DE3889945T2 - Methoden und Materialien für die HIV-Erkennung und Therapie. - Google Patents
Methoden und Materialien für die HIV-Erkennung und Therapie.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Sinne Verfahren und Substanzen, die für die Diagnose und Behandlung von Infektionen mit dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV) geeignet sind. Im engeren Sinne betrifft die Erfindung immunologisch aktive Polypeptide, vorzugsweise Antikörper oder Antikörperfragmente sowie im günstigsten Falle monoklonale Antikörper, die mit Idiotypen von Antikörpern gegen das Protein des menschlichen T4-Lymphozyten und ebenso mit dem HIV-Virion (HIV-Viruspartikel) reagieren in einer Weise, die es gestattet, die HIV-Infektiosität in vitro und in vivo zu neutralisieren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung immunologisch aktive Polypeptide, die für Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden können, um Schutzreaktionen gegen die HIV-Infektion zu entwickeln.
- Der gegenwärtige Kenntnisstand hinsichtlich der Epidemiologie und Immunologie des Verursachers von AIDS beim Menschen wird zusammenfassend dargestellt in: Laurence, "The Immune System in Aids", Scientific American, Dezember 1985, S. 84-93; Gallo, "The First Human Retrovirus", Scientific American, Dezember 1986,S. 88-98; Gallo, "The AIDS Virus", Scientific American, Januar 1987, S. 47-56; Levy et al., Science, 225, 840- 842 (1984); "Mobilizing Against AIDS", Institute of Medicine, National Academy of Sciences, Harvard-University Press (Cambridge, Mass. 1986) und Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3, S. 477-500 (1985). Sehr umfassend wurde die Rolle des T4-Oberflächenglykoproteins (gelegentlich als "CD4"-Protein oder Determinante bezeichnet) der menschlichen T-Lymphozyten bei HIV-Infektionen untersucht, wie von Dalgleish et al., Nature, 312, S. 763-767 (1984); Klatzmann et al., Science, 312, 767-768 (1986); Klatzmann et al., Science, 225, S. 59-62 (1984); McDougal et al., J. Immunol., 135, S. 3151-3162 (1985) und Maddon et al., Cell, 47, S. 333-348 (1986) dargelegt wird. Siehe auch Marrack et al., "The T Cell and Its Receptor", Scientific American, Februar 1986, S. 36-45 und McDougal et al., Science, 231, 382-385 (1986).
- Seit einiger Zeit wird in Betracht gezogen, daß lösliche Formen von CD4 möglicherweise einen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von HIV-Infektionen haben. Siehe Fisher et al., Nature, 331, 76-77 (1988); Hussey et al., ibd., auf S. 78-81; Deen et al., ibd., S. 82-83, sowie Traunecker et al., ibd., auf S. 84-86, die sich alle auf eine in vitro-Neutralisierung der HIV-Infektiosität mittels löslichem CD4 beziehen. Zu den möglichen Nachteilen der vorgeschlagenen Verwendung von Therapeutika mit löslichem CD4 gehört die bekannte Reaktivitätvon CD4 mit Molekülen der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes ("MHC"), die sich auf der Oberfläche anderer Immunzellen, darunter B-Zellen, Makrophagen und Monozyten, befinden, was zu der Vermutung führt, daß CD4 vor dem beabsichtigten therapeutischen Einsatz modifiziert werden müßte (z. B. durch Verkürzung). Zahlreiche Berichte in der Fachliteratur beziehen sich auf das Potential von Antikörpern, die Infektiosität von HIV in vitro und in vivo zu neutralisieren, und insbesondere auf Versuche zur aktiven Immunisierung mit der Zielstellung, eine Immunität nach Antigenkontakt zu entwickeln. Siehe z. B. Matthews et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 83, S. 9709-9713 (1986); Norman, "AIDS Therapy: A New Push For Clinical Trials", Science, 230, S. 1355- 1358 (1985) und vorhergehende Artikel in dieser Reihe; Newmark, Nature, 2314, S. 304- 305 (1986) sowie Anmerkungen in Scientific American, Februar 1987 auf den Seiten 86- 88 unter der Überschrift "AIDS: Hope...And Warnings" und in New Scientist, 18. Dezember 1986, Seite 7 unter der Überschrift "Can Protein T Thwart The AIDS Virus...?". Siehe auch Mitsuya et al., Nature, 352, 773-778 (1987); Kennedy et al., Science, 231, 1556- 1559 (1986); Chanh et al., EMBO Journal, 5 (11), 3065-3071 (1986); Chanh et al., Eur. J. Immunol., 16, 1465-1468 (1986); Putney et al., Science, 2314, 1392-1395 (1986) und Matsushita et al., Abstract W.3.2, S. 106, "III International Conference on Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)", 1. bis 5. Juni 1987.
- Für den Hintergrund der vorliegenden Erfindung sind die veröffentlichten Untersuchungsergebnisse hinsichtlich der immunologischen Rolle von Anti-Idiotypen interessant. Siehe z. B. Kennedy et al., "Anti-Idiotypes and Immunity", Scientific American, Juli 1986,5. 40- 56; Jerne, "The Immune System", Scientific American, Juli 1973, S. 52-60; Marx, "Making Antibodies Without The Antigens", Science, 228, S. 162-165 (1985); Finberg et al., CRC Critical Reviews in Immunology, 7, 269-284 (1987) und Kennedy et al., Science, 232, S. 220-223 (1986). Siehe auch Norman, a. a. O., der sich auf die mögliche Wechselbeziehung zwischen Anti-HIV-Immuntherapie und Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern gegen die HIV-Oberflächenproteine bezieht.
- Von besonderem Interesse für den Hintergrund der vorliegenden Erfindung ist die Arbeit von McDougal et al., J. Immunology, 137, 2937-2944 (1986), in der angemerkt wurde, daß: "...anti-idiotypische Kaninchen-Sera, die gegen jeden von vier in Frage kommenden monoklonalen CD4-Antikörpern [OKT4A, OKT4D, OKT4F und Leu3a (zuweilen als "Anti- Leu3a" bezeichnet)] eingesetzt wurden, nicht mit dem [HIV] Virus reagierten oder die Virusbindung an CD4&spplus;-T-Zellen hemmten." Diese Bemerkung verdient einen Vergleich mit den kürzlich gemachten mündlichen Äußerungen von Ronald C. Kennedy auf dem 7th Annual DNA/Hybridoma Congress, San Francisco, 1. - 4. März 1987, wiedergegeben in Bio/Technology, 5, 421-422 (1987) sowie auf der III International Conference on Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), Washington D.C., 1. - 5. Juni 1987, (s. Abstract TH.9.5), wiedergegeben in New Scientist, 11. Juni 1987 auf Seite 26. In diesen Äußerungen wurde die Entwicklung polyklonaler Antisera gegen Anti-T4-Antikörper erwähnt, ebenso wie die Fähigkeit derartiger Antisera, HIV zu erkennen sowie insbesondere HIV auf infektiösem Weg in vitro zu neutralisieren. In der zweiten Äußerung wurde auch die Herstellung monoklonaler anti-idiotypischer Antikörper erwähnt, wobei diese Entwicklung auch in Chanh et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 84, 3891-3895 (Juni 1987) beschrieben wird.
- WO-A-88101303 schlägt löslische Fragmente der Aminosäuresequenz, die einen Bestandteil eines T4-Glykoproteins (der Zellrezeptor für HIV) darstellen, sowie aus solchen Fragmenten zubereitete immunologische Substanzen vor. Allerdings gibt es keinen Hinweis darauf, daß dieser Vorschlag jemals ausgeführt wurde, noch werden die Eigenschaften der Endprodukte offenbart.
- Nach wie vor besteht in der Fachwelt ein dringender Bedarf an neuen Substanzen für die Diagnose des Vorhandenseins von HIV-Partikeln und HIV-infizierten Zellen in biologischen Flüssigkeiten und Gewebeproben sowie ein dringender Bedarf an neuen Mitteln, eine Neutralisierung der Infektiosität von HIV in vivo zu bewirken, sowie an der Entwicklung von Impfverfahren, die einen immunologischen Schutz gegen die HIV-Infektion erzeugen. Gemäß der Erfindung wird ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid in Form eines Antikörpers oder schimären Antikörpers oder eines ihrer Fragmente zur Verfügung gestellt, das zur spezifischen Immunbindung an das HIV-Virion oder an die Oberfläche HIV-infizierter Zellen in der Lage ist, gekennzeichnet durch die Fähigkeit, die Infektiosität von HIV in vitro zu neutralisieren, und durch die spezifische Immunreaktivität mit einem Antikörper, der für den menschlichen T4-Lymphozyten immunspezifisch ist.
- Die vorliegende Erfindung sieht gereinigte und isolierte, immunologisch aktive Polypeptide vor, die mit Idiotypen von Antikörpern (vorzugsweise monoklonalen Antikörpern) gegen das Protein des menschlischen T4-Lymphozyten reagieren. Diese erfindungsgemäßen Produkte sind zur spezifischen Immunbindung mit dem Bestandteil des HIV-Virions fähig, der notwendigerweise mit T4-Oberflächenproteinen während der HIV-Infektion von Wirtszellen wie menschlichen T-Lymphozyten und Zellen des menschlichen Nervensystems reaktiv ist. Die erfindungsgemäßen Produkte lassen sich kennzeichnen u.a. durch ihre stammesunabhängige Fähigkeit zur Neutralisierung der Infektiosität von HIV in vitro, durch ihre spezifische Reaktivität mit HIV-Protein, das ein Molekulargewicht von rund 60.000 bis rund 80.000 gemäß SDS-PAGE aufweist, sowie durch ihre Nicht-Reaktivität mit Molekülen der Haupthistokompatibilitätsklasse II, die sich auf der Oberfläche menschlicher Immunzellen befinden.
- Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden demzufolge immunologisch aktive Produkte hergestellt, die mittels spezifischer Immunbindung an HIV-Partikeln und an die Oberflächen HIV-infizierter Zellen "antworten", obwohl sie ohne unmittelbaren immunologischen Bezug auf diese Oberflächenproteine erzeugt wurden.
- Erfindungsgemäße gereinigte und isolierte Polypeptide eignen sich in bemerkenswerter Weise für den Einsatz in Versuchsverfahren zum Nachweis und/oder zur Mengenmessung von HIV in biologischen Flüssigkeiten, wobei das Nachweisverfahren auf der Immunbindung zwischen HIV-Partikeln und reaktiven Polypeptiden (z. B. Antikörpern) der Erfindung beruht. Darüber hinaus verhalten sich erfindungsgemäß entwickelte Antikörper, schimäre Antikörper sowie ihre Fragmente auf selektive Weise immunreaktiv mit den Oberflächen HIV-infizierter Zellen und stellen somit brauchbare Reagenzien dar für den Nachweis HIV- infizierter Zellen in Flüssigkeiten und Gewebeproben sowie für die Aussonderung HIV- infizierter Zellen aus Zellpopulationen, die sowohl infizierte als auch nichtinfizierte Zellen enthalten. In diesem Sinne werden sich die erfindungsgemäßen Produkte als nützlich erweisen bei diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen, zu denen die Aussonderung und/oder selektive Zerstörung HIV-infizierter Zellen gehören.
- Gereinigte und isolierte immunologisch aktive erfindungsgemäße Substanzen eignen sich außerdem ausgezeichnet zur Verwendung bei der Anti-HIV-Behandlung von Lebewesen, insbesondere des Menschen, die für die Infektion mit HIV anfällig sind. So werden bei einem dieser Verfahren immunologisch wirksame Mengen von beispielsweise erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern entweder einem Patienten verabfolgt, der bereits mit HIV infiziert ist, oder einem Patienten, bei dem die Gefahr einer HIV-Infektion besteht, um eine passive Immunität hinsichtlich der HIV-Infektion aufzubauen. Bei einem weiteren Verfahren werden HIV-infizierte Zellen beispielsweise einer in vitro-Abtrennung von nichtinfizierten Zellen des Patienten unterzogen, wobei die letzteren dem Patienten wieder zugeführt werden können.
- In der folgenden ausführlichen Beschreibung wird dargelegt, daß sich die erfindungsgemäßen antikörperähnlichen Polypeptide vorzugsweise gewinnen lassen, indem zunächst m onospezifische Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper) gegen das Glykoprotein des menschlichen T4-Lymphozyten (die CD4-Determinante) entwickelt werden und anschließend Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper) gegen den T4-idiotypischen Bereich der im ersten Schritt gebildeten Antikörper erzeugt werden.
- Schimäre Antikörper und ihre Fragmente sowie insbesondere bispezifische Antikörper liegen als Produkte ebenfalls im Erwägungsbereich der vorliegenden Erfindung, ebenso wie antikörperähnliche Produkte, die in mikrobiellen Wirten (z. B. prokaryontischen und eukaryontischen Zellen in Kultur) erzeugt werden, wobei die Wirte mit DNA-Sequenzen transformiert oder transfiziert werden, die den Kode für die gewünschten Polypeptid- Produkte enthalten.
- Sind die morphologischen Daten hinsichtlich der idiotypischen Bereiche der erfindungsgemäßen Antikörper bekannt, wird es beispielsweise möglich, prokaryontische und eukaryontische Zellen wie kultivierte E.Coli-, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen einzusetzen, um brauchbare Antikörperfragmente (wie fab'- und f(ab')&sub2;-Fragmente) zu erzeugen. Außerdem wird bei der Erfindung in Erwägung gezogen, schimäre Antikörper (z.B. Maus-/Mensch-Antikörper) zu präparieren, indem transformierte Myelom- oder Hybridom-Zellen von Mäusen (insbesondere mutierte Zellen mit Deletion der schweren Kette) als Erzeugerwirte eingesetzt werden. Hybride Hybridom-Zellen, die bispezifische Antikörper für diagnostische und therapeutische Zwecke erzeugen, werden in Erwägung gezogen. Weiterhin könnten Rekombinationsverfahren zur Herstellung von HIV-Spaltimpfstoffen angewendet werden. Beispielsweise werden sich erfindungsgemäße monoklonale Antikörper voraussichtlich äußerst gut eignen, um Expressionsprodukte der HIV-DNA in transformierten oder transfizierten viralen oder prokaryontischen Wirten darzustellen, so daß eine DNA isoliert werden kann, die die Aminosäuresequenz natürlich vorkommender und immunologisch signifikanter HIV-Proteine (einschließlich der Glykoproteine) insgesamt oder teilweise kodiert. In geeigneten Wirten könnte die Anwesenheit einer derartigen DNA eine hochgradige Produktion von Impfstoffen ermöglichen.
- In einer bevorzugten Form sieht die Erfindung antikörperähnliche Polypeptide vor, die als monoklonale Antikörper gegen monoklonale menschliche T4-Lymphozyten gekennzeichnet sind. Besonders werden monoklonale Anti-OKT4- und Anti-OKT4A-Antikörper bevorzugt, die beide mit HIV-Proteinen von 60...80 kD reagieren. Der größte Vorzug wird gegenwärtig den monoklonalen Anti-OKT4A-Antikörpern gegeben, die über eine beachtliche Fähigkeit zur in vitro-Neutralisierung der HIV-Infektiosität mehrerer HIV-Stämme verfügen und die sich partizipierend bei der Komplement-vermittelten Zytolyse HIV-infizierter Zellen verhalten.
- In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung erstmalig Hybridom-Zellinien zur Verfügung, die "anti-idiotypische" monoklonale Antikörper produzieren, die eine spezifische Immunreaktivität mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Protein des menschlichen T4-Lymphozyten im Rahmen einer Antigen-/Antikörperreaktion aufweisen. In beispielhafter Weise stellt die vorliegende Erfindung neue murinabgeleitete Hybridom- Zellinien zur Verfügung: JT4C8, JT4C12 und JT4C16, JT1-1F3, JT1-1F3-E5, JT1-D7 und JT2-N15,die alle als Bestandteil ihres Überstandes bei Kulturzüchtung einen monoklonalen Antikörper produzieren, der spezifisch mit dem Anti-T4-Idiotyp und außerdem mit HIV- Virionproteinen auf eine Art reagiert, die erwartungsgemäß sowohl eine in vitro- als auch eine in vivo-Neutralisierung der HIV-Infektiosität gestattet.
- Die Hybridom-Zellinie JT4C8 wurde am 18. Februar 1987 in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, beim United States Department of Agriculture, Plum Island, New York unter A.T.C.C. Accession No. HB9385 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie JT4C12 wurde am 18. Februar 1987 in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, beim United States Department of Agriculture, Plum Island, New York unter A.T.C.C. Accession No. HB9387 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie JT4C16 wurde am 18. Februar 1987 in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, beim United States Department of Agriculture, Plum Island, New York unter A.T.C.C. Accession No. HB9386 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie JT1-1F3 wurde am 25. Juni 1987 in der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, U. K. unter ECACC Accession No. 87062501 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie JT1-1F3-E5 wurde am 25. Juni 1987 in der European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, U. K. unter ECACC Accession No. 87062502 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie JT1-D7 wurde am 29. Januar 1988 im Fermentation Research Institute, Ibaragi-ken, Japan unter Accession No. FERM BP-1685 hinterlegt. Die Hybridom-Zellinie JT2-N15 wurde am 29. Januar 1988 im Fermentation Research Institute, Ibaragi-ken, Japan unter Accession No. FERM BP-1684 hinterlegt.
- In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von HIV-Spalt- impfstoffen mittels allgemein bekannter Affinitätsreinigungsverfahren vor, wobei HIV- Proteinfraktionen (besonders solche im Molekulargewichtsbereich von rund 60.000 bis rund 80.000 sowie insbesondere zwischen rund 65.000 und 67.000) isoliert werden, indem Immunabsorbenzien Verwendung finden, die unter Einsatz der erfindungsgemäßen Antikörper präpariert wurden.
- Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand anschaulicher Beispiele und Beschreibungen zur Ausführung der Erfindung näher erläutert unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen:
- Die Figuren 1, 2 und 3 stellen die Ergebnisse der Immunreaktivitätsuntersuchungen von erfindungsgemäßen Antikörpern mit Proteinen HIV-infizierter und nichtinfizierter Zellen grafisch dar.
- Die Figuren 4 und 5 veranschaulichen Immun-Blot-Versuchsergebnisse, die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern und HIV-Proteinen durchgeführt wurden.
- Die Figuren 6A bis 6E zeigen fotografische Ergebnisse von Immunfluoreszenz-Färbungsversuchen auf infizierten und nichtinfizierten Zellen, wobei erfindungsgemäße Antikörper eingesetzt wurden.
- Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Ausführung der Erfindung bei der Erzeugung einer Reihe von Hybridom-Zellinien einschließlich JT4C8, JT4C12, JT4C16, JT1-1F3, JT1-1F3- E5, JT1-D7 und JT2-N15, die Isolierung monoklonaler Antikörper gegen Anti-CD4 aus ihnen sowie die Verstärkung und Charakterisierung solcher monoklonaler Antikörper. Insbesondere Beispiel 1 bezieht sich auf die Stimulierung eines murinen Wirts zur Erzeugung von Antikörpern gegen den handelsüblichen monoklonalen Anti-T4-Antikörper "OKT4", auf die Fusion von Milzzellen mit Myelom-Zellen, auf die Aussonderung, Klonierung und Züchtung von Hybridom-Zellen sowie auf die Isolierung monoklonaler Antikörper aus ihnen. Beispiel 2 betrifft die Charakterisierung der auf diese Weise produzierten monoklonalen Antikörper durch Fluoreszenz-Immuntests, durch Western-Blot-Tests zur Bestimmung der Reaktivität mit HIV-Protein sowie durch Untersuchungen bezüglich der Fähigkeit, eine in vitro-Neutralisierung der HIV-Infektiosität zu bewirken. Beispiel 3 stellt ein erstes Verfahren dar zur Erzeugung von Hybridom-Zellinien, die in ihrem Nährmedium in der Lage sind, monoklonale Antikörper gegen den handelsüblichen Antikörper "OKT4A" zu produzieren. Beispiel 4 bezieht sich auf die Charakterisierung derart produzierter Antikörper mittels Immunfluoreszenz-Bestimmung, Western-Blot-Bestimmung, Bestimmung der in vitro-Neutralisierung, ELISA-Bestimmung sowie Bestimmung der Fluoreszenz-Zellfärbung. Beispiel 5 zeigt ein zweites Verfahren zur Erzeugung von Hybridom-Zellinien, die in ihrem Nährmedium monoklonale Antikörper gegen den handelsüblichen Antikörper "OKT4A" produzieren können, sowie die Charakterisierung derart erzeugter Antikörper mittels Western-Blot-Bestimmung und Bestimmung der in vitro-Neutralisierung.
- Hybride Tumor-Zellinien werden erzeugt, indem immunologische Standardverfahren angewendet werden, wie sie in Oi und Herzenberg, Selected Methods Cell Immunology, 351-372 (1979) und Godding, "Antibody Production By Hybridomas", J.Immunol.Meth., 39, S. 285-308 (1980) beschrieben werden. Milzzellen von Mäusen, die mit monoklonalem Anti-T4 hyperimmunisiert wurden, werden mit einer Mäuse-Myelom-Zellinie in Anwesenheit von Polyethylenglykol fusioniert. Der Überstand der Züchtung aller "Hybridom"- Zellkulturen wird auf das Vorhandensein der gewünschten Antikörperaktivität hin untersucht. Ausgewählte Hybridom-Zellen werden kloniert, um Zellinien fortzupflanzen, die in dem Überstand ihrer Kultur einen Antikörper erzeugen, der eine hochspezifische Anti-anti- T4-Aktivität aufweist.
- BALB/C-Mäuse wurden jeweils einer Milzinjektion mit monoklonalem Antikörper gegen den menschlichen T4-Lymphozyten unterzogen (OKT4 Ortho Diagnostics Rahway, N.J.).
- Ein Milligramm der gefriergetrockneten OKT4-Substanz wurde in 1 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Dialyse wurde eingesetzt, um den ursprünglichen Phosphatpuffer zu entfernen und durch 50 mM MES-Puffer (Sigma Chemicals), pH-Wert 6,0, zu ersetzen. Anschließend wurde die Substanz einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-(HPLC)-Trennungmittels eines FPLC -Gerätes (Pharmacia, Laboratory Seperation Division, Piscataway, N.J. 08854) unterzogen. Die Trennung erfolgte mit einer Mono-Q-Säule sowie unter Anwendung empfohlener Verfahren, lediglich der Salzgradient wurde auf 0 bis 0,5 M NaCl geändert. Aliquote Anteile (20ul) aller 0,5-ml-Fraktionen wurden auf ihre Aktivität untersucht, wobei frisch gewonnene menschliche Lymphozyten (10&sup5; Zellen pro ml) Verwendung fanden. Genauer gesagt, die Zellen und HPLC-Fraktionen wurden gemischt und zentrifugiert. Danach wurden die Zellen mehrere Male gewaschen und erneut in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) suspendiert. 5 ug Kaninchen-Antikörper gegen Maus-IgG, markiert mit FITC, wurden mit den Zellen inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Zellgranulat erneut in PBS suspendiert, und die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines fluorimetrischen Zellzählgerätes ermittelt. Die Fraktionen mit der höchsten Aktivität wurden gesammelt, gemäß SDS-PAGE analysiert und erwiesen sich als über 90 % rein.
- Vier Mäusen wurde zunächst eine Milzinjektion von insgesamt etwa 100 ul Impfmaterial verabfolgt (ungefähr 1,5 ug OKT4 pro Maus). Vierzehn und achtundzwanzig Tage danach erhielt jede Maus eine Auffrischungsinjektion von 100 ul Impfmaterial.
- Vier Tage nach der letzten Auffrischungsinjektion wurden die Mäuse getötet. Die Milzen wurden aseptisch entnommen und in Petrischalen (auf Eis) gegeben, die Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco) enthielten. Die Milzen wurden von Fett und Bindegewebe befreit und durch ein rostfreies Stahlsieb mit einer Maschenweite von 100 passiert. Die sich ergebenden einzelnen Milzzellen wurden durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 1000 U/min granuliert. Das Zellgranulat wurde zweimal gewaschen (wie oben) und erneut in RPMI 1640 suspendiert. Die Zellkonzentration wurde durch Zählen in einem Hämozytometer in Gegenwart von 0,2 % Trypanblau bestimmt.
- Aus dem BALB/C-Stammgewonnene Mäuse-Myelom-Zellen NS1/1.Ag4.1 wurden in einem RPMI-1640-Medium gezüchtet, das 15 % hitzeinaktiviertes Pferdeserum (Pel-Freeze) enthielt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugieren über 10 Minuten bei 1000 U/min granuliert und mit antibiotikumfreiem RPMI 1640 gewaschen. Die Zellkonzentration wurden nach erneuter Suspendierung im selben Medium durch Zählen ermittelt. Milz- und NS1/1-Zellen wurden in einem Verhältnis von 4 : 1 kombiniert und 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und eine Zellfusion bei 37 ºC unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) 1500, Molekulargewicht 500...600 durchgeführt. Die Arbeitsschritte erfolgten unter ständigem leichten Rühren, wobei die folgenden Substanzen während der angegebenen Zeitdauer zugegeben wurden: 1,0 ml 50 %ige PEG in RPMI 1640 während einer Minute, wobei eine Minute gerührt wurde; 1,0 ml RPMI 1640 mit 15 % Pferdeserum während einer Minute; 1,0 ml RPMI 1640 mit 15 % Pferdeserum während einer Minute sowie 8 ul RPMI 1640 mit 15 % Pferdeserum während zwei Minuten.
- Die resultierenden fusionierten Zellen wurden 10 Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugiert und wiederum in 15 % Pferdeserum enthaltendem RPMI 1640 suspendiert, das außerdem 100 Einheiten Penicillin G und 100 mg Streptomycin pro ml enthielt. Die Zellen wurden mit einer Menge von jeweils 0,1 ml pro Bohrung auf Platten mit 96 Bohrungen aufgebracht, die zuvor in 5 % CO&sub2; äquilibriert worden waren. Die Platten wurden über Nacht bei 37 ºC in 5 % CO&sub2; inkubiert.
- Am zweiten Tag wurden in jede Bohrung 0,1 ml HAT-Medium (13,6 ug/ml Hypoxanthin, 0,176 ug/ml Aminopterin und 3,88 ug/ml Thymidin) in RPMI 1640, das 15% Pferdeserum enthielt, gegeben. Dieses Medium ermöglicht es, daß Milzzellen-NS1/1-Hybriden überleben und nichtfusionierte NS1/1-Zellen oder Zellen, die mit anderen Zellen fusioniert sind, ausgesondert werden. Nichtfusionierte primäre Milzzellen von ausgewachsenen Mäusen können in Kultur nur wenige Tage überleben.
- Am 3., 4., 6., 9. und 12. Tag wurden 0,1 ml Medium aus jeder Bohrung entnommen und 0,1 ml frisches HAT-Medium in RPMI 1640, das 15 % Pferdeserum enthielt, zugegeben. Am 15., 19., 23. und 27. Tag wurde 0,1 ml Medium aus jeder Bohrung entnommen und durch 0,1 ml RPMI 1640, das 15 % Pferdeserum enthielt, lediglich Hypoxanthin und Thymidin in denselben Konzentrationen wie oben ersetzt. Am 28. Tag wurden die Kulturüberstände von allen Bohrungen untersucht, um OKT4-spezifische Antikörper nachzuweisen.
- Zum Auffinden von Hybridom-Zellinien, die Antikörper gegen OKT4 produzieren, wurde ein Fluoreszenz-gekoppelter Immunabsorbensassay ("FLISA") genutzt. Die Bohrungen von Titrationsplatten mit 96 Bohrungen wurden über Nacht bei 37 ºC mit 100 ul Kalk-Kohlensäure-Lösung abgedeckt, die 3,0 ug/ml Kaninchen-Antikörper gegen Maus-IgGFc enthielt. Die Vertiefungen wurden zehnmal mit 0,05 % Tween 20 enthaltender PBS gewaschen. Sie wurden eine Stunde lang bei 37 ºC mit 20 % Pferdeserum blockiert. Das Blockierungsmittel wurde durch zweimaliges Waschen mit PBS/Tween 20 wie oben entfernt.
- Aliquote Teile von zwanzig Mikroliter der Kulturflüssigkeit aus jeder Hybridom-Bohrung und 80 ul PBS wurden in den beschichteten Bohrungen eine Stunde lang bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Die Bohrungen wurden zehnmal mit 0,05 % Tween 20 enthaltender PBS gewaschen und mit 150 ul/Bohrung Mäuseserum (8 ug /ml) blockiert, 3 Stunden Iang bei 37 ºC und anschließend 2 Stunden lang bei 4 ºC inkubiert.
- 100 ul FITC-markiertes OKT4 (0,3 ug/ml) wurden in jeder Vertiefung über Nacht und im Dunkeln bei 4 ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden zehnmal mit einer PBS-/Tween-20- Lösung wie oben gewaschen. In jede Vertiefung wurden 200 ul einer Lösung aus 5 x 10&supmin;&sup5; N NaOH und 5,6 x 10&supmin;&sup4; N NH&sub4;OH gegeben. Die Platten wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann 1 Minute lang geschüttelt. Nach dem Transfer auf Titertek-Microtiter-Platten vom Format 1 x 8 wurden die Vertiefungen flourimetrisch untersucht (Anregung 490 nm; Abstrahlung 530 nm), wobei ein Mikroplatten-Lesegerät vom Typ MTP 100F von Corona Electric zum Einsatz kam.
- Von den 2710 untersuchten Vertiefungen erwiesen sich 19 als signifikant positiv für eine Reaktion mit OKT4. Die 19 positiven Klone wurden von JT4C1 bis JT4C19 durchnumeriert.
- Das formale Klonieren der aus den positiven Bohrungen gewonnenen Hybridom-Zellen erfolgte durch Strecken auf zusätzliche Bohrungen mit einem solchen Verhältnis, daß etwa 1 Zelle auf 3 Vertiefungen kam. Im allgemeinen erbrachte das formale Klonieren aus einer aktiven Bohrung formale Klone, die sich als Subklone derselben Hybridom-Zelle erwiesen, doch in einigen Fällen ergaben sich nach drei Generationen abweichende Klonpopulationen. Subklone von derselben Ursprungsbohrung wurden mit der Nummer der Ausgangsklone und einer zusätzlichen Nummer versehen (z. B. wurden die aus der Bohrung JT4C7 gewonnenen Klone mit den Bezeichnungen JT4C7-1, JT4C7-2 usw. versehen).
- Um die von den in Beispiel 1 beschriebenen positiven Klonen produzierten Antikörper zu charakterisieren, wurden Tests zur Bestimmung der relativen Affinität der monoklonalen Antikörper gegenüber dem ursprünglichen Immunogen durchgeführt. Die Antikörper wurden außerdem mittels Western-Blot-Analyse auf ihre Immunreaktivität mit HIV-Virion- proteinen hin untersucht, und die Antikörper wurden nach ihrer Fähigkeit zur Neutralisierung der Infektiosität des HIV-Virus bewertet.
- Entsprechend den in Beispiel 1 zur Untersuchung der Antikörper angewendeten allgemeinen Arbeitsschritten wurde eine fluoreszenzgekoppelte Analyse durchgeführt, allerdings mit dem Unterschied, daß verschiedene Verdünnungen von Kaninchen-Antikörpern gegen Maus-IgG Fc in die Testvertiefungen eingebracht wurden. Die Fluoreszenz-Ergebnisse für die aus den Klonen JT4C1 bis JT4C13 und JT4C16 abgeleiteten Antikörper sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 2 zeigt die Fluoreszenz-Ergebnisse für verschiedene Subklone von JT4C7.
- Die Werte in Tabelle 1 zeigen an, daß die Antikörper der Klone JT4C1, JT4C2 und JT4C4 eine relativ hohe Affinität aufweisen. Die Antikörper der Klone JT4C11 und JT4C13 zeigen eine relativ geringe Affinität, während die Antikörper der übrigen untersuchten Klone eine mittlere Affinität besaßen.
- In gleicher Weise macht Tabelle 2 deutlich, daß von den Subklonen von JT4C7 die Klone JT4C7-12 und JT4C7-9 die höchste bzw. die niedrigste Affinität bei diesem Versuchsverfahren zeigten. TABELLE 1 Konzentration des Anti-Maus-Antikörpers ug/ml Klon-Nr. (unbehandelt) TABELLE 2 Konzentration des Anti-Maus-Antikörpers ug/ml Subklon-Nr. HAT-Medium
- Antikörper, die von allen 19 in Beispiel 1 identifizierten positiven Klonen abgeleitet worden waren, wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen, um die Immunreaktivität mit Proteinen des HIV-Virions zu bestimmen. Genauer ausgedrückt, HTLV-IIIB-Partikeln wurden mit SDS (0,1 %) und Dithiothriotol (0,003 M) getrennt, und die Substanz wurde auf ein 7,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Das Gel wurde entsprechend den üblichen Verfahren einer Elektrophorese unterzogen, und die Substanzen wurden auf Nitrocellulose- Filterpapier übertragen. Die Filter wurden zunächst mit 20 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum in PBS 1 Stunde lang inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Filter mit den Antikörper-Überständen der einzelnen Klone 3 Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert und danach über Nacht bei 4 ºC und bei leichtem Schütteln. Nach Waschen mit PBS/Tween 20 und erneutem Blockieren mit 20 % Pferdeserum wie oben eine Stunde lang, wurden 10ug Peroxydase-markierte Kaninchen- Antikörper gegen Maus-IgG zugefügt, und das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10maligem Waschen mit PBS/Tween 20 wurde die Farbe mit Standardmitteln entwickelt. Die von den Klonen JT4C8, JT4C12 und JT4C16 abgeleiteten Antikörper reagierten jeweils sehr stark mit HIV-Protein, das ein Molekulargewicht von etwa 60.000 bis 80.000 hatte. Die Fähigkeit dieser Antikörper zur Immunreaktion mit HIV- Protein, das bei ihrer Erzeugung keine Rolle spielte, läßt sehr günstige Voraussagen zu hinsichtlich der Eignung dieser Antikörper, eine Neutralisierung von HIV in vitro und in vivo zu bewirken.
- Eine Isotyp-Analyse der obengenannten Antikörper, die beim Western-Blot-Versuch reagierten, zeigte, daß die Antikörper JT4C12 und JT4C16 dem Isotyp IgG&sub3; angehörten.
- Hybridom-Kulturüberstände wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur HIV-Neutralisierung in der folgenden Weise geprüft. Drei Tage alte Überstände wurden im Verhältnis 1 : 5 in Vollmedium [500 ml RPMI 1640; 6 ml 100 x Penicillin/Streptomycin; 6 ml 100 x L- Glutamin; 100 ml FCS und 1,2 ml Polybrene Stock (1 mg/ml)] verdünnt. 200 ul der mediumverdünnten Probe wurden jeweils in die Bohrungen einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen gegeben, wobei zwei Vertiefungen ausgespart blieben, in die lediglich eine gleiche Menge Medium eingebracht wurde. Zusätzliches Medium wurde einer der "lediglich Medium" enthaltenden Bohrungen zugegeben, und alle übrigen erhielten 200 Pl eine HIV- Viruastammlösung mit hohem Titer. Die Platten wurden in Kunststofftaschen versiegelt, 1...1,5 Stunden lang bei 4 ºC inkubiert und konnten sich bei 15minütigem Stehen wieder auf 17 ºC erwärmen. H9-Zellen wurden 30 Minuten lang bei 37 ºC und mit einer Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml in Vollmedium inkubiert, anschließend zentrifugiert und erneut in frischem Vollmedium mit einer Dichte von 5 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. 200 ul der Zellsuspension wurden in jede der Bohrungen gegeben (so daß das Gesamtvolumen auf 600 ul stieg), und die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Daraufhin wurden 150 ul auf eine Duplikatplatte übertragen, die in jeder Bohrung 2,0 ml frisches Vollmedium enthielt. Die Kulturen wurden in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37 ºC inkubiert. Nach 4 Tagen wurden die Kulturen gesplittet, und frisches Vollmedium wurde zugegeben. Am 7. Tag der Inkubation wurden die Proben für Neutralisierungstests nach dem IFA- und Revertase- Verfahren präpariert. [Siehe Guroff et al., Nature, 316, 72-74 (1985); Matthews et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 83, 9709-9713 (1986) und Poiesz et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 77, 7415-7419 (1980)]. Bei einem ersten Versuchsdurchgang zur Bestimmung der Neutralisierung waren die Ergebnisse im wesentlichen negativ oder ließen keine deutlichen Schlüsse zu, doch bei einem zweiten Durchgang, der zeitgleich mit dem ersten begonnen worden war, zeigten die Antikörper von 12 der geprüften 15 Klone in der JT4C1-19-Reihe beim IFA- oder RT-Test oder bei beiden eine Neutralisierungswirksamkeit, und 5 von 6 Antikörpern der geprüften JT4C7-Subklone wiesen Merkmale einer Neutralisierung auf. In allen Fällen war die Neutralisierung "partiell" im Vergleich zum Humanserum eines AIDS-Patienten (HTLV-IIIB), das bei diesen Versuchen eine 100prozentige Neutralisierung zeigte.
- Die allgemeinen Hybridom-Bildungs- und Untersuchungsverfahren von Beispiel 1 wurden wiederholt, wobei der handelsübliche monoklonale Antikörper gegen den menschlichen T4- Lymphozyten mit der Bezeichnung OKT4A (Ortho Diagnostics, Rahway, N.J.) eingesetzt und unter Verwendung einer Mono-S-Säule (anstelle einer Mono-Q-Säule) gereinigt wurde. Das spezielle Immunisierungsverfahren unterschied sich nur geringfügig von dem in Beispiel 1, und zwar dadurch, daß die Initialinjektion intraperitoneal erfolgte und ungefähr 15 ug gereinigte Antikörper enthielt. Die zweite intraperitoneale Inokulation fand sieben Tage später statt und bestand aus annähernd 10 ug gereinigten Antikörpern. Dreizehn Tage später wurde die abschließende Auffrischung mit rund 5 ug Antikörpern in Form einer Milz-lnjektion verabfolgt. Von 2090 untersuchten Bohrungen zeigten 34 eine signifikant positive Reaktion mit OKT4A, wobei 10 von diesen eine hohe Aktivität aufwiesen (Fluoreszenz-Werte von rund 1000 und mehr gegenüber einem "Hintergrund" von etwa 200). Diese zehn positiven Klone erhielten die Bezeichnungen JT1-D7, JT1-1F3, JT1-1G2, JT1- 6E12, JT1-6F12, JT2-8E9, JT3-2C4, JT3-5A11, JT3-6D9 und JT3-6E8.
- Um die von den in Beispiel 3 beschriebenen positiven Klonen produzierten Antikörper zu charakterisieren, wurden Tests durchgeführt, wie sie im wesentlichen in Beispiel 2 geschildert wurden. Kurz gefaßt: Überstands-Antikörper reagierten bei der Western-Blot- Bestimmung mit HIV-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 60.000 bis etwa 80.000. Die Versuche zeigten in den meisten Fällen eine Reaktion mit Protein mit einer Molekulargewicht von 67.000, während einige Antikörper eine Reaktivität mit einer Proteinspezies aufwiesen, die ein Molekulargewicht von 78.000 hatte. Bemerkenswerterweise war keine Reaktivität zu verzeichnen mit den Fraktionen von 41 kD oder 120 kD, die für gewöhnlich als die hauptsächlichen immunologisch signifikanten HIV-Hüllglykoproteine eingestuft werden. Von den Antikörpern mit der stärksten Reaktion gehörten zwei (JT1- 6E12 und JT2-8E9) zum IgM-Isotyp, und der Antikörper des Klons JT1-1F3 war vom IgG&sub1;- Isotyp. Die folgende Tabelle 3 veranschaulicht die Ergebnisse des fluoreszenzgekoppelten Tests unter Verwendung des Antikörpers JT1-1F3. Tabelle 3 Konzentration des Anti-Maus-Antikörpers ug/ml unbehandelt Kontrolle HAT)
- Neutralisierungsuntersuchungen, die gleichzeitig mit denen von Beispiel 2 (C) durchgeführt wurden, zeigten ebenfalls zunächst negative Neutralisierungsergebnisse und beim zweiten Versuch nur geringe Anzeichen für eine Neutralisierungsfähigkeit beim RT-Test. Ungeachtet dieser Tatsache wurde der IgG&sub1;-absondernde Klon JT1-1F3 für eine Aszites-Amplifikation sowie für weitere ELISA-Untersuchungen zur Bestimmung der Reaktivität des Antikörpers mit HIV-Protein ausgewählt.
- Beim ersten ELISA-Screenen wurden unterschiedliche Konzentrationen von HTLV-IIIB- Protein (d. h. Konzentrationen von 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078, 0,039 und 0,020 ug/ml) auf Mikrotiterplatten aufgetragen, blockiert (20 % Pferdeserum/PBS, 37 ºC, 2 Stunden) und über Nacht getrocknet. Kulturüberstand (20 ul mit 80 ul PBS) oder HAT-Medium-Kontrolle wurden als erster Antikörper zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur und Lagerung über Nacht bei 4 ºC wurden Peroxidase- konjugierte Kaninchen-Antikörper gegen Maus-IgG (0,3 ug/ml in 5 % Pferdeserum/PBS) als zweiter Antikörper hinzugefügt. Nach zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde Substrat (O-Phenylendiamin, 0,5 mg/ml in McIlvan's Buffer, pH-Wert 5,5; 10 ml 3%iges Wasserstoffperoxid) zugegeben. Nach 20 min. Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 50 ul 0,4-M- Schwefelsäure gestoppt und die Absorption bei λ 492-610 abgelesen. Die Versuchsergebnisse sind in Figur 1 grafisch dargestellt und zeigen, daß HIV bei Konzentrationen von 1,25 ug nachweisbar war und daß die Reaktivität bis zu 40 ug Viruskonzentration progressiv anstieg.
- Das ELISA-Verfahren wurde auf Platten wiederholt, auf die zunächst unterschiedliche Konzentrationen von Membranpräparaten nichtinfizierter H9-Zellen aufgetragen wurden [10&sup6;, 6 x 10&sup5;, 4 x 10&sup5;, 2 x 10&sup5;, 6 x 10&sup4;, 4 x 10&sup4;, 2 x 10&sup4;, 1 x 10&sup4;, 6 x 10³, 4 x 10³, 2 x 10³ Zellen/ml]. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in Figur 2 grafisch veranschaulicht und zeigen keine Reaktivität mit nichtinfizierten Präparaten.
- Schließlich wurde die HIV-Protein-ELISA-Bestimmung mit denselben unterschiedlichen Proteinkonzentrationen der HTLV-IIIB-HIV-Variante, der haitianischen HIV-Variante mit der Bezeichnung AL1212C (erhalten von Dr. David Hall, Masachusetts General Hospital, Boston, MA) sowie der afrikanischen HIV-Variante mit der Bezeichnung 906 (erhalten von Dr. Jerome Groopman, New England Deaconess Hospital, Boston, Massachusetts) wiederholt. Wie aus der grafischen Darstellung in Figur 3 hervorgeht, erkannte der Antikörper JT1-1F3 ein gemeinsames Epitop aller drei HIV-Varianten.
- Anschließend wurde ein aus Aszites-Flüssigkeit abgeleiteter JT1-1F3-Antikörper auf die in vitro-Neutralisierungsaktivität untersucht, und zwar nach dem oben beschriebenen RT-Test sowie nach Synzytium-Induktion. Bei diesem Verfahren wurde ein Vergleich angestellt zwischen unterschiedlichen Konzentrationen des JT1-1F3-Antikörpers (Aszites-Flüssigkeit-IgG-Fraktion), einer negativen Kontrolle (Aszites-Flüssigkeit/Pristan) und einer positiven Kontrolle in Form des Serums von einem HTLV-IIIB-infizierten Patienten. Entsprechend dem Verfahren wurden die HIV-Stämme IIIB, AL1212C und 906 mit dem mAk JT1-1F3, Kontroll-Aszites-Flüssigkeit oder neutralisierendem Humanserum (im Verhältnis 1 : 5 in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt) 90 Minuten lang bei 4 ºC inkubiert. Danach wurden H9-Zellen (5 x 10&sup6;) in jede Bohrung zugegeben und 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert. Aliquote Mengen (150 ul) wurden allen Bohrungen entnommen und zu 2,0 ml frischem Medium hinzugegeben. Am 4. Tag wurden die Kulturen 1 : 1 aufgespalten. Am 4. und 7. Tag wurden Revertase-Aktivität und Synzytium-Induktion gemessen. Die Ergebnisse des 7. Tages sind in Tabelle 4 aufgeführt, wobei die relative Synzytium- Induktion folgendermaßen angezeigt wird: (-) = 0/200 Zellen, (+/-) = 1-5/200 Zellen, (+) = > 10% derZellen, (++) = > 25% der Zellen und (+++) = > 50% der Zellen. TABELLE 4 JT1-1F3-NEUTRALISIERUNG HIV = HTLV-III B HIV = AL1212C HIV = 906 RT-Aktivität/% Neutalisierung Synzytium Induktion nichtinfizierte H9 HIV HIV + 1 mg/ml Ak HIV + ug/ml Ak HIV + Ascites (Kontrolle) HIV + Humanserum
- Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse machen in bezug auf den JT1-1F3-Antikörper eine in vitro-Neutralisierungsaktivität gegenüber allen drei untersuchten HIV-Varianten deutlich. Im Gegensatz dazu erwies sich das Serum infizierter Patienten hinsichtlich der neutralisierenden Aktivität als ausgesprochen variantenspezifisch, was darauf hinweist, daß der monoklonale Antikörper ein signifikantes typenübergreifendes Epitop erkennt.
- Das Molekulargewicht der Spezies, mit der der JT1-1F3-Antikörper reagiert, wurde mittels Immun-Blot ermittelt. Gereinigtes HTLV-IIIB (5 und 10 ug) wurde mittels SDS-PAGE und Coomasie-Blau-/Silber-Färbung (Fig. 4, Banden B und C) analysiert. Gleiche aliquote Mengen wurden mit SDS-PAGE analysiert, auf Nitrocellulose-Papier übertragen und auf ihre Reaktivität mit dem JT1-1F3-Antikörper untersucht. Eine einzige Spezies war nachweisbar mit ungefähr 67 kD (Fig. 4, Banden E und F).
- Die Reaktivität des JT1-1F3-Antikörpers mit dem HTLV-IIIB-Isolat wurde mit jener gegenüber anderen HIV-Stämmen verglichen. Die Stämme HTLV-IIIB, AL1212C und 906 ergaben mittels ELISA-Test ähnliche Reaktivitätsmuster. Darüber hinaus ergab eine Western-Blot- Bestimmung mit dem JT1-1F3-Antikörper und jedem der drei HIV-Stämme eine Reaktivität mit Antigenen von ähnlichem Molekulargewicht (Fig. 5). Diese Befunde zeigen, daß der mAk JT1-1F3 mit verwandten oder identischen Antigenen reagiert, die in divergenten HIV- Stämmen nachweisbar sind.
- Die obigen Erkenntnisse in bezug auf den JT1-1F3-Antikörper ließen vermuten, daß er ebenfalls für den Nachweis HIV-infizierter Zellen geeignet sein könnte. Zu diesem Zweck wurde die Bindung des JT1-1F3-Antikörpers (IgG-Fraktion der Aszites-Flüssigkeit) an nichtinfizierte und HIV-infizierte H9-Zellen untersucht. Das Ausmaß der JT1-1F3-Bindung wurde mittels Fluorescein behandelten Kaninchen-Antikörpern gegen Maus-IgG ermittelt. Wie aus Figur 6A ersichtlich ist, war nur eine geringe, wenn überhaupt eine nachweisbare Bindung des Antikörpers an nichtinfizierte H9-Zellen zu verzeichnen. Demgegenüber war bei HTLV-IIIB-infizierten H9-Zellen fokale und diffuse Bindung des Antikörpers nachweisbar (Fig. 68). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, als H9-Zellen eingesetzt wurden, die mit den Stämmen 906 und AL1212C infiziert waren (Fig. 6C und 6D). Diese Vorgehensweise wurde auf hämatopoetische Zellen von einem AIDS-Patienten ausgedehnt. Mononukleäre Zellen wurden mittels Ficoll-Hypaque-Trennung aus dem peripheren Blut des AIDS-Patienten gewonnen und auf Reaktivität mit JT1-1F3 untersucht. Figur 6E zeigt, daß bei diesen Zellen ein fokales und diffuses Immunfluoreszenz-Färbungsmuster zu verzeichnen war, das den Resultaten bei den HIV-infizierten H9-Zellen ähnelte.
- Bemerkenswert ist die Tatsache, daß die Prüfung der Reaktivität des JT1-1F3-Antikörpers mit Zellen, die Oberflächenbestandteile der Klasse II der Haupthistokompatibilität ("MHC") besitzen (d. h. humane B-Zellinie MD1 und normale mononukleäre Zellen des peripheren Bluts) keine wesentliche Reaktion erkennen lassen.
- Ein Subklonieren von JT1-1F3 führte zur Auswahl der Subklone JT1-1F3-E5 und JT1-D7, die jeweils in progressiver Weise größere Mengen von IgG&sub1;-Antikörpern produzieren als JT1-1F3. Die folgende Tabelle 5 zeigt vergleichende Neutralisierungs-Versuchsergebnisse für JT1-1F3, JT1-1F3-E5 und JT1-D7. Die anschließende Tabelle 6 verdeutlicht die mit der ELISA-Bestimmung ermittelte Reaktivität der Antikörper, die von diesen drei Hybridom- Zellinien erzeugt wurden. TABELLE 5 HIV = HTLV-III B HIV = AL1212C HIV = 906 RT-Aktivität/% Neutalisierung nichtinfizierte H9 HIV HIV + mg/ml Ak HIV + ug/ml Ak * NT = nicht getested TABELLE 6 Vergleich von 3 Hybridom-Zellinien mittels ELISA HIV-IIIB-Virusprotein Kontrolle (Kulturmedien)
- Die in den Beispielen 1 und 3 geschilderten Verfahren zur Bildung und Untersuchung des Hybridoms wurden nochmals unter Verwendung von OKT4A wiederholt, wobei in bezug auf den Immunisierungsprozeß folgende Änderungen vorgenommen wurden. Die Initialimmunisierung erfolgte durch eine intraperitoneale Injektion und bestand aus 10 ug OKT4A- Antikörpern, die in der Mono-S-Säule gereinigt worden waren. Die zweite intraperitoneale Injektion (7 ug) wurde 17 Tage später verabfolgt und die abschließende intravenöse Dosis von 7 ug 18 Tage später. Nach Fusionierung und Untersuchung wurde ein IgG&sub1;-produzierender positiver Klon mit der Bezeichnung JT2-N15 für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Ebenso wie JT1-1F3 und seine Subklone JT1-1F3-E5 und JT1-D7 erzeugte JT2-N15 einen monoklonalen Antikörper, der bei der Western-Blot-Bestimmung mit HIV- Protein reagierte, das ein Molekulargewicht von rund 65...67.000 besaß. Kulturmedien von der Züchtung von JT2-N15 erwiesen sich bei der ELISA-Analyse als positiv, und die Ergebnisse eines vorläufigen Neutralisierungsversuches hinsichtlich HIV-IIIB-Infektiosität sind in der folgenden Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Neutralisierung von HIV-IIIB durch JT2-N15 RT-Aktivität und % der Neutralisierung nichtinfizierte H9 HIV HIV + 1,5 mg/ml Ak HIV + 705 ug/ml Ak
- Für weitere Untersuchungen der neutralisierenden Wirksamkeit anti-idiotypischer Antikörper, die nach dem Aszites-Verfahren vermehrt wurden, wurde im voraus ermittelt, daß die folgende Verfahrensweise die aktivsten Aszites-Präparate ergibt. Fünf bis acht Wochen alte Mäuse werden mit 0,5 bis 1,0 ml Pristan "vorbereitet", und zwei Wochen später erhalten sie eine Injektion mit 2 bis 8 x 10&sup6; (vorzugsweise etwa 5 x 10&sup6;) Hybridom-Zellen. Die Entnahme der Aszites-Flüssigkeit begann zwei Wochen nach der Inokulation, wobei diese ersten Flüssigkeitsproben (etwa 3 bis 5 ml) die höchste Neutralisierungswirkung zeigten. Eine drei Tage später erfolgte zweite Entnahme von Aszites-Flüssigkeit erbrachte 8 bis 10 ml mit geringerer Aktivität. Eine dritte Entnahme aus überlebenden Tieren ergab im allgemeinen 3 bis 5 ml Flüssigkeit, die sich in einigen Fällen als wesentlich weniger aktiv erwies als das Material sowohl von der ersten als auch von der zweiten Entnahme. Die in den Tabellen 4 und 5 gezeigten Neutralisierungswerte für JT1-1F3 beruhen auf der gesammelten Aszites-Flüssigkeit aus drei Entnahmen, wogegen die Werte für JT1-1F3-E5, JT1-D7 und JT2-N15 in den Tabellen 5 und 7 auf Aszites-Material basieren, das nur aus der ersten und zweiten Entnahme stammt.
- Während sich die vorangegangenen Beispiele auf Verfahren mit den im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörperpräparaten OKT4 und OKT4A bezogen, ist zu erwarten, daß andere handelsübliche Antikörper wie Leu3a (Becton-Dickenson, Immunocytometry Systems, Mountain View, California, 94039) in gleicher Weise für die Herstellung erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper geeignet sind. Ebenso eignen sich nicht handelsübliche Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper), die mittels bekannter Hybridom-Techniken erzeugt werden unter Verwendung menschlicher T-Zellen, menschlicher T-Lymphoblastzellen, die das T4-Glykoprotein exprimieren, sowie durch Rekombination hergestellte menschliche T4-Proteinisolate als ursprüngliches Immunogen. Obwohl die von JT1-1F3 und seinen Subklonen sowie von JT2-N15 produzierten Antikörper dem IgG&sub1;-Isotyp angehören, wird ferner erwartet, daß Antikörper anderer Isotypen ebenso brauchbar sind. So könnten beispielsweise Antikörper des IgG&sub2;-Isotyps sich als nützlicher erweisen bei Verfahren, die Komplement-vermittelte zytolytische Reaktionen beinhalten.
- Eine Bestätigung für die Durchführbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren ist enthalten in der Arbeit von Chanh et al., P.N.A.S. (USA), 84, 3891-3895 (Juni 1987), worin berichtet wird, daß der monoklonale Antikörper gegen Leu3a (mit der Bezeichnung HF1.7) zur in vitro-Neutralisierung der HIV-IIIB-Infektiosität in der Lage ist. Allerdings wurde die Neutralisierungswirksamkeit von HF17 als "schwach" eingestuft [siehe Weiss, Nature, 331, S. 15 (Januar 1988)], und es wurde nicht dargestellt, daß sie sich auf andere Stämme außer HIV-IIIB erstreckt. Außerdem gibt es im Gegensatz zu den in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen monoklonalen Antikörpern gegen OKT4 und OKT4A beim Anti-Leu3a-Antikörper von Chanh et al. keine Indikation für seine Reaktion mit irgendeinem HIV-abgeleiteten Protein außer gp120, wie die Figur 4 auf Seite 3894 bei Chanh et al., a. a. O., zeigt. [Siehe auch Dalgleish et al., The Lancet, 11, 1047-1050, 7. November 1987, worin auf polyklonale Antikörper gegen Leu3a Bezug genommen wird.]
- Auch wenn sich die vorangegangenen Beispiele auf murin-abgeleitete Hybridom-Zellpräparate beziehen, liegt es im Erwägungsbereich der Erfindung, hybride Hybridom- Zellinien (z. B. Maus/Mensch) zu erzeugen und einzusetzen, insbesondere Mensch/Mensch- Hybridome, die zum Beispiel in einer Weise hergestellt werden, die übereinstimmt mit Borrebaeck, TIBTECH, Juni 1986, S. 147-153; Abrams et al., Methods in Enzymology, 121, S. 107-119 (1986); Kozbor et al., Methods in Enzymology, 121, S. 120-140 (1986); Suresh et al., Methods in Enzymology, 121, S. 210-228 (1986) und Masuho et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., 135 (2), S. 495-500 (2986). Siehe auch Klausner, "'Single Chain' Antibodies Become a Reality", Bio/Technology 4, 1041-42 (1986); Klausner, "Stage Set For 'Immunological Star Wars'", Bio/Technology, 5, 867-868 (1987) und Marx, "Antibodies Made To Order", Science, 229, 455-456 (1985).
- Angesichts dessen kann leicht nachvollzogen werden, daß die obengenannten spezifischen Verfahren für die Herstellung von Hybridom-Zellinien sowie die Identifizierung und Isolierung monoklonaler Antikörper nicht auf den Bereich der Erfindungsausführung eingeschränkt zu verstehen sind. Zahlreiche alternative Verfahren sind vorhanden, mit denen sich dieselben Ergebnisse erzielen lassen, wie beispielsweise die Artikel in Methods in Enzymology, Vol. 121, "Immunological Techniques, Part 1", Hrsg. Langone et al., Academic Press, Inc. (New York 1986) demonstrieren.
- Weiterhin wird im Rahmen der Erfindung erwogen, immunologisch aktive Polypeptide für den Einsatz bei erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren zu entwickeln, indem die Expression von DNA-Sequenzen mit dem entsprechenden Kode in Kulturen von prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen genutzt wird, die auf geeignete Weise transformiert und transfiziert wurden.
- Erfindungsgemäße therapeutische Verfahren gegen HIV sollen so aufgefaßt werden, daß sie die Verabfolgung wirksamer Mengen von erfindungsgemäßen Antikörpern oder Antikörperfragmenten bei einem HIV-infizierten oder HIV-Infektions-gefährdeten Patienten umfassen, um eine passive Immunität zu erzeugen, die zu einer Neutralisierung der HIV- Infektiosität in vivo führt. In diesem Zusammenhang wird in Betracht gezogen, die erfindungsgemäßen Produkte mit immunologisch zulässigen Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen und Trägersubstanzen zu kombinieren, um immunologisch wirksame therapeutische Zusammensetzungen gegen HIV zu erstellen.
- Die gegen HIV gerichteten, erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahren innerhalb des Erwägungsbereiches der Erfindung beinhalten auch eine aktive Immunisierung unter Verwendung biologisch aktiver HIV-Proteinfraktionen, die mit monoklonalen Antikörpern gegen monoklonale und menschliche Lymphozyten reagieren. Derartige Produkte könnten unmittelbar aus Viruspräparaten mittels allgemein bekannter Affinitäts-Reinigungsverfahren gewonnen werden, die die Bildung immunologischer Reaktionsgemische aus HIV-Proteinen und erfindungsgemäßen Antikörpern umfassen, wonach das gewünschte Protein isoliert wird. Als Beispiel sei erwähnt, daß das HIV-Protein mit dem Molekulargewicht von 60.000 bis 80.000, das beim Verfahren von Beispiel 4 vom JT1-1F3 erkannt wurde, ein vorrangiger Anwärter für die Verwendung in Impfstoffen ist. Dasselbe wird für rekombinierte Expressionsprodukte erwartet, die auf einer HIV-DNA beruhen, die mittels der erfindungsgemäßen Antikörper immunologisch identifiziert (und/oder gereinigt) werden kann.
- Es ist zu erwarten, daß diagnostische Verfahren, bei denen erfindungsgemäße Polypeptide zur Erkennung und Quantifizierung von HIV-Partikeln in biologischen Flüssigkeiten wie Blut eingesetzt werden, einen wesentlichen Bestandteil von Eingangsuntersuchungen der Patienten, die aus der erfindungsgemäßen passiven Immunisierung Nutzen ziehen könnten, sowie bei der Überwachung der erfindungsgemäßen therapeutischen Maßnahmen bilden. Die Erkenntnis, daß die Antikörper der Erfindung selektiv mit den Oberflächen HIV-infizierter Zellen reagieren, bedeutet eine Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten, einschließlich des histologischen Screenens von Gewebe- (z. B. lymphatische Zellen)- und Flüssigkeits- (z. B. Blut)-Proben zum Nachweis einer HIV-Infektion, möglicherweise in frühen Stadien der Infektion, die durch Untersuchungen auf der Basis von Antikörper-Siebtests noch nicht nachweisbar sind. Die Erkennung infizierter Zellen durch die erfindungsgemäßen Antikörper gestattet die Aussonderung solcher Zellen aus Zellpopulationen, die sowohl infizierte als auch nichtinfizierte Zellen umfassen. Das führt zu der Erwägung, daß das Blut von AIDS-Patienten einer extrakorporalen Behandlung unterzogen werden könnte, um mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper infizierte Lymphozyten zu beseitigen oder selektiv abzutöten. Weiterhin liegt im Erwägungsbereich der Erfindung die in vivo-Behandlung mit erfindungsgemäßen Antikörpern bei zusätzlicher Zirkulation von Komplement, so daß eine Zytolyse infizierter Zellen erfolgt. Unterstützt wird die Durchführbarkeit eines derartigen therapeutischen Herangehens durch vorläufige positive Versuchsergebnisse, die die Fähigkeit von JT1-D7-Antikörpern aufzeigen, an der komplementabhängigen in vitro-Zytolyse von HIV-infizierten H9-Zellen mitzuwirken.
- Die selektiven Reaktivitätseigenschaften der Antikörper machen sie zu aussichtsreichen Kandidaten für die medikamentöse oder toxische in vivo-Anwendung gegenüber infizierten Zellen sowie für den Einsatz bei der Entwicklung bispezifischer Antikörper, die Doppeldeterminanten einschließen und somit beispielsweise die Effektor-T-Zellen-Aktivität "in den Brennpunkt rücken" könnten. Siehe z. B. Stearz et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 83, 1453-1457 (1986).
- Ausgehend von der Tatsache, daß die vorliegende Erfindung auf den immunologischen Eigenschaften des T4-Proteins - von dem angenommen wird, daß es den gemeinsamen Rezeptor für HIV-Infektionen mit allen Varianten (z. B. AL1212C, 906, ARC, LAV, HTLV- IIIRF, HTLV-IIIB) stellt - weniger als auf Eigenschaften einer spezifischen HIV-Variante begründet ist, ist zu erwarten, daß sich die erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren bei der Erkennung und Behandlung der Infektion mit allen HIV- Varianten anwenden lassen. Der Einsatz von erfindungsgemäßen Polypeptiden als Diagnose- und Forschungswerkzeug könnte den Erwartungen zufolge zusätzliche Informationen über das Wesen der Wechselwirkung zwischen HIV und Wirtszellen liefern. So werden beispielsweise die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper dazu beitragen, die primäre, sekundäre und tertiäre strukturelle Konformation der Region(en) der Oberflächenproteine von HIV und Wirtszellen zu identifizieren, die spezifischer- und notwendigerweise bei den Erkennungs- und Assoziationsprozessen in bezug auf die HIV-Infektion von Zellen wechselseitig beteiligt sind. Dieses Wissen würde es wiederum ermöglichen, erfindungsgemäße immunologisch aktive Substanzen herzustellen, indem synthetische und durch Rekombination erzeugte Peptidimmunogene verwendet werden.
Claims (21)
1. Gereinigtes und isoliertes Polypeptid in Form eines Antikörpers oder schimären
Antikörpers oder eines ihrer Fragmente, das zur spezifischen Immunbindung an das HIV-
Virion oder an die Oberfläche HIV-infiziener Zellen in der Lage ist, dadurch
gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, die Invektiosität von HIV in vitro zu neutralisieren
und die spezifische Immunreaktion mit einem Antikörper auszulösen, der für den
menschlichen T4-Lymphozyten immunspezifisch ist.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine spezifische Immunreaktion mit einem
monoklonalen Antikörper auslöst, der für den menschlichen Lymphozyten T4
immunspezifisch ist.
3. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine spezifische Immunreaktion mit dem
Antikörper OKT4 auslöst.
4. Polypeptid nach Anspruch 1, das eine spezifische Immunreaktion mit dem
Antikörper OKT4A auslöst.
5. Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche, das ein Molekulargewicht von
annähernd 60 000 bis 80 000 gemäß SDS-PAGE aufweist.
6. Polypeptid nach Anspruch 5, das ein Molekulargewicht von annähernd 65 000 bis
67 000 gemäß SDS-PAGE aufweist.
7. Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche, das immunologisch nicht-
reaktiv mit Molekülen der Haupthistokompatibilitätsklasse II ist.
8. Polypeptid nach einem der vorstehenden Ansprüche in Form eines von einem
murinen Wirt abgeleiteten Antikörpers oder Antikörperfragments.
9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Form eines menschlichen
Antikörpers oder Antikörperfragments.
10. Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9 in Form eines monoklonalen Antikörpers oder
monoklonalen Antikörperfragments.
11. Polypeptid nach Anspruch 10 in Form eines Doppeldeterminanten einschließenden,
bispezifischen monoklonalen Antikörpers.
12. Hybridom-Zellinie der American Type Culture Collection and Accession Nr. HB9385,
HB9387 oder HB9386, der European Collection of Animal Cell Cultures, Accesion Nr.
87062501 oder 87062502 oder der Fermentation Research Institute Accession Nr. FERM
BP-1685 oder FERM BP-1684.
13. Hybride Hybridom-Zellinie, die in der Lage ist, in ihrem Kulturmedium ein Polypeptid
nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zu produzieren.
14. Impfstoffzusammensetzung zur Auslösung einer schützenden Immunantwort auf die
Infektion durch ein HIV-Virus, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polypeptids
nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthält.
15. Gehaltsbestimmungsverfahren zum Nachweis und/oder der Quantifizierung von HIV
in einer biologischen Flüssigkeit, das auf einer immunologischen Reaktion zwischen HIV
und einem immunologisch reaktiven Polypeptid beruht, das zur spezifischen
Immunbindung an HIV in der Lage ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid nach
einem der Ansprüche 1 bis 11 als immunologisch reaktives Polypeptid genutzt wird.
16. Gehaltsbestimmungsverfahren zum Nachweis und/oder der Quantitfizierung HIV-
infizierter Wirtszellen in einer Flüssigkeits- oder Gewebeprobe, das die Bildung eines
immunologischen Reaktionsgemischs der Probe mit einem Polypeptid nach einem der
Ansprüche 1 bis 11 und den Nachweis der Immunbindung des Polypeptids an die
Oberflächen infizierter Zellen umfaßt.
17. Gehaltsbestimmungsverfahren nach Anspruch 16, in dem der Nachweis die
Bestimmung einer nachweisbaren Markierung umfaßt, die an den Antikörper gebunden ist.
18. Gehaltsbestimmungsverfahren nach Anspruch 16, in dem der Nachweis die
Bestimmung einer nachweisbaren Markierung an einen Antikörper umfaßt, der dem
Reaktionsgemisch zugesetzt wird.
19. Verfahren zur Abtrennung HIV-infizierter Zellen in einer Population infizierter und
nichtinfizierter Zellen, das die Bildung eines immunologischen Reaktionsgemischs der
Zellpopulation und eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und die
Abtrennung der infizierten von den nichtinfizierten Zellen auf der Grundlage der selektiven
Bindung des Polypeptids an die infizierten Zellen umfaßt.
20. Verfahren zur Isolierung der HIV-Proteine aus einer Flüssigkeitsprobe, das die
Vermittlung des Kontakts zwischen der Probe und einem Polypeptid nach einem der
Ansprüche 1 bis 11 zwecks Bildung eines immunologischen Reaktionsgemischs
einschließlich des Proteins und des Polypetids sowie die Isolierung des Proteins aus dem
Reaktiosngemisch umfaßt.
21. Eine mikrobielle Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz, die das Polypeptid nach
einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert, transformien oder transfiziert ist.
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