DE60215676T2

DE60215676T2 - Gegen ein Peptid, das ein kryptisches Epitop von GP41 aus HIV-1 nachahmt gerichteter Körper

Info

Publication number: DE60215676T2
Application number: DE60215676T
Authority: DE
Inventors: Gabriela Stiegler; Renate Kunert; Hermann Katinger
Original assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Current assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Priority date: 2001-09-07
Filing date: 2002-09-09
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2022-09-10
Also published as: EP1423417A2; WO2003022879B1; EP1423417B1; US20040241641A1; WO2003022879A2; US7595049B2; WO2003022879A3; AU2002340880B2; DE60215676D1; ES2274100T3; JP4243187B2; JP2005502708A; ATE343592T1

Description

Gebiet der Technik
Die vorliegende Erfindung liegt auf den Gebieten der angewandten Mikrobiologie und der Impfstoffentwicklung und bezieht sich auf Antikörper, die ein kryptisches Epitop auf gp41 aus HIV-1 erkennen, sowie auf Anwendungen dieser Antikörper für diagnostische und therapeutische Zwecke.
Hintergrund
Es ist gezeigt worden, dass die Gegenwart spezifischer Antikörper eine wichtige Rolle beim Schutz vor zahlreichen Viruserkrankungen des Menschen spielt. Die Rolle der humoralen Immunantwort bei HIV-Infektion ist aber noch umstritten. Es gibt Hinweise darauf, dass die Entwicklung einer breiten neutralisierenden Immunantwort, wie sie in Langzeit-Nonprogressoren zu finden ist, den Fortschritt der Erkrankung verzögert, während hingegen bei schnellen Krankheits-Progessoren die Titer von neutralisierenden Antikörpern oft niedrig sind. Andere Untersuchungen legen nahe, dass bei Müttern mit hohen Titern von neutralisierenden Antikörpern eine Übertragung des Virus auf ihre Neugeborenen weniger wahrscheinlich ist. Zwischen dem Vorhandensein neutralisierender Antikörper und Manifestationen der Erkrankung wurde eine allgemeine Korrelation beobachtet. Ausserdem lässt sich aus einer Abnahme der HIV-spezifischen Antikörper-Antworten oft eine schlechte Diagnose vorhersagen.
Zahlreiche Versuche sind an Tieren und Menschen ausgeführt worden, um die Rolle von Antikörpern in der HIV-1-Infektion zu studieren. Eine Infusion von HIV-1-spezifischen neutralisierenden Antikörpern in Schimpansen und Makaken, auf die ein intravenöser oder mukosaler Challenge mit HIV oder chimärem Affen-/Menschen-Immunschwächevirus (SHIV: simian/human immunodeficiency virus) folgte, verhinderte eine Infektion bzw. ein Fortschreiten der Erkrankung. Positive Wirkungen einer passiven Immunisierung mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörperzubereitungen gegenüber HIV-1 sind auch in einer Anzahl von Versuchen an Freiwilligen beobachtet worden. Zum Beispiel zeigten die beiden humanen monoklonalen Antikörper 2F5 (ECAAC, Zugangsnummer 90091704) und 2G12 (ECACC, Zugangsnummer 93091517) nützliche Wirkungen in einer ersten klinischen Testphase. Wiederholte Infusionen beider Antikörper ergeben in HIV-positiven Patienten eine Verringerung der Viruslasten und der infizierten peripheren mononukleären Zellen (PBMC), eine Vermehrung der CD4+-T-Lymphozyten und eine Komplementaktivierung.
Bisher ist die Anzahl monoklonaler Antikörper, die konservierte Epitope erkennen und für ein hohes therapeutisches Potenzial bekannt sind, gering (D'Souza und Mitautoren, J. Infect. Dis. 1997; 175: 1056–1062). Nur für die drei monoklonalen Antikörper (mAk) 2F5, 2G12 (Buchacher und Mitautoren, AIDS Res. Hum. Retroviruses 1994; 10: 359–369) und IgG1b12 (Burton und Mitautoren, Science 1994; 266: 1024–1027) wurde eine signifikante antivirale Aktivität über Kladen hinweg (cross-clade) beschrieben. Die Identifizierung von monoklonalen Antikörpern gegen konservierte neutralisierende B-Zellen-Epitope auf der HIV-1-Hülle ist eventuell nicht nur für passive Immunisierungsstrategien nützlich, sondern liefert auch wichtige Informationen für eine Impfstoffauslegung, die auf der Induktion einer breiten humoralen Immunantwort beruht. Es gibt Hinweise dafür, dass ein Impfstoff, der ausschliesslich auf T-Zellen-Epitopen beruht, höchstwahrscheinlich nicht genügt, um vor einer HIV-1-Infektion zu schützen (Parren und Mitautoren, AIDS 1999; 13 (Suppl. A): S137–S162).
Vor einigen Jahren haben wir durch Immortalisierung menschlicher peripherer Blutlymphozyten von HIV-1-positiven Spendern ein Panel von 33 menschlichen monoklonalen Antikörpern gegen HIV-1 zusammengestellt. Aus diesem Panel wurden zwei Antikörper (2F5, 2G12) als potente Hemmer von Labor- und Primärisolaten von HIV-1 identifiziert. Die mAk 2F5 und 2G12 wurden weiter entwickelt und bald als zwei der am potentesten neutralisierenden Antikörper erkannt. Der monoklonale Antikörper 4E10 (ECACC, Zugangsnummer 90091703), ursprünglich ein IgG3-Antikörper, wurde in ein Auswertungsprogramm des serologischen Antikörperprojekts (ASP: Antibody Serological Project) einbezogen und zeigte neutralisierende Wirkung auf einige Laborstämme (D'Souza und Mitautoren, AIDS 1994; 8: 169–181). Der Übergang von Antikörpern vom Isotyp 63 zum Isotyp 68 wurde in Biotech. Bioeng. 67 (1), Seiten 97–103, offenbart.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Der mAk 4E10 wurde jetzt in einer kontinuierlichen CHO-Zelllinie als ein Antikörper der IgG1-Klasse geklont, wobei die konstanten Bereiche der schweren Ketten mit denen der rekombinanten mAk 2F5 und 2G12 identisch waren. Nach diesem Klassenwechsel von IgG3 zu IgG1 zeigte der mAk 4E10 überraschenderweise eine erhöhte neutralisierende Potenz. Entgegen den Erwartungen war der mAk 4E10 in seiner IgG1-Version, nicht aber in seiner IgG3-Version, darüber hinaus sogar der einzige Antikörper, der alle Primärisolate neutralisierte, die von HIV-1-positiven Individuen abgeleitet worden waren, die an einer ersten klinischen Testphase mit den mAk 2F5 und 2G12 teilgenommen hatten. Ferner neutralisierte er primäre HIV-1-Isolate, die gegenüber einer Neutralisierung durch mAk 2F5 und/oder 2G12 unempfindlich waren.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten 4E10-Antikörper der IgG1-Klasse zur Verfügung zu stellen, der im Vergleich zu den vorbekannten mAk 4E10 der Klasse IgG3 (ECACC, Zugangsnummer 90091703) eine signifikant erhöhte neutralisierende Aktivität gegenüber HIV-1 besitzt und der primäre HIV-1-Isolate neutralisiert, die gegenüber einer Neutralisierung durch mAk 2F5 und/oder 2G12 unempfindlich sind. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verwendung des verbesserten mAk 4E10 der IgG1-Klasse (hiernach als 4E10-IgG1 bezeichnet) für diagnostische und therapeutische Zwecke sowie für ein Hervorrufen oder Prüfen von anti-idiotypischen Antikörpern zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, die HIV-1 neutralisierende Wirkung von mAk 4E10-IgG1 zu hemmen oder zu verhindern.
Der Ausdruck „4E10", wie hier nachfolgend verwendet, bezieht sich auf den humanen monoklonalen Antikörper 4E10 sowohl in der IgG3- als auch in der IgG1-Variante, wenn nicht ausdrücklich anders gesagt. In den Beispielen und in den entsprechenden Zeichnungen bezieht sich der Ausdruck „4E10" aber typischerweise auf die IgG1-Variante, da die hier offenbarten Versuche unter Verwendung der IgG1-Variante von 4E10 durchgeführt worden sind. Der Ausdruck „4E10-IgG3" soll sich ausschliesslich auf die bekannte IgG3-Variante beziehen, der Ausdruck „4E10-IgG1" auf die IgG1-Variante von 4E10. Der mAk 4E10-IgG3 wird durch eine Hybridom-Zelllinie erzeugt, die bei ECACC unter der Zugangsnummer 90091703 hinterlegt ist, während 4E10-IgG1 durch eine CHO-Zelllinie exprimiert wird (hinterlegt gemäss Budapester Vertrag bei ECACC unter der Zugangsnummer 01110665). Beide Varianten erkennen das gleiche Epitop auf gp41 aus HIV-1. Sie unterscheiden sich aber signifikant in ihrer HIV-1 neutralisierenden Fähigkeit.
Weiter wird hierin offenbart, dass der mAk 4E10 ein bislang unbekanntes Epitop auf gp41 an einer zum 2F5-Epitop C-terminalen Stelle erkennt. Die Prüfung des mAk 4E10 gegen an die T-Zelllinie adaptierte (TCLA: T-cell line adapted) HIV-1-Isolate und primäre HIV-1-Isolate unterschiedlicher Kladen deutet darauf hin, dass dieser Antikörper in seinem neutralisierenden Potenzial mindestens ebenso potent wie 2F5 und 2G12 sein könnte. Die neutralisierenden Eigenschaften von 4E10-IgG1 in vitro werden hier im Vergleich mit anderen, gut charakterisierten neutralisierenden monoklonalen Antikörpern beschrieben.
Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die den mAk 4E10-IgG1 in Kombination mit einem geeigneten Träger umfasst, wahlweise als eine Mischung mit zumindest einem weiteren Antikörper, vorzugsweise aus der Gruppe von 2F5 und 2G12 ausgewählt.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, die Verwendung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen in der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von H1V-1-gefährdeten oder -infizierten Personen und insbesondere für die Verhütung oder Therapie von AIDS zu ermöglichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Bindung von 2F5 und 4E10 an Peptide 2030, 2031 und gp160_IIIB. Serielle zweifache Verdünnungen von Peptiden wurden vor der Inkubation mit konstanten Mengen von 4E10 bzw. 2F5 (100 ng/ml) über Nacht auf ELISA-Platten geschichtet. Die Bindung wurde durch mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Ziege-Antimensch-IgG(γ) nachgewiesen.
2: Neutralisierung des Primärisolats S2/05 durch 2F5, 2G12, 4E10 und IgG1b12. Die Prüfung erfolgte an PBMC mit der p24-Produktion als Replikationsmarker. Die Menge von p24 in der Kultur ohne mAk war 195 ng/ml.
3A, 3B: Hemmung der Bindung von mAk 4E10 an mit gp41 (A) oder Peptid 2031 (B) vorbeschichteten ELISA-Platten nach einer Vorinkubierung des mAk 4E10 entweder mit gp41 oder mit Peptid 2031. Serielle zweifache Verdünnungen der Peptide gp41 oder 2031 wurden vor der Aufgabe auf die mit gp41 oder Peptid 2031 beschichteten Platten mit konstanten Mengen von 4E10 (250 ng/ml) vorinkubiert. Die Antikörperbindung wurde durch mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Ziege-Antimensch-IgG(γ) nachgewiesen.
4A, 4B, 4C: Neutralisierung des Primärisolats P6/71 durch 4E10, 2F5, 2G12, IgG1b12 und Doppelkombinationen (1:1). Die Kombinationsindices bei 50-%iger Neutralisierung (CI₅₀) sind angegeben. Die Prüfung erfolgte an PBMC mit der p24-Produktion als Replikationsmarker. Die Menge von p24 in der Ku1tur ohne mAk war 96 ng/ml. Synergie wurde mit dem Verfahren von Chou und Talalay bestimmt, wobei CI < 1 Synergie anzeigt.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
In einem Auswertungsprogramm der Arbeitsgruppe Antikörperauswahl der AIDS Clinical Trials Group wurden nur die mAk 2F5, 2G12 und IgG1b12 als potente Kandidaten für eine passive Immuntherapie gegen HIV-1 identifiziert. Unsere hier vorgelegten, neuesten Befunde zeigen, dass 4E10-IgG1 ein zusätzlicher Antikörper vergleichbaren antiviralen Potenzials ist.
Epitopmappingstudien haben offenbart, dass 4E10 ein Epitop auf der Ektodomäne von gp41 erkennt. Da 4E10 weder an gp160_MN-Peptid 2030 (QTQQEKNEQELLELDKWASL) noch an das GGGLELDKWASL-Peptid band, ist es unwahrscheinlich, dass das 2F5-Kernepitop, das aus den Aminosäuren LDKWA besteht, wesentlich zur Bindung von 4E10 an gp160_MN-Peptid 2031 (LLELDKWASLWNWFDITNWL) beiträgt. Unsere Schlussfolgerung, dass auf diesen Bereich folgende Aminosäuren für die Erkennung durch 4E10 verantwortlich sind, wurde durch zusätzliche Epitopmappingstudien bestätigt, wobei Peptidbibliotheken für das Mapping genutzt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass das 4E10-Kernepitop tatsächlich C-terminal zum 2F5-Epitop liegt und zumindest eine Sequenz von sechs Aminosäuren (aa: amino acids) umfasst, die mit den aa 672 bis 677 (NWFDIT) von gp41 des TCLA-Isolats HTLV-IIIMN identisch sind oder ihnen entsprechen.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Ausdruck „entsprechen", dass die Aminosäuresequenz des 4E10-Epitops mit der Aminosäuresequenz am gp41 des HIV-1-Isolats identisch ist, auf die ausdrücklich Bezug genommen worden war, oder wegen der Degeneration des genetischen Codes oder wegen Variationen zwischen verschiedenen HIV-1-Isolaten davon abweichen kann. Die abweichenden Sequenzen müssen aber immer noch für das Bindungsmotiv oder das durch den mAk 4E10 erkannte Epitop repräsentativ sein, zum Beispiel müssen sie von einer Bibliothek, die gp41-Fragmente enthält, unter Verwendung des 4E10 als Prüfwerkzeug erkennbar sein. Zum Beispiel ist die Sequenz NWFDIT bei den aa 672 bis 677 des gp41 von HTLV-IIIMN gleichwertig bzw. homolog mit der Sequenz NWFNIT, die an der gleichen Stelle von gp41 des Isolats HXB2 auftritt. Weitere Beispiele gleichwertiger oder homologer Sequenzen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, SWFGIT, TWFGIT, NWFSIT.
Die meisten der während einer natürlichen Infektion durch gp41 induzierten Antikörper sind gegen die Reste in der Nähe der aa 598 bis 604 und 644 bis 663 (Nummerierung nach HIV-1 HXB2; Xu und Mitautoren, J. Virol. 1991; 65: 4832–4838) gerichtet. Diese Antikörper hemmen die virale Replikation nicht, einige erhöhen vielleicht sogar die virale Infektivität durch komplement-vermittelte Mechanismen. Bislang ist der mAk 2F5 der einzige beschriebene Anti-gp41-Antikörper gewesen, der potente neutralisierende Eigenschaften über Kladen hinweg gezeigt hat. Interessanterweise werden 2F5-artige spezifische Antikörper nur selten in den Seren von mit HIV-1 infizierten Personen gefunden. Die HIVIG (die gepoolten Seren von mehr als 70 HIV-1-positiven Spendern) zeigen keine signifikante 2F5-artige spezifische Bindung an gp160 und/oder gp41. Der Bereich auf gp41, an den 2F5 bindet, ist während einer natürlichen Infektion offensichtlich für das menschliche Immunsystem kryptisch.
Die Ergebnisse, die hier für den mAk 4E10 beschrieben worden sind, einen weiteren breit neutralisierenden Antikörper gegen diesen Bereich auf gp41, dessen Epitop jetzt C-terminal zum 2F5-Kernepitop gemappt worden ist, bestätigen, dass dieser Bereich für die virale Infektivität und Replikation wesentlich ist. Da beide Antikörper nur schwach an infizierte Zellen und freie Viren binden, aber potente neutralisierende Aktivitäten aufweisen, schlagen wir für 2F5 und 4E10 ähnliche Mechanismen der Hemmung der viralen Re plikation vor. Diese Hypothese wird eventuell noch bestärkt durch die von Synzytieninhibierungstests gewonnenen Ergebnisse, denen zufolge eine Vorinkubation des Virus mit einem beliebigen der beiden Antikörper die antivirale Wirksamkeit von 4E10 bzw. 2F5 nicht verbessert hat.
Angesichts des Befundes, dass die beiden mAk, obwohl sie hochaktive Eingangsblocker (Neutralisierer) von HIV-1 sind, nur sehr schwach an freie Viren bzw. an HIV-1-infizierte Zellen binden, wird dementspechend geschlossen, dass dieser fusogene Bereich von gp41 nur während des Ereignisses der Fusion von HIV-1 mit der Wirtszelle exponiert wird. Dies könnte einerseits eine zusätzliche Erklärung für die kryptische Natur dieser neutralisierenden 2F5- und 4E10-Epitope während einer natürlichen Infektion liefern. Andererseits haben wir bisher kein HIV-1-Isolat gefunden, das gegenüber einer Neutralisierung durch eine Kombination dieser beiden Antikörper unempfindlich war.
Der mAk 4E10 inhibiert die virale Replikation von TCLA- und primären Stämmen von HIV-1 bereits bei ziemlich niedrigen Konzentrationen, die mit denen vergleichbar sind, die bei der Verwendung von 2F5 oder 2G10 anwendbar sind. Er übt eine ähnliche antivirale Aktivität über Kladen hinweg aus, wenn er mit den anderen untersuchten mAk verglichen wird. Obwohl 2F5 und 4E10 aneinander angrenzende Epitope erkennen, antagonisieren sie sich nicht, wenn sie kombiniert geprüft werden. Es zeigte sich, dass 4E10 sogar noch wirksamer als 2F5 und als 2G12 gegen die HIV-1-Isolate war, die von asymptomatischen HIV-Patienten gewonnen worden waren, die an einer jüngst durchgeführten ersten klinischen Testphase mit mAk 2F5 und 2G12 teilnahmen. Andererseits neutralisierte 4E10 nur eines von sechs Isolaten, die früher von österreichischen AIDS-Patienten im Spätstadium abgeleitet worden waren. In unserem derzeitigen Panel von Primärisolaten gab es nur ein weiteres Isolat (92UG029), das gegenüber 4E10 verhältnismässig resistent war. Es ist bemerkenswert, dass diese sechs resistenten Isolate (d.h. die fünf früher gewonnenen resistenten Isolate und das eine derzeitige Isolat) CXCR4 als den einzigen Korezeptor für den Wirtszelleneingang nutzen. Alle anderen Isolate, die einen Makrophagen- oder dualtropen Phänotyp zeigten, wurden durch den mAk 4E10 ohne weiteres gehemmt. Hingegen wurden alle TCLA-Viren, die CXCR4 für den Eingang nutzen, bei niedrigen 4E10-Konzentrationen gehemmt. Allerdings sind die mit neutralisierungsempfindlichen TCLA-Stämmen in einem auf Zelllinien beruhenden Synzytienassay gewonnenen Ergeb nisse eventuell nicht mit den auf PBMC beruhenden Assays mit primären Viren vergleichbar.
Die Entwicklung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART: highly active antriretroviral therapy) für HIV-1-Infektion hat die Situation von HIV-1-positiven Personen zumindest in den entwickelten Ländern dramatisch verbessert (Carpenter und Mitautoren, JAMA 2000; 283: 381–390). Nichtsdestoweniger führen ernste Nebenwirkungen und das Auftreten von HAART-resistenten Viren zu einem dringenden Bedürfnis nach neuen therapeutischen Vorgehensweisen, die auf zusätzliche Zielstellen wirken. Gegenwärtig konzentriert sich die Aufmerksamkeit auf Eingangsinhibitoren, darunter monoklonale Antikörper, antikörperähnliche Moleküle und Peptide. Die mAk 2F5 und 2G12 haben, insbesondere wenn sie kombiniert verwendet wurden, bereits eine bemerkenswerte antivirale Wirksamkeit in HIV-1-positiven Freiwilligen gezeigt. Daher stellen wir zusätzliche HIV-1 neutralisierende Antikörper zur Verfügung, die die Bindungseigenschaften des mAk 4E10 besitzen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird dementsprechend ein anderer HIV-1 neutralisierender monoklonaler Antikörper als der veröffentlichte humane mAk 4E10-IgG3 zur Verfügung gestellt, wobei dieser Antikörper an eine Aminosäuresequenz bindet, die den aa 672 bis 677 (aa NWFDIT) von gp41 des TCLA-Isolats HTVL-IIIMN entspricht. In einer bevorzugten Ausführungsform neutralisiert dieser Antikörper sogar HIV-1-Mutanten, die gegenüber einer Neutralisierung durch die mAk 2F5 und/oder 2G12 unempfindlich sind. Ein Vertreter dieses Typs von neutralisierenden Antikörpern ist der mAk 4E10-IgG1, d.h. die IgG1-Variante des bekannten mAk 4E10-IgG3.
Bei dieser Gelegenheit wird darauf hingewiesen, dass gewisse den mAk 4E10-IgG3 betreffende Information des Standes der Technik anscheinend irrtümlich war: Buchacher und Mitautoren (AIDS Res. Human Retroviruses 10 (4), 1994, 359–369) haben Ergebnisse veröffentlicht, die eine Bindung des mAk 4E10 an ein C-terminales Epitop an den gp41-Aminosäurepositionen aa 824 bis 830 demonstrieren (die Nummerierung bezieht sich auf den HIV-1-Stamm BH10). Als wir ihre Versuche wiederholten, waren wir nicht in der Lage, diesen Befund zu bestätigen.
Auch die dort beschriebene Kreuzreaktion mit Proteinen der MHC-Klasse II wurde nicht beobachtet. Wir fanden keinerlei Wechselwirkung mit den relevanten Peptiden 2047 und 2048, die die Aminosäuren EGTDRVI enthalten.
Trotz dieser irreführenden Informationen des Standes der Technik, die aus dem mAk 4E10-IgG3 lediglich einen aus einer Anzahl von wenig interessanten Antikörpern ohne vielversprechende Anti-HIV-Eigenschaften machten, haben wir den Antikörper noch einmal vergleichenden Inhibierungstests unterworfen, nachdem wir seinen Phänotyp durch rekombinante Expression in CHO-Zellen von IgG3 zu IgG1 verändert hatten. Die aus Neutralisierungsexperimenten mit der IgG1-Variante gewonnenen Ergebnisse waren unerwartet günstig und vielversprechend und übertrafen bei weitem unsere Erwartungen, wie weiter oben umrissen.
Anscheinend ist 4E10-IgG1 ein leistungsfähiges Werkzeug z.B. für die passive Immunisierung, weil sich erwiesen hat, dass der mAk 4E10-IgG1 auch Viren neutralisiert, die einer Neutralisierung durch die Antikörper 2F5 und/oder 2G12 entgangen waren, und weiter auch, weil wir nicht in der Lage waren, ein HIV-1-Isolat zu finden, das gegenüber einer Neutralisierung durch eine Kombination von 2F5 und 4E10-IgG1 unempfindlich war. In der einen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung daher auf eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Hemmung oder Verhütung einer HIV-1-Infektion von Säugerzellen, die zumindest einen HIV-1 neutralisierenden monoklonalen Antikörper umfasst, der an eine Aminosäuresequenz bindet, die den aa 672 bis 677 von gp41 des TCLA-Isolats HTVL-IIIMN entspricht, wobei der meistbevorzugte Antikörper der mAk 4E10-IgG1 ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung den mAk 4E10-IgG1 in Kombination mit zumindest einem weiteren neutralisierenden anti-HIV-1-Antikörper, bevorzugt in Kombination mit zumindest einem der mAk 2F5 und 2G12.
In noch einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des mAk 4E10, wahlweise in seiner IgG1-Variante, um einen antiidiotypischen Antikörper hervorzurufen oder auf ihn zu prüfen, der mit dem bindenden Paratop des mAk 4E10 reagiert und der das 4E10-Epitop oder einen wesentlichen Teil davon nachahmt, d.h. der ein Fragment des gp41 aus HIV-1 imitiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die den aa 672 bis 677 von gp41 des TCLA-Isolats HTVL-IIIMN entspricht.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
Damit die hierin beschriebene Erfindung vollständiger verstanden wird, werden die folgenden Beispiele vorgelegt. Die Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sind nicht als diese Erfindung in irgendeiner Beziehung einschränkend auszulegen.
Beispiele
Die folgenden Materialien und Verfahren wurden in den nachfolgenden Beispielen 1 bis 7 verwendet.
a) Antikörper
Die Erzeugung, Herstellung und Charakterisierung der menschlichen monoklonalen Antikörper 4E10, 2F5, 2G12 und 3D6 sind zuvor beschrieben worden (D'Souza und Mitautoren, J. Infect. Dis. 1997; 175: 1056–1062; Kunert und Mitautoren, Biotechnol. Bioeng. 2000; 67: 97–103). Kurz gesagt, wurden Antikörper produzierende Hybridome durch ein kombiniertes Polyethylenglykol-/Elektrofusionsverfahren erzeugt. Von asymptomatischen HIV-1-positiven Spendern stammende PBMC wurden mit der Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinie CB-F7 verschmolzen. Hybridomüberstände wurden auf die Produktion HIV-spezifischer Antikörper geprüft, und positive Klone wurden mit ELISA, Western-Blot- und Immunfluoreszenz-Assays weiter analysiert. Die Antikörper wurden rekombinant in Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO: Chinese Hamster overy cells) als IgG1(k) exprimiert, um den Isotyp von 2F5 und 4E10 von IgG3 zu IgG1 zu wechseln und eine sichere Massenproduktion zu ermöglichen. Für die vorliegenden, in den nachfolgenden Beispielen 1 bis 7 beschriebenen Untersuchungen wurden die rekombinanten CHO-IgG1-Versionen der Antikörper 2F5 und 4E10 verwendet.
4E10, 2F5 und 2G12 enthalten identische konstante Bereiche und unterscheiden sich nur in ihren variablen Teilen, die von den ursprünglichen Hybridomklonen abgeleitet worden waren. 2G12 erkennt ein komformationsempfindliches Epitop auf gp120, mAk 2F5 erkennt das ELDKWA-Motiv auf der Ektodomäne von gp41, und 4E10 erkennt ein anderes Epitop auf gp41. 3D6 erkennt ein Epitop in der immundominanten Schleife von gp41 (Aminosäuren GCSGKLICTTAVPWNAS) und diente als eine nicht neutralisierende Kontrolle in allen Synzytieninhibierungstests.
Der menschliche mAk IgG1b12 wurde freundlicherweise von Dr. Dennis Burton, The Scripps Research Institute, zur Verfügung gestellt. Seine Erzeugung ist bei Burton und Mitarbeitern, Science 1994; 266: 1024–1027, beschrieben worden. IgG1b12 erkennt ein die CD4-Bindungsdomäne überlappendes Epitop, und es konnte gezeigt werden, dass er CD4/gp120-Wechselwirkung hemmt. HIVIG wurde von NABI (Boca Raton, Florida, USA) hergestellt und enthielt von einer Vielzahl von HIV-1-positiven Patienten abgeleitetes, gereinigtes polyklonales HIV-1-spezifisches Immunglobulin. Die Zubereitung, die 98 % monomere IgG enthielt, wurde freundlicherweise von Dr. John Mascola zur Verfügung gestellt.
b) Zellen
Die AA-2-Zelllinie für den Synzytieninhibierungstest wurde vom AIDS Reagent Reference Program des NIH erhalten (von M. Hershfield zur Verfügung gestellt). Die Zellen wurden zweimal wöchentlich in einem Zellkulturmedium (CCM: cell culture medium) passagiert, das RPMI-1640 (Biochrom, Berlin, Deutschland) enthielt und mit 10 % hitze-desaktiviertem FCS und 4 mM L-Glutamin ergänzt wurde.
PBMC für Virenneutralisierungstests wurden durch Ficoll-Gradientenzentrifugierung bei 400 g aus Blut gewonnen, das von HIV-negativen Freiwilligen abgeleitet worden war. Die Zellen wurden vor der Verwendung während zweier Tage mit Phytohämagglutinin (Sigma, St. Louis, MO) in einem CCM stimuliert, das mit 20 E/ml IL-2 und Antibiotika (Penicillin 100 E/ml, Streptomycin 100 μg/ml; Biochrom, Berlin, Deutschland) ergänzt worden war.
c) Viren
Primäre HIV-1-Isolate 92BR 021/030, 92RW 009/021, 92TH 14/21/24 und 92UG 001/029/037 wurden aus dem WHO Network für HIV Isolation and Characterization erhalten und durch das AIDS Reagent Project des MRC zur Verfügung gestellt. Viren WYG, WRF, WHM, WRB und WSC wurden früher aus österreichischen AIDS-Patienten im Spätstadium isoliert. Als S2/02, S2/03, S2/04, S2/05, S2/06, S2/08, S2/09 und P6/71 bezeichnete Isolate wurden während der ersten klinischen Testphase 1999/2000 mit 2F5 und 2G12 aus asymptomatischen HIV-1-positiven Freiwilligen isoliert. Die Viren wurden auf stimulierten PBMC gezüchtet und als zellfreie Überstände geprüft.
TCLA-Viren HTLV-IIIB, HTLV-IIIMN und HTLV-IIIRF wurden aus infizierten H9-Zellen abgeleitet, die durch die American Type Culture Collection und das AIDS Research and Reference Reagent Program des NIH zur Verfügung gestellt worden waren; cl82 wurde durch Dr. E. M. Fenyö zur Verfügung gestellt. Stammkulturen wurden auf AA-2-Zellen gezüchtet und titriert. Die 50-%ige Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50: 50 % tissue culture infectious dose) wurde nach dem Verfahren von Reed und Muench berechnet (Reed LJ und Muench H, Am. J. Hygiene 1938; 27: 493–497).
Beispiel 1: Epitopmapping mit ELISA
Für das Mapping des 4E10-Epitops wurden 34 überlappende gp41-Peptide von HTLV-IIIMN (aa 501–856, Tabelle 1; von AnaSpec, Inc., hergestellt) aus dem AIDS Research and Reference Reagent Program abgeleitet (Nummern 2015 bis 2049). Die meisten dieser Peptide hatten eine Länge von 20 Aminosäuren und hatten eine Überlappung von 10 Aminosäuren zwischen sequenziellen Peptiden. Das Peptid GGGLELDKWASL wurde im eigenen Labor synthetisiert.
Das verkürzte rekombinante E. coli-gp41 MN-Peptid wurde durch die Zentralstelle für AIDS-Reagentien des NIBSC von Dr. J. Raina zur Verfügung gestellt. Rekombinantes Vakzinia-gp160 IIIB war ein Geschenk der Immuno-AG, Österreich.
Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorp, Roskilde, Dänemark) wurden über Nacht bei +4°C mit synthetischen Peptiden, gp41 MN oder gp160 IIIB bei einer konstanten Konzentration von 1 μg/ml oder bei 10 μg/m1 beginnenden seriellen Verdünnungen in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer beschichtet. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, die 0,1 % Tween 20 enthielt, und während zwei Stunden bei 37°C mit 2 % Magermilch blockiert. Nach dem Waschen wurden (mit 500 ng/ml beginnende) serielle Verdünnungen von 4E10 oder 2F5 oder konstante Konzentrationen (100 ng/ml) während einer Stunde inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und durch mit Meerrettich-Peroxidase (Zymed, San Francisco, CA) konjugiertem Ziege-Antimensch-IgG(g) während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit einer 0,03 % H₂O₂ enthaltenden 1,2-o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid- (OPD; Sigma, St. Louis, MO) Anfärbelösung entwickelt. Nach Abbrechen der Reaktion mit 2,5 N H₂SO₄ wurde die optische Dichte (OD) bei 492/620 nm gemessen.
Für Konkurrenzuntersuchungen wurden alle überlappenden gp41 MN-Peptide, GGGLELDKWASL und gp41 MN getestet. Konstante Konzentrationen von 4E10 (250 ng/ml) wurden (beginnend mit 50 μg/ml bei synthetischen Peptiden und mit 5 μg/ml bei gp41) mit seriellen Verdünnungen der Peptide während zwei Stunden bei 37°C inkubiert, ehe sie den mit Peptid 2031 oder gp41 (1 μg/ml) beschichteten Platten aufgegeben wurden. Immunfluoreszenzanalyse erfolgte mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie. Für die konfokale Mikroskopie wurden PBMC, die mit primären HIV-1-Viren (S2/02, S2/04, S2/08) infiziert waren, während einer Stunde bei 37°C an Deckgläser (Biorad, München, Deutschland) haften lassen. Nicht infizierte und nicht stimulierte sowie mitogen-stimulierte PBMC des gleichen Spenders dienten als negative Kontrollen. Die Deckgläser wurden mit PBS gewaschen und während 20 min mit 5 % Magermilch in PBS blockiert. Antikörper 4E10, 2F5, 2G12 und HIVIG wurden in Konzentrationen von 100 μg/ml aufgebracht und während einer Stunde bei +4°C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS/Magermilch gewaschen und während einer Stunde mit FITC-markiertem polyklonalem Ziege-Antimensch-IgG(g) (Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Nach intensivem Waschen mit PBS wurden die Zellen während 20 Minuten mit Paraformaldehyd (3 %) fixiert und anschliessend mit PBS gewaschen. Das Fluoreszenzsignal wurde in einem konfokalen Mikroskop Biorad MRC 600 visualisiert.
Wechselweise wurden die gleichen Versuche mit einer Paraformaldehyd-Fixierung vor der Anfärbung der PBMC und Inkubierungsschritten bei 37°C ausgeführt. Für Analysen mit Durchflusszytometrie wurden HIV-1-infizierte PBMC (Isolate S2/02, S2/04) und stimulierte sowie nicht stimulierte, nicht infizierte PHA-P-Zellen gewaschen und während 30 min bei +4°C mit 10 % FCS enthaltender PBS blockiert. PBMC wurden während einer Stunde auf Eis mit 4E10, 2F5 und HIVIG (100 μg/ml) inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS/FCS wurden die Zellen während einer Stunde wiederum auf Eis mit polyklonalem, FITC-markiertem Ziege-Antimensch-IgG(g) inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und vor der Analyse auf einem FACS-Vantage (Becton Dickinson, San Jose, CA) während einer Stunde bei Raumtemperatur mit 3 % Paraformaldehyd fixiert.
Synzytieninhibierungstest
Die Synzytieninhibierung wurde mit AA-2-Zellen als Indikatorenzelllinie und Synzytienbildung als Auslesung beurteilt, wie früher beschrieben (Purtscher und Mitautoren, AIDS Res. Hum. Retroviruses 1994; 10: 1651–1658). Kurz gesagt, wurden serielle Verdünnungen von Antikörpern in CCM, die Polybrene (5 μg/ml; Sigma, St. Louis, MO) enthielten, mit Viren von 10²–10³ TCID50/ml während einer Stunde bei 37°C vorinkubiert, ehe die AA-2-Zellen hinzugegeben wurden. Die Zellen wurden vor Beurteilung der Synzytienbildung während fünf Tagen inkubiert. Die Versuche wurden mit vier bis acht Replikaten je Verdünnungsschritt ausgeführt. Das Vorhandensein von wenigstens einer Synzytie je Loch wurde als ein Hinweis auf HIV-1-Infektion betrachtet. Die 50 % hemmende Konzentration (IC50) wurde nach dem Verfahren von Reed und Muench, Am. J. Hygiene 1938; 27: 493–497, berechnet. Die Versuche wurden mit 2F5, 2G12 und 4E10 ausgeführt. Alle Tests beinhalteten eine Virentitration des Inoculums, um den infektiösen Titer zu bestimmen. In alternativen Versuchen wurde der Vorinkubationsschritt von Antikörper und Virus unterlassen.
Neutralisierungstest
Die neutralisierende Aktivität der hu-mAk 4E10 (= 4E10-IgG1), 2F5 (2F5-IgG1), 2G12 und IgG1b2 wurde in einem auf PBMC beruhenden Neutralisierungstest bestimmt, wie zuvor beschrieben (Purtscher und Mitautoren, AIDS Res. Hum. Retroviruses 1994; 10: 1651–1658). Serielle Verdünnungen der Antikörper wurden vor Zugabe der PBMC und weiterer Inkubation während sieben Tagen während einer Stunde bei 37°C mit den Viren vorinkubiert. Die Versuche wurden mit vier Replikaten je Verdünnungsschritt ausgeführt. Das Virenwachstum wurde zum Zeitpunkt der Testbeendigung mit einem empfindlichen p24-ELISA gemessen (Steindl und Mitautoren, J. Immunol. Methods 1998; 217: 143–151). Die Verhältnisse der p24-Antigenproduktion in mAk enthaltenden Kulturen zur p24-Antigenproduktion in Kontrollkulturen wurden unter Berücksichtigung des p24-Eintrags berechnet, und die mAk-Konzentrationen (μg/ml), die eine 50%ige Hemmung bewirkten, wurden durch lineare Regressionsanalyse bestimmt. Jeder Test beinhaltete eine Virentitration, um die aktuelle TCID50 zu bestimmen. Die Versuche wurden als gültig angesehen, wenn die viralen Titer zwischen 10² und 10³ TCID50 lagen und die maximale Replikation zu mindestens fünfmal höheren Konzentrationen als der p24-Eintrag führte.
Bestimmung von Synergie bei mAk-Kombinationen
Die synergistischen Neutralisierungswirkungen von mAk in Kombinationen wurden nach dem Verfahren von Chou und Talalay berechnet (Chou TC und Talalay, Adv. Enzyme Regul. 1984; 22: 27–55). Kurz gesagt wurde die Menge der einzelnen mAk, die erforderlich ist, um eine 50-%ige Hemmung zu erreichen, mit den Konzentrationen verglichen, die erforderlich sind, wenn eine Kombination von mAk verwendet wird. Der Kombinationsindex (CI: combination index) wurde auf der Grundlage der Gleichung: CI = (D1)/(Dx)1 + (D2)/(Dx)2, berechnet. (Dx)1 und (Dx)2 sind die Dosierungen von mAk1 bzw. mAk2 allein, die erforderlich sind, um eine 50-%ige Hemmung zu erreichen, während (D1) und (D2) die Dosierungen von mAk1 bzw. mAk2 sind, wenn in Kombination verwendet. CI < 1 zeigt Synergismus an, CI = 1 zeigt additive Wirkungen an, und CI > 1 zeigt Antagonismus an.
Ergebnisse
Um den Bindungsbereich von 4E10 zu bestimmen, wurden vierunddreissig (34) überlappende gp41 MN-Peptide durch ELISA auf ihre Reaktivität mit 4E10 geprüft. Das Peptid GGGLELDKWASL, das das minimale 2F5-gp41-Epitop umfasst, wurde als negative Kontrolle verwendet, während gp41 MN und gp160 IIIB als positive Kontrollen dienten. 2F5 wurde parallel geprüft, um die Möglichkeit zu erkunden, dass beide Antikörper das gleiche Epitop erkennen. 4E10 band an Peptid 2031, gp160 (1 und Tabelle 1) und gp41 in einer von der Dosierung abhängigen Weise. Kein anderes Peptid zeigte signifikante Reaktivität mit 4E10. 2F5 band an die gleichen Peptide und zusätzlich an Peptid 2030 (1 und Tabelle 1) sowie an das GGGLELDKWASL-Peptid, die alle die ELDKWA-Sequenz enthalten.
TABELLE 1: Aminosäuresequenzen von überlappenden HIV-1-gp41 MN-Peptiden, die für 4E10- und 2F5-ELISA-Bindungsstudien verwendet wurden^A
Mit allen synthetischen gp41 MN-Peptiden und gp41 ausgeführte Konkurrenzstudien bestätigten, dass nur das Peptid 2031 und das gp41 mit 4E10 reagierten (gp160 wurde nicht geprüft). Eine Vorinkubation mit seriellen Verdünnungen des Peptids 2031 und des gp41 bei konstanten Mengen von 4E10 ergab lediglich eine dosierungsabhängige Hemmung der Bindung des mAk 4E10 an gp41 (3A) bzw. an Peptid 2031 (3B). Kein anderes Peptid vermochte die Bindung von 4E10 zu hemmen.
Aus den obigen Ergebnissen schlossen wir, dass das minimale Bindungsepitop (das Kernepitop) von 4E10 auf dem Peptid 2031 ganz vorliegt und auf das ELDKWAS-Epitop von 2F5 folgend innerhalb der aa-Sequenz LWNWFDITNWL (aa-Positionen 670–680 von gp41; Nummerierung gemäss TCLA-Isolat HTLV-IIIMN) liegt. Ein genaueres Mapping mit kleineren Peptiden offenbarte ein Kernepitop von sechs Aminosäuren, das die Sequenz NWFDIT umfasste (aa 672 bis 677 des gp41 von HTLV-IIIMN).
Beispiel 2: Immunfluoreszenzanalyse der 4E10-Bindungseigenschaften
Wir führten Bindungsstudien von 4E10 an nicht stimulierten sowie PHA-P-stimulierten HIV-1-negativen wie auch HIV-1-infizierten PBMC aus, um die Wechselwirkung von 4E10 mit auf der Oberfläche von infizierten PBMC vorhandenen HIV-1-Antigenen und auch eine mögliche Kreuzreaktivität mit der MHC-Klasse II zu untersuchen, die früher beschrieben worden war (Buchacher und Mitautoren, siehe oben). Die Bindung von 4E10 wurde durch indirekte Immunfluoreszenz mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie mit der von 2F5, 2G12 und HIVIG verglichen.
Signifikante Bindung wurde nur an infizierten Zellen nachgewiesen, wo 2G12 und HIVIG stark gebunden waren, während 4E10 und 2F5 nur eine schwache Reaktivität aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Ferner band 4E10 auch nicht stärker als 2F5, 2G12 und HIVIG an nicht infizierte PBMC. Zwischen den Ergebnissen, die für bei +4°C angefärbte native Zellen gewonnen worden waren, und denen, die an Zellen gewonnen worden waren, die vorfixiert und bei 37°C angefärbt worden waren, wurde kein Unterschied beobachtet.
Beispiel 3: Synzytieninhibierungstest mit T-Zelllinien-adaptierten (TCLA) HIV-1-Stämmen
Die Fähigkeit des menschlichen monoklonalen Antikörpers 4E10 (= 4E10-IgG1), die Bildung von Synzytien durch TCLA-Isolate HTLV-IIIB, HTLV-IIIRF, HTLV-IIIMN und cl82 in AA-2-Zellen zu hemmen, wurde mit der entsprechenden Fähigkeit der mAk 2F5 und 2G12 verglichen. Der mAk 2G12 erkennt ein konformationsempfindliches, glykosylierungsabhängiges Epitop auf gp120, das nicht mit der V1-, V2- und V3-Schleife oder der CD4-Bindungsstelle in Beziehung steht (Trkola und Mitautoren, J. Virol. 1996; 70: 1100–1108). 4E10 und 2F5 hemmten die Synzytienbildung bei allen vier Viren, während 2G12 nicht das HTLV-IIIMN neutralisierte (Tabelle 2).
TABELLE 2: Synzytieninhibierungstest^a mit den mAk 4E10, 2F5 und 2G12 gegen T-Zelllinien-adaptierte Viren
3D6, ein mAk, der ein Epitop in der immundominanten Schleife von gp41 erkennt (Buchacher und Mitautoren, siehe oben), diente als eine nicht neutralisierende Kontrolle und vermochte die Synzytienbildung nicht zu hemmen. Die 50 % hemmenden Konzentrationen von 4E10 reichten von 0,3 μg/ml für den Stamm MN bis zu 12,5 μg/ml für den Stamm RF. 2F5 und 2G12 neutralisierten die TCLA-Stämme bei vergleichsweise niedrigen Konzentrationen, wobei aber 2G12 das HTLV-IIIMN-Virus nicht neutralisierte. 4E10 war der potenteste mAk gegen HTLV-IIIMN, 2F5 war der potenteste mAk gegen HTLV-IIIB und cl82 (0,3 μg/ml), während 2G12 das HTLV-IIIRF bei geringeren Konzentrationen neutralisierte als die anderen beiden mAk (2,4 μg/ml).
Beispiel 4: Einfluss der Vorinkubation von Virus und mAk auf die Synzytienhemmung
Um den Einfluss einer Vorinkubation des Virus mit Antikörper vor der Zugabe zu den Zielzellen zu bestimmen, wurden die Tests wechselweise ohne den Vorinkubationsschritt ausgeführt. Das Virus (HTLV-IIIRF) und die mAk (4E10, 2F5, 2G12) wurden zu den AA-2-Zellen gleichzeitig hinzugefügt. Für 4E10 (-IgG1) und 2F5 (-IgG1) unterschieden sich die Ergebnisse mit und ohne Vorinkubation nicht, während bei 2G12 nach dem einstündigen Vorinkubationsschritt ein dramatischer Anstieg von 300 % beobachtet wurde.
Beispiel 5: Neutralisierung von primären HIV-1-Isolaten
Als Nächstes wurde die neutralisierende Aktivität des mAk 4E10(-IgG1) mit der entsprechenden Aktivität von 2F5, 2G12 und IgG1b12 gegen ein Panel von Primärisolaten von unterschiedlichen Kladen in einem auf PBMC beruhenden Neutralisierungstest verglichen. IgG1b12 bindet an ein diskontinuierliches Epitop, das mit der CD4-Bindungsdomäne auf gp120 überlappt (siehe Burton und Mitautoren, Science 1994; 266: 1024–1027). Die mAk-Konzentrationen, bei denen eine 50-%ige Neutralisierung erreicht wurde, werden in Tabelle 3 gezeigt (Werte aus zwei unabhängigen Versuchen erhalten).
TABELLE 3: Neutralisierung von primären HIV-1-Isolaten durch die mAk 4E10, 2F5, 2G12 und IgG1b12^a
4E10 neutralisierte 18 von 22, 2F5 20 von 22, 2G12 13 von 22 und IgG1b12 5 von 6 geprüften Isolaten bei Konzentrationen von weniger als 50 μg/ml. Zum Beispiel war 4E10 ebenso aktiv wie 2G12 gegen das Isolat S2/05, aber aktiver als 2F5 und IgG1b12 (2). Die mittleren Konzentrationen, die erforderlich waren, um für die neutralisierten Viren eine 50-%ige Hemmung der viralen Replikation zu erreichen, waren 5,7 (4E10), 2,6 (2F5), 0,7 (2G12) und 12,4 μg/ml (IgG1b12). Kein Virus war gegenüber allen vier Antikörpern resistent. Ausserdem wurde jedes Virus durch mindestens einen der Anti-gp41- Antikörper 4E10 bzw. 2F5 neutralisiert, wobei 16 von 22 Isolaten durch beide mAk neutralisiert wurden, 2 von 22 nur durch 4E10 und 4 von 22 nur durch 2F5.
Beispiel 6: Vergleich der neutralisierenden Aktivität des Hybridom-mAk 4E10-IgG3 und des CHO-rekombinanten mAk 4E10-IgG1
Der auf PBMC beruhende Neutralisierungstest wurde mit primären HIV-1-Isolaten ausgeführt (siehe Beispiel 5).
TABELLE 4: Neutralisierende Aktivität von 4E10-IgG3 verglichen mit 4E10-IgG1
Die Ergebnisse demonstrieren beeindruckend die bemerkenswerte Steigerung der Neutralisierungswirkung des mAk 4E10-IgG1 gegenüber dem bekannten mAk 4E10-IgG3.
Beispiel 7: Kombinierte Anwendung der mAk 4E10 und 2F5
Da 4E10 und 2F5 benachbarte Epitope erkennen, wurde die mögliche hemmende Wechselwirkung von 2F5 und 4E10 in der Neutralisierung primärer Viren an fünf unterschiedlichen primären Viren (S2/02, S2/03, S2/04, S2/06 und S2/08) untersucht, indem Zubereitungen, die entweder den Antikörper 2F5 oder den Antikörper 4E10 enthielten, mit einer Zubereitung verglichen wurden, die eine Kombination der beiden Antikörper (im Verhältnis 1:1) enthielt. Die Kombination von 2F5(-IgG1) und 4E10(-IgG1) lieferte eine geringfügig synergistische oder additive Wirkung (CI ≤ 1) in allen Versuchen; eine antagonistische Wirkung wurde in keinem der Versuche gefunden. Ergebnisse eines zusätz- lichen Versuchs mit dem Primärisolat P6/71, bei dem 2G12 und IgG1b12 ebenfalls einbezogen wurden, werden in 4A, 4B und 4C gezeigt. Die Kombinationsindices (CI50) für diesen Versuch betrugen 0,64, 0,23 und 0,87 für die Kombinationen von 4E10 mit 2F5, 2G12 bzw. IgG1b12 und deuten darauf hin, dass auch 2G12 und IgG1b12 den mAk 4E10 nicht antagonisieren, sondern additive, wenn nicht sogar synergistische Wirkungen zeigen.
Zuordnung der Aminosäuresequenzen:
SEQUENZENAUFLISTUNG

Claims

Monoklonaler, HIV-1 neutralisierender Antikörper ausser mAk 4E10 IgG3 (ECACC Acc. Nr. 90091703), worin der Antikörper an eine Aminosäuresequenz bindet, die mit aa 672–677 (NWFDIT) des gp41 des TCLA-Isolats HTVL IIIMN identisch ist oder ihr entspricht, und in der Lage ist, HIV-1-Mutanten zu neutralisieren, die gegenüber einer Neutralisierung durch mAk 2F5 (ECACC Acc. Nr. 90091704) und/oder mAk 2G12 (ECACC Acc. Nr. 93091517) unempfindlich sind, dadurch gekennzeichnet, dass er mAk 4E10 IgG1 (ECACC Acc. Nr. 01110665) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung oder Verhütung einer HIV-1-Infektion von Säugerzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Antikörper nach Anspruch 1 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest einen weiteren neutralisierenden Anti-HIV-1-Antikörper umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest einen der mAk 2F5 und 2G12 umfasst.
Verwendung des mAk 4E10-IgG1 (ECACC Acc. Nr. 01110665) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegen HIV-1-Infektion.
Verwendung nach Anspruch 5 zur Hemmung oder Verhütung einer Infektion von Säugerzellen durch HIV-1-Stämme, die gegenüber einer Neutralisierung durch einen der mAk 2F5 und 2G12 oder beide unempfindlich sind.
Verwendung des mAk 4E10-IgG1 (ECACC Acc. Nr. 01110665), um ein Peptid und insbesondere einen antiidiotypischen Antikörper hervorzurufen oder zu überprüfen, der mit dem 4E10 bindenden Paratop des mAk 4E10-IgG1 reagiert.
Verwendung des mAk 4E10-IgG1 (ECACC Acc. Nr. 01110665) nach Anspruch 7, worin das Peptid ein Fragment des gp41 von HIV-1 imitiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mit aa 672–677 (NWFDIT) des gp41 des TCLA-Isolats HTVL IIIMN identisch ist oder ihr entspricht.
Pharmazeutische Zusammensetzung für die passive Immunisierung eines Säugerempfängers gegen HIV-1-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest einen in Anspruch 1 definierten, HIV-1 neutralisierenden Antikörper umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest einen weiteren, HIV-1 neutralisierenden Antikörper umfasst, der aus der Gruppe von mAk 2F5 (ECACC Acc. Nr. 90091704) und mAk 2G12 (ECACC Acc. Nr. 93091517) ausgewählt ist.