DE69635161T2

DE69635161T2 - Rekombinante hetero-multimerische proteine von dem alpha-beta c4 bp typ

Info

Publication number: DE69635161T2
Application number: DE69635161T
Authority: DE
Inventors: David Klatzmann; Jacques Cohen
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Universite de Reims Champagne Ardenne URCA
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Universite de Reims Champagne Ardenne URCA
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2016-07-19
Also published as: US7074411B1; ATE304054T1; CA2227030A1; FR2736916B1; WO1997004109A1; EP0842282A1; DE69635161D1; US20070015258A1; EP0842282B1; JPH11510687A; US7504483B2; FR2736916A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft hetero-multimere Fusionsproteine der Art C4BP, Zusammensetzungen, die diese enthalten sowie deren Herstellungsverfahren. Genauer betrifft die Erfindung hetero-multimere Fusionsproteine, die aus der Assoziation von α- und β-Monomeren des Proteins C4BP oder Fragmenten desselben stammen, wobei diese Monomere mit Polypeptiden fusioniert sind, die von Proteinen mit funktioneller Aktivität stammen, welche Liganden- oder Rezeptoreigenschaften aufweisen.
Die Nummern in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis am Ende des Textes.
Das "C4BP-binding protein" (C4BP), welches zuvor als Protein bezeichnet wurde, das reich an Prolin ist, ist sowohl in dem Koagulationssystem (1) als auch in dem Komplementsystem (2, 3) ein wichtiges Protein. Die häufigste Form von C4BP ist aus 7 identischen α-Ketten von 75 Kd und einer β-Kette von 45 Kd zusammengesetzt. Die cDNA-Nucleotid-Sequenz und die Proteinsequenz der α-Kette wurden bestimmt (4). Eine vollständige Beschreibung des menschlichen C4BP, dessen Isolierung und Kennzeichnung wurden in (2) beschrieben; eine Aktualisierung der Kenntnisse über dieses Molekül wurde in (5) zusammengefasst.
Die Existenz der beiden α- und β-Ketten war bis 1990 unbekannt, erst in 1990 hat A. Hillarp zum ersten Mal die Existenz einer neuen Untereinheit, als β-Kette bezeichnet, in dem multimeren Protein bewiesen, und welche die Bindungs-Bindungsstelle mit dem Protein S (6, 7) enthält.
In der Patentanmeldung BIOGEN WO 91/11461 werden multimere Proteine der Art C4BP beschrieben, die nur aus den α-Monomeren bestehen, in welchen der N-terminale Teil durch ein Fragment des Proteins CD4 substituiert wurde.
Jedoch wird für die in dieser Schrift beschriebenen Konstruktionen nur die α-Kette verwendet, die β-Kette war zu dieser Zeit unbekannt. Der Nachteil dieser Konstruktionen ist es, dass es sehr schwierig ist, den physischen Zustand des synthetischen Moleküls zu kontrollieren, das heißt, einerseits die Anzahl der Monomere, die sich assoziieren, und andererseits, wenn gewünscht ist, im Innern des Multimers zwei unterschiedliche funktionelle Teile zu assoziieren, die Anteile dieser funktionellen Elemente zu kontrollieren.
Therapeutische Mittel mit einer Funktion auf Ebene des Immunsystems, zellulär oder humoral, oder Immuninterventionsmittel, wurden in zahlreichen Richtungen entwickelt; die Anwendungsgebiete von therapeutischen Immuninterventionen von Antikörpern, insbesondere monoklonale Antikörper, bleiben jedoch bis heute bescheiden aufgrund der schlechten Beherrschung von Phänomenen, die nach ihrer Zellbindung unerwartet auftreten. Tatsächlich ist es bis heute nicht möglich, diese Antikörper zu verwenden, selbst humanisiert, außer zum Zwecken der zellulären Destruktion. Die Entwicklung bispezifischer Antikörper wurde gleichermaßen vorgesehen, und einige dieser weisen einen Teil auf, der geeignet ist, ein Antigen zu binden, und der andere Teil hat die Eigenschaft eines Liganden für einen Rezeptor, was es ermöglicht, eine Wegermittlung zu einem Zellsystem (8) durchzuführen. Jedoch ermöglichen es diese Systeme nicht, mehrere Liganden in einem gleichen Komplex zu assoziieren, was in bestimmten Fällen für die Auslösung einer Immunreaktion notwendig erscheint.
Ein anderes multimerisierendes System beruht auf dem Fc von IgM vor; es weist mehrere Nachteile auf: der Hauptnachteil ist es, molekulare Spezies mit unterschiedlichen Größen herzustellen, welche Sulfhydrylreste offerieren, die in der Lage sind, mit den plasmatischen Molekülen oder den Zellflächen zu reagieren. Des weiteren können die Funktionen des Fc-Fragments der Bindung mit dem Zellrezeptor und die Aktivierung des Komplements nicht wünschenswert sein.
Ein rekombinantes hetero-multimeres Molekül kann im Gegensatz dazu ermöglichen, mehrere Antikörperfunktionen zu assoziieren, oder mehrere Moleküle von Enzymen oder mehrere Antigene oder Fragmente oder Mischungen dieser, wodurch ein multivalenter Tracer mit einem besseren Amplifikationspotenzial des erkannten Signals im Vergleich zu einem Fusionsprotein, welches einen einzelnen Antikörper oder einen bispezifischen Antikörper und ein enzymatisches oder antigenisches Molekül assoziiert, hergestellt wird.
Dieser Ansatz kann es ermöglichen, außer der Opsonierung durch Auslösen von zellulärer Immunität die Verwendung vorzusehen, die durch humorale Immunität durch Aktivierung des Komplements hervorgerufen wird.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es folglich, hetero-multimere lösliche rekombinante Molekül-Chimäre zu entwickeln, welche unterschiedliche Funktionen in einem gleichen Molekül assoziieren, aus einer Perspektive einer Immunintervention bei einer humanen Dysimmunpathologie. Diese Moleküle ermöglichen es, in die physiopathologischen Mechanismen unterschiedlicher Erkrankungen einzugreifen, insbesondere in den Bereichen, die sich beziehen auf:

• die Erkrankung des Transports und der Eliminierung von Immunkomplexen durch die Erythrocyten, und insbesondere bei Lupus erythematodes disseminatus oder HIV-Infektionen,
• das Einfangen von Antigenen, welches durch die Fc-Rezeptoren auf der Zellenoberfläche der Monozyten-Makrophagen-Familie vermittelt wird;
• die Modulation durch Moleküle mit löslicher CD16-Aktivität;
• die Prävention von erythrocytärer anti-Rh(D)-Alloimmunisierung
• die Inhibition der Zellpenetration des HIV-Virus mittels löslicher Formen von CD4, von Antikörpern, die gegen die Bestandteile des Virus und/oder der Moleküle mit enzymatischen Funktionen gerichtet sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes multimeres Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens umfasst:

a) ein Fusionsmolekül A polypeptidischer Natur, das aus einem C-terminalen Fragment der α-Kette von C4BP, gelegen zwischen den Aminosäuren 549 und 124, und einem Polypeptidfragment, das heterolog zur α-Kette ist, gebildet ist,
b) ein Fusionsmolekül B polypeptidischer Natur, das aus einem C-terminalen Fragment der β-Kette von C4BP, gelegen zwischen den Aminosäuren 235 und 120, und einem Polypeptidfragment, das heterolog zur β-Kette ist, gebildet ist.

Die Aminosäuren 549 oder 235 weisen jeweils die C-terminalen Enden der Fusionsmoleküle auf, wobei die heterologen Fragmente durch ihr C-terminales Ende jeweils mit den Resten der α- und β-Kette fusioniert sind, wobei die Moleküle in a) und in b) miteinander durch ihren C-terminalen Teil assoziiert sind, um das multimere Protein zu bilden.
Vorzugsweise ist ein rekombinantes multimeres Protein gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das C-terminale Fragment der α-Kette zwischen den Aminosäuren 549 und 493 liegt, und dadurch, dass das C-terminale Fragment der β-Kette zwischen den Aminosäuren 235 und 176 liegt. Die Reassoziation der Fusionsmoleküle wird realisiert durch die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen an Position 498 und 510 des C-terminalen Endes der α-Kette und den Cysteinen an Position 199 und 185 des C-terminalen Endes der β-Kette.
Jede Chimäre zwischen den α- und β-Ketten, die gegebenenfalls ein Cystein der α-Kette und ein Cystein der β-Kette in dem Fusionsmolekül A oder B oder in beiden assoziiert, liegt gleichermaßen im Schutzumfang von multimeren Proteinkonstruktionen gemäß der Erfindung.
Insbesondere kann die Möglichkeit, den Abstand zwischen den beiden Cysteinen zu modifizieren, ermöglichen, die Anzahl der Monomere zu modifizieren, die das Multimer bildet.
Zu Darstellungszwecken kann eine Steigerung der Distanz zwischen den Cysteinen zu einer Steigerung der Anzahl an Monomeren führen, die in das Multimer eingehen; im Gegensatz dazu führt eine Minderung dieser Distanz zu einer Minderung dieser Anzahl. In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, diese Distanz derart zu modifizieren, dass die kontrollierte Reassoziation der beiden Arten von Ketten, die Träger eines Ligands oder eines Rezeptors sind, bezüglich Ihrer Anzahl und ihrer Proportion modifiziert werden.
In der vorliegenden Erfindung wurde ein multimerisierendes System offenbart, welches es ermöglicht, hepta- und octamere Formulierungen mittels des C-terminalen Endes der elementaren Ketten des Moleküls C4BP zu erhalten. Die Multimerisierung der Moleküle, deren C-terminales Ende durch den C-terminalen Teil von C4BP α oder C4BP β ersetzt wurde, liefert eine octamere Form.
Auf jeden Fall muss das Fragment, das von der β-Kette des C4BP stammt, ohne Bindungsstellen für das Protein S sein, wobei sich diese Stellen auf Ebene der beiden SCR des proximalen Teils des N-terminalen Endes der β-Kette befinden.
Folglich ist ein rekombinantes multimeres Protein gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Anzahl Monomere α/β zwischen 7/1 und 5/3 liegt und bevorzugt 7/1 ist, wenn die Fragmente der C-terminalen Teile in den oben genannten Fragmenten A und B eine homogene Herkunft haben.
Idealerweise ist das rekombinante multimere Molekül ein Protein, welches nur humane Komponenten assoziiert, wodurch somit jede xenogene Immunisierung vermieden wird, und das Komplement ohne spezifische Funktionen, die in diesem Sinn absichtlich hinzugefügt wurden, nicht aktiviert wird. Ein solches Molekül darf nicht mit Zellrezeptoren oder plasmatischen Molekülen interagieren und kann so eine bessere Aktivität für das chimäre Molekül durch seine Multivalenz sowie eine längere Lebensdauer sicherstellen.
Ein multimeres Protein gemäß der vorliegenden Erfindung weist Eigenschaften bezüglich einer Immunintervention auf, insbesondere eine Fähigkeit, die Aktivität des Komplements anzupassen, um eine künstliche Opsonierung zu erzeugen. Aufgrund des heterofunktionellen Charakters, der diesem Protein durch die Hinzufügung N-terminaler Heterologe zugewiesen werden kann, wird dieses Ergebnis erhalten.
Zu diesem Zweck ist ein rekombinantes Protein gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die heterologen Fragmente in A und in B von spezifischen Liganden des Immunsystems stammen, besonders von Oberflächenproteinen von Lymphozyten vom Typ CD, von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, von Antigenen oder Antigenfragmenten; die heterologen Fragmente in A und B können gemäß der Anwendung, die dem rekombinanten Protein gegeben werden soll, aus den folgenden Polypeptiden mit Ligandenaktivität, ohne Anspruch auf Vollständigkeit, gewählt werden:

i) Fragmenten, die von Lymphozytenproteinen stammen, das sind CD4, CD8, CD16, CD35 (oder CR1),
ii) Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die eine anti-erythrocytäre Spezifität, und insbesondere anti-Rh(D), aufweisen,
iii) Antigenen, insbesondere Impfantigenen, wie preS2 des Hepatitis B-Virus,
iv) einem Enzym zu therapeutischen Zwecken oder genauer dem Fragment dieses Enzyms, welches der aktiven Bindungsstelle entspricht, die mit dem C-terminalen Teil der alpha-Kette fusioniert werden kann, um das Fragment A zu bilden, wobei das Fragment B dann aus jeder Art Polypeptid wie unter i) bis iii) genannt gebildet werden kann.

Noch genauer können die Kombinationen von A und B, die besonders vorteilhaft sind, die Immunintervention der Erfindung zu verwenden, multimere Proteine sein, in denen die polypeptidischen Fusionsfragmente enthalten:

v) – in A das CD4 oder ein Derivat von CD4, und
– in B den scFv eines anti-Rh(D) oder anderer Antikörper, insbesondere neutralisierender Antikörper, oder Ziel-Antigene.

Eine weitere vorteilhafte Konstruktion ist ein multimeres Protein, in welchem die polypeptidischen Fusionsfragmente enthalten:

– in A ein Antigen, besonders ein Impfantigen, oder ein therapeutisches Enzym oder CD35 (oder CR1) oder einen Antikörper, oder jedes Fragment davon, das die Ligandeneigenschaft des gesamten Enzyms besitzt;
– in B einen Antikörper oder ein Fragment davon, das sein Paratop bewahrt hat.

Andere vorteilhafte rekombinante multimere Proteine sind jene, in welchem die polypeptidischen Fusionsfragmente enthalten:

– in A ein Impfimmunogen, und
– in B ein CD4 oder ein abgeleitetes Molekül, vorausgesetzt, dass es die Ligandeneigenschaft des gesamten Moleküls bewahrt hat.

Des weiteren sieht die vorliegende Erfindung eukaryotische oder prokaryotische Zellen vor, die mit einem oder mehreren Plasmiden transfiziert wurden, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält bzw. enthalten und mindestens für ein polypeptidisches Fusionsmolekül A und ein polypeptidisches Fusionsmolekül B codiert bzw. codieren.
Die unterschiedlichen Zell-Linien, die verwendet werden können, um von Plasmiden transfiziert zu werden, sind vorzugsweise eukaryotische Zellen, die in der Lage sind, die posttranslationelle Glykosylierung durchzuführen; als Beispiele können Hefen oder tierische Zell-Linien, wie Zellen fibroblastischer Natur wie BHK- oder CHO-Zellen, oder auch Lymphozyten-Linien, wie immortalisierte Lymphozyten, genannt werden. Gemäß unterschiedlichen Ausführungen der vorliegenden Erfindung können die Zellen:

– mit zwei unterschiedlichen Plasmiden cotransfiziert sein, oder
– mit einem Plasmid transfiziert sein, das für ein erstes Polypeptid codiert, dann mit dem zweiten Plasmid über-transfiziert sein, welches für das zweite Polypeptid codiert, oder
– aus der Fusion der beiden Zellen stammen, von denen eine mit dem Plasmid transfiziert wurde, dass für das erste Polypeptid codiert, und die andere mit einem Plasmid transfiziert wurde, dass für das zweite Polypeptid codiert.

Die Zellfusionen werden auf herkömmliche Weise durchgeführt, entweder durch Wirkung von PEG (Polyethylenglykol) oder durch Wirkung des Epstein-Barr-Virus, oder auf jede andere herkömmliche Weise, um zwei unterschiedliche eukaryotische Zellen zu fusionieren.
Genauer können die Zellen durch das erste Plasmid, das am 12. Juli 1995 bei der C. N. C. M. unter der Nr. I-1610 hinterlegt wurde, und durch das zweite Plasmid, welches bei der C. N. C. M. am 12. Juli 1995 unter der Nummer I-1611 hinterlegt wurde, transfiziert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen ein Herstellungsverfahren für ein multimeres Protein gemäß der Erfindung. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die folgenden Schritte aufweist:

– Transfektion der Ziel-Zelllinien mit mindestens einem Plasmid, das eine heterologe Sequenz enthält, die für die Kette A bzw. B wie oben beschrieben codiert,
– Expression und Isolierung der heterologen Ketten A oder B,
– Einführung der Polypeptide in ein oxidierendes Medium in vorbestimmten Verhältnissen;
– Isolierung der Multimere.

Vorzugsweise ist das Herstellungsverfahren dadurch gekennzeichnet, dass die transfizierten Linien entweder:

– mit zwei Plasmiden cotransfiziert wurden, die Träger von DNA-Sequenzen sind, die jeweils für die Polypeptide A bzw. B codieren, oder
– mit einem Plasmid transfiziert wurden, das für ein erstes Polypeptid codiert, anschließend mit einem zweiten Plasmid über-transfiziert wurden, das für das zweite Polypeptid codiert, oder
– aus der Fusion der beiden Zellen stammen, von denen die eine mit dem Plasmid transfiziert wurde, welches für das erste Polypeptid codiert, und die andere mit einem Plasmid transfiziert wurde, das für das zweite Polypeptid codiert.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines rekombinanten Proteins wie zuvor beschrieben bei der Herstellung eines Medikaments, und genauer eines Medikaments, das bestimmt ist für

– die Prävention der fötalen-mütterlichen Alloimmunisierung, oder
– für die Therapie oder die Prophylaxe von viralen, bakteriellen oder parasitären Infektionen,
– für die Therapie von Autoimmunerkrankungen und insbesondere Lupus erythematodes disseminatus, oder Alloimmunerkrankungen.

Auf allgemeine Weise bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines rekombinanten Proteins, wie zuvor beschrieben, für die Herstellung eines Medikaments, welches gemäß der den Liganden oder den Rezeptoren zugeordneten Funktionalität eine Immunintervention ermöglicht, insbesondere bei der Opsonierung oder der nicht-Opsonierung von Zielzellen durch Aktivierung, Modulation oder Inhibition des Komplements.
Dem Durchschnittsfachmann ist bekannt, je weiter die Entdeckung von Funktionalitäten bestimmter Proteine oder bestimmter Liganden oder Rezeptoren fortschreitet, ein rekombinantes multimeres Protein gemäß der Erfindung zu konstruieren, welches für die gewünschte Wirkung am besten angepasst ist.
Vorteilhafterweise ist die Verwendung des multimeren Proteins gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie eine ausreichende Aktivierung des Komplements ermöglicht, um die Opsonierung von Zellen hervorzurufen, deren Antigen- oder Epitop-Stellen nicht natürlicherweise in der Lage sind, eine solche Aktivierung auszulösen.
Gleichermaßen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Wirkstoff ein rekombinantes multimeres Protein wie oben beschrieben aufweist. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann eine Immuntherapie oder eine Immunprävention unterschiedlicher Krankheiten ermöglichen, insbesondere jener, die mit viralen, bakteriellen Infektionen, mit Autoimmun- oder Alloimmunkrankheiten verbunden sind.
Ein rekombinantes Protein gemäß der Erfindung ist gleichermaßen für einen diagnostischen Test verwendbar, der den Einsatz von mindestens zwei unterschiedlichen Liganden oder Rezeptoren erfordert.
Dass ein Multimer mit sehr hohem Molekulargewicht erzeugt werden kann, wurde in einem Modell von multi-CR1 (ungef. 1,5 Millionen Dalton) überprüft. Dieses Molekül ist funktionell und inhibiert die Aktivierung des Komplements in einem von dem Komplement abhängigen Lyse-Modell, von mit Antikörpern bedeckten Erythrocyten, bei Konzentrationen, die geringer sind als jene, die für das lösliche monomere CR1 erforderlich sind.
Dass Heterochimäre erzeugt werden können, welche unterschiedliche Funktionen assoziieren, wurde anschließend bewiesen, indem einserseits der anti-Rh(D)-Antikörper, und genauer der variable Teil Fv dieses Antikörpers, und noch genauer der Einzelkettenteil dieses variablen Teils, genannt scFv, verwendet wurde, im vorliegenden Fall mit dem Molekül CD35 oder (CR1) assoziiert, das geeignet ist, die Aktivität des Komplements zu inhibieren oder modulieren; das andere verwendete System ist ein hetero-multimeres System der Art CD4/Antigen.
Die folgenden Beispiele haben keinen begrenzenden, sondern nur darstellenden Charakter und dienen einzig dazu, zu beweisen, dass die Konstrukte dieser hetero-multimeren Rekombinanten zu Immuninterventionszwecken erzeugt werden können; die Zeichnungsfiguren, welche die Beispiele darstellen, haben die folgenden Bedeutungen:
1 stellt einen Expressionsvektor dar, welcher aus einem Plasmid gebildet ist, das die Sequenz enthält, die für das CD4 codiert und sT4CD4-C4BP genannt wird;
2 stellt einen Plasmidvektor dar, welcher die Sequenz enthält, die für das multimere CD16 codiert.
3 stellt einen Plasmidvektor dar, welcher die Sequenz enthält, die für das multimere CR1 codiert;
4 stellt einen anderen Plasmidvektor dar, pCDM8, welcher für das gleiche multimere CR1 codiert;
5 stellt einen Plasmidvektor dar, welcher die Sequenz enthält, die für das scFv des multimeren anti-Rh(D)-Antikörpers codiert;
6 stellt einen anderen Plasmidvektor dar, pST4, welcher die gleiche Sequenz enthält, die für das scFv des anti-Rh(D)-Antikörpers codiert;
7 stellt einen dritten Plasmidvektor dar, welcher diese gleiche Sequenz enthält, die für das scFv des anti-Rh(D)-Antikörpers codiert;
8 stellt einen Plasmidvektor der Art pKC3B dar, welcher die Sequenz enthält, die für das multimere CR1 codiert.
In allen diesen Zeichnungsfiguren sind die Restriktionsenzyme, welche das Einsetzen der heterologen Sequenz ermöglichen, durch ihre herkömmliche Nomenklatur angegeben.
9 stellt das Ergebnis dar, das mit dem multimeren scFv auf der Agglutination von roten Blutkörperchen, welche das Rhesus-Antigen aufweisen oder nicht aufweisen, erhalten wurde. Das Rohr in A stellt die Positivkontrolle dar, in welchem die roten Blutkörperchen O Rh+ mit einem nativen monoklonalen anti-R(h) Antikörper agglutiniert sind; das Rohr B stellt die Negativkontrolle dar, in welchem die roten Blutkörperchen O Rh– nicht mit dem scFv anti-R(h) von Multimeren agglutiniert sind; Rohr C stellt den Versuch dar, in welchem die roten Blutkörperchen O Rh+ und scFv anti-Rh+ agglutiniert sind; das Rohr D ist eine weitere negativer Bezug, in welchem die roten Blutkörperchen O Rh– in ein Kulturmedium ohne Antikörper gebracht wurden.
10 stellt das Profil dar, welches in Durchflußcytometrie nach Erythrocytenbindung eines hetero-Chimärs anti-Rh(D)-CR1 erhalten wurde.
Fünf Spuren sind dargestellt, in denen:

– die erste Spur nicht-papainierte rote Blutkörperchen O Rh+ mit einer CR1-Dichte von 180 Bindungsstellen aufweist;
– die zweite Spur nicht-papainierte rote Blutkörperchen O Rh+ mit einer CR1-Dichte von 550 Bindungsstellen darstellt;
– die dritte Spur papinierte rote Blutkörperchen O Rh+ darstellt, die ihre CR1-Dichte von 180 Stellen verloren haben; diese Erythrocyten, die in CR1 mittels der Heterochimäre scFv anti-Rh+/CR1 rekonstruiert sind, drücken die supraphysiologische Dichte von 1200 Bindungsstellen CR1 pro Erythrocyt aus;
– die Spuren 4 und 5 stellen Kontrollen dar, in welchen für die Spur 4 papainierte rote Blutkörperchen O Rh+, und für die Spur 5 papainierte rote Blutkörperchen O Rh– mit der Heterochimäre scFv anti-Rh(D)/CR1 behandelt worden sind.

I – Konstruktion von Ketten CR1-C4BP
Der Vorteil, das CR1 in einer multimeren Konstruktion gemäß der Erfindung zu verwenden, resultiert aus Arbeiten der Erfinder über die physiologische Entwicklung von CR1 bei dem normalen Subjekt. Sie konnten so die Parameter eines physiologischen Katabolismus von erythrocytärem CR1 und seinen Beziehungen mit dem genetischen Polymorphismus der Dichte von erythrocytärem CR1 bestimmen. Sie konnten gleichermaßen den Katabolismus von erythrocytärem CR1 bei den Lupus-Patienten, d.h., Patienten die an Lupus erythematodes disseminatus leiden, präzisieren. Die Verteilung unter den Lupus-Patienten und den normalen Subjekten unterschiedlicher Genotypen des Polymorphismus bezüglich Länge und Anzahl an Bindungsstellen C3b/C4b von CR1 wurde gleichermaßen untersucht. Rekombinante CR1-Moleküle, welche es ermöglichen, die Dichte an erythrocytärem CR1 zu modifizieren, um deren physiologischen Zustand wieder herzustellen, oder um mit "supraphysiologischen" Dichten an CR1 "ausgestattete" Erythrocyten herzustellen, wurden dann erzeugt. Das Potential von löslichem CR1 wurde in unterschiedlichen Modellen dargelegt, insbesondere experimenteller myokardialer Ischämie und dem Arthus-Phänomen. Ein lösliches multimeres CR1-Molekül wurde hergestellt, und seine entzündungshemmende Fähigkeit, seine plasmatische Lebensdauer sowie sein Distributionsraum wurden beim Tier untersucht. Eine chemische Kopplung der reduzierten Monomere an die Erythrocyten erfolgte über ihre freien SH-Gruppen. Die Erythrocyten wurden so mit supraphysiologischen Dichten von in funktioneller Weise präsentiertem CH1 ausgestattet, und ihre Bindungsfähigkeit an künstliche Immunkomplexe Hbs-Antigen/antiHBs-Antikörper, opsoniert mit C3b, wurde dann untersucht.
Die mit einem anti-Rh(D) erhaltenen Ergebnisse sind im nachfolgenden Beispiel I dargestellt.
Die für die Herstellung der Transfizierung C4BP-CR1 verwendeten Konstrukte sind in den 3, 4 und 8 in den Plasmiden pMAMneo, pCDM8 und pKC3b dargestellt.
a) Konstruktion von pMAMneo CR1-C4BP:
Die komplementäre DNA, die für das CR1 codiert, wurde an den Stellen Xho I und Not I in das Plasmid pCDM8 eingesetzt (dank der Hilfsbereitschaft von T. J. Bartow, D. T. Fearon und W. Wong, John Hopkins Hospital, Baltimore, U.S.A.).
Die Sequenz, die für den extra-membranären Teil des CR1 codiert, wird durch Verdauung dieses Plasmids durch die Restriktionsenzyme Xho I und Bal I extrahiert. Der C-terminale Teil des C4BP wird durch die Starter 5'-GAGACCCCCGAAGGCTGTGA-3' und 5'-CTCGAGTTATAGTTCTTTATCCCAAGTGG-3' amplifiziert, wobei dieser zweite Starter ein Stopkodon und eine Restriktionsstelle Xho I enthält.
Die Sequenzen, die für den C-terminalen Teil des C4BP und für den extramembranären Teil des CR1 codieren, werden in pMAM Neo (clontech, Palo Alto, USA) an der Stelle Xho I (3) CR1-C4BP durch Verdau mit Xho I eingesetzt und in das Plasmid pCDM8 (Invitrogen, San Diego, USA) eingesetzt.
b) Konstruktion pCDM8 CR1-C4BP:
Die Sequenz, die für das Fusionsprotein CR1-C4BP codiert, wurde aus pMAM Neo CR1-C4BP durch Verdau mit Xho I extrahiert und in das Plasmid pCDM8 (Invitrogen, San Diego, USA) (4) eingesetzt.
c) Konstruktion pKC3b CR1-C4BP:
Die Sequenz, die für das Fusionsprotein CR1-C4BP codiert, wurde aus pMAM Neo CR1-C4BP durch Verdau mit Xho I extrahiert und in das Plasmid pKC3b (8) eingesetzt.
II – Konstruktion des rekombinanten Multimers:
Ein C-terminales Fragment der α-Kette von C4BP wurde durch PCR aus genomischer DNA übertragen. Es liegt in einem einzelnen Exon vor. Die minimale Größe liegt jenseits des zweiten Cysteins, vom C-terminalen Ende aus betrachtet, die optimale Größe liegt einige Aminosäuren weiter, wobei ein Spacer von 5 bis 10 Aminosäuren hergestellt wird, d.h., insgesamt 58 Aminosäuren.
Die gewählte maximale Größe ist 6 SCR, um die Bindungsstelle C3b-C4b zu vermeiden. Dieses maximale Fragment ist aus einer cDNa von mRNA des C4BP synthetisiert, da es mehrere Exons aufweist. Das optimale Fragment des C-terminalen Teils des C4BP wird erneut durch PCR mittels Startern, die an ihren Enden mit Seitenarmen ausgestattet sind, welche die geeigneten Stellen für enzymatische Restriktion zum Einbau in einem gegebenen Vektor aufweisen, welcher bereits das Gen des Proteins aufweist, das zu multimerisieren gewünscht wird. Eine enzymatische Stelle nahe dem C-terminalen Teil dieses Proteins, oder in seinem extramembranären Teil angeordnet, wird gewählt, welche das Einsetzen am 3' des multimerisierenden Fragments ermöglicht.
Das 3'-Ende des multimerisierenden Fragments wird entweder an einer Stelle des Vektors oder an einer Stelle gebunden, die jenseits des Gens des Proteins von Interesse angeordnet ist. Der Teil des Gens des Proteins von Interesse, angeordnet an 3' des multimerisierenden Fragments, wird auf jeden Fall nicht mehr übertragen, da das multimerisierende Fragment ein Stopkodon aufweist.
Es ist folglich so möglich, sehr leicht einen Expressionsvektor zu modifizieren, welcher das Gen eines gegebenen Proteins enthält, indem einfach das Fragment ohne weitere Modifizierung eingesetzt wird.
Die Vektoren pCDM8, ST4, pMAMneo wurden für die unterschiedlichen Anwendungsbeispiele des multimeren Systems gemäß der Erfindung verwendet.
Dem Durchschnittsfachmann ist in der Lage, zur Zeit existierende Vektoren oder solche, die kurz davor stehen, entwickelt zu werden, zu finden, welche geeignet sind, die beste Wirksamkeit aufzuweisen, um das Fusionsprotein in die Zellen zu transfizieren und dieses exprimieren zu lassen.
Anwendungsbeispiel Nr. 1:
Prävention von anti-Rh(D)-Alloimmunisierung
Im Rahmen einer Prävention von anti-Rh(D)-Alloimmunisierung werden heteromultimere Moleküle, welche erythrocytäre Funktionen und CR1 assoziieren, hergestellt. Sie ermöglichen eine leichte Bindung von CR1 an Erythrocyten, wobei genau kontrollierbare CR1-Dichten sichergestellt werden.
Das zur Herstellung des scFv anti-Rh(D) verwendete Antikörper-Molekül wurde in dem Labor von Philippe ROUGER am Institut National de Transfusion Sanguine (INTS) (9) produziert und sequenziert.
Konstruktion der Vektoren, welche die Sequenz aufweisen, die für scFv anti-Rh(D) und den terminalen Teil der α-Kette des C4BP codiert.
Zunächst wurde eine Epitopstelle eines anti-Rhesus-Antikörpers an einer Struktur der Art scFv (für single chain Fv) für eine Expression in E. Coli durch Transfizierung mit einem Phagenvektor reduziert.
Die Konstruktionen der Art scFv sind Fragmente von Antikörpern, welche den variablen Teil des Antikörpers aufweisen und nur ein einzelne Kette enthalten. Diese Technik wurde von G. WINTER (10) beschrieben. Die für dieses scFv codierende Sequenz wurde anschließend nach Hinzufügen des multimerisierenden Systems in einen Expressionsvektor transfiziert.
Weiter oben wurde die Konstruktion von Expressionsvektoren beschrieben, die Träger der Sequenz sind, die für das scFv des anti-Rh(D)-Antikörpers codieren, und die in den 6 und 7 dargestellt sind.
Der C-terminale Teil des C4BP wurde durch die Starter 5'-GCGGCCGCAGAGACCCCCGAAGGCTGTG-3', welches eine Restriktionsstelle Not I enthält, und 5'-CCACTTTGGATAAAGAACTATAA-3', welches eine Restriktionsstelle Xho I enthält, amplifiziert.
Dieses Fragment wurde an der Stelle Not I am 3' des Gens scFv anti-Rh(D) eingesetzt. Diese Sequenz wurde anschließend in das Plasmid pCDM8 eingesetzt und an den Stellen Hind III und Xho I von pKC3b eingesetzt. Diese Konstruktion ist in 5 dargestellt.
5 stellt eine weitere Konstruktion des scFv des anti-Rh(D) C4BP in dem Plasmid pKC 3B dar.
Die Plasmide wurden anschließend verwendet, um die tierischen Zellen, und insbesondere die Zellen CHO DHFR, zu transfizieren.
Die Zellen CHO DHFR (American Type Culture Collection, Rockville, USA) wurden gemäß der Technik mit Calciumphosphat (Calcium phosphate transfection kit, 5 prime 3 prime Inc., Boulder, U.S.A.) transfiziert.
Die Zellen werden im HAM-Medium, welches gering an Hypoxanthin und Thymidin (Biochrom, Vindelle, Frankreich), mit 10% dialysiertem Kalbserum (SVF GIBCO BRL, Paisley, Schottland) und 1% Glutamin (Sigma, St Louis, USA) kultiviert.
Die Funktionalität der rekonstituierten multimeren Proteine, entweder C4BP-scFv oder C4BP-Rh(D)/CR1 wurde untersucht.
Die funktionelle Produktion von multimerem scFv wurde wie erläutert hergestellt (i) durch eine biosynthetische Markierung und eine Immunpräzipitation, gefolgt von einer Analyse durch SPS-PAGE, (ii) durch die Detektion in Durchflußcytometrie von multi-scFv anti-Rh(D), gebunden an den Erythrocyten, (iii) durch den agglutinierenden Charakter bei geringer Ionenstärke auf papainierten Blutkörperchen von multi-scFv anti-Rh(D)-Chimären, (iiii) durch die Analyse von molekulären Interaktionen mittels einer Detektionsvorrichtung für evaneszente Wellen (IASys FISONS), wobei die Bindung an den Erythrocyten der multimeren anti-scFv anti-Rh(D)-Chimäre überprüft werden.
Nachfolgend wurde nachgewiesen, dass Heteromultimere, welche unterschiedliche Funktionen assoziieren, durch die Herstellung einer anti-R(h)esus D/CR1-Chimäre erzeugt werden können. Ihr funktioneller Charakter wurde in Durchflußcytometrie dargestellt.
Die in Durchflußcytometrie erhaltenen Ergebnisse sind in 10 dargestellt. In dieser Zeichnungsfigur ist klar ersichtlich, dass, wenn die Spuren 3 und 5 verglichen werden, in denen jeweils die roten Blutkörperchen Rh+ oder Rh– sind, beobachtet werden kann, dass nur die roten Blutkörperchen, welche das Oberflächen-Antigen aufweisen, agglutiniert sind. Gleichermaßen ist aus der Zeichnungsfigur ersichtlich, dass es nicht die Wirkung des Papains ist, die diese Agglutinierung ermöglicht, da die papainierten Rh+ roten Blutkörperchen nicht durch das CR1 agglutiniert sind.
Es war tatsächlich möglich, eine supraphysiologische Dichte an CR1-Molekülen auf zuvor papainierten und folglich an CR1 verarmten Erythrocyten durch die Bindung auf den Rhesus-D-Molekülen eines gemischten multimeren anti-Rh(D)/CR1-Chimärs zu binden.
Anwendungsbeispiel Nr. 2: extrazelluläre Destruktion von HIV
Wenn die humorale Immunreaktion nicht in der Lage ist, das HIV-Virus auszurotten, ist sie jedoch gegen zahlreiche Infektionserreger wirksam, gegen welche normalerweise von den geimpften Subjekten neutralisierende Antikörper produziert werden. Natürliche Antikörper können einen Schutz gegen zahlreiche bakterielle oder virale Infektionserreger vermitteln, welche andere Gattungen infizieren.
Bestimmte Antigenmotive wurden als Ziele dieser Art von Antikörpern aufgrund ihrer Rolle bei der hochakuten Abstoßung von Xenogen-Transplantaten charakterisiert. Die potentiell ungünstige Rolle der humoralen Immunreaktion und der Aktivierung des Komplements gegenüber der Infektion durch den HIV-Virus wurde bewiesen. Unter bestimmten Umständen kann die Opsonierung von Virionen zu einer Erleichterung der makrophagischen Ingestion oder der lymphocytären Bindung von Virionen mittels Zellrezeptoren für das Komplement oder das Fc-Fragment von IgG führen. Dafür ist der HIV-Virus als umhüllter Virus extrem sensibel gegenüber der lytischen Aktion des Komplements, wenn die Aktivierung des letztgenannten ausreichend ist, um dessen letzte lytische Schritte sowie die Bindung seines Membranattacke-Komplexes zu initiieren. Die xenogenen Retroviren werden durch das normale menschliche Serum äußerst wirksam zerstört aufgrund der Existenz natürlicher Antikörper, mittels einer Aktivierung des Komplements. Dieses Phänomen hat in den 70er Jahren sogar zu der Schlussfolgerung der natürlichen Immunität der menschlichen Gattung gegenüber Retroviren geführt.
Das gewünschte Ziel ist die Umleitung einer lytischen humoralen Immunreaktion zu den HIV-Virionen, wobei das Anhaften an den Virionen durch den Bestandteil CD4 eines rekombinanten heteromultimeren Proteins hergestellt wird. Dafür haben die Erfinder die Tatsache berücksichtigt, dass die sehr große Variabilität des HIV-Virus jedoch durch den konstanten Erhalt, wesentlich für das Virus, einer Bindungskapazität an CD4 für seine Zellpenetration begrenzt wird.
Das Molekül CD4 ist wiederum in der Lage, die Gesamtheit der HIV-Virionen zu binden, im Gegensatz zu zahlreichen neutralisierenden Antikörpern mit einer begrenzten Wirksamkeitsspektrum gegenüber einer kleinen Anzahl von Unterarten. Das lösliche Molekül CD4 inhibiert die Zellinfektion durch HIV. Jedoch machen die für seine Wirkung erforderlichen Konzentrationen, insbesondere für die Neutralisierung von Wildisolaten, seine klinische Verwendung unpraktikabel. Unterschiedliche Versuche wurden gemacht, um seine Halbwertszeit und seine Avidität zu verbessern und/oder eine Fc gamma Effektorfunktion zur Zellbindung oder zur Aktivierung des Komplements durch Konstrukte der Art: CD4/IgG, bi- oder tetravalent, hervorzurufen.
Die Erfinder haben ein multivalentes heptameres CD4-Molekül mittels eines multimerisierenden C4BP-Systems entwickelt, dessen biologische Wirksamkeit in vitro durch Inhibition der Infektion von für das HIV sensiblen Zellen mit herkömmlichen Inhibitionskonzentrationen an löslichem monomerischem CD4 bewiesen wurde.
In dem vorliegenden Beispiel haben die Erfinder, anstatt die Zellpenetration des Virus zu inhibieren, versucht, seine extrazelluläre Zerstörung mittels löslichen Molekülen zu bewirken, die geeignet sind, einerseits auf dem Virion zu binden und andererseits eine Antigen-Effektorfunktion beizubringen, wodurch die Zerstörung des Virus ausgelöst wird durch eine Antikörper-Reaktion, welche von dem präexistenten Komplement bei dem Individuum abhängig ist. Diese Reaktion richtet sich gegen ein Antigen ohne Bezug mit dem HIV, aber gegenüber welchem eine neutralisierende und lytische Wirksamkeit des Immunsystems dennoch getestet wurde.
Anders formuliert haben, da der HIV-Virus die Fähigkeit aufweist, sich zu "maskieren", sich zu "verstecken" oder "Täuschungsmanöver auszuführen" die Erfinder versucht, Ziele anzubringen, die das Immunsystem des Individuums erkennen und wirksam behandeln kann.
Dazu wurden zwei plasmidische Konstruktionen hergestellt, welche jeweils das CD4 oder das Fragment des CD4 tragen, die Träger für die "Liganden"-Fraktion und ein Antigen sind.
a) Konstruktion des Vektors ST4 CD4-C4BP
Die 183 letzten Nukleotiden der Sequenz, die für das C4BP codiert, haben durch PCR auf der genomischen DNA amplifiziert, indem die Starter verwendet wurden: 5'-GAGACCCCCGAAGGCTGTGTGA-3' und 5'ATTTCTAGAGAGTTATAGTTCTTTATCCAAAGTGGA-3', wobei der letztgenannte Starter ein Stopkodon und eine Restriktionsstelle für Xba I aufweist. Das PCR-Fragment wurde an 5' an eine synthetische doppelsträngige Oligonukleotidsequenz gebunden: 5'CCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACAG-3'. Dieses Fragment codiert für das C-terminale Ende des extramembranären Teils von CD4 und hat eine Stelle Ava I an 5'.
Diese Sequenz wurde an den Stellen Ava I und Xba I in das Plasmid sT4 CD4 eingesetzt, welches das Konstrukt enthält, die für das lösliche CD4 codiert, und dieses Konstrukt ist in 1 dargestellt.
b) Konstruktion von Fusionsmolekülen C4BP-Antigene
Zunächst gilt es zu erforschen, welche Parameter die Reaktion des Antikörpers gp 120 der beiden infizierten Subjekte zu einer Aktivierung des Komplements bis zu der Amplifizierungsschleife des CD3 leiten, was eine bei dem Individuum eher günstige Opsonierung beendet, ohne dabei eine so starke Aktivierung der gemeinsamen letzten Schritte mitzubewirken, dass die die Lyse des Virions beendet. Die Rolle der Oberflächenmoleküle zur Inhibition und Aktivierung des Komplements, die das Virion von der Zelloberfläche entfernt hat, ist bewiesen. Das Abstoßen der Partikel der Hülle bei der Bindung von Antikörpern (shedding) ist bei der terminalen Aktivierung des Komplements gleichermaßen ungünstig. Die Aktivierung der gemeinsamen Finalbahn des Komplements erfordert eine kritische Aktivierungsdichte des C3, um die Konvertierung von C5 zu initiieren. Diese wird nicht hergestellt durch die Bindung von IgG an die Epitope von gp 120, die zu weit voneinander entfernt sind.
Das Beibringen eines "Clusters" von Antigenen aufgrund der Konstruktionen gemäß der Erfindung für jede Bindungsstelle auf dem Virion ermöglicht es somit, eine ausreichende lokale Aktivierung des Komplements in Gang zu setzen.
Unterschiedliche Kategorien von Antigenen wurden berücksichtigt: Impfantigene, bakterielle Antigene, gegen welche die menschliche Gattung universell immunisiert ist, xenogene Antigene, die Ziele von natürlichen Antikörpern sind.

– Impfantigene, welche in Form von geklonten Genen existieren, die für ein Protein codieren, das in eukaryotische Zellen exprimierbar ist (Antigen Hbs, Tetanus-Anatoxin ...),
– Bakterielle Antigene, gegenüber welchen eine starke Immunität bei der menschlichen Gattung besteht (Escherichia-Coli, Klebsiella, Shigella-Flagellin oder Salmonellen-Antigen),
– Moleküle, welche Akzeptor-Proteinsequenzen für xenogene Glykosylierungen besitzen, können gleichermaßen vorgesehen werden, nachdem sie von tierischen Zellen produziert wurden, welche starke Glykosyltransferase-Aktivität besitzen, welche ihnen die Glykosylierungsstellen von bekannten natürlichen Antikörpern aufpfropfen, die stark bei der Xenotransplantation reagieren (zum Beispiel alpha-Galactosylgruppe, Hindernis bei xenogenen Transplantationen Schwein-Mensch).

Diese Mini-Antikörper werden als Bindungsmittel für Erythrocyten von Heterochimären verwendet, die diese aufweisen, wobei sie nur eine Valenz der Art C4BP β darstellen, die mit einem multimeren Antigen-Molekül der Art heptameres C4BP α assoziiert ist. Die wirksamsten Antigensysteme werden somit in einem leicht quantifizierbarem Auswahlverfahren bestimmt. Sie werden dann in ein rekombinantes CD4/Antigen-Ziel-Chimär transferiert, dessen unterschiedliche Verhältnisse CD4/Antigen (1CD4/7 Antigene oder nCD4/M Antigene) in einem Inhibitionsmodell einer viralen Infektion in vitro getestet werden.
Die Ziel-Antigene, die am meisten von Interesse sind, wurden in heteromultimere Konstrukte eingesetzt, welche das CD4 aufweisen, und auf ihre Kapazität getestet, die Zerstörung von HIV-Virionen in Anwesenheit von Humanserum und Komplement zu ermöglichen, wobei das restliche Infektionsvermögen in einem Inhibitionstest von Zellinfektion in vitro bewertet wurde.
Materialien und Verfahren
Außer den oben genannten Konstrukten waren die verwendeten Techniken zur Transfizierung und Zellkultur die folgenden:
Transfizierung
Die Zellen CH0-DHFR (American Type Culture Collection, Rockville, USA) wurden gemäß der Calciumphosphat-Technik (Calcium phosphate transfection kit, 5 prime 3 prime Inc., Boulder, U.S.A.) transfiziert.
Zellkultur
Die Zellen wurden im HAM-Medium, welches arm an Hypoxanthin und Thymidin (Biochrom, Vindelle, Frankreich) ist, mit 10% dyalisiertem Kalbserum (SVF GIBCO BRL, Paisley, Schottland) und 1% Glutamin (Sigma, St Louis, USA) kultiviert.
Die mit pMAMNeo transfizierten Zellen wurden wegen ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber Neomycin (G418, 0,7 mikrog/ml) (Sigma) gewählt.
Die Produktion von mCR1 in den mit pMAMneo CR1-C4BP transfizierten Zellen wird durch Dexamethason (0,8 mikrog/ml) induziert.
Die Erfinder haben für ihre Versuche eine Vorrichtung für kontinuierliche Zellkultur mit Hohlfasern für die Herstellung von rekombinanten Proteinen im Maßstab von einigen Milligramm oder mehreren Dutzend Milligramm von rekombinanten Proteinen verwendet. Der Mehrzahl der Versuche konnte ausgehend von Überständen von trockenen oder konzentrierten Zellkulturen durchgeführt werden. Gereinigte Zubereitungen in kleinem Maßstab wurden gleichermaßen hergestellt.
Die Synthese von Oligonukleotiden, die für die Vektorkonstrukte verwendet wurden, wurde durchgeführt, um das C-terminale C4BP Fragment an jedes Konstrukt anzupassen. Gleichermaßen wurden die Nukleotidsequenzen mit einem automatischen Fluoreszenzsequenzierer für die Kontrolle von Konstrukt bestimmt.
Kommentare
Die multimeren Proteine gemäß der Erfindung, ihre Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zu prophylaktischen oder therapeutischen Zwecken oder ihre Verwendung als Diagnose- oder Forschungswerkzeug sind sehr leistungsfähig.
Ihre Verwendung kann ein wirksames Werkzeug für die Analyse von physiologischen Mechanismen in der Immunreaktion sowie zum Verständnis der Physiopathologie von bestimmten Störung des Immunsystems sein.
Solche Moleküle ermöglichen eine hochentwickeltere Immunintervention, was die Möglichkeit eröffnet, zahlreiche physiopathologische Mechanismen in vitro besser zu studieren. In einigen Fällen ermöglicht die Intervention den Weg einer Immunmanipulation in vivo im Rahmen eines therapeutischen Ziels. Es handelt sich somit gleichzeitig um Werkzeuge zur physiopathologischen klinischen Forschung, zur experimentellen Forschung in vitro und um therapeutische Werkzeuge in vivo.
Literaturverzeichnis

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Claims

Rekombinantes multimeres Protein, das eine Immunintervention bei einer humanen Dysimmunpathologie ermöglicht, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens umfasst: a) ein Fusionsmonomer A polypeptidischer Natur, das aus einem C-terminalen Fragment der α-Kette von C4BP, gelegen zwischen den Aminosäuren 124 und 549, das Disulfidbrücken mit der C-terminalen Extremität der β-Kette von C4BP bildet, und aus einem Polypeptidfragment, das heterolog zur α-Kette ist, gebildet ist, b) ein Fusionsmonomer B polypeptidischer Natur, das aus einem C-terminalen Fragment der β-Kette von C4BP, gelegen zwischen den Aminosäuren 120 und 235, das Disulfidbrücken mit der C-terminalen Extremität der α-Kette von C4BP bildet, und aus einem Polypeptidfragment, das heterolog zur β-Kette ist, gebildet ist, wobei die Moleküle in a) und b) in ihrem C-terminalen Teil assoziiert sind, um das multimere Protein zu bilden.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das C-terminale Fragment der α-Kette zwischen den Aminosäuren 493 und 549 liegt, und dass das C-terminale Fragment der β-Kette zwischen den Aminosäuren 176 und 235 liegt.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Anzahl Monomere α/β zwischen 7/1 und 5/3 liegt, und bevorzugt 7/1 beträgt.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologen Fragmente in A und in B von spezifischen Liganden des Immunsystems stammen, besonders von Oberflächenproteinen von Lymphozyten vom Typ CD, von Antikörpern oder Antikörperfragmenten, von Antigenen oder Antigenfragmenten.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Fragmenten, die von Lymphozytenproteinen stammen, um CD4, CD8, CD16, CD35 (oder CR1) handelt.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Antikörperfragmente eine anti-Rh(D)-Spezifität aufweisen.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Antigenen um Impfantigene handelt.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem heterologen Fragment in A um ein therapeutisches Enzym handelt.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologen Polypeptidfragmente enthalten: – in A das CD4 oder ein Derivat von CD4; und – in B den scFv eines Antikörpers, insbesondere einen neutralisierenden Antikörper oder ein anti-Rh(D).
Rekombinantes multimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologen Polypeptidfragmente enthalten: – in A ein Antigen, besonders ein Impfantigen, oder ein therapeutisches Enzym oder CD35 (oder CR1) oder einen Antikörper, oder jedes Fragment davon, das die Ligandeneigenschaften des gesamten Moleküls besitzt, – in B einen Antikörper oder ein Fragment davon, das sein Epitop bewahrt hat.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologen Polypeptidfragmente enthalten: – in A ein Impfimmunogen, und – in B ein CD4 oder ein abgeleitetes Molekül, vorausgesetzt, dass es die Ligandeneigenschaft des gesamten Moleküls bewahrt.
Prokaryotische oder eukaryotische Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem oder mehreren Plasmiden transfiziert wurden, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält bzw. enthalten, welche für mindestens ein polypeptidisches Fusionsmolekül A und ein polypeptidisches Fusionsmolekül B gemäß Anspruch 1 codiert.
Zellen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen entweder – mit zwei verschiedenen Plasmiden cotransfiziert wurden, oder – mit einem ersten Plasmid transfiziert wurden, das für ein erstes Polypeptid codiert, und anschließend mit dem zweiten Plasmid, das für das zweite Polypeptid codiert, über-transfiziert wurden, oder – aus der Fusion der beiden Zellen stammen, von denen eine mit einem Plasmid transfiziert wurde, das für das erste Polypeptid codiert, und die andere mit einem Plasmid transfiziert wurde, das für das zweite Polypeptid codiert.
Zellen gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Plasmid um jenes handelt, das am 12. Juli 1995 bei der C. N. C. M. unter der Nummer I-1610 hinterlegt wurde, und bei dem zweiten Plasmid um jenes handelt, das bei der C. N. C. M. am 12. Juli 1995 unter der Nummer I-1611 hinterlegt wurde.
Verfahren zur Herstellung eines multimeren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die folgenden Schritte aufweist: – Transfektion der Ziel-Zelllinien mit mindestens einem Plasmid, das jeweils eine heterologe Sequenz enthält, die für eine Kette A bzw. B gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 codiert; – Expression und Isolierung der heterologen Ketten A oder B; – Einführung der Polypeptide in ein oxidierendes Medium in vorbestimmten Verhältnissen; – Isolierung der Multimere.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die transfizierten Linien entweder – mit zwei Plasmiden cotransfiziert wurden, die Träger von DNA-Sequenzen sind, die für die Polypeptide A bzw. B codieren, oder – mit einem Plasmid transfiziert wurden, das für ein erstes Polypeptid A codiert, und anschließend mit dem zweiten Plasmid, das für das zweite Polypeptid B codiert, über-transfiziert wurden, oder – aus der Fusion der Zellen stammen, die mit einem Plasmid, das eine DNA-Sequenz trägt, die für das Polypeptid A codiert, bzw. mit einem Plasmid, das eine DNA-Sequenz trägt, die für das Polypeptid B codiert, transfiziert wurden.
Verwendung eines rekombinanten multimeren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments, das zur Prävention der fötalen-mütterlichen Alloimmunisierung bestimmt ist.
Verwendung eines rekombinanten multimeren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments, das zur Therapie oder Prophylaxe von viralen, bakteriellen oder parasitären Infektionen bestimmt ist.
Verwendung eines rekombinanten multimeren Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments, das zur Therapie von Autoimmunerkrankungen und insbesondere Lupus erythematodes disseminatus bestimmt ist.
Rekombinantes multimeres Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung in einem diagnostischen Test, der den Einsatz von mindestens zwei verschiedenen Liganden erfordert.
Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff ein multimeres Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfasst, wobei die pharmazeutische Zubereitung eine Immuntherapie oder eine Immunprävention von Krankheiten ermöglicht, die insbesondere mit viralen, bakteriellen Infektionen oder Autoimmunerkrankungen oder Alloimmunerkrankungen in Verbindung stehen.