DE69837380T2

DE69837380T2 - Biologisches material zur behandlung eines säugetieres durch transfer eines für einen antikörper kodierendes gen und eine pharmazeutische zusammensetzung die diese enthält

Info

Publication number: DE69837380T2
Application number: DE69837380T
Authority: DE
Inventors: Marc Piechaczyk; Danièle NOEL
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-01-20
Filing date: 1998-01-16
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2018-01-17
Also published as: FR2758569B1; ATE357520T1; DK0966532T3; ES2285755T3; FR2758569A1; EP0966532A1; PT966532E; DE69837380D1; WO1998031808A1; EP0966532B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentherapie und besteht darin, in die Zellen eines Individuums mindestens ein für ein therapeutisches Protein kodierendes Gen zu transferieren. Insbesondere betrifft die Erfindung den Transfer von Nukleinsäuresequenzen in Zellen, die nicht natürlich Antikörper produzieren, die für therapeutische Antikörper insgesamt oder teilweise oder Derivate derselben kodierend sind, wobei eine Proteinkomponente an der therapeutischen Wirkung beteiligt ist, so dass die von diesen Nukleinsäuresequenzen genetisch modifizierten und in ein Individuum implantierten Zellen im Blutkreislauf des besagten Probanden eine therapeutisch wirksame Menge dieses Antikörpers produzieren und sekretieren.
Die Gentherapie besteht in der Korrektur des Defekts eines Gens durch Einführung in die Zellen, in denen der Defekt des besagten Gens eine Krankheit verursacht, einer DNA-Sequenz, die die genetische Information trägt, die es erlaubt, den Defekt zu korrigieren. Die Perspektiven zur Anwendung der Gentherapie auf dem Gebiet von genetisch bedingten Krankheiten sind zahlreich, wobei beispielsweise Korrekturen von Thalassämien, der Drepanozytose, Defekte des Leberstoffwechsels, der Mukoviszidose, von Myopathien usw. zu nennen wären (W. F. Anderson, 256, 808, 1992; R. C. Mulligan, Science, 260, 926, 1993; D. Miller, Nature, 357, 455, 1992; R. Morgan und W. F. Anderson, Ann. Rev. Biochem., 62, 191, 1993; B. Dodet, Biofutur, Mai 1992).
Mit der Gentherapie können allerdings auch Krankheiten bekämpft werden, die nicht ausschließlich auf einen Gendefekt zurückzuführen sind, wie zum Beispiel Krebserkrankungen oder Virusinfektionen, indem in die Zellen des betroffenen Organs oder Gewebes ein für ein Protein oder eine therapeutische RNA kodierendes Gen eingeschleust wird. Derartige therapeutische Substanzen sind zum Beispiel Cytokine, intrazelluläre Antikörper, Varianten viraler Proteine, Antisense-RNAs, Ribozyme usw.
Die Techniken zur Einschleusung der genetischen Information in Zellen sind in der Literatur beschrieben. Jedoch können zwei hauptsächliche Methoden ins Auge gefasst werden.
Die erste Methode besteht darin, die die genetische Information tragende DNA-Sequenz direkt in vivo in die Zellen der Organe oder Gewebe einzuschleusen, die Ziel der Therapie sind, oder in die Zellen von Organen oder Geweben, die für die Produktion der therapeutischen Substanz zuständig sind, entweder in die Nähe des Ortes der Produktion, oder auf systemische Art und Weise.
Die zweite Methode, die auf der Zelltherapie beruht und als ex vivo bezeichnet wird, besteht darin, einem Individuum Zellen zu entnehmen, diese Zellen in vivo zu modifizieren, indem man dort die DNA-Sequenz mit der genetischen Information einschleust, die man transferieren möchte, um dann die derart modifizierten Zellen in den Organismus des Individuums zurückzuschleusen. Diese therapeutische Strategie ist zum Beispiel in dem amerikanischen Patent Nr. 5 399 346 beschrieben.
Die die genetische Information tragenden DNA-Sequenzen, die man in die Zellen einschleusen möchte, sind funktional mit DNA-Sequenzen verbunden, die ihre in vivo-Expression erlauben und können sich in verschiedenen Formen darstellen:

– Bei einem direkten Gentransfer in vivo gemäß der ersten hier oben ins Auge gefassten Methode können sie verwendet werden: • in freier Form, das heißt, in Form nackter DNA transferiert, wie ein Plasmid oder ein Restriktionsfragment, vor allen durch in vivo-Injektion in die Zellen, wie in der internationalen Patentanmeldung beschrieben, die unter der Nummer WO 90 11 092 veröffentlicht ist, • in komplexierter Form oder mit anderen Molekülen verbunden, die ihren Eintritt in die eukaryotischen Zellen unterstützen, wie Lipofectin, Transfectace, Transfectam, Polyethylenimin usw., • in einen viralen Vektor inkorporiert, der direkt in vivo in die Zellen des Ziel-Organs oder des Gewebes durch Infektion eingeschleust wird.
– Bei einem Gentransfer gemäß der zweiten zuvor ins Auge gefassten Methode, ex vivo genannt, wird die DNA-Sequenz in vitro in die Zellen integriert, die danach in den Organismus des Individuums eingeschleust werden; hier kann es sich dann zum Beispiel um hämatopoetische Zellen, T-Lymphozyten, Hepatozyten usw. handeln. In diesem Fall können die in vitro von der DNA-Sequenz gemäß den oben beschriebenen Techniken für eine direkte in vivo Einschleusung genetisch modifizierten Zellen dem behandelten Individuum entnommen worden sein oder von einem anderen Menschen oder Tier stammen, wie dem Schwein (E. Cozzi und D. J. G. White, Nature Genetics, 1, 964–966, 1995).

Unter den Substanzen, die in der Lage sind, mit einer Krankheit zu interferieren und die man im Organismus des Patienten für eine Gentherapie produzieren möchte, wären bestimmte Antigene oder Antikörper zu nennen.
Die Expression von DNA-Sequenzen, die für Antigen-Proteine kodierend sind, zielt darauf ab, durch die Zellen, die von dieser DNA genetisch modifiziert wurden, die Produktion eines Antigens zu erlauben, das in der Lage ist, das Individuum zu immunisieren. Eine derartige Impfstrategie wurde zum Beispiel bei verschiedenen Erkrankungen angewendet, unter anderem beim Grippevirus (Tang, D., De Vit, M., und Johnston, Nature, 356, 152–154, 1992).
Die in vitro-Produktion von Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten, wie zum Beispiel chimerschen Antikörpern, durch Gentechnik in den eukaryotischen Zellen wurde ebenfalls bereits beschrieben, zum Beispiel in den Europäischen Patenten, die unter den Nummern 120 694 und 125 023 veröffentlicht wurden. Die Injektion von therapeutischen Antikörpern in Patienten zielt auf die Antigene ab, die in eine Erkrankung impliziert sind, um entweder direkt oder über eine Ereigniskaskade des Stoffwechsels oder des Immunsystems einen der die Krankheit verursachenden Wirkstoffe zu neutralisieren. Als Beispiele derartiger therapeutischer Strategien wären die Behandlung oder die Vorbeugung gegen B-Lymphome zu nennen (Yefenof, E., Picker, L. I., Scheuermann. R. N., Vitetta, E. S., Street, N. E. Tucker, Tl, Uhr, J. W., Current Opinion in Immunology, 5, 740–744, 1993).
Die internationale Patentanmeldung, die unter der Nummer WO 94 29 446 veröffentlicht wurde, beschreibt die intrazelluläre Expression von für Antikörper kodierenden DNA-Sequenzen. Mit dieser Methode wird eine Gentherapie direkt in vivo einer Erkrankung möglich, die auf zelluläre Komponenten zurückgreift, die mit den traditionellen Impfmethoden unzugänglich sind, oder auf der in vivo-Produktion rekombinanter Antigene fußt. Die DNA-Sequenzen, die von den gemäß der in der internationalen Patentanmeldung WO 94 29 446 beschriebenen Methode genetisch modifizierten Zellen exprimiert wurden, sind demzufolge im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Antikörpergen umfassen, das derart modifiziert wurde, dass der Antikörper nicht sekretiert wird.
Die vorliegende Erfindung zielt im Gegensatz dazu darauf ab, die in vivo Expression von Antikörpergenen durch Zellen durchzuführen, die die besagten Antikörper in den Blutkreislauf des Säugers sekretieren, das Träger von Zellen ist, die von dem Antikörpergen genetisch modifiziert wurden.
Diese Erfindung basiert auf der Tatsache, dass verschiedene Zelltypen, die andere sind als diejenigen, die natürlich Antikörper produzieren, in der Lage sind, nach genetischer Modifizierung stabil in vivo Antikörper zu produzieren.
Die Plastozyten als auf die Produktion von Antikörpern spezialisierte Zellen sind nämlich schlechte Kandidaten für die langfristige Produktion von therapeutischen Antikörpern durch Gentransfer; die Plastozyten haben eine eingeschränkte Lebensdauer in der Größenordnung von einigen Tagen, und die Tatsache, dass sie bereits einen anderen Antikörper produzieren, führt zu Verbindungen oder Rekombinationen zwischen den Ketten des natürlich produzierten Antikörpers und dem Antikörper, der durch das transferierte Gen exprimiert wurde, was für die angestrebte therapeutische Wirkung sehr nachteilig ist. Es war demzufolge wichtig zu zeigen, dass nicht auf die natürliche Produktion von Antikörpern spezialisierte Zellen in der Lage waren, einen Gentransfer zu akzeptieren, in vivo einen therapeutischen Antikörper zu exprimieren und gewünschte, vorzugsweise regulierte Niveaus von Antikörpern in den Blutkreislauf eines Säugers zu sekretieren.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, mindestens eine Säugetierzelle eines Zelltyps enthaltend, der keine Antikörper natürlich produziert, wie die Keratinozyten, die Hepatozyten, die Fibroblasten der Haut, die Myoblasten, die Endothelzellen und die hämatopoetischen Stammzellen, genetisch modifiziert in vitro durch eine Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Nukleinsäuresequenz ein Antikörpergen vom Typ IgG und Elemente enthält, die die Expression in vivo des besagten Antikörpergens und die Sekretion in den Blutkreislauf eines Säugers einer therapeutisch wirksamen Menge dieses Antikörpers oder eines Fragments desselben gewährleisten, durch die besagten genetisch modifizierten Zellen.
Unter Nukleinsäuresequenz werden sowohl DNA- als auch DNA-Sequenzen oder Sequenzen verstanden, die modifizierte Nukleotide enthalten.
Die Nukleinsäuresequenz, die in die Zusammensetzung der Erfindung eingeht, umfasst:

– mindestens ein Gen eines therapeutischen Antikörpers, das heißt, ein für einen nativen, nicht modifizierten und damit natürlichen Antikörper kodierendes Gen, oder ein Antikörperfragment, wie die Fragmente Fab oder F(ab)'2 oder die Fragmente ScFv, oder auch ein Antikörperderivat wie einen chimerischen Antikörper oder einen Antikörper oder ein mit einer Effektorsubstanz fusioniertes Antikörperfragment wie zum Beispiel ein Toxin oder ein Hormon,
– mindestens ein Element, welches die Expression des vorangehenden Gens gewährleistet; es handelt sich um Sequenzen, die die Transkription promotern, die vor dem Antikörpergen platziert sind und seine Expression in den Zellen kontrollieren, die nicht natürlich Antikörper produzieren.

Neben dem Antikörpergen und seinem Promoter kann die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz zur Termination der Transkription umfassen, die sich nach dem Antikörpergen befindet und die Sekretion des Produkts des Antikörpergens in den Blutkreislauf des Säugers erlaubt, von dem Zellen durch die Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert wurden.
Der verwendete Promoter kann jeder Promoter sein, der eine effiziente Expression des Gens erlaubt, das er in dem von der Nukleinsäuresequenz genetisch modifizierten Zelltyp kontrolliert. Damit kann er ein viraler Promoter, ein ubigitärer oder spezieller Gewebspromoter oder auch ein synthetischer Promoter sein.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung besteht aus Zellen, die nicht natürlich Antikörper produzieren und sich in einer Form darstellen, die ihre Inkorporierung in den Organismus eines Säugers sowie eventuell ihre vorhergehende Kultur erlauben, wobei die besagten Zellen von mindestens einer Nukleinsäuresequenz genetisch modifiziert sind, die ein Antikörpergen vom Typ IgG enthält und Elemente, die die Expression in vivo des besagten Antikörpergens und die Sekretion in den Blutkreislauf eines Säugers einer therapeutisch wirksamen Menge dieses Antikörpers oder eines Fragments desselben gewährleisten.
Diese Ausführungsform kann in zwei Varianten umgesetzt werden:

– Entweder stammen die Zellen, die nicht natürlich Antikörper produzieren und in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eintreten, von dem zu behandelnden Säuger. In dieser Variante werden die Zellen durch Techniken der Zell- und Molekularbiologie vorbereitet, wie zum Beispiel aus Biopsien, die dem zu behandelnden Patienten entnommen wurden, wobei diese Zellen danach von der Nukleinsäuresequenz, die das Antikörpergen trägt, genetisch modifiziert werden, entweder durch Transfektion oder durch Infektion durch einen Vektor, denen entsprechend, die zuvor im Fall eines Gentransfers direkt in vivo beschrieben wurden. Die aus diesem biologischen Material hergestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen werden dem Patienten, dessen Zellen entnommen wurden, wieder verabreicht.
– Oder die Zellen, die nicht natürlich Antikörper produzieren und in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eintreten, stammen von einem anderen als dem zu behandelnden Menschen oder Tier. Diese Zellen wurden wie in der vorhergehenden Variante vorbereitet. Bei humanen Zellen stammen diese von kompatiblen Spendern; bei nicht humanen Zellen werden Zellen von genetisch modifizierten Tieren verwendet, wie dem Schwein, die für eine Organtransplantation kompatibel gemacht wurden.

Die vorstehenden Zellen präsentieren sich in einer Form, die deren Implantation anhand jedes bekannten Mittels in den Organismus des aufnehmenden Säugers gestattet. Im Übrigen können sie sich in einer Form präsentieren, die es gestattete, sie zuvor zum Transplantieren zu kultivieren. Es kann sich um jeden Träger oder jedes Kulturmedium handeln, das mit ihrer Verabreichung und ihrer Inkorporation beim Empfänger kompatibel ist, wie zum Beispiel eine Matrix des Typs derjenigen, welche die europäische Patentanmeldung beschreibt, die unter der Nummer 378 576 veröffentlicht wurde und Fibroblasten betrifft.
Ausgewählt werden Zellen, die keine Antikörper natürlich produzieren, aber besitzen:

– die Fähigkeit, Proteine in den Blutkreislauf eines Säugers zu sekretieren,
– eine lange Lebensdauer im Organismus des Säugers, vorzugsweise mindestens von mehreren Monaten bis zu mehreren Jahren bis zum ganzen Leben des Patienten.

Insbesondere sind diese Zellen wegen ihrer Fähigkeit ausgewählt, problemlos entnommen, ex vivo genetisch modifiziert und bei einem Säuger implantiert werden zu können.
Von diesen Zelltypen, die die vorstehenden Merkmale aufweisen, fasst die Erfindung spezieller die Keratinozyten, die Hepatozyten, die Fibroblasten der Haut, die Myoblasten, die Endothelzellen und die hämatopoetischen Stammzellen ins Auge.
Es wurde überraschenderweise nachgewiesen (Fenjves, E. S., Smith, J., Zaradic, S., und Teichmann, L. B., Human Gene Therapy, 5, 1241–1248, 1994), dass die Keratinozyten relativ effizient Proteine in Richtung des Organismus produzieren können und nicht nur nach außen. Außerdem ist ihre Kultur problemlos und in Krankenhäusern seit mehreren Jahren Routine, um Hauttransplantate herzustellen.
Die Hepatozyten sind schwieriger zu handhaben als die Keratinozyten. Allerdings wurde nachgewiesen (Grossmann, M., Raper, S. E., Kozarsky, K., Stein, E. A., Engelhart, J. F., Müller, D., Lupien, P. J., Wilson, J. M., Nature Genetics, 6, 335–341, 1994; Ferry, N., Duplessis, O., Houssin, D., Danos, O., Heard, J-M., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 8377–8381, 1991), dass die Hepatozyten von rekombinanten Retrovieren sowohl ex vivo als auch in vivo infiziert werden können.
Die Kultur und die retrovirale Transduktion von Fibroblasten der Haut sind problemlos (Moullier, P., Maréchal, V., Danos, O., Heard, J-M., Transplantation, 56, 427–432, 1993). Die Handhabung der Organoide ist komfortabel (Moulier et al., Nature Genetics, 4, Juni 1993, 154–159). Die Fibroblasten weisen den Vorteil auf, einem Individuum durch eine einfache chirurgische Operation problemlos entnommen werden zu können. Außerdem sind Gentherapieprotokolle zur Korrektur lysosomaler Defizite bei Kindern in Vorbereitung.
Die Myoblasten, die nicht differenzierte Muskelzellen sind, können ebenfalls gereinigt werden und werden wahrscheinlich ohne genetische Modifizierung im Rahmen der Behandlung bestimmter degenerativer Krankheiten verwendet (Yao, S-N., Smith, K. J. und Kurachi, K., Gene Therapy, 1, 99–107, 1994).
Die genetische Modifizierung von Endothelzellen wurde bereits durchgeführt, um therapeutische Proteine herzustellen, zum Beispiel in der internationalen Patentanmeldung PTC, die unter der Nummer WO 90 06997 veröffentlicht wurde. Die Endothelzellen, die die Wand der Blutgefäße bilden, sind damit besonders für die Umsetzung des biologischen Materials der Erfindung geeignet, deren Aufgabe darin besteht, die Sekretion der Antikörper durch genetisch modifizierte Zellen in den Blutkreislauf eines Säugers zu veranlassen.
Es können weitere Zelltypen ins Auge gefasst werden, wie hämatopoetische Stammzellen, sofern diese die weiter oben definierten Merkmale erfüllen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung findet ihre Anwendung in der Zubereitung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Behandlung oder Vorbeugung vor Krebsrezidiven und Virusinfektionen oder -expansionen bestimmt sind, vor allem von AIDS.
In der Bevölkerung des Westens erkrankt zirka jede vierte Person an Krebs, und die heute zur Verfügung stehenden Therapien sind nur für jeden zweiten Patienten wirklich zufriedenstellend.
Die Menschheit wird in immer größerem Ausmaß von schweren Viruskrankheiten befallen, wobei selbstverständlich insbesondere an das HIV-Virus gedacht wird, für welches man bis heute über keine wirksame Therapie verfügt, um der Infektion vorzubeugen oder sie zu behandeln.
Das biologische Material der Erfindung ist deswegen bemerkenswert, da es erlaubt, eine neue Methode zur Therapie dieser sehr schweren Krankheiten ins Auge zu fassen.
Bei Krebs erlaubt es nämlich dem Organismus, langfristig über spezielle Antikörper der Tumorzellen zu verfügen, die cytocid wirken oder die Zellruhe hervorrufen. Dieses Ziel wird durch Verwendung von Nukleinsäuresequenzen erreicht, die ein Gen tragen, das für Antikörper kodierend ist, die gegen ein spezielles Antigen von Tumorzellen gerichtet sind.
Bei Virusinfektionen erlaubt es das erfindungsgemäße biologische Material dem Organismus, langfristig ein Basis-Antikörperniveau aufrecht zu erhalten, das entweder neutralisierend für die Viren oder cytocid für die infizierten Zellen ist. Dieses Ziel wird durch die Verwendung von DNA-Sequenzen erreicht, die für Antikörper kodierend sind, die gegen ein spezielles Antigen des für die besagte Infektion verantwortlichen Virus oder gegen ein spezielles Antigen der von dem besagten Virus infizierten Zellen gerichtet sind.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem Träger- oder Zusatzstoffe enthalten, die klassischerweise verwendet werden. Die Zelldosen, die in diese pharmazeutischen Zusammensetzung eingehen, sind im Hinblick auf die umgesetzte Nukleinsäuresequenz und ihrer Präsentationsform an die verwendete Art der Verabreichung und an die entsprechende Erkrankung angepasst, um die Produktion und die Sekretion einer therapeutisch wirksamen Menge des Antikörpers in den Blutkreislauf des behandelten Individuums zu erlauben.
Die Zellen stellen ein biologisches Material dar, das insbesondere für die Zubereitung von pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignet ist, die für eine ex vivo Zelltherapie eines Individuums gedacht sind.
Die vorstehenden humanen Zellen, sofern sie nicht von dem Patienten stammen, bei dem sie implantiert werden, oder die Tierzellen werden selbstverständlich vor ihrer Implantation mit allen physikalischen oder genetischen Mitteln behandelt, die dem Fachmann bekannt sind, um vor dem Immunsystem des Patienten, der sie aufnimmt, geschützt zu sein.
Die Erfindung hat weiterhin die Verwendung der vorstehenden pharmazeutischen Zusammensetzung für die Zubereitung eines Medikaments, das zur Behandlung von Krebserkrankungen oder Virusinfektionen bestimmt ist, zum Gegenstand.
Neben den vorstehenden Merkmalen weist die Erfindung andere Merkmale auf, die im Laufe der nun folgenden Beschreibung zu Tage treten werden und die sich auf experimentelle Beispiele zur Durchführung und Umsetzung der vorliegenden Erfindung beziehen, wobei es sich von selbst versteht, dass diese Beispiele den Geltungsbereich der Ansprüche nicht beschränken.
Anhand der nachfolgend beschriebenen Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass:

– in vitro die bei dem Patienten entnehmbaren, ex vivo genetisch modifizierbaren und reimplantierbaren Zellen, die nicht natürlich Antikörper produzieren, in der Lage sind, rekombinante Antikörper zu sekretieren, wobei die Eigenschaften des ursprünglichen Antikörpers beibehalten bleiben,
– mindestens ein vorstehender Zelltyp in der Lage ist, in vivo rekombinante Antikörper zu sekretieren, wobei die Eigenschaften des ursprünglichen Antikörpers beibehalten bleiben,
– das erfindungsgemäße biologische Material im modifizierten Organismus keine Immunantwort induziert, die den rekombinanten Antikörper neutralisiert.

Definition des rekombinanten Antikörpers
Der rekombinante Modell-Antikörper, der für die Transferexperimente von Genen von Antikörpern verwendet wurde, über die nachfolgend berichtet wird, ist ein monoklonaler Maus-Antikörper humanen Anti-Thyreoglobulins (Tg10) (Piechaczyk et al., Hybridoma, Band 4, 4, (1985), 361–367). Seine molekulare Klonierung und die funktionale Charakterisierung der komplementären DNAs seiner schweren Kette und seiner leichten Kette wurde wie folgt durchgeführt.
Das Thyreoglobulin ist ein jodiertes Glycoprotein mit einem hohen Molekulargewicht, das an der Synthese, der Lagerung und der Sekretion der Schilddrüsenhormone T3 und T4 beteiligt ist (Marriq, C., C. Arnaud, M. Rolland und S. Lissitzky. 1980. Eur. J. Biochem. 111:3347). Ein monoklonaler Maus-Antikörper, hier nachfolgend mit Tg10 bezeichnet, der gegen eine Antigenregion (Region II) gerichtet ist, die von natürlichen Autoantikörpern bei Patienten, die unter der Grave-Krankheit, der Hashimoto-Schilddrüsenentzündung und Schilddrüsenkarzinomen leiden, regelmäßig erkannt wird, wurde von den Mitarbeitern des Labors CNRS UMR 9921 der Pharmazeutischen Fakultät Montpellier, Avenue Charles Flahaut, 34060, Montpellier Cedex 01, Frankreich (Piechaczyk et al., Hybridoma, Band 4, 4, (1985), 361–367) hergestellt. Die komplementären DNAs der leichten (Kappa) und schweren (IgGI) Ketten des Antikörpers Tg10 wurden im Vektor pSPORT1 (Gibco/BRL) mit entsprechenden Gentechniken geklont (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Die Nukleotidsequenzen der variablen Abschnitte der schweren und leichten Ketten, die jeweils Antikörperketten spezifizieren, wurden bestimmt und sind jeweils auf den 1 und 2 in der Anlage dargestellt. Die Klonierung und Sequenzierung der cDNA des Antikörpers Tg10 wurde im oben genannten Labor durchgeführt.
Für ihre funktionale Charakterisierung wurden die DNAs der leichten Kette und der schweren Kette des Antikörpers Tg10 im retroviralen Vektor pLXPXSN geklont (Morgan, R. A., L. Couture, O. Elroy-Stein, J. Ragheb, B. Moss und W. F. Anderson. 1992. Nucl. Acids Res 20:1299), entweder an der einen und der anderen Seite der Sequenz IRES des endogenen Poliovirus zu diesem Vektor, um die Vektoren PM120 zu bilden, oder individuell vor der Sequenz IRES, um die Vektoren PM117 und PM124 zu bilden, wie auf der 3 in der Anlage dargestellt. Die Affenzellen COS-7 (ATCC CRL 1651) wurden danach mit der Kalziumphosphattechnik entweder durch PM130 allein oder durch die Kombination PM117 + PM124 transfektiert. Das Vorhandensein reaktiver Antikörper gegen das humane Thyreoglobulin in den Kulturüberständen wurde mit der ELISA-Technik getestet (Piechaczyk et al., Habridoma, Band 4, 4, (1985), 361–367). Außerdem wurden die kinetischen Konstanten der Verbindung und des Zerfalls des rekombinanten Antikörpers Tg10, produziert von den Zellen COS-7 mit dem Thyreoglobulin, ausgehend von den Kulturüberständen durch plasmonische Oberflächenresonanz (Fagerstam, L. G. und R. Karlsson. 1993. Biosensor techniques. In Immunochemistry. V. Oss und M. van Regenmortel, eds. M Dekker Inc. S. 949–970) gemäß der von der Firma Pharmaci Biosensor entwickelten Biacore-Technik bestimmt.
Die Werte dieser Konstanten sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Überraschenderweise zeigt die Tabelle 1, dass die schwere Kette, die allen aus PM124 synthetisiert wurde, von den Zellen COS-7 sekretiert wird und das humane Thyreoglobulin in bezug zum vollständigen Antikörper mit einer nur 10 Mal geringeren Affinität erkennt.
Retroviren produzierende Linien
Die meisten primären Zellen reagieren extrem sensibel auf klassische Transfektionsmethoden. Weiterhin ist die Lebensdauer und damit die Expression der transfektierten DNA in den meisten transfektierten Zellen im Allgemeinen sehr kurz.
Um eine wirksame Infektion verschiedener Zelltypen und eine langfristige Expression des Antikörpers Tg10 in den genetisch modifizierten Zellen zu erlauben, wurde eine rekombinante Retroviren produzierende Zelllinie begründet, die die DNAc des Antikörpers Tg10 transportiert und exprimiert.
Die Zellen zur amphortopen retroviralen Verpackung PA 317 (Miller, D. und Buttimore, 1986, Molec. Cell Biol. 6, 2895–2902) wurden mit der Technik der Kalziumphosphatausfällung durch den retroviralen Vektor PM130 transfektiert. Es wurden mehrere stabile produzierende Klone ausgebildet. Die Linie PA130.10 wurde für spätere Infektionsversuche verwendet. Ihr Virustiter, getestet auf der NIH 3T3 indizierende Linie (Miller, D. und Buttimore, 1986, Molec. Cell. Biol. 6, 2895–2902), betrug 10⁴ cfu/ml.
in vitro Versuche
Die von der Linie PA130.10 produzierten Retroviren wurden verwendet, um verschiedene ausgebildete Zelllinien, die für verschiedene Zelltypen repräsentativ sind, die bei der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, zu infizieren:

– Linie NIH3T3 muriner Fibroblasten,
– Linie A431 humaner Keratinozyten,
– Linie HepG2 humaner Hepatozyten,
– Linie C2C12 von Myoblasten.

Für jeden Typ retroviraler Transduktion wurden verschiedene Zellklone abgeleitet, und der im Kulturüberstand produzierte Antikörper Tg10 wurde mit ELISA getestet. Die ermittelten Ergebnisse wurden in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst:
Tabelle 2
Außerdem wurde die Produktion im Fall der Myoblasten C2C12, in vitro in Myotuben differenziert, konserviert.
Es erwies sich, dass die thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften der von diesen verschiedenen Zelltypen produzierten Antikörper, bestimmt durch plasmonische Oberflächenresonanz gemäß der BIAcore-Technologie (Pharmacia Biosensor), mit denen des Ausgangs-Antikörpers Tg10 identisch waren.
Die retroviralen Vektoren wurden in einem zweiten Schritt verwendet, um primäre Fibroblasten von Mäusehaut (retrovirale Infektion) und humane Hepatozyten (Transfektion) zu infizieren. Die Antikörperproduktionen betrugen jeweils:

– 10 bis 20 ng/10⁵ Zellen/3 Tage, und
– 1 bis 10 ng/10⁵ Zellen/4 Tage.

Außerdem waren die Merkmale der produzierten Antikörper dieselben wie die der Ausgangs-Antikörper.
in vivo Versuch
Genetisch modifizierte Zellen C2C12, die die Fähigkeit behalten haben, sich in Myotuben zu differenzieren, wurden durch Injektion in die Vorderbeine 4 syngenischer Mäuse C3H in der Größenordnung von 10⁷ Zellen pro Bein implantiert.
Bei 3 der 4 Mäuse wurde die Produktion rekombinanter Antikörper, die die thermodynamischen Eigenschaften und die Eigenschaften der Wiedererkennung des Antigens des Ausgangs-Antikörpers beibehalten hatten, zwei Monate lang beobachtet. Die produzierte Antikörpermenge erhöhte sich regelmäßig vom Basisniveau auf eine Produktion von zirka 100 ng/ml Serum.
Fehlen der den rekombinanten Antikörper neutralisierenden Immunantwort
Eine der wesentlichen Aufgaben der Erfindung ist, die Produktion eines rekombinanten, vorzugsweise therapeutischen Antikörpers, durch genetisch modifizierte Säugerzellen systemisch zu veranlassen.
Ein mögliches Risiko dieser Methode ist das Auftreten einer Immunantwort von Seiten des modifizierten Organismus, was zur Neutralisierung des rekombinanten Antikörpers führen kann.
Dieses Hindernis konnte durch die hier oben vorgestellten experimentellen Ergebnisse ausgeschlossen werden.
2 × 10⁷ primäre myogene Zellen, die den monoklonalen Antikörper Tg10 nach retroviraler Transduktion stabil exprimieren, wurden auf Ebene des tibialis anterior von Mäusen C3H implantiert. Das Serum der Mäuse wurde mehrere Monate lang in Intervallen von einer Woche entnommen. Die sekretierte Antikörpermenge Tg10 wurde anhand der ELISA-Methode getestet. Parallel dazu wurde die Menge antiidiotypischer Antikörper durch ELISA bestimmt.
In einer Serie von 5 Mäusen belief sich die Sekretion von Antikörpern Tg10 zwischen 100 und 300 ng/ml Serum über 4 Monate. Unter diesen Bedingungen konnte keine anti-idiotypische Antwort festgestellt werden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, mindestens eine Säugetierzelle eines Zelltyps enthaltend, der keine Antikörper natürlich produziert, wie die Keratinozyten, die Hepatozyten, die Fibroblasten der Haut, die Myoblasten, die Endothelzellen und die hämatopoetischen Stammzellen, genetisch modifiziert in vitro durch eine Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Nukleinsäuresequenz ein Antikörpergen vom Typ IqG und Elemente enthält, die die Expression in vivo des besagten Antikörpergens und die Sekretion in den Blutkreislauf eines Säugetiers einer therapeutisch wirksamen Menge dieses Antikörpers oder eines Fragments desselben gewährleisten, durch die besagten genetisch modifizierten Zellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, die keine Antikörper natürlich produzieren, entweder aus dem zu behandelnden Säugetier oder aus einem anderen Säugetier als dem zu behandelnden Säugetier hervorgehen, das eine Behandlung absolviert hat, um kompatibel zu werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, die keine Antikörper natürlich produzieren, aus denen ausgewählt sind, welche besitzen: – die Fähigkeit zur Sekretion von Proteinen in den Blutkreislauf eines Säugetiers, – eine lange Lebensdauer im Organismus eines Säugetiers von mindestens mehreren Monaten bis mehreren Jahren bis zum gesamten Leben des Patienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikörpergen ein für einen nativen Antikörper kodierendes Gen ist, ein Fragment oder ein Derivat dieses Antikörpers wie ein chimerischer Antikörper.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der besagten Antikörper, das Fragment oder das Antikörperderivat gegen ein spezielles Antigen von Tumorzellen gerichtet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einen pharmazeutisch akzeptablen Überträger umfassend.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Zubereitung eines Medikaments, das zur Behandlung von Krebserkrankungen oder Virusinfektionen bestimmt ist.