer (alle von GIBCO-BRL, Gaitersburg, MD), und 0,4 mg/ml Hygromycin B (Calbiochem, San Diego, CA, wie oben beschrieben) gehalten. HeLa S3-Zellen (ATCC CCL-2.2) wurden in DMEM gehalten, das mit 10% FCS, 2mM L-Glutamin und Antibiotika (GIBCO) supplementiert war.
Hapten-Modifikation von Zielzellen
HeLa S3-Zellen wurden ausgiebig in PBS gewaschen, gezählt und ihre Konzentration wurde auf 10⁷/ml eingestellt. Verschiedene Mengen einer frischen 50 mg/ml-Lösung von NIP-CAP-Osu [Succiriimidester von 3-Nitro-4-hydroxy-5-iodphenylessigsäure mit Aprionsäure auf Abstand gehalten] (Genosys Biotechnologies Inc., Cambridge, UK) in trockenem Dimethylformamid wurden der Zellsuspension zugegeben, unter Erzielung von End-Konzentrationen im Bereich von 1–10 μg/ml. Die Zellen wurden für 1 h bei 37°C inkubiert und dann dreimal mit 15 ml kaltem PBS gewaschen, supplementiert mit 10% FCS.
Durchflusszytometrie
Die Expression von chTCR-Molekülen wurde durch Standarddirekt-Immunofluoreszenz unter Verwendung von FITC-konjugierten Ziegeantiserum gegen Maus λ-Kette (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) aufgezeichnet. Die relative Menge von an Hapten-modifizierte HeLa S3-Zellen gebundenem NIP wurde durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung einer Sättigungsmenge von löslichem B1.8scFv-Antikörperfragment und eines FITC-konjugierten Ziegeantiserum gegen Maus λ-Kette (Southern Biotechnology Associates) abgeschätzt. Es wurden mindestens 20.000 Zellen mit einem FACScan (Becton Dickinson) analysiert.
T-Zellstimulierung
Jurkat 1D9-Zellen (5 × 10⁵/ml) wurden für 48 h in Abwesenheit oder Anwesenheit von Tetracyclinhydrochlorid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) vorinkubiert und die Oberflächenexpression von chTCR wurde durch FACS-Analyse untersucht. In jedem Assay wurden 5 × 10⁴-Effektor Jurkat 1D9-Zellen, die verschiedene chTCR-Dichten exprimierten, mit Target HeLa S3-Zellen cokultiviert, die verschiedene Gehalte an NIP-modifizierten Zelloberflächenproteinen in verschiedenen Effektor : Ziel (E : T)-Verhältnissen im Medium allein oder in Gegenwart von Tetracyclin bei der gleichen Konzentration, die ursprünglich für die Repression verwendet wurde, cokultiviert. Die Zellen wurden zweifach in 96-Wellplatten mit runden Böden (Corning, NY, USA) bei 37°C in 5% CO₂ in einem Endvolumen von 200 μl inkubiert, und nach 20 h wurden zellfreie Überstände geerntet und unter Verwendung eines ELISA-Kit (Genzyme Diagnostic, Cambridge, MA) auf IL-2-Aktivität untersucht.
Ergebnisse
Die Markierung von HeLa S3-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von NIP-CAP-Osu führte zur Erzeugung von Populationen lebendiger Zellen, die verschiedene Niveaus von Hapten-modifizierten Zelloberflächenproteinen in einem homogenen Muster exprimierten (9).
In 9 sind die GACS-Profile verschiedener HeLa-Zellpopulationen gezeigt. Das Profil am extremen linken Ende (markiert "con") betrifft Zellen der negativen Kontrolle ohne NIP-CAP-Osu-Markierung. Die Profile 1–4 sind die durch FACS-Analyse von HeLa S3-Zellen erzeugt worden, die mit 1, 2,5, 5 bzw. 10 μg/ml Hapten markiert waren.
Wir haben vorgehend gezeigt, dass das bei dieser Untersuchung analysierte chTCR fähig ist, eine spezifische Erkennung seines verwandten Antigens (NIP, konjugiert an BSA), entweder in Lösung oder auf Plastik immobilisiert, zu vermitteln, was zur Produktion von IL-2 durch transfizierte T-Zellen führt. In diesem Beispiel haben wir konsistent herausgefunden; dass nicht mit Tetracyclin behandelte chTCR-exprimierende 1D9-Zellen nach Inkubation mit NIPmodifizierten HeLa S3-Stimulatorzellen spezifisch zur Produktion von IL-2 in einer Dosis-abhängigen Art ausgelöst werden konnten (siehe 10A bis 10C). Interessanterweise war das Niveau der IL-2-Sekretion höher als das, das in der gleichen Zellpopulation als Antwort auf Plastik-immobilisierte NIP-BSA-Konjugate beobachtet wurde. Dies legt es nahe, dass zusätzliche synergistische oder costimulatorische Signale existieren. Nicht-markierte HeLa S3-Zellen haben Jurkat 1D9-Zellen nicht aktiviert (nicht gezeigt), wodurch die Spezifität der Antwort gegenüber NIP demonstriert wird. Nicht-transduzierte ursprüngliche Jurkat-Zellen konnten durch NIP-markierte (10) oder unmarkierte (nicht gezeigt) HeLa-S3-Zellen nicht zur Sekretion von IL-2 stimuliert werden. Jurkat 1D9-Zellen, die für 24 bis 48 h in Gegenwart von 10 ng/ml Tetracyclin inkubiert waren, haben den Hauptteil der Oberflächen-chTCR-Expression (1) herunterreguliert und die Zellen wurden im Ergebnis gegenüber der Stimulierung mit zellgebundenem Hapten unempfindlich, sogar bei hohen E : T-Verhältnissen (10).
Diskussion
Die Erfinder haben einen einzelnen Vektor verwendet, der alle Komponenten des TRS für die pharmakologische Regulation eines in einer humanen T-Zelllinie exprimierten fremden Gens enthält. Der TRS umfasst das tTA-Gen, üblicherweise unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, und ein interessierendes Gen unmittelbar stromabwärts des tTA-responsiven Promotors (9). Um die Anwendung des TRS auf T-Zellen zu erleichtern, haben die Erfinder einen geschlossenen Plasmidvektor konstruiert, der beide Komponenten des TRS codiert, sowie ein Hygromycin-selektierbares Markergen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors. Der neue Vektor überwindet die Effizienzverluste, die mit einer Co-Transfektion durch das ursprüngliche Zweiplasmid-basierte TRS-System (9) verbunden sind und er stellt die Integration gleicher Kopiezahlen der tTA- und Reportergeneinheiten in einer unmittelbaren cis-Konfiguration auf dem gleichen chromosomalen Locus sicher.
Unter Verwendung dieses stabilen Expressionssystems als Modell für Ansätze zur integrierten Gentherapie haben die Erfinder gezeigt, dass ein scFv-TCRζ-chimeres Molekül funktional in einer humanen T-Zelllinie exprimiert werden kann und dass diese Expression pharmakologisch herunterreguliert werden kann, was zu einem Verlust der Empfindlichkeit gegenüber dem Zielantigen in der genetisch modifizierten T-Zelle führt. In Abwesenheit von Tetracyclinen war das Expressionsniveaus des chTCRs vergleichbar mit dem, das beobachtet wurde, wenn das chimere Gen unter der Kontrolle des starken CMV IE Enhancer/Promotors stand. Eine wirksame Tetracyclin-abhängige Suppression der Genexpression wurde in allen untersuchten T-Zelltransfektanten beobachtet. In Abhängigkeit von der Dosis und dem eingesetzten Analog konnte die Expression von chTCRs mehr oder weniger stark reprimiert werden. Dies zeigt, dass der TRS auf T-Zellen anwendbar ist, unter Erzielen eines funktionalen Niveaus der Transaktivatorexpression ohne irgendeine sichtbare toxische Bremswirkungen der VP16-Domäne.
Variable Wirkungen sind für verschiedene Tetracyclinanaloge in vorhergehenden Untersuchungen des TRS gezeigt worden, wobei Doxycyclin im Vergleich zu Tetracyclin 100-fach stärkere Wirkung aufweist (18). In unserem System erfolgte eine maximale Repression bei einer Konzentration von 10 ng/ml Tetracyclin, wohingegen Doxycyclin eine vollständige Repression des TRP über einen Bereich von 100 pg/ml bis 1 ng/ml verursachte.
Der zeitliche Verlauf des Abfalls in der chTCR-Expression bei Exposition gegenüber Tet oder Dox war kurz und dies legt nahe, dass die chimeren TCRζ-Ketten ähnlich zu Wildtyp TCRζ-Ketten einem schnellen Abbau unterliegen (19). In dieser Hinsicht ist es interessant festzustellen, dass der Abbau von ζ-Ketten in Jurkatzellen gegenüber dem in primären T-Zellen ähnlich ist (19). Im Gegensatz zur raschen Suppression der Genexpression war ihre Erholung nach Entfernung von Doxycyclin wesentlich langsamer. Die Verzögerung vor dem Beginn der Erholung der chTCR-Genexpression variierte direkt proportional zur Konzentration von Doxycyclin, das für die Repression verwendet wurde. Diese andauernde Repression und die relativ langsame Erholung der Genexpression, die nach Entfernen der Tetracyclinanaloge erfolgt, ist in allen Zelltypen beobachtet worden und könnte bei der Entwicklung neuartiger T-Zellimmuntherapieansätze und neuer Immunvermeidungsstrategien von Interesse sein.
Die Expression des chimeren TCR führte zu einer Empfindlichkeit gegenüber NIP-BSA-Konjugaten, was durch die IL-2-Sekretion bei Exposition gegenüber diesen Antigenen gezeigt wurde. Es wurde gezeigt, dass Doxycyclin diese Empfindlichkeit gegenüber Antigen bei Konzentrationen vollständig verhinderte, die keine anderen immunomodulierenden Wirkungen auf humane T-Zellen hatten und weit unter den Gewebekonzentrationen lagen, die klinisch erzielt werden, wenn Doxycyclin zur Behandlung einer Infektion verwendet wird (20). Daher zeigen diese Ergebnisse, dass die Verwendung des TRS-Vektors ein Mittel liefern kann, um den reinfusierten Gen-modifizierten T-Zellen Unempfindlichkeit gegenüber dem Zielantigen zu verleihen, falls diese Autoimmunstörungen verursachen. In ähnlicher Weise sollte es durch Behandlung manipulierter T-Zellen mit Doxycyclin vor deren Verabreichung möglich sein, die Expression des Transgens für einen vorherbestimmten Zeitraum abzuschalten, wodurch der Collateralschaden auf normale Gewebe, die möglicherweise niedrige Gehalte des Zielantigens exprimieren, begrenzt wird.
Interessanterweise war bei Tet oder Dox-behandelten Jurkat-T-Zellen stets eine gewisse Restexpression des chTCR durch FACS-Analyse nachweisbar, sogar wenn die Suppression ausreichend war, um eine Empfindlichkeit gegenüber dem Zielantigen vollständig zu unterdrücken. Dies zeigt, dass die Anzahl der chTCR-Moleküle, die im "Aus"-Zustand exprimiert werden, nicht hinreichend ist, um eine wirksame T-Zeltaktivierung auszulösen (21), selbst bei dem experimentell verwendeten System, in dem Zellen hohen Konzentrationen an multivalentem Antigen ausgesetzt wurden. Die Fähigkeit, die Expression der TCR-Moleküle in einfacher Art auf definiertem Niveau zu regulieren, könnte relevant sein, um die Stöchiometrie des T-Zellaktivierungsprozesses zu untersuchen. Im therapeutischen Bereich deutet dies auf die Möglichkeit hin, T-Zellen eine differenzielle Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Oberflächendichten des Antigens auf den Zielzellmembran zu verleihen.
Eine vollständige Suppression der Transgenexpression wurde in der vorliegenden Untersuchung nicht erzielt. Die Charakteristika des eingesetzten Vektors und/oder der Zelltyp-spezifischen Faktoren können für dieses Niveau der Transkription verantwortlich sein, dass in dem nicht-induzierten Zustand beobachtet wurde (22, 23). Zusätzlich muss die potenzielle Immungenität des tTA-Proteins in Betracht gezogen werden. In dem von uns eingesetzten Vektor steht der Transaktivator unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, was die konsistente Expression unabhängig von dem Vorliegen von Tetracyclin sicherstellt und daher möglicherweise eine Immunantwort gegen genetisch modifizierte T-Zellen hervorruft, selbst im reprimierten Zustand. Dies tritt jedoch für eine neuere Generation Enhancer-freier-Tetracyclin-responsiver Vektoren nicht zu, in denen Tetracyclin das tTA-Protein an der Bindung an TRP hindert, wodurch sowohl seine eigene Expression als auch die Expression des Reportergens im Sinne eines selbstregulierenden Kreislaufs unterdrückt wird (18, 24). Diese Anordnung führt zu einer verstärkten Suppression der Transgenexpression (auf ein vernachlässigbares Niveau in vorläufigen Untersuchungen) und stellt sicher, dass das Vorliegen des tTA-Proteins im vollständig reprimierten Zustand stark reduziert ist (24).
Zusammenfassend gesagt, haben wir die Verwendung eines einzelnen Tetracyclinsupprimierbaren Vektors zum Erzielen einer chimeren TCR-Gens in Jurkat-T-Zellen gezeigt, und wir haben darüber hinaus gezeigt, dass dies ein zweckmäßiges Verfahren für die pharmakologische Regulierung der Empfindlichkeit manipulierter T-Zellen gegenüber ihrem Zielantigen darstellt.

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SEQUENZLISTE

Claims

Leukozyt, transformiert mit einer Nucleinsäure-Sequenz, die ein Leukozyt-aktivierendes Molekül auf eine Art exprimiert, die in Bezug auf die Konzentration eines exogenen Mittels sensitiv ist, wobei der Leukozyt durch Interaktion zwischen dem Leukozyt-aktivierenden Molekül und einem Leukozyt-stimulierenden Molekül aktiviert wird, das auf der Oberfläche einer Zelle vorliegt, wobei der Leukozyt in Bezug auf verschiedene Dichten dieser Leukozytstimulierenden Moleküle differentiell reaktiv ist und zwischen Zielzellen, die relativ hohe Dichten der Leukozyt-stimulierenden Moleküle aufweisen, und Nicht-Zielzellen, die relativ niedrige Dichten der Leukozytstimulierenden Moleküle aufweisen, unterscheidet.
B- oder T-Lymphozyt gemäß Anspruch 1.
Leukozyt gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Nucleinsäure-Sequenz in operabler Weise mit einem Pharmazeutikaregulierbaren Promotor verbünden ist.
Leukozyt gemäß mindestens einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Leukozyt-stimulierende Molekül ein Tumorassoziiertes Antigen ist, das auf einer Tumor-Zielzelle mit höheren Dichten exprimiert wird als auf Nicht-Tumor-Nicht-Zielzellen.
Leukozyt gemäß mindestens einem. der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Leukozyt-stimulierende Molekül ein Karzino-embrionisches Antigen ist.
Leukozyt gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Leukozyt ein T-Lymphozyt ist.
Leukozyt gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Leukozyt-aktivierende Molekül ein chimäres Polypeptid ist.
Leukozyt gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Leukozyt-aktivierende Molekül eine intrazelluläre Signaldomäne, eine Transmembrandomäne, die das Molekül in der Membran der Leukozytenzelle hält, und eine extrazelluläre Domäne umfasst.
Leukozyt gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Leukozyt-aktivierende Molekül die interzelluläre Signaldomäne von mindestens eine der Ketten des CD3-Komplexes umfasst, oder die intrazelluläre Signaldomäne eines co-stimulierenden Moleküls.
Leukozyt gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Leukozyt-aktivierende Molekül eine Do- mäne umfasst, die eine Bindungsspezifizität für das Leukozyt-stimulierende Molekül aufweist.
Leukozyt gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das exogene Mittel Tetracyclin oder ein Analog davon (wie hierin definiert) ist.
Zusammensetzung zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren, wobei die Zusammensetzung eine Mehrzahl von Leukozyten gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11 in einem physiologisch akzeptablen Verdünner enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, umfassend: Das Transformieren der Leukozyten, die aus einer Probe von einem zu behandelnden Individuum erhalten wurden, mit einer Nucleinsäure-Sequenz, die die Expression eines Leukozyt-aktivierenden Moleküls in einer Art steuern, die in Bezug auf die Konzentration eines exogenen Mittels sensitiv ist; und Mischen der transformierten Leukozyten mit einem physiologisch akzeptablen Verdünner.
Verwendung eines Leukozyten gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Eliminierung von unerwünschten Zellen in einem menschlichen Individuum.