DE68907735T2

DE68907735T2 - Genfragmente, die die variable Region eines Anti-HIV-Antikörpers codieren, von diesen exprimierte chimäre Anti-HIV-Antikörper und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE68907735T2
Application number: DE89101583T
Authority: DE
Inventors: Yasuyuki Eda; Toshio Hattori; Kazuhiko Kimachi; Hiroaki Maeda; Shuzo Matsushita; Kiyoshi Takatsuki; Sachio Tokiyoshi
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1988-01-30
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-01-31
Also published as: EP0327000A3; JPH022352A; ES2059577T3; EP0327000B1; AU613699B2; DE68907735D1; EP0327000A2; AU2895489A; JP2646007B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue chimäre Antikörper gegen das menschliche Immunschwäche-Virus (HIV), die zur Behandlung und Prävention des durch HIV verursachten erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) nützlich sind. Die vorliegende Erfindung betrifft vor allem Genfragmente, die die variablen Regionen der H- und der L-Ketten der chimären anti-HIV-Antikörper codieren, die chimäre anti-HIV-Antikörper mit einer MIV-neutralisierenden Aktivität exprimieren können, eine Transformante, in die solche Genfragmente aufgenommen sind, davon exprimierte chimäre anti-HIV-Antikörper und ein Verfahren zu deren Herstellung.
AIDS ist eine durch das Retrovirus HIV verursachte Krankheit [Barre-Sinoussi et al., Science 220 (1983), 868; Popovic et al., Science 224 (1984), 497]. Die Krankheit wurde 1981 bei fünf Homosexuellen in Los Angeles entdeckt, die nach einem Bericht der Wochenzeitschrift American CDC [Centers for Disease Control: MMWR 30 (1981), 250] an Kalini-Lungenentzündung litten. Diese Krankheit hat sich seitdem sehr schnell über die ganze Welt verbreitet. Nach einer statistischen Erhebung durch die Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist diese Krankheit bereits in 122 Ländern festgestellt worden und die Gesamtzahl der Patienten überschritt am 12. August 1987 60 000. Auch in Japan sind am 4. September 1987 fünfzig Patienten bestätigt worden, von denen achtundzwanzig Patienten bereits verstorben sind. Obwohl AIDS sich so schnell über die gesamte Welt verbreitet hat, sind Prävention und Behandlung dieser Krankheit noch nicht effektiv möglich.
Ein in der Praxis verwendeter anti-HIV-Wirkstoff ist AZT (3'-Azido-3'-desoxythymidin) [Carroll Ezzell, Nature 326 (1987), 430]. Dieses Arzneimittel wurde als ein Krebs-hemmender Wirkstoff entwickelt und wirkt früh im viralen Lebenszyklus durch Blockierung der Reversen Transkriptase (RT) und damit der reversen Transkription des RNA-Genoms von HIV-1 in DNA. Es ist jedoch festgestellt worden, daß dieses Arzneimittel eine starke Toxizität gegen aktives hämatopoetisches Gewebe zeigt, wodurch in vielen Fällen Anämien verursacht werden. Viele andere Substanzen sind auf eine anti-HIV-Aktivität untersucht worden, es ist jedoch bisher noch kein wirksamer und sicherer anti-HIV-Wirkstoff entwickelt worden. Obwohl die Untersuchungen zur Entwicklung eines Impfstoffs zur Prävention dieser Krankheit intensiv fortgesetzt worden sind, wurde bisher nicht über einen zur praktischen Anwendung geeigneten Impfstoff berichtet.
Ein Anhaltspunkt für eine Immuntherapie ist möglicherweise durch einen Vergleich der immunologischen Profile von serologisch-positiven, gesunden Individuen mit Patienten mit einem AIDS-verwandten Komplex (ARC) und AIDS gefunden worden. HIV-neutralisierende Antikörper wurden häufig in infizierten Individuen nachgewiesen, und niedrige oder fehlende neutralisierende Titer entsprachen einer schlechten Prognose. Der Antikörper-Spiegel steht mit der vorhandenen Antikörper-abhängigen Zellcytotoxizität (ADCC) in Zusammenhang oder hemmt die in der asymptomatischen Phase vorhandene, in der symptomatischen Phase jedoch abnehmende Funktion der RT [Ho et al., J. Virologv 61 (1987), 2024]. Ferner ist ein Zusammenhang zwischen den klinischen Symptomen und den neutralisierenden Antikörpern in einer Gruppe von Thalassämie-Patienten, die durch Bluttransfusion und HIV- positiv wurden, bei Kindheits-AIDS und einer ARC-Gruppe festgestellt worden [Guroff, R. et al., J. Immunol. 138 (1987), 3731; Guroff R. et al., Pediatric Research, im Druck] . In beiden Fällen ist berichtet worden, daß die klinischen Symptome in den Fällen, in denen neutralisierende Antikörper nachgewiesen werden konnten, nicht ernst sondern relativ positiv waren, sich jedoch in den Fällen, in denen die neutralisierenden Antikörper nicht nachgewiesen werden konnten, verschlimmerten, woraus geschlossen werden kann, daß neutralisierende Antikörper in vivo tatsächlich wirksam sind. Es gibt auch eine Veröffentlichung mit dem Vorschlag, selbst an HIV-leidenden Menschen eine aktive Immunisierung durchzuführen [Salk, J., Nature 327 (1987), 473]. Daher sind HIV-neutralisierende Antikörper zur Therapie und Prävention von AIDS wichtig.
Wie vorstehend erwähnt, sind anti-HIV-Antikörper ein potentieller Wirkstoff zur Verhinderung der Ausbreitung der Krankheit und zur Entfernung der betroffenen Zellen in vivo, und man erwartet, daß sie bei Verwendung in Kombination mit dem bereits klinisch verwendeten anti-viralen Wirkstoff und ähnlichen eine ausgezeichnete Wirkung zeigen.
Als vorstehend beschriebener anti-HIV-Antikörper können monoclonale Antikörper mit der HIV-neutralisierenden Aktivität verwendet werden. Die grundsätzlichen Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern sind bereits etabliert worden, die meisten betreffen jedoch monoclonale Maus-Antikörper. Im medizinischen Bereich, d. h., bei der immunologischen Diagnose, bei der Behandlung und Prävention von Krankheiten, wird die Verabreichung dieser monoclonalen Maus-Antikörper als zur praktischen Anwendung noch nicht geeignet betrachtet. Dies ist auf ihre physiologische Aktivität (z. B. Komplement-aktivierende Aktivität oder ADCC) oder Antigenität (monoclonale Maus-Antikörper verursachen bei ihrer Verabreichung als Fremdprotein an Menschen Nebenwirkungen, beispielsweise einen anaphylaktischen Schock oder eine Serumerkrankung) zurückzuführen. Bei menschlichen monoclonalen Antikörpern existieren diese Probleme nicht, und man erwartet, daß sie von praktischem Nutzen sind.
Da mehrfache Antikörper-Injektionen in immuntherapeutischen Protokollen notwendig sind, ist eine Verminderung der Antigenität ein wichtiges Anliegen. Wenn monoclonale Antikörper verfügbar wären, wurde es sich durchaus lohnen, viele neue Anwendungen in der Serumtherapie zu erforschen, wenn nur Überempfindlichkeitsreaktionen vermieden werden könnten. Menschliches Immunglobulin ist bei der Verabreichung an Menschen dem anderer Arten vermutlich überlegen, da es im Hinblick auf die Effektorzellen des Empfängers besser funktioniert und weniger immunogen ist. Die Vorgehensweise besteht darin, monoclonale Antikörper vom Menschen zu verwenden, die entweder durch menschliche Hybridome oder durch Zellinien von menschlichen, durch das Epstein-Barr-Virus immortalisierten B-Lymphocyten produziert werden. Zur Zeit sind jedoch die Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern vom Menschen im Vergleich mit denen von monoclonalen Maus-Antikörpern nicht gut entwickelt, und daher ist es noch schwierig, monoclonale Antikörper vom Menschen mit einer größeren Spezif ität als die von monoclonalen Maus-Antikörpern zu erhalten. Ferner gibt es ethische Probleme bei der in vivo-Immunisierung und Schwierigkeiten bei der in vitro-Immunisierung, die als Quellen für Produzenten von monoclonalen Antikörpern vom Menschen erforderlich sind. Das heißt, bei Antikörpern gegen ein gefährliches Antigen, beispielsweise HIV, ist es im Hinblick auf biologische Risiken nicht ratsam menschliche Lymphocyten zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern zu verwenden. Daher gibt es nur wenige HIV-neutralisierende monoclonale Antikörper vom Menschen, die zur Therapie und Prävention verwendet werden können.
Man nimmt an, daß sich mit chimären Antikörpern die Lösung dieses Problems angehen läßt. Wie es gut bekannt ist, bestehen Immunglobulin-Moleküle aus Domänen von variablen und konstanten Regionen. Die konstanten Domänen von Maus- Immunglobulin-Molekülen sind wahrscheinlich ein wichtiges Ziel der Antigen-Erkennung durch das menschliche Immun-System. Wenn die konstanten Domänen von Maus-Antikörpern durch ihre menschlichen Gegenstücke ersetzt werden könnten, würde man erwarten, daß die erhaltenen chimären Maus-Mensch- Moleküle die ursprüngliche Spezifität beibehalten, jedoch bei Menschen eine viel geringere Antigenität aufweisen. Verfahren der Genmanipulation sind nun verfügbar geworden, die die Herstellung von künstlichen chimären Maus-Mensch- Antikörpern erlauben [Neuberger et al., Nature 312 (1984), 604; Boulianne et al., Nature 312 (1984), 643; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851].
Andererseits hat die Erforschung des Immunglobulin- Gens im Zuge der Entwicklung der Verfahren der Gentechnik in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht [Susumu Tonegawa, Nature 307 (1983), 575; Tasuku Honjo, Annual Rev. Immunol. 1 (1983), 499]. Wie es gut bekannt ist, werden Immunglobuline durch Gene für die variable Region (V-Region) codiert, die das Antigen bindet, und durch Gene für die konstante Region (C-Region), die im Zusammenhang mit der Wechselwirkung mit einer Komponente des Complementsystems oder mit einer spezifischen Zelle eine physiologische Aktivität aufweist. Funktionelle Immunglobulin-Gene werden durch somatische Rekombinationsereignisse gebildet, in denen Gen-Segmente fusioniert werden, (V, variable Region; D, Diversitäts-Segment; J, Verbindungsregion; C, konstante Region), die in der Keimbahn-DNA weit auseinanderliegen. Daher sind die V-J- und V-D-J-Verbindungen wesentlich für die Bildung der DNA-Sequenz, die die variable Region der leichten (L) Kette bzw. der schweren (H) Kette codiert, während die "Switch"-Rekombination die codierenden Sequenzen der C-Region der Klassen der H-Kette (Isotypen) ersetzt. Die wichtigste Funktion der V-J- und V-D-J-Verbindungen besteht darin, vollständige Immunglobulin-Gene mit unterschiedlichen Arten von die V-Region-codierenden DNA-Sequenzen aus der begrenzten Zahl der vom Keimbahngenom getragenen Gensegmente zu erzeugen. Wenn ein Antikörper ein bestimmtes Epitop spezifisch bindet, sind daher die DNA-Sequenzen, die die V- Region der L-Kette bzw. der H-Kette codieren, beinahe die einzigen Sequenzen gegen das Epitop.
Jede V-Region wird in einer derartigen Weise gebildet, daß ein Genfragment aus einer Anzahl von V- Genfragmenten, D-Genfragmenten (bei der L-Kette nicht festgestellt) und J-Genfragmenten ausgewählt wird, und diese anschließend in dieser Reihenfolge miteinander verbunden werden. In diesem Fall hängt die Spezifität eines Antikörpers stark davon ab, welches Genfragment aus jeder Gruppe von Genfragmenten ausgewählt wird, mit anderen Worten, die Spezifität eines Antikörpers wird durch die Kombination der Genfragmente im Gen der V-Region der H-Kette und der L-Kette bestimmt. Daher wird angenommen, daß eine bestimmte Kombination der V-D-J- (oder V-J)-Genfragmente der H-Kette und der L-Kette einem spezifischen Antigen entspricht.
Es gibt DNA-Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts des Gens der V-Region, die eine wichtige Rolle bei der Expression des Immunglobulin-Gens spielen können. Das heißt, stromaufwärts des Gens der V-Region existiert eine DNA- Sequenz, die als Promotor wirkt, und stromabwärts des Gens der V-Region (zwischen dem J-Genfragment und dem Gen der C- Region) existiert eine DNA-Sequenz, die als Enhancer wirkt, wodurch die Effizienz der Transkription des Immunglobulin- Gens verstärkt wird. Diese DNA-Sequenzen des Promotors und des Enhancers sind bereits identifiziert und in Immunglobulin-Genen sowohl von Mäusen als auch von Menschen bestimmt worden [Queen, C. et al., Cell 33 (1983), 741; Banerji, J. et al., Cell 33 (1983), 729; Gillies, S. D. et al., Cell 33 (1983), 717; Hayday, A. C. et al., Nature 307 (1984), 334; und Emorine, L. et al., Nature 304 (1983), 447].
Zur Lösung der vorstehend erwähnten Probleme sowohl bezüglich der monoclonalen Maus-Antikörper als auch der monoclonalen Antikörper vom Menschen gibt es ein Vorgehen, in dem ein chimärer Maus-Mensch-Antikörper hergestellt wird, in dem die Antigen-bindende variable (V) Region von einem monoclonalen Maus-Antikörper stammt, während die konstante (C) Region, die die Antigenität oder Immunogenität und physiologische Aktivität betrifft, von einem monoclonalen Antikörper vom Menschen stammt, wie in der japanischen Erstveröffentlichung der Patente mit der Nr. 155132/1985 und der Nr. 47500/1986 beschrieben. Es sollte berücksichtigt werden, daß es zur Herstellung eines solchen chimären Antikörpers sehr wichtig ist, DNA-Sequenzen von Genen bereitzustellen, die die Aminosäuresequenzen der zur Bindung eines gewünschten Antigens fähigen variablen Region des Antikörpermoleküls codieren. Bis zur vorliegenden Erfindung war es jedoch sehr schwierig, solche Gene (DNA-Sequenzen) , die die Aminosäuresequenzen der variablen Region der anti-HIV-Antikörper codieren, und noch schwieriger einen Antikörper zu finden, der eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweist. Daher gibt es bis jetzt keine Beschreibung von einem gegen HIV wirksamen chimären Antikörper, geschweige denn von einer Herstellung eines eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden chimären anti-HIV-Antikörpers.
Die hier genannten Erfinder haben intensive Untersuchungen zur Herstellung von chimären, eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden Antikörpern durchgeführt. Als Ergebnis wurden Gene (DNA-Sequenzen), die die variable Region eines eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden Antikörpers codieren, aus einer Hybridom-Zelle isoliert, die einen eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden Antikörper produziert, und chimäre Maus-Mensch- Antikörper gegen HIV, die eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisen, durch Expression der so hergestellten Gene produziert.
Ein Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Genfragments, das die variable Region der H-Kette eines eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden Immunglobulins codiert und DNA-Sequenzen enthält, die die nachstehend dargestellten Aminosäuresequenzen (a) bis (d) codieren:
Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein Genfragment bereit zustellen, das die variable Region der L-Kette eines eine HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden Immunglobulins codiert und das DNA-Sequenzen enthält, die die nachstehend dargestellten Aminosäuresequenzen (a') bis (d') codieren:
Ein weiterer Zweck ist die Bereitstellung von chimären anti-HIV-Antikörpern, die eine variable (V) Region umfassen, die von der Antigen-bindenden Stelle eines monoclonalen Maus-Antikörpers mit einer HIV-neutralisierenden Aktivität stammt, und eine von einem menschlichen monoclonalen Antikörper stammende konstante (C) Region, wobei die variablen Regionen der H-Kette bzw. der L-Kette die nachstehend dargestellten Aminosäuresequenzen enthalten: [Die in der variablen Region der H-Kette enthaltende Aminosäuresequenz] [Die in der variablen Region der L-Kette enthaltende Aminosäuresequenz]
Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer transformierten Myelomzelle, die cotransformiert ist mit einem Expressionsvektor, der ein die H-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers codierendes Gen enthält, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region der H-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende (stromabwärts) eines Genfragments, das die variable Region einer H-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, und einen Promotor stromaufwärts dieses Gens, sowie mit einem Expressionsvektor, der ein die L-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers codierendes Gen enthält, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region der L-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende eines Genfragments, das die variable Region einer L-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, und einen Promotor stromaufwärts dieses Gens.
Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer transformierten Myelomzelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein die H- Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers codierendes Gen enthält, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region der H-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende eines Genfragments, das die variable Region einer H-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, und einen Promotor stromaufwärts dieses eine H-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers codierenden Gens, sowie ein die L-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörper codierendes Gen, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende eines Genfragments, das die variable Region einer L- Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, und einen Promotor stromaufwärts dieses die L-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers codierenden Gens.
Ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines chimären anti-HIV-Antikörpers, das in einer Maus-Myelomzelle die gleichzeitige Expression eines Gens umfaßt, das die H-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers codiert, wobei ein die konstante Region der H-Kette eines menschlichen Immunglobulins codierendes Gen-Fragment mit dem 3'-Ende (stromabwärts) eines Genfragments verknüpft ist, das die variable Region der H-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, und eines die L-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörper codierenden Gens, wobei ein Genfragment, das die konstante Region einer L-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, mit dem 3'-Ende (stromabwärts) des Genfragments verknüpft ist, das die variable Region einer L-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV- neutralisierender Aktivität codiert, und die Gewinnung des exprimierten Produkts.
Da die erfindungsgemäßen chimären anti-HIV-Antikörper ihre ursprüngliche Spezifität bewahren (sie zeigen dadurch eine anti-HIV-neutralisierende Aktivität, haben aber eine viel niedrigere antigene Wirkung gegen Menschen), können sie als sicherer und keine Nebenwirkungen verursachender Wirkstoff zur Diagnose, Behandlung und Prävention von AIDS verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

In Fig. 1 und 3 sind die Restriktionskarten der jeweils in den Beispielen hergestellten Gene der VH-Region bzw. der Vκ-Region dargestellt.
In Fig. 2 ist eine Röntgenaufnahme dargestellt, die das Ergebnis einer Northern-Hybridisierungs-Analyse eines Gens der VH-Region zeigt, das in Beispiel 2 aus einer mRNA aus 54'CB1-Zellen hergestellt wurde.
In Fig. 4 ist eine Röntgenaufnahme dargestellt, die das Ergebnis einer Northern-Hybridisierungs-Analyse eines Gens der Vκ-Region zeigt, das in Beispiel 2 aus einer mRNA aus 54'CB1-Zellen hergestellt wurde.
In den Figuren 5 und 7 ist jeweils ein Beispiel einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz eines Gens der VH-Region bzw. der Vκ-Region dargestellt.
In den Figuren 6 und 8 ist jeweils ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz eines Gens der VH-Region bzw. der Vκ-Region dargestellt.
In Fig. 9 ist eine Ausführungsform der Konstruktion eines ein Gen für die H-Kette eines chimären anti-HIV- Antikörpers enthaltenden Expressionsvektors dargestellt.
In Fig. 10 ist eine Ausführungsform der Konstruktion eines ein Gen für die L-Kette eines chimären anti-HIV- Antikörpers enthaltenden Expressionsvektors dargestellt.
In Fig. 11 ist eine weitere Ausführungsform der Konstruktion eines ein Gen für die L-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers enthaltenden Expressionsvektors dargestellt.
In Fig. 12 ist eine Ausführungsform der Konstruktion eines Expressionsvektors dargestellt, der ein Gen für die H- Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers und ein Gen für die L-Kette eines chimären anti-HIV-Antikörpers enthält.
In Fig. 13 ist eine Röntgenaufnahme dargestellt, die das Ergebnis einer Northern-Hybridisierungs-Analyse einer mRNA einer Zelle zeigt, die einen chimären anti-HIV- Antikörper mit einem Gen der VH-Region und einem Gen der Vκ- Region produzierte, wobei beide Gene nach Beispiel 2 hergestellt wurden, ein menschliches Gen der Cγ1-Region und ein Gen der C -Region, wobei beide Gene nach Beispiel 3 hergestellt wurden.
Fig. 14 zeigt das Ergebnis einer unter Verwendung eines anti-Mensch-IgG-Antikörpers durchgeführten Western- Blotting-Analyse eines Proteins eines chimären anti-HIV- Antikörpers.
In Fig. 15 ist das Ergebnis einer unter Verwendung eines chimären anti-HIV-Antikörpers durchgeführten Western- Blotting-Analyse eines solubilisierten HIV-Partikels dargestellt.
In Fig. 16 ist ein Schaubild dargestellt, das das Ergebnis einer unter Verwendung eines chimären anti-HIV- Antikörpers durchgeführten Facster-Analyse einer HIV-befallenen Zelle anzeigt.
In Fig. 17 ist ein Photo von Zellen dargestellt, das die Fähigkeit eines anti-HIV-Antikörpers zur Hemmung der Syncytium-Bildung zeigt.
In Fig. 18 ist ein Photo von Zellen dargestellt, das die Fähigkeit eines anti-HIV-Antikörpers zur Hemmung der HIV-Infektion zeigt.
Eine in der vorliegenden Erfindung verwendete, monoclonale anti-HIV-Maus-Antikörper produzierende Zelle kann gemäß den üblichen Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Maus-Antikörpern produziert werden. Eine monoclonale anti-HIV-Maus-Antikörper produzierende Zelle kann zum Beispiel unter Verwendung des HIV oder des HIV-Glycoproteins (env; gp41, gp120) als Antigen gemäß den üblichen Verfahren zur Herstellung von Hybridomen produziert werden. Das HIV oder HIV-Glycoprotein kann von verfügbaren HIV-infizierten Zellen hergestellt werden, beispielsweise von H9/HTLV-IIIB (ATCC-Nr. CRL8543) oder Molt3/HTLV-IIIB (ATCC-Nr. CRL 8602). Die so hergestellten, monoclonale anti-HIV-Maus-Antikörper produzierenden Zellen werden auf Zellen abgesucht, die einen monoclonalen Antikörper mit einer HIV-neutralisierenden Aktivität produzieren. Von diesen Zellen ist die einen Antikörper mit einer HIV-neutralisierenden Aktivität produzierende 54'CB1-Hybridom-Zellinie erhalten worden [Shuzo Matsushita et al., Medical Immunology 14 (1987), 307], die die bevorzugte Zellinie zur Herstellung des erfindungsgemäßen Genfragments ist.
Die die erfindungsgemäße variable Region codierenden Genfragmente sind aus einer derartigen vorstehend beschriebenen Zelle isolierte Genfragmente, die einen monoclonalen Antikörper mit einer HIV-neutralisierenden Aktivität produziert, und ihre Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Da jedoch eine derartige Zelle, wie schon erwähnt, eine große Zahl von Genfragmenten der V-Region zusätzlich zu den Genfragmenten enthält, die die für den gewünschten anti-HIV-Antikörper charakteristische V-Region codieren (das die VH-Kette eines Antikörpers codierende Maus-Gencluster enthält beispielsweise 100 oder mehr V-Genfragmente, 11 oder mehr D- Genfragmente und 4 J-Genfragmente; und das die Vκ-Kette codierende Maus-Gencluster enthält 300 oder mehr V-Genfragmente und 4 J Genfragmente), ist es erforderlich, die Gene, die die für den gewünschten anti-HIV-Antikörper charakteristische V-Region codieren, von den anderen in den Zellen enthaltenen chromosomalen Genen abzutennen. Es können zwei Verfahren zur Isolierung der die variable (V) Region der H-Kette und der L-Kette eines Maus-Immunglobulins codierenden Gene verwendet werden. In dem einen Verfahren werden die Gene der V-Region von der chromosomalen DNA der Zelle gemäß dem üblichen Verfahren cloniert [vgl. beispielsweise Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab. (1982)]. Im anderen Verfahren wird cDNA von der mRNA der Zelle gemäß dem üblichen Verfahren synthetisiert [beispielsweise D. M. Glover (Hrsg.), "DNA cloning Vol. I" IRL- Press (1985)] und die Gene der V-Region cloniert. In jedem der Verfahren kann eine DNA als Sonde zur Clonierung der Gene der V-Region verwendet werden, die auf der Grundlage einer Nucleinsäuresequenz von Maus-Immunglobulin-Genen synthetisiert wird, deren Nucleinsäuresequenz bereits beschrieben worden ist [beispielsweise Sakano et al., Nature 286 (1980) , 676; Max, E. E. et al., J. Biol. Chem. 256 (1981) 5116]. Im zuerst erwähnten Verfahren wird ein aktives und exprimierbares Gen der V-Region, in dem die V-D-J-Gene neu angeordnet sind, in mRNA transkribiert und in proteine translatiert werden, zur Ermittlung des für die Antikörperproduzierende Zelle charakteristischen Gens durch das Southern-Hybridisierungsverfahren gemäß dem üblichen Verfahren [vgl. beispielsweise Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab. (1982)] unter Verwendung von Antikörper-produzierenden Zellen und der chromosomalen DNA der parentalen Zelle identifiziert, um so das gewünschte Gen der V-Region schneller clonieren zu können. Wenn das gewünschte Gen aus der chromosomalen DNA hergestellt wird, enthält das produzierte Gen intervenierende Sequenzen mit der Bezeichnung "Introns".
Die so clonierten Genfragmente, die die V-Region des Antikörpers mit einer anti-HIV-neutralisierenden Aktivität codieren, wurden durch einen Vergleich mit anderen Genfragmenten, die keine anti-HIV-neutralisierende Aktivität aufwiesen, analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß für die Genfragmente, die die V-Region des erfindungsgemäßen anti-HIV-Antikörpers codieren, dadurch gekennzeichnet sind, daß das eine V-Region der H-Kette codierende Gen eine DNA- Sequenz enthält, die die nachstehend dargestellte Amino- Säuresequenz codiert:
(a) Thr Tyr Pro Ile Glu;
(b) Asn Phe His Pro Tyr Ser Asp Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly;
(c) Tyr Gly Ser Ala Tyr Ala; und
(d) Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
und daß das die V-Region der L-Kette codierende Gen eine DNA-Sequenz enthält, die die nachstehend dargestellte Aminosäuresequenz codiert:
(a') Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn;
(b') Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser;
(c') Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro; und
(d') Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys.
Man nimmt an, daß jede der vorstehend beschriebenen vier in der H-Kette und der L-Kette enthaltenen Amino- Säuresequenzen wichtige Aminosäuresequenzen für die Bestimmung der neutralisierenden Aktivität des Antikörper-Moleküls sind und daß sie in einem engen Zusammenhang mit der Funktion des eine anti-HIV-neutralisierende Aktivität aufweisenden Antikörper-Moleküls stehen. Daher wird der erfindungsgemäße chimäre anti-HIV-Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß die V-Regionen der H-Kette und der L-Kette DNA-Sequenzen enthalten, die die vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenzen codieren. Bevorzugte Beispiele für Gene, die die V-Region des Antikörper-Moleküls mit der anti-HIV neutralisierenden Aktivität codieren, sind ein Genfragment, das die in Fig. 6 dargestellte Aminosäuresequenz des Gens der H-Kette codiert, bzw. ein Genfragment, das die in Fig. 8 dargestellte Aminosäuresequenz des Gens der L-Kette codiert. Bezüglich der Nucleotidsequenz von derartigen Genen ist in Fig. 5 bzw. Fig. 6 ein Beispiel einer Nucleotidsequenz des Gens der H-Kette bzw. des Gens der L-Kette dargestellt.
Andererseits können die zur Herstellung des erfindungsgemäßen chimären anti-HIV-Antikörpers verwendeten Gene der konstanten (C) Region des Gens der H-Kette und L-Kette von menschlichem Immunglobulin aus einer menschlichen, Antikörper produzierenden Zelle, beispielsweise aus der ARH- 77-Zellinie (ATCC CRL1621), in der gleichen Weise wie beim Gen der V-Region isoliert werden. Menschliche, Antikörper produzierende Zellen werden nicht notwendigerweise zur Isolierung des menschlichen Gens der C-Region verwendet, da das Gen der C-Region nicht neu angeordnet wird. Entsprechend der Gewinnung des vorstehend beschriebenen Maus-Gens der V- Region kann das menschliche Gen der C-Region durch zwei Verfahren isoliert werden. In jedem der Verfahren kann eine DNA-Sonde verwendet werden, die auf der Grundlage einer Nucleinsäuresequenz von menschlichen Immunglobulin-Genen synthetisiert wird, deren Nucleinsäuresequenz bereits beschrieben worden ist [beispielsweise Ellison, J. M. et al., Nuc. Acids. Res. 10 (1982), 4071; Heiter, P. A. et al., Cell 22 (1980), 197] . Das Gen der C-Region ist nicht auf den γ1- und κ-Isotyp beschränkt, sondern schließt auch Gene des u-, , α, γ2-4 und λ-Isotyps ein. Das Gen der γ1-Kette wird jedoch bevorzugt, wenn eine stärker wirksame Komplement-Aktivierung und ADCC gewünscht werden.
Die Gene des chimären anti-HIV-Antikörpers können grundsätzlich durch beidseitige Kombination der beiden vorstehend beschriebenen Genfragmente (Genfragment der V-Region und Genfragment der C-Region) sowohl im Fall des Gens der H- Kette als auch des Gens der L-Kette konstruiert werden. Ferner gibt es je nach dem Verfahren der Gen-Isolierung zwei Kombinationen dieser Genfragmente, d. h., eine Kombination des Gens der V-Region und des Gens der C-Region, die aus der chromosomalen DNA isoliert werden, und eine Kombination des Gens der V-Region und des Gens der C-Region, die aus der cDNA isoliert werden.
Bei der Kombination des aus der chromosomalen Maus- DNA isolierten Gens der V-Region und des aus der chromosomalen DNA eines Menschen isolierten Gens der C-Region enthält vorzugsweise das Maus-Gen der V-Region regulatorische Elemente, beispielsweise einen zur Expression erforderlichen Promotor und Enhancer. Ein derartiger Promotor und Enhancer stammen nicht notwendigerweise von der Maus, sondern können auch von Menschen oder Viren stammen. Vorzugsweise ist der Promotor stromaufwärts (5'-seitig) des Gens der V-Region angeordnet und der Enhancer liegt zwischen dem Gen der V- Region und dem Gen der C-Region, seine Lage ist jedoch nicht darauf beschränkt
Andererseits sollte bei der Kombination des aus der cDNA einer Maus isolierten Gens der V-Region und des aus der cDNA eines Menschen isolierten Gens der C-Region die Kombination derart durchgeführt werden, daß sich die Leseraster der durch das Gen der V-Region codierten Aminosäuresequenz und der durch das Gen der C-Region codierten Amino- säuresequenz nicht verschieben und daß sich die Aminosäuresequenz der V-Region und die Aminosäuresequenz der C-Region nicht verändern. Ferner ist es erforderlich, regulatorische Elemente (Promotor und Enhancer) stromaufwärts der Gene einzufügen, um ihre Expression in Tierzellen zu ermöglichen.
Das so hergestellte Gen des chimären Antikörpers kann vorzugsweise in ein geeignetes Vektor-Plasmid mit einem Selektionsmarker eingefügt werden, beispielsweise in pSV2- gpt [Mulligan, R. C. et al., P.N.A.S. USA 78 (1981), 2027], in pSV2-neo [Southern, P. J. et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327] oder in ein, einen Teil eines viralen Gens [beispielsweise eines Papilloma-Virus] aufweisendes Vektor- Plasmid, das zur Vermehrung in einer Wirtszelle fähig ist, wobei zur Konstruktion eines das Gen eines chimären Antikörpers enthaltenden Plasmids das Gen der H-Kette und das Gen der L-Kette getrennt oder gleichzeitig eingefügt werden.
Zum Erhalt des chimären anti-HIV-Antikörpers wird eine tierische Wirtszelle mit dem so hergestellten, das Gen des chimären Antikörpers enthaltenden Plasmid transformiert. Beispiele für tierische Wirtszellen sind immortalisierte Mauszellen und andere tierische Zellen, vorzugsweise B- Lymphocyt-Zellinien [beispielsweise Plasmazellen, wie P3X63Ag8 653 (ATCC CRL 1580), P3X63Ag8U 1 (ATCC CRL 1597), P3/N51/1-Ag4-1 (ATCC CRL18), Sp2/0-Ag12 (ATCC CRL 1581) oder Hybridome]. Die Transformation der Wirtszelle mit der DNA kann durch jedes übliche Verfahren durchgeführt werden, dazu gehören das DEAE-Dextran-Verfahren, das Calciumphosphat- Transfektions-Verfahren, das Protoplasten-Fusions-Verfahren und das Elektroporations-Verfahren [vgl. beispielsweise Hames, B. D. et al. (Hrsg.), "Transcription and Translation" IRL-Press (1984)]. Wenn die Transformation mit einem Plasmid durchgeführt wird, das sowohl das Gen der H-Kette als auch der L-Kette des chimären Antikörpers enthält, ist nur ein Selektionsmarker ausreichend, wenn jedoch die Transformation mit getrennten Plasmiden durchgeführt wird, die die beiden Gene der H-Kette und der L-Kette des chimären Antikörpers enthalten, sind zwei Selektionsmarker erforderlich. Im letzteren Fall wird ein stufenweises Transformations-Verfahren bevorzugt, in dem die Transformation mit dem einen Plasmid und anschließend mit dem anderen Plasmid durchgeführt wird.
Die so transformierte Zelle wird unter geeigneten Bedingungen gezüchtet (beispielsweise in 10 % fötales Kälberserum enthaltendem RPMI-1640-Medium), wobei der chimäre anti-HIV-Antikörper in der gleichen Weise wie von einem üblichen Hybridom produziert und sekretiert wird. Die Reinigung des produzierten chimären Antikörpers kann in der gleichen Weise wie bei der Reinigung von Antikörpern durchgeführt werden.
Es bestätigte sich, daß der so hergestellte erfindungsgemäße chimäre Antikörper anti-HIV-neutralisierende Aktivität besitzt, und daher ermöglicht die vorliegende Erfindung die Herstellung eines zuvor noch nie hergestellten chimären anti-HIV-Antikörpers. Der erfindungsgemäße chimäre anti-HIV-Antikörper kann als ein wirksamer Wirkstoff zur AIDS-Behandlung, wie er zuvor nie aufgefunden worden war, verwendet werden. Ferner wurde die charakteristische Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz der variablen Region des erfindungsgemäßen Antikörper-Moleküls mit der anti-HIV-neutralisierenden Aktivität bestimmt. Diese Daten ermöglichen die Herstellung durch genetische Rekombinationsverfahren.

Beispiel 1

Herstellung eines monoclonalen anti-HIV-Maus-Antikörpers

Ein einen monoclonalen anti-HIV-Maus-Antikörper produzierendes Hybridom wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt, d. h., BALB/c-Mäuse wurden viermal mit einem Immunogen immunisiert, das aus einem durch Erhitzen inaktivierten, gereinigten Virus [HTLV (menschliches lymphotropes T-Zell-Virus)-IIIB] und einer viralen Glycoprotein-Fraktion bestand, die mit einer Kombination von ConA (Concanavalin A)-Sepharose (von Pharmacia) und Immunaffinitäts-Sepharose gereinigt worden war. Anschließend wurden Milzzellen entnommen und unter Verwendung von Polyethylenglycol (von Sigma Chemical) mit X63-Maus-Myelomzellen fusioniert, und die fusionierten Zellen cloniert [Robert-Guroff et al., J. Exp. Med., 154 (1981), 1957]. Die so erhaltenen Kulturüberstände der Hybridom-Clone wurden durch einen Enzym-verbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) auf Antikör-per gegen das HTLV- IIIB-Protein abgesucht. Die positiven Clone wurden außerdem durch ein Western-Blotting-Verfahren und eine Immunfluoreszenz-Färbung der Oberfläche von Virusproduzierenden Zellen getestet, um so ein Hybridom (mit der Bezeichnung 54'CB1-Zelle) zu etablieren, das einen monoclonalen anti-HIV-Antikörper (0,5β-Antikörper) produziert [Shuzo Matsushita et al., Medical Immunology 3 (1987), 14, und Matsushita et al., J. Virology 62 (1988), 2107].
Durch ein Kreuzimmunisierungs-Verfahren wurde bestätigt, daß das durch den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper (0,5β-Antikörper) erkannte Molekül mit dem identisch ist, das durch einen anti-gp120-Antikörper erkannt wird, der in menschlichem HIV-infiziertem Serum festgestellt wird. So wurde nachgewiesen, daß der 0,5β-Antikörper mit dem monoclonalen Antikörper identisch ist, der das äußere gp120- Hüll-Glycoprotein von HTLV-IIIB oder vom mit einer Lymphadenopathie verbundenen Virus Typ 1 (LAV1) erkennt. Der 0,5β-Antikörper hemmt die Syncytium-Bildung zwischen den HIV-infizierten Zellen und den nicht mit HIV-infizierten positiven CD4-Zellen. In einem Virus-Neutralisationstest, in dem H9-Zellen mit einem Gemisch des 0,5β-Antikörpers und des zellfreien HIV-Virus beimpft werden, ist nachgewiesen worden, daß der 0,5β-Antikörper in einer so niedrigen Konzentration wie 100 ng/ml die Infektion hemmt.
Zur Herstellung des Gens der V-Region des erfindungsgemäßen chimären anti-HIV-Antikörpers, wie hier nachstehend beschrieben, wurde die 54'CB1-Zelle verwendet, die den monoclonalen anti-HIV-Maus-Antikörper (0,5β) mit einer solchen neutralisierenden Aktivität produziert.

Beispiel 2

Isolierung des Gens der V-Kette des Immunglobulins aus dem anti-HIV-Antikörper produzierenden Maus-Hybridom

Ein Gen der variablen (VH) Region der H-Kette eines Maus-Immunglobulins wurde wie nachstehend beschrieben isoliert.
Die chromosomalen DNA-Moleküle wurden aus 54'CB1- Zellen, X63-Zellen und Leberzellen von BALB/c-Mäusen gemäß dem Verfahren von N. Blin und D. W. Stafford [Nuc. Acids. Res.p 3 (1976), 2303] hergestellt, und jeweils 10 ug der hergestellten chromosomalen DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten (von der Takara Shuzo Co. Ltd.: die in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendeten Reagenzien waren von der Takara Shuzo Co. Ltd. oder von der Toyobo Co. Ltd., sofern nicht anders angegeben). Mit der mit dem Restriktionsenzym gespaltenen DNA wurde eine 0,7 % Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt, und sie wurde auf einen Membranfilter aus Nylon überführt (Gene-Screen-Plus, von NEN-Research-Product), woran sich eine Southern-Hybridisierung mit einer synthetisierten, mit [³²P]-markierten, ein Maus-Gen der JH-Region enthaltenden DNA-Sonde anschloß [Sakano et al., Nature 286 (1980), 676]. Die Southern- Hybridisierung wurde gemäß der Anleitung des dem Gene- Screen-Plus-Filter beigefügten Handbuchs durchgeführt. Die für die DNA jeder Zelle nachgewiesenen Banden wurden miteinander verglichen, und als Ergebnis wurde bei Verwendung der Maus-JH-Sonde eine 3,3 kb-Bande als eine für die EcoRI-gespaltene DNA der 54'CB1-Zelle charakteristische Bande identifiziert. Diese Bande ist ein aktives Gen, das ein funktionelles Gen der VH-Region enthält und an der Expression der Spezifität des durch die 54'CB1-Zelle produzierten anti-HIV-Antikörpers beteiligt ist. Die Molekülgröße dieses Gens wurde durch eine Marker-DNA bestimmt, die durch Spaltung von λ Phagen-DNA mit dem Restriktionsenzym HindIII hergestellt wurde.
Das dieser Größe entsprechende DNA-Fragment wurde durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation [10 bis 40 % (Gew./Vol.) Saccharose, 26 000 UpM, 18 Stunden, 15ºC] gereinigt. Dieses DNA-Fragment und der EcoRI-Arm der λgt11- Vektor-DNA (von Stratagene) wurden mit T4-DNA-Ligase miteinander verbunden, und es wurde zur Herstellung einer VH-Gen- Bibliothek der 54'CB1-Zelle mit einem von Stratagene erhältlichen Kit eine in vitro-Verpackung durchgeführt. Eine Plaque-Hybridisierung [W. D. Benton und R. W. Davis, Science 196 (1977), 180] wurde mit dieser Bibliothek durchgeführt und ein das Gen der VH-Region des anti-HIV-Antikörpers enthalcender Clon gH11 unter Verwendung der JH-Maus-Sonde ermittelt. In Fig. 1 ist eine Restriktionskarte dieses Clons dargestellt. Ein mit EcoRI inseriertes Fragment dieses Clons wurde durch das Verfahren von Thomas und Davis [M. Thomas und R. W. Davis, Mol. Biol. 91 (1974), 315] aus der Phagen- DNA isoliert und in der nachstehend beschriebenen Northern- Hybridisierung verwendet.
Gesamt-RNA wurde durch das Guanidiniumisothiocyanat- Verfahren [Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18 (1979), 5294] aus den 54'CB1-Zellen und den X63-Zellen extrahiert. Mit der erhaltenen RNA (10 ug) wurde eine Elektrophorese mit einem 3 % Formaldehyd enthaltenden 0,75 % Agarosegel durchgeführt, und sie wurde auf einen Nylon-Membranfilter überführt (Gene-Screen-Plus), woran sich eine Northern-Hybridisierung mit einer synthetisierten [³²P]-markierten DNA- Sonde anschloß, die ein Maus-Gen der Cγ1-Region enthielt [Honjo et al., Cell 18 (1979), 559] oder mit einem [³²P]- markierten, mit EcoRI inserierten Genfragment von gH11. Die Northern-Hybridisierung wurde gemäß der Anleitung des dem Gene-Screen-Plus-Filter beigefügten Handbuchs durchgeführt. Bei der Hybridisierung wurde mit beiden Sonden eine Bande von 1,8 kb nachgewiesen (Fig. 2). Daher enthält der Clon gH11 ein funktionelles Gen der VH-Region.
Andererseits wurde ein Gen der variablen Region der κ-Kette (Vκ) des Maus-Immunglobulins in der nachstehend beschriebenen Weise isoliert.
Chromosomale DNA-Moleküle wurden aus 54'CB1-Zellen, X63-Zellen und Leberzellen von BALB/c-Mäusen gemäß dem Verfahren von N. Blin und D. W. Stafford hergestellt. Jeweils 10 ug der hergestellten chromosomalen DNA wurden mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten. Mit der mit dem Restriktionsenzym gespaltenen DNA wurde eine 0,7 % Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt, und sie wurde auf einen Membranfilter aus Nylon überführt (Gene-Screen-Plus), woran sich eine Southern-Hybridisierung mit einer synthetisierten, [³²P]-markierten, ein Maus-Gen der Jκ-Region enthaltenden DNA-Sonde anschloß [Max, E. E. et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 5116]. Die für die DNA jeder Zelle nachgewiesenen Banden wurden miteinander verglichen, und als Ergebnis wurde bei Verwendung der Maus-Jκ-Sonde eine 3,6 kb-Bande als eine für die HindIII-gespaltene DNA der 54'CB1-Zelle charakteristische Bande identifiziert. Diese Bande ist ein aktives Gen, das ein funktionelles Gen der Vκ-Region enthält und an der Expression der Spezifität des durch die 54'CB1-Zelle produzierten anti-HIV-Antikörpers beteiligt ist. Die Molekülgröße dieses Gens wurde durch eine Marker-DNA bestimmt, die durch Spaltung von λ Phagen-DNA mit dem Restriktionsenzym HindIII hergestellt wurde.
Das dieser Größe entsprechende DNA-Fragment wurde durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation [10 bis 40 % (Gew./Vol.) Saccharose, 26 000 UpM, 18 Stunden, 15ºC] gereinigt. Dieses DNA-Fragment und der HindIII-Arm der Charon28-Vektor-DNA (von den Bethesda Research Laboratories) wurden mit T4-DNA-Ligase miteinander verbunden, und es wurde zur Herstellung einer Vκ-Gen-Bibliothek der 54'CB1-Zelle mit einem von Stratagene erhältlichen Kit eine in vitro- Verpackung durchgeführt. Eine Plaque-Hybridisierung nach Benton und Davis wurde mit dieser Bibliothek durchgeführt und ein das Gen der Vκ-Region des anti-HIV-Antikörpers enthaltender Clon gL41 unter Verwendung der Jκ-Maus-Sonde ermittelt. In Fig. 3 ist eine Restriktionskarte dieses Clons dargestellt. Ein mit HindIII inseriertes Fragment dieses Clons wurde durch das Verfahren von Thomas und Davis aus der Phagen-DNA isoliert und in der nachstehend beschriebenen Northern-Hybridisierung verwendet.
Gesamt-RNA wurde durch das Guanidiniumisothiocyanat- Verfahren aus den 54'CB1-Zellen und den X63-Zellen extrahiert. Mit der erhaltenen RNA (10 ug) wurde eine Elektrophorese mit einem 3 % Formaldehyd enthaltenden 0,75 % Agarosegel durchgeführt, und sie wurde auf einen Nylon- Membranfilter überführt (Gene-Screen-Plus), woran sich eine Northern-Hybridisierung mit einer synthetisierten [³²P]-markierten DNA-Sonde anschloß, die das Maus-Gen der Cκ-Region enthielt [Max, E. E. et al., J. Biol. Chem. 256 (1981), 5116] oder mit einem [³²P]-markieren, mit HindIII inserierten Genfragment von gL41. Bei der Hybridisierung wurde mit beiden Sonden eine Bande von 1,2 kb nachgewiesen (Fig. 4) Daher enthält der Clon gL41 ein funktionelles Gen der Vκ- Region.

Beispie1 3

Isolierung des Gens der C-Region von menschlichem Immunglobulin

Das Gen, das ein menschliches, die Cγ1-Region codierendes Gen enthielt, und das Gen, das ein menschliches, die Cκ-Region codierendes Gen enthielt, die zur Herstellung des chimären anti-HIV-Antikörpers verwendet werden sollten, wurden aus einer menschlichen Plasmazelle der Leukämie-Zellinie ARH77 [ATCC CRL 1621] cloniert, und diese waren erhältlich von Professor Takeshi Watanabe an der Kyushu-Universität, Seitai Bogyo Igaku Kenkyusho (Medical Institute of Bioregulation) [Kudo et al., Gene 33 (1985), 181, und Nishimura et al., Cancer Res. 47 (1987), 999].

Beispiel 4

Bestimmung der Nucleotidsequenz des Gens der V-Region des anti-HIV-Maus-Antikörpers

Die Nucleotidsequenz des Gens der VH-Region des anti- HIV-Antikörpers wurde in der nachstehend beschriebenen Weise bestimmt.
Ein das Gen der VH-Region enthaltendes 1,4 kb-DNA- Fragment (HincII-XbaI) wurde aus dem Clon gH11 isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde an beiden Termini mittels des großen Fragments der DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit glatten Enden versehen und zur Herstellung von zwei Clonen, in denen das DNA-Fragment in entgegengesetzten Orientierungen inseriert war, in die HincII-Stelle des Vektors pUC18 erneut cloniert. Diese Clone wurden mit KpnI und BamHI gespalten. Deletions-mutierte Clone, die einen unterschiedlichen Abstand von der BamHI-Stelle aufwiesen, wurden mit dem "Takara-Kilosequence-Deletion-Kit" hergestellt und zum Erhalt von VH-Genfragmenten mit unterschiedlichen Längen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten. Diese VH-Genfragmente wurden mit dem Takara-Ligierungs- Kit in die EcoRI-HindIII-Stelle des Vektors M13mp19 inseriert.
Eine kompetente JM101-Zelle wurde gemäß dem Verfahren aus der Benutzeranleitung von Toyobo hergestellt und mit der DNA von M13mp19, in den die VH-Gene inseriert worden waren, transformiert. Eine einzelsträngige DNA wurde aus der Transformante extrahiert und gereinigt, und deren Nucleotidsequenz mit dem Takara-M13-Sequenzierungs-Kit und dem Fuji- Gencer-Gel-System bestimmt. Als Ergebnis wurde, wie in Fig. 5 dargestellt, das zwei Exons umfassende VH-Gen bestätigt.
Die erhaltene Nucleotidsequenz zeigt die Gegenwart einer Octanucleotidsequenz, ATGCAAAT, von der man animmt, daß sie für einen Promotor eines Immunglobulin-Gens wesentlich ist, und eines VH-Gens, das ein V-Genfragment, ein D- Genfragment und ein JH4-Genfragment (Fig. 5) umfaßt.
Ausgehend von dieser Nucleotidsequenz wurde von den Exons eine Aminosäuresequenz abgeleitet, und als Ergebnis zeigt sich, daß die Exons einen offenen Leserahmen (Fig. 6) aufweisen. Die N-terminale Aminosäuresequenz der H-Kette des 0,5β-Antikörpers wurde durch das Edman-Abbau-Verfahren analysiert, das in "Zoku Seikagaku Jikken Koza (Biochemistry Experimental Text, 2. Band) Nr. 2, Chemistry of Proteins, 1. Band", Hrsg. Biochemical Society of Japan, (1987), 313, beschrieben ist, konnte jedoch aufgrund einer Modifikation der N-terminalen Aminosäure nicht bestimmt werden. Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete N-terminale Aminosäure ist Glutamin, und man nahm an, daß der Edman-Abbau durch die Empfänglichkeit dieses Glutamins für eine Umwandlung in Pyroglutaminsäure unterbrochen wird.
Andererseits wurde eine Nucleotidsequenz des Gens der Vκ-Region des anti-HIV-Antikörpers in der nachstehend beschriebenen Weise bestimmt.
Ein das Gen der VK-Region enthaltendes 2,0 kb-DNA- Fragment (BstEII-HincII) wurde aus dem Clon gL41 isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde an beiden Termini mittels des großen Fragments der DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit glatten Enden versehen und zur Herstellung von zwei Clonen, in denen das DNA-Fragment in entgegengesetzten Orientierungen inseriert war, in die HincII-Stelle des Vektors pUC18 erneut cloniert. Einer dieser Clone (rechte Orientierung) wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und SmaI gespalten, und der andere Clon (entgegengesetzte Orientierung) mit den Restriktionsenzymen SacI und AccI. Deletions-mutierte Clone, die einen unterschiedlichen Abstand von der SmaI-Stelle oder der AccI-Stelle aufwiesen, wurden mit dem "Takara-Kilosequence-Deletion-Kit" hergestellt und zum Erhalt von Vκ-Genfragmenten mit unterschiedlichen Längen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten. Diese Vκ-Genfragmente wurden mit dem Takara- Ligierungs-Kit in die EcoRI-HindIII-Stelle des Vektors M13mp19 inseriert.
Eine kompetente JM101-Zelle wurde gemäß dem Verfahren aus der Benutzeranleitung von Toyobo hergestellt und mit der DNA von M13mp19, in den die Vκ-Gene inseriert worden waren, transformiert. Eine einzelsträngige DNA wurde aus der Transformante extrahiert und gereinigt, und deren Nucleotidsequenz mit dem Takara-M13-Sequenzierungs-Kit und dem Fuji- Gencer-Gel-System bestimmt. Als Ergebnis wurde, wie in Fig. 7 dargestellt, das zwei Exons umfassende Vκ-Gen bestätigt.
Die erhaltene Nucleotidsequenz zeigt die Gegenwart einer Octanucleotidsequenz, ATTTGCAT, von der man animmt, daß sie für einen Promotor eines Immunglobulin-Gens wesentlich ist, und eines Vκ-Gens, das ein V-Genfragment und ein Jκ3-Genfragment (Fig. 7) umfaßt.
Ausgehend von dieser Nucleotidsequenz wurde von den Exons eine Aminosäuresequenz abgeleitet, und als Ergebnis zeigt sich, daß die Exons einen offenen Leserahmen (Fig. 8) aufweisen. Die N-terminale Aminosäuresequenz der H-Kette des 0,5β-Antikörpers wurde durch das Edman-Abbau-Verfahren, wie vorstehend beschrieben, analysiert, um so die Sequenz der fünf N-terminalen Aminosäuren (Asparagin-Isoleucin-Valin- Leucin-Threonin) zu bestimmen, die mit der Sequenz der von der Nucleotidsequenz (Fig. 8) abgeleiteten fünf Aminosäuren übereinstimmt. Es wurde dadurch auch bestätigt, daß dieses Vκ-Gen ein exprimierbares Gen ist.

Beispiel 5

Konstruktion des Plasmids pSV2-βγ1, das ein VH-Maus mit einer anti-HIV-Antikörper-Aktivität codierendes Gen und ein menschliches Cγ1-Gen enthält

Ein das menschliche Cγ1-Gen enthaltendes 14 kb-DNA- Fragment (XbaI-HpaI) wurde in die XbaI-HincII-Stelle des Vektors pUC18 inseriert. Der die Insertion enthaltende Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten und die Spaltstelle durch T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Ein 3,3 kb-DNA-Fragment (EcoRI-EcoRI), das eine Promotor-Region der H-Kette der Maus, ein VH-Maus-Gen und eine Enhancer-Region der H-Kette der Maus enthielt, wurde an beiden Termini mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Diese beiden DNA-Fragmente wurden zur Herstellung eines Plasmids, das das Gen βγ1 der H-Kette eines chimären Antikörpers enthielt, mit dem Takara-Ligierungs-Kit miteinander ligiert. Das Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und ein βγ1-Genfragment durch Agarose- Gelelektrophorese isoliert. Das erhaltene Fragment wurde zur Herstellung von pSV2-βγ1 (Fig. 9) in die BamHI-Stelle des Vektors pSV2-gpt [Mulligan, R. C. et al., PNAS. USA 78 (1981), 2072] inseriert.

Beispiel 6

Konstruktion der Plasmide pSV2'-βκ und pSV2-βκ2, die ein Gen enthalten, das Vκ-Maus mit einer anti-HIV-Aktivität codiert und ein menschliches Cκ-Gen

Der EcoRI- und BamHI-Clonierungsstellen enthaltende Vektor pSV2-neo [Southern, P. J. et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327] wurde zum Erhalt einer zusätzlichen HindIII-Clonierungsstelle modifiziert. Zunächst wurde der Vektor pSV2-neo mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten und die Spaltstelle mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und die glatten Enden mit T4-DNA-Ligase erneut miteinander ligiert, so daß die ursprünglich im Vektor enthaltene HindIII-Stelle verschwand. Anschließend wurde dieser Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gespalten und ein DNA-Fragment von etwa 5,0 kb unter Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Dieses DNA-Fragment und das EcoRI-BamHI-DNA-Fragment (375 bp) von pBR322 wurden zur Konstruktion des Vektors pSV2'-neo durch das Takara- Ligierungs-Kit miteinander ligiert.
Der Vektor pSV2'-neo wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten. Mit den gespaltenen Enden des Vektors pSV2'-neo wurde mit Hilfe des Takara- Ligierungs-Kits ein 1,1 kb-HindIII-EcoRI-DNA-Fragment ligiert, das eine Enhancer-Region der κ-Kette der Maus enthielt [die ursprüngliche XmnI-Stelle ist mit einem EcoRI- Linker in eine EcoRI-Stelle umgewandelt worden; dieses Gen ist von Professor Takeshi Watanabe an der Kyushu- Universität, Seitai Bogyo Igaku Kenkyusho (Medical Institute of Bioregulation) erhältlich]. Das erhaltene plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und mit den gespaltenen Enden wurde ein 2,6 kb-EcoRI-EcoRI-DNA-Fragment li-iert, das ein menschliches Cκ-Gen enthielt. Das erhaltene Plasmid wurde ferner mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten und mit den gespaltenen enden zur Konstruktion von pSV2'-βκ (Fig. 10) ein 3,6 kb-HindIII-HindIII-DNA-Fragment ligiert, das eine Promotor-Region der Maus-κ-Kette und ein Maus-Vκ-Gen enthielt.
pSV2-βκ2 wurde auch unter Verwendung des Enhancers des Gens der H-Kette des menschlichen Immunglobulins konstrüiert. Ein 3,6 kb-HindIII-HindIII-DNA-Fragment, das eine Promotor-Region der κ-Kette der Maus und ein Maus-Vκ-Gen enthielt, wurde mit T4-DNA-Polymerase an beiden Termini mit glatten Enden versehen und zur Umwandlung der HindIII-Stelle am 5'-Ende des Maus-Vκ-Genfragments in eine EcoRI-Stelle in eine HincII-Stelle des Vektors pUC18 inseriert. In der gleichen Weise wurde die EcoRI-Stelle am 3'-Ende eines 2,6 kb- EcoRI-EcoRI-DNA-Fragments, das das menschliche Cκ-Gen enthielt, in eine HindIII-Stelle umgewandelt. Die beiden so hergestellten DNA-Fragmente wurden mit T4-Ligase an der HindIII-Stelle miteinander ligiert, und unter Verwendung der EcoRI-Stellen an beiden Enden wurde das ligierte DNA- Fragment in die EcoRI-Stelle des Vektors pSV2-neo eingefügt. Dieses Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI partiell gespalten, und die DNA-Fragmente, in denen nur eine der beiden EcoRI-Stellen gespalten wurde, wurden unter Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese isoliert. In diese DNA- Fragmente wurde unter Verwendung des Takara-Ligierungs-Kits ein 1,0 kb-EcoRI-EcoRI-DNA-Fragment eingefügt (durch Umwandlung eines MluI-HpaI-DNA-Fragments unter Verwendung eines EcoRI-Linkers hergestellt), das einen Enhancer des Gens der H-Kette von menschlichem Immunglobulin enthielt. Ein Plasmid, bei dem das DNA-Fragment des Enhancers in die 5'-EcoRI-Stelle des Vκ-Maus-Gens inseriert war, wurde zur Konstruktion von pSV2-βκ2 (Fig. 11) ausgewählt.

Beispiel 7

Konstruktion des Plasmids pSV2'-βγ1κ, das ein Gen enthält, das die chimäre Maus-Mensch-H-Kette mit einer anti-HIV- Aktivität codiert und ein die chimäre Maus-Mensch-L-Kette codierendes Gen

Die pSV2'-βκ-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI partiell gespalten, und die DNA-Fragmente, in denen nur eine der beiden BamHI-Stellen gespalten war, wurden unter Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Andererseits wurde die pSV2-βγ1-DNA mit dem Restriktions-enzym BamHI gespalten und ein DNA-Fragment, das eine chimäre Maus- Mensch-H-Kette enthielt, unter Verwendung der Agarose- Gelelektrophorese isoliert. Die beiden so hergestellten DNA- Fragmente wurden mit dem Takara-Ligierungs-Kit miteinander ligiert. Die Suche nach einem Plasmid, in dem das DNA- Fragment, das das Gen der chimären Maus-Mensch-H-Kette enthielt, an der BamHI-Stelle innerhalb des Vektors pSV2'- neo, jedoch nicht an der BamHI-Stelle innerhalb der Maus-Vκ- Region inseriert war, erfolgte anhand des Unterschieds in den Restriktionskarten. In dieser Weise wurde das beide chimäre Antikörper-Gene der H-Kette und der L-Kette enthaltende plasmid pSV2'-βγ1κ konstruiert (Fig. 12).

Beispiel 8

Transformation von Myelomzellen mit den Plasmiden pSV2-βγ1, pSV2'-βκ und pSV2-βκ2

DNA von pSV2-βγ1, pSV2'-βκ oder pSV2-βκ2 wurde zur Durchführung der Transformation durch das DEAE-Dextran- Verfahren in mehrere Myelom-Zellinien eingeführt, beispielsweise in die Stämme P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580), P3X63Ag8U 1 (ATCC CRL 1597), P3/NS1/1-Ag4-1 (ATCC CRL 18) und Sp2/0- Ag12 (ATCC CRL 1581) [Kohler et al., Nature 256 (1975), 495, und Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6 (1976), 292]. Das heißt, die Myelom-Zellen wurden mit DMEM-Medium, das kein fötales Kälberserum (FKS) enthielt, mehrmals gewaschen, und anschließend wurden die Zellen (1 x 10&sup8;) 30 Minuten in DMEM (2,5 ml) suspendiert, das 90 ug DNA der Plasmide pSV2-βγ1, pSV2'-βκ oder pSV2-βκ2 und 200 ug/ml DEAE-Dextran (Pharmacia) enthielt. Nach mehrmaligem Waschen mit DMEM ohne FKS wurden die Zellen in 10 % FKS enthaltendem RPMI-1640-Medium suspendiert und auf eine Platte mit 24 Vertiefungen überführt, so daß jede Vertiefung 1 ml erhielt, in dem 5 x 10&sup5; Zellen enthalten waren, wonach 48 Stunden gezüchtet wurde. Anschließend wurde das Kulturmedium durch RPMI-1640- Medium ersetzt, das bei Einbringung der pSV2-βγ1-DNA 6,5 ug/ml Mycophenolsäure (Sigma Chemical), 250 ug Xanthin (Sigma Chemical) und 10 % FKS enthielt oder durch RPMI-1640- Medium, das bei Einbringung der DNA von pSV2'-βκ oder der DNA von pSV2-βκ2 1,5 mg/ml Geneticin (Sigma Chemical) und 10 % FKS enthielt, und die transformierten Zellen wurden abgesucht.
Die transformierten Zellen wurden auf einem Objektträger immobilisiert, mit Aceton-Ethanol (1:1) behandelt und mit einem mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-markiertem Ziegen-anti-Mensch-IgG-Antikörper (γ-Ketten-Spezifität oder κ-Ketten-Spezifität: Cappel Lab. Inc.) zur Auffindung von transformierten, eine starke und spezifische Fluoreszenz im Cytoplasma aufweisenden Zellen angefärbt, und als Ergebnis wurden Zellen etabliert, in denen die eingeführte DNA unter Produktion einer menschlichen γ1-Kette oder menschlichen κ-Kette stark exprimiert wird.
Die DNA von pSV2'-βκ oder von pSV2-βκ wurde außerdem in die mit pSV2-βγ1-DNA transformierten Zellen eingeführt, und die pSV2-βγ1-DNA wurde außerdem in die mit der pSV2'-βκ- DNA oder mit pSV2-βκ2-DNA transformierten Zellen in der gleichen, hier vorstehend beschriebenen Weise zum Erhalt von nacheinander transformierten Zellen eingeführt.
Zum Absuchen von Zellen, die einen chimären Antikörper produzieren, wurde unter Verwendung eines anti-Mensch-IgG-Antikörpers (Cappel Lab. Inc.) ein ELISA durchgeführt. Das heißt, der Kulturüberstand der nacheinander transformierten Zellen wurde auf einen Objektträger aus Plastik (Falcon 3912) aufgetragen, der mit dem anti-Mensch- IgG-Antikörper (Cappel Lab. Inc.) beschichtet war, mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Mensch-IgG (Cappel Lab. Inc.) umgesetzt und mit TMBZ (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin: Dojin Kagaku K. K.) entwickelt, um chimäre Antikörper-produzierende Zellen zu finden und zu etablieren.

Beispiel 9

Transformation von Myelom-Zellen mit dem Plasmid pSV2'-βγ1κ

DNA von pSV2'-βγ1κ wurde zur Durchführung der Transformation durch das DEAE-Dextran-Verfahren in mehrere Myelom-Zellinien eingeführt, beispielsweise in die Stämme P3X63Ag8 653 (ATCC CRL 1580), P3X63Ag8 U1 (ATCC CRL 1597), P3/NS1/1-Ag4-1 (ATCC CRL 18) und Sp2/0-Ag12 (ATCC CRL 1581) [Kohler et al., Nature 256 (1975), 495, und Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6 (1976), 292]. Das heißt, die Myelom- Zellen wurden mit DMEM-Medium, das kein FKS enthielt, mehrmals gewaschen, und anschließend wurden die Zellen (1 x 10&sup8;) 30 Minuten in DMEM (2,5 ml) suspendiert, das 90 ug DNA und 200 ug/ml DEAE-Dextran (Pharmacia) enthielt. Nach mehrmaligem Waschen mit DMEM ohne FKS wurden die Zellen in 10 % FKS enthaltendem RPMI-1640-Medium suspendiert und auf eine Platte mit 24 Vertiefungen überführt, so daß jede Vertiefung 1 ml erhielt, in dem 5 x 10&sup5; Zellen enthalten waren, wonach 48 Stunden gezüchtet wurde. Anschließend wurde das Kulturmedium durch RPMI-1640-Medium ersetzt, das 1,5 mg/ml Geneticin (Sigma Chemical) und 10 % FKS enthielt, und die transformierten Zellen wurden abgesucht.
Zur Auffindung der Zellen, die einen chimären Antikörper produzieren, wurde unter Verwendung eines anti- Mensch-IgG-Antikörpers (Cappel Lab. Inc.) ein ELISA durchgeführt. Das heißt, dem Objektträger aus Plastik (Falcon 3912), der mit einem anti-Mensch-IgG-Antikörper (Cappel Lab. Inc.) beschichtet war, wurden der Kulturüberstand der transformierten Zellen, zur Umsetzung Peroxidasekonjugiertes Ziegen-anti-Mensch-IgG (Cappel Lab. Inc.) und zur Entwicklung TMBZ zugesetzt, um chimäre Anti-körperproduzierende Zellen zu finden und zu etablieren.

Beispiel 10

Expression eines Gens, das den chimären anti-HIV-Antikörper codiert

Zur Untersuchung der Expression des chimären, durch die so etablierten, chimäre Antikörper produzierenden Zellen erzeugten Antikörpers wurden der ELISA, die Western-Blotting-Analyse und Northern-Blotting-Analyse durchgeführt.
Nach der Beschichtung des Objektträgers aus Plastik (Falcon 3912) mit dem äußeren HIV-Hüllglycoprotein gp120, anti-Mensch-γ1-Ketten-Ahtikörper (Cappel Lab. Inc.) oder anti-Mensch-κ-Ketten-Antikörper (Cappel Lab. Inc.) wurden dem Objektträger der Kulturüberstand der vorstehend beschriebenen, DNA-transformierten Myelomzellen, zur Umsetzung Peroxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Mensch-IgG (Cappel Lab. Inc.) und zur Entwicklung TMBZ zugesetzt. Als Ergebnis setzte sich der Kulturüberstand jeder transformierten, chimäre Antikörper produzierenden Zelle mit dem äußeren HIV- Hüllglycoprotein gp120, anti-Mensch-γ1-Ketten-Antikörper und anti-Mensch-κ-Ketten-Antikörper um. Dies läßt vermuten, daß der chimäre, durch chimäre Antikörper produzierende Zellen erzeugte Antikörper eine Spezifität gegen gp120 aufweist und daß seine H-Kette und L-Kette den vom Menschen stammenden ähnlich sind. Ferner wurde die Menge an exprimiertem chimärem Antikörper durch Eichung unter Verwendung eines menschlichen polyclonalen IgG geschätzt, und als Ergebnis bestätigte sich, daß in 10 ml des Kulturüberstands 1 x 10&sup7; Zellen den chimären anti-HIV-Antikörper in einem Bereich von etwa 0,5 bis 5 ug/ml produzierten.
Von den in Beispiel 8 etablierten, chimäre anti-HIV- Antikörper produzierenden Zellen wurden die Zellen, die 5 bis 8 ug/ml des chimären Antikörpers produzierten (Cβ1- Zelle), erneut cloniert und im nachstehend beschriebenen Experiment verwendet. Diese Zelle produzierte den chimären Antikörper selbst dann noch stabile wenn einen Monat in einem 41-Rührkolben gezüchtet wurde. Diese transformierte, den chimären, anti-HIV-neutralisierenden Antikörper produzierende Zelle Cβ1 ist durch den Anmelder beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags als FERM BP-2249 hinterlegt worden.
Es wurde untersucht, ob die mRNA des chimären (Cβ1) Antikörpers normal produziert wurde oder nicht. Die mRNA wurde aus der Antikörper produzierenden Cβ1-Zelle und ihrer parentalen Zelle P3x63Aga 653 (P3 653) extrahiert. Eine Northern-Blotting-Analyse wurde unter Verwendung des 0,5β- VH-Gens (gH11), des 0,5β-Vκ-Gens (gL41)7 des Gens der menschlichen Cγ1-Kette und des Gens der menschlichen Cκ-Kette als Sonde durchgeführt. Wie in Fig. 13 dargestellt, wurde als Ergebnis mit den 0,5β-VH- und menschlichen Cκ1-Sonden für die H-Kette eine Bande von etwa 1,8 kb entdeckt, während mit der 0,5β-Vκ- und menschlichen Cκ-Sonde für die L-Kette eine Bande von etwa 1,3 kb entdeckt wurde. Dies ließ vermuten, daß der chimäre Antikörper in einem mRNA-Schritt chimär gemacht wurde.
Anschließend wurde die Größe des Proteins des exprimierten Cβ1-Antikörpers durch Western-Blotting-Analyse untersucht. Der Cβ1-Antikörper oder der normale menschliche IgG-Antikörper wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 2ME einer SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)-Analyse unterzogen und auf einen Nitrozellulose- Filter (Bio Rad) überführt. Der Filter wurde zur Umsetzung mit dem Ziegen-anti-Mensch-IgG-(H+L)-Antikörper (Cappel Lab. Inc.) und zur Entwicklung mit dem Peroxidase-konjugiertem anti-Ziegen-IgG-Antikörper (Cappel Lab. Inc.) und dem HRP- Farbentwicklungs-Reagenz (Bio Rad) inkubiert. Wie in Fig. 14 dargestellt, wurden als Ergebnis sowohl für Cβ1 als auch für menschliches IgG Banden an beinahe der gleichen Position nachgewiesen. Die Größe betrug etwa 160 k für H&sub2;L&sub2;, etwa 50 k für H und etwa 28 k für L. Dies läßt vermuten, daß der chimäre Cβ1-Antikörper die normale Konfiguration eines Antikörper-Moleküls aufwies.

Beispiel 11

Aktivität des chimären anti-HIV-Antikörpers

Es wurde untersucht, ob der Cβ1-Antikörper mit der HIV-infizierten Zelle reagierte oder nicht. Der Cβ1- Antikörper wurde mit HIV-infizierten H9-Zellen inkubiert und die Analyse mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (Facster; Becton Deckinson) durchgeführt. Wie in Fig. 16 dargestellt, wies der Cβ1-Antikörper im Vergleich zu normalem menschlichem IgG eine Verschiebung der Fluoreszenz- Stärke auf, wodurch bewiesen wurde, daß der Cβ1-Antikörper das gp120-Antigen auf den HIV-infizierten H9-Zellen erkannte.
Anschließend wurde die HIV-neutralisierende Aktivität des Cβ1-Antikörpers bestimmt. Zunächst wurde die die Syncytium-Bildung hemmende Aktivität des Cβ1-Antikörpers unter Verwendung des Syncytium-Bildungssystems der HIV-infizierten Zellen bewertet. Das heißt, bei einer vorherigen Behandlung der mit LAV1-infizierten CEM-Zellen (ATCC CCL119) mit dem Cβ1-Antikörper und einer Inkubation mit nicht-infizierten CEM-Zellen zur gemeinsamen Züchtung wurde die Syncytium-Bildung, wie in Fig. 17 dargestellt, zu 100 % gehemmt, obwohl die Syncytium-Bildung üblicherweise 24 Stunden nach der Inkubation der LAV1-infizierten CEM-Zellen mit nicht-infizierten CEM-Zellen zur gemeinsamen Züchtung beobachtet wurde. Daher wurde erwartet, daß der Cβ1-Antikörper eine Aktivität zur Hemmung einer Infektion von Zelle zu Zelle aufwies.
Der Cβ1-Antikörper wurde anschließend hinsichtlich seiner Aktivität bei der Hemmung einer Infektion mit zellfreien HIV-Partikeln bewertet. Das heißt, eine außerordentlich starke Zellbildung wurde als Konsequenz der LAV1- Infektion beobachtet, wenn die MT4-Zellen mit HIV (LAV1)- Partikeln infiziert und 3 Tage gezüchtet wurden. Eine außerordentlich starke Zellbildung wurde nicht beobachtet. Mit anderen Worten, es trat keine LAV-Infektion auf, wenn LAV zuvor mit Cβ1 (Fig. 18) behandelt wurde.
Ferner wurde zum Nachweis von infizierten Zellen ein indirektes Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren unter Verwendung des monoclonalen anti-P24-Antikörpers (Cellular Products) durchgeführt, es wurde jedoch keine Expression des P24- Antigens beobachtet. Der Cβ1-Antikörper weist folglich anscheinend eine Aktivität bei der Hemmung einer Infektion mit HIV-Partikeln auf. Nach den beiden vorstehend beschriebenen Ergebnissen weist der Cβ1-Antikörper anscheinend eine Aktivität bei der HIV-Neutralisierung auf.
Wie durch die in den Beispielen 10 und 11 dargestellten Ergebnisse deutlich nachgewiesen wurde, produzierte die erfindungsgemäße transformierte Zelle (Cβ1) den chimären Maus-Mensch-Antikörper, der die variable Region (VH, Vκ) des 0,5β-Maus-Antikörpers, die das äußere HIV-Hüll-Glycoprotein gp120 spezifisch binden kann, und die konstante Region des menschlichen IgG-Antikörpers (Cγ1, Cκ) in Form eines intakten Immunglobulins (H&sub2;L&sub2;) umfaßt.

Claims

1. Chimerer anti-HIV-Antikörper, umfassend eine H-Kette und eine L-Kette, wobei die konstanten Regionen der H-Kette und der L-Kette von einem menschlichen Immunglobulin stammen und die variablen Regionen der H-Kette und der L-Kette die folgenden Aminosäuresequenzen enthalten: [Aminosäuresequenz in der variablen Region der H-Kette] [Aminosäuresequenz in der variablen Region der L-Kette]

2. Chimerer anti-HIV-Antikörper nach Anspruch 1, wobei die variablen Regionen der H-Kette und der L-Kette die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen: [variable Region der H-Kette] [variable Region der L-Kette]

3. Transformierte Myelomzelle, die cotransformiert ist mit einem Expressionsvektor, der ein die H-Kette eines chimeren anti-HIV-Antikörpers codierendes Gen enthält, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region der H-Kette eines menschlichen Immunglobulins Codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende (stromabwärts) eines Genfragments, das die variable Region einer H-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, enthaltend DNA-Sequenzen, die die folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) codieren:

und einen Promotor stromaufwärts dieses Gens; und einem Expressionsvektor, der ein die L-Kette eines chimeren anti-HIV-Antikörpers codierendes Gen enthält, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region der L-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende eines Genfragments, das die variable Region einer L-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, enthaltend DNA-Sequenzen, die die folgenden Aminosäuresequenzen (a') bis (d') codieren:

und einen Promotor stromaufwärts dieses Gens.

4. Transformierte Myelomzelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher ein die H-Kette eines chimeren anti-HIV-Antikörpers codierendes Gen enthält, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region einer H-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende eines Genfragments, das die variable Region einer H-Kette eines immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, enthaltend DNA-Sequenzen, die die folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) codieren:

und einen promotor stromaufwärts des die H-Kette des chimeren anti-HIV-Antikörper codierenden Gens, und ein die L-Kette eines chimeren anti-HIV-Antikörper codierenden Gens, wobei das Gen ein Genfragment umfaßt, das die konstante Region der L-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, verknüpft mit dem 3'-Ende eines Genfragments, das die variable Region einer L-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, enthaltend DNA-Sequenzen, die die folgenden Aminosäuresequenzen (a') bis (d') codieren:

und einen promotor stromaufwärts des Gens, das die L- Kette des chimeren anti-HIV-Antikörpers codiert.

5. Verfahren zur Herstellung eines chimeren anti-HIV-Antikörpers, umfassend die gleichzeitige Expression in einer Maus-Myelomzelle eines Gens, das die H-Kette eines chimeren anti-HIV-Antikörpers codiert, wobei ein die konstante Region der H-Kette eines menschlichen Immunglobulins codierendes Genfragment mit dem 3'-Ende (stromabwärts) des Genfragments verknüpft ist, das die variable Region der H-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV- neutralisierender Aktivität codiert, enthaltend DNA-Sequenzen, die die folgenden Aminosäuresequenzen (a) bis (d) codieren:

und ein die L-Kette eines chimeren anti-HIV-Antikörper codierendes Gen, wobei ein Genfragment, das die konstante Region einer L-Kette eines menschlichen Immunglobulins codiert, mit dem 3'-Ende des Genfragments verknüpft ist, das die variable Region einer L-Kette eines Immunglobulins mit anti-HIV-neutralisierender Aktivität codiert, enthaltend DNA-Sequenzen, die die folgenden Aminosäuresequenzen (a') bis (d') codieren:

Sekretion und Sammeln des exprimierten Produkts.