DE69029937T2 - FÜr DIE CO4-BINDENDE DOMÄNE VON HIV SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER - Google Patents

FÜr DIE CO4-BINDENDE DOMÄNE VON HIV SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) wird durch ein Virus verursacht, das gelegentlich als menschliches T-Zell-lymphotropes Virus Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) bezeichnet wurde. Das Virus wird gegenwärtig als menschliches Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) bezeichnet.
  • HIV- 1 schädigt das Immunsystem durch Infektion und Verringerung von T- Helfer ("inducer")-Lymphocyten (hier nachstehend als T-Zellen bezeichnet). T-Zellen sind essentiell, da sie die Produktion von Antikörpern durch B-Zellen, Reifung von cytotoxischen T-Lymphocyten (Killer-T-Zellen), Reifung und Aktivität von Makrophagen und natürlichen Killerzellen und direkt und indirekt zahlreiche andere Regulator- und Effektorfunktionen des Immunsystems kontrollieren.
  • Die Infektion einer T-Zelle erfolgt durch Interaktion zwischen einem HIV-1- Epitop und einer Rezeptorstelle auf der Oberfläche der T-Zelle. Diese Rezeptorstelle auf der T-Zelle ist ein Proteinmolekül mit der Bezeichnung CD4-Antigen. Das HIV-1- Epitop besteht aus dem externen Hüllglycoprotein gp120 (Molekulargewicht etwa 120 000 Dalton). Das Glycoprotein gp120 wird durch Spaltung des in der HIV-infizierten T-Zelle produzierten Vorläuferglycoproteins gp160 in den Transmembranbestandteil gp41 (Molekulargewicht etwa 41 000 Dalton) und in gp120 erzeugt. Das Glycoprotein gp41 reicht durch die aus einer Lipiddoppelschicht bestehende Membran der Virionen und der infizierten Zellen hindurch, und sein äußerer Teil ist durch eine nicht-kovalente Bindung mit gp120 assoziiert. Das Glycoprotein gp120 trägt eine Stelle, die mit Zielzellen fusioniert, wodurch das genetische Material des Virus in die Zelle eindringt.
  • Nach der Identifizierung des CD4-Antigens als Zelloberflächenrezeptor für HIV-1 wurde wiederholt gezeigt, daß lösliche Formen des CD4-Antigens (sCD4) die infizierende Wirkung des Virus blockieren können. Lösliches CD4 inhibiert verschiedene Varianten von HIV-1, was anzeigt, daß die betreffenden Viren einen relativ konservierten CD4-Bindungsbereich teilen. Lasky et al. identifizierten einen gp120-spezifischen monoclonalen murinen Antikörper (Mab), der die Interaktion zwischen gp120 und CD4 inhibieren kann (Cell 50 (1987), 995-985). EP-A-0 279 688 offenbart den gleichen Antikörper. Dieser Mab bindet jedoch nicht an einen die Aminosäuresequenz IINMWQKVGKAMYAP aufweisenden Bereich von gp120.
  • Das von diesem Mab erkannte Epitop wurde einem konservierten Bereich der Aminosäurereste 413 bis 456 zugeordnet, in dem HIV-1 und das entfernt verwandte HIV-2 eine signifikante Homologie teilen. Diese Domäne von gp120 scheint für die Bindung an CD4 wesentlich zu sein. Der CD4-bindende Bereich des Hüllglycoproteins gp120 scheint jedoch in HIV-1-infizierten Personen nicht immunogen zu sein, da es nur eine sehr geringe antigene Kreuzreaktivität gegen Hüllproteine zwischen Seren von HIV-1- oder HIV-2-infizierten Patienten gibt (R. Clavel et al., Science 233 (1986), 343- 346). WO 88/09181 offenbart monoclonale Antikörper gegen HIV-1, die unterschiedliche Bereiche von gp120 zwischen den Aminosäureresten 284 und 318 erkennen. WO 87/07616 offenbart Peptide des env-Bereichs des HIV-Genoms und die Verwendung dieser Peptide in Zusammensetzungen zur Behandlung oder Verhinderung von AIDS. Diese Peptide stammten vom Bereich mit den Aminosäureresten 600 bis 750 des env-Bereichs.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Epitop, das im Bereich des Hüllglycoproteins gp120 von HIV-1 liegt, das an den CD4-Rezeptor von T-Zellen und an einen monoclonalen Antikörper bindet, der dieses Epitop erkennt und in einem Syncytiumbildungstest unter Verwendung von CEM-SS-Zellen eine neutralisierende Aktivität gegen HIV-1 zeigt. Das Epitop liegt etwa bei den Aminosäureresten 423 bis 437 von gp120 und weist die Sequenz IINMWQKVGKAMYAP auf. Der mit diesem Epitop reagierende Antikörper kann die T-Zell-Infektion durch verschiedene Stämme und HIV-1-Isolate inhibieren.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper (und verwandte Antikörper) können als Therapeutika oder Impfstoffe gegen AIDS, den AIDS-verwandten Komplex (ARC) oder zur Behandlung von HIV-infizierten, jedoch asymptomatischen Individuen verwendet werden. Der vollständige Antikörper oder ein Fragment davon kann verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann dieser Antikörper mit cytotoxischen oder Antivirusmitteln oder mit einem dieses Mittel enthaltenden Mikroträger (beispielsweise einem Liposom) konjugiert werden zur Produktion eines Immunkonjugats, das die Abgabe des Mittels an die HIV-1-infizierten Zellen zielgerecht bewirkt. Die gerichtete Abgabe eines therapeutischen Wirkstoffs kann auch durch vom erfindungsgemäßen Antikörper stammende bispezifische Antikörper durchgeführt werden. Bispezifische Antikörper weisen eine zweite Spezifität für den an das Ziel abzugebenden Wirkstoff auf.
  • Zu therapeutischen Zwecken kann der erfindungsgemäße Antikörper in vivo als vollständig von Mäusen oder anderen Tieren stammender Antikörper verwendet werden. Der Antikörper stammt vorzugsweise vom Menschen. Alternativ kann der Antikörper in Form eines chimären Tier/Mensch-Antikörpers hergestellt werden.
  • Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können ferner anderweitig verwendet werden, beispielsweise zur Entwicklung von anti-Idiotypen zur Verwendung in Diagnosetests, zur Antikörper-Durchmusterung oder Arzneimittel-Durchmusterung.
  • Peptide, die den erfindungsgemäßen gp120-Epitopen entsprechen, können ebenfalls zur Stimulierung einer neutralisierenden Immunantwort gegen HIV verwendet werden. Das Peptid weist die Aminosäuresequenz IINMWQKVGKAMYAP auf.
    • Genaue Beschreibung der Figuren
  • Die Figuren 1A und 1B zeigen jeweils die Neutralisation von verschiedenen HTLV-III-Isolaten durch sieben anti-CD4-Bindungsbereichs-Antikörper, die in einem Syncytiumbildungstest bestimmt wurde.
  • Die Figuren 2A, 2B und 2C zeigen jeweils die Neutralisation von verschiedenen HTLV-III-Isolaten durch sieben anti-CD4-Bindungsbereichs-Antikörper, die unter Verwendung von H9-Zellen in einem Infektiositätstest bestimmt wurde.
  • Figur 3 zeigt die Ergebnisse von Inhibitionstests der HIV-1-Bindung, die mit zwei HTLV-III-Stämmen durchgeführt wurden.
  • Figur 4 zeigt die Immunreaktivität menschlicher Seren von Patienten mit AIDS oder dem AIDS-verwandten Komplex (ARC), asymptomatischen HIV-1-seropositiven Personen und seronegativen Kontrollen gegen das Peptid T35S.
  • Figur 5 zeigt die cytotoxischen Wirkungen des Immunkonjugats G3-519-PAP- S, wenn es HTLV-IIIB-, HTLV-IIIMN- oder HTLV-IIIRF-infizierten H9-Zellen präsentiert wird.
  • Figur 6 ist ein Histogramm, das die Spezifität der cytotoxischen Wirkungen der Immunkonjugate zeigt.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Das erfindungsgemäße Epitop liegt auf dem gp120 innerhalb des an den CD4- Rezeptor von T-Zellen bindenden Bereichs. Das CD4-Rezeptorbindungsepitop enthält ein Segment mit der Aminosäuresequenz IINMWQKVGKAMYAP. Diese Sequenz entspricht den Resten 423 bis 437 von gp120. Antikörper gegen das Epitop können mit hoher Wirksamkeit eine HIV-Infektion inhibieren. Sämtliche für das Epitop spezifischen monoclonalen Antikörper inhibierten beispielsweise mehrere HIV-1-Isolate. Ferner ist das Epitop unter den HIV-1-Stämmen und -Isolaten stark konserviert. Daher können Antikörper, die für ein oder mehrere dieser Epitope spezifisch sind, unterschiedliche Stämme und Isolate von HIV-1 inhibieren.
  • Antikörper gegen dieses Epitop können durch somatische Zellfusionsverfahren hergestellt werden. Vgl. beispielsweise G. Köhler und C. Milstein, Nature 256 (1975), 725, und Fung et al., Biotechnology 5 (1987), 940-946. In kürze, ein Tier, beispielsweise eine Maus, wird mit gp120 von HIV immunisiert. Das gp120 kann dazu aus diesen viralen Lysaten gereinigt oder teilweise gereinigt werden. Die Reinigung von gp120 kann durch Affinitätschromatographie mit einem Antikörper gegen gp120 durchgeführt werden. Nach der Immunisierung werden dem immunisierten Tier B-Zellen entnommen und anschließend mit unsterblichen Zellen, beispielsweise Myelomzellen, fusioniert.
  • Hybridome, die den an das Epitop bindenden Antikörper produzieren, können in Durchmusterungs-Verfahren identifiziert werden. In einem solchen Durchmusterungs- Verfahren werden die Hybridzellen zunächst vorzugsweise in einem Enzym-gebundenen Immunsorbenttest (ELISA) oder einem Westernblot-Test auf eine Antikörperproduktion gegen gp120 getestet. Dieser Test wird mit allen Hybridzellen durchgeführt, und positive Hybridzellen werden für die weitere Analyse ausgewählt. Die Hybridzellen mit den höchsten Reaktivitäten werden letztlich ausgewählt. Die Antikörper können auf eine Kreuzreaktivität mit unterschiedlichen Virusisolaten durch Immunfluoreszenzfärbung auf der Oberfläche von Virus-infizierten Zellen und durch Radioimmunpräzipitationstests mit metabolisch radiomarkierten Viren getestet werden. Vgl. z. B. Fung et al., a. a. O.
  • Nach Identifizierung der anti-gp120-Antikörper durch die vorstehend beschriebenen Verfahren können die Antikörper auf ihre Neutralisationswirkung getestet werden, die vorzugsweise durch zwei Tests ermittelt wird, wobei der erste Test ein von D. D. Ho et al., Science 239 (1988), 1021-1023, beschriebener Virus- Neutralisationstest ist. In diesem Test wird der Grad der Inhibition der HIV-1-Infektion von H9-Zellen ermittelt. Der von P. L. Nara et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 3 (1987), 283-302, beschriebene zweite Neutralisationstest beruht auf dem Grad der Inhibition der Syncytiumbildung. HIV-1 und Antikörper werden einer CD4&spplus;-CEM-SS- Zellen enthaltenden Vertiefung zugesetzt. HIV-infizierte CEM-SS-Zellen exprimieren gp120 auf der Zelloberfläche und bilden mit den benachbarten CD4&spplus;-CEM-SS-Zellen ein Syncytium. Die Neutralisation von HIV-1 durch den Mab zeigt sich als Inhibition der Syncytiumbildung. Die erfindungsgemäßen Mabs zeigen mindestens eine neutralisierende Aktivität gegen HIV-1 in einem CEM-SS-Zellen verwendenden Syncytiumbildungstest.
  • Das Epitop, an das die HIV-1-inhibierenden Antikörper binden, wird anschließend identifiziert. Dies kann durch Konstruktion von Peptiden, die den unterschiedlichen Bereichen entsprechen und in denen jeweils fünf Aminosäuren überlappen, erreicht werden. Die Reaktivität mit den Peptiden kann anschließend in einem Standardimmuntest, beispielsweise einem ELISA, untersucht werden. Insbesondere können die Antikörper auf eine Reaktivität mit dem die Sequenz IINMWQKVGKAMYAP (oder analoge Sequenzen) aufweisenden I15P-Bereich von gp120 untersucht werden.
  • Die therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper schließt sowohl eine in vivo-Immuntherapie als auch eine extrakorporale Immuntherapie ein. Die direkte in vivo-Behandlung mit den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern schließt eine innere Verabreichung der Antikörper, vorzugsweise durch intravenöse Injektion, ein. Bei einer erforderlichen Behandlung von infizierten Gehirnzellen können die Antikörper an einen Wirkstoff gekoppelt werden, beispielsweise bestimmte lipophile Substanzen, die eine Überwindung der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Antikörper können eine Infektion von T-Zellen durch unterschiedliche Stämme und Isolate von HIV-1 inhibieren und daher gegen die unterschiedlichen, in der Patientenpopulation vorhandenen Virusarten wirksam schützen.
  • Mit feststehenden gentechnischen Verfahren können Antikörper produziert werden, die Teile von Tieren und vom Menschen aufweisen. Diese chimären Antikörper umfassen eine von einem tierischen Antikörper stammende (variable) Antigenbindungsdomäne und eine von einem menschlichen Antikörper stammende konstante Domäne. Das Tier ist beispielsweise eine Maus oder ein anderes Nagetier, beispielsweise eine Ratte. Wenn die variable Domäne des chimären Antikörpers von der Maus stammt, während die konstante Domäne vom Menschen stammt, ist der chimäre Antikörper üblicherweise weniger immunogen als ein "reiner" monoclonaler Mausantikörper und zur therapeutischen Verwendung wahrscheinlich geeigneter.
  • Chimäre Antikörper können durch chimäre DNA-Konstrukte, die zusammengesetzte Antikörperketten codieren, produziert werden. Vgl. V. T. Oi et al., Bio Techniques 4(4) (1986), 214-221, und L. K. Sun et al., Hybridoma 5 (1986). Dieses DNA-Konstrukt umfaßt DNA, die funktionell umgelagerte Gene für die variable Domane einer leichten oder schweren Kette eines HIV-1-neutralisierenden Antikörpers codiert, wobei sie an die die konstante Domäne des Menschen codierende DNA gebunden ist. Lymphoide Zellen, beispielsweise Myelome oder Hybridome, die mit den DNA-Konstrukten für die leichte und schwere Kette transfiziert sind, können die Antikörperketten exprimieren und zusammenfügen.
  • Eine weitere wesentliche, nicht-immunogene, therapeutische Ausführungsform ist die Verwendung menschlicher monoclonaler Antikörper. Ein bevorzugtes Verfahren zum Erhalt von unsterblichen Antikörper-produzierenden B-Zellinien ist die Transformation der B-Zellen von HIV-1-infizierten Personen durch ein Epstein-Barr- Virus. Die transformierten B-Zell-Clone können durch Durchmusterung auf ihre spezifische Reaktivität mit gp120 und den Epitop-Peptiden erhalten werden. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren ist die Einrichtung menschlicher monoclonaler Expressionsbanken unter Verwendung eines Bakteriophagen-Lambda-Expressionsvektors (z.B. ImmunoZap von Stratacyte, La Jolla, California), beschrieben von Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology Nr.1 Bd. 3 (Jan. 1990). Dieses Verfahren umfaßt im wesentlichen die Amplifikation der Gene der variablen Domäne der Immunglobuline von einer Population von Lymphocyten mit einer anschließenden Konstruktion einer E. coli-Bank, in der die Gene der variablen Domäne der schweren Kette allein oder in Kombination mit den Genen der leichten Ketten exprimiert werden. Antigene (beispielsweise das erfindungsgemäße Peptid) werden zur Durchmusterung verwendet, um Clone zu identifizieren, die an das Antigen bindende Domänen produzieren. Nach der Identifizierung der Gene der Antigen-spezifischen variablen Domäne können diese mit den Genen der gewünschten menschlichen konstanten Domäne durch ein Verfahren, das dem zur Produktion eines vorstehend beschriebenen chimären Antikörpers verwendeten Verfahrens gleicht, verknüpft werden.
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können die monoclonalen Antikörper zur Unterstützung der Abgabe von cytotoxischen oder Antivirusmitteln verwendet werden, indem sie Immunkonjugate bilden, die den an ein Toxin konjugierten Antikörper oder ein Fragment davon umfassen. Beispiele für cytotoxische Wirkstoffe sind cytotoxische Steroide, Gelonin, Abrin, Ricin und Phospholipasen. Beispiele für Antivirusmittel sind Interferon, Azidothymidin und Ribavirin. Ein besonders bevorzugtes Toxin, das mit den erfmdungsgemäßen Antikörpern verwendet wird, ist das Kermesbeere-Antivirusprotein (PAP-S). Die Immunkonjugate können durch chemische Verknüpfung von Antikörper und Toxin oder durch DNA- Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
  • Eine weitere Form des monoclonalen Antikörpers ist ein bispezifischer Hybridantikörper, der zwei unterschiedliche Antigenbindungsstellen mit unterschiedlicher Spezifität trägt. Eine Antigenbindungsstelle kann von den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern stammen, und eine zweite Antigenbindungsstelle kann eine Spezifität für einen an eine bestimmte Stelle zu transportierenden Wirkstoff aufweisen. Die zweite Antigenbindungsstelle kann beispielsweise für ein Oberflächenepitop einer menschlichen T-Zelle oder eines Mäkrophagen, beispielsweise des CD4-Moleküls, spezifisch sein. Diese bispezifischen Antikörper können verwendet werden, um eine T- Zelle oder einen Makrophagen an eine HIV-1-infizierte Zelle zu leiten.
  • Die bispezifischen Antikörper können einzelne Antikörper, Hybridantikörper oder Antikörperfragmente mit einer Bispezifität sein (Vgl. M. Brennan, "A Chemical Technique for the Preparation of Bispecific Antibodies from Fab' Fragments of Mouse Monoclonal IgG&sub1;", Biotechniques 4 (1986), 424-27), oder sie können Heteroaggregate aus zwei Antikörpern mit einer jeweils anderen Spezifität sein.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper sind besonders zur passiven Immunisierung geeignet, da sie durch Kreuzreaktion gegen HIV-1 von unterschiedlichen Stämmen in der Population schützen können. In diesem Verfahren werden Patienten, die asymptomatisch (ohne AIDS- oder ARC-Symptome) oder seronegativ, jedoch in einer hohen Risikogruppe sind, zur Inhibition der Infektion behandelt. Die Behandlung schließt Föten, die von Müttern mit HIV-1 getragen werden, oder Babies, die von Müttern mit HIV-1 geboren werden, und mit AIDS-Patienten oder infizierten Blutprodukten arbeitende Beschäftigte im Gesundheitswesen ein. Zur Behandlung können als Wirkstoff wiederum die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper, chimären monoclonalen Antikörper oder bispezifischen monoclonalen Antikörper verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper können ferner verwendet werden, um durch gut bekannte Verfahren anti-Idiotyp-Antikörper für einen Diagnosetest zu entwickeln, um zu ermitteln, ob eine mit HIV-1-infizierte asymptomatische Person oder ein AIDS- oder ARC-Patient die Antikörper produziert, die mit dem bestimmten Peptidsegment von gp120 der in diesem Peptidsegment antigenisch verwandten HIV-1-Stämme reagieren. Ein derartiger Diagnosetest könnte einer der gut bekannten Tests sein, einschließlich des Sandwich- oder Tandemtests.
  • Die anti-Idiotyp-Antikörper können ferner in einem Arzneimittel-Durchmusterungstest zur Isolierung von Mabs oder anderen Arzneimitteln verwendet werden, die mit dem CD4-Bindungsbereich reagieren und daher möglicherweise in der Therapie verwendet werden können.
  • Die erfindungsgemäßen neutralisierenden Antikörper erkennen Epitope, die in einem CD4-Bindungsbereich von gp120 liegen, der die nachstehende Aminosäuresequenz aufweist:
  • IINMWQKVGKAMYAP
  • Dieses Peptid stellt die Reste #423 bis #437 von gp120 dar. Ein Peptid aus elf Aminosäuren, das die Aminosäurereste #422 bis #432 umfaßt und zuvor als Epitop des monoclonalen Antikörpers 5C2E5 von Lasky et al., Cell 50 (1987), 975-985, identifiziert wurde, reagierte nicht mit den erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpern.
  • Die erfindungsgemäßen Peptidimmunogene können die vorstehend identifizierten Aminosäuresequenzen oder beliebige funktionell äquivalente immunchemische und/oder immunogene Sequenzen davon einschließen. Diese Äquivalente schließen beispielsweise alle eigentlichen Epitopteile sämtlicher Sequenzen ein, die den Peptidbereichen von unterschiedlichen HIV-1-Stämmen und den durch verschiedene Veränderungen, beispielsweise Insertionen, Deletionen und Substitutionen von Aminosäuren, produzierten Peptiden entsprechen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können miteinander gekoppelt werden, um größere, multivalente Oligopeptide zu bilden. Die Peptide können durch chemische Synthese hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform können sie durch DNA- Rekombinationsverfahren hergestellt werden, in denen Peptid-codierende DNA-Sequenzen synthetisiert oder aus HIV-1-DNA isoliert und in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert werden.
  • Die Peptide können auch einzeln oder kombiniert verwendet werden, um eine Immunantwort gegen HIV-1 zu erzeugen. Dazu können die Peptide in Impfstoffzusammensetzungen formuliert werden, üblicherweise zur Verabreichung in Konzentrationen im Bereich von 1 µg bis 20 mg/kg des Wirts. Physiologisch verträgliche Träger, beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), können in den Formulierungen verwendet werden. Adjuvantien, beispielsweise Aluminiumhydroxidgel, können ebenfalls verwendet werden. Der Verabreichungsweg kann intramuskulär, intraperitoneal, subcutan oder intravenös sein. Die Zusammensetzungen können so häufig wie erforderlich, üblicherweise in Abständen von ein bis vier Wochen, verabreicht werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der Impfstoffzusammensetzung werden die Peptide an ein Trägerprotein, beispielsweise ein fremdes KLH (keyhole Limpet hemocyanin), gekoppelt. Dies kann die Immunogenität der Haptenpeptide erhöhen. Die Peptide können in Immuntests verwendet werden, um den neutralisierenden Antikörper zu identifizieren oder eine Durchmusterung auf die Gegenwart des neutralisierenden Antikörpers im Serum durchzuführen.
  • Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
    • Beispiel 1 Produktion und Testen von monoclonalen Antikörpern, die mit der CD4- Bindungsdomäne von gp120 reagieren. A. Materialien und Verfahren 1. Antikörperproduktion und Durchmusterung
  • Das Hüllglycoprotein gp120 von HTLV-IIIB wurde aus H9/HTLV-IIIB- Zellextrakten isoliert. H9/HTLV-IIIB-Zellen wurden mit einem Lysepuffer lysiert, der aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 120 mM NaCl, 1 mM MnCl&sub2;, 0,5 % Triton X-100 und 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid bestand. Die Extrakte wurden 1 Stunde bei 56ºC Hitze-inaktiviert und mit Linsen-Sepharose (Sigma, St. Louis, MO) umgesetzt. Die gebundene Fraktion wurde eluiert und mit Affigel-10, das mit einem monoclonalen murinen Antikörper gegen gp120 (BAT123) gekoppelt war, inkubiert. Vgl. Fung et al., Biotechnology 5 (1987), 940-946. Die virale gp120-Fraktion wurde eluiert und als Immunogen verwendet. Fünf männliche BALB/c-Mäuse wurden mit 25 µg Protein in komplettem Freundschem Adjuvans und anschließend dreimal mit 25 µg Protein im Abstand von 1 Monat im gleichen Adjuvans immunisiert. Drei Tage nach der letzten Auffrischungsimmunisierung wurden die Mäuse geopfert, die Milzzellen isoliert und mit SP2/0-Myelomzellen fusioniert, wie von Fung et al. (a. a. O.) beschrieben. Auf die Hybridzellen wurde durch Zugabe von 0,1 mM Hypoxanthin, 0,4 µm Aminopterin und 16 µM Thymidin zum Nährmedium selektiert. Nach zwei Wochen wurden die Überstände aus den Vertiefungen der Mikrotiterplatten gesammelt. Jede Vertiefung wies nach 10 Tagen etwa 10 Hybridkolonien auf. Es wurde geschätzt, daß es etwa 140 000 Hybridome zur anschließenden Durchmusterung im ELISA mit den Peptiden T35S und gp120 als Antigenschicht gab. Peptid T35S ist ein synthetisches Peptid, das den CD4- Bindungsbereich enthält, wie von Lasky et al. (a. a. O.) beschrieben. Mabs von Hybridomen, die für eine weitere Charakterisierung ausgewählt wurden, wurden in Maus-Ascites produziert und durch Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt. insgesamt 7 Hybridome (outgrowths) mit den stärksten positiven Reaktionen in beiden Durchmusterungs-Tests wurden durch begrenzende Verdünnung als Einzelzellen geclont und die Überstände im ELISA unter Verwendung von T35S als Antigenschicht abgesucht. Diese sieben Mabs werden als G3-Serie bezeichnet, die jeweils als G3-42, -211, - 299, -508, -519, -536 und -537 bezeichnet werden. Sie gehören alle zur Subklasse IgG1.
  • Die gleiche Immunisierung, wie vorstehend beschrieben, wurde anschließend an zwei weiteren Mäusen durchgeführt. Nach ihrer Opferung wurde das gleiche Fusionsverfahren, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Auf die Hybride wurde ebenfalls, wie vorstehend beschrieben, selektiert, es wurden jedoch 60 Platten mit jeweils 96 Vertiefungen mit etwa 10 Clonen pro Vertiefung verwendet, wobei etwa 60 000 Hybridomkolonien erhalten wurden. Eine anschließende Durchmusterung ELISA mit dem Peptid gp120 zeigte bei 635 Vertiefungen positive Ergebnisse (eine optische Dichte (O.D.) von > 0,25 im ELISA zeigt dies an). Auf diese Hybridome wurden selektiert und sie wurden, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet, und die vier mit den stärksten positiven Reaktionen im Durchmusterungs-Test wurden durch begrenzende Verdünnung als Einzelzellen geclont, wobei die Überstände im ELISA mit gp120 als Antigenschicht abgesucht wurden. Die vier Mabs, die alle zur Subklasse IgG1 gehören, werden als G45-Serie bezeichnet, die jeweils als G45-60, G45-16, G45-70 und G45-89 bezeichnet werden.
    • 2. Untersuchung der Reaktivität von Mabs mit unterschiedlichen HIV-1-Isolaten
  • Mabs der G3-Serien wurden auf eine Reaktivität mit anderen HIV-1-Isolaten getestet. H9-Zellen, die persistent mit HTLV-IIIB, HTLV-IIIRF, HTLV-IIIMN, HTLV-IIIAL, HTLV-IIIWMJ, HTLV-IIIZ34 und HTLV-IIIZ84 infiziert waren, wurden in RPMI-1640-Medium gehalten, dem 10 % Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum, 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zugesetzt waren. Zellfreie Kulturüberstände von HTLV-IIIB-, HTLV-IIIRF- und HTLV-IIIAL-infizierten H9-Zellen mit hoher reverser Transkriptase-Aktivität wurden in Aliquots eingefroren und für Neutralisationstests, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
    • 3. Immunfluoreszenzfärbung
  • Das Verfahren der Immunfluoreszenzfärbung von HIV-1-infizierten H9- Zellen wurde von Fung et al. (a.a.O.) beschrieben. 50 µl Aliquots von H9-Zellen mit 5 x 10&sup6; Zellen/ml wurden in 1,5 ml-Mikrofuge-Röhrchen gegeben. 50 µl Protein A- gereinigter Mab (5 µg/ml) wurden zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur (R.T.) inkubiert. Die Röhrchen wurden anschließend 5 Minuten bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen mit 2 % fötales Rinderserum und 0,1 % Natriumazid enthaltendem RPMI-1640-Medium gewaschen. Die Röhrchen wurden zur Ablösung der Zellen angetippt. 10 µl Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG (Tago, Burlingame, CA) wurden in einer Verdünnung von 1:200 zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zugesetzt und 30 Minuten bei R.T. inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen in PBS suspendiert, auf Objektträger gegeben, immobilisiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Kontrollen waren nicht-infizierte H9-Zellen und Antikörper von irrelevanter Spezifität.
  • Für die Mabs der G45-Serie wurden die gleichen Färbeverfahren verwendet, um die Bindung an bestimmte HIV-1-Isolate zu testen. Die Zellen wurden jedoch mit 0,5 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend durch fließcytometrische Verfahren analysiert (Kim et al., J. Immunol. 144 (1990),1257).
    • 4. Enzym-gebundener Immunsorbenttest (ELISA)
  • Die Durchmusterung und die Epitopkartierung von Mabs wurden mit Hilfe eines ELISAs durchgeführt. Die Reaktivitäten von HIV-1-seropositiven Patientenseren mit dem Peptid T35S wurden ebenfalls im ELISA getestet. Die Seren wurden nach dem Zufallsprinzip 65 HIV-1-seropositiven Patienten entnommen. Dreißig Personen hatten AIDS, 19 den AIDS-verwandten Komplex und 16 waren asymptomatisch. Seren von 10 HIV-1-seronegativen Spendern wurden ebenfalls als Kontrollen getestet.
  • Im ELISA wurden Vertiefungen von Immulon 2-Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantily, VA) über Nacht bei R.T. mit 100 µl synthetischen Peptiden (5 µg/ml, jedoch 0,5 µg/ml für T35S) oder 100 µl gereinigtem gp120 (0,1 µg/ml) in PBS beschichtet. Sie wurden anschließend 1 Stunde bei R.T. mit 5 % BLOTTO in PBS inkubiert und mit PBS-Tween 20 (0,05 %) gewaschen. Anschließend wurden 100 µl Kulturmedium, 100 µl gereinigter Maus-Mab (mit PBS/Tween 20 auf 0,4 µg/ml verdünnt) oder 100 µl verdünntes menschliches Serum (mit BLOTTO-Puffer 1:100 verdünnt) zugesetzt und die Vertiefungen 1 Stunde bei R.T. mit dem geeigneten, mit Meerrettichperoxidase (mit 5 % BLOTTO in PBS verdünnt) konjugierten Ziegen-anti-Maus-IgG oder Ziegen-anti- Mensch-IgG inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die gebundenen Antikörper durch Umsetzung mit 0,1 % Tetramethylbenzidin und 0,0003 % Wasserstoffperoxid als Substrate sichtbar gemacht. Die optische Dichte (OD) der Reaktionslösung wurde bei 450 nm gemessen.
    • 5. Herstellung von gp120-Peptiden
  • Das Peptid T35S wurde von den Peninsula Laboratories (Belmont, CA) synthetisiert und charakterisiert. Alle anderen Peptide dieser Untersuchung wurden unter Verwendung des RaMPS-Peptidsynthesesystems von DuPont (Wilmington, DE) unter Verwendung eines im Handbuch beschriebenen FMOC (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)- Syntheseprotokolis synthetisiert. Die Reinheit der RaMPS-synthetisierten Peptide wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie charakterisiert und die vorhergesagte Struktur durch schnelle Atombeschuß/Massenspektrometrie-Analyse gemessen. Die Aminosäurereste und die Sequenzen der synthetischen Peptide stammten vom HXB2- Clon von HIV-1 (G. Myers et al., Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos Natl. Lab., Los Alamos, NM (1988)), wie in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1. Sequenzen der synthetischen Peptide und ihre Lage im CD4-Bindungsbereich von gp120 von HTLV-IIIB*
  • * Die Aminosäurereste und -sequenzen wurden von Myers et al. (a.a.O.) übernommen.
    • 6. Radioimmunpräzipitationstest (RIPA)
  • Die Reaktivität der Antikörper der G3-Serie wurde nach einem feststehenden RIPA-Protokoll getestet (D. D. Ho et al., Science 239 (1988), 1021-1023). Kurz gesagt, H9-Zellen (mit HTLV-IIIB, HTLV-IIIRF, HTLV-IIIAL und HTLV-IIIWMJ infiziert) wurden 4 Stunden mit [³&sup5;S]-Cystein und [³&sup5;S]-Methionin (100 µCi/ml) (ICN, Irvine, CA) metabolisch markiert und in einem RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % Na-Desoxycholat, 0,1 % SDS und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert. Die Lysate wurden mit Protein A-Sepharose, an die Kaninchenantiserum gegen die Maus-k-Leichtkette (k-PAS) gebunden war, 3 Stunden bei R.T. vorgeklärt. Der RIPA wurde durch Zugabe von 3 µg gereinigtem Maus-Mab und 0,3 ml einer 10 % Suspension von k-PAS zu 200 µl markiertem und geklärtem Lysat durchgeführt. Die Proben wurden 18 Stunden bei 4ºC inkubiert und die Kügelchen mit RIPA-Lysepuffer gewaschen. Die Pellets wurden in Elektrophorese- Probenpuffer suspendiert und 3 Minuten gekocht. Die Proteine wurden durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einer anschließenden Autoradiographie analysiert.
    • 7. Neutralisationstests von HIV-1
  • Virus-Neutralisationsstudien an Mabs der G3-Serie wurden unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Tests durchgeführt: einem Syncytiumbildungstest unter Verwendung von CEM-SS-Zellen, wie von Nara et al., AIDS Res. Human Retroviruses 3 (1987), 283-302, beschrieben, und einem zweiten Neutralisationstest unter Verwendung von H9-Zellen, wie von Ho et al. (a.a.O.) beschrieben. Nur der Syncytiumbildungstest wurde für die G45-Serie verwendet.
  • Zur Durchführung des Syncytiumbildungstests wurden zweifache Verdünnungsreihen von Mabs in RPMI-1640-Medium, dem 10 % Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum zugesetzt war, hergestellt. Es wurden 50 µl von jedem verdünnten Antikörper mit einem gleichen Volumen an Virus (100 Syncytiumbildungseinheiten oder SFUs) vermischt und 1 Stunde bei R.T. inkubiert. Die Gemische wurden zu zwei Poly- L-Lysin-behandelten Mikrotitervertiefungen zugesetzt, die 5 x 10&sup4; DEAE-Dextran-behandelte CEM-SS-Zellen enthielten, und 3 bis 4 Tage inkubiert. Die Zahl der gebildeten Syncytien wurde unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops gezählt. Die Neutralisationstiter wurden unter Verwendung des 50 % (Vn/Vo=0,5) Neutralisationspunktes ermittelt. Vn stellt die Zahl der Virus-induzierten SFUs in den Testvertiefungen dar und Vo die Gesamtzahl der Virus-induzierten SFUs in der Kontrolle bei alleiniger Zugabe von Nährmedium.
  • Im zweiten Neutralisationstest wurde der Grad der Inhibition der Infektiosität von HIV-1 in H9-Zellen gemessen. In diesem Test wurden 100 µl Virusinokulum (50 TCID&sub5;&sub0;) mit 100 µl Testantikörpern in unterschiedlichen Konzentrationen 1 Stunde bei 37ºC vorinkubiert, bevor 0,75 x 10&sup6; H9-Zellen in 1,5 ml RPMI-1640-Medium, das 15 % fötales Rinderserum, 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 250 E/ml Penicillin, 250 µg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin enthielt, inokuliert wurden. Am siebten Tag wurden die zellfreien Kulturüberstände für einen Test auf das HIV-spezifische p24-Antigen im ELISA gesammelt (Abbott Laboratories, N. Chicago, IL).
  • Ein weiterer Neutralisationstest wurde unter Verwendung von G3-519 bei mehreren HIV-1-Isolaten von Patienten mit einem anderen Verfahren durchgeführt, wie von D. D. Ho et al., N. Engl. J. Med. 321 (1989), 1621, beschrieben. 50 TCID&sub5;&sub0; von HIV-1-Isolaten von Patienten wurden verwendet, um 1 x 10&sup6; PHA-stimulierte periphere mononucleäre Blutzellen (PBMC) von seronegativen HIV-1-Clonen zu infizieren. Unterschiedliche Konzentrationen von Mabs wurden 1 Std. bei 37ºC vor der Infektion mit dem Virus inkubiert. Nach 7 bis 10 Tagen wurden die Kulturüberstände für p24- Tests (nachstehend beschrieben) gesammelt, um die HIV-1-Infektion zu überwachen.
    • 8. HIV-1-Bindung-Inhibitionstest
  • Für die G3-Serie wurde ein Bindung-Inhibitionstest verwendet, wie von D. D. Ho et al. (a.a.O.) beschrieben. Kurz gesagt, ein konzentriertes Präparat von HIV-1- Virionen (10 µl) wurde mit 10 µl Mab (1 mg/ml) 30 Minuten bei R.T. vorbehandelt, bevor es mit C8166-Zellen (5 x 10&sup5;, 30 Minuten bei 37ºC) inkubiert wurde. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und in 25 µl Lösung mit menschlichem anti-HIV- Antikörper, der an FITC (1:50 verdünnt) konjugiert war, suspendiert. Nach 30 Minuten bei 4ºC wurden die Zellen gewaschen, in 1 % Paraformaldehyd fixiert und mit Hilfe der Durchflußcytometrie analysiert.
    • B. Ergebnisse 1. Erzeugung und Charakterisierung des gp120-spezifischen Mab
  • Die sieben Mabs der G3-Serie und der G45-Serie, die durch die hier genauer beschriebenen Verfahren isoliert wurden, reagierten mit anderen HIV-1-Stämmen, beispielsweise HTLV-IIIRF, -MN, -AL, -Z84 und -Z34. Dies wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung der Oberfläche von Virus-infizierten Zellen bestätigt (Tabelle 2). Tabelle 2 Immunfluoreszenzfärbung von anti-CD4-Bindungsbereichs-Antikörpern für H9-Zellen, die mit 6 unterschiedlichen Stämmen von HIV-1a infiziert waren
  • a Die relative Intensität der Immunfluoreszenz wird durch die Anzahl von "+ "-Zeichen wiedergegeben.
  • b Die anderen Mitglieder der G45-Serie wurden nicht auf eine Bindung getestet.
  • Unter Verwendung von Lysaten von mit metabolisch markierten, HTLV- IIIB-, HTLV-IIIRF-, HTLV-IIIAL- und HTLV-IIIWMJ-infizierten H9-Zellen wurden auch die Mabs der G3-Serie durch Radioimmun-Präzipitationstests untersucht. Alle 7 Mabs der G3-Serie fällten sowohl gp120 als auch gp160 von unterschiedlichen HIV-1- Isolaten spezifisch aus, wie in Tabelle 3 zusammengefaßt ist. Dies zeigt ferner die breite Reaktivität dieser Antikörper mit vielen Stämmen von HIV-1. Tabelle 3 Radioimmun-Präzipitationsreaktionen von 7 anti-CD4-Bindungsbereichs-Antikörper der G3-Serie mit gp120 von 4 unterschiedlichen Stämmen von HIV-1a
  • a Die relative Intensität der gp120-Proteinbande der Autoradiogramme wird durch die Anzahl von "+"-Zeichen wiedergegeben.
    • 2. Neutralisation der Infektiosität von HTLV-IIIB. HTLV-IIIRF. HTLV-IIIAL und HTLV-IIIZ54
  • Im Syncytiumbildungstest wurden die Syncytien nach 3 oder 4 Tagen gezählt. Um festzustellen, ob eine gruppenspezifische neutralisierende Immunantwort ein Merkmal der anti-CD4-Bindungsbereichs-Mabs war, wurden HTLV-IIIB- und HTLV- IIIRF-Isolate verwendet, deren vorhergesagte Aminosäuresequenzen von gp120 sich um 21,4 % unterschieden, sowie HTLV-IIIZ84 (von Zaire) und HTLV-IIIAL (von Haiti), die sich bekanntermaßen von den vorstehend beschriebenen Stämmen unterschieden. Die sieben Mabs der G3-Serie zeigten deutlich unterschiedliche neutralisierende Aktivitäten gegen die Isolate HTLV-IIIB und HTLV-IIIRF in Fig. 1 (die Neutralisation dieser Stämme ist in Fig. 1 (A) bzw. Fig. 1 (B) dargestellt). Vn stellt die Gesamtzahl von Virus-induzierten SFU in den Testvertiefungen dar und Vo die Gesamtzahl von Virusinduzierten SFU in der Kontrolle ohne Antikörper. Die ID&sub5;&sub0; (Dosis mit 50 % Inhibition, d. h. die Mab-Konzentration, bei der die Infektion von Zielzellen durch HIV-1 um 50 % inhibiert ist) für jeden Mab der G3-Serie sowohl gegen HTLV-IIIB als auch HTLV-IIIRF ist in Tabelle 4 dargestellt. Die Tabelle 4 zeigt ferner die Syncytiumbildungsinhibition von G3-519 und G45-60 gegen HTLV-IIIMN und HTLV- IIIZ84.
  • Die Daten in Fig. 1 und Tabelle 4 legen nahe, daß (wie es sowohl im Syncytiuminhibitionstest als auch den Infektiositätstest bei H9-Zellen gemessen wurde) G3-299 am stärksten HTLV-IIIB neutralisiert, wahrend G3-519 am wirksamsten HTLV- IIIRF neutralisiert. Die Mehrzahl dieser Mabs erfordert hohe Dosen (> 10 µg/ml), um eine 50%ige Neutralisation von zugesetztem HIV-1 zu erreichen.
  • Eine alleinige Messung durch Syncytiuminhibition ergab, daß HTLV-IIIRF und HTLV-IIIMN von G45-60 und G3-519 im wesentlichen gleich stark neutralisiert wurden. G45-60 neutralisierte HTLV-IIIZ84 jedoch wesentlich effektiver.
  • Ähnliche Ergebnisse der HIV-1-Neutralisation wurden für die Mabs der G3- Serie unter Verwendung des Infektiositätstests bei H9-Zellen erhalten. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 4 und Figur 2 zusammengefaßt, wobei Figur 2A die Neutralisation von HTLV-IIIB, Fig. 2B die Neutralisation von HTLV-IIIRF und Fig. 2C die Neutralisation von HTLV-IIIAL darstellt. Figur 2 zeigt die Verringerung des p24-Antigens im Überstand im Vergleich zu der von Kontrollkulturen. Die verwendeten Symbole sind mit denen von Figur 1 identisch. Wiederum neutralisierten die Antikörper G3-299 und G3-519 am wirksamsten HTLV-IIIB bzw. HTLV-IIIRF. HTLV-IIIAL war besonders empfindlich für eine Neutralisation durch G3-508, G3-519, G3-42 und G3-536. Der ID&sub5;&sub0; für G3-508 und G3-519 war für beide weniger als 0,2 µg/ml (Tabelle 4). Mehrere Mabs erforderten mehr als 10 µg/ml zur Neutralisation der Infektiosität von HIV-1 um 50%. Tabelle 4 ID&sub5;&sub0; für bestimmte Mabs in zwei unterschiedlichen Neutralisationstests von HTLV- IIIB, HTLV-IIIRF, HTLV-IIIAL, HTLV-IIIMN und HTLV-IIIZ84
    • 3. Herstellung und Neutralisation von HIV-1-Isolaten von Patienten durch G3-519
  • Eine Neutralisationsstudie wurde unter Verwendung von G3-519 mit einigen primären HIV-1-Isolaten durchgeführt, die aus Plasma von acht AIDS-Patienten aus dem Gebiet von Los Angeles erhalten wurden. Diese primären HIV-1-Isolate wurden zur Infektion von PHA-stimulierten, seronegativen, peripheren, mononukleären Blutzellen ("PBMC") verwendet. Nach 7 bis 10 Tagen wurden die Kulturüberstände, die die viralen Isolate der Patienten enthielten, durch Zentrifugation der Zellkulturen gesammelt. Der Kulturüberstand wurde im p24-ELISA, hergestellt von Abbott Laboratories, Inc., auf die p24-Konzentration getestet.
  • G3-519 zeigte eine neutralisierende Aktivität (ID&sub5;&sub0; < 5 µg/ml) bei vier der acht Patienten, eine eingeschränkte neutralisierende Aktivität bei einem Patienten (ID&sub5;&sub0; &ge; 5 µg/ml) und keine neutralisierende Aktivität bei drei Patienten.
    • 4. Darstellung des Epitops im CD4-Bindungsbereich
  • Zur genaueren Kartierung der Lage des Epitops im CD4-Bindungsbereich auf gp120 wurden 4 Peptide (T15W, I15P, A15S und I15D), von denen jedes das folgende um 5 Aminosäuren überlappte, und das fünfte Peptid Q11K, das als Epitop des Mab 5C2E5 identifiziert wurde (L. A. Lasky et al., a.a.O.), synthetisiert (Tabelle 1). Ein ELISA mit dieser Gruppe von Peptiden wurde unter Verwendung der sieben Mabs durchgeführt. Sämtliche Mabs binden I15P sehr stark (OD > 1,0), jedoch nicht seine benachbarten Peptide (OD < 0,1) (Tabelle 5). Es ist interessant festzustellen, daß das Peptid Q11K (L. A. Lasky et al. (a.a.O.)), ein Peptid aus elf Aminosäuren, das mit Ausnahme des N-terminalen Glutamins fast vollständig im Peptid I15P enthalten ist, keine merkliche Reaktivität mit einem der sieben Mabs unter diesen experimentellen Bedingungen zeigte. Tabelle 5 Reaktivität von Mabs mit synthetischen Pedtiden im ELISAa, die vom Gen für das HIV- 1-Hüllgen codiert werden
  • a Das ELISA-Verfahren ist in "Materialien und Verfahren" beschrieben. Die Meßdaten dieser Mabs gegen Beschichtungen aus unterschiedlichen synthetischen Peptiden werden bei einer OD von weniger als 0,1 als negativ (-) und bei einer OD von mehr als 1,0 als positiv (+) angesehen.
    • 5. Inhibition der Bindung von HIV-1 an CD4&spplus;-Zellen
  • Wie in Fig. 3 dargestellt, zeigten alle sieben gegen die Aminosäuren 423 bis 437 von gp120 gerichteten Mabs der G3-Serie eine bedeutende Inhibition der Bindung von HTLV-IIIB (leerer Balken) oder HTLV-IIIRF (schraffierter Balken) an CD4&spplus;- C8166-Zellen. Diese monoclonalen Antikörper sind in Figur 3 wie folgt bezeichnet: G3- 519 (4), G3-508 (5), G3-42 (6), G3-211 (7), G3-299 (8), G3-536 (9) und G3-537 (10). Weitere Reagentien sind: AIDS-Serum (1), normales menschliches Serum (2) und BAT- 123 (3). Trotz der wesentlichen Unterschiede in der Fähigkeit zur Neutralisation von HIV-1, wie vorstehend gezeigt, war die Inhibitionswirkung dieser Mabs auf die spezifische Bindung von HIV-1 an die CD4&spplus;-C8166-Zellen vergleichbar. Im Gegensatz dazu hatte BAT123, ein für die zentrale hypervariable Schleife von gp120 (Aminosäurereste 300 bis 330, Fung et al., a.a.O.) spezifischer Maus-Mab, keine Wirkung auf die Bindung von HIV-1 an die Zielzellen.
    • 6. Reaktivität von Serum von HIV-1-infizierten Personen mit dem CD4- Bindungsbereichs-Peptid T35S
  • Serumproben von Patienten mit AIDS (N=30) oder ARC (N=16), asymptomatischen HIV-1-seropositiven Personen und normalen gesunden Spendern (N=10) wurden durch eine ELISA-Analyse auf eine Reaktivität mit dem Peptid T35S getestet. Für jede Serumprobe wurde ein OD-Wert als Differenz zwischen der durchschnittlichen Absorption von zwei Peptid-beschichteten Vertiefungen und zwei PBS-behandelten Vertiefungen berechnet. Der Subtraktionswert der OD (0,075) war die durchschnittliche OD + 2SD für 10 seronegative Serumproben. Die Ergebnisse des ELISA (Fig. 4) zeigten, daß sich die Immunreaktivität von AIDS- oder ARC-Patientenseren nicht wesentlich von der von normalen Kontrollproben unterschied. Unter den untersuchten 30 AIDS- und 19 ARC-Patienten wurden keine nachweisbaren Antikörper gegen das Peptid T35S festgestellt. Nur die Serumproben von zwei der 16 asymptomatischen seropositiven Personen gaben Signale, die wesentlich oberhalb des Subtraktionswerts lagen.
    • Beispiel 2 Immunkonjugate aus PAP-S und Mabs
  • Immunkonjugate können durch chemische Kupplung von unterschiedlichen neutralisierenden monoclonalen murinen Antikörpern, die die CD4-Bindungsdomäne von gp120 von HIV-1 erkennen, mit PAP-S über eine Disulfidbrückenbindung hergestellt werden. Diese Immunkonjugate, beispielsweise G3-519-PAP-S, können eine spezifische Cytotoxizität gegen mit unterschiedlichen Stämmen und Isolaten von HIV-1 infizierte menschliche T-Zellen zeigen. Die vorstehend beschriebenen Epitopkartierungs- Untersuchungen unter Verwendung von synthetischen Polypeptiden zeigten, daß der Mab G3-519 einen relativ konservierten Bereich (Aminosäuren mit den Nummern 423 bis 433) von gp120 erkannte.
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung und Wirksamkeit eines Immunkonjugats, das Kermesbeere-Antivirusprotein (PAP-S) und mit einem Epitop auf dem CD4-Bindungsbereich von gp120 reagierende Mabs umfaßt.
    • A. Materialien und Verfahren 1. Reinigung von PAP-S
  • PAP-S wurde von Samen von Phytolacca americana (Kermesbeere) unter Verwendung eines Verfahrens von Barbieri et al. (L. Barbieri et al., Biochem. J. 203 (1982), 55-59) gereinigt. Kurz gesagt, Samen der Kermesbeere (100 g) wurden in 500 ml 5 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) homogenisiert. Unlösliche Materialien und Lipid wurden nach der 1-stündigen Zentrifugation bei 10 000 x g entfernt. Der Überstand wurde auf eine mit 5 mM Phosphatpuffer äquilibrierte CM-Sepharose-"Fast Flow" (Pharmacia, Piscataway, NJ)-Säule aufgetragen. Nach dem Waschen wurden die gebundenen Proteine mit einem NaCl-Gradienten (0 bis 0,3 M) eluiert. Der Peak, der die Aktivitat der Ribosomen-Inaktivierung enthielt, wurde vereinigt und gegen PBS unter Verwendung einer Membran mit einer oberen Ausschlußgrenze für ein Molekulargewicht von 10 000 Dalton dialysiert.
    • 2. Konjugation von Antikörper und Toxin
  • Mab G3-519 (10 mg) wurde mit dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (Pharmacia) in einem Molverhältnis von 1:3 umgesetzt, wie von Carlsson et al. (J. Carlsson et al., Biochem. J. 173 (1978), 723- 737) beschrieben. Kermesbeere-Antivirusprotein (6 mg) wurde mit 2-Iminothiolan in einem molaren Verhältnis von 1:3 umgesetzt, wie von R. Lambert et al., Biochemistry 17 (1978), 406-416, beschrieben. Die überschüssigen Chemikalien wurden durch Gelfiltration unter Verwendung einer 10PD-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) entfernt. Der chemisch modifizierte Antikörper und PAP-S wurden vereinigt und 2 Stunden bei R.T. oder über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nicht-konjugiertes PAP-S wurde durch Gelfiltration auf einer mit PBS äquilibrierten Sephacryl S-200 (HR)-Säule entfernt. Die den Antikörper und das Konjugat enthaltenden Peaks wurden vereinigt, auf 10 ml konzentriert und anschließend gegen 5 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, dialysiert. Die dialysierten Proben wurden auf eine Mono S (Pharmacia)-Säule aufgetragen und die Immunkonjugate unter Verwendung eines NaCl-Gradienten aus der Säule eluiert. Die Zusammensetzung des Immunkonjugats wurde durch eine 7,5%ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Fast System, Pharmacia) zusammen mit Molekulargewichtsmarkern (Bio- Rad) analysiert.
    • 3. Cytotoxizitätstest von Immunkonjugaten
  • Die Fähigkeit des G3-519-Immunkonjugats zum Abtöten von HIV-infizierten Zellen wurde durch Inhibition der [³H]-Thymidin-Aufnahme durch infizierte Zellen getestet. H9-Zellen, die mit HIV-1-Stämmen (HTLV-IIIB, HTLV-IIIRF und HTLV- IIIMN) entweder nicht-infiziert oder chronisch infiziert waren, wurden in der log-Phase in RPMI-1640-Medium gehalten, dem 15 % Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum, 100 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zugesetzt waren. Es wurden 180 µl mit 5 x 10&sup4; Zellen/ml in alle Vertiefungen einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte gegeben. Es wurden 20 µl gereinigtes Immunkonjugat von 5fachen Verdünnungsreihen (100 µg/ml bis 160 ng/ml) den Vertiefungen in dreifacher Ausführung zugesetzt. Die Kontrollen waren ein irrelevantes Immunkonjugat von PAP- S oder ein Gemisch des nicht-konjugierten Antikörpers und PAP-S in äquivalenten Konzentrationen unter identischen Bedingungen. Die Zellkulturen wurden 24 Stunden bei 37ºC gehalten und mit 1 µCi (³H)-Thymidin pro Vertiefung weitere 4 Stunden pulsförmig behandelt. Die Zellen wurden auf Glasfaserfiltern unter Verwendung eines Skatron-Zellerntegeräts geerntet und das auf dem trockenen Filter zurückgehaltene (³H)- Thymidin wurde durch Scintillationszählung gemessen. Die Inhibition der Aufnahme von Thymidin in die Zellen wurde berechnet, indem die Radioaktivität von Testkulturen mit der der Kontrolle verglichen wurde.
  • Zur Untersuchung der spezifischen Zelltötung durch das Immunkonjugat wurden Experimente unter Verwendung von nicht-konjugiertem Mab als Konkurrenz des Konjugats durchgeführt. Es wurden 0,6 µg/ml G3-519-PAP-S, das 55 % der Thymidin- Aufnahme inhibierte, in der Untersuchung verwendet. Die infizierten H9-Zellen wurden mit den nicht-konjugierten Mabs 30 Minuten bei 37ºC vor der Zugabe von G3-519- PAP-S inkubiert.
    • B. Ergebnisse 1. Reinigung und Charakterisierung des G3-519-Immunkonjugats
  • Das G3-519-Immunkonjugat wurde aus der Mono-S-Säule als einzelner Peak bei einer NaCl-Konzentration von 110 mM eluiert. Bei einer Analyse durch 7,5 % SDS- PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen konnte der Peak jedoch in zwei Proteinbanden aufgespalten werden, einer Bande mit höherem Molekulargewicht, die das zwei Moleküle PAP-S pro Molekül Antikörper enthaltende Konjugat darstellte, und einer Bande mit geringerem Molekulargewicht, die ein Konjugat mit einem Molekül PAP-S pro Antikörpermolekül darstellte. Eine densitometrische Analyse von Coomassie-Blau-gefärbten Gelen zeigte, daß das Konjugat mit höherem Molekulargewicht etwa 25 % der gesamten Immunkonjugate ausmachte. Die Bindungsaktivität des Immunkonjugats, die im ELISA unter Verwendung von synthetischen Oligopeptiden einschließlich des Bindungsepitops von G3-519 ermittelt wurde, zeigte keine Behinderung der Antikörperbindungs-Aktivität nach der Konjugation.
    • 2. Cytotoxizität von G3-519-PAP-S für HIV-1-infizierte Zellen
  • H9-Zellen, die mit den drei verschiedenen Stämmen von HIV-1 getrennt infiziert wurden, zeigten alle eine Empfindlichkeit für eine G3-519-PAP-S-Behandlung (Fig. 5). Die Symbole sind: nicht-infizierte H9-Zellen (gefüllte Dreiecke), HTLV-IIIB- infizierte H9-Zellen (leere Kreise), HTLV-IIIMN-infizierte H9-Zellen (leere Dreiecke) und HTLV-IIIRF-infizierte H9-Zellen (leere Vierecke). Das Immunkonjugat tötete HTLV-IIIMN-infizierte H9-Zellen effektiver (IC&sub5;&sub0; = 1,4 x 10&supmin;¹&sup0; M) als HTLV-IIIB- infizierte H9-Zellen (IC&sub5;&sub0; = 1,7 x 10&supmin;&sup9; M). G3-519-PAP-S war bis zu einer Konzentration von 5,3 x 10&supmin;&sup8; M für nicht-infizierte H9-Zellen nicht cytotoxisch.
    • 3. Spezifische Cytotoxizität von Immunkonjugaten
  • Die Spezifität des G3-519-Immunkonjugates für Zielzellen wurde durch Antikörperblockierungs-Experimente untersucht. Wie in Fig. 6 dargestellt, konkurrierten zugesetzte nicht-konjugierte G3-519 (leere Balken) vor der Inkubation der Zielzellen mit den Immunkonjugaten mit den Immunkonjugaten um die Zellbindung und blockierten effizient die Cytotoxizität der Immunkonjugate in einer Dosis-abhängigen Weise. Die Zahlen der X-Achse zeigen die Konzentration des nicht-konjugierten Antikörpers in µg/ml.
  • Wie vorstehend beschrieben, inhibierten 0,6 µg/ml G3-519-PAP-S 55 % der Thymidinaufnahme durch HTLV-IIIB-infizierte H9-Zellen. In Gegenwart eines 50fachen Überschusses von Mab G3-519 inhibierte das Immunkonjugat 13 % der Thymidin-Aufnahme. Ein irrelevanter Mab für hCG (schraffierte Balken) inhibierte die Cytotoxizität der Immunkonjugate selbst bei einem 200fachen Überschuß dieses Antikörpers nicht.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß G3-519-PAP-S H9-Zellen, die mit drei unterschiedlichen Stammen von HIV-1 infiziert waren, spezifisch abtötete und daher gegen unterschiedliche Stämme wirksam ist. Weitere Antikörperkonjugate gegen den CD4- Bereich sollten ebenfalls wirksam im Abtöten von Zellen sein, die mit unterschiedlichen HIV-1-Isolaten und -Stämmen infiziert sind.

Claims (13)

1. Monoclonaler Antikörper, der an die Aminosäuresequenz IINMWQKVGKAMYAP im CD4-Bindungsbereich des gp120 von HIV-1 bindet und der Neutralisierungsaktivität gegen HIV-1 in einem Syncytiumbildungstest unter Verwendung von CEM-SS-Zellen zeigt.
2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der die Infektion von T-Zellen durch unterschiedliche Stämme und unterschiedliche Isolate von HIV-1 hemmt.
3. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der von der Maus stammt.
4. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 3, der vom IgG- Isotyp ist.
5. Antikörperkonjugat, umfassend einen monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, konjugiert mit einem cytotoxischen Mittel, einem Antivirusmittel oder einem Mittel, das die Überwindung der Bluthirnschranke erleichtert.
6. Arzneimittel, enthaltend eine therapeutische Menge eines monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Antikörperkonjugat nach Anspruch 5.
7. Kontinuierliche, stabile, Antikörper produzierende Zellinie, die einen monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 produziert.
8. Zellinie nach Anspruch 7, die ein Hybridom ist.
9. Zellinie nach Anspruch 8, die ein transfiziertes Myelom ist, das einen chimeren Tier/Mensch-Antikörper produziert.
10. Zellinie nach Anspruch 9, wobei der chimere Antikörper ein Maus/Mensch-Antikörper ist.
11. Peptid, bestehend aus der Sequenz IINMWQKVGKAMYAP.
12. Peptid nach Anspruch 11, gekoppelt an ein Trägerprotein.
13. Antiidiotypischer monoclonaler Antikörper, der an einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet.
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