-
Technischer Bereich
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf den Bereich
der Proteinreinigung und im Besonderen auf die Reinigung von nicht
fusioniertem Glycoprotein gp120 voller Länge aus HIV-SF2.
-
Hintergrund
-
Versuche,
Impfstoffe gegen HIV-1 herzustellen, trafen auf begrenzten Erfolg,
wie durch das Kriterium gemessen wurde, bei Tieren eine Immunantwort
zu erzielen, die der von Menschen, welche serumpositiv auf HIV-1
sind, ähnlich
oder gleich ist. Das Hauptziel, welches bis jetzt nicht erreicht
wurde, ist die Erzeugung von Antikörpern, die in vitro bei Titern
virusneutralisierend wirken, welche sowohl den Wert als auch die
Komplexität (d.
h. die Fähigkeit,
mehr als ein Isolat zu neutralisieren) erreichen, die bei menschlichen
Seren von infizierten Individuen gefunden wird. Alle neutralisierenden
Antikörper
beim Menschen wurden zu dem Hüllprotein
gp160 oder einem seiner es zusammensetzenden Teile (gp120 oder gp41)
kartiert, und demnach haben sich die meisten Bemühungen um Impfstoffe auf die
Entwicklung von auf Hüllproteine
bezogene Antigene konzentriert.
-
Fünf Typen
solcher Antigene wurden entwickelt: (1) gereinigtes gp120, abgeleitet
von HIV-infizierten Gewebekulturzellen (hierin als „virenabgeleitetes
gp120 bezeichnet");
(2) gp120, welches in Zellen hergestellt wurde, die mit rekombinanten
Viren infiziert sind, wie Vaccinia oder Baculovirus („Lebendvirus-Vektor
abgeleitetes gp120 und gp160");
(3) rekombinantes gp120, hergestellt in Säugerzellen („rekombinantes
Säuger-gp120", manchmal fälschlicherweise
bezeichnet als natives rekombinantes gp120); (4) rekombinante denaturierte
Polypeptide, die alle oder verschiedene Abschnitte von gp120 und
gp41 darstellen („rekombinante denaturierte
Antigene"); und
(5) Peptide, die kleine Segmente von gp120 und gp41 darstellen („Peptide").
-
Immunogenitätsversuche
wurden mit all diesen Antigentypen durchgeführt, und zwar mit recht einförmigen Ergebnissen.
Im Allgemeinen sind die Antigene stark immunogen, wenn sie verschiedenen
Arten als Adjuvans zugesetzt werden. Sie haben Antikörper erzeugt,
die in der Lage sind, das homologe Isolat von HIV-1 zu neutralisieren,
aber sie neutralisieren nicht-homologe Isolate schlecht oder gar
nicht. Die Neutralisationswerte haben ebenfalls (im Allgemeinen)
nicht den Wert an neutralisierendem Titer erreicht, der in infizierten Menschen
gefunden wurde.
-
Zum
Beispiel können
sowohl vollständig
glycosyliertes gp120, das auf natürliche Weise von Viren gereinigt
oder durch gentechnisch veränderte
Säugerzellen
hergestellt wurde, nicht-glycosyliertes gp120, hergestellt in Hefe,
als auch ein Fragment von gp120, hergestellt in E. coli, HIV-1-neutralisierende
Antikörper
in Versuchstieren hervorbringen. Meistens sind die Antworten von
Tieren, die mit Virion- oder rekombinanten gp120-Antigenen immunisiert
wurden, nur bei der Neutralisation des Virusisolats, von dem das
gp120-Antigen stammt, wirksam. Eine Ausnahme ist die Arbeit von
Berman et al. (Referenz 1, nachstehend), die zeigt, dass gereinigtes
rekombinantes HIV-1-gp120, sekretiert von gentechnisch veränderten
Zellen des Eierstocks beim Chinesischen Hamster, gruppenspezifische
neutralisierende Antikörper
bei Schimpansen hervorbrachte.
-
Ein
anderer Faktor, der bei der Herstellung von HIV-1-Impfstoffen besonders
schwer zu überwinden war,
ist die Sequenzdiversität.
HIV-1 und HIV-2 sind dadurch gekennzeichnet, dass sie ein sehr hohes
Ausmaß an
Sequenzdiversität
besitzen, die im gp120-Abschnitt der Hülle am stärksten ausgeprägt ist.
Diese Sequenzdiversität
ist in Regionen angehäuft,
die als hypervariable Regionen bekannt sind. Viele Gruppen haben
die Verwendung eines Impfcocktails vorgeschlagen, welcher antigene
Stoffe, die von verschiedenen HIV-Isolaten abgeleitet sind, umfasst,
um einen Schutz gegen weite Bereiche von infektiösen Quellen zu gewähren.
-
Entsprechend
bleibt ein Bedarf nach einem antigenen Stoff, der immunologische
und andere Protein/Protein bindende Eigenschaften bei gp120, so
wie es auf einem HIV-1-Viruspartikel präsentiert wird, besitzt. Insbesondere
sind antigene Stoffe, die in der Lage sind, neutralisierende Antikörper zu
induzieren, vorzugsweise unter Verwendung eines einzigen Quellenmaterials,
das neutralisierende Antikörper
gegen verschiedene Feldisolate induziert, äußerst wünschenswert.
-
Relevante Literatur
-
Die
folgenden Veröffentlichungen
beziehen sich alle auf die fünf
Typen von Impfstoffkandidaten, die vorstehend beschrieben wurden:
- (1) Berman et al., „Human Immunodeficiency Virus
Type I Challenge of Chimpanzees Immunized with Recombinant Envelope
Glycoprotein gp120," Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 5200–5204;
- (2) Berman et al., „Expression
and Immunogenicity of the Extracellular Domain of the Human Immunodeficiency
Virus Type I Envelope Glycoprotein gp160," Journal of Virology (1989) 63: 3489–3498;
- (3) Nara et al., „Purified
Envelope Glycoproteins from Human Immunodeficiency Virus Type I
Variance Induced individual, Type-Specific Neutralizing Antibodies", Journal of Virology
(1988) 62: 2622: 2628;
- (4) Arthur et al., „Serological
Responses in Chimpanzees Inoculated with Human Immunodeficiency
Virus Glycoprotein (gp120) Subunit Vaccine," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:
8583–8587;
- (5) Evans et al., „An
Engineered Polio Virus Chimaera Elicits Broadly Reactive HIV-1 Neutralizing
Antibodies," Nature
(1989) 339: 385–388;
- (6) Barreff et al., „Large-Scale
Production and Purification of a Vaccinia Recombinant-Derived HIV-1
gp160 and Analysis of its Immunogenicity," AIDS Research and Human Retroviruses
(1989) 5: 159–171;
- (7) Earl et al., „Isolate-
and Group-Specific Immune Response to the Envelope Protein of Human
Immunodeficiency Virus induced by a Live Recombinant Vaccinia Virus
in Macaques," AIDS
Research and Human Retroviruses (1989) 5: 23–32;
- (8) Putney et al., „HTLV-III/LAV-Neutralizing
Antibodies to an E. coli-produced Fragment, of the Virus Envelope," Science (1986) 234:
1392–1395;
- (9) Steimer et al., „Genetically
Engineered Human Immunodeficiency Envelope Glycoprotein gp120 Produced in
Yeast is the Target of Neutralizing Antibodies," Vaccines 87 (1987) 236–241;
- (10) Steimer et al., „Recombinant
env and gag Polypeptides in Characterizing HIV-1-Neutralizing Antibodies," Vaccines 88 (1988)
347–355;
- (11) Ho et al., „Human
Immunodeficiency Virus Neutralizing Antibodies Recognize Several
Conserved Domains an the Envelope Glycoproteins," Journal of Virology (1987) 61: 2024–2028; und
- (12) Palker et al., „Type-Specific
Neutralization of the Human Immunodeficiency Virus with Antibodies
to env-Encoded Synthetic Peptides," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:
1932–1936.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung stellt das Verfahren gemäß Anspruch 1 bereit.
-
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
Die
Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung spezifischer
Ausführungsformen
in Kombination mit den Zeichnungen, die Teil der vorliegenden Beschreibung
sind, besser zu verstehen sein, worin:
-
1 ein
schematisches Diagramm eines beispielhaften Expressionsplasmids
für die
Herstellung von rekombinantem HIV-1-gp120 (rgp120) ist.
-
2 eine Tabelle ausgerichteter Aminosäuresequenzen
für verschiedene
HIV-1-Isolate mit den angezeigten konstanten (C) und variablen (D)
Domänen
ist. Mögliche
N-gekoppelte Glycosylierungsorte nur für die HXB2-Sequenz sind durch
[] angezeigt; Cysteinreste haben * über sich in dieser Figur. Diese
Sequenzdaten wurden in Human Retroviruses and AIDS 1988, A Compilation
and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, herausgegeben
durch Gerald Myers et al., veröffentlicht
durch die Theoretical Biology and Biophysics Group, T-10, Poststelle
K710, Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New Mexico,
87545, veröffentlicht.
Es gibt auch eine Version von 1989, die von derselben Quelle herausgegeben
und veröffentlicht wurde.
-
3A eine Graphik ist, die Produktfraktionen,
wie sie in einem Reinigungsschritt unter Verwendung einer Phenyl-HIC-Säule gewonnen
werden, zeigt.
-
3B eine Graphik ist, die Produktfraktionen,
wie sie in einem Reinigungsschritt unter Verwendung einer Ether-HIC-Säule gewonnen
werden, zeigt.
-
3C eine Graphik ist, die Produktfraktionen,
wie sie in einem Reinigungsschritt unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie
gewonnen werden, zeigt.
-
4 eine
Graphik ist, die die Erzeugung eines CD4-gp120-Komplexes unter Verwendung
von Gelfiltrations-HPLC zeigt.
-
5 eine
Graphik ist, die die HIV-ZR6-Neutralisationsdaten von Seren vom
Pavian 2964, analysiert nach 0, 5, 6, 7, 8 und 9 Immunisierungen
mit pg120, zeigt.
-
6 eine
Reihe von Graphiken ist, die Neutralisationstiter aller Serumproben
vom immunisierten Pavian 2958 und vom mit gp120 immunisierten Pavian
2964 aus Beispiel 6 zeigen.
-
7 ein
schematisches Diagramm vom unterbrochenen Immunisierungsschema am
Primaten ist.
-
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Beispiel 1
-
Mutagenese und Expression von HIV-gp120
in Säugerzellen
-
Das
Hüllgen,
das gp160 von HIV-SF2 codiert, wurde durch Einführung eines Stop-Codons nach Arg509
an der natürlichen
gp41-Prozessierungsstelle von gp120 zur Expression von gp120-Sequenzen
hergestellt. Das 5'-Ende
des Gens wurde modifiziert, um einen NheI-Endonuclease-Restriktionsstelle
5' zu der Sequenz,
die Glu31 codiert, zu inserieren, so dass die natürliche Signalsequenz
durch andere Signalsequenzen ersetzt werden konnte, um auf verbesserte
Sekretion aus Säugerzellen
zu testen. Um gp120 als sekretiertes Glycoprotein in Säugerzellen
herzustellen, wurden die HIV-Signalsequenz und untranslatierte 5'-Sequenzen durch
solche aus menschlichem t-PA ersetzt und mutagenisiert, um einen
NheI-Ort in die Nähe
des 3'-Endes der
tPA-Signal-DNA zu platzieren, um Ala Ser zu codieren. Das entstandene
Genkonstrukt wurde mit einer Reihe von Promotoren fusioniert. Die
transiente gp120-Expression wurde nach Transfektion der Expressionsvektoren
in COS-7-Zellen und Vergleich der Mengen an sekretiertem gp120 durch
Ziegen-Einfang-ELISA (nachstehend
beschrieben) und Western Blot bestimmt. Die höchsten Expressionsmengen wurden
bei Verwendung des CMV IE-1-Promotors gesehen und waren mindestens
50-Mal höher
als mit dem frühen SV40-Promotor.
Für die
Konstruktion permanenter Zelllinien wurde das Expressionsplasmid
pCMV6aSF2-120 (1) zusammen mit einem dhfr-Expressionsplasmid
unter Verwendung von Calciumphosphat-Copräzipitation in CHP-dhfr-Zellen
(dg44; siehe unten) transfiziert. Die entstandenen Zelllinien wurden
durch Absuchen von Clonen mit dem gp120-Ziegen-Einfang-ELISA charakterisiert.
Die am stärksten
exprimierenden Zelllinien wurden in Pools in Methotrexat amplifiziert.
Clone wurden bei einer Menge von 0,1 mM isoliert. Unter Verwendung
von gereinigtem Protein als Standard wurde gezeigt, dass Zelllinien
im Bereich von 5 mg pro Liter bezogen auf T-Flaschen gp120 sekretieren.
-
Die
Zellen, die für
die Expression des gp120-Gens verwendet wurden, wurden ursprünglich von
Dr. Leslie Rall der Chiron Corporation im September 1985 bei etwa
100 Passagen gewonnen. Diese Zellen wurden ursprünglich von Dr. Gail Urlaub
und Dr. Lawrence Chasin an der Columbia University, New York isoliert und
sind in Urlaub et al., Cell (1983) 33: 45 beschrieben. Die Zellen
wurden als DG44 bezeichnet. Sie stammen von Eierstock-(CHO)K-1-Zellen
vom Chinesischen Hamster und wurden durch doppelte Deletion defizient
in Dihydrofolatreduktase (dhfr–) gemacht.
-
Die
CHO-dhfr–-Zellen
wurden kontinuierlich in dem folgenden Medium kultiviert: Hams-F-12-Medium, supplementiert
mit 10% dialysiertem fötalen
Kälberserum,
200 mg/ml Streptomycin. Medium und Serum wurden von der University
of California, San Francisco Cell Culture Facility, San Francisco,
CA erhalten. Alle anderen Bestandteile wurden von Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO geliefert. Die Zellen wurden durch Passage mit
einer 1:10-Spaltung in T-75-Flaschen zweimal pro Woche aufrechterhalten.
-
Für die Lagerung
wurden Zell-Aliquots in fötalem
Kälberserum
(FCS), 10% Dimethyl-Sulfoxid (DMSO) eingefroren und bei –80°C in der
Gasphase flüssigen
Stickstoffs gelagert. Zu diesem Zweck wurden in T-75-Flaschen Zellen
zur Konfluenz (etwa 107 Zellen pro T-75-Flasche)
gezüchtet.
Die Zellen wurden mit Trypsin versetzt, zentrifugiert und in einer
Konzentration von etwa 5 × 106 Zellen/ml in eiskaltem 10% DMSO in FCS resuspendiert.
1 ml Aliquots wurden in kryokonservierende Fläschchen überführt. Wenn Zellen benötigt wurden,
wurde ein Aliquot in einem 37°C-Wasserbad
aufgetaut, und die Zellen wurden in T-75-Flaschen zur kontinuierlichen Kultur
und Passage gesät.
-
Die
zwei Tests, die, wie vorstehend beschrieben, zum Nachweis von HIV-1-Antigenen, die mit
der Hülle
in Beziehung stehen, verwendet wurden, wurden auf die folgende Weise
durchgeführt.
Für beide
Tests wurde gereinigtes, von CHO abgeleitetes gp120 als Standard
unter Verwendung von zweifachen Verdünnungen von 200 ng/ml bis 0,195
ng/ml verwendet.
- (a) Ziege-Einfanq-ELISA: Das
Einfang-Reagens für
diesen Test war durch Protein-A-Sepharose-Affinität gereinigtes
Immunglobulin einer Ziege, die mit gereinigtem env-2-3 (SF2), welches
nachstehend beschrieben ist und das ein nicht-glycosyliertes, in Hefe hergestelltes
Polypeptid ist, das der Aminosäuresequenz von
gp120 des HIV-SF2-Virusisolats entspricht, hyperimmunisiert worden
war. Das Reagens, das zum Nachweis des eingefangenen Antigens verwendet
wurde, war ein polyclonales Antiserum, das in Kaninchen gegen dasselbe
Antigen hervorgerufen worden war. Platten wurden mit 5 mg/ml Ziegen-Immunglobulin
gegen env-2-3 (SF2) beschichtet, mit Verdünnungen von viralem Lysat oder
Säuger-abgeleiteten gp120-Antigenen inkubiert
und dann wurde das eingefangene Antigen durch das polyclonale Kaninchenantiserum
gegen env-2-3 (SF2), das 1/100 verdünnt worden war, nachgewiesen,
gefolgt von Konjugat und ABTS-Substrat.
- (b) Menschlicher Einfang-ELISA: Dieser Test ist mit dem vorstehend
beschriebenen „Ziege-Einfang-ELISA" identisch, mit der
Ausnahme, dass das Einfang-Reagens Protein-A-Sepharose-gereinigtes
Immunglobulin von menschlichen Seren, gewonnen von HIV-1-seropositiven
Blutspendern war.
-
Beispiel 2
-
Zelluläre
Produktion
-
Eine
Zelllinie, CHO-A-6a120-145-0.1-22, gewonnen wie in Beispiel 1 beschrieben,
wurde für
die Herstellung in Rollflaschen in Medien mit reduziertem Serum
und ohne Methotrexat ausgewählt.
Kulturen in Rollflaschen (850 cm2) wurden
etabliert und in Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium und
Ham-F-12, 1:1), welches mit 6% fötalem
Kälberserum
(FCS) supplementiert war, zur Konfluenz expandiert. Für die Herstellung
wurde die Supplementierung auf 1% FCS mit 0,03% HB-CHO (Hana Biologics,
Alameda, CA.) umgestellt. Konditioniertes Medium (200 ml) wurde
alle 24–48
Stunden gesammelt, bei 2–8°C gelagert,
vereinigt und durch Filtration durch Kapselfilter von 0,45 Micron
(Gelman) geklärt.
Die Zellen wurden mehr als zwei Monate in jedem von zwei Produktionsdurchgängen ohne
offensichtlichen Produktionsverlust an gp120 aufrechterhalten. Die
Expressionswerte lagen im Bereich von 5 bis 20 mg/l.
-
Beispiel 3
-
Reinigung
-
- (1) Konzentration. Die Konzentration des Zellkulturüberstands
aus Beispiel 2 (40 l) wurde unter Verwendung von Dead-end-Filtration
(0,45 Micron-Kapselfilter, Gelman) und Querstrom-Ultrafiltration
unter Verwendung eines abgeschnittenen Hohlfaser-Ultrafilters mit
einem Aufschluss von 30 K (AG Technology #UFP-30-C-6; 6 ft2 und 0,5 mm i. D. der Faser), angetrieben
durch eine positive Verdrängerpumpe
(Waukesha #18), durchgeführt.
Die Permeationsrate lag bei etwa 150 ml/min bei einer Rezirkulationsrate
von etwa 12 l/min und einem Druck von 26 Psi. Die Filtration dauerte
an, bis das Filterrückstandsvolumen
1–2 l
erreichte. Die Filtrationsschritte wurden in einem kalten Raum bei
2–8°C durchgeführt. Das
Ultrafiltrationskonzentrat war eine braune, klare Flüssigkeit.
- (2) DEAE-Chromatographie. Das Konzentrat wurde auf eine Ionenaustauschersäule (11,4
cm Durchm. × 15
cm), gepackt mit DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia), äquilibriert
in Puffer (0,02 M Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 M NaCl) bei einer Durchflussrate
von 35 ml/min bei Raumtemperatur aufgebracht. Das Ultrafiltrationskonzentrat
wurde durch Zusetzen von Natriumchlorid (4 M Stammlösung) auf
ein Volumen von 2 l und eine Leitfähigkeit von 1,4 mS eingestellt.
Die nicht-adsorbierte Fraktion, die das Produkt enthält, wurde
in Fraktionen von 250 ml unter Verwendung eines Iso-Foxy®-Fraktionensammlers
gesammelt. Serumalbumin, andere Proteine und die Masse des braun
gefärbten
Materials banden an die Säule
und wurden mit Stufengradienten von 1 M NaCl eluiert. Diese Fraktionen
enthielten eine kleine, aber variable Menge des Produkts; kein Versuch
wurde gemacht, das Produkt von der gebundenen Fraktion zu gewinnen.
Das DEAE-Sephadex-A-50-Harz wurde nach jeder Verwendung verworfen.
Es wurde durch den ELISA-Test gezeigt, dass die durchgelaufene Fraktion
die Masse des Produkts enthielt. Bei diesem Reinheitsstadium war
es schwierig, die diffuse gp120-Bande
auf einem SDS-Gel zu lokalisieren.
- (3) Hydrdphobe Phenyl-Interaktionschromatographie. Die DEAE-Fraktion
wurde in Ammoniumsulfat durch Zusetzen von festem Ammoniumsulfat
auf 40% Sättigung
gebracht. Nach gründlicher
Vermischung wurde eine geringe Menge Präzipitat durch Zentrifugation
entfernt. Eine TSK-Phenyl-5PW-HIC-Säule (5,5 cm Durchm. × 20 cm)
wurde mit mindestens zwei Volumina Wasser unter Verwendung einer
präparativen
Gilson-HPLC gewaschen. Dann wurde die Säule mit zwei oder mehr Volumina
Puffer A (0,02 M Natriumacetat, pH 5,0, 40% gesättigtes Ammoniumsulfat) äquilibriert.
Die Äquilibrierung
der Säule
wurde durch Messung der Leitfähigkeit
des ausfließenden
Materials überprüft. Die Überstandsfraktion
nach Zusetzen von Ammoniumsulfat wurde durch Pumpen durch Pumpe
A bei 30 ml/min auf die Säule
aufgebracht, dann wurde die Säule
mit Puffer A gewaschen, bis die Grundlinie sich stabilisierte (normalerweise
etwa 15–20
min). Ein Gradient von 0,02 M Natriumacetat, pH 5,0 wurde 40 min
laufen gelassen, um das Produkt zu eluieren. Fraktionen unter dem
CD-Peak wurden durch SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung eines
Pharmacia Phast®-Systems
getestet, um das Produkt zu lokalisieren. Bei diesem Stadium an
Reinheit war die gp120-Bande klar zu unterscheiden. Produkt-enthaltende
Fraktionen wurden für
das nächste
Chromatographie-Stadium vereinigt (siehe 3A).
- (d) Hydrophobe Ether-Interaktionschromatographie. Ein zweiter
HIC-Schritt wurde auf einer TSK-Ether-5PW-HPLC-Säule (5,5 cm Durchm. × 20 cm)
nach demselben Verfahren wie für
die Phenyl-HIC-Säule
durchgeführt.
Die Säule
wurde mit mindestens zwei Säulenvolumina
Wasser gewaschen, dann in Puffer A äquilibriert (zu 40% gesättigtes
Ammoniumsulfat, 0,02 M Natriumacetat, pH 5,0). Der Produkt-Pool
von der Phenyl-Säule
wurde durch Zusetzen von Ammoniumsulfat auf eine Leitfähigkeit
von 165 S/cm eingestellt, gefolgt von 10 minütiger Zentrifugation bei 12.000
UpM. Die Probe wurde aufgetragen und unter Verwendung eines 40 min-Gradienten von 100%
Puffer A auf 100% Puffer B, wie vorstehend beschrieben, eluiert.
Produkt-enthaltende Fraktionen (siehe 3B)
wurden durch SDS-Gelelektrophorese auf
einem Phast®-System
lokalisiert, dann für
die Gelfiltrationschromatographie vereinigt. Der gp120-Peak der
Ether-Säule
war hauptsächlich
gp120 mit kleineren Mengen an Verunreinigungen von niedrigerem Molekulargewicht.
Diese Verunreinigungen wurden durch Gelfiltrationschromatographie
(nachstehend) aufgelöst.
- (5) Gelfiltrationschromatographie. Die HIC-Etherfraktion wurde
auf einer Ultrafiltrationsmembran (Amico YM-30) auf eine Proteinkonzentration
von etwa 10 mg/ml, wie bei A-280 gemessen, unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten
von 0,6 = 1 mg/ml konzentriert, dann gegen mindestens fünf Volumina
0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9 dialfiltriert. Die Probe wurde auf
eine Gelfiltrationssäule
(Superdex®200,
Pharmacia, 1,6 cm Durchm. × 60
cm) bei einer Gesamtproteinkonzentration von nicht mehr als 10 mg/ml
in einem Volumen von nicht mehr als 4% des Säulenvolumens aufgebracht und
mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,9 eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden
gesammelt, einer SDS-Gelelektrophorese mit Coomassie Brilliantblau R350-Färbung auf
einem Phast-System unterzogen, und dann, um Filtrations-HPLC auf
einer DuPont GF-450-Säule
(Laufpuffer: 0,2 M Natriumphosphat, pH 6,7, 1 ml/min) zu erhalten,
um Dimer-enthaltende Fraktionen zu lokalisieren, vereinigt. Die
führende
Kante des gp120-Peaks enthielt reines gp120, wohingegen die Hinterkante
erneut auf der Gelfiltrationssäule
chromatographiert wurde. Der Produkt-Pool wurde auf einer Amicon
YM-30-Membran konzentriert,
gegen 5 Volumina destilliertes Wasser diafiltriert und mindestens
zwei Tage bei einem Druck von weniger als 10 Micron lyophilisiert.
- (6) Zusammenfassung der Reinigungsergebnisse. Tabelle 1 fasst
die Ergebnisse einer typischen Reinigung, die mit 40 Litern Zellkulturüberstand
beginnt, zusammen. Diese Daten zeigen, dass eine 250-fache Reinigung
mit einem Ertrag von 20–25%
erreicht wird. Das Produkt erschien als eine breite Bande, die bei H120
kD in einem SDS-Gel wanderte. Die Dichtemessung ergab, dass 80–90% der
Färbeintensität unterhalb
der gp120-Bande lag. Dies repräsentiert
wahrscheinlich eine Minimalschätzung
der Reinheit dieser Herstellung, da gp120 schlecht Färbemittel
bindet. Ungefähr
7-mal weniger Coomassie Brilliantblau wurde, verglichen mit BSA,
pro Microgramm Protein gebunden. Die Erscheinung der Gelbande wurde
durch vorherige Behandlung der Probe mit 2-Mercaptoethanol oder
Dithiothreit nicht verändert,
was zeigt, dass das Protein intern nicht gespalten ist. Umkehrphasen-HPLC-Analyse
bei erhöhter
Temperatur ließ den
Schluss zu, dass die Reinheit des Produkts 90% überstieg.
-
Tabelle 1
| SF2-rgp120-Reinigungstabelle |
| Schritt | Volumen | Protein | rgp120 | Reinheit |
| 1.
Kulturüberstand | 40,0
l | 55.
g | 210.
mg | 0,4% |
| 2.
UF-Konzentrat | 3,76 | 44,9 | 180 | 0,4 |
| 3.
DEAE | 4,75 | 8,55 | 140 | 1,6 |
| 4.
Phenyl-HIC | 0,724 | 0,996 | 150 | 15 |
| 5.
Ether-HIC | 0.260 | 0,354 | 110 | 31 |
| 6.
Gelfiltration | 0,020 | 0,053 | 48 | 90 |
-
Beispiel 4
-
- (1) Vergleich von gereinigtem SF-2-rgp120 mit
viralem gp120. Gereinigtes gp120 wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
unterzogen, um Größe und Reinheit
festzustellen. Das Protein wanderte an der vorausgesagten Stelle
für ein
120 K-Protein mit einer breit gefärbten Bande, die charakteristisch
ist für
Glycoproteine. Diese breite Bande ist mit der erwarteten Kohlenhydratheterogenität an den
22 vorhergesagten N-verbundenen Glycosylierungsstellen, wie sie
für andere
Isolate beschrieben worden war, konsistent. Um das rekombinante
gp120 mit dem in Viruspartikeln gefundenen zu vergleichen, wurden
Lysate von HIV-SF2-infizierten HUT-78-Zellen hergestellt und in
einem Western-Blot mit HIV-positiven menschlichen und gp120-spezifischen
Tierseren untersucht. Die beobachteten Muster waren mit der konservierten
Konformation konsistent.
- (2) N-terminale Sequenzierung. Die aminoterminale Aminosäuresequenz
wurde durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Die beobachteten
und erwarteten Sequenzen waren:
beobachtet E K L W V T V Y
Y G V P V W K ...
erwartet T E K L W V T V Y Y G V P V W K
...
Diese Sequenz bestätigt,
dass das heterologe Signal durch die Signalpeptidase nach dem Serin
des Signals korrekt prozessiert wurde und dass das Protein nicht
mit irgendwelchen zusätzlichen
Aminosäuren
fusioniert ist. Dieser Sequenz fehlt das N-terminale Threonin, das auf viralem
gp120 vom HTLVIIIB-Isolat (Robey et al., PNAS (1986) 83: 7023–7027) gefunden
wurde. Die N-terminale Aminosäuresequenz
stimmt mit der HIV-SF1-Hüllsequenz überein,
die von der DNA-Sequenz dieses Isolats für mindestens die ersten 15 Aminosäuren vorhergesagt
war.
- (3) Aminosäurenzusammensetzung.
Aminosäureanalysen
wurden an fünf
Chargen von gp120, die wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt waren,
durchgeführt.
Der Durchschnitt dieser Werte stimmte mit der auf Grund der DNA-Sequenz
erwarteten Zusammensetzung innerhalb des experimentellen Fehlers
für alle Aminosäuren, mit
Ausnahme von Ile (33,5 beobachtet gegen 39 erwartet) und Ser (32,7
beobachtet gegen 24 erwartet) überein.
Der Wert für
Ser war innerhalb der fünf
Chargen variabel und repräsentiert
wahrscheinlich eine serinreiche Verunreinigung.
- (4) Native Gelelektrophorese und IEF. Die Heterogenität der Ladung
von gp120 war bei isoelektrischen Fokussierungsversuchen und bei
der nativen Gelelektrophorese offensichtlich. Isoelektrische Fokussierung zeigte
die Gegenwart von multiplen Banden innerhalb der Hülle bei
pH 5 bis 7 an. Das Protein wanderte als einzelne breite Bande in
einem nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gel.
- (5) Gelfiltrations-HPLC. Das Molekulargewicht von rekombinantem
gp120 war in Gegenwart von SDS 120 K; das Molekulargewicht in Abwesenheit
von SDS wurde durch Gelfiltrations-HPLC gemessen. Bei neutralem
pH-Wert in Puffern mit mittlerer Ionenstärke eluierte gereinigtes gp120
als einzelner Haupt-Peak mit einem Retentionsvolumen, das einem
Molekulargewicht von H130 K entsprach. Eine kleine Menge an Dimer
war ebenfalls vorhanden; die Dimer-Fraktion erhöhte sich auf 10–20 des
gesamten gp120 bei Lagerung in Lösung.
Die Dimer-Fraktion wurde am Gelfiltrations-Schritt isoliert und
getrennt analysiert. Diese Fraktion wanderte bei Analyse durch SDS-Gelelektrophorese
in Gegenwart eines Reduktionsmittels als Monomer, jedoch in Abwesenheit
von Reduktionsmitteln (2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit) als
Dimer; demnach war es wahrscheinlich durch Disulfidbrücken verbunden.
Die Aminosäurezusammensetzung
der Dimerfraktion war nicht zu unterscheiden von der der Monomerfraktion.
Die Dimerfraktion band auch beim Radio-immunpräzipitationstest CD4. Der Gelfiltrations-HPLC-Peak
von gp120 war breiter, als man bei einem Protein mit diesem Molekulargewicht
erwarten würde.
Die Breite des für
gp120 erhaltenen Extra-Peaks kann der Heterogenität der Kohlenhydrateinheit
zugeschrieben werden. Das im Hinblick auf die vorhandenen Verunreinigungen
hohe Molekulargewicht von gp120 machte es möglich, Gelfiltrations-HPLC als
Reinigungstest nach dem Phenyl-HIC-Schritt zu verwenden. Er wurde
routinemäßig als
Test beim Gelfiltrationsschritt verwendet, um die Fraktionen, die
gp120-Dimere enthielten, aus dem Produkt-Pool zu eliminieren.
- (6) CD4-Bindung. Das CD4, das in diesem Beispiel verwendet wurde,
war rekombinantes, lösliches
CD4, das von einer CHO-Zelllinie abstammte, welche mit einem Expressionsplasmid
transfiziert war, das die gesamte externe Domäne codierte. Details über die
CD4-Herstellung zur Verwendung als Bindungsstandard sind in Beispiel
5 gezeigt. Bindungsversuche wurden durch Radio-Immunpräzipitation durch Gelfiltrations-HPLC
durchgeführt.
- (a) Allgemeine Verfahren von Radio-Immunpräzipitationen. Konfluente einzellige
Schichten von Zellen, die (zum Beispiel) gp120 herstellen, wurden
in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium ohne Cystein und Methionin
(cys-met-DME) markiert. Fünf
ml cys-met-DME mit je 100 mCi/ml 35S-Met
und Cys wurden jeweils einer T75-Flasche 6–8 Stunden lang zugesetzt.
Die markierten Proben wurden geerntet, zentrifugiert, um die Zellen
zu entfernen, und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Die zu präzipitierenden
Proben wurden auf 1 × Lysepuffer
[0,1 M NaCl, 0,02 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Desoxycholat,
0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF), 17 mg/ml Aprotinin] eingestellt. Die Proben wurden mit einem
Zehntel Volumen normales Ziegenserum 30 Minuten lang bei 4°C vorgeklärt, gefolgt
von 30 Minuten Präzipitation
mit Protein A-Sepharose (PAS) (1/2 Volumen 20% Suspension) bei 4°C. Immunglobulin
von hyperimmunisierten Tieren oder HIV-positive menschliche Serumproben
wurden unter Verwendung von PAS durch Standardverfahren affinitätsgereinigt.
Die Seren wurden auf das beste Verhältnis von Signal zu Geräusch titriert;
die meisten Immunglobulinfraktionen wurden bei 5–10 mg pro Probe verwendet.
Immun-Präzipitationen
wurden 1–12
Stunden bei 4°C
in Abhängigkeit
vom Volumen der Probe durchgeführt,
gefolgt von 1 Stunde mit PAS. Alle Proben innerhalb eines Versuchs
wurden auf dasselbe Volumen angeglichen. Das PAS wurde mit Lysepuffer
ohne BSA gewaschen, gefolgt von 0,12 M Tris pH 7, und die Pellets
wurden in 1 Laemmli-Probenpuffer solubilisiert, gekocht und auf
Gele aufgetragen. Die Gele wurden mit En3Hance®,
behandelt, getrocknet und fluorographiert.
- (b) CD4-Bindung durch Radio-Immunpräzipitation. CD4 wurde mit 35S, wie vorstehend beschrieben, markiert,
und die CD4-Konzentration wurde unter Verwendung eines Einfang-ELISAs
unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers und von polyclonalem
Kaninchenserum, das gegen CD4 hervorgerufen worden war, bestimmt.
Für Copräzipitationsversuche
wurde CD4 in steigenden Mengen einer festgesetzten Menge an gp120
(1 mg) zugesetzt, um die Sättigungsmenge
festzustellen, und dann mit anti-gp120-Antiseren copräzipitiert.
Diese Menge an CD4 wurde für
gp120-Titrationsversuche verwendet. Markiertes CD4 wurde mit normalem
Serum vorgeklärt,
wie vorstehend beschrieben. Nach Vorklärung der markierten Komponente
wurden CD4 und gp120 eine Stunde bei 4°C komplexiert, dann wurde eine
Stunde bei 4°C
Antikörper gegen
die unmarkierte Komponente zugesetzt (10 mg pro Probe). OKT4 wurde
von Ortho Diagnostics erworben. PAS wurde eine Stunde bei 4°C zugesetzt,
und die Komplexe wurden gewaschen und, wie vorstehend beschrieben,
für die
Elektrophorese vorbereitet.
Gp120 war vor und nach Reinigung
bei der Bindung an CD4 in diesem Versuch effektiv, wie durch gleiche Bandenintensitäten für gleiche
Mengen an zugesetztem gp120 gezeigt. Ein nicht-glycosyliertes Analogon für in Hefe
hergestelltes gp120 (env 2–3,
siehe U.S.-Patentanmeldung Nr 138.894, eingereicht am 24. Dezember
1987) war in diesem Versuch nicht in der Lage, an CD4 zu binden.
Die dimere Form von gp120, isoliert von der Superdex®200-Säule, band
in diesem Versuch ebenfalls CD4. Die Bindungssättigung wurde graphisch bestimmt.
Von den Mengen bei halber Sättigung
wurde ein Kd-Wert von 6,9 nM gemessen.
- (c) CD4-Bindung durch Gelfiltrations-HPLC. Gereinigtes gp120
und unmarkiertes CD4 wurden in einem Volumen von 60 ml vermischt,
wobei 0,3 M Kaliumphosphat, pH 6,8, enthalten waren. Nach Vermischen
wurde ein Anteil der Probe (45 ml) auf eine DuPont GF-450-Gelfiltrations-HPLC-Säule mit
einem Waters WISP 712-Probeninjektor injiziert und in 0,4 M Kaliumphosphat,
pH-Wert 6,8, bei 1 ml/min laufen gelassen. Die optische Dichte wurde
bei 215 nm überwacht,
und die Daten wurden unter Verwendung von Waters Maxima 820®Chromatographie-Software aufgenommen.
-
Wurden
CD4 und gp120 getrennt auf eine Gelfiltrations-HPLC-Säule aufgetragen,
zeigte jede Komponente an der erwarteten Elutionszeit einen einzelnen
Peak (siehe 4; Spur A ist nur CD4, Spur
B ist nur gp120). Wurden die Komponenten vor der Chromatographie
miteinander vermischt, erschien ein neuer Peak bei einer Elutionszeit,
die 160 K entsprach, und die Peaks bei 120 K und 40 K verkleinerten
sich (4; Spur C). Dieses Ergebnis liefert den direkten
physikalischen Nachweis der Bildung eines 1:1 Komplexes zwischen CD4
und gp120. Zusätzliche
Versuche wurden mit variierenden Verhältnissen von CD4 und gp120
und bei verschiedenen Konzentrationen der Reaktionspartner durchgeführt. Die
Ergebnisse dieser Versuche unterstützten die Existenz eines Hochaffinitätskomplexes
zwischen einem Molekül
CD4 und einem Molekül
gp120.
-
Beispiel 5
-
CHO-Zellen
wurden zusammen mit AD-dhfr und einem Expressionsplasmid, das lösliches
rekombinantes menschliches CD4 (vollständige externe Domäne) codiert,
transfiziert. Der Expressionsvektor wurde durch Clonieren einer
CD4-codierenden
Sequenz, einer Gabe von Dr. D. Littman von UCSF, in den Vektor pCMV6a
(pCMV6a120-SF2 minus der codierenden gp120-Sequenz), konstruiert.
Eine Zelllinie, die lösliches CD4
sekretiert, wurde isoliert. Die resultierende Zelllinie, identifiziert
als CHO ST4.2 ist, wie vorstehend beschrieben, öffentlich erhältlich.
Das clonierte Gen ST 4.2 codiert 380 Aminosäuren, die den vier extrazellulären Domänen bis
zur Transmembrangrenze entsprechen. Das Reinigungsverfahren für dieses
Protein beteiligt zwei Säulen.
Zuerst wurde der CHO-Zellüberstand
auf eine S. Sepharose-Kationenaustauschersäule geladen und von ihr eluiert.
Ein Liter CHO-Überstand
wurde mit doppelt destilliertem Wasser auf 15 l verdünnt und
auf 300 ml aufgequollenes Harz, das in 0,2 × PBS/2,5 mM EDTA, pH 7,0 (Leitfähigkeit
3,6 ohm–1cm–1) äquilibriert worden
war, bei einer Beschickungsrate von 3,6 l/Std. bei Raumtemperatur
geladen. Die Säule
wurde mit 500 ml 0,2 × PBS/2,5
mM EDTA und 200 ml 50 mM NaCl, 0,2 × PBS, 12,5 mM EDTA gespült. Die
Elution erfolgte mit 1 l 200 mM NaCl, 10,2 × PBS, 12,5 mM EDTA. Das Eluat
von dieser S. Sepharose-Säule ließ man dann über eine
Affinitätssäule mit
monoclonalen Antikörpern
laufen. Der monoclonale Antikörper
(25-10-F5.5C1, im Folgenden als 25-10-F5 bezeichnet), der für diese
Reinigung verwendet wurde, erkennt in der Amino-terminalen Hälfte (innerhalb
der ersten zwei immunglobulin-ähnlichen
Domänen)
der extrazellulären
Region von CD4 ein Konformations-Epitop. Andere Antikörper mit
Spezifität
für irgendein
Epitop innerhalb derselben Domänen sollten
ebenso effektiv sein. Das S. Sepharose-Elutionsmittel wurde gefiltert
(0,45 Micron) und mit 1 ml/min oder weniger auf die Affinitätssäule geladen.
Die beladene Säule
wurde mit destilliertem Wasser gespült (25 × Harzvolumen) und mit 5 mM
Triethylaminformiat, 10 ml Elutionspuffer pro 4 ml Gelharz eluiert.
Der pH-Wert des mAb-Elutionsmittels wurde mit 1 M Tris (pH 8,0)
auf pH 7 angeglichen. Die von der Affinitätssäule eluierten Fraktionen wurden
dialysiert und konzentriert. Tabelle 1 zeigt den Ertrag jedes Schritts
des Reinigungsverfahrens.
-
-
Die
Werte von aktivem CD4 in den verschiedenen Fraktionen wurden unter
Verwendung eines Einfang-ELISAs, wobei der monoclonale Antikörper 25-10-F5
als Einfang-Reagens verwendet wurde und von einem polyclonalen Kaninchenantiserum,
das gegen gereinigtes ST4.2 hervorgerufen worden war, als Nachweisreagens
bestimmt. Fraktionen und Durchfluss jeder Säule wurden mit dem anfänglichen Überstand
und einem bekannten CD4-Standard verglichen. Dies ermöglichte
die Quantifizierung, wie viel aktives CD4 bei jedem Schritt gewonnen
wurde. Es versetzte einen ebenfalls in die Lage, die Zunahme an
Reinheit nach jedem Reinigungsschritt zu schätzen. Dies wurde durch Vergleichen
der Gesamtmenge (Milligramm) an aktivem CD4, wie durch den ELISA
bestimmt, mit den gesamten Milligramms an Protein, wie durch einen
Pierce-Protein-Mikrotest bestimmt, durchgeführt. Bei Verwendung dieser
Verfahren zeigte es sich, dass der Ertrag bei der S. Sepharose-Säule 76%
und bei der Affinitätssäule 74%
betrug, was einen Gesamtertrag von 56% ergibt. Es ist zu bemerken,
dass die S. Sepharose-Säule allein
eine 31-fache Reinigung ergab und eine Lösung erzielte, die nach nur
dem ersten Schritt aus 93% CD4 bestand. Die Affinitätssäule steigerte
die Reinheit des S. Sepharose-Eluats im Wesentlichen bis zur Homogenität.
-
Die
Reinheit dieser Endfraktionen wurde auf zwei Wege analysiert. Zuerst
ließ man
das Protein auf einem 12% SDS-Gel laufen und färbte es mit Coomassie-Brilliantblau. Diese
visuelle Analyse indizierte, dass das Protein in hohem Maße gereinigt
war; mindestens 95% des Endprodukts waren CD4. Eine Aminosäureanalyse
wurde an ST4.2-Proben durchgeführt,
die gemäß diesem
Protokoll gereinigt waren, und indizierte ebenfalls, dass das Material
in hohem Maße
gereinigt war.
-
Die
gp120-Bindungsfähigkeit
von gereinigtem ST4.2 wurde sowohl durch ELISA als auch unter Verwendung
einer gp120-Säule
analysiert. ST4.2 konnte auf Mikrotiterplatten beschichtet werden
und behielt die gp120-Bindungsaktivität bei. Um die gp120-Bindung
der verschiedenen Chargen von CD4 zu testen, wurden Mikrotiterplatten
mit verschiedenen Konzentrationen an CD4 von jeder Charge inkubiert,
und dann wurde jeder Vertiefung eine einzige gp120-Konzentration
zugesetzt. Gebundenes gp120 wurde mit einem polyclonalen Kaninchenantiserum
gegen gp120 (Rb-anti-env2-3-Serum) nachgewiesen. Ein starkes Signal
wurde gesehen, wobei einer Austitrierung erfolgte, als die Menge
an auf die Platte beschichtetem ST4.2 zurückging. Die Bindung von gp120
wurde auch für
zwei der Chargen dadurch festgestellt, dass man das gereinigte ST4.2 über eine
Affinitätssäule mit
gp120 laufen ließ.
Eine Anfangslösung
von 10 mg/ml ST4.2 wurde auf die Säule geladen. Der CD4-Gehalt
jeder Fraktion wurde durch Immunblot-Analyse der verschiedenen Fraktionen
unter Verwendung des polyclonalen Kaninchenantiserums gegen ST4.2,
wie vorstehend diskutiert, bestimmt. Diese Ergebnisse zeigten, dass
nahezu 100% des immunreaktiven CD4-Materials an das gp120 auf der
Säulenmatrix absorbiert
wurde und als spezifischer Peak eluierte.
-
Natives
und denaturiertes ST4.2 wurden auf Mikrotiterplatten beschichtet,
und die Fähigkeit
verschiedener, CD4 spezifischer, immunologischer Reagenzien zur
Erkennung der zwei Formen des Proteins wurde verglichen. Ein polyclonales
Kaninchen-Serum, hergestellt durch Immunisierung mit gereinigtem
ST4.2, erkannte sowohl native als auch denaturierte Formen von CD4;
OKT4A, von dem bekannt ist, dass es ein Konformations-Epitop erkennt,
reagierte deutlich mit nativem CD4, reagierte jedoch nicht mit dem
Protein, das denaturiert worden war. Der monoclonale Antikörper 25-10-F5
zeigte ein Reaktionsmuster, welches dem von OKT4A ähnlich war.
-
Herstellungen
von gereinigtem ST4.2 wurden bei –80°C und 4°C gelagert und periodisch auf
(1) Immunreaktivität
mit dem polyclonalen Kaninchen-Antiserum, das sowohl natives als
auch denaturiertes CD4 erkennt, (2) Erkennung durch OKT4A und 25-10-F5,
welche nur mit nativem CD4 reagieren, sowie (3) gp120-Bindung getestet.
Ein signifikanter Aktivitätsverlust,
der durch die monoclonalen Antikörper
OKT4A und 25-10-F5 sowie die gp120-Bindung festgestellt wurde, wurde
bei Lagerung bei 4°C
beobachtet. Das Material, das bei –80°C gelagert wurde, behielt jedoch
seine volle Aktivität.
Zusätzlich
wurde auch bemerkt, dass gereinigtes ST4.2 bei wiederholtem Einfrieren
und Auftauen an Aktivität
verliert.
-
Beispiel 6
-
Ein
Immunisierungsversuch wurde durchgeführt, um die Herstellung neutralisierender
Antikörper
unter Verwendung von gp120, das, wie oben beschrieben, hergestellt
ist und die Konformation bewahrt hat, mit anderen gp120-Molekülen zu vergleichen,
von welchen bekannt ist, dass ihre Konformation modifiziert wurde. Ein
gp120-Analogon (env 2–3),
hergestellt in Hefe, welches denaturiert und nicht-glycosyliert
ist, wurde als Vergleichsantigen verwendet. Beide gp120-Substanzen
wurden von derselben Genquelle, dem HIV-1 SF-2-Isolat, abgleitet.
Die Antikörperherstellung
wurde bei Pavianen unter Verwendung des in Tabelle 2 gezeigten Immunisierungsschemas
gemessen.
-
-
Immunogene
wurden auf die folgende Weise hergestellt:
- (1)
Gruppe 1 und 2: Setze einem Teil Antigen (gp120 oder env 2–3) zwei
Teile unvollständiges
Freundsches Adjuvans (ICFA) zu, mische mit einer Spritze und injiziere
500 ml pro Tier.
- (2) Gruppe 3 und 4: Erwärme
ein Fläschchen
mit Antigen/MTP-PE-Adjuvans
auf Raumtemperatur, verwirble es eine Minute lang und injiziere
500 ml pro Tier innerhalb von 30 Minuten (mische erneut bei Bedarf).
- (3) Gruppe 5 und 6: Erwärme
ein Fläschchen
mit Antigen/Alaun auf Raumtemperatur, verwirble es eine Minute lang
und injiziere 500 ml pro Tier innerhalb von 30 Minuten (mische erneut
bei Bedarf).
-
Die
Immunisierung erfolgte zu Anfang des Versuchs und in der 4., 8.,
12. und 20. Woche nach Versuchsbeginn. Blutproben wurden am Versuchsbeginn
(Prä-Blutprobe) genommen
sowie zu den Zeiten, die in den Tabellen (nachstehend) beschrieben
sind, welche die Ergebnisse darstellen.
-
Die
Ergebnisse sind in den beigefügten
Tabellen 3 und 4 zusammengefasst. Die mit env 2–3 immunisierten Tiere zeigen
neutralisierende Aktivität
gegen das homologe Isolat HIV-SF-2 in allen Adjuvans-erhaltenden
Gruppen und in einer Adjuvans-erhaltenden Gruppe (IFA-MTP) Neutralisation
gegen HIV-MN (3 von 7 Tieren insgesamt). Es gibt ein Tier, das nachweisbare
Neutralisation gegen HIV-HTLV-IIIB
mit diesem Antigen zeigt.
-
Dagegen
zeigen alle der mit gp120 immunisierten Tiere in allen drei Adjuvans-erhaltenden Gruppen gegen
HIV-SF2 und HIV-MN neutralisierende Aktivität, sowohl nach vier als auch
nach fünf
Immunisierungen. Sechs von acht mit gp120 immunisierten Tieren haben
auch signifikante neutralisierende Aktivität gegen HIV-HTLBIIIB, und die Tiere sind aus allen
drei Adjuvans-erhaltenden Gruppen.
-
-
-
Junge
adulte (männliche/weibliche)
Paviane (Papio) wurden mit 55 mg gp120, das in einem von zwei Adjuvantien
formuliert war, immunisiert: Aluminiumhydroxid (Alaun, 0,8 mg pro
Dosis); oder unvollständiges Freundsches
Adjuvans plus 250 mg Muramyltripeptid (IFA-MTP). Die Tiere wurden
etwa alle vier Wochen immunisiert, und die Seren wurden auf den
Verlust von hüll-spezifischem
Titer überwacht.
Die Zusammenfassung der Daten für
die antigenspezifische Antwort ist in den Tabellen 5 und 6 für jedes
Tier in der Studie gezeigt. Hüll-spezifische
Titer zeigten nach jeder Auffrischung einen Peak und gingen dann
zurück.
Es ist zu bemerken, dass die Alaun- und IFA-MTP-Titer etwa um das
zehnfache voneinander abweichen. Basis-Titer wurden nach sechs Monaten Pause
erreicht, und die Tiere erhielten dann in monatlichen Abständen erneut
eine Auffrischung. Um die Effektivität der Hüll-Antikörper bei der Virusneutralisation
zu messen, wurden die Seren in Neutralisationstests in vitro sowohl
gegen homologes HIV-SF2 als auch gegen heterologe Virusisolate getestet.
Die Seren wurden zu Zeitpunkten mit bekannten hohen Hüll-Titern
auf Virusneutralisation in der Woche 10 (nach 3 Immunisierungen),
23 (nach 5 Immunisierungen) vor der Pause und in der Woche 57 (nach
6 Immunisierungen) nach der Auffrischung, die der Pause folgte,
getestet. Zwei Virusneutralisationstests wurden verwendet, ein p24gag-Inhibierungstest,
beschrieben in Haigwood et al., AIDS Res. Hum. Retrov. (1990) 6; 855–869 und
Steimer et al., Vaccine (1988), H. Gimsberg et al., Herausgeber,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 347–355, und ein Infektionszentrum-Inhibierungstest
von Nara et al., AIDS Res. Hum. Retrov. (1987) 3283–302. Wie
in Tabelle 5 veranschaulicht, wurden neutralisierende Antikörper, die
gegen HIV-SF2 und HIV-MN effektiv sind, in beiden Adjuvans-erhaltenden
Gruppen nach nur drei Immunisierungen erzeugt, und die Titer wurden
mit weiteren Auffrischungen aufrechterhalten oder vermehrt. In Tabelle
6 wurden HIV-BRU- und HIV-HTLVIIIB-spezifische neutralisierende
Antikörper
nach fünf
und sechs Immunisierungen reproduzierbar beobachtet; nach sechs
Immunisierungen wurden keine Titer gegen HIV-ZR6 beobachtet. Insgesamt
waren sowohl die homologen SF2- als auch die heterologen neutralisierenden
Titer in den Tieren mit IFA-MTP höher als in der Tieren mit Alaun.
-
-
-
Serum,
das von dem nach sechs Immunisierungen am stärksten antwortenden, mit gp120
immunisierten Pavian gewonnen wurde, wurde weiter auf die Fähigkeit
getestet, die zusätzlichen
Virus-Isolate HIV-SF2, HIV-MN, HIV-RF, HIV-CC, HIV-ZR6 und HIV-NDK (Tabelle 7a)
zu neutralisieren. Es ist zu bemerken, dass die HIV-SF2-Neutralisationstiter
durch den p24gag-Inhibierungstest bestimmt wurden, wohingegen die HIV-MN-Neutralisation
durch das Infektions-Zentrum-Protokoll
von Nara et al. getestet wurde. Deshalb kann der beträchtliche
Unterschied in der Neutralisation dieser beiden Isolate teilweise
den zwei verschiedenen Tests, die verwendet wurden, zugeschrieben
werden.
-
Diese
Daten zeigen, dass das gp120-Protein, das eine stoffliche Konformation
beibehält
und das wie oben beschrieben hergestellt ist, bei der Herstellung
von kreuzneutralisierenden Antikörpern
erfolgreicher ist als Formen, die ihre natürliche Konformation nicht beibehalten.
-
Beispiel 7
-
Wiederholte
Immunisierung der IFA-MTP-Gruppe von Pavianen wurde durchgeführt, um
zu bestimmen, ob zusätzliches
wiederholtes Aussetzen von rekombinantem, nativem, glycosyliertem
gp120 Antikörper ergeben
könnte,
die bei der Neutralisation eines noch breiteren Kreises von Isolaten
effektiv sein könnten.
Wiederholte Immunisierung veränderte
die Titer neutralisierender Antikörper gegen HIV-SF2, HIV-MN,
HIV-RF oder HIV-CC nicht drastisch. Wiederholte Immunisierung resultierte
jedoch im Auftreten von niedrigen Titern von neutralisierenden Antikörpern gegen
Afrikanische Isolate, HIV-ZR6 und HIV-NDK (Tabelle 7b). Die temporäre Entwicklung
der HIV-ZR6-Neutralisation wurde durch Auftragen der Daten der Virusneutralisation
(5) von Serum vom Pavian 2964, das nach 0, 5, 6,
7, 8, und 9 Immunisierungen mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem
gp120 analysiert worden war, untersucht.
-
Die
Neutralisation wurde durch Bestimmen der Anzahl an Syncytienerzeugenden
Einheiten pro ml (sfu/ml) in Vertiefungen, die Versuchsseren enthielten
(Vn, Durchschnitt an doppelten Vertiefungen), und Dividieren dieser
Zahl durch den sfu/ml-Virus allein (Vo, Durchschnitt von 8 Replica-Vertiefungen)
bewertet. Diese Fraktion, Vn/Vo, wurde gegen die Verdünnung der
Serumprobe aufgetragen, und die Neutralisation wurde durch Notieren
der Serumverdünnung,
die eine 90% Reduktion an Vn erlaubte, bewertet, d. h. Vn/Vo = 0,1. Die
Proben werden durch den Schlüssel
auf der rechten Seite angezeigt, wobei die Nummern Blutproben entsprechen.
Blutprobe 0 ist die Prä-Blutprobe,
die keine Virusneutralisation zeigt. Blutprobe 12 folgt auf 5 Immunisierungen;
Blutprobe 22 folgt auf 6 Immunisierungen; Blutprobe 24 folgt auf
7 Immunisierungen; Blutprobe 27 folgt auf 8 Immunisierungen; Blutprobe
22 folgt auf 9 Immunisierungen.
-
Wie
aus 5 hervorgeht, verschoben wiederholte Auffrischungen
den Verlauf der Neutralisationskurve, so dass die Neutralisation
in Blutprobe 32 nach 9 Immunisierungen nachgewiesen wurde. Diese
Ergebnisse zeigten, dass wiederholte Auffrischungen auf Antikörper produzierende
Clone selektierte, die eine breitere Spezifität haben.
-
-
Beispiel 8
-
Die
Analyse aller Serumproben von zwei einzelnen Pavianen, 2964 und
2958, skizzierte weitere Unterschiede bei Tieren, die mit rekombinantem,
denaturiertem, nicht-glycosyliertem Protein und mit rekombinantem,
nativem, glycosyliertem (rpg120) immunisiert wurden (6).
Pavian 2964 wurde mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem Protein
geimpft, und Pavian 2958 wurde mit rekombinantem, denaturiertem,
nicht-glycosyliertem Protein geimpft. Die HIV-SF2-Neutralisation
wurde durch den p25gag-Inhibierungstest, beschrieben in Haigwood
et al., AIDS. Res. And Hum. Retrov. (1990) 6: 855–869 getestet.
Alle anderen Isolate wurden durch den Infektions-Zentrum-Inhibierungstest
getestet. Serum von jeder Blutprobe wurde gegen HIV-SF2, HIV-MN
und HIV-HTLVIIIB auf Virusneutralisationsaktivität getestet. Weitere Auffrischungen
mit denaturiertem, nicht-glycosyliertem Protein ließ die Antikörper- oder
Neutralisationstiter nicht über
die Werte, die in der 10. Woche gemessen wurden, ansteigen, und
es gab keine nachweisbare Neutralisation von HIV-HTLVIIIB. Bei dem
Tier, das mit rgp120 immunisiert war, stiegen die HIV-SF2, HIV-MN
und HIV-HTLVIIIB-Titer nach jeder Auffrischung an, wobei die stärkste Zunahme
nach der Pause beobachtet wurde. Die Muster der Neutralisationsaktivität waren
für alle
drei Viren ähnlich,
obwohl die Stärke
der Antwort unterschiedlich war. Das Auftreten der HIV-HTLVIIIB-Neutralisation
war im Vergleich mit den anderen beiden Isolaten verspätet. In
zusätzlichen Versuchen
an Pavianen, die nachstehend im Beispiel 9 diskutiert werden, haben
wir gezeigt, dass rekombinantes, denaturiertes, nicht-glycosyliertes
Protein, formuliert in MF59, nicht in der Lage war, eine Neutralisation von
HIV-MN oder HIV-BRU-neutralisierender Aktivität zu induzieren (Daten nicht
gezeigt); gp120-Seren neutralisierten diese drei Isolate genauso
gut wie HIV-ZR6 nach wiederholten Auffrischungen (Tabelle 8).
-
6 ist
eine Reihe von Graphiken, die Neutralisationstiter aller Serumproben
von Pavian 2958, immunisiert mit denaturiertem, nicht-glycosyliertem
gp120 und Pavian 2964, immunisiert mit nativem, glycosyliertem gp120,
zeigen. Die Immunisierung dieser Tiere ist in Beispiel 6 beschrieben.
-
Beispiel 9
-
Die
Paviane wurden mit 55 mg gp120 immunisiert, das entweder mit mikrofluidisierter
Emulsion, die Muramyltripeptid-Phosphatidyl-Ethanolamin, 100 mg
(MF59), enthielt, oder unvollständigem
Freundschem Adjuvans (IFA) formuliert war. Die Formulierung von
MF59 war 5% Squalen, 0,5% Tween-80, 0,5% Span-85 mit endogenem MTP-PE
zu 0,4 mg/ml in Wasser, die mit einem Mikrofluidizer emulgiert war
und unter Argon bis zur Verwendung gelagert wurde. Dann wurde es
mit Antigen unter Schütteln
vermischt und injiziert. Daten, die die antigenspezifischen Antworten
für die
Paviane zusammenfassen, sind in Tabelle 8 gezeigt.
-
Gp120-spezifische
Titer zeigten nach jeder Auffrischung in dieser Untersuchung ebenfalls
einen Peak und gingen dann zurück.
Höhere
Titer wurden mit MF59 und nicht mit IFA erreicht. Virusneutralisation
wurde gegen homologe und heterologe Isolate getestet und wurde in
den Wochen 10, 24 und 38 nach drei, vier beziehungsweise 5 Immunisierungen
bestimmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 8 zusammengefasst. In
dieser Studie hatten Tiere in der MF59-Gruppe höhere Titer und einen höheren Anteil
an positiven Tieren in der Gruppe als die IFA-Gruppe. Neutralisierende Titer, die
gegen HIV-SF2 und HIV-MN effektiv waren, wurden nach drei Immunisierungen
und gegen HIV-HTLVIIIB und HIV-ZR6 nach fünf Immunisierungen beobachtet.
Die Tiere, die mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem gp120
in MF59 immunisiert waren, reagierten mit Antikörpern, die nach nur fünf Immunisierungen
bei der Neutralisation von HIV-BRU und HIV-ZR6 effektiv waren. In
einer vorherigen Studie wurde die Neutralisation von afrikanischen
Isolaten nach nur acht (HIV-NDK) oder neun (HIV-ZR6) Immunisierungen
erreicht. Zusätzlich
waren die Titer höher,
die in Beispiel 9 mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem gp120
mit MF59 als Adjuvans gegen HIV-ZR6 erreicht wurden. Auch war das
Auftreten von neutralisierenden Antikörpern, die gegen HIV-BRU und
HIV-ZR6 effektiv
waren, in dieser Studie simultan, im Gegensatz zu Beispiel 6, das
vorstehend beschrieben ist. Dieses Ergebnis könnte dem Adjuvans oder dem
Dosierungszeitplan der Immunisierungen zugeschrieben werden, die
im Beispiel 9 zwei kürzere Pausenzeiträume zuließ, verglichen
mit einem einzigen langen Pausenzeitraum in Beispiel 6.
-
-
-
Beispiel 10
-
In
den folgenden Verfahren, die den vorstehend beschriebenen für Paviane ähneln, wurden
vier Schimpansen (Pan troglodytes) mit 55 mg gp120 mit 2 × MF59 als
Adjuvans (2 Tiere), Adjuvans allein (1 Tier) immunisiert oder wurden
nicht immunisiert (1 Tier), um die Immunogenität des Proteins bei dieser Primatenart, dem
nächsten
lebenden Verwandten des Menschen, zu bestimmen. Der experimentelle
Dosierungszeitplan wird in 7 gezeigt.
In 7 stellen die schattierten Balken Zeitlinien (Immunisierungsschemata)
für jede
der drei Studien dar: Paviane von Beispiel 6 (oberste Linie), Paviane
von Beispiel 9 (mittlere Linie) und Schimpansen von Beispiel 10
(untere Linie). Eine Zeitskala in Wochen ist am unteren Ende der
Figur gezeigt. Immunisierungen werden durch vertikale Balken, die
oberhalb nummeriert sind, um die Immunisierungsnummer anzuzeigen,
an der Stelle in der Zeitlinie der Injektion angezeigt. Die Paviane
in Beispiel 6 wurden in den Wochen 0, 4, 8, 12, 21, 55, 59, 65 und
80 immunisiert, mit der Ausnahme von Pavian 2964, der in Woche 82
an Stelle von Woche 80 immunisiert wurde. Die Paviane in Beispiel
9 wurden in den Wochen 0, 4, 8, 22 und 36 immunisiert. Die Schimpansen
wurden in den Wochen 0, 4, 8 und 28 immunisiert. Die Formulierung
von 2 × MF59 war
10% Squalen, 1% Tween-80, 1% Span-85 mit endogenem MTP-PE zu 0,4
mg/ml in Wasser, welche mit einem Mikrofluidizer emulgiert wurde
und unter Argon bis zur Verwendung gelagert wurde; es wurde dann
mit Antigen durch Schütteln
vermischt und injiziert. Die Tiere wurden in monatlichen Intervallen
dreimal intramuskulär
immunisiert, und die Seren wurden auf hüll-spezifische Titer und auf
virusneutralisierende Antikörper
bei den Blutproben, die jeder Immunisierung folgten, analysiert.
Die Daten sind in Tabelle 9 für
die beiden Schimpansen, die mit rekombinantem, nativem, glycosyliertem
Protein immunisiert wurden, zusammengefasst. Keiner der anderen
Kontroll-Schimpansen entwickelte gp120-spezifische Antikörper oder neutralisierende
Antikörper
(Daten nicht gezeigt). Beide Tiere, die mit rekombinantem, nativem,
glycosyliertem Protein immunisiert wurden, entwickelten gute Antworten
auf das immunisierende Antigen, und beide Tiere besitzen virusneutralisierende
Antikörper,
die gegen HIV-SF2 und HIV-MN effektiv sind. Serum von einem der
Schimpansen neutralisierte ebenfalls HIV-HTLVIIIB nach drei Immunisierungen.
Die Schimpansen erhielten nach einer Pausenzeit von sechs Monaten
Auffrischungsimpfungen, und die Seren wurden nach dieser Immunisierung
analysiert. Sind die Virusneutralisationstiter gegen HIV-SF2 ausreichend
hoch, so erhalten die Tiere eine Challenge aus einer titrierten
Stammlösung
von HIV-SF2 von Schimpansen. Die Schimpansen werden zwei Wochen
vor der Challenge erneut immunisiert. Im Falle der Existenz neutralisierender
Antikörper,
die gegen heterologe Isolate effektiv sind, existiert auch die Möglichkeit
einer heterologen Viruschallenge in denselben Tieren.
-
-
Hinterlegung Biologischen
Materials
-
Die
folgenden beispielhaften Materialien wurden am 7. November 1990
bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD,
hinterlegt, und, wie angezeigt, bezeichnet. Diese Hinterlegungen
werden unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die
Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zum Zweck von Patentverfahren aufrechterhalten.
| Hinterlegung | ATCC
# | Hinterlegt |
| Eierstockzellen
des chinesischen Hamsters | | |
| CHO-A-6a120-145-0,1-22 | CRL
10379 | 9.
März 1990 |
| Eierstockzellen
des chinesischen Hamsters | | |
| CHO-DG44 | CRL
10378 | 8.
März 1990 |
| E.
coli | | |
| HB101
(pCMV6a120-SF2) | 68249 | 8.
März 1990 |
-
Diese
Hinterlegungen werden nur zum Vorteil des Fachmannes bereitgestellt.
