DE69837845T3

DE69837845T3 - Osteoprotegerin bindende proteine und deren rezeptoren

Info

Publication number: DE69837845T3
Application number: DE69837845.8T
Authority: DE
Inventors: William Boyle
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2016-06-23
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: EP0975754B1; DK0975754T3; AU9523401A; US20060246064A1; BG103824A; EP0975754B2; HK1022330A1; JP2001526532A; NO325175B1; NO995044D0; AU2008202516A1; JP2008054682A; RO128635A2; ID23855A; ATE363533T1; BG65242B1; IL132304A0; AU779461B2; EA003636B1; PL336311A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die an der Differenzierung von Osteoklasten mitwirken. Insbesondere betrifft die Erfindung Osteoprotegerin-bindende Proteine, für die Proteine kodierende Nukleinsäuren, Expressionsvektoren und Wirtszellen zur Herstellung der Proteine sowie Bindungstests. Es sind auch Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Knochenkrankheiten wie beispielsweise Osteoporose, Knochenverlust aufgrund von Arthritis, Paget'sche Krankheit und Hyperkalziämie, beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch Rezeptoren für Osteoprotegerin-bindende Proteine und Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Knochenkrankheiten unter Verwendung der Rezeptoren.
Hintergrund der Erfindung
Lebendes Knochengewebe zeigt ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der Ablagerung und der Resorption von Knochen. Diese Vorgänge werden primär von zwei Zelltypen vermittelt: Osteoblasten, die Moleküle sekretieren, die die organische Matrix von Knochen umfassen, und Osteoklasten, die die Auflösung der Knochenmatrix und die Löslichmachung von Knochensalzen fördern. Bei jungen Lebewesen mit wachsenden Knochen übersteigt die Geschwindigkeit der Knochenablagerung die Geschwindigkeit der Knochenresorption, während die Geschwindigkeit der Resorption die Ablagerung bei älteren Lebewesen übersteigen kann. In der letzteren Situation führt der zunehmende Abbau von Knochen zu einer verringerten Knochenmasse und -stärke, einem erhöhten Risiko von Knochenbrüchen und einer langsamen oder unvollständigen Reparatur gebrochener Knochen.
Osteoklasten sind große, phagozytische, vielkernige Zellen, die im Knochenmark aus hämatopoetischen Vorläuferzellen gebildet werden. Obwohl das Wachstum und die Bildung reifer funktioneller Osteoklasten nicht gut verstanden sind, nimmt man an, dass Osteoklasten neben der Monozyten-/Makrophagen-Zellinie als Reaktion auf die Exponierung gegenüber verschiedenen wachstumsfördernden Faktoren reifen. Man glaubt, dass die frühe Entwicklung von Knochenmarkvorläuferzellen zu Präosteoklasten durch lösliche Faktoren wie beispielsweise Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Tumornekrosefaktor-β (TNF-β), Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-6 (IL-6) und den Leukämie-inhibierenden Faktor (LIF) vermittelt wird. In Kultur werden Präosteoklasten in Gegenwart von hinzugegebenem Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF) gebildet. Diese Faktoren wirken primär bei den frühen Schritten der Osteoklastenentwicklung. Von der Mitwirkung von Polypeptidfaktoren an den letzten Stadien der Osteoklastenbildung wurde noch nicht ausführlich berichtet. Es wurde jedoch berichtet, dass Parathormon die Bildung und Aktivität von Osteoklasten stimuliert und Calcitonin die gegenteilige Wirkung aufweist, jedoch in einem geringeren Ausmaß.
Kürzlich wurde ein neuer, als Osteoprotegerin (OPG) bezeichneter Polypeptidfaktor beschrieben, der die Bildung von Osteoklasten in vitro und in vivo negativ regulierte (siehe die ebenfalls im Eigentum befindliche und anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/577,788, eingereicht am 22. Dezember 1995, 08/706,945, eingereicht am 3. September 1996 und 08/771,777, eingereicht am 20. Dezember 1996, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind, und die PCT-Anmeldung Nr. WO 96/26271 ). Bei transgenen Mäusen, die das OPG-Polypeptid exprimierten, erhöhte OPG die Knochendichte dramatisch und verringerte das Ausmaß des Knochenverlustes, wenn es an Ratten verabreicht wurde, denen die Gebärmutter entfernt worden war. Eine Analyse der OPG-Aktivität bei der in vitro-Osteoklastenbildung zeigte, dass OPG das Wachstum und die Differenzierung von Monozyten/Makrophagen-Vorläufern nicht stört, aber mit größerer Wahrscheinlichkeit die Differenzierung von Osteoklasten aus Monozyten/Makrophagen-Vorläufern blockiert. Somit scheint OPG eine Spezifität hinsichtlich des Regulierens des Ausmaßes der Osteoklastenbildung aufzuweisen.
OPG umfasst zwei Polypeptiddomänen, die verschiedene strukturelle und funktionelle Eigenschaften aufweisen. Die N-terminale Domäne, die etwa die Reste 22–194 des Volllängen-Polypeptides (das N-terminale Methionin wird als Rest 1 bezeichnet) umspannt, zeigt durch die Konservierung von Cystein-reichen Domänen, die für Mitglieder der TNFR-Familie charakteristisch sind, eine Homologie zu anderen Mitgliedern der Tumornekrosefaktor-Rezeptor(TNFR)-Familie, insbesondere zu TNFR-2. Die C-terminale Domäne umspannt die Reste 194–401 und weist keine signifikante Homologie zu irgendwelchen bekannten Sequenzen auf. Anders als eine Anzahl anderer Mitglieder der TNFR-Familie scheint OPG ausschließlich ein sekretiertes Protein zu sein, und es scheint nicht in einer membranassoziierten Form synthetisiert zu werden.
Auf der Grundlage seiner Aktivität als negativer Regulator der Osteoklastenbildung wurde postuliert, dass OPG an einen Polypeptidfaktor binden könnte, der an der Osteoklastendifferenzierung mitwirkt, und auf diese Weise einen oder mehr als einen der letzten Schritte blockiert, die zur Bildung eines reifen Osteoklasten führen.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, Polypeptide zu identifizieren, die mit OPG wechselwirken. Diese Polypeptide können bei der Osteoklastenreifung eine Rolle spielen und können bei der Behandlung von Knochenkrankheiten nützlich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein neues Mitglied der Tumornekrosefaktor-Familie wurde in einer murinen cDNA-Bibliothek identifiziert, die in COS-Zellen exprimiert und unter Verwendung eines rekombinanten OPG-Fc-Fusionsproteins als Affinitätssonde gescreent wurde. Das neue Polypeptid ist ein OPG-bindendes Transmembranprotein, von dem vorausgesagt wird, dass es eine Länge von 316 Aminosäuren umfasst und eine N-terminale cytoplasmatische Domäne, eine Transmembrandomäne und eine C-terminale extrazelluläre Domäne aufweist. OPG-bindende Proteine der Erfindung können membranassoziiert sein oder in einer löslichen Form vorliegen.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines Antikörpers als Modulator des Osteoprotegerinbindungsproteins (OPGbp) zur Zubereitung eines Medikaments für die Verhinderung oder Behandlung einer Knochenkrankheit bereit, wobei es sich bei dem Antikörper um einen Antagonisten handelt, der an OPGbp der 4A–F (SEQ ID NO: 4) bindet, und die OPGbp-vermittelte Osteoklastogenese und/oder Knochenresorption hemmt. Offenbart sind Nukleinsäuren, die für ein OPG-bindendes Protein kodieren, Vektoren und Wirtszellen, die das Polypeptide exprimieren und ein Verfahren zum Herstellen des rekombinanten OPG-bindenden Proteins. Ebenfalls sind Antikörper oder Fragmente davon, die spezifisch an das OPG-bindende Protein binden, offenbart.
OPG-bindende Proteine können für Tests verwendet werden, um die OPG-Konzentrationen in biologischen Proben zu quantifizieren, um Zellen und Gewebe zu identifizieren, die OPG-bindendes Protein zeigen, und um neue Mitglieder der OPG-Familie oder der Familie der OPG-bindenden Proteine zu identifizieren. Es werden auch Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereitgestellt, die mit OPG-bindendem Protein wechselwirken. Solche Verbindungen umfassen Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und organische Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht und können entweder als Agonisten oder Antagonisten der Aktivität des OPG-bindenden Proteins wirken.
OPG-bindende Proteine wirken an der Differenzierung von Osteoklasten mit, und der Umfang der Osteoklastenaktivität moduliert wiederum die Knochenresorption. Agonisten und Antagonisten von OPG-bindenden Proteinen modulieren die Osteoklastenbildung und Knochenresorption und können verwendet werden, um Knochenkrankheiten zu behandeln, die durch Veränderungen der Knochenresorption gekennzeichnet sind, wie beispielsweise Osteoporose, Hyperkalziämie, Knochenverlust aufgrund von Arthritis, Metastase, Krankheiten mit Immobilisierung oder Parodontose, Paget'sche Krankheit, Osteopetrosis, prosthetische Lockerung und dergleichen. Von dieser Erfindung werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen umfasst, die OPG-bindende Proteine und Agonisten und Antagonisten von OPG-bindenden Proteinen umfassen.
Rezeptoren für OPG-bindende Proteine wurden auch in einer murinen cDNA-Bibliothek identifiziert, die aus Knochenmarkzellen hergestellt war, welche an ein fluoreszenzmarkiertes OPG-bindendes Protein binden. Die Rezeptoren können verwendet werden, um Agonisten und Antagonisten der Wechselwirkungen des OPG-bindenden Proteins mit seinem Rezeptor zu identifizieren, die verwendet werden können, um Knochenkrankheiten zu behandeln.
Beschreibung der Figuren
1A–F. Struktur und Sequenz der Insertion 32D-F3, die für das OPG-bindende Protein kodiert. Die vorausgesagte Transmembrandomäne und die vorausgesagten Stellen für mit Asparagin verbundenen Kohlenhydratketten sind unterstrichen.
2A–C. Expression von OPG-bindendem Protein in mit pcDNA/32D-F3 transfizierten COS-7-Zellen. Die Zellen wurden mit pcDNA/32D-F3-DNA lipofektiert, anschließend hinsichtlich der Bindung entweder an ein Konjugat aus Ziegen-anti-Mensch-IgG1 und alkalischer Phosphatase (sekundärer alleine), menschlichem OPG[22–201]-Fc plus sekundärer (OPG-Fc) oder ein chimäres Fusionsprotein aus ATAR-extrazellulärer Domän und Fc (sATAR-Fc) getestet. ATAR ist ein neues Mitglied der TNFR-Superfamilie, und das sATAR-Fc-Fusionsprotein dient sowohl bezüglich der Bindung der menschlichen IgG1-Fc-Domäne als auch von generischem TNFR-verwandten Protein als Kontrolle, und es bindet an Oberflächenmoleküle von 32D-Zellen.
3. Expression von OPG-bindendem Protein in menschlichen Geweben. Northern Blot-Analyse von mRNA aus menschlichem Gewebe (Clontech) unter Verwendung einer radiomarkierten Hybridisierungssonde, die von 32D-F3 abgeleitet ist. Das relative Molekulargewicht ist links in Kilobasenpaaren (kb) angegeben. Die Spitze des Pfeils rechts zeigt die Wanderung eines ungefähr 2,5 kb großen Transkriptes, das in Lymphknoten-mRNA nachgewiesen wurde. Eine sehr schwache Bande der gleichen Masse wird auch in fötaler Leber nachgewiesen.
4A–F. Struktur und Sequenz der pcDNA/hu OPGbp 1.1-Insertion, die für das menschliche OPG-bindende Protein kodiert. Die vorausgesagte Transmembrandomäne und die vorausgesagte Stelle für mit Asparagin verbundenen Kohlenhydratketten sind unterstrichen.
5. In vitro-Stimulierung der Osteoklastenentwicklung aus Knochenmarkmakrophagen und ST2-Zell-Cokulturen, die mit rekombinantem murinem OPG-bindenden Protein [158–316] behandelt waren. Die Kulturen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des murinen OPG-bindenden Proteins behandelt, die von 1,6 bis 500 ng/ml reichten. Nach 8–10 Tagen wurden die Kulturen lysiert, und die TRAP-Aktivität wurde durch den Lösungstest gemessen. Zusätzlich wurden einige Kulturen gleichzeitig mit 1, 10, 100, 500 und 1000 ng/ml des rekombinanten murinen OPG[22–401]-Fc-Proteins behandelt. Das murine OPG-bindende Protein induziert eine dosisabhängige Stimulierung der Osteoklastenbildung, wohingegen OPG[22–401]-Fc die Osteoklastenbildung inhibiert.
6. In vitro-Stimulierung der Osteoklastenentwicklung aus Knochenmarkvorläufern in Gegenwart von M-CSF und murinem OPG-bindendem Protein [158–316]. Das Knochenmark von Mäusen wurde geerntet und in Gegenwart von 250, 500, 1000 und 2000 U/ml M-CSF kultiviert. Verschiedene Konzentrationen des OPG-bindenden Proteins [158–316], die von 1,6 bis 500 ng/ml reichten, wurden zu diesen gleichen Kulturen hinzugegeben. Die Osteoklastenentwicklung wurde durch den TRAP-Lösungstest gemessen.
7A–C. Aus Knochenmarkzellen gewonnene Osteoklasten resorbieren Knochen in vitro in Gegenwart von sowohl M-CSF als auch OPG-bindendem Protein [158–316]. Knochenmarkzellen, die entweder mit M-CSF, OPG-bindendem Protein oder mit beiden Faktoren kombiniert behandelt waren, wurden auf Knochenschnitten in Kulturnäpfen ausplattiert, und es wurde ihnen erlaubt, sich zu reifen Osteoklasten zu entwickeln. Die sich ergebenden Kulturen wurden anschließend mit Toluidinblau (linke Spalte) oder histochemisch gefärbt, um die TRAP-Enzymaktivität (rechte Spalte) nachzuweisen. Bei Kulturen, die beide Faktoren erhielten, wurden reife Osteoklasten gebildet, die fähig waren, Knochen anzugreifen, wie aus der Gegenwart von blau gefärbten Löchern auf der Knochenoberfläche geschlossen wurde. Dies korrelierte mit der Gegenwart von zahlreichen großen, vielkernigen, TRAP-positiven Zellen.
8. Kurve, die die Konzentrationen von ionisiertem Kalzium (iCa) im Vollblut aus Mäusen, denen OPG-bindendes Protein injiziert wurde, 51 Stunden nach der ersten Injektion zeigt und aus Mäusen, die auch eine gleichzeitige OPG-Verabreichung erhielten. OPG-bindendes Protein erhöht die iCa-Konzentrationen erheblich und dosisabhängig. OPG (1 mg/kg/Tag) blockierte die Erhöhung des iCa bei einer Dosis des OPG-bindenden Proteins von 5 ug/Tag vollständig, und es blockierte die Erhöhung bei einer Dosis des OPG-bindenden Proteins von 25 ug/Tag teilweise. (*), verschieden von einer mit einem Vehikel behandelten Kontrolle (p < 0,05). (#), iCa-Konzentration mit OPG-Behandlung erheblich verschieden von der Konzentration bei Mäusen, die diese Dosis des OPG-bindenden Proteins alleine erhielten (p < 0,05).
9A–D. Radiogramme des linken Femurs und der linken Tibia bei Mäusen, die 3,5 Tage lang mit 0, 5, 25 oder 100 μg/Tag des OPG-bindenden Proteins behandelt wurden. Es tritt eine dosisabhängige Erniedrigung der Knochendichte auf, die am deutlichsten in der proximalen Tibiametaphyse dieser Mäuse augenscheinlich ist, und die bei einer Dosis von 100 μg/Tag besonders stark ist.
10A–F. cDNA-Sequenz und Proteinsequenz von murinem ODAR. Es ist die Nukleinsäuresequenz des ~2,1 kb cDNA-Klons gezeigt sowie die Translation des 625 Reste langen offenen Leserahmens, die darüber angezeigt ist. Das hydrophobe Signalpeptid ist unterstrichen, und die hydrophobe Transmembransequenz (Reste 214–234) ist in Fettdruck gehalten. Cysteinreste, die die Cystein-reichen Wiederholungs-Motive in der extrazellulären Domäne umfassen, sind in Fettdruck gehalten.
11A–C. Immunofluoreszenzfärbung der ODAR-Fc-Bindung an mit OPG-bindendem Protein transfizierten Zellen. COS-7-Zellen, die mit einem Expressionsplasmid für OPG-bindendes Protein transfiziert waren, wurden mit menschlichem IgG-Fc (oberstes Feld), ODAR-Fc (mittleres Feld) oder OPG-Fc (unterstes Feld) transfiziert. Ein FITC-markierter Ziegen-anti-Mensch-IgG-Fc-Antikörper wurde als sekundärer Antikörper verwendet. Positive bindende Zellen wurden durch konfokale Mikroskopie untersucht.
12A–H. Wirkungen von ODAR-Fc auf die Erzeugung von Osteoklasten aus Maus-Knochenmark in vitro. Murine Knochenmarkkulturen wurden wie in Beispiel 8 etabliert und gegenüber OPG-bindendem Protein (5 ng/ml) und CSF-1 (30 ng/ml) exponiert. Verschiedene Konzentrationen von ODAR-Fc, die von 1500 ng/ml bis 65 ng/ml reichten, wurden hinzugegeben. Die Osteoklastenbildung wurde durch TRAP-Zytochemie und durch den TRAP-Lösungstest nach 5 Tagen in Kultur bewertet.
13. Knochenmineraliendichte bei Mäusen nach viertägiger Behandlung mit ODAR-Fc bei verschiedenen Dosen. Die Mäuse erhielten ODAR-Fc durch tägliche subkutane Injektion in einem phosphatgepufferten Salinevehikel. Die Mineraliendichte wurde aus in 70% ETOH fixierten Knochen an der proximalen Tibiametaphyse der Mäuse durch periphere quantitative computergestützte Tomographie (pQCT) (XCT-960M, Norland Medical Systems, Ft Atkinson, WI) bestimmt. Zwei 0,5 mm Knochenquerschnitte, 1,5 mm und 2,0 mm vom proximalen Ende der Tibia wurden untersucht (XMICE 5.2, Stratec, Deutschland), um die Gesamtknochenmineraliendichte in der Metaphyse zu bestimmen. Eine Weichgewebetrennschwelle von 1500 wurde verwendet, um die Begrenzung des Metaphysenknochens zu definieren. ODAR-Fc rief in einer dosisabhängigen Weise eine erhebliche Erhöhung der Knochenmineraliendichte in der proximalen Tibiametaphyse hervor. Gruppe n = 4.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, das als ein OPG-bindendes Protein bezeichnet wird, spezifisch an OPG bindet und an der Osteoklastendifferenzierung beteiligt ist. Ein cDNA-Klon, der für die murine Form des Polypeptides kodiert, wurde in einer aus der myelomonozytischen Maus-Zellinie 32D hergestellten und in COS-Zellen transfizierten Bibliothek identifiziert. Die Transfektanden wurden auf ihre Fähigkeit gescreent, an ein OPG[22–201]-Fc-Fusionspolypeptid zu binden (Beispiel 1). Die Nukleinsäuresequenz zeigte, dass das OPG-bindende Protein ein neues Mitglied der TNF-Familie ist und am nächsten mit AGP-1 verwandt ist, einem Polypeptid, das früher in der ebenfalls im Eigentum befindlichen und ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/660,562, eingereicht am 7. Juni 1996, beschrieben ist. (Ein mit AGP-1 identisches und als TRAIL bezeichnetes Polypeptid ist in Wiley et al. Immunity 3, 673–682 (1995) beschrieben). Von dem OPG-bindenden Protein wird vorausgesagt, dass es ein Typ II-Transmembranprotein ist, das eine cytoplasmatische Domäne am N-Terminus, eine Transmembrandomäne und eine C-terminale extrazelluläre Domäne aufweist (1A–F). Die N-terminale cytoplasmatische Domäne umspannt etwa die Reste 1–48, die Transmembrandomäne umspannt etwa die Reste 49–69, und die extrazelluläre Domäne umspannt etwa die Reste 70–316, wie in den 1A–F gezeigt ist (SEQ ID NO: 2). Das membranassoziierte Protein bindet spezifisch an OPG (2A–C). Somit teilen sich das OPG-bindende Protein und OPG zahlreiche Merkmale eines Rezeptor-Ligandenpaares, obwohl es möglich ist, dass andere natürlich vorkommende Rezeptoren für das OPG-bindende Protein existieren.
Ein DNA-Klon, der für menschliches OPG-bindendes Protein kodiert, wurde aus einer Lymphknoten-cDNA-Bibliothek isoliert. Die menschliche Sequenz (4A–F) ist zur murinen Sequenz homolog. Aufgereinigtes, lösliches, murines OPG-bindendes Protein stimulierte in vitro die Osteoklastenbildung und induzierte in vivo Hyperkalziämie und Knochenresorption.
Als OPG-bindendes Protein wird ein Polypeptid bezeichnet, das eine Aminosäuresequenz eines OPG-bindenden Proteins von einem Säugetier oder einem Fragment, Analog oder Derivat davon aufweist und wenigstens die Aktivität der Bindung an OPG aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen ist das OPG-bindende Protein murinen oder menschlichen Ursprungs. In einer anderen Ausführungsform ist das OPG-bindende Protein ein lösliches Protein, das, in einer Form, eine isolierte extrazelluläre Domäne aufweist, die von der cytoplasmatischen und der Transmembran-Domäne getrennt ist. Das OPG-bindende Protein wirkt an der Osteoklastendifferenzierung und an der Geschwindigkeit und dem Ausmaß der Knochenresorption mit, und es wurde festgestellt, dass es die Osteoklastenbildung stimuliert und die Knochenresorption stimuliert.
Nukleinsäuren
Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren bereit, die für OPG-bindende Proteine kodieren. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff Nukleinsäure cDNA, genomische DNA, ganz oder teilweise synthetische DNA und RNA. Die Nukleinsäuren der Erfindung sind aus der Gruppe gewählt, die aus:

a) den wie in den 1A–F (SEQ ID NO: 1) und den 4A–F (SEQ ID NO: 3) gezeigten Nukleinsäuren;
b) Nukleinsäuren, die an die für ein Polypeptid kodierenden Regionen der in den 1A–F (SEQ ID NO: 1) und den 4A–F (SEQ ID NO: 3) gezeigten Nukleinsäuren hybridisieren; und unter hochstringenten Bedingungen an die Nukleinsäuren hybridisiert bleiben; und
c) Nukleinsäuren, die mit Hinblick auf die Nukleinsäuren in (a) oder (b) degeneriert sind,

Nukleinsäurehybridisierungen umfassen typischerweise einen Vorgang mit vielen Schritten, der einen ersten Hybridisierungsschritt umfasst, um Nukleinsäureduplexe aus Einzelsträngen zu bilden, gefolgt von einem zweiten Hybridisierungsschritt, der unter stringenteren Bedingungen ausgeführt wird, um selektiv Nukleinsäureduplexe zu behalten, die die erwünschte Homologie aufweisen. Die Bedingungen des ersten Hybridisierungsschrittes sind im Allgemeinen nicht entscheidend, vorausgesetzt, dass sie nicht von höherer Stringenz als die des zweiten Hybridisierungsschrittes sind. Im Allgemeinen wird die zweite Hybridisierung unter Bedingungen mit hoher Stringenz ausgeführt, wobei Bedingungen mit „hoher Stringenz” Temperatur- und Salzbedingungen bezeichnen, die ungefähr 12–20°C unter der Schmelztemperatur (T_m) eines perfekten Hybrides von einem Teil oder der Gesamtheit der komplementären Stränge liegen, die den 1A–F (SEQ ID NO: 2) und 4A–F (SEQ ID NO: 4) entsprechen. In einer Ausführungsform bedeuten Bedingungen mit „hoher Stringenz” Bedingungen von etwa 65°C und nicht mehr als etwa 1 M Na+. Es wird verstanden, dass die Salzkonzentration, die Temperatur und/oder Länge der Inkubation in sowohl dem ersten als auch dem zweiten Hybridisierungsschritt so verändert werden können, dass man die hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung erhält. Bedingungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren und Berechnungen des T_m von Nukleinsäurehybriden sind in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) beschrieben.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können an einen Teil der oder an alle der für ein Polypeptid kodierende Regionen des OPG-bindenden Proteins hybridisieren, die in den 1A–F (SEQ ID NO: 2) und 4A–F (SEQ ID NO: 4) gezeigt sind, und daher Verkürzungen oder Erweiterungen der hierin gezeigten Nukleinsäuresequenzen sein können. Verkürzte oder erweiterte Nukleinsäuren sind von der Erfindung umfasst, vorausgesetzt, dass sie wenigstens die Eigenschaft der Bindung an OPG beibehalten. In einer Ausführungsform wird die Nukleinsäure für ein Polypeptid mit wenigstens etwa 10 Aminosäuren kodieren. In einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäure für ein Polypeptid mit wenigstens etwa 20 Aminosäuren kodieren. In noch einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäure für ein Polypeptid mit wenigstens etwa 50 Aminosäuren kodieren. Die hybridisierenden Nukleinsäuren können auch nichtkodierende Sequenzen umfassen, die am 5'- und/oder 3'-Ende der Regionen liegen, die für das OPG-bindende Protein kodieren. Nichtkodierende Sequenzen umfassen regulatorische Regionen, die an der Expression von OPG-bindendem Protein mitwirken, wie beispielsweise Promotoren, Enhancerregionen, Translations-Initiierungsstellen, Transkriptionsterminationsstellen und dergleichen.
In bevorzugten Ausführungsformen kodieren die Nukleinsäuren der Erfindung für Maus- oder menschliches OPG-bindendes Protein. Nukleinsäuren können für eine membrangebundene Form des OPG-bindenden Proteins oder für lösliche Formen kodieren, denen eine funktionelle Transmembranregion fehlt. Die vorausgesagte Transmembranregion für murines OPG-bindendes Protein umfasst die Aminosäurereste 49 bis 69 einschließlich, wie sie in den 1A–F (SEQ ID NO: 1) gezeigt sind. Die vorausgesagte Transmembranregion des menschlichen OPG-bindenden Proteins umfasst die Reste 49–69, wie sie in den 4A–F (SEQ ID NO: 3) gezeigt sind. Substitutionen, die hydrophobe Aminosäurereste in dieser Region durch neutrale oder hydrophile Aminosäurereste ersetzen, würden der Erwartung nach die Membranassoziierung stören und zu löslichem OPG-bindendem Protein führen. Zusätzlich würden Deletionen von Teilen oder der Gesamtheit der Transmembranregion der Erwartung nach ebenfalls lösliche Formen des OPG-bindenden Proteins hervorrufen. Nukleinsäuren, die für die Aminosäurereste 70–316, wie sie in den 1A–F (SEQ ID NO: 1) gezeigt sind, oder für Fragmente oder Analoga davon kodieren, umfassen lösliche OPG-bindende Proteine.
Nukleinsäuren, die für verkürzte Formen von löslichen menschlichen OPG-bindenden Proteinen kodieren, sind ebenfalls umfasst. Lösliche Formen umfassen die Reste 69–317, wie sie in den 4A–F (SEQ ID NO: 3) gezeigt sind, und Verkürzungen davon. In einer Ausführungsform erzeugen N-terminale Verkürzungen Polypeptide der Reste 70–317, 71–317, 72–317 und so weiter. In einer weiteren Ausführungsform kodieren Nukleinsäuren für lösliches OPGbp, das die Reste 69–317 und N-terminale Verkürzungen davon bis zu OPGbp [158–317] oder alternativ bis zu OPGbp [166–317] umfasst.
Das Plasmid phuOPGbp 1.1 in E. coli-Stamm DH10, das für das menschliche OPG-bindende Protein kodiert, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD am 13. Juni 1997 hinterlegt.
Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können zum Nachweis von Sequenzen, die für OPG bindendes Protein kodieren, in biologischen Proben verwendet werden. Insbesondere können die Sequenzen verwendet werden, um cDNA und genomische Bibliotheken auf die verwandten Sequenzen von OPG-bindenden Proteinen, insbesondere solchen bei anderen Arten, zu screenen. Die Nukleinsäuren sind auch zum Modulieren der Konzentrationen des OPG-bindenden Proteins durch Antisense-Technologie oder in vivo-Genexpression nützlich. Die Entwicklung von transgenen Tieren, die OPG-bindendes Protein exprimieren, ist zur Herstellung des Polypeptides und zur Untersuchung der biologischen Aktivität in vivo nützlich.
Vektoren und Wirtszellen
Die Nukleinsäuren der Erfindung werden mit DNA-Sequenzen so verbunden werden, dass sie biologisch aktives OPG-bindendes Protein exprimieren. Sequenzen, die für die Expression benötigt werden, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und umfassen Promotoren und Enhancersequenzen zur Initiierung der RNA-Synthese, Transkriptionsterminationsstellen, Ribosomenbindungsstellen zur Initiierung der Proteinsynthese, und Leader-Sequenzen für die Sekretion. Sequenzen, die die Expression und Sekretion von OPG-bindenden Proteinen steuern, können homolog sein, d. h. die Sequenzen sind identisch mit oder ähnlich denjenigen Sequenzen im Genom, die an der Expression und Sekretion des OPG-bindenden Proteins beteiligt sind, oder sie können heterolog sein. Eine Vielzahl von Plasmidvektoren sind zum Exprimieren von OPG-bindendem Protein in Wirtszellen verfügbar (siehe zum Beispiel Methods in Enzymology v. 185, Goeddel, D. V. Hrsg., Academic Press (1990)). Zur Expression in Säugetierwirtszellen ist das Plasmid pDSRα, das in der PCT-Anmeldung Nr. 90/14363 beschrieben ist, eine bevorzugte Ausführungsform. Bevorzugte Ausführungsformen zur Expression in bakteriellen Wirtszellen umfassen Plasmide, die den lux-Promotor (siehe die ebenfalls im Eigentum befindliche und anhängige US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/577,778, die am 22. Dezember 1995 eingereicht wurde) beinhalten. Zusätzlich sind Vektoren zur gewebespezifischen Expression von OPG-bindendem Protein in transgenen Tieren verfügbar. Es können auch retrovirale oder auf Adenoviren basierende Gentransfervektoren für die Expression von OPG-bindendem Protein in menschlichen Zellen zur in vivo-Therapie verwendet werden (siehe PCT-Anmeldung Nr. 86/00922).
Es werden auch prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen, die OPG-bindendes Protein exprimieren, durch die Erfindung bereitgestellt. Wirtszellen umfassen bakterielle, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugetierzellen. OPG-bindendes Protein kann auch in transgenen Tieren wie beispielsweise Mäusen oder Ziegen hergestellt werden. Plasmide und Vektoren, die die Nukleinsäuren der Erfindung enthalten, werden in geeignete Wirtszellen unter Verwendung von Transfektions- oder Transformationstechniken eingeführt, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Wirtszellen können DNA-Sequenzen enthalten, die für OPG-bindendes Protein kodieren, wie es in den 1A–F gezeigt ist, oder für ein Teil davon wie beispielsweise die extrazelluläre Domäne oder die cytoplasmatische Domäne. Nukleinsäuren, die für OPG-bindende Proteine kodieren, können durch Substitution von Codons modifiziert werden, die die optimale Expression in einem gegebenen Wirt erlauben. Wenigstens einige der Codons können sogenannte Vorzugscodons sein, die nicht die Aminosäuresequenz verändern und in Genen, die stark exprimiert werden, häufig gefunden werden. Es wird jedoch verstanden, dass Codonveränderungen zum Optimieren der Expression nicht auf die Einführung von Vorzugscodons beschränkt sind. Beispiele bevorzugter Säugetierwirtszellen für die Expression von OPG-bindendem Protein umfassen, sind aber nicht beschränkt auf COS, CHOd-, 293 und 3T3-Zellen. Eine bevorzugte bakterielle Wirtszelle ist Escherichia coli.
Polypeptide
Die Erfindung stellt auch OPG-bindendes Protein als Produkt der prokaryotischen oder eukaryotischen Expression einer exogenen DNA-Sequenz bereit, d. h. OPG-bindendes Protein ist ein rekombinantes OPG-bindendes Protein. Exogene DNA-Sequenzen umfassen cDNA, genomische DNA und synthetische DNA-Sequenzen. OPG-bindendes Protein kann das Produkt der Expression durch bakterielle, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugetierzellen oder durch zellfreie Translationssysteme sein. OPG-bindendes Protein, das in bakteriellen Zellen hergestellt ist, wird einen N-terminalen Methioninrest aufweisen. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen von OPG-bindendem Protein bereit, das das Anziehen prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtszellen umfasst, die mit für OPG-bindendes Protein kodierenden Nukleinsäuren transformiert oder transfektiert sind, und das Isolieren von Polypeptidexpressionsprodukten der Nukleinsäuren.
Polypeptide, die OPG-bindende Proteine von Säugetieren oder Fragmente, Analoga oder Derivate davon sind, sind von der Erfindung umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das OPG-bindende Protein menschliches OPG-bindendes Protein. Ein Fragment des OPG-bindenden Proteins bezeichnet ein Polypeptid, das eine Deletion von einer oder mehr als einer Aminosäure aufweist, so dass das sich ergebende Polypeptid wenigstens die Eigenschaft aufweist, an OPG zu binden. Diese Fragmente werden Deletionen aufweisen, die vom N-terminalen Ende, dem C-terminalen Ende und internen Regionen des Polypeptides stammen. Fragmente des OPG-bindenden Proteins sind wenigstens etwa 10 Aminosäuren, wenigstens etwa 20 Aminosäuren oder wenigstens etwa 50 Aminosäuren lang. In bevorzugten Ausführungsformen wird OPG-bindendes Protein eine Deletion von einer oder mehr als einer Aminosäure der Transmembranregion (Aminosäurereste 49–69 wie in den 1A–F gezeigt) oder alternativ einer oder mehr als einer Aminosäure des N-Terminus bis zu und/oder einschließlich der Transmembranregion (Aminosäurereste 1–49 wie in den 1A–F gezeigt) aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform ist das OPG-bindende Protein ein lösliches Protein, das beispielsweise die Aminosäurereste 69–316 oder 70–316 oder N-terminal oder C-terminal verkürzte Formen davon umfasst, die die OPG-Bindungseigenschaft beibehalten. OPG-bindendes Protein ist, wie es in den 4A–F gezeigt ist, auch ein menschliches lösliches Protein, das die Reste 69–317 umfasst, wie in den 4A–F gezeigt, sowie N-terminal verkürzte Formen davon, z. B. 70–517, 71–517, 71–317, 72–317 und so weiter. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das lösliche menschliche OPG-bindende Protein die Reste 69–317 und die N-terminale Verkürzung davon bis zu OPGbp [158–317] oder alternativ bis zu OPG [166–317].
Ein Analogon eines OPG-bindenden Proteins bedeutet ein Polypeptid, das eine Substitution oder eine Addition von einer oder mehr als einer Aminosäure aufweist, so dass das sich ergebende Polypeptid wenigstens die Eigenschaft der Bindung an OPG aufweist. Die Analoga werden Substitutionen oder Additionen an irgendeiner Stelle des Polypeptides aufweisen. Bevorzugte Analoga umfassen die Analoga der löslichen OPG-bindenden Proteine. Fragmente oder Analoga können natürlich vorkommen wie beispielsweise ein Polypeptidprodukt einer allelischen Variante oder einer mRNA-Splice-Variante, oder sie können unter Verwendung von für den Fachmann auf dem Gebiet des Manipulierens und Synthetisierens von Nukleinsäuren verfügbaren Techniken konstruiert werden. Die Polypeptide können, müssen aber nicht einen N-terminalen Methioninrest aufweisen.
Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind Derivative des OPG-bindenden Proteins, die Polypeptide sind, die posttranslationale Modifikationen (z. B. Hinzufügen von N-verbundenen oder O-verbundenen Kohlenhydratketten, Verarbeiten der N-terminalen oder C-terminalen Enden), Anlagern von chemischen Teilen an das Aminosäurerückgrat, chemische Modifikationen der N-verbundenen oder O-verbundenen Kohlenhydratketten und das Hinzufügen eines N-terminalen Methioninrestes als Ergebnis der Expression in einer prokaryontischen Wirtszelle durchlaufen haben. Insbesondere sind chemisch modifizierte Derivate des OPG-bindenden Proteins vorgesehen, die zusätzliche Vorteile wie beispielsweise eine erhöhte Stabilität, längere Kreislaufzeit oder verringerte Immunogenität bereitstellen.
Von besonderem Nutzen ist eine Modifikation mit wasserlöslichen Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglycol und Derivativen davon (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,179,337 ). Die chemischen Teile für die Derivatisierung können aus wasserlöslichen Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglycol, Ethylen-glycol/Propylenglycol-Copolymeren, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylalkohol und dergleichen ausgewählt sein. Die Polypeptide können an zufälligen oder vorbestimmten Stellen innerhalb des Moleküls modifiziert sein und einen, zwei, drei oder mehr angelagerte chemische Teile umfassen. Polypeptide können auch an vorbestimmten Stellen im Polypeptid, wie beispielsweise dem N-Terminus oder an einem ausgewählten Lysin- oder Arginin-Rest innerhalb des Polypeptids, modifiziert sein. Andere bereitgestellte chemische Modifikationen umfassen eine nachweisbare Markierung wie beispielsweise eine Enzym-, Fluoreszenz-, Isotopen- oder Affinitäts-Markierung, um den Nachweis und die Isolierung des Proteins zu erlauben.
Chimären des OPG-bindenden Proteins, die einen Teil oder die gesamte Aminosäuresequenz des OPG-bindenden Proteins umfassen und an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert sind, sind ebenfalls umfasst. Die heterologe Sequenz kann jede Sequenz sein, die erlaubt, dass das sich ergebende Fusionsprotein wenigstens die Aktivität beibehält, an OPG zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die C-terminale extrazelluläre Domäne des OPG-bindenden Proteins an eine heterologe Sequenz fusioniert. Solche Sequenzen umfassen heterologe cytoplasmatische Domänen, die alternative intrazelluläre Signaltransduktionsereignisse zulassen, Sequenzen, die die Oligomerisierung fördern, wie beispielsweise die Fc-Region von IgG, Enzymsequenzen, die eine Markierung für das Polypeptid bereitstellen, und Sequenzen, die Affinitätssonden bereitstellen, wie beispielsweise eine Antigen-Antikörper-Erkennung.
Die Polypeptide der Erfindung werden aus Geweben und Zellinien isoliert und aufgereinigt, die OPG-bindendes Protein exprimieren, und sie sind entweder aus Lysaten oder aus konditioniertem Wachstumsmedium und aus transformierten Wirtszellen, die OPG-bindendes Protein exprimieren, extrahiert. OPG-bindendes Protein kann aus der murinen myelomonozytischen Zellinie 32-D (ATCC Zugangsnummer CRL-11346) erhalten werden. Menschliches OPG-bindendes Protein oder dafür kodierende Nukleinsäuren können aus menschlichem Lymphknoten- oder fötalem Lebergewebe isoliert werden. Isoliertes OPG-bindendes Protein ist frei von einer Assoziation mit menschlichen Proteinen oder anderen Zellbestandteilen.
Ein Verfahren zur Aufreinigung von OPG-bindendem Protein aus natürlichen Quellen (z. B. Geweben und Zellinien, die normalerweise OPG-bindendes Protein exprimieren) und aus transfizierten Wirtszellen ist von der Erfindung ebenfalls umfasst. Das Aufreinigungsverfahren kann sich eines oder mehr als eines Standardproteinaufreinigungsschrittes in einer geeigneten Abfolge bedienen, um aufgereinigtes Protein zu erhalten. Die Chromatographieschritte können Ionenaustausch-, Gelfiltrations-, hydrophobe Wechselwirkungs-, Umkehrphasen-, Chromatofokussierungs-, Affinitätschromatographie umfassen, die einen Antikörper gegen OPG-bindendes Protein oder einen Biotin-Streptavidin-Affinitätskomplex und dergleichen verwendet.
Antikörper
Antikörper, die spezifisch an die Polypeptide der Erfindung binden, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Die Antikörper können durch eine Immunisierung mit Vollängen-OPG-bindendem Protein, löslichen Formen des OPG-bindenden Proteins oder einem Fragment davon hergestellt werden. Die Antikörper der Erfindung können polyklonal oder monoklonal sein oder können rekombinante Antikörper wie beispielsweise chimäre Antikörper sein, wobei die murinen konstanten Regionen auf den leichten und schweren Ketten durch menschliche Sequenzen ersetzt sind, oder sie können CDR-transplantierte Antikörper sein, wobei nur die komplementaritätsbestimmenden Regionen murinen Ursprungs sind. Antikörper der Erfindung können auch menschliche Antikörper sein, die zum Beispiel durch Immunisierung von transgenen Tieren hergestellt sind, die fähig sind, menschliche Antikörper herzustellen (siehe zum Beispiel PCT-Anmeldung Nr. WO93/12227 ). Die Antikörper sind zum Nachweisen des OPG-bindenden Proteins in biologischen Proben nützlich und erlauben dadurch die Identifizierung von Zellen oder Geweben, die das Protein herstellen. Zusätzlich haben Antikörper, die an das OPG-bindende Protein binden und eine Wechselwirkung mit anderen bindenden Verbindungen blockieren, möglicherweise eine therapeutische Verwendung beim Modulieren der Differenzierung von Osteoklasten und der Knochenresorption.
Antikörper gegen das OPG-bindende Protein können bei der Behandlung von Knochenkrankheiten wie beispielsweise der Osteoporose und der Paget'schen Krankheit nützlich sein. Antikörper können hinsichtlich der Bindung an das OPG-bindende Protein in Abwesenheit oder Anwesenheit von OPG getestet und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Liganden(OPG-bindendes Protein)-vermittelte Osteoklastengenese und/oder Knochenresorption zu inhibieren, untersucht werden. Es wird auch erwartet, dass die Peptide selbst als Antagonist der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung wirken und die ligandenvermittelte Osteoklastengenese inhibieren, und Peptide des OPG-bindenden Proteins werden auch für diesen Zweck erforscht werden.
Zusammensetzungen
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge des OPG-bindenden Proteins der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Träger, Lösungsverbesserer, Emulgator, Konservierungsmittel und/oder Adjuvans umfassen. Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Agonisten oder Antagonisten des OPG-bindenden Proteins umfassen. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge” bedeutet eine Menge, die eine therapeutische Wirkung bezüglich eines spezifizierten Zustandes und Verabreichungsweges bereitstellt. Die Zusammensetzung kann in flüssigen oder in einer lyophilisierten Form vorliegen und umfasst ein Verdünnungsmittel (Tris-, Acetat- oder Phosphatpuffer), das verschiedene pH-Werte und Ionenstärken aufweist, Lösungsverbesserer wie beispielsweise Tween oder Polysorbat, Träger wie beispielsweise menschliches Serumalbumin oder Gelatine, Konservierungsmittel wie beispielsweise Thimerosal oder Benzylalkohol und Antioxidationsmittel wie beispielsweise Ascorbinsäure oder Natriumdisulfit. Die Auswahl einer bestimmten Zusammensetzung wird von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich des behandelten Zustandes, des Verabreichungsweges und der erwünschten pharmakokinetischen Parameter. Eine umfangreichere Übersicht über Bestandteile, die für pharmazeutische Zusammensetzungen geeignet sind, ist in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, A. R. Gennaro, Hrsg. Mack, Easton, PA (1980) zu finden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden auch Zusammensetzungen, die lösliche OPG-bindende Proteine umfassen, bereitgestellt. Ebenfalls umfasst sind Zusammensetzungen, die lösliches OPG-bindendes Protein umfassen, das mit wasserlöslichen Polymeren modifiziert ist, um die Löslichkeit, Stabilität, Plasmahalbwertszeit und Bioverfügbarkeit zu erhöhen. Zusammensetzungen können auch den Einbau des löslichen OPG-bindenden Proteins in Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen oder Vesikeln zur gesteuerten Abgabe über eine verlängerte Zeitspanne umfassen. Lösliches OPG-bindendes Protein kann in Mikropartikeln formuliert sein, die zur pulmonalen Verabreichung geeignet sind.
Zusammensetzungen der Erfindung können durch eine Injektion verabreicht werden, entweder subkutan, intravenös, oder intramuskulär, oder durch eine orale, nasale, pulmonale oder rektale Verabreichung. Der letztendlich gewählte Verabreichungsweg wird von einer Reihe von Faktoren abhängen und kann durch einen Fachmann auf dem Gebiet ermittelt werden.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge der Nukleinsäuren der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans bereitstellen. Nukleinsäurezusammensetzungen werden zur Abgabe von einem Teil oder der Gesamtheit der kodierenden Region des OPG-bindenden Proteins und/oder von flankierenden Regionen an Zellen und Gewebe als Teil eines Antisense-Therapieplanes geeignet sein.
Verwendungsverfahren
OPG-bindende Proteine können für eine Vielzahl von Tests zum Nachweisen von OPG und zum Charakterisieren von Wechselwirkungen mit OPG verwendet werden. Im Allgemeinen umfasst der Test das Inkubieren von OPG-bindendem Protein mit einer OPG enthaltenden biologischen Probe unter Bedingungen, die das Binden von OPG an das OPG-bindende Protein und das Messen des Ausmaßes der Bindung erlauben. OPG kann aufgereinigt oder in Mischungen wie beispielsweise Körperflüssigkeiten oder Kulturmedium vorhanden sein. Es können Tests entwickelt werden, die qualitativ oder quantitativ sind, wobei die letzteren zum Bestimmen der Bindungsparameter (Affinitätskonstante und Kinetiken) von OPG an OPG-bindendes Protein und zum Quantifizieren der Konzentrationen des biologisch aktiven OPGs in Mischungen nützlich sein können. Die Tests können auch verwendet werden, um das Binden von OPG an Fragmente, Analoga und Derivate des OPG-bindenden Proteins zu untersuchen und neue Mitglieder der OPG-Familie und der Familie der OPG-bindenden Proteine zu identifizieren.
Das Binden von OPG an das OPG-bindende Protein kann in verschiedenen Formaten ausgeführt werden, einschließlich zellbasierter Bindungstests, Membranbindungstests, Tests in einer flüssigen Phase und Immuntests. Im Allgemeinen werden Spurenkonzentrationen von markiertem OPG mit Proben mit OPG-bindendem Protein für eine spezifische Zeitdauer inkubiert, gefolgt von der Messung von gebundenem OPG durch Filtrierung, Elektrochemilumineszenz (ECL, ORIGEN System von IGEN), zellbasierte Tests oder Immuntests. Homogene Testtechnologien für Radioaktivität (SPA; Amersham) und zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF, Packard) können ebenfalls ausgeführt werden. Das Binden wird durch das Markieren von OPG oder einem anti-OPG-Antikörper mit radioaktiven Isotopen (125I, 35S, 3H), Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorescein), Lanthanoiden (Eu3+), Chelaten oder Cryptaten, Orbipyridyl-Ruthenium(Ru2+)-Komplexen nachgewiesen. Es wird verstanden, dass die Auswahl einer markierten Sonde von dem verwendeten Nachweissystem abhängen wird. Alternativ kann OPG mit einer unmarkierten Epitop-Markierung (z. B. Biotin, Peptiden, His₆, myc) modifiziert werden und an Proteine wie beispielsweise Streptavidin-, anti-Peptid- oder anti-Protein-Antikörper gebunden werden, die eine nachweisbare Markierung tragen, wie sie oben beschrieben ist.
In einem alternativen Verfahren kann das OPG-bindende Protein direkt unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen OPG-bindende Proteine in einem Immuntest getestet werden. Zusätzliche Formen von OPG-bindenden Proteinen, die Epitopmarkierungen wie oben beschrieben enthalten, können bei Lösungs- und Immuntests verwendet werden.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die mit OPG-bindendem Protein wechselwirken, sind auch von der Erfindung umfasst. Das Verfahren umfasst das Inkubieren von OPG-bindendem Protein mit einer Verbindung unter Bedingungen, die das Binden der Verbindung an OPG-bindendes Protein und das Messen des Ausmaßes der Bindung erlauben. Die Verbindung kann im Wesentlichen aufgereinigt oder in einer rohen Mischung vorhanden sein. Bindende Verbindungen können Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Kohlenhydrate, Lipide oder organische Verbindungen mit geringem Molekulargewicht sein. Die Verbindungen können weiterhin durch ihre Fähigkeit charakterisiert werden, die Aktivität des OPG-bindenden Proteins zu erhöhen oder zu verringern, um zu bestimmen, ob sie als ein Agonist oder als ein Antagonist wirken.
OPG-bindende Proteine sind auch zum Identifizieren von intrazellulären Proteinen, die mit der cytoplasmatischen Domäne wechselwirken, durch ein Yeast-two-hybrid-Screeningverfahren nützlich. Zum Beispiel können Hybridkonstrukte, die eine DNA umfassen, die für die N-terminalen 50 Aminosäuren eines OPG-bindenden Proteins, das an eine Hefe-GAL4-DNA-bindende Domäne fusioniert ist, kodieren, als Two-hybrid-Köderplasmid verwendet werden. Positive Klone, die aus dem Screening hervorgehen, können weiter charakterisiert werden, um wechselwirkende Proteine zu identifizieren. Diese Information kann dabei helfen, einen intrazellulären Signalmechanismus aufzuklären, der mit dem OPG-bindenden Protein zusammenhängt, und intrazelluläre Ziele für neue Wirkstoffe bereitzustellen, die die Knochenresorption modulieren.
OPG-bindendes Protein kann verwendet werden, um Zustände zu behandeln, die durch übermäßige Knochendichte gekennzeichnet sind. Der üblichste Zustand ist Osteopetrosis, bei der ein genetischer Defekt zu einer erhöhten Knochenmasse führt, und der gewöhnlich in den ersten Lebensjahren tödlich ist. Osteopetrosis wird bevorzugterweise durch die Verabreichung von löslichem OPG-bindenden Protein behandelt.
Die Erfindung umfasst auch Modulatoren (Agonisten und Antagonisten) des OPG-bindenden Proteins und die Verfahren, um sie zu erhalten. Ein Modulator des OPG-bindenden Proteins kann wenigstens eine Aktivität, die mit dem OPG-bindenden Protein assoziiert ist, entweder erhöhen oder erniedrigen, wie beispielsweise die Fähigkeit, an OPG oder ein anderes wechselwirkendes Molekül zu binden oder die Osteoklastenreifung zu regulieren. Typischerweise kann ein Agonist oder Antagonist ein Cofaktor wie beispielsweise ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Lipid oder Molekül mit niedrigem Molekulargewicht sein, das mit OPG-bindendem Protein wechselwirkt, um seine Aktivität zu regulieren. Potenzielle Polypeptidantagonisten umfassen Antikörper, die entweder mit löslichen oder membranassoziierten Formen des OPG-bindenden Proteins wechselwirken, und lösliche Formen von OPG-bindendem Protein, die einen Teil oder die gesamte extrazelluläre Domäne des OPG-bindenden Proteins umfassen. Moleküle, die die Expression des OPG-bindenden Proteins regulieren, umfassen typischerweise Nukleinsäuren, die komplementär zu Nukleinsäuren sind, die für OPG-bindendes Protein kodieren und die als Antisense-Expressionsregulatoren wirken.
OPG-bindendes Protein ist beim Steuern der Bildung von reifen Osteoklasten beteiligt, dem primären Zelltyp, der mit der Knochenresorption in Zusammenhang gebracht wird. Eine Erhöhung der Geschwindigkeit der Knochenresorption (über die der Knochenbildung) kann zu verschiedenen Knochenkrankheiten führen, die kollektiv als Osteopenien bezeichnet werden und Osteoporose, Osteomyelitis, Hyperkalziämie, durch einen chirurgischen Eingriff oder Steroidverabreichung herbeigeführte Osteopenie, Paget'sche Krankheit, Osteonekrose, Knochenverlust aufgrund von rheumatischer Arthritis, parodontaler Knochenverlust, Immobilisierung, prosthetische Lockerung und osteolytische Metastase umfassen. Umgekehrt kann eine Verringerung der Geschwindigkeit der Knochenresorption zu Osteopetrosis führen, einem Zustand, der durch eine übermäßige Knochendichte gekennzeichnet ist. Die Agonisten und Antagonisten von OPG-bindendem Protein modulieren die Osteoklastenbildung und können an Patienten verabreicht werden, die an Knochenkrankheiten leiden. Die Agonisten und Antagonisten von OPG-bindenden Protein, die für die Behandlung von Osteopenien verwendet werden, können alleine oder in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines knochenwachstumfördernden Agens verabreicht werden, einschließlich der knochengestaltbildenden Faktoren, die als BMP-1 bis BMP-12 bezeichnet werden, Mitglieder der Familien von transformierendem Wachstumsfaktor-β und TGF-β, der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren FGF-1 bis FGF-10, Interleukin-1-Inhibitoren, TNFα-Inhibitoren, Parathormon, Prostaglandine der E-Serie, Bisphosphonate und knochenverstärkenden Mineralien wie beispielsweise Fluorid oder Kalzium. Antagonisten des OPG-bindenden Proteins können bei der Behandlung von Osteopenie besonders nützlich sein.
Rezeptoren für Osteoprotegerin-bindende Proteine
Die Erfindung stellt auch Rezeptoren bereit, die mit OPG-bindenden Proteinen wechselwirken. Insbesondere stellt die Erfindung einen Osteoklastendifferenzierungs- und -Aktivierungsrezeptor (ODAR) bereit. ODAR ist ein Transmembran-Polypeptid, das seinen höchsten Homologiegrad zu CD40 zeigt, einem Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie. Die Nukleinsäuresequenz von murinem ODAR und das kodierte Polypeptid sind in den 10A–F gezeigt. Das menschliche Homolog des murinen ODAR kann leicht durch Hybridisierungsscreening einer menschlichen cDNA- oder einer genomischen Bibliothek mit der Nukleinsäuresequenz der 10A–F isoliert werden. Die Vorgehensweisen zum Klonieren menschlicher ODAR sind denjenigen ähnlich, die in Beispiel 5 für das Klonieren von menschlichen OPG-bindenden Proteinen beschrieben sind. Das menschliche Homolog des in den 10A–F gezeigten Polypeptides ist in Anderson et al. (Nature 390), 175–179 (1997)) erschienen und wird darin als RANK bezeichnet. RANK ist als ein Typ I-Transmembranprotein charakterisiert, das eine Homologie zu Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie aufweist und an der Funktion von dendritischen Zellen beteiligt ist.
Ein Beleg für die Wechselwirkung von ODAR und OPG-bindendem Protein ist in Beispiel 13 gezeigt. Eine lösliche Form von ODAR (ODAR-Fc-Fusionsprotein) verhindert die Osteoklastenreifung in vitro (12A–H) und erhöht die Knochendichte bei normalen Mäusen nach subkutaner Injektion (13). Die Ergebnisse sind konsistent damit, dass das OPG-bindende Protein mit ODAR wechselwirkt und ODAR aktiviert, um die Osteoklastenreifung zu fördern.
Die Osteoklastenentwicklung und die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Knochenresorption werden durch die Wechselwirkung von OPG-bindendem Protein und ODAR reguliert. Verbindungen, die die Wechselwirkung von OPG-bindendem Protein und ODAR verringern oder blockieren, sind potentielle Antagonisten der Aktivität des OPG-bindenden Proteins und können die Osteoklastenentwicklung stören, was zu einer verringerten Knochenresorption führt. Alternativ sind Verbindungen, die die Wechselwirkung von OPG-bindendem Protein und ODAR erhöhen, potentielle Agonisten, die die Osteoklastenentwicklung fördern und die Knochenresorption erhöhen.
Es kann eine Vielzahl von Tests verwendet werden, um die Wechselwirkung von OPG-bindendem Protein mit ODAR in vitro unter Verwendung aufgereinigter Proteine zu messen. Diese Tests können verwendet werden, um Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu screenen, die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Bindung von OPG-bindendem Protein an ODAR zu erhöhen oder zu verringern. Bei einer Art von Test kann das ODAR-Protein durch Kopplung an den Boden der Reaktionsnäpfe einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden. Anschließend können radiomarkiertes OPG-bindendes Protein (zum Beispiel iodiertes OPG-bindendes Protein) und die Testverbindung(en) entweder einzeln (in einer jeden Reihenfolge) oder gleichzeitig zu den Reaktionsnäpfen hinzugegeben werden. Nach der Inkubation können die Näpfe gewaschen und unter Verwendung eines Szintillationszählers auf Radioaktivität hin ausgezählt werden, um das Ausmaß der Bindung von OPG-bindendem Protein an ODAR in Gegenwart der Testverbindung zu bestimmen. Typischerweise wird die Verbindung über einen Konzentrationsbereich getestet werden, und eine Reihe von Kontrollnäpfen, denen ein oder mehr als ein Element des Tests fehlt, kann verwendet werden aus Gründen der Genauigkeit der Evaluierung der Ergebnisse. Eine Alternative zu diesen Verfahren umfasst das Umkehren der „Positionen” der Proteine, d. h. Immobilisieren von OPG-bindendem Protein an den Mikrotiterplattennäpfen, das Inkubieren mit der Testverbindung und radiomarkiertem ODAR, und das Bestimmen des Ausmaßes der ODAR-Bindung (siehe zum Beispiel Kapitel 18 von Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, NY [1995]).
Als Alternative zum Radiomarkieren können OPG-bindendes Protein oder ODAR mit Biotin konjugiert sein, und die Anwesenheit von biotinyliertem Protein kann dann unter Verwendung von mit einem Enzym wie beispielsweise Meerrettichperoxidase [HRP] oder alkalischer Phosphatase [AP] verbundenem Streptavidin nachgewiesen werden, das kolorimetrisch oder durch Fluoreszenzmarkieren von Streptavidin nachgewiesen werden kann. Es kann auch ein gegen OPG-bindendes Protein oder ODAR gerichteter Antikörper verwendet werden, der mit Biotin konjugiert ist und der nach Inkubation mit enzym-verbundenem Streptavidin, das mit AP oder HRP verbunden ist, nachgewiesen werden kann.
Das OPG-bindende Protein und ODAR können auch durch Anlagern an Agarosekügelchen, Acrylkügelchen oder andere Arten solcher inerter Substrate immobilisiert werden. Der Substrat-Protein-Komplex kann in eine Lösung eingebracht werden, die das komplementäre Protein und die Testverbindung enthält; nach der Inkubation können die Kügelchen durch Zentrifugation präzipitiert werden, und das Ausmaß der Bindung zwischen dem OPG-bindenden Protein und ODAR kann unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren abgeschätzt werden. Alternativ kann der Substrat-Protein-Komplex in einer Säule immobilisiert werden, und das Testmolekül und das komplementäre Protein können über die Säule geführt werden. Die Bildung eines Komplexes aus OPG-bindendem Protein und ODAR kann anschließend unter Verwendung einer jeden der oben dargestellten Techniken abgeschätzt werden, d. h. Radiomarkieren, Antikörperbinden oder dergleichen.
Eine andere Art in vitro-Test, der zum Identifizieren einer Verbindung nützlich ist, die die Bildung eines ODAR/OPG-bindendes Protein-Komplexes erhöht oder verringert, ist ein Nachweissystem auf der Basis von Oberflächenplasmonresonanz wie beispielsweise das Biacore-Testsystem (Pharmacia, Piscataway, NJ). Das Biacore-System kann unter Verwendung des Protokolls des Herstellers verwendet werden. Dieser Test umfasst im Wesentlichen das kovalente Binden entweder von OPG-bindendem Protein oder von ODAR an einen mit Dextran beschichteten Sensorchip, der sich in einem Detektor befindet. Die Testverbindung und das andere komplementäre Protein können dann entweder gleichzeitig oder sequenziell in die den Sensorchip enthaltende Kammer injiziert werden, und die Menge des bindenden komplementären Proteins kann auf der Grundlage der Änderung der molekularen Masse abgeschätzt werden, die mit der mit Dextran beschichteten Seite des Sensorchips physikalisch assoziiert ist; die Änderung der molekularen Masse kann durch das Detektorsystem gemessen werden.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehr als zwei Testverbindungen zusammen zur Verwendung bei der Erhöhung oder der Verringerung der Bildung des ODAR/OPG-bindendes Protein-Komplexes zu untersuchen. In diesen Fällen können die oben angegebenen Tests leicht durch das Hinzugeben von einer solchen zusätzlichen Testverbindung(en) entweder gleichzeitig mit oder nach der ersten Testverbindung hinzugegeben werden. Die restlichen Schritte des Tests sind wie oben dargestellt.
In vitro-Tests, wie beispielsweise diejenigen, die oben beschrieben sind, können vorteilhafterweise verwendet werden, um große Zahlen von Verbindungen schnell bezüglich ihrer Wirkungen auf die Komplexbildung zwischen ODAR und OPG-bindendem Protein zu screenen. Die Tests können automatisiert sein, um Verbindungen zu screenen, die in Phage display-, synthetischen Peptid- und chemisch synthetisierten Bibliotheken erzeugt sind.
Verbindungen, die die Komplexbildung zwischen OPG-bindendem Protein und ODAR erhöhen oder verringern, können auch in einer Zellkultur unter Verwendung von ODAR-tragenden Zellen und Zellinien gescreent werden. Die Zellen und Zellinien können von jedem Säugetier erhalten werden, werden aber bevorzugterweise von menschlichen oder anderen Primaten-, Hunde- oder Nagerquellen erhalten werden. ODAR-enthaltende Zellen, wie beispielsweise Osteoklasten, können aus anderen Zelltypen durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von der Öffentlichkeit zugänglichen Vorgehensweisen angereichert werden. Das Anlagern des OPG-bindenden Proteins an ODAR-tragende Zellen wird in Anwesenheit oder Abwesenheit von Testverbindungen untersucht und das Ausmaß der Bindung kann z. B. durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines biotinylierten Antikörpers gegen OPG-bindendes Protein bestimmt werden. Alternativ kann, wie in Beispiel 8 beschrieben ist, eine Kultur von Maus- oder menschlichen Osteoklasten etabliert werden, und Testverbindungen können bezüglich ihrer Fähigkeit, die Osteoklastenreifung zu blockieren, die durch das Hinzugeben von CSF-1 und OPG-bindendem Protein stimuliert wird, untersucht werden. Zellkulturtests können vorteilhafterweise verwendet werden, um Verbindungen, die in den oben beschriebenen Proteinbindungs-Tests positiv bewertet werden, weiter zu untersuchen.
Verbindungen, die die Wechselwirkung von OPG-bindendem Protein mit ODAR erhöhen oder verringern, können auch durch Verabreichen der Verbindungen an Mäuse, gefolgt von Messungen der Knochendichte unter Verwendung von Knochenszintidensitometrie oder Radiographie hinsichtlich der in vivo-Aktivität eingeschätzt werden. Vorgehensweisen zum Messen der Knochendichte sind in der PCT-Veröffentlichung WO97/23614 und in Beispiel 13 beschrieben.
Die Erfindung stellt Verbindungen bereit, die die Wechselwirkung zwischen dem OPG-bindenden Protein und ODAR verringern oder blockieren und Antagonisten der Osteoklastenbildung sind. Solche Verbindungen gehören im Allgemeinen zu einer von zwei Gruppen. Eine Gruppe umfasst diejenigen Verbindungen, die vom OPG-bindenden Protein abgeleitet sind, oder die mit OPG-bindendem Protein wechselwirken. Diese sind oben beschrieben. Eine zweite Gruppe umfasst diejenigen Verbindungen, die von ODAR abgeleitet sind oder mit ODAR wechselwirken. Beispiele für Verbindungen, die Antagonisten von ODAR sind, umfassen Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Kohlenhydrate, Lipide oder organische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht.
Antagonisten von ODAR können Verbindungen sein, die an oder nahe einer oder mehr als einer Bindestelle von OPG bp auf der extrazellulären Domäne von ODAR binden und die Komplexbildung verringern oder vollständig blockieren. Diejenigen Regionen auf ODAR, die an der Komplexbildung mit OPG-bindendem Protein beteiligt sind, können durch Analogie mit der Struktur des homologen TNFβ-/TNF-R55-Komplexes identifiziert werden, die in Banner et al. (Cell 73, 431–445 (1993)) beschrieben ist. Zum Beispiel kann die Struktur des TNFβ-/TNF-R55-Komplexes verwendet werden, um Regionen des OPG-bindenden Proteins und von ODAR zu identifizieren, die an der Komplexbildung beteiligt sind. Es können anschließend Verbindungen entworfen werden, die bevorzugterweise an die Regionen binden, die an der Komplexbildung beteiligt sind und als Antagonisten wirken. Bei einem in Beispiel 11 dargestellten Ansatz wurden Peptidantigene für die Verwendung beim Erzeugen von Antikörpern gegen OPG-bindendes Protein entworfen, die als Antagonisten wirken. Von diesen Antikörpern wird erwartet, dass sie an OPG-bindendes Protein binden und die Komplexbildung mit ODAR blockieren. Bei einem ähnlichen Ansatz können Peptidantigene auf der Grundlage der ODAR-Struktur verwendet werden, um anti-ODAR-Antikörper zu erzeugen, die als Antagonisten wirken.
Antagonisten von ODAR können auch an Stellen auf ODAR binden, die sich von der Bindestelle oder den Bindestellen für OPG bp unterscheiden und Konformationsänderungen im ODAR-Polypeptid induzieren, die zu einer verringerten oder unproduktiven Komplexbildung mit OPG-bindenden Proteinen führen.
In einer Ausführungsform ist ein Antagonist eine lösliche Form von ODAR, dem eine funktionelle Transmembrandomäne fehlt. Lösliche Formen von ODAR können eine Deletion von einer oder mehr als einer Aminosäure in der Transmembrandomäne (Aminosäuren 214–234, wie sie in den 10A–F gezeigt sind) aufweisen. Lösliche ODAR-Polypeptide können Teile oder die gesamte extrazelluläre Domäne aufweisen und sind fähig, an OPG-bindendes Protein zu binden. Optional kann löslicher ODAR ein Teil eines chimären Proteins sein, wobei ein Teil oder die gesamte extrazellulären Domäne von ODAR an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist. In einer Ausführungsform ist die heterologe Aminosäuresequenz eine Fc-Region von menschlichem IgG.
Modulatoren (Agonisten und Antagonisten) von ODAR können verwendet werden, um eine Osteopenie zu verhindern oder zu behandeln, einschließlich Osteoporose, Osteomyelitis, maligne Hyperkalziämie, durch einen chirurgischen Eingriff oder Steroidverabreichung hervorgerufene Osteopenie, Paget'sche Krankheit, Osteonekrose, Knochenverlust aufgrund von rheumatoider Arthritis, parodontalen Knochenverlust, Immobilisierung, prosthetische Lockerung und osteolytische Metastase. Für die Behandlung von Osteopenien verwendete Agonisten und Antagonisten von ODAR können alleine oder in Kombination mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines knochenwachstumfördernden Agens verabreicht werden, einschließlich knochengestaltbildender Faktoren, die als BMP-1 bis BMP-12 bezeichnet werden, Mitglieder der Familien von transformierendem Wachstumsfaktor-β und TGF-β, die Fibroblastenwachstumsfaktoren FGF-1 bis FGF-10, Interleukin-1-Inhibitoren, TNFα-Inhibitoren, Parathormon, Prostaglandine der E-Serie, Bisphosphonate, Östrogene, SERMs und knochenverstärkender Mineralien wie beispielsweise Fluorid und Kalzium. Antagonisten von ODAR sind bei der Behandlung von Osteopenie besonders nützlich.
Die folgenden Beispiele werden vorgebracht, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, werden aber nicht als den Umfang derselben beschränkend ausgelegt.
Beispiel 1
Identifizierung einer Zellinienquelle für ein OPG-bindendes Protein
Osteoprotegerin (OPG) reguliert die Osteoklastengenese in vitro und in vivo negativ. Da OPG ein mit TNFR verwandtes Protein ist, ist es wahrscheinlich, dass es mit einem Mitglied der TNF-verwandten Familie wechselwirkt, während es seine Wirkungen vermittelt. Mit einer Ausnahme sind alle bekannten Mitglieder der TNF-Superfamilie Typ II-Transmembranproteine, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Um eine Quelle eines OPG-bindenden Proteins zu identifizieren, wurden rekombinante OPG-Fc-Fusionsproteine als Immunsonden verwendet, um auf OPG-bindende Proteine zu screenen, die sich auf der Oberfläche von verschiedenen Zellinien und von primären hämatopoetischen Zellen befinden.
Zelllinien, die als adhärente Kulturen in vitro wuchsen, wurden unter Verwendung der folgenden Verfahren behandelt: die Zellen wurden in Gewebekulturplatten mit 24 Reaktionsnäpfen (Falcon) ausplattiert, dann bis zu einer Konfluenz von ungefähr 80% wachsen gelassen. Die Wachstumsmedien wurden anschließend entfernt, und die adhärenten Kulturen wurden mit phosphatgepufferter Saline (PBS) (Gibco) gewaschen, die 1% fötales Kälberserum (FCS) enthielt. Rekombinantes Maus-OPG[22–194]-Fc- und menschliches OPG[22–201]-Fc-Fusionsprotein (siehe US Seriennummer 08/706,945, eingereicht am 3. September 1996) wurden einzeln in 1% FCS enthaltendem PBS auf 5 ug/ml verdünnt, dann zu den Kulturen hinzugegeben und es wurde ihnen gestattet, 45 Min. lang bei 0°C zu inkubieren. Die Lösung des OPG-Fc-Fusionsproteins wurde verworfen und die Zellen wurden wie oben beschrieben in PBS-FCS-Lösung gewaschen. Die Kulturen wurden anschließend gegenüber Phycoerythrin-konjugiertem sekundärem Ziegen-F(ab')-anti-Mensch-IgG Antikörper (Southern Biotechnology Associates Kat. Nr. 2043-09) exponiert, der in PBS-FCS verdünnt war. Nach einer 30–45-minütigen Inkubation bei 0°C wurde die Lösung verworfen, und die Kulturen wurden wie oben beschrieben gewaschen. Die Zellen wurden anschließend durch Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert, um Zellinien nachzuweisen, die auf der Zelloberfläche ein OPG-bindendes Protein exprimieren.
Suspensionszellkulturen wurden auf eine ähnliche Weise mit den folgenden Modifikationen analysiert: das Verdünnungsmittel und der Waschpuffer bestanden aus Kalzium- und Magnesium-freier phosphatgepufferter Saline, die 1% FCS enthielt. Die Zellen aus sich exponentiell replizierenden Kulturen in Wachstumsmedium geerntet, durch Zentrifugation pelletiert, dann in einer Mikrotiter-Gewebekulturplatte mit 96-Reaktionsnäpfen (Falcon) mit einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden nacheinander gegenüber rekombinanten OPG-Fc-Fusionsproteinen, anschließend wie oben beschrieben gegenüber sekundären Antikörpern exponiert, und die Zellen wurden zwischen jedem Schritt durch Zentrifugation gewaschen. Die Zellen wurden dann durch fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS) unter Verwendung eines Becton Dickinson FACscan analysiert.
Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde festgestellt, dass die murine myelomonozytische Zellinie 32D (ATCC-Zugangsnummer CRL-11346) ein Oberflächenmolekül exprimiert, das sowohl mit dem Maus-OPG[22-194]-Fc- als auch dem menschlichen OPG[22-201]-Fc-Fusionsprotein nachgewiesen werden konnte. Der sekundäre Antikörper alleine band nicht an die Oberfläche von 32D-Zellen, genauso wenig wie aufgereinigtes IgG1-Fc, was anzeigt, dass das Binden der OPG-Fc-Fusionsproteine aufgrund des OPG-Teils stattfand. Dieses Binden konnte in einer dosisabhängigen Weise durch die Hinzugabe von rekombinantem murinen oder menschlichen OPG[22–401]-Protein kompetitiert werden. Somit ist die OPG-Region, die für seine biologische Aktivität erforderlich ist, fähig, spezifisch an ein von 32D abgeleitetes Oberflächenmolekül zu binden.
Beispiel 2
Expressionsklonieren eines murinen OPG-bindenden Proteins
Eine cDNA-Bibliothek wurde aus 32D mRNA hergestellt und in den Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert. Exponentiell wachsende und in Gegenwart von rekombinantem Interleukin-3 gehaltene 32D-Zellen wurden geerntet, und die Gesamtzell-RNA wurde durch saure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extrahierung (Chomczynski und Sacchi. Anal. Biochem. 162, 156–159, (1987)) aufgereinigt. Die poly(A+)-mRNA-Fraktion wurde unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen aus dem Gesamt-RNA-Präparat durch Adsorption an und Elution von Dynabeads Oligo (dT) 25 (Dynal Corp) erhalten. Eine gerichtete, Oligo-dT-geprägte cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md) unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen hergestellt. Die sich ergebende cDNA wurde vollständig mit den Restriktionsendonukleasen SalI und NotI verdaut, dann durch Größenausschlussgelchromatographie fraktioniert. Die Fraktionen mit den höchsten Molekulargewichten wurden ausgewählt und dann in die Polylinker-Region des Plasmidvektors pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert. Dieser Vektor enthält stromaufwärtig zur Mehrfachklonierungsstelle den CMV-Promotor und steuert in eukaryontischen Zellen eine hohe Expression. Die Bibliothek wurde dann durch Elektroporation in kompetente E. coli (ElectroMAX DH10B, Gibco, NY) eingeführt und auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agar titriert. Die Bibliothek wurde anschließend in getrennte Pools eingeteilt, die ungefähr 1000 Klone/Pool enthielten, und man ließ 1,0 ml-Kulturen eines jeden Pools 16–20 Stunden lang bei 37°C wachsen. Aus jeder Kultur wurde Plasmid-DNA unter Verwendung des Qiagen Qiawell 96 Ultra Plasmid-Kits (Katalog Nr. 16191) nach den vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen hergestellt.
Eingeteilte Pools der 32D-cDNA-Expressionsbibliothek wurden einzeln in COS-7-Kulturen lipofektiert, dann auf den Erwerb eines OPG-bindenden Proteins auf der Zelloberfläche getestet. Dafür wurden COS-7-Zellen mit einer Dichte von 1 × 10⁶ pro ml in Gewebekulturplatten mit sechs Reaktionsnäpfen (Costar) ausplattiert, dann anschließend über Nacht in DMEM (Gibco) kultiviert, das 10% FCS enthielt. Ungefähr 2 μg Plasmid-DNA aus jedem Pool wurde in 0,5 ml serumfreiem DMEM verdünnt, dann durch Zentrifugation durch eine 0,2 μm-Spin-X-Säule (Costar) sterilisiert. Gleichzeitig wurden 10 μl Lipofectamin (Life Technologies Kat. Nr. 18324-012) zu einem getrennten Röhrchen hinzugegeben, das 0,5 ml serumfreies DMEM enthielt. Die DNA- und Lipofectamin-Lösungen wurden gemischt, und es wurde ihnen gestattet, bei Raumtemperatur 30 Min. lang zu inkubieren. Die COS-7-Zellkulturen wurden anschließend mit serumfreiem DMEM gewaschen, und die DNA-Lipofectamin-Komplexe wurden 2–5 Std. lang bei 37°C gegenüber den Kulturen exponiert. Nach dieser Zeitspanne wurde das Medium entfernt und durch 10% FCS enthaltendes DMEM ersetzt. Die Zellen wurden anschließend 48 Std. lang bei 37°C kultiviert.
Um Kulturen nachzuweisen, die ein OPG-bindendes Protein exprimieren, wurde das Wachstumsmedium entfernt, und die Zellen wurden mit PBS-FCS-Lösung gewaschen. Ein Volumen von 1,0 ml PBS-FCS, das 5 μg/ml menschliches OPG[22–201]-Fc-Fusionsprotein enthielt, wurden zu jedem Reaktionsnapf gegeben und 1 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS-FCS-Lösung gewaschen und dann in PBS, das 2% Paraformaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in PBS enthielt, 5 Min. lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Kulturen wurden einmal mit PBS-FCS gewaschen, dann 1 Std. lang bei 65°C inkubiert, während sie in PBS-FCS-Lösung eingetaucht waren. Den Kulturen wurde gestattet, abzukühlen, und die PBS-FCS-Lösung wurde abgesaugt. Die Kulturen wurden anschließend mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-Mensch-IgG (Fc-spezifischen) Antikörper (SIGMA Produkt Nr. A-9544) bei Raumtemperatur 30 Min. lang inkubiert, dann dreimal mit 20 mM Tris-Cl (pH 7,6) und 137 mM NaCl gewaschen. Immunkomplexe, die während dieser Schritte gebildet wurden, wurden durch das Testen auf die Aktivität von alkalischer Phosphatase unter Verwendung des Fast Red TR/AS-MX-Substrat-Kits (Pierce, Kat. Nr. 34034) unter Befolgung der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen nachgewiesen.
Mit diesem Ansatz wurden insgesamt ungefähr 300000 unabhängige 32D-cDNA-Klone gescreent, die durch 300 transfizierte Pools von jeweils 1000 Klonen repräsentiert wurden. Es wurde ein einzelner Reaktionsnapf identifiziert, der Zellen enthielt, die die Fähigkeit erworben hatten, spezifisch von dem OPG-Fc-Fusionsprotein dekoriert zu werden. Dieser Pool wurde durch sequenzielle sib-Selektionsrunden unterteilt, was einen einzelnen Plasmidklon 32D-F3 ergab (1A–F). Die Plasmid-DNA von 32D-F3 wurde dann in COS-7-Zellen transfiziert, die entweder mit sekundärem FITC-konjugiertem Ziegen-anti-Mensch-IgG Antikörper alleine, mit menschlichem OPG[22–201]-Fc-Fusionsprotein plus sekundärem oder mit ATAR-Fc-Fusionsprotein (ATAR ist auch als HVEM bekannt; Montgomery et al. Cell 87, 427–436 (1996)) immungefärbt wurden (2A–C). Der sekundäre Antikörper alleine band nicht an COS-7/32D-F3-Zellen, genauso wenig wie das ATAR-Fc-Fusionsprotein. Nur das OPG-Fc-Fusionsprotein band an die COS-7/32D-F3-Zellen, was anzeigt, dass 32D-F3 für ein OPG-bindendes Protein kodierte, das auf der Oberfläche von exprimierenden Zellen gezeigt war.
Beispiel 3
Die Sequenz des OPG-bindenden Proteins
Der oben isolierte 32D-F3-Klon enthielt eine Insertion von ungefähr 2,3 kb cDNA (1), die auf einem automatisierten Applied Biosystems 373A DNA-Sequenziergerät unter Verwendung von primergetriebenen Taq-Farbstoff-Abschluss-Reaktionen (Applied Biosystems) unter Einhaltung der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen in beiden Richtungen sequenziert wurde. Die sich ergebende erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit der DNA-Sequenzdatenbank unter Verwendung des FASTA-Programms (GCG, Universität Wisconsin) abgeglichen, und bezüglich der Anwesenheit langer offener Leserahmen (LORFs) unter Verwendung der „Sechs-Wege offener Leserahmen”-Anwendung (Frames) (GCG, Universität Wisconsin) analysiert. Ein LORF von 316 Aminosäure(aa)-Resten, der mit einem Methionin begann, wurde in der geeigneten Orientierung nachgewiesen, und vor ihm lag eine 5'-untranslatierte Region von etwa 150 bp. Die 5'-untranslatierte Region umfasste ein im Leserahmen liegendes Stop-Codon, das stromaufwärts zum vorausgesagten Startcodon lag. Dies zeigt, dass die Struktur des 32D-F3-Plasmids mit seiner Fähigkeit konsistent ist, die CMV-Promotorregion zu verwenden, um die Expression eines 316 aa-Genproduktes in Säugetierzellen zu steuern.
Die vorausgesagte Sequenz des OPG-bindenden Proteins wurde dann mit der vorhandenen Datenbank mit bekannten Proteinsequenzen unter Verwendung einer modifizierten Version des FASTA-Programms (Pearson, Meth. Enzymol. 183, 63–98 (1990)) verglichen. Die Aminosäuresequenz wurde auch unter Verwendung des Sequenzprofilverfahrens (Gribskov et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355–4359 (1987)), wie durch Lüethy et al. Protein Sci. 3, 139–146 (1994)) modifiziert, auf das Vorhandensein von spezifischen, in allen bekannten Mitgliedern der Tumornekrosefaktor(TNF)-Superfamilie konservierten Motiven analysiert. Es schien über das ganze OPG-bindende Protein eine erhebliche Homologie zu verschiedenen Mitgliedern der TNF-Superfamilie zu geben. Das Maus-OPG-bindende Protein schien mit den Maus- und den menschlichen Homologen von sowohl TRAIL als auch dem CD40-Liganden am nächsten verwandt zu sein. Eine weitere Analyse der Sequenz des OPG-bindenden Proteins zeigte eine starke Übereinstimmung mit der TNF-Superfamilie mit einem höchst signifikanten Z-Wert von 19,46.
Die Aminosäuresequenz des OPG-bindenden Proteins enthält eine mutmaßliche hydrophobe Transmembrandomäne, die bei einem M49 beginnt und bis zu L69 reicht. Auf der Grundlage dieser Konfiguration relativ zum Methionin-Startcodon wurde vorausgesagt, dass das OPG-bindende Protein ein Typ II-Transmembranprotein mit einer kurzen N-terminalen intrazellulären Domäne und einer längeren C-terminalen extrazellulären Domäne (4A–F) ist. Dies wäre zu allen bekannten Mitgliedern der TNF-Familien, mit der Ausnahme von Lymphotoxin alpha (Nagata und Golstein, Science 267, 1449–1456 (1995)), ähnlich.
Beispiel 4
Expression der mRNA von menschlichem OPG-bindenden Protein
Zahlreiche Northern Blots mit menschlichem Gewebe (Clontech, Palo Alto, CA) wurden mit einem ³²P-dCTP-markierten 32D-F3-Restriktionsfragment sondiert, um die Größe des menschlichen Transkriptes nachzuweisen und die Expressionsmuster zu bestimmen. Die Northern Blots wurden in 5X SSPE, 50% Formamid, 5X Denhardt'scher Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA 2–4 Std. lang bei 42°C vorhybridisiert. Die Blots wurden anschließend in 5X SSPE, 50% Formamid, 2X Denhardt'scher Lösung, 0,1% SDS, 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 5 ng/ml markierter Sonde 18–24 Std. lang bei 42°C hybridisiert. Die Blots wurden dann 10 Min. lang bei Raumtemperatur in 2X SSC, 10 Min. lang bei 50°C in 1X SSC und anschließend 10–15 Min. lang in 0,5 X SSC gewaschen.
Unter Verwendung einer aus der Maus-cDNA abgeleiteten Sonde und unter Hybridisierung unter stringenten Bedingungen wurde eine überwiegende mRNA-Spezies mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 2,5 kb in den Lymphknoten nachgewiesen (3). Ein schwaches Signal wurde beim gleichen relativen Molekulargewicht auch in der mRNA von fötaler Leber nachgewiesen. In den anderen untersuchten Geweben wurden keine Transkripte des OPG-bindenden Proteins nachgewiesen. Diese Daten legen nahe, dass die Expression der mRNA von OPG-bindendem Protein in den menschlichen Geweben extrem begrenzt war. Die Daten zeigen auch an, dass der isolierte cDNA-Klon sehr nahe an der Größe des nativen Transkriptes liegt, was nahelegt, dass 32D-F3 ein Vollängen-Klon ist.
Beispiel 5
Molekulares Klonieren des menschlichen OPG-bindenden Proteins
Das menschliche Homolog des OPG-bindenden Proteins wird in menschlichen peripheren Lymphknoten in der Form einer ungefähr 2,5 kb langen mRNA exprimiert und durch Hybridisierung mit einer Maus-cDNA-Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nachgewiesen. Für das OPG-bindende Protein kodierende DNA wird durch das Screenen einer cDNA-Bibliothek von menschlichem Lymphknoten entweder durch Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von Plaques rekombinanter Phagen oder von Kolonien transformierter Bakterien erhalten, (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, New York (1989)). Zu diesem Zweck wird die Phagen- oder Plasmid-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von radioaktiv markierten Sonden gescreent, die von dem murinen OPG-bindendem Protein-Klon 32D-F3 abgeleitet waren. Die Sonden werden verwendet, um Nitrozellulosefilter zu screenen, die von einer ausplattierten Bibliothek abgenommen wurden. Diese Filter werden vorhybridisiert und anschließend unter den in Beispiel 4 angegebenen Bedingungen hybridisiert, was letztendlich aufgereinigte Klone der cDNA des menschlichen OPG-bindenden Proteins ergibt. Aus einem jeden Klon mit menschlichem OPG-bindenden Protein erhaltene Insertionen würden sequenziert und analysiert, wie in Beispiel 3 beschrieben ist.
Eine poly A+-RNA aus menschlichem Lymphknoten (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) wurde mit Hinblick auf das Vorhandensein von OPG-bp-Transkripten analysiert, wie zuvor in US Seriennummer 08/577,788, eingereicht am 22. Dezember 1995, beschrieben ist. Ein unter stringenten Bedingungen mit einer 32P-markierten Maus-OPG-bp-Sonde sondierter Northern Blot dieser RNA-Probe zeigte das Vorhandensein von menschlichen OPG bp-Transkripten. Eine oligo-dT-geprägte cDNA-Bibliothek wurde dann aus der Lymphknoten-mRNA unter Verwendung des SuperScript-Kits (GIBCO life Technologies, Gaithersberg, MD) synthetisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben ist. Die sich ergebende cDNA wurde nach ihrer Größe ausgewählt, und die Fraktion mit hohem Molekulargewicht in den Plasmidvektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert. Elektrokompetente E. coli DH10 (GIBCO life Technologies, Gaithersberg, MD) wurden transformiert, und 1 × 10⁶ gegen Ampicillin-resistente Transformanten wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung einer 32P-markierten Sonde für Maus-OPG-bindendes Protein gescreent.
Ein Plasmidklon der mutmaßlich cDNA menschlichen OPG-bindenden Proteins wurde isoliert, phuOPGbp-1.1 und enthielt eine 2,3 kp-Insertion. Die sich ergebende Nukleotidsequenz der phuOPGbp-1.1-Insertion war zu der cDNA-Sequenz des Maus-OPG-bindenden Proteins zu ungefähr 80–85% homolog. Die Translation der DNA-Sequenz der Insertion zeigte das Vorhandensein eines langen offenen Leserahmens an, von dem vorausgesagt wurde, dass er für ein 317 aa-Polypeptid kodiert (4A–F). Ein Vergleich der Maus- und Menschen-OPG-bp-Polypeptide zeigt, dass sie zu ~87% identisch sind, was anzeigt, dass dieses Protein während der Evolution hoch konserviert ist.
Die DNA- und Proteinsequenzen des menschlichen OPG-bindenden Proteins waren nicht in Genbank vorhanden, und es gab keine homologen EST-Sequenzen. Wie bei dem murinen Homolog zeigt das menschliche OPG-bindende Protein starke Sequenzähnlichkeiten zu allen Mitgliedern der TNFα-Zytokin-Superfamilie.
Beispiel 6
Klonieren und bakterielle Expression des OPG-bindenden Proteins
PCR-Amplifikationen unter Verwendung der Primerpaare und der Matrize, die unten beschrieben sind, werden verwendet, um verschiedene Formen von murinen OPG-bindenden Proteinen zu erzeugen. Ein Primer von jedem Paar führt ein TAA-Stopcodon und eine einzige XhoI- oder SacII-Stelle nach dem C-Terminus des Gens ein. Der andere Primer eines jeden Paares führt eine einzige NdeI-Stelle, ein N-terminales Methionin und optimierte Codons für den aminoterminalen Teil des Gens ein. Die PCR und das Thermozyklisieren werden unter Verwendung von standardgemäßen rekombinante DNA-Techniken durchgeführt. Die PCR-Produkte werden aufgereinigt, restriktionsverdaut und in die einzigen NdeI- und XhoI- oder SacII-Stellen des Vektors pAMG21 (ATCC-Zugangsnummer 98113) eingefügt und in den prototrophen E. coli 393 oder 2596 transformiert. Andere üblicherweise verwendete E. coli-Expressionsvektoren und Wirtszellen sind zur Expression ebenfalls geeignet. Nach der Transformierung werden die Klone ausgewählt, Plasmid-DNA isoliert, und die Sequenz der Insertion mit dem OPG-bindenden Protein bestätigt.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [75–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 242 Aminosäuren aufwies und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met(75)-Asp-Pro-Asn-Arg-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR zu verwendende Matrize war pcDNA/32D-F3, und die Oligonukleotide #1581-72 und #1581-76 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes verwendet wurde.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [95–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 223 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met-His(95)-Glu-Asn-Ala-Gly-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR verwendete Matrize war pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1591-90 und #1591-95 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes verwendet wurde.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [107–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 211 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met-Ser(107)-Glu-Asp-Thr-Leu-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR verwendete Matrize war pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1591-93 und #1591-95 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes verwendet wurde.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [118–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 199 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met(118)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR verwendete Matrize war pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1591-94 und #1591-95 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes verwendet wurde.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [128–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 190 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met-Lys(128)-Glu-Leu-Gln-His-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR verwendete Matrize war pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1591-91 und #1591-95 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes verwendet wurde.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [137–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 181 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met-Gln(137)-Arg-Phe-Ser-Gly-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR verwendete Matrize war pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1591-92 und #1591-95 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes verwendet wurde.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [146–316]
Dieses Konstrukt ist so konstruiert, dass es eine Länge von 171 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufweist, nämlich NH₂-Met(146)-Glu-Gly-Ser-Trp--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR zu verwendende Matrize ist das oben beschriebene pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [75–316], und die Oligonukleotide #1600-98 und #1581-76 werden das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes zu verwendende Primerpaar sein.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [156–316]
Dieses Konstrukt ist so konstruiert, dass es eine Länge von 162 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufweist, nämlich NH₂-Met-Arg(156)-Gly-Lys-Pro--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR zu verwendende Matrize ist pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [158–316] unten und die Oligonukleotide #1619-86 und #1581-76 werden das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes zu verwendende Primerpaar sein.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [158–316]
Dieses Konstrukt wurde so konstruiert, dass es eine Länge von 160 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met-Lys(158)-Pro-Glu-Ala--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR zu verwendende Matrize war pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1581-73 und #1581-76 waren das Primerpaar, das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes zu verwenden war.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [166–316]
Dieses Konstrukt ist so konstruiert, dass es eine Länge von 152 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufweist, nämlich NH₂-Met-His(166)-Leu-Thr-Ile--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR zu verwendende Matrize ist pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1581-75 und #1581-76 werden das für die PCR und das Klonieren dieses Genkonstruktes zu verwendende Primerpaar sein.
pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [168–316]
Dieses Konstrukt ist so konstruiert, dass es eine Länge von 150 Aminosäuren und die folgenden N-terminalen und C-terminalen Reste aufwies, nämlich NH₂-Met-Thr(168)-Ile-Asn-Ala--------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Die für die PCR zu verwendende Matrize ist pcDNA/32D-F3 und die Oligonukleotide #1581-74 und #1581-76 werden das für die PCR und das Klonieren zu verwendende Primerpaar sein.
Es wird verstanden, dass die obigen Konstrukte Beispiele sind und der Fachmann unter Verwendung der hier dargelegten allgemeinen Vorgehensweise leicht andere Formen des OPG-bindenden Proteins erhalten kann.
Die rekombinanten bakteriellen Konstrukte von pAMG21-murines OPG-bindendes Protein [75–316], [95–316], [107–316], [118–316], [128–316], [137–316] und [158–316] wurden kloniert, die DNA-Sequenz bestätigt, und das Ausmaß der Expression des rekombinanten Genproduktes nach Induktion untersucht. Alle Konstrukte riefen eine Menge an rekombinantem Genprodukt hervor, das nach einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und nach dem Färben mit Coomassie von rohen Lysaten leicht sichtbar waren. Das Wachstum von transformierten E. coli 393 oder 2596, die Induktion der Expression von OPG-bindendem Protein und die Isolierung von OPG-bindendem Protein enthaltenden Einschlusskörpern wird gemäß Vorgehensweisen durchgeführt, die in PCT WO97/23614 beschrieben sind. Die Aufreinigung von OPG-bindenden Proteinen aus den Einschlusskörpern erfordert die Löslichmachung und die Renaturierung des OPG-bindenden Proteins unter Verwendung von Vorgehensweisen, die dem Fachmann auf dem Gebiet zur Verfügung stehen. Man stellte fest, dass rekombinantes murines OPG-bindendes Protein [158–316] hauptsächlich in unlöslicher Form hergestellt wurde, dass aber etwa 40% davon in der löslichen Fraktion festgestellt wurde. Das rekombinante Protein wurde wie unten beschrieben aus der löslichen Fraktion gereinigt, und seine Bioaktivität untersucht.
Beispiel 7
Aufreinigung von rekombinantem murinem OPG-bindendem Protein [158–316]
Gefrorene bakterielle Zellen, die exprimiertes murines OPG-bindendes Protein (158–316) enthielten, wurden aufgetaut und in 20 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA resuspendiert. Die Zellsuspension (20% Gew./Vol.) wurde anschließend über drei Durchgänge durch einen Mikrofluidisierer homogenisiert. Die Suspension der lysierten Zellen wurde in einen JA14-Rotor bei 10.000 Upm 45 Minuten lang zentrifugiert. Eine SDS-PAGE-Analyse zeigte eine Bande bei einem Molekulargewicht von ungefähr 18 kd, die sowohl in den Einschlusskörpern als auch im Überstand sichtbar war. Die lösliche Fraktion wurde dann auf eine Pharmacia SP-Sepharose-4FF-Säule aufgebracht, die mit 10 mM MES pH 6,0 äquilibriert war. Das OPG-bindende Protein wurde mit einem Gradienten aus 0–0,4 M NaCl in MES pH 6,0 über 20 Säulenvolumen eluiert. OPG-bindendes Protein enthaltende Fraktionen wurden dann auf eine ABX Bakerbond-Säule aufgebracht, die mit 20 mM MES pH 6,0 äquilibriert war. Das OPG-bindende Protein wurde mit einem 15CV-Gradienten aus 0–0,5 M NaCl in MES pH 6,0 eluiert. Das Endprodukt war nach SDS-PAGE zu über 95% homogen. N-terminales Sequenzieren ergab die folgende Sequenz: Met-Lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His, die als diejenige identifiziert wurde, die für ein am Rest 158 (mit einem Starter-Methionin) beginnendes Polypeptid vorausgesagt war. Das relative Molekulargewicht des Proteins während der SDS-PAGE ändert sich nach einer Reduzierung nicht.
Beispiel 8
In vitro-Bioaktivität von rekombinantem löslichem OPG-bindendem Protein
Von rekombinantem OPG-Protein wurde früher gezeigt, dass es die Vitamin D3-abhängige Osteoklastenbildung aus Knochenmark und Milzvorläufern in einem Osteoklasten-Bildungstest blockiert, wie in US Seriennummer 08/577,788 beschrieben ist. Weil OPG-bindendes Protein an OPG bindet und ein neues Mitglied der TNF-Liganden-Familie ist, ist es ein potentielles Ziel der OPG-Bioaktivität. Rekombinantes lösliches OPG-bindendes Protein (158–316), das den minimalen Kern der TNFα-artigen Domäne repräsentiert, wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit untersucht, die Osteoklastendifferenzierung aus Osteoklastenvorläufern zu modulieren. Knochenmarkzellen wurden aus den Femuren adulter Mäuse isoliert und mit M-CSF behandelt. Die nicht adhärierende Fraktion wurde mit ST2-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von sowohl Vitamin D3 als auch Dexamethason co-kultiviert. Wie früher gezeigt worden ist, entwickeln sich Osteoklasten nur aus Co-Kulturen, die Stromazellen (ST2), Vitamin D3 und Dexamethason enthalten. Verschiedene Konzentrationen von rekombinantem löslichem OPG-bindendem Protein, die von 0,16 bis 500 ng/ml reichten, wurden hinzugegeben und die Osteoklastenreifung wurde durch den TRAP-Lösungstest und durch visuelle Beobachtung bestimmt. OPG-bindendes Protein stimulierte die Osteoklastendifferenzierung und -reifung in einer dosisabhängigen Weise stark, wobei die halbmaximalen Wirkungen im Bereich von 1–2 ng/ml auftraten, was nahelegt, dass es als ein wirksamer Induktor der Osteoklastengenese in vitro wirkt (5). Die Wirkung von OPG-bindendem Protein wird durch rekombinantes OPG blockiert (6).
Um zu untersuchen, ob OPG-bindendes Protein das Stroma und hinzugegebene Steroide ersetzen könnte, wurden Kulturen unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von M-CSF etabliert, um das Wachstum von Osteoklastenvorläufern zu fördern, und verschiedene Mengen des OPG-bindenden Proteins wurden ebenfalls hinzugefügt. Wie in 6 gezeigt ist, stimulierte OPG-bindendes Protein die TRAP-Aktivität in einer dosisabhängigen Weise, und die Größenordnung der Stimulierung hing von der Konzentration des hinzugegebenen M-CSF ab, was nahelegt, dass diese beiden Faktoren zusammen ausschlaggebend für die Entwicklung der Osteoklasten sind. Um die biologische Relevanz dieser letzten Beobachtung zu bestätigen, wurden Kulturen auf bovinen kortikalen Knochenschnitten etabliert und die Wirkungen von M-CSF und OPG-bindendem Protein entweder alleine oder zusammen untersucht. Wie in den 7A–C gezeigt ist, stimulierte OPG-bindendes Protein in Gegenwart von M-CSF die Bildung von großen TRAP-positiven Osteoklasten, die die Knochenoberfläche angegriffen, was zu Löchern führte. Somit wirkt OPG-bindendes Protein als ein die Osteoklastengenese stimulierender (Differenzierungs-)Faktor. Dies legt nahe, dass OPG die Osteoklastenentwicklung durch das Sequestrieren des OPG-bindenden Proteins blockiert.
Beispiel 9
In vivo-Aktivität von rekombinantem löslichen OPG-bindenden Protein
Auf der Grundlage von in vitro-Versuchen ist in E. coli hergestelltes rekominantes murines OPG-bindendes Protein [158–316] ein wirksamer Induktor der Entwicklung von Osteoklasten aus myeloiden Vorläufern. Um seine Wirkungen in vivo zu bestimmen, erhielten männliche, 4–5 Wochen alte BDF1-Mäuse (Charles River Laboratories) subkutane Injektionen von OPG-bindendem Protein [158–316] drei Tage lang zweimal am Tag und am Morgen des vierten Tages (Tage 0, 1, 2 und 3). Fünf Gruppen von Mäusen (n = 4) erhielten Träger alleine oder 1, 5, 25 oder 100 μg/des OPG-bindenden Proteins [158–316] pro Tag. Zusätzliche 5 Gruppen von Mäusen (n = 4) erhielten die obigen Dosen an Träger oder an OPG-bindendem Protein [158–316] und zusätzlich dazu menschliches Fc-OPG [22–194] bei einer Konzentration von 1 mg/kg/Tag (ungefähr 20 μg/Tag) durch eine einzelne tägliche subkutane Injektion. Das ionisierte Kalzium im Vollblut wurde vor der Behandlung am Tag 0 und 3–4 Stunden nach der ersten täglichen Injektion von OPG-bindendem Protein [158–316] an den Tagen 1, 2 und 3 bestimmt. Die Mäuse wurden vier Stunden nach der letzten Injektion am Tag 3 geopfert und es wurden Radiogramme angefertigt.
Eine Rekombinante von OPG-bindendem Protein [158–316] führte nach zwei Tagen Behandlung bei einer Dosis von 5 μg/Tag und höher zu einer erheblichen Erhöhung des ionisierten Kalziums im Blut (8). Die Schwere der Hyperkalziämie zeigte eine wirksame Induktion der Osteoklastenaktivität, die das Ergebnis einer erhöhten Knochenresorption war. Eine gleichzeitige OPG-Verabreichung begrenzte die Hyperkalziämie bei Dosen von OPG-bindendem Protein [158–316] von 5 und 25 μg/Tag, aber nicht bei 100 μg/Tag. Diese gleichen Tiere wurden durch Radiographie analysiert, um zu bestimmen, ob es irgendwelche durch Röntgen sichtbare Wirkungen auf die Knochenmineraliendichte gab (9A–D). Rekombinantes OPG-bindendes Protein [158–316], das 3 Tage lang injiziert wurde, verringerte die Knochendichte in der proximalen Tibia von Mäusen in einer dosisabhängigen Weise. Die Verringerung der Knochendichte war bei Mäusen, die 100 μg/Tag erhielten, besonders augenscheinlich, was bestätigt, dass die ausgeprägte Hyperkalziämie bei diesen Tieren durch eine erhöhte Knochenresorption und die sich daraus ergebende Abgabe von Kalzium aus dem Skelett hervorgerufen wurde. Diese Daten zeigen klar, dass das OPG-bindende Protein [158–316] in vivo so wirkt, dass es die Knochenresorption fördert, was zu einer systemischen Hyperkalziämie führt, und dass rekombinantes OPG diese Wirkungen aufhebt.
Beispiel 10
Klonieren und Expression von löslichem OPG-bindendem Protein in Säugetierzellen
Der Volllängen-Klon von murinem und menschlichem OPG-bindendem Protein kann in Säugetierzellen wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben exprimiert werden. Alternativ können die cDNA-Klone so modifiziert werden, dass sie für sekretierte Formen des Proteins kodieren, wenn es in Säugetierzellen exprimiert wird. Um dies zu erreichen, könnte das natürliche 5'-Ende der cDNA, das für das Startcodon kodiert und ungefähr über die ersten 69 Aminosäuren des Proteins reicht, einschließlich der Transmembran-umspannenden Region, durch eine Signalpeptid-Leadersequenz ersetzt werden. Zum Beispiel können für das Startcodon und das Signalpeptid eines bekannten Gens kodierende DNA-Sequenzen an die cDNA-Sequenz des OPG-bindenden Proteins angespleißt werden, die irgendwo nach der Region beginnt, die für den Aminosäurerest 68 kodiert. Bezüglich den sich dabei ergebenden rekombinanten Klonen wird vorausgesagt, dass sie sekretierte Formen des OPG-bindenden Proteins in Säugetierzellen produzieren und dass sie posttranslationale Modifikationen wie beispielsweise eine Glycosylierung durchlaufen sollten, die normalerweise an der C-terminalen extrazellulären Domäne des OPG-bindenden Proteins auftreten. Unter Verwendung dieser Strategie wurde eine sekretierte Form des OPG-bindenden Proteins konstruiert, die an ihrem 5'-Ende das murine OPG-Signalpeptid und an ihrem 3'-Ende die menschliche IgG1-Fc-Domäne aufweist. Der Plasmidvektor pCEP4/muOPG[22-401]-Fc, wie beschrieben in US-Seriennummer 08/577,788, eingereicht am 22. Dezember 1995, wurde mit NotI verdaut, um zwischen dem 3'-Ende von OPG und dem Fc-Gen zu schneiden. Die linearisierte DNA wurde dann teilweise mit XmnI verdaut, um nur zwischen den Resten 23 und 24 des OPG zu schneiden und dabei ein glattes Ende zu hinterlassen. Die Restriktionsverdaue wurden dann mit CIP dephosphorylisiert, und der Vektorteil dieser Verdaue (einschließlich der Reste 1–23 von OPG und Fc) wurde über ein Gel aufgereinigt.
Die cDNA-Region des murinen OPG-bindenden Proteins, die für die Amionsäurereste 69–316 kodiert, wurde unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Stratagene, San Diego, CA) durch PCR ausgehend von der Plasmid-Matrize unter Verwendung der folgenden Oligonukleotide als Primer vervielfältigt:
Das 1602-61-Oligonukleotid vervielfältigt das 5'-Ende des Gens und enthält eine künstliche StuI-Stelle. Der 1602-59-Primer vervielfältigt das 3'-Ende des Gens und enthält eine künstliche NotI-Stelle. Das sich ergebende erhaltene PCR-Produkt wurde mit NotI und StuI verdaut und anschließend über ein Gel aufgereinigt. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mit Vektor ligiert und anschließend verwendet, um elektrokompetente E. coli-DH10B-Zellen zu transformieren. Der sich ergebende Klon wurde sequenziert, um die Integrität der amplifizierten Sequenz und der Restriktionsstellenübergänge zu bestätigen. Dieses Plasmid wurde anschließend verwendet, um menschliche 293-Fibroblasten zu transfizieren, und das OPG-bindende Protein Fc-Fusionsprotein wurde aus Kulturmedien gewonnen, wie es früher in der US-Seriennummer 08/577,788, eingereicht am 22. Dezember 1995, beschrieben ist.
Unter Verwendung einer ähnlichen Strategie wurde ein Expressionsvektor konstruiert, der fähig ist, eine N-terminal verkürzte Version zu exprimieren, die an die menschliche IgG1-Fc-Domäne fusioniert ist. Dieses Konstrukt besteht aus dem murinen OPG-Signalpeptid (aa-Rest 1–21), das im Leserahmen an die Reste 158–316 des murinen OPG-bindenden Proteins fusioniert ist, gefolgt von einer Fusion im Leserahmen an die menschliche IgG1-Fc-Domäne. Um dies zu bewerkstelligen, wurde der Plasmidvektor pCEP4/murines OPG [22–401] (US-Seriennummer 08/577,788, eingereicht am 22. Dezember 1995) mit HindIII und NotI verdaut, um den gesamten OPG-Leserahmen zu entfernen. Murines OPG-bindendes Protein mit den Resten 158–316 wurde durch PCR unter Verwendung der Plasmid-Matrize pcDNA/32D-F3 und der folgenden Primer amplifiziert:
1616-44 vervielfältigt das OPG-bindende Protein, das am Rest 158 beginnt und ebenso die Reste 16–21 des muOPG-Signalpeptids mit einer künstlichen XhoI-Stelle enthält. 1602-59 amplifiziert das 3'-Ende des Gens und fügt eine NotI-Stelle im Leserahmen hinzu. Das PCR-Produkt wurde mit NotI und XhoI verdaut und dann über ein Gel aufgereinigt.
Die folgenden komplementären Primer wurden aneinander anelliert, um einen Adapter zu bilden, der für das murine OPG-Signalpeptid und die Kozak-Sequenz kodiert, die die Translationsinitiationsstelle umgibt:
Diese Primer wurden anelliert, wodurch 5'-Überhänge erzeugt wurden, die mit HindIII am 5'-Ende und XhoI am 3'-Ende kompatibel waren. Der oben erhaltene verdaute Vektor, die anellierten Oligonukleotide und das verdaute PCR-Fragment wurden miteinander ligiert und in DH10B-Zellen elektroporiert. Der sich ergebende Klon wurde sequenziert, um einen authentischen Wiederbau des Übergangs zwischen dem Signalpeptid, dem Fragment des OPG-bindenden Proteins, das für die Reste 158–316 kodiert, und der IgG1-Fc-Domäne zu bestätigen. Das rekombinante Plasmid wurde aufgereinigt, in menschliche 239-Fibroblasten transfiziert und in der Form eines Produktes aus konditioniertem Medium wie oben beschrieben exprimiert.
Murine und menschliche Volllängen-cDNAs wurden in den pCEP4-Expressionsvektor (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert und dann wie in Beispiel 1 beschrieben in Kulturen menschlicher 293-Fibroblasten transfektiert. Die Zellkulturen wurden mit Hygromycin selektiert, wie oben beschrieben, und serumfreies konditioniertes Medium wurde hergestellt. Das konditionierte Medium wurde gegenüber einer Säule mit immobilisiertem rekombinantem OPG exponiert, und die abdeckenden Formen von murinem und menschlichem rekombinanten OPG-bp wurden affinitätsgereinigt. Eine N-terminale Sequenzanalyse der aufgereinigten löslichen OPG-bindenden Proteine zeigt an, dass das murine Protein bevorzugterweise vor Phenylalanin 139 gespalten wird und dass das menschliche Protein bevorzugterweise vor dem homologen Rest, Isoleucin 140, gespalten wird. Zusätzlich wird das menschliche Protein auch bevorzugterweise vor Glycin 145 gespalten. Dies legt nahe, dass natürlich vorkommende lösliche Formen des menschlichen OPG-bindenden Proteins N-terminale Reste entweder an Isoleucin an der Position 140 oder Glycin an der Position 145 aufweisen.
Beispiel 11
Peptide des OPG-bindenden Proteins und Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen das Protein
Antikörper gegen spezifische Regionen des OPG-bindenden Proteins können durch Immunisierung mit Peptiden aus dem OPG-bindenden Protein erhalten werden. Diese Peptide können alleine verwendet werden oder es können konjugierte Formen des Peptides für das Immunisieren verwendet werden.
Die Kristallstruktur von reifem TNFα wurde beschrieben [E. Y. Jones, D. I. Stuart und D. P. C. Walker (1990) J. Cell Sci. Suppl. 13, 11–18], und das Monomer bildet ein antiparalleles β-Faltblatt-Sandwich mit einer Marmeladenbrötchen-Topologie. In dieser Kristallstruktur werden zehn antiparallele β-Stränge beobachtet und diese bilden ein beta-Sandwich, wobei ein Beta-Strang aus den Strängen B'BIDG und der andere aus den Strängen C'CHEF besteht [E. Y. Jones et al., ebenda]. Zwei Schleifen des reifen TNFαs wurden aufgrund von Mutagenese-Untersuchungen mit dem Ausbilden von Kontakten mit dem Rezeptor in Verbindung gebracht; diese sind die Schleifen, die zwischen den Beta-Strängen B & B' und der Schleife zwischen den Beta-Strängen E & F gebildet werden [C. R. Goh, C-S. Loh und A. G. Porter (1991) Protein Engineering 4, 785–791]. Die Kristallstruktur des zwischen TNFβ und der extrazellulären Domäne des 55 kd-TNF-Rezeptors (TNF-R55) gebildeten Komplexes wurde aufgelöst, und die Kontakte zwischen Rezeptor und Ligand wurden beschrieben [D. W. Banner, A. D'Arcy, W. Janes, R. Gentz, H-J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher und W. Lesslauer (1993) Cell 73, 431–445]. In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Mutageneseuntersuchungen [C. R. Goh et al., ebenda] wurde festgestellt, dass die entsprechenden Schleifen BB' und EF des Liganden TNFβ in der aufgelösten Kristallstruktur des TNFb:TNF-R55-Komplexes die Mehrheit der Kontakte mit dem Rezeptor ausbilden. Die Aminosäuresequenz des murinen OPG-bindenden Proteins wurde mit den Aminosäuresequenzen von TNFα und TNFβ verglichen. Die Regionen des murinen OPG-bindenden Proteins, die den BB'- und EF-Schleifen entsprechen, wurden auf der Grundlage dieses Vergleiches vorausgesagt und es wurden Peptide konstruiert, die unten beschrieben sind.
A. Antigen(e):

Rekombinantes murines OPG-bindendes Protein [158–316] wurde wie unten beschrieben als Antigen (ag) zum Immunisieren von Tieren verwendet, und das Serum wird unter Verwendung von Ansätzen untersucht werden, die unten beschrieben sind. Peptide der mutmaßlichen BB'- und EF-Schleifen des murinen OPG-bindenden Proteins wurden synthetisiert und werden für Immunisierungen verwendet werden; diese Peptide sind:

BB'-Schleifen-Peptid:	NH2--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKIS-COOH (SEQ ID NO: 33)
BB'-Schleifen-Cys-Peptid:	NH2--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC-COOH (SEQ ID NO: 34)
EF-Schleifen-Peptid:	NH2--VYVVKTSIKIPSSHNLM-COOH (SEQ ID NO: 35)
EF-Schleifen-Cys-Peptid:	NH2--VYVVKTSIKIPSSHNLMC-COOH (SEQ ID NO: 35)

Peptide mit einem C-terminalen Cysteinrest wurden für die Konjugation unter Verwendung von Ansätzen verwendet, die unten in Abschnitt B beschrieben sind, und für die Immunisierung verwendet.
B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin- oder Rinderserumalbumin-Konjugation:
Ausgewählte Peptide oder Proteinfragmente können mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) konjugiert werden, um ihre Immunogenität in Tieren zu erhöhen. Es können auch mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugierte Peptide oder Proteinfragmente in dem EIA-Protokoll verwendet werden. Imject Maleimid-aktiviertes KLH oder BSA (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) wird in dH₂O wieder auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml wieder in Lösung gebracht. Peptid- oder Proteinfragmente werden in Phosphatpuffer aufgelöst, dann mit einer äquivalenten Masse (g/g) KLH oder BSA gemischt. Man erlaubt, dass die Konjugation 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (rt) unter sanftem Rühren reagiert. Die Lösung wird anschließend über eine Entsalzungssäule laufengelassen oder über Nacht gegen PBS dialysiert. Das Peptidkonjugat wird bei –20°C gelagert, bis es für Immunisierungen oder bei EIAs verwendet wird.
C. Immunisierung:
Balb/c-Mäusen (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA), Lou-Ratten oder New Zealand White-Kaninchen wird subkutan (SQI) in vollständigem Freund'schem Adjuvans (CFA, 50% Vol./Vol.; Difco Laboratories, Detroit MI) emulgiertes AG (50 μg, 150 μg bzw. 100 μg) injiziert. Die Kaninchen wurden zwei bis dreimal in 2 Wochen-Abständen aufgefrischt, wobei das Peptid in einer ähnlichen Weise in unvollständigem Freund'schem Adjuvans (ICFA; Difco Laboratories, Detroit, MI) zubereitet wurde. Mäuse und Ratten wurden ungefähr alle 4 Wochen aufgefrischt. Sieben Tage nach der zweiten Auffrischung werden Testblutabnahmen durchgeführt und die Serumantikörpertiter werden bestimmt. Wenn sich bei Kaninchen ein Titer entwickelt hat, werden über 6 aufeinanderfolgende Wochen wöchentliche 50 ml Blut abgenommen. Mäuse und Ratten werden hinsichtlich der Hybridomproduktion auf der Grundlage der Serumtiterkonzentrationen ausgewählt; Tiere mit halbmaximalen Titern, die höher als 5000 sind, werden verwendet. Anpassungen an dieses Protokoll können von einem Fachmann auf dem Gebiet vorgenommen werden; zum Beispiel sind nun verschiedene Arten von Immunmodulatoren verfügbar und können in dieses Protokoll aufgenommen werden.
D. Enzym-verbundener Immunosorbenstest (EIA):
EIAs werden durchgeführt werden, um die Serumantikörper(AK)-Titer von einzelnen Tieren zu bestimmen, und später zum Screenen auf potentielle Hybridome. Mit flachem Boden ausgestattete, stark bindende Mikrotiter-EIA/RIA-Platten mit 96 Reaktionsnäpfen (Costar Corporation, Cambridge, MA) werden mit aufgereinigtem rekombinantem Protein oder Proteinfragment (Antigen, AG) bei 5 μg pro ml in Carbonat-Hydrogencarbonatpuffer, pH 9,2 (0,015 M Na₂CO₃, 0,035 M NaHCO₃) beschichtet werden. Die Proteinfragmente können mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert werden, wenn dies nötig ist. 50 μl AG werden zu jedem Napf hinzugegeben werden. Die Platten werden dann mit Acetatfilm (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA) abgedeckt und werden bei Raumtemperatur (rt) auf einer schaukelnden Plattform 2 Stunden lang oder über Nacht bei 4°C inkubiert werden. Die Platten werden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 250 μl pro Napf 5% BSA-Lösung geblockt werden, die durch das Mischen von einem Teil BSA Verdünnungsmittel/Blockierungslösungskonzentrat (Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) mit einem Teil deionisiertem Wasser (dH₂O) hergestellt ist. Nach dem Verwerfen der Blockierungslösung werden 50 μl von 2-fachen Serumverdünnungen (1:100 bis 1:12800) oder Hybridomgewebekulturüberstände zu jedem Napf hinzugegeben werden. Das Serumverdünnungsmittel ist 1% BSA (10% BSA Verdünnungsmittel/Blockierungslösungskonzentrat 1:10 verdünnt in Dulbecco's phosphat-gepufferte Saline, D-PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY)), während die Hybridomüberstände unverdünnt untersucht werden. Im Falle des Hybridomscreenings wird ein Napf als Konjugatkontrolle beibehalten werden und ein zweiter Napf als eine positive AK-Kontrolle. Die Platten werden dann wiederum 1 Stunde lang bei Raumtemperatur schaukelnd inkubiert, dann viermal unter Verwendung einer 1x-Zubereitung von 20x Konzentrat-Waschlösung (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) in dH₂O gewaschen werden. In 1% BSA verdünnter Meerrettichperoxidase-konjugierter sekundärer Antikörper (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) wird dann 30 Minuten lang in einem jeden Napf inkubiert. Die Platten werden wie zuvor gewaschen, trocken getupft, und ABTS-Peroxidase-Einzelbestandteilsubstrat (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) wird hinzugegeben. Die Extinktion bei 405 nm wird für jeden Napf unter Verwendung eines Mikroplatten-EL310-Lesegerätes (Bio-tek Instruments, Inc., Winooski, VT) abgelesen. Der halbmaximale Titer des Serumantikörpers wird durch das Auftragen des log₁₀ der Serumverdünnung gegen die optische Dichte bei 405 und das anschließende Extrapolieren am 50%-Punkt der maximalen optischen Dichte, die für das Serum erhalten wurde, berechnet. Hybridome werden als positiv ausgewählt, wenn die Werte der optischen Dichte mehr als 5-fach über dem Hintergrund liegen. Anpassungen an dieses Protokoll können vorgenommen werden; zum Beispiel kann ein konjugierter sekundärer Antikörper wegen der Spezifität oder nicht vorhandenen Kreuzreaktivität ausgewählt werden.
E. Zellfusion:
Dem für die Hybridomproduktion ausgewählten Tier werden intravenös 50 bis 100 μg AG in PBS injiziert. Vier Tage später wird das Tier durch Kohlendioxid geopfert, und seine Milz wird unter sterilen Bedingungen in 35 ml Dulbeccos' Modified Eagle's-Medium gewonnen, das 200 U/ml Penicillin G, 200 μg/ml Streptomycinsulfat und 4 mM Glutamin (2x P/S/G DMEM) enthält. Die Milz wird von überschüssigem Fettgewebe befreit, dann mit 4 Schalen sauberem 2x P/S/G-DMEM abgewaschen. Sie wird dann in eine sterile Stomacher-Tasche (Tekmar, Cincinnati, OH) überführt, die 10 ml 2x P/S/G-DMEM enthält, und sie wird mit dem Stomacher Lab-Blender 80 (Seward Laboratory UAC House; London, England) zu einer Einzelsuspension zerkleinert. Wenn die Zellen aus der Milzkapsel in das Medium abgegeben werden, werden sie aus der Tasche entfernt und in ein steriles 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (Becton Dickinson and Company, Lincoln Park, NJ) übertragen. Zu der Tasche werden frische Medien hinzugegeben, und der Vorgang wird weitergeführt, bis der gesamte Zellinhalt der Milz abgegeben ist. Diese Splenozyten werden drei Mal 10 Minuten lang durch Zentrifugation bei 225 g gewaschen.
Gleichzeitig werden log-Phasen-Kulturen von Myelomzellen, Sp2/0-Ag14 oder Y3-Ag1.2.3 für Maus- bzw. Ratten-Splenozyten-Fusionen (American Type Culture Collection; Rockville, MD), die in vollständigem Medium (DMEM, 10% inaktiviertes fötales Rinderserum, 2 mM Glutamin, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 10 mM Hepespuffer; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) angezogen werden, in ähnlicher Weise gewaschen. Die Splenozyten werden mit den Myelomzellen zusammengegeben und noch einmal pelletiert. Die Medien werden von dem Zellpellet abgesaugt und 2 ml Polyethylenglycol 1500 (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) werden eine Minute lang sanft mit den Zellen vermischt. Danach wird ein gleiches Volumen 2x P/S/G-DMEM langsam hinzugegeben. Den Zellen wird 2 Minuten lang bei 37°C gestattet zu fusionieren, anschließend werden zusätzliche 6 ml 2x P/S/G-DMEM hinzugegeben. Die Zellen werden noch einmal 3 Minuten lang bei 37°C gehalten. Schließlich werden 35 ml 2x P/S/G-DMEM zu der Zellsuspension hinzugegeben, und die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert. Das Medium wird von dem Pellet abgesaugt und die Zellen sanft in vollständigem Medium resuspendiert. Die Zellen werden auf Gewebekulturplatten mit 96 Reaktionsnäpfen mit flachem Boden (Becton Dickinson Labware; Lincoln Park, NJ) durch einzelne Tropfen aus einer 5 ml-Pipette verteilt. Die Platten werden über Nacht unter angefeuchteten Bedingungen bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Am nächsten Tag wird ein gleiches Volumen des Selektionsmediums zu jedem Napf hinzugegeben. Die Selektion besteht aus 0,1 mM Hypoxanthin, 4 × 10^–4 mM Aminopterin und 1,6 × 10^–2 mM Thymidin in vollständigem Medium. Die Fusionsplatten werden 7 Tage lang inkubiert, gefolgt vom zweimaligen Wechseln des Mediums während der nächsten 3 Tage; nach jedem Flüssigkeitswechsel wird HAT-Selektionsmedium verwendet. Die Überstände der Gewebekultur werden 3 bis 4 Tage nach dem letzten Flüssigkeitswechsel aus jedem hybridenthaltenden Napf entnommen und durch EIA auf spezifische Antikörper-Reaktivität untersucht. Dieses Protokoll wurde durch das in Hudson and Hay, „Practical Immunology, Second Edition”, Black Scientific Publications, modifiziert.
Beispiel 12
Klonieren eines Rezeptors des OPG-bindenden Proteins, der auf hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert wird
Biologisch aktives rekombinantes murines OPG-bindendes Protein [158–316] wurde mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) konjugiert, um eine Fluoreszenzsonde zu erzeugen. Das Fluoreszenzmarkieren wurde durch Inkubation von rekombinantem murinen OPG-bindenden Protein [158–316] mit 6-Fluorescein-5-(und 6)-Carboxyamidohexansäuresuccinimidylester (Molecular Probes, Eugene, OR) bei einem molaren Verhältnis von 1:6 12 Std. lang bei 4°C durchgeführt. Mit FITC markiertes OPG-bindendes Protein [158–316] wurde durch Gelfiltrationschromatographie weiter aufgereinigt. Knochenmarkzellen von Mäusen wurden isoliert und wie in Beispiel 10 beschrieben in Kultur in Gegenwart von CSF-1 und OPG-bindendem Protein [158–316] inkubiert. Knochenmarkzellen von Mäusen wurden über Nacht mit CSF-1 (30 ng/ml) und OPG-bindendem Protein [158–316] (20 ng/ml) kultiviert. Nicht adhärierte Zellen wurden zuerst entfernt und auf Eis gelagert, und die verbliebenen adhärierte Zellen wurden durch Inkubieren mit Zelldissoziationspuffer (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) entfernt, mit der nicht adhärierten Population vereinigt und dann wie oben beschrieben mit FITC-OPG-bindendem Protein gefärbt. Nach dem Waschen und Resuspendieren in PBS mit 0,5% BSA wurden die Zellen gegenüber FITC-OPG-bindendem Protein exponiert, gewaschen und dann durch FACS sortiert. Die Population von Zellen, die beim Färben mit dem FITC-OPG-bindenden Protein positiv waren, wurde gesammelt, und die mRNA wurde wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert. Diese mRNA-Zubereitung wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek unter Befolgung von Vorgehensweisen herzustellen, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
Die cDNA-Bibliothek, die aus dieser Quelle hergestellt wurde, wurde wie früher in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO97/23614 und in Simonet et al. (Cell 89, 309–319 (1997)) beschrieben für eine zufällige EST-Sequenzanalyse verwendet. Unter Verwendung von diesem Verfahren wurde eine ~2,1 kb cDNA nachgewiesen, die für ein neues TNFR-verwandtes Protein kodierte. Der lange offene Leserahmen der cDNA von murinem ODAR kodiert für ein Protein mit 625 Aminosäureresten und enthält die herausragenden Merkmale von TNF-verwandten Proteinen: ein hydrophobes Signalpeptid an seinem N-Terminus; vier Cystein-reiche Tandem-Wiederholungssequenzen, eine hydrophobe Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Signaldomäne. Die Homologie dieses Proteins zu anderen Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie und seine Expression in Knochenmarkzellen, die an FITC-markiertes OPG-bindendes Protein binden, legen nahe, dass es ein potentieller Rezeptor für das TNF-verwandte OPG-bindende Protein ist. Dieses Protein wird als ODAR oder Osteoklastendifferenzierungs- und -aktivierungsrezeptor bezeichnet. Die Nukleinsäuresequenz und vorausgesagte Aminosäuresequenz von murinem ODAR ist in den 10A–F gezeigt.
Eine kürzlich ausgeführte Analyse von Sequenzen in öffentlich zugänglichen Datenbanken zeigt, dass dieses Protein das murine Homolog eines menschlichen TNFR-verwandten Proteins ist, das als RANK (Anderson et al., Nature 390, 175–179 (1997)) bekannt ist.
Beispiel 13
Herstellung von rekombinantem ODAR-Protein in Säugetierzellen
Eine an die Fc-Region von menschlichem IgG₁ fusionierte lösliche extrazelluläre Domäne von ODAR wurde unter Verwendung von Vorgehensweisen zur Konstruktion und Expression von Fc-Fusionsproteinen hergestellt, wie zuvor in WO 97/23614 und in Simonet et al., oben beschrieben. Um lösliches ODAR-Protein in Säugetierzellen zu erzeugen, wurde für die extrazelluläre Domäne von murinem ODAR kodierende cDNA (Aminosäuren 27–211) durch PCR mit dem folgenden Satz an Oligonukleotidprimern amplifiziert:
Die PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 μl mit einer Einheit Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) in 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton-X100, 10 μM von jedem dNTP, 1 μM von jedem Primer und 10 ng der ODAR-cDNA-Matrizen durchgeführt. Die Reaktionen wurden 30 s lang bei 94°C, 30 s lang bei 55°C und 1 Min. lang bei 72°C für insgesamt 16 Zyklen durchgeführt. Das PCR-Fragment wurde durch Elektrophorese isoliert. Das PCR-Fragment erzeugt eine HindIII-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine NotI-Restriktionsstelle am 3'-Ende. Das mit HindIII und NotI-verdaute PCR-Fragment wurde dann im Leserahmen in einen modifizierten pCEP4-Fc-Vektor vor die Sequenz der menschlichen schweren IgG-γ1 Kette subkloniert, wie zuvor in WO 97/23614 und in Simonet et al. oben beschrieben ist. Es wurde ein Linker eingeführt, der für zwei irrelevante Aminosäurereste kodiert, die die Kontaktstelle zwischen der extrazellulären Domäne von ODAR und der IgG-Fc-Region überspannen.
Dieses Konstrukt wurde dann mit NheI und HindIII verdaut, und das folgende anelliert Oligonukleotidpaar, das für das OPG-Signalpeptid (Aminosäuren 1–21) kodiert, wurden im Leserahmen eingefügt:
Ein Linker, der für zwei irrelevante Aminosäuren kodiert, wurde zwischen dem OPG-Signalpeptid und den ODAR-Sequenzen eingeführt. Das endgültige konstruierte Konstrukt (ODAR-Fc/pCEP4) kodiert für ein Fusionsprotein, das vom N-Terminus zum C-Terminus folgendes enthält: OPG-Signalpeptid(Aminosäuren 1–21)-Linker(LysLeu)-ODAR(Aminosäuren 27–211)-Linker(AlaAla)-menschliches IgG Fc.
Das Konstrukt wurde durch das Kalziumphosphatverfahren in 293-EBNA-1-Zellen wie beschrieben transfiziert (Ausubel et al., Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1–9.1.3, (1994)). Die transfizierten Zellen wurden in 200 μg/ml Hygromycin (GibcoBRL) selektiert und die sich daraus ergebenden Wirkstoff-resistenten Massenkulturen vereinigt und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden einmal in PBS gewaschen und anschließend 72 Std. lang in serumfreiem Medium kultiviert. Das konditionierte Medium wurde gesammelt. Das ODAR-Fc-Fusionsprotein in dem Medium wurde durch Western Blot-Analyse mit anti-menschlichem IgG-Fc-Antikörper nachgewiesen.
Das Fc-Fusionsprotein wurde durch Protein A-Säulenchromatographie (Pierce) unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen aufgereinigt. Fünfzig pMol des aufgereinigten Proteins wurden dann einer N-terminalen Sequenzanalyse durch automatisierten Edman-Abbau, im Wesentlichen wie von Matsudaira et al (J. Biol. Chem. 262, 10–35 (1987)) beschrieben, unterworfen. Die folgende Aminosäuresequenz wurde nach 10 Zyklen abgelesen: NH₂-K L V T L Q V T P-CO₂H.
Die Bindungsaktivität von ODAR-Fc mit OPG-bindendem Protein wurde durch Immunofluoreszenzfärben von transfektierten COS-7-Zellkulturen wie in Beispiel 2 beschrieben untersucht. Die COS-7-Zellen wurden mit 1 μg eines Expressionsvektors lipofektiert, der für murines OPG-bindendes Protein kodierende DNA enthielt. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Zellen dann eine Std. lang bei 4°C in PBS-FBS-Lösung inkubiert, die 10 mg/μl menschliches IgG-Fc-, ODAR-Fc-, oder OPG-Fc-Protein enthielt. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in eine weitere Std. lang in PBS-FBS-Lösung inkubiert, die 20 μg/ml FITC-markierten Ziegen-anti-Mensch-IgG (Southern Biotech Associates) enthielt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen durch konfokale Mikroskopie (ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imaging, Inc., Okemos, MI) untersucht. Sowohl ODAR-Fc als auch OPG-Fc binden an mit OPGL transfizierte COS-7-Zellen (11A–C).
Beispiel 14
Biologische in vitro Aktivität von rekombinantem löslichen ODAR
Die Fähigkeit von ODAR, die Stimulierung der Osteoklastenbildung durch OPG-bindendes Protein zu inhibieren, wurde in einer Mäuseknochenmarkkultur in Gegenwart von CSF-1 (30 ng/ml) und OPG-bindendem Protein (5 ng/ml) abgeschätzt. Verfahrensweisen für die Verwendung von Mäuseknochenmarkkulturen, um die Osteoklastenreifung zu studieren, sind in WO 97/23614 und in Beispiel 8 beschrieben. Wie in Beispiel 12 beschrieben hergestelltes ODAR-Fc-Fusionsprotein wurde in Konzentrationen von 65 bis 1500 ng/ml hinzugegeben. Die Osteoklastenbildung wurde nach fünf Tagen in Kultur durch gegen Tartrat resistente alkalische Phosphatase(TRAP)-Zytochemie und den TRAP-Lösungstest abgeschätzt.
Eine dosisabhängige Inhibition der Osteoklastenbildung durch ODAR-Fc-Fusionsprotein wurde sowohl durch Zytochemie als auch TRAP-Aktivität (12A–H) beobachtet. Das ODAR-Fc-Fusionsprotein inhibierte die Osteoklastenbildung mit einem ED₅₀ von ungefähr 10–50 ng/ml.
Beispiel 15
Biologische Aktivität von rekombinantem löslichen ODAR in vivo
Junge, schnell wachsende männliche BDF1-Mäuse im Alter von 3–4 Wochen erhielten vier Tage lang verschiedene Dosen des ODAR-Fc-Fusionsproteins durch einzelne tägliche subkutane Injektion in Träger (PBS/0,1% BSA). Die Mäuse wurden am Tag 5 geröntgt. Die verwendeten Dosen des ODAR-Fc-Fusionsproteins betrugen 0,5, 1,5 und 5 mg/kg/Tag. Bei jeder Behandlung wurden alle Mäuse in der Gruppe und in der Kontrollgruppe, die PBS/0,1% BSA erhielten, auf einem einzigen Film geröntgt. Die proximale Tibiametaphysenregion wurde zwischen Paaren von Kontroll- und behandelten Tibien verglichen und als ein „+” bewertet, wenn die behandelten Tibien nach visueller Abschätzung dichter waren als die Kontrolle, was die 8 unten gezeigten Werte ergab. Ein willkürlicher Wert von 5/8 wurde für ein „positives” Ergebnis benötigt. (Dosis ist angegeben in mg/kg/Tag). (n = 4).
Nach dem Opfern wurde die rechte Tibia von jedem Tier entfernt, und die Knochendichte in der proximalen Tibiametaphyse wurde periphere quantitative computergestützte Tomographie (pQCT) (Stratec, Deutschland) gemessen. Zwei 0,5 mm Knochenquerschnitte, 1,5 mm und 2,0 mm vom proximalen Ende der Tibia wurden analysiert (XMICE 5.2, Stratec, Deutschland), um die Gesamtknochenmineraliendichte in der Metaphyse zu bestimmen. Eine Weichgewebetrennschwelle von 1500 wurde verwendet, um die Begrenzung des Metaphysenknochens zu definieren.

Die ODAR-Fc-Verabreichung bei jungen wachsenden Mäusen inhibierte die Knochenresorption an der proximalen tibialen Wachstumsplatte, was eine Region erhöhter Knochendichte hervorrief, die auf Radiogrammen visuell augenscheinlich war. Die radiographischen Veränderungen traten bei einer Dosis von 1,5 mg/kg/Tag und darüber in zwei Experimenten (Tabelle 1) in Erscheinung. Die Messung der Knochendichte durch pQCT in Proben aus dem zweiten Experiment in einer ähnlichen Region der Tibia bestätigte die dosisabhängige erhöhte Knochendichte bei diesen Mäusen (13). Tabelle 1 Inhibition der Knochenresorption durch ODAR-Fc-Fusionsprotein Experiment #1

Faktor	Dosis	1	2	3	4	5	6	7	8	Ergebnis
ODAR-Fc	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Positiv 8/8
ODAR-Fc	1,5	–	+	+	–	+	+	+	+	Positiv 6/8
ODAR-Fc	0,5	–	–	–	–	–	–	–	–	Negativ 0/8
ODAR-Fc	0,15	–	–	–	–	–	–	–	–	Negativ 0/8

Experiment #2

Faktor	Dosis	1	2	3	4	5	6	7	8	Ergebnis
ODAR-Fc	5,0	+	+	+	+	+	+	+	+	Positiv 8/8
ODAR-Fc	1,5	+	+	+	+	+	+	+	+	Positiv 8/8
ODAR-Fc	0,5	–	–	–	+	–	–	–	–	Negativ 1/8

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Antikörpers als Modulator des Osteoprotegerinbindungsproteins (OPGbp) zur Zubereitung eines Medikaments für die Verhinderung oder Behandlung einer Knochenkrankheit, wobei es sich bei dem Antikörper um einen Antagonisten handelt, der an OPGbp der 4A–F (SEQ ID NR. 4) bindet und die OPGbp-vermittelte Osteoklastogenese und/oder Knochenresorption hemmt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen rekombinanten Antikörper handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen chimären Antikörper oder einen Antikörper mit gepfropfter CDR handelt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen humanen Antikörper handelt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Antikörper durch Immunisierung eines transgenen Tieres zubereitet wird, das zum Bilden humaner Antikörper in der Lage ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper an eine membranassoziierte Form von OPGbp bindet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper an eine lösliche Form von OPGbp bindet.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die lösliche Form von OPGbp Aminosäurereste 69–317 von 4A–F (SEQ ID NR. 4) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper mit einem oder mehreren eines knochenmorphogenen Faktors verabreicht wird, der aus BMP-1 bis BMP-12, dem transformierenden Wachstumsfaktor beta, einem Mitglied der Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta, einem Fibroblastenwachstumsfaktor, ausgewählt aus FGF-1 bis FGF-10, einem Interleukin-1-Inhibitor, einem TNF-alpha-Inhibitor, Parathormon, einem Prostaglandin der E-Serie, einem Biphosphonat oder einem knochenstärkenden Mineral ausgewählt ist.