DE69533675T2

DE69533675T2 - Monoklonaler antikörper gegen rhesus d (d7c2)

Info

Publication number: DE69533675T2
Application number: DE69533675T
Authority: DE
Inventors: Lena Edelman; Christel San Francisco General MARGARITTE; Michel Kaczorek; Hassan Chaabihi
Original assignee: PROTEINE PERFORMANCE SA; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: PROTEINE PERFORMANCE SA; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-09-01
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2015-09-02
Also published as: WO1996007740A1; FR2724182A1; CA2198935A1; PT778891E; DE69533675D1; FR2724182B1; ATE280228T1; US6312690B1; ES2231789T3; EP0778891B1; EP0778891A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Erhalt eines rekombinanten monoklonalen Anti-Rhesus D-Antikörpers.
Personen, deren rote Blutzellen durch Alloantikörper agglutiniert werden, die gegen das D-Antigen (eines der Antigene des RH-Systems) gerichtet sind, werden gemeinhin als "Rhesus-positiv" oder "Rh-positiv", und Personen, deren rote Blutzellen nicht durch diese Alloantikörper agglutiniert werden, als "Rhesus-negativ" oder "Rh-negativ" bezeichnet.
Die hämolytische Erkrankung des Neugeborenen ist in der Mehrheit der Fälle bei einer Rh-negativen Mutter auf Anti-Rhesus D-Alloantikörper zurückzuführen (die Alloimmunisierung gegen andere Antigene des RH-Systems ist sehr viel seltener), die bei einem Rhesus-positiven Fötus eine hämolytische Anämie hervorrufen, die in schweren Fällen bei der Geburt entweder in utero-Transfusionen oder eine Blutaustausch-Transfusion erforderlich macht.
Die Alloimmunisierung der Mutter erfolgt im allgemeinen bei einer früheren Entbindung; fötale rote Blutzellen gelangen in den mütterlichen Blutkreislauf und induzieren eine Immunisierung, wenn das Kind Rh-positiv ist.
Die Prophylaxe gegen die hämolytische Erkrankung des Neugeborenen besteht in der Injektion von Anti-Rhesus D-Antikörpern an Rhesus-negative Frauen unmittelbar nach der Entbindung oder einem Schwangerschaftsabbruch.
Zur Zeit sind die zu diesem Zweck verwendeten Anti-Rhesus-Antikörper polyklonale Immunglobuline, die von freiwilligen Rh-negativen Spendern stammen, die bei mehreren Gelegenheiten gegen Rh-positive rote Blutzellen immunisiert wurden.
Dies führt einerseits zu Problemen, weil man über eine ausreichende Zahl von Freiwilligen verfügen muß, um dem Bedarf gerecht zu werden, und andererseits, weil das Risiko einer Kontamination mit Viren oder anderen Pathogenen besteht, die in den aus dem Blut Freiwilliger erhaltenen Immunglobulinpräparaten vorhanden sein könnten.
Für diese Herstellungsweise gibt es zur Zeit jedoch keine Alternative. Obwohl es Versuche der Kultivierung von Lymphoblastoid-Zellinien gibt, die von B-Lymphozyten stammen, die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert wurden und monoklonale Antikörper sekretieren, hat wegen der impliziten Risiken bei der Verwendung von Epstein-Barr-Virus tatsächlich kein aus dieser Art Kultivierung erhaltenes Produkt die Marktzulassung erhalten.
Um die mit der Verwendung von Epstein-Barr-Virus verbundenen Risiken zu vermindern und monoklonale Anti-Rhesus D-Antikörper mit bestimmten biologischen Eigenschaften zu isolieren, wurde außerdem ein Verfahren zum Erhalt von chimären Antikörpern entwickelt, die die variablen Domänen und die konstanten Domänen monoklonaler Anti-Rhesus D-Antikörper mit verschiedenen Eigenschaften vereinen (WO 91/07492, veröffentlicht am 30. Mai 1991 im Namen von Central Blood Laboratories Authority).
Tests, die an mehreren Präparaten von Anti-Rhesus D-Antikörpern durchgeführt wurden, die im Stand der Technik verfügbar sind, zeigten jedoch ein Reaktivitätsspektrum, das von einem Antikörper zum anderen stark variiert, und insbesondere eine allgemeine Unfähigkeit, mit der Gesamtheit der Rhesus-positiven Phänotypen und mit dem partiellen Rhesus Rh 33 zu reagieren (STERN, Australian J. Medical Science 13 (2): 43–47, 1992); es ist also zur Zeit nicht möglich, den Erhalt chimärer Antikörper ins Auge zu fassen, die das augenblickliche Defizit im Reaktivitätsspektrum der Anti-Rhesus D-Antikörper, von denen sie sich ableiten, ausgleichen können.
Um eine Quelle für Anti-Rhesus D-Immunglobuline ohne die Nachteile der bis jetzt verwendeten Immunglobuline zu erhalten, haben sich die Erfinder die Produktion von monoklonalen rekombinanten humanen Anti-Rhesus-Antikörpern in Insektenzellen unter Verwendung eines von einem Baculovirus abstammenden Expressionsvektors zur Aufgabe gemacht.
Zu diesem Zweck haben die Erfinder zuerst eine Zellinie selektioniert, die einen monoklonalen Anti-Rhesus D-Antikörper mit der Bezeichnung D7C2 produziert. Dieser Antikörper gehört zur Klasse der IgMs, agglutiniert die roten Blutzellen mit gewöhnlichem Rhesus-Phänotyp, den schwachen Rhesus und den größten Teil des partiellen Rhesus mit Ausnahme der DIV; dieser Antikörper bindet an ein Polypeptid mit 30 bis 32 Kda von der Membran der roten Blutzellen.
Die Erfinder haben folglich die Sequenzen kloniert, die für die variablen Regionen der schweren (H) und leichten (L) Ketten von D7C2 kodieren und haben Expressionskassetten konstruiert, die die Expression jeder dieser Sequenzen unter der Kontrolle eines starken Baculoviruspromotors erlauben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Fragment, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

– einem DNA-Fragment, das eine Sequenz umfasst, die für die variable Region der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert;
– einem DNA-Fragment, das eine Sequenz umfasst, die für die variable Region der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert.

Unter "Sequenz, die für die variable Region der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert" versteht man insbesondere die im anhängenden Sequenzprotokoll unter der Nr. SEQ ID NO: 1 identifizierte Sequenz, die für das Polypeptid SEQ ID NO: 2 kodiert.
Unter "Sequenz, die für die variable Region der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert" versteht man insbesondere die Sequenz SEQ ID NO: 3, die für das Polypeptid SEQ ID NO: 4 kodiert.
Für den Fachmann ist es also offensichtlich, dass diese Definition auch Sequenzen umfasst, die zu den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 funktionell äquivalent sind, d. h. insbesondere:

– jede Sequenz, die für die Polypeptide SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 kodiert, sowie
– Sequenzen, die für Polypeptide kodieren, die sich von den Polypeptiden SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 durch ein paar Aminosäuren unterscheiden, unter der Bedingung, dass sich diese Variation nicht in einer Peptidsequenz befindet, die an der Erkennung des Epitops beteiligt ist.

Dies umfasst beispielsweise eine Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz sich von der des Polypeptids SEQ ID NO: 4 durch den Austausch des Thr-Rests in Position 23 gegen einen Ala-Rest unterscheidet, was durch den Austausch eines A in Position 67 in der Sequenz SEQ ID NO: 3 durch ein G zustande kommt.
Sequenzen, die zu den Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 funktionell äquivalent sind, sind auch Sequenzen, die von einer Modifikation von deren Enden herrühren, um dort Restriktionsstellen zu erzeugen, oder um die, die dort vorhanden sind, zu modifizieren oder zu supprimieren. Dies beinhaltet beispielsweise eine Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz sich von der des Polypeptids SEQ ID NO: 2 durch den Austausch der drei ersten Reste, Asp-Ile-Glu, gegen die Reste Gln-Ser-Val unterscheidet, was durch den Austausch eines A in Position 67 in der Sequenz SEQ ID NO: 3 durch ein G zustande kommt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Expressionskassette, umfassend eine Sequenz, die für die variable Region der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, oder eine Sequenz, die für die variable Region der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, wobei diese Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle eines geeigneten Promotors steht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist dieser Promotor ein Baculoviruspromotor.
Als Beispiel für Baculoviruspromotoren, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die Promotoren für Polyhedrin und P10 der Baculoviren AcMNPV oder SIMNPV oder Derivate von Baculoviruspromotoren zu nennen, die aus synthetischen oder rekombinanten Promotoren bestehen, die ausgehend von einem Baculoviruspromotor erhalten wurden und in Insektenzellen funktionsfähig sind, wie beispielsweise der, der von WANG et al. [Gene, 100, 131–137, (1991)] beschrieben wurde.
Eine Expressionskassette gemäß dieser Ausführungsform umfasst beispielsweise:

– einen wie oben definierten Baculoviruspromotor;
– eine Sequenz, die für ein Signalpeptid für die Sekretion kodiert;
– eine Sequenz, die für die variable Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, und eine Sequenz, die für die konstante Domäne der leichten Kette eines Immunglobulins kodiert; oder
– eine Sequenz, die für die variable Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, und eine Sequenz, die für die konstante Domäne der schwerer. Kette eines Immunglobulins kodiert.

Es gibt eine große zahl von Sequenzen, die für Signalpeptide kodieren, die in Insektenzellen funktionsfähig sind und zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Als nicht einschränkendes Beispiel sind Sequenzen zu nennen, die für die Signalpeptide der Acetylcholinesterase von Drosophila, des ovinen Trophoblastins kodieren, sowie Sequenzen, die für die Signalpeptide der H- und L-Ketten von murinen oder humanen Immunglobulinen kodieren, usw.
Jede der erfindungsgemäßen Kassetten ermöglicht die Expression entweder der leichten Kette oder der schweren Kette eines nachfolgend als r-D7C2 bezeichneten rekombinanten Antikörpers, der die Spezifität des monoklonalen Antikörpers D7C2 besitzt.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal dieser Ausführungsform sind die Sequenzen, die für die konstanten Domänen der leichten und schweren Immunglobulinketten kodieren, Sequenzen humanen Ursprungs.
Die Sequenz, die die konstante Domäne der leichten Kette kodiert, kann aus den Sequenzen ausgewählt werden, die für die konstanten Domänen der leichten kappa (κ)- und lambda (λ)-Ketten kodieren.
Die Sequenz, die für die konstante Domäne der schweren Kette kodiert, kann aus den Sequenzen ausgewählt werden, die für die konstanten Domänen der schweren γ1-, γ2-, γ3-, γ4-, α-, ε- und μ-Ketten kodieren. Auf diese Weise kann man einen rekombinanten Antikörper erhalten, der zu der gewünschten Immunglobulinklasse gehört (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE und IgM).
Sehr vorteilhaft wird man eine Sequenz wählen, die für die konstante Cγ-Domäne einer schweren γ-Kette kodiert. Der rekombinante Antikörper r-D7C2, der auf diese Weise erhalten wurde, gehört zur Klasse der IgG und wird nachfolgend als r-IgG-D7C2 bezeichnet.
Die Sequenzen, die für die leichte Kette und für die schwere Kette eines r-IgG-D7C2-Antikörpers vom Isotyp IgG1 kodieren, sind im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nr. SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 dargestellt; die entsprechenden Polypeptidsequenzen tragen die Identifikationsnummern SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner rekombinante Vektoren, die wenigstens eine wie oben definierte Expressionskassette tragen; in diesem Rahmen umfasst die vorliegende Erfindung insbesondere rekombinante Baculoviren, die die Expression des r-D7C2-Antikörpers ermöglichen, sowie Transferplasmide, die die Konstruktion dieser rekombinanten Baculoviren erlauben.
Die erfindungsgemäßen Transferplasmide tragen ein Insert, das umfasst: eine wie oben definierte Expressionskassette, und auf beiden Seiten dieser Kassette Baculovirussequenzen, die homolog zu denen der Regionen sind, die den Teil des Virusgenoms flankieren, an dessen Stelle die Kassette inseriert werden soll.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Transferplasmide sind die Baculovirussequenzen homolog zu denen der Regionen, die das Gen für p10 flankieren, oder homolog zu denen der Regionen, die das Gen für Polyhedrin flankieren.
Gemäß einem besonders vorteilhaften Merkmal dieser Ausführungsform wird die Expressionskassette, die das Gen enthält, das für die leichte Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, von den Regionen flankiert, die das Gen für Polyhedrin in Wildtyp-Baculovirus umgeben, und die Expressionskassette, die das Gen trägt, das für die schwere Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, wird von den Regionen flankiert, die das P10-Gen in Wildtyp-Baculovirus umgeben.
Schematisch erfolgt die Konstruktion der erfindungsgemäßen Transferplasmide, indem man in ein Plasmid, das in der Lage ist, in einem bakteriellen Wirt (im allgemeinen E. coli) zu replizieren, die Region des Baculovirusgens (beispielsweise p10 oder Polyhedrin, oder jeden anderen Locus des Baculovirus) inseriert, an dessen Stelle die Gene inseriert werden sollen, die für die H- oder L-Ketten des Immunglobulins kodieren. In dieser Region wird die für das Baculovirusgen kodierende Sequenz (und gegebenenfalls die Promotorsequenz dieses Gens) durch die Sequenz ersetzt, die für die zu exprimierende Immunglobulinkette kodiert (und gegebenenfalls die Sequenz des Promotors, unter dessen Kontrolle diese Immunglobulinkette exprimiert werden soll, wenn es sich beispielsweise um einen "abgeleiteten" Promotor handelt). Das so erhaltene Transferplasmid enthält also ein Insert, das eine heterologe Sequenz umfasst (Sequenz einer Kette des r-D7C2-Antikörpers), die von Baculovirussequenzen flankiert wird.
Um die gleichzeitige Expression der schweren Kette (H-Kette) und der leichten Kette (L-Kette) und ihre Reassoziation unter Bildung des rekombinanten Antikörpermoleküls zu ermöglichen, haben die Erfinder die beiden Kassetten in einen gleichen Expressionsvektor inseriert. Auf diese Weise haben sie ein doppelt rekombinantes Baculovirus erhalten, in dem die für jede der H- und L-Ketten kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines starken Promotors steht.
Ein erfindungsgemäßes rekombinantes Baculovirus, das die Expression des r-D7C2-Antikörpers erlaubt, kann nach dem folgenden Prinzip konstruiert werden:

– man stellt getrennt zwei wie oben definierte Transferplasmide her: eines für die H-Kette und eines für die L-Kette.

Anschließend cotransfiziert man die Insektenzellen mit der DNA der so hergestellten Transfervektoren und der DNA des Baculovirus. Diese Cotransfektion erfolgt in zwei Schritten:
Das Transferplasmid, das die Expressionskassette für das Gen für die leichte Kette enthält, die von Regionen flankiert wird, die das Gen für Polyhedrin in Wildtyp-Baculovirus umgeben, wird mit der DNA von Wildtyp-Baculovirus AcMNPV zur Cotransfektion von Insektenzellen in Kultur verwendet.
Durch homologe Rekombination zwischen der Virus-DNA und dem Plasmid werden die Sequenzen, die für die leichte Kette des rekombinanten Immunglobulins kodieren, in das Virusgenom transferiert.
Nach Replikation der Virus-DNA in den transfizierten Zellen fährt man mit der Selektion der rekombinanten Baculoviren fort, die die Sequenz für die leichte Kette des rekombinanten Immunglobulins integriert haben.
Diese rekombinanten Baculoviren werden nach zwei Kriterien selektioniert: ihrer Unfähigkeit, Polyeder zu produzieren, und ihrer Fähigkeit, die leichte Kette zu exprimieren.
1 veranschaulicht den Erhalt des Baculovirus, der die leichte λ-Kette des rekombinanten Antikörpers r-IgG-D7C2 exprimiert.
In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit der DNA des im ersten Schritt erhaltenen rekombinanten Baculovirus und mit der des Transferplasmids cotransfiziert, das die Expressionskassette enthält, die das Gen trägt, das für die schwere Kette des rekombinanten Antikörpers r-D7C2 kodiert, und die von den Regionen flankiert wird, die das P10-Gen des Baculovirus umgeben. Wie zuvor wird das Gen für die schwere Kette durch homologe Rekombination in die Virus-DNA transferiert.
Dann selektioniert man die doppelt rekombinanten Viren, die in der Lage sind, gleichzeitig eine schwere und eine leichte Immunglobulinkette zu produzieren. der Nachweis der schweren und der leichten Immunglobulinkette erfolgt mittels ELISA.
2 veranschaulicht diesen zweiten Schritt, der es erlaubt, ein Baculovirus zu erhalten, das die leichte lambda-Kette und die schwere gamma-Kette des rekombinanten Antikörpers r-IgG-D7C2 exprimiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Baculovirus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es wenigstens eine wie oben definierte Expressionskassette umfasst, die eine Sequenz umfasst, die für die ganze H-Kette oder einen Teil der H-Kette des r-D7C2-Antikörpers kodiert, oder eine Sequenz, die für die ganze L-Kette oder einen Teil der L-Kette des r-D7C2-Antikörpers kodiert, wobei diese Sequenz unter der Kontrolle eines starken Baculoviruspromotors steht.
Gemäß einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus umfasst dieses eine Expressionskassette, die die Sequenz umfasst, die für die H-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 kodiert, und eine Expressionskassette, die die Sequenz umfasst, die für die L-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 kodiert.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal dieser Ausführungsform sind der Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrolliert, die für die L-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 kodiert, und der Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrolliert, die für die H-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 kodiert, zwei unterschiedliche Promotoren.
Gemäß einem vorteilhaften Aspekt dieses Merkmals liegt einer dieser Promotoren an der Stelle, die in Wildtyp-Baculovirus durch den Polyhedrinpromotor belegt ist, und der andere liegt an der Stelle, die in Wildtyp-Baculovirus durch den P10-Promotor belegt ist.
Gemäß einem weiteren vorteilhaften Aspekt dieses Merkmals ist einer dieser Promotoren der Polyhedrinpromotor oder eines seiner Derivate, und der andere ist der P10-Promotor oder eines seiner Derivate.
Vorteilhaft ist der Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrolliert, die für die leichte Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, der Polyhedrinpromotor oder eines seiner Derivate, und der Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrolliert, die für die schwere Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, ist der P10-Promotor oder eines seiner Derivate.
Gemäß einem weiteren Merkmal dieser Ausführungsform sind die Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, das mit der L-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 verbunden ist, und die Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, das mit der H-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 verbunden ist, zwei unterschiedliche Sequenzen.
Ein erfindungsgemäßes rekombinantes Baculovirus, das eine Expressionskassette mit der für die λ-Kette des monoklonalen Antikörpers r-IgG-D7C2 kodierenden Sequenz und eine Expressionskassette mit der für die γ1-Kette des monoklonalen Antikörpers r-IgG-D7C2 kodierenden Sequenz umfasst, wurde am 19. August 1994 bei der C. N. C. M. (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, unterhalten vom Institut Pasteur, 25, rue du Docteur ROUX, Paris) unter der Nummer I-1468 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Insektenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus infiziert sind.
Die Expression und die Produktion von rekombinanten monoklonalen r-D7C2-Antikörpern erfolgt in vitro in erfindungsgemäßen Insektenzellen.
Die Infektion der Zellen mit einem erfindungsgemäßen doppelt rekombinanten Baculovirus führt zur gleichzeitigen Expression der H- und L-Kette. Diese Ketten lagern sich zusammen und rekonstituieren den rekombinanten monoklonalen Antikörper r-D7C2, der anschließend in das Kulturmedium sekretiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten monoklonalen Antikörpers, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Schritt umfasst, bei dem man Insektenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus infiziert sind, kultiviert, und einen Schritt, bei dem man den Antikörper aus dem Kulturmedium erhält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein rekombinanter monoklonaler Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass seine variablen Domänen die Sequenz der variablen Domänen des monoklonalen Antikörpers D7C2 haben. Dies umfasst insbesondere die Präparationen von rekombinanten monoklonalen r-D7C2-Antikörpern, die nach dem oben definierten erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.
Unter "Sequenz der variablen Domänen des monoklonalen Antikörpers D7C2" versteht man insbesondere die Sequenz der variablen Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2, die im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nr. SEQ ID NO: 2 identifiziert ist, und die Sequenz der variablen Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2, die im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nr. SEQ ID NO: 4 identifiziert ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des rekombinanten monoklonalen Antikörpers r-D7C2 gehört dieser zur Klasse der IgG.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal dieser Ausführungsform ist der Antikörper r-D7C2 vom IgG1-Isotyp.
Ein erfindungsgemäßer rekombinanter Antikörper kann zur Diagnostik und zur Therapie verwendet werden. Eine besonders interessante Verwendung betrifft die Herstellung von Medikamenten zur Prophylaxe der Bluterkrankheit bei Neugeborenen.
Zu diesem Zweck verwendet man insbesondere einen rekombinanten r-IgG-D7C2-Antikörper der IgG-Klasse, der eine ADCC-Effektor aktivität besitzt, die dem parentalen D7C2-Antikörper, der ein IgM ist, fehlt.
Die Herstellung eines rekombinanten Anti-Rhesus D-Antikörpers in Insektenzellen ermöglicht es, die Risiken und Probleme, die mit der Immunisierung Rh-D-negativer männlicher Freiwilliger durch Injektion von Rh-D-positiven humanen roten Blutzellen verbunden sind, zu vermeiden und die Risiken einer Kontamination mit Viren oder anderen Pathogenen, die in den aus dem Blut von Freiwilligen extrahierten Immunglobulinpräparationen vorhanden sein könnten, zu verringern.
Außerdem weist diese Produktionsweise die folgenden Vorteile auf:

– pharmazeutische Sicherheit: die Verwendung von Insektenzellinien und Baculovirus birgt kein Risiko für zufällige Viren oder für Onkogene, das bei Verwendung von humanen Zellinien auftritt;
– Standardisierung des Herstellungsverfahrens und des daraus stammenden Produkts;
– Versorgungsquelle in praktisch unbeschränkten Mengen.

Die vorliegende Erfindung läßt sich mit Hilfe der nachfolgenden ergänzenden Beschreibung, die Herstellungsbeispiele für erfindungsgemäße rekombinante Baculoviren und ihre Verwendung zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers vom IgG1-Isotyp, nachfolgend als r-IgG-D7C2 bezeichnet, in Insektenzellen betrifft, besser verstehen.
Es versteht sich, dass diese Beispiel lediglich der Veranschaulichung des Gegenstandes der Erfindung dienen und diesen in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1: Produktion des D7C2-Antikörpers und Klonierung der schweren und leichten Ketten
A) Beschreibung des D7C2-Antikörpers
Die humane Zellinie D7C2 wurde nach Immortalisierung, mit Epstein-Barr-Virus, von peripheren Blutlymphozyten von einem Rhesus-negativen Spender (dce/dce), der bei 5 Gelegenheiten mit Rhesus-positiven roten Blutzellen (DCe/DCe) immunisiert worden war, erhalten.
Der von dieser Zellinie sekretierte Antikörper ist vom IgM-Isotyp. Dieser Antikörper, der nachfolgend als IgM-D7C2 bezeichnet wird, agglutiniert die roten Blutzellen mit Rhesus-positivem Phänotyp DCeee, DCCee, DccEE, Dccee, und agglutiniert nicht die Rhesus-negativen roten Blutzellen ddccee, ddCcee, ddccEe. Er agglutiniert schwaches Rhesus und den größten Teil partielles Rhesus (Agglutination von DIIIa, DIIIc, DIVA, DVa, DVc, DVII und Rh33) mit Ausnahme der DVI. Er agglutiniert die roten LW(a–b+)-Blutzellen und agglutiniert nicht die roten r^G- und Rhmod-Blutzellen. Die an Membranpräparationen von in TRITON X-100 solubilisierten Rhesus-positiven roten DCe/DCe-Blutzellen durchgeführten Immunpräzipitationstests zeigten eine Bindung des IgM-D7C2-Antikörpers mit einem Polypeptid von etwa 30 bis 32 Kda.
B) Klonierung und Sequenzierung der variablen Teile der schweren Kette und der leichten Kette
Gesamt-RNA wird mit Guanidinthiocyanat aus Zellen des Klons D7C2 extrahiert und dann mit Isopropanol gefällt. Nach Entfernen der DNA durch Verdau mit DNAse wird die RNA mit NaCl (Endkonzentration 0,2 M) gefällt.
Die cDNA wird ausgehend von 1 μg RNA durch reverse Transkription unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers synthetisiert.
Die variablen Teile der schweren (VH) und leichten (VL) Ketten werden durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ausgehend von 1 μg einzelsträngiger RNA unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase amplifiziert.
Die verwendeten Primer sind die folgenden:

– Für VH:
– Für VL:

Auf diese Weise wurden 30 Amplifikationszyklen durchgeführt.
Nach Phosphorylierung wird das amplifizierte Fragment über ein Agarosegel gereinigt und dann in das Plasmid PTZ18R ligiert. Das erhaltene Plasmid wird zur Transformation von Escherichia coli KL 1 blue verwendet.
Die Selektion er transformierten Bakterien erfolgt mit einem Resistenztest auf Ampicillin.
Die Nucleotidsequenz der Inserts der als PTZ-V_LD7C2 bzw. PTZ-V_HD7C2 bezeichneten Plasmidvektoren wird mit Hilfe des PROMEGA-Sequenzierungskits bestimmt.
Die Sequenz, die für die variable Region der leichten Kette des humanen monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 kodiert, ist im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 1 dargestellt; die entsprechende Polypeptidsequenz ist im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 2 dargestellt.
Die Sequenz, die für die variable Region der schweren Kette des humanen monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 kodiert, ist im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 3 dargestellt; die entsprechende Polypeptidsequenz ist im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 4 dargestellt.
Die Lage der CDR (komplimentaritätsbestimmende Regionen) sind unter den charakteristischen Eigenschaften für die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 aufgeführt.
Beispiel 2: Konstruktion von Transferplasmiden, die die variablen Sequenzen von D7C2 tragen
A) TRANSFERPLASMID FÜR DIE LEICHTE LAMBDA-KETTE:
1) Herstellung des Plasmids pBCλ
a – Plasmid pGmAc116T
Dieser Vektor leitet sich von dem Plasmid pGmAc115T ab [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230–3235, (1992)], das sich selbst wiederum von dem Plasmid pAcI ableitet [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664–2671 (1993)], das das EcoRI-I-Fragment des Kernpolyeder-Baculovirus von Autographa california (AcMNPV) und folglich das Polyhedrin-Gen und die dieses Gen flankierenden Sequenzen enthält. Um pGmAc116T zu erhalten, wurde aus dem Plasmid pGmAc115T ein 1900 bp-Fragment deletiert, das von einer EcoRI-Stelle stromaufwärts des Polyhedrin-Gens bis zu einer XhoI-Stelle 1900 bp stromabwärts von dieser EcoRI-Stelle reichte.
5 μg des Plasmids pGmAc115T wurden mit 15 Units des Enzyms XhoI (BOEHRINGER) 2 Stunden bei 37°C in einem Reaktionsvolumen von 50 μl unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen verdaut. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform wurde die Plasmid-DNA mit Alkohol gefällt. Diese DNA wurde anschließend mit EcoRI (BOEHRINGER) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl in Gegenwart von 0,5 Units Enzym partiell geschnitten. Die Inkubation erfolgte 20 Minuten bei 37°C. Nach einer erneuten Extraktion mit Phenol/Chloroform wurden die durch die XhoI- und EcoRI-Spaltung erzeugten Enden mit Klenow-Enzym (BIOLABS) in Gegenwart der 4 dNTPs nach dem vom Hersteller angegebenen Protokoll glatt gemacht. Schließlich wurde die Plasmid-DNA mit Alkohol gefällt und mit der Ligase des Phagen T4 (BOEHRINGER) unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen inkubiert.
Die kompetenten E. coli-Bakterien wurden mit einem Teil der Ligationsmischung transformiert; das Screening der aus dieser Transformation stammenden Kolonien ermöglichte die Selektion des Plasmids pGmAc116T. Dieses Plasmid enthält eine BglII-Stelle stromabwärts vom Polyhedrinpromotor.
b – Signalpeptid
Die gewählte für das Signalpeptid kodierende Sequenz wurde chemisch in Form von zwei komplementären Oligonucleotiden synthetisiert, die Enden aufweisen, die die Insertion des Doppelstrangs in eine BglII-Stelle erlauben. Zur Paarung werden 15 μg von jedem der zwei Oligonucleotide in 50 μl Puffer (1 mM Tris, pH 7,5, 0,1 M EDTA) 5 Minuten in einem Wasserbad bei 70°C inkubiert. Dann läßt man das Bad auf Raumtemperatur (22 bis 25°C) abkühlen. Das Produkt der Paarung wird direkt für die Ligationsreaktionen mit dem zuvor mit BglII geschnittenen Plasmid pGmAc116T eingesetzt.
Die Ligationsbedingungen sind wie folgt:
1 μg des mit BglII geschnittenen Plasmids pGmAc116T; 1 μg des für das Signalpeptid kodierenden doppelsträngigen Oligonucleotids; 2 μl 10X-Ligasepuffer (BOEHRINGER); destilliertes Wasser q. s. auf 19 μl; 1 Unit (1 μl) Ligase (BOEHRINGER). Die Inkubation erfolgt 2 Stunden bei 22°C; das Ligationsprodukt wird zur Transformation kompetenter E. coli-Bakterien eingesetzt.
c – Konstante Cλ-Region
Die für die konstante Region der humanen leichten λ-Kette kodierende Sequenz wurde mittels PCR mit der cDNA humaner B-Lymphozyten als Matritze amplifiziert. Die Humanlymphozyten (etwa 5 × 10⁸) wurden ausgehend von 200 ml Blut unter Verwendung von HISTOPAQUE^® (SIGMA) präpariert. Gesamt-RNA wurde aus diesen Lymphozyten mit einem PHARMACIA-Kit (RNA-Extraktionskit) extrahiert. Der erste cDNA-Strang wurde ausgehend von Gesamt-RNA mit Hilfe des "First-Strand cDNA synthesis kit" von PHARMACIA hergestellt.
Die Amplifikation der Cλ-Region mittels PCR erfolgte in Gegenwart des Primers OPP-HuCλ3', der zum 3'-Ende der Cλ-Regionen komplementär ist und die Restriktionsstelle BglII trägt, und des Primers OPP-HuCλ5', der zum 5'-Ende der Cλ-Regionen komplementär ist und die Restriktionsstelle XhoI trägt.
Die zwei Primersequenzen sind wie folgt:
*OPP-HuCλ3' (SEQ ID NO: 18):
5'-CCT GTC AGA TCT ATG AAC ATT CTG TAG GGG-3'
(BglII-Stelle unterstrichen).
*OPP-HuCλ5' (SEQ ID NO: 19):
5'-CCG CCC TCC CTC GAG CTT CAA-3'
(XhoI-Stelle unterstrichen).
Das Amplifikationsprodukt wurde mit XhoI und BglII verdaut, bevor es in die BglII-XhoI-Stellen des Plasmids pGmAc kloniert wurde, das die für das Signalpeptid kodierende Sequenz trägt.
Die Zusammensetzung der Ligationsmischung ist wie folgt:
1 μg des mit XhoI und BglII geschnittenen Plasmids pGmAc; 200 ng des amplifizierten und mit BglII und XhoI verdauten Cλ-Fragments; 2 μl 10X-Ligasepuffer (BOEHRINGER); destilliertes Wasser q. s. auf 19 μl; 1 Unit (1 μl) Ligase (BOEHRINGER).
Die Inkubation erfolgt 2 Stunden bei 22°C; das Ligationsprodukt wird zur Transformation kompetenter E. coli-Bakterien eingesetzt.
Das erhaltene Plasmid wird als pBCλ bezeichnet.
2) Klonierung der variablen Region der λ-Kette von D7C2
Die Klonierung der variablen Region der leichten λ-Kette des humanen monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 erfolgte auf folgende Weise:
Die variable λ-Region des monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei verwendet wurden:

– die DNA des oben in Beispiel 1 beschriebenen Plasmids PTZ-V_LD7C2, die die variable Region der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 trägt, als Matritze;
– ein Primer, der eine Konsensussequenz des 5'-Endes der humanen V_L-Gene (OPP-HuVλ5') darstellt, und ein weiterer Primer, der zur 5'-Region der Sequenz komplementär ist, die für die konstante lambda-Region (OPP-HuVλ3') kodiert, und der es erlaubt, jede variable Region der λ-Kette zu amplifizieren.

Diese Primer tragen außerdem die Restriktionsstellen für die Enzyme SacI bzw. XhoI.
Die Nucleotidsequenzen dieser Primer sind wie folgt:
*OPP-HuVλ5' (SEQ ID NO: 20):
5'-CA(GC)TCTGAGCTCAC(GT)CAG-3'
(SacI-Stelle unterstrichen).
Die Verwendung dieses Primers führt zur Modifikation der Sequenz Gln-Ser-Val der drei ersten Aminosäuren des Gerüsts 1 des parentalen IgM-D7C2-Antikörpers zu Asp-Ile-Glu im rekombinanten Antikörper.
*OPP-HuVλ3' (SEQ ID NO: 21):
5'-TTGAAGCTCGAGGGAGGGCGGGAA-3'
(XhoI-Stelle unterstrichen).
Die Zusammensetzung der Amplifikationsmischung ist wie folgt:
10 μl 10X-DNA-Polymerase-Puffer, 100 ng Plasmid PPTZ-V_LD7C2; 4 μl Desoxynucleotid-Mischung (Mischung, die 5 mM dATP + 5 mM dCTP + 5 mM dGTP + 5 mM dTTP enthält, BOEHRINGER); 2 mM MgSO₄; 1000 pmol des Primers OPP-HuVλ5' und 200 pmol des Primers OPP-HuVλ3'; 1 μl thermostabile DNA-Polymerase; und destilliertes Wasser q. s. auf 100 μl.
Die Amplifikation erfolgte in 30 aufeinanderfolgenden Inkubationszyklen mit 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 40°C und 30 Sekunden bei 72°C, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 72°C.
Die Amplifikation erlaubte es, ein Fragment mit etwa 360 bp zu erhalten, das die variable VL-Region des D7C2-Antikörpers sowie die Sequenz enthält, die für die ersten 16 Aminosäuren der konstanten humanen λ-Region kodiert.
Nach Amplifikation der VL-Region wurde ein Verdau des Amplifikationsprodukts mit den Enzymen SacI und XhoI durchgeführt und das erhaltene Fragment wurde zwischen die SacI- und XhoI-Stellen des Plasmids pBCλ inseriert, was das Plasmid pBλD7C2 lieferte. Die Zusammensetzung der Ligationsmischung ist wie folgt:
2 μl 10X-Puffer für T4-DNA-Ligase (BOEHRINGER); 100 ng des mit den Enzymen SacI und XhoI behandelten V_LD7C2-Fragments; 1 μl des mit SacI und XhoI geschnittenen Plasmids pBCλ; 1 μl Ligase (1 Unit); und destilliertes Wasser q. s. auf 20 μl.
Die Inkubation erfolgt 8 Stunden bei 16°C und dann wird das Ligationsprodukt zur Transformation kompetenter E. coli-Bakterien eingesetzt.
Die Konstruktionsschritte für das Plasmid pBλD7C2 sind in 1 dargestellt.
Die Sequenz des Inserts von Plasmid pBλD7C2, die für die leichte lambda-Kette eines r-D7C2-Antikörpers und für das Signalpeptid kodiert, ist im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 5 dargestellt; die Polypeptidsequenz der von diesem Insert kodierten leichten lambda-Kette ist unter der Nummer SEQ ID NO: 6 dargestellt.
B) TRANSFERPLASMID FÜR DIE SCHWERE KETTE
1) Herstellung des Plasmids pBCγ1
a – Transferplasmid
Das Plasmid pGm16 [BLANC et al., Virology, 192, 651–654, (1993)] leitet sich von einem Plasmid ab, in das das EcoRI-P-Fragment des AcMNPV-Baculovirus, das das p10-Gen enthält, kloniert wurde. Praktisch die gesamte kodierende Sequenz wurde deletiert und durch eine BglII-Stelle ersetzt, die die Insertion von unter der Kontrolle des p10-Promotors zu exprimierenden Sequenzen ermöglicht.
b – Signalpeptid
Die für dieses Peptid kodierende Sequenz ist die eines Maus-VH-Gens (NEUBERGER M. S., 1983. EMBO J. 2, 1373–1378).
Sie wurde chemisch in Form solcher komplementärer Stränge synthetisiert, dass sie in die BglII-Stelle inseriert werden kann (1). Die Paarungs- und Ligationsbedingungen sind mit den für die leichte Kette angewandten identisch.
c – Humane konstante Regionen (Cγ1)
Die cDNA der für die humane Cγ1-Region kodierenden Sequenz wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Primer synthetisiert:
*HuCγ1BAC (SEQ ID NO : 22):
5' CAA GGT ACC ACG GTC ACC GTC TCC-3'
(KpnI-Stelle unterstrichen).
Dieser Primer entspricht einer Konsensussequenz der murinen JH-Regionen (3'-Enden der variablen Regionen der schweren murinen Ketten) und umfasst eine KpnI-Stelle.
*HuCγ1FOR (SEQ ID NO: 23):
5'-GAAGATC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G-3'
(BglII-Stelle unterstrichen).
Die Sequenz wurde ausgehend von humanen Cγ1-Sequenzen bestimmt. Der Primer ist zum 3'-Ende der humanen Cγ1 komplementär und ermöglicht es, nach Amplifikation stromabwärts vom Stopcodon eine BglII-Stelle zu rekonstituieren.
Die zur Amplifikation der humanen Cγ1-Region verwendete Matritze ist die gleiche cDNA-Mischung wie die, die zur Amplifikation der für Cλ kodierenden Sequenzen eingesetzt wurde.
Das Amplifikationsprodukt wurde sequenziert und in den Transfervektor pGm16 kloniert, der die für das Signalpeptid kodierende Sequenz enthält. Das erhaltene Konstrukt wurde pBCγ1 genannt.
2) Klonierung der variablen Region der schweren Kette des D7C2-Antikörpers
Die Klonierung der variablen V_H-Region der schweren Kette des D7C2-Antikörpers erfolgte auf folgende Weise:
Die variable V_H-Region der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei verwendet wurden:

– die DNA des Plasmids PTZ-V_HD7C2, das die variable Region der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers IgM-D7C2 trägt, als Matritze;
– ein Primer, der das 5'-Ende der variablen Regionen der VH4-Familie (OC15-HuVH4) rekonstituiert, und ein zweiter Primer, der zum 3'-Teil der humanen JH-Gene (OPP-HuJH) komplementär ist. Diese Primer tragen die Restriktionsstellen für die Enzyme PstI bzw. KpnI.

Die Nucleotidsequenzen dieser Primer sind wie folgt:
*OC15-HuVH4 (SEQ ID NO: 24):
5'-GTC CAA CTG CAG CAG TGG GGC GCA GGA CTG TTG AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC-3'
(Die PstI-Stelle ist unterstrichen).
Dieser Primer wurde bestimmt, um die Sequenz zu rekonstituieren, die für die 14 ersten Aminosäuren des Gerüsts 1 der variablen Regionen der VH4-Familie der humanen λ1-Ketten kodiert, die in Plasmid PTZ-V_HD7C2 fehlt.
*OPP-HuJH (SEQ ID NO: 25):
5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT ACC TTG GC-3'
(Die KpnI-Stelle ist unterstrichen).
Dieser Primer ist komplementär zur Konsensussequenz am 3'-Ende der humanen JH-Regionen und umfasst eine KpnI-Stelle.
Die Zusammensetzung der Amplifikationsmischung ist wie folgt:
10 μl 10X-DNA-Polymerase-Puffer, 100 ng Plasmid PPTZ-V_HD7C2, 4 μl Desoxynucleotid-Mischung (Mischung, die 5 mM dATP + 5 mM dCTP + 5 mM dGTP + 5 mM dTTP enthält, BOEHRINGER), 75 pmol des Primers OC15-HuVH4 und 100 pmol des Primers OPP-HuJH, 1 μl thermostabile DNA-Polymerase und destilliertes Wasser q. s. auf 100 μl.
Die Amplifikation erfolgte in 30 aufeinanderfolgenden Inkubationszyklen mit 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 72°C.
Nach Amplifikation der V_HD7C2-Region wurde ein Verdau des erhaltenen Amplifikationsfragments mit PstI-KpnI durchgeführt (Größe des erhaltenen DNA-Fragments etwa 360 bp) und das erhaltene Fragment wurde zwischen die PstI- und KpnI-Stellen des Plasmids pBCγ1 mit der Kassette für die schwere Kette inseriert, was das beladene Plasmid pBγ1D7C2 lieferte.
Die Zusammensetzung der Ligationsmischung ist wie folgt:
2 μl 10X-Ligasepuffer (BOEHRINGER), 20 ng des mit den Enzymen PstI und KpnI behandelten V1D7C2-Fragments, 500 ng des mit PstI und KpnI geschnittenen Plasmids pBCλ1, 1 μl Ligase (BOEHRINGER) und destilliertes Wasser q. s. auf 20 μl.
Die Ligation und die Transformation kompetenter E. coli-Bakterien erfolgten wie oben beschrieben.
Die Konstruktionsschritte für das Plasmid pBγ1D7C2 sind in 2 dargestellt.
Die Sequenz des Inserts von Plasmid pBγ1D7C2, die für die schwere gamma-1-Kette eines r-IgG-D7C2-Antikörpers und für das Signalpeptid kodiert, ist im anliegenden Sequenzprotokoll unter der Nummer SEQ ID NO: 5 dargestellt; die Polypeptidsequenz der von diesem Insert kodierten schweren gamma-1-Kette ist unter der Nummer SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Beispiel 3: Konstruktion eines rekombinanten Baculovirus, das den r-D7C2-Antikörper produziert
a – Insertion der leichten Kette
Das beladenen Plasmid pBλD7C2 wurde zur Cotransfektion der Insektenzellen mit der DNA von Wildtyp-Baculovirus AcMNPV verwendet.
Die Transfektionsbedingungen sind wie folgt: 500 ng Virus-DNA und 4 μg Plasmid-DNA in Gegenwart von 40 μl DOTAB (BOEHRINGER) in 3 ml Kulturmedium ohne Kälberserum für Insektenzellen. Die Cotransfektion wurde mit 4 × 10⁶ Sf9-Insektenzellen (ATCC35CRL 1711) durchgeführt. Nach 4 Stunden Kontakt bei 28°C wird die Cotransfektionsmischung gegen 4 ml TGV5-Medium (Vollmedium für Insektenzellen mit 5% Kälberserum) ausgetauscht. Die Kultivierung wird 6 Stunden bei 28°C fortgesetzt.
Das Virus, das die leichte Kette des Antikörpers r-IgG-D7C2 unter der Kontrolle des Polyhedrinpromotors produziert, wurde zuerst auf seine Unfähigkeit zur Produktion von Polyhedrin selektioniert und dann auf seine Fähigkeit zur Expression einer leichten Kette mit etwa 25 kDa, nachweisbar durch Western-Blot mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Antikörpers gegen die humane λ-Kette (CALTAG, TEBU).
Die DNA des erhaltenen rekombinanten Virus (AcMNPV-λD7C2 genannt) wurde aus Überständen infizierter Zellen präpariert.
b – Insertion der schweren Kette
Das beladenen Plasmid pBγ1D7C2 wurde bei der Cotransfektion mit der DNA des modifizierten Baculovirus AcMNPV-λD7C2 verwendet. Die Cotransfektion erfolgte mit 500 ng Virus-DNA und 5 μg Plasmid-DNA auf Sf9-Zellen. Die Doppelrekombinanten wurden mit der Methode der limitierten Verdünnung in Verbindung mit der ELISA-Methode selektioniert.
Nach einer Woche Kultivierung wird der Cotransfektionsüberstand verdünnt (10^–4 bis 10^–10) und dann in 96-Loch-Platten auf Sf9-Zellen verteilt (100 μl Überstand/Vertiefung), und nach einer Stunde Kontakt werden 100 μl Medium in jede Vertiefung gegeben. Die Sekretion von γ1-Immunglobulinen wird im Überstand einer jeden Vertiefung nach einer Woche Kultivierung bei 28°C mittels ELISA untersucht.
Der ELISA-Test wird wie nachfolgend angegeben durchgeführt:
50 μl Kulturüberstand einer von jeder Vertiefung werden auf eine mit Anti-Gesamt-Human-IgG-Antikörpern (CALTAG, TEBU) beschichtete ELISA-Platte (NUNC) aufgebracht. Die Adsorption der Anti-IgG-Antikörper (100 μl einer 1/2000-Verdünnung pro Vertiefung) erfolgte in PBS-Puffer (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na₂HPO₄; 1,4 mM KH₂PO₄) über Nacht bei 4°C nach einer vorherigen 1-stündigen Sättigung bei 37°C mit PBS, das mit 5% Kälberserum supplementiert war. Nach Zugabe der Kulturüberstände werden in jede Vertiefung 50 μl von mit 1% Kälberserum und 0,1% Tween 20 supplementiertem PBS gegeben. das Ganze wird bei 37°C inkubiert und es werden drei Waschvorgänge mit mit 1% Tween 20 supplementiertem PBS durchgeführt. Die Platten werden 1 Stunde bei 37°C mit Biotingekoppelten Anti-Human-IgG-Antikörpern (CALTAG) mit 100 μl/Vertiefung einer 1/10000-verdünnung in PBS, das mit 1% Kälberserum und 0,1% Tween 20 supplementiert ist, beschichtet.
Nach drei erneuten Waschvorgängen werden die Platten in Gegenwart von Streptavidin/alkalische Phosphatase-Konjugat (Verdünnung 1/10000, CALTAG) inkubiert und dann mit dem Substrat p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml, SIGMA), verdünnt in alkalischem Puffer (9 Volumenteile 3 M NaCl-Lösung und ein Volumenteil 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 9,6), entwickelt. Die optische Dichte jeder Vertiefung wird durch Spektrophotometrie bei 405 nm gemessen. Die Überstände der bei den stärksten Virusverdünnungen positiven Vertiefungen werden geerntet und aufbewahrt.
Die Isolierung eines rekombinanten Virusklons, der die leichte Kette und die schwere Kette exprimiert, wird durch zwei weitere Infektionsreihen in 96-Loch-Platten und Antikörperbestimmung mittels ELISA, gefolgt von einer Klonierung mit der Methode der Lyse-Plaques, sichergestellt. Das selektionierte Virus wurde Ac10HRh-33LRh (313) genannt.
Beispiel 4: Produktion und Reinigung des rekombinanten monoklonalen Antikörpers r-IgG-D7C2
a – Kultivierung und Reinigung
Das selektionierte Virus Ac10HRh-33LRh (313) wird auf Sf9-Insektenzellen in TGV2-Medium (2% fötales Kälberserum) vermehrt. Die Konzentration an produziertem und sekretiertem Antikörper wird mittels ELISA bestimmt; sie liegt bei etwa 3 mg/l.
Eine Teil des erhaltenen viralen Überstands wird mit Hilfe von CENTRIPREP 30-Konzentratoren (AMICON) bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 1800 Umdrehungen pro Minute 10-fach konzentriert. Dieses Konzentrat wird direkt für die in vitro-Tests auf biologische Aktivität eingesetzt. Die Konzentration an rekombinantem Antikörper wird zu 30 mg/l im Konzentrat bestimmt.
Ferner wird ein Teil (50 ml) des viralen Überstands auf eine zuvor mit PBS äquilibrierte Protein A-Chromatographiesäule (SEPRACOR-Gel) aufgetragen, um die IgG1-Rekombinante zu reinigen. Nach zweimaligem aufeinanderfolgenden Spülen der Säule mit PBS und einer 0,1 M Citrat/Citronensäure-Lösung, pH 5, wird das Immunglobulin mit einer 0,1 M Citrat/Citronensäure-Lösung, pH 3, eluiert. Die Elution wird durch Messung der OD bei 280 nm verfolgt. Schließlich werden die aufgefangenen Fraktionen mit einer Tris-HCl-Lösung, pH 8, auf pH 7 neutralisiert und bei 4°C aufbewahrt. Die gereinigte Antikörperlösung wird parallel zur konzentrierten Lösung auf biologische Aktivität getestet.
b – Überprüfung der Zusammenlagerung und der Größe der Immunglobulinketten
Die Qualität des von dem rekombinanten Virus Ac10HRh-33LRh (313) produzierten Antikörpers wurde durch elektrophoretische Migration auf einem 12,5%igen SDS-PAGE-Gel überprüft, wobei ein handelsüblicher monoklonaler humaner IgGλ (SIGMA) als Kontrolle verwendet wurde. Dieser Versuch zeigte, dass der nicht-reduzierte humane Antikörper auf gleicher Höhe wie der humane Kontrollantikörper läuft. Nach Reduktion mit Dithiothreitol (DTT) beobachtet man das Auftreten von zwei Untereinheiten, die den schweren und leichten Ketten entsprechen und die auf gleicher Höhe wie die Ketten des in gleicher Weise behandelten humanen Kontrollantikörpers laufen.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen wurden die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und die schweren und leichten Ketten wurden mit spezifischen Anti-Human-IgG- oder Anti-Human-λ-Antikörpern nachgewiesen.
Beispiel 5: Biologische Aktivität des rekombinanten monoklonalen Antikörpers r-IgG-D7C2
Die biologische Aktivität des rekombinanten Antikörpers wurde unter Verwendung des 10-fach konzentrierten Kulturüberstandes der Insektenzellen, die r-IgG-D7C2 produzierten, gemessen. Die Messungen erfolgten bezogen auf einen "nicht-pertinenten" (irrelevanten) rekombinanten Antikörper (IgG1, κ), der gegen ein anderes Protein als das Rhesus-Antigen gerichtet (negative Kontrolle) und unter den gleichen Bedingungen in Insektenzellen produziert worden war, und bezogen auf den humanen parentalen monoklonalen Antikörper IgM-D7C2 (IgM, λ).
Die biologische Aktivität des rekombinanten Antikörpers r-IgG-D7C2 wurde bestimmt:

1. Durch Agglutinationstests in Röhrchen mit dem 10-fach konzentrierten Überstand der Insektenzellenkulturen (30 μg/l) und einem Panel Rh-positiver (R1/r, R1/R1, R2/R2, Ro/r) und Rh-negativer (r/r) (G. N. R. G. S.) Papain-behandelten humaner roter Blutzellen. 50 μl konzentrierter Kulturüberstand, der r-IgG-D7C2 enthielt, und 50 μl der Suspension von 2% roten Blutzellen wurden 45 Minuten bei 37°C inkubiert; die Agglutination wird nach der Stärke der Reaktion mit + bis +++ beurteilt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben. Tabelle I
Der Titer des rekombinanten Antikörpers r-IgG-D7C2, bestimmt durch 1 Stunde Inkubation des Überstands mit einem Pool Papainbehandelter roter R1/r-Blutzellen bei 37°C beträgt 1/512.
2. Durch einen ADCC-Test
* Effektorzellen (Humanlymphozyten) Die mononukleäre Schicht wird aus peripherem Blut gewonnen, das heparinisiert und über einen Ficoll-Hypaque-Gradienten aufgetrennt war. Die Zellen werden eine Nacht bei 37°C in einer Zellkulturschale aus Kunststoff (um die Monozyten zu supprimieren) mit 1% fötalem Kälberserum inkubiert; die nicht-adhärierenden Zellen werden anschließend zurückgewonnen und in einer Menge von 8 × 10⁶ Zellen/ml für den Zytotoxizitätstest verwendet.
* Targetzellen (rote Blutzellen)
– Das venöse Blut von gesunden Spendern der R1/R1-Gruppe (Rhesus-positiv) und der r/r-Gruppe (Rhesus-negativ) wird in Citrat gesammelt und dann werden die Blutzellen zu 2% in NaCl suspendiert und mit Papain behandelt.
– Markierung mit Chrom Cr⁵¹ 20 × 10⁶ Papain-behandelte rote Blutzellen werden eine Stunde bei 37°C mit 200 μCi Cr⁵¹ inkubiert, 4mal gewaschen und 9 zu 1000 in NaCl resuspendiert.
– ADCC-Test

Die Versuche werden dreifach durchgeführt, einschließlich der folgenden Kombinationen:

– Cr⁵¹-markierte rote Blutzellen, suspendiert 9 zu 1000 in NaCl, um die spontane Freisetzung von Chrom zu messen.
– Cr⁵¹-markierte rote Blutzellen, suspendiert in destilliertem Wasser, um die maximale Freisetzung von Chrom zu messen.
– Cr⁵¹-markierte rote Blutzellen ohne Antikörper, um die mögliche Zytotoxizität der Effektorzellen zu messen.
– Cr⁵¹-markierte rote Blutzellen, sensibilisiert mit:
– der Anti-D-Rekombinante r-IgG-D7C2;
– einem spezifischen polyklonalen Anti-D-Antikörper (Gammaglobuline, CNTS) als positive Kontrolle;
– dem "nicht-pertinenten" rekombinanten Antikörper als negative Kontrolle.

Die Antikörper werden in zwei verschiedenen Konzentrationen eingesetzt (7,5 μg/ml, 3,5 μg/ml).
Die präparierten Zellen, Effektor- und Targetzellen, werden wie folgt in Mikrotiterplatten mit rundem Boden verteilt:
50 μl Lymphozyten (8 × 10⁶ Zellen/ml) und 50 μl der Suspension der Cr⁵¹-markierten roten Blutzellen (8 × 10⁵ Zellen/ml) werden in einem Verhältnis von 10/1 in jede Vertiefung gegeben; anschließend werden zur vergleichenden Untersuchung 50 μl der verschiedenen Antikörper zugegeben. Die Menge an freigesetztem Cr⁵¹ wird für jede Suspension roter Blutzellen gemessen und die % spezifische Lyse werden nach folgender Formel berechnet:
Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen II (rote Blutzellen R1/R1) und III (rote Blutzellen r/r) angegeben.
TABELLE II
TABELLE III
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Antikörper r-IgG-D7C2 eine spezifische Lyse der Rh-positiven roten R1/R1-Blutzellen induziert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Fragment, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus: – einem DNA-Fragment, das für die variable Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, wobei diese variable Domäne durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definiert ist; – einem DNA-Fragment, das für die variable Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, wobei diese variable Domäne durch die Sequenz SEQ ID NO: 4 definiert ist.
Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens ein DNA-Fragment nach Anspruch 1 unter der transkriptionellen Kontrolle eines Baculoviruspromotors umfasst.
Expressionskassette nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Elemente umfasst, die die Expression der schweren Kette oder der leichten Kette eines als r-D7C2 bezeichneten rekombinanten monoklonalen Antikörpers erlauben, wobei diese Elemente bestehen aus: – einem Baculoviruspromotor, unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen: – eine Sequenz, die für ein Signalpeptid für die Sekretion kodiert; und – eine Sequenz, die für die variable Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, und eine Sequenz, die für die konstante Domäne der leichten Kette eines Immunglobulins kodiert; oder – eine Sequenz, die für die variable Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2 kodiert, und eine Sequenz, die für die konstante Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins kodiert.
Expressionskassette nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für die konstante Domäne der leichten oder der schweren Immunglobulinkette kodiert, eine Sequenz humanen Ursprungs ist.
Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Baculoviruspromotor der Promotor für Polyhedrin oder eines seiner Derivate oder der Promotor für p10 oder eines seiner Derivate ist.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens ein DNA-Fragment nach Anspruch 1 umfasst.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens eine Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5 umfasst.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Transfervektor darstellt, der ein Insert trägt, das umfasst: eine Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4 und zu beiden Seiten dieser Kassette Baculovirus-Sequenzen, die homolog zu denen der Regionen sind, die den Teil des Baculovirus-Genoms flankieren, an dessen Stelle die Kassette inseriert werden soll.
Transfervektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese Baculovirus-Sequenzen homolog zu denen der Regionen sind, die das Gen für p10 flankieren, oder homolog zu denen der Regionen, die das Gen für Polyhedrin flankieren.
Transfervektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionskassette, die das Gen enthält, das für die leichte Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, von den Regionen flankiert wird, die das Gen für Polyhedrin in Wildtyp-Baculovirus umgeben, und die Expressionskassette, die das Gen trägt, das für die schwere Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, von den Regionen flankiert wird, die das P10-Gen in Wildtyp-Baculovirus umgeben.
Rekombinantes Baculovirus, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5 umfasst.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Expressionskassette umfasst, die die Sequenz umfasst, die für die H-Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, und eine Expressionskassette, die die Sequenz umfasst, die für die L-Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrolliert, die für die L-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 kodiert, und der Promotor, der die Transkription der Sequenz kontrolliert, die für die H-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 kodiert, zwei unterschiedliche Promotoren sind.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich der eine dieser Promotoren an der Stelle befindet, die bei Wildtyp-Baculovirus durch den Promotor für Polyhedrin ausgefüllt ist, und sich der andere an der Stelle befindet, die bei Wildtyp-Baculovirus durch den Promotor für P10 ausgefüllt ist.
Rekombinantes Baculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Transkription der Sequenz, die für die leichte Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, unter Kontrolle des Promotors für Polyhedrin oder einem seiner Derivate steht, und die Transkription der Sequenz, die für die schwere Kette des Antikörpers r-D7C2 kodiert, unter Kontrolle des Promotors für P10 oder einem seiner Derivate steht.
Rekombinantes Baculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, das mit der L-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 verbunden ist, und die Sequenz, die für das Signalpeptid kodiert, das mit der H-Kette des monoklonalen Antikörpers r-D7C2 verbunden ist, zwei unterschiedliche Sequenzen sind.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 16, hinterlegt bei der C. N. C. M. am 19. August 1994 unter der Nummer I-1468.
Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 17 infiziert sind.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt umfasst, bei dem man Insektenzellen nach Anspruch 18 kultiviert, und einen Schritt, bei dem man den Antikörper aus dem Kulturmedium erhält,
Rekombinanter monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass seine variablen Domänen bestehen aus: – der variablen Domäne der leichten Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2, wobei diese variable Domäne durch die Sequenz SEQ ID NO: 2 definiert ist; und – der variablen Domäne der schweren Kette des monoklonalen Antikörpers D7C2, wobei diese variable Domäne durch die Sequenz SEQ ID NO: 4 definiert ist.
Rekombinanter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass er nach einem Verfahren nach Anspruch 19 erhältlich ist.
Rekombinanter monoklonaler Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptidsequenz seiner leichten Kette und die Polypeptidsequenz seiner schweren Kette humane Sequenzen sind.
Rekombinanter monoklonaler Antikörper nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass er Zur Klasse der IgG gehört.
Verwendung eines rekombinanten monoklonalen Antikörpers nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 23 zur Herstellung von Medikamenten.