DE68926499T2 - Synthetisches antigen zum bewirken einer anti-hiv-reaktion - Google Patents
Synthetisches antigen zum bewirken einer anti-hiv-reaktionInfo
- Publication number
- DE68926499T2 DE68926499T2 DE68926499T DE68926499T DE68926499T2 DE 68926499 T2 DE68926499 T2 DE 68926499T2 DE 68926499 T DE68926499 T DE 68926499T DE 68926499 T DE68926499 T DE 68926499T DE 68926499 T2 DE68926499 T2 DE 68926499T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- arg
- peptide
- cells
- gly
- ile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 title abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 claims description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 abstract description 10
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 abstract description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 62
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 9
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 8
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 8
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 101100438957 Mus musculus Cd8a gene Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- 101150098072 20 gene Proteins 0.000 description 1
- YQGZIRIYGHNSQO-ZPFDUUQYSA-N Arg-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N YQGZIRIYGHNSQO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010038826 HIV Envelope Protein gp160 Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010036616 P18-I10 peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007810 virus-infected cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet von Impfstoffen und Diagnose- oder Prognosereagentien für AIDS. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein synthetisches oligopeptid, das Zytotoxizität durch T-Zellen gegen Human-Immunschwächevirus-(HIV)-Antigene und die Proliferation von HIV-spezifischen CTL hervorruft.
- Verschiedene Strategien werden zur Bekämpfung des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) entwickelt. Das Hüllprotein des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) wurde als ein antigener Wirkstoff zur Erzeugung von Anti-HIV-Antikörpern verwendet. Dieser Lösungsansatz betont den Mechanismus des Hervorrufens von neutralisierenden Antikörpern gegen das Virus.
- Eine andere Art der HIV-Infektion ist jedoch die direkte Zelle-zu-Zelle-Übertragung von HIV. Ein derartiger zellver mittelteümechanismus erfordert keine Neuinfektion durch extrazelluläres Virus. Somit wären Behandlungsmodalitäten, die von der Zugänglichkeit und Neutralisierung des Virus durch die Antikörper abhängig sind, in Fällen der zellvermittelten Infektion nicht wirksam.
- Es wurde berichtet, daß zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) eine wichtige Rolle bei der Resistenz gegen die virale Infektion spielen (Kast, et al., J. Exp. Med., 164: 723-748 (1986)). Ein synthetisches Peptid, das eine gesteigerte Produktion der T-Zellen stimuliert, um selektiv das Target (HIV-Antigen exprimierende Zellen) zu töten, ist jedoch bisher nicht bekannt oder identifiziert.
- EP-A-0273716, eingereicht am 23. Dezember 1987 und veröffentlicht am 6. Juli 1988, zeigt ein Verfahren der Induzierung von zellulärer Immunität gegen das native Protein des AIDS- Virus durch Immunisierung mit kurzen synthetischen Peptiden auf. Tabelle 3 zeigt das Peptid IleArgIleGlnArgGlyProGly-ProArgAlaPheValThrIleGlyLysIleGlyAsnMetArgGlnAlaHisCys. Bei der Bestimmung der potentiellen Immunogenität der Proteinsequenz wurden die helikale Amphipathizität der Segmente entlang der gesamten Sequenz eines Proteins, die konformationale Propensität von Segmenten, die Anwesenheit oder Abwesenheit von Helixunterbrechern in Segmenten und die Anwesenheit und die Plazierung von Aminosäureresten, welche die T-Zellerkennung begünstigen, in der Proteinsequenz berücksichtigt.
- Das Dokument lehrt T-Zellepitope, die von T-Helferzellen in Verbindung mit Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekülen der Klasse II erkannt werden. Die Lehren sind nicht anwendbar auf oder beinhalten nicht T-Zellepitope, die von zytotoxischen T-Zellen in Verbindung mit MHC-Molekülen der Klasse I erkannt werden. Die Druckschrift zeigt, daß T-Helferzellen zur Erkennung von Peptidsequenzen neigen, die sich als amphipatische Helices auf der Basis ihrer Periodizität der Hydröphobität falten können. Dieser Lösungsansatz wird verwendet, um T-Helferzellepitope auf HIV zulokalisieren. Keine dieser Untersuchungen weist darauf hin, daß diese Prinzipien auf zytotoxische T-Zellen angewendet werden können.
- WO 86/02382 zeigt Antigene des Lymphadenopathie-assoziierten Virus (LAV) und des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) auf, ein Verfahren zur Herstellung der Antigene, eine das Antigen umfassende Impfstoffzusammensetzung, ein Verfahren zur Erfassung von Antikörpern gegen LAV oder damit verwandte Proteine und Diagnosekits zur in-vitro-Erfassung von Antikörpern gegen LAV.
- In ähnlicher Weise ist die WO 87/02775 auf eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Erfassung von sowie auf eine Impfung gegen virale verursachende Wirkstoffe von AIDS und des mit AIDS zusammenhängenden Komplexes (ARC) gerichtet. Obgleich dieses Dokument HTLV-III Hüll-Glykoproteine und Peptide aufzeigt, ist es auf Mechanismen zum Hervorrufen von Antikörpern gerichtet, die in der Lage sind, HTLV-III zu neutralisieren.
- Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes synthetisches Peptid zu schaffen, das in der Lage ist, zytotoxische T-Zellen speziell gegen HIV-Antigen exprimierende Zellen zu stimulieren. Der Einfachheit halber wird das Peptid gemäß vorliegender Erfindung hierin als "Env-K&sub1;" bezeichnet.
- Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung zu schaffen, die eine antigene Menge des Env-K&sub1; Peptids enthält, um die Produktion von HIV-spezifischen CTL zu stimulieren.
- Es isteine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Diagnose- und Prognosekit zum Erfässen von HIV odervgrhersagen des Verlaufes einer HIV-Infektion zu schaffen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Verwendung des Env-K&sub1;-Peptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung einer HIV-Infektion in einem dafür anfälligen Wirt zu schaffen, welche Zusammensetzung eine wirksamen Menge von Env-K&sub1; Peptid zur Herstellung von HIV-spezifischen CTL enthält.
- Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillieren Beschreibung der Erfindung deutlich.
- Diese und weitere Aufgaben, Merkmale und viele der mit der Erfindung verbundenen Vorteile sind durch das Studium der folgenden detaillierten Beschreibung, im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet, besser verständlich.
- Fig. 1 zeigt das Dosis-Ansprechverhalten von Env-K&sub1; für die Sensibilisierung von Targets für hüllspezifische CTL. CTL-Linie-Effektorzellen (5 x 10&sup4;/Schale) wurden zu der Versuchskultur mit verschiedenen Konzentrationen von Env-K&sub1; in der Anwesenheit von &sup5;¹Cr-markierten, Neo-Gen transfizierten BALB/c3T3 Fibroblasten-(H-2d)-Targetzellen (5 x 10³/Schale) hinzugegeben. Nach sechsstündiger Inkubation bei 37ºC wurde der Kulturüberstand abgeerntet und die Radioaktivität in einem Gammazähler gemessen. Die spezifische &sup5;¹CR-Freisetzung wurde berechnet wie unten beschrieben. Die spontane Freisetzung für die Targetzellen lag unter 25%.
- Fig. 2 zeigt den pHänotyp der H-2d CTL-Linie, der für Env-K&sub1; tragende Zellen spezifisch ist. 5 x 10³ &sup5;¹CR-markierte BALB/c3T3 Neo-Gen Transfektanten wurden mit Zellen von der Larigzeit-Anti-gp160 CTL-Linie in mehreren Effektor-Target- Verhälthissen in Anwesenheit von 1 M Env-K&sub1; kultiviert. Die Effektorzellen wurden mit monoklonalen Antikörpern Anti-L3T4 plus Komplement ( - ), Anti-Lyt2 plus Komplement ( - ) oder nur mit Komplement ( - ) vorbehandelt. ( - ) zeigt die Kontrollgruppe ohne Behandlung.
- Fig. 3 zeigt, daß die für Peptid Env-K&sub1; spezifischen CTL durch das Klasse I Molekül Dd restringiert sind. 5 x 10&sup4; Effektorzellen von der Langzeitlinie wurden mit 5 x 10³ &sup5;¹Cr- markierten Targets in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Env-K&sub1; kultiviert. T1.1.1 ( - ) und T4.8.3 ( - ) bezeichnen L-Zellen-(H-2k)-Transfektanten, die Ld bzw. Dd exprimieren. Neo-Gen transfizierte 3T3 Fibroblasten, 18-Neo, (Kd,Ld,Dd) ( - ) wurden als eine positive Kontrollgruppe und Neo-Gen transfizierte L-Zellen, L28, (Kk, Dk) ( - ) als eine negative Targetkontrollgruppe verwendet. Die spezifische Lyse in der Abwesenheit von Peptid betrug -0,2, 0,3, 1,5 und 0,02% jeweils für die 4 Targets. Die spontane Freisetzung lag im Bereich von 14,6 bis 16,8%.
- Fig. 4 zeigt die Stimulation der Proliferation der CTL LINIE durch Env-K&sub1; in Anwesenheit von IL-2. Feld 4A zeigt 1 x 10&sup4; LINIE-Zellen, die mit 0,1 µM Env-K&sub1; (Peptid Nr. 18) oder keinem Peptid mit oder ohne 10% IL-2 (dieselbe Quelle wie zur Erzeugung und Aufrechterhaltung der LINIE) in Anwesenheit von 2 x 10&sup4; Mitomycin-C behandelten (50 µg/ml, 37ºC, 30 Min.) 18Neo Transfektanten (H-2d) in 200 µl Medium in 96 Schalen enthaltenden Flachbodenkulturplatten stimuliert wurden. Nach 3 Tagen wurden die Schalen mit 1 µ Ci ³H-Thymidin (6,7 Ci/mmol) gepulst und weitere 16 Stunden später wurde die ³H- Aktivität durch β-Szintillationszählung gemessen. Feld 4B zeigt 1 x 10&sup4; LINIE-Zellen, die mit 0,1 M Env-K&sub1; (Peptid Nr. 18) oder Peptid Nr. 30 oder keinem Peptid mit oder ohne 10% IL-2 in Anwesenheit von 4 x 10&sup5; bestrahlten (3300 rad) B10.D2 Milzzellen (SC) (H-2d in 200 µl Medium in 96 Schalen enthaltenden Flächbodenkulturplatten stimuliert wurden. Die Thymidininkorporation wurde wie in Feld A gemessen.
- Die vorstehenden und verschiedene weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch ein isoliertes synthetisches Oligopeptid, Env-K&sub1;, erzielt, das etwa 15 Aminosäurereste in der folgenden Sequenz hat:
- Arg - Ile - Gln - Arg - Gly - Pro - Gly - Arg - Ala - Phe - Val - Thr - Ile - Gly - Lys, oder eine funktionell äquivalente Variante davon.
- Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein von einem Durchschnittsfachmann des Fachgebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Obgleich Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleich denjenigen sind, die hierin beschrieben werden, in der praktischen Ausführung oder zur Prüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nachfolgend die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Alle nachfolgend erwähnten Veröffentlichungen sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Sofern nicht anderweitig erwghnt, werden Standardvorgehens- oder -verfahrensweisen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, befolgt.
- Der Begriff "Variahte" oder "funktionell äquivalente Variante", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, daß das Oligopeptid Env-K&sub1; gemäß vorliegender Erfindung durch Deletion, Addition, Substitution oder Derivatisierung der hierin beschriebenen Aminosäurereste in jeder geeigneten Weise modifiziert werden kann, solange das resultierende Peptid in einer funktionell der Wirkweise von Env-K&sub1; ähnlichen Weise. fur jedes HIV-Isolat wirkt. Alle derartigen Varianten oder Derivate des Env-K&sub1;-Peptids gemäß vorliegender Erfindung sind hierin als funktionelle Äquivalente desselben eingeschlossen, wobei es sich versteht, daß mit den modernen Techniken der chemischen Synthese und Manipulationen mehrere Variationen der Aminosäuresequenz von Env-K&sub1;, während dessen essentielle biologische Eigenschaften aufrechterhalten werden, innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmannes in dem Fachgebiet, zu dem diese Erfindung gehört, liegen.
- Mit der bekannten Aminosäuresequenz von Env-K&sub1; wird das Peptid problemlos in herkömmlicher Weise unter Verwendung von im Handel erhältlichen Peptidsynthesizern (wie z.B. Applied Biosystems Model 430A) synthetisiert, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
- Die Details der Materialien und der Verfahren werden nachstehend beschrieben.
- BALB/c (H-2d) und C3H/HeN (H-2k)-Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erhalten. BALB.K (H-2k) und BALB/c Mäuse, die in bestimmten Experimenten verwendet wurden, wurden in der Kolonie gezüchtet, die auf NIH gehalten wurde. Die Mäuse wurden im Alter von 6-12 Wochen verwendet.
- vSC-8 (rekombinanter Vacciniavektor, der das bakterielle lacZ Gen enthält) und vSC-25 (rekombinanter Vacciniavektor, der das HIV env Glykoprotein gp 160 des HTLV IIIB-Isolats ohne andere strukturelle oder regulatorische HIV-Proteine exprimiert) entsprachen denen durch Chakrabarti, et al. Nature, 320: 535-537 (1986) beschriebenen.
- Ein EcoRV Fragment, das die Region des HIV Klons BH.8 enthµlt, die für gp 160 codiert, das zum Aufbau von vSC-25 verwendet wird, wurde in den von SV40 hergeleiteten Expressionsvektor pcEXV-3 geklont. Diese DNA wurde zusammen mit pSV2neo in entweder BALB/c-3T3 (H-2d) oder DAP.3 L- Zellen (H-2k)-Fibroblasten unter Verwendung eines Standardkalziumphosphat-Präzipitationsverfahrens co-transfiziert. Die Transfektanten wurden auch mit Psv2neo alleine hergestellt. Einzelne Klone wurden nach der Selektion G418 (Geneticin, GIBCO) ausgewählt, expandiert und auf die Expression des gp 160 Gens durch RNA Hybridisierung unter Verwendung des EcoRB Fragments, das durch Random Hexamer Priming markiert wurde, als Probe geprüft. T1.1.1 und T4.8.3 sind L-Zellen Transfektanten, die Ld bzw. Dd MHC-Moleküle der Klasse 1 jeweils exprimieren.
- Die folgenden mAb wurden verwendet: Anti-Lyt2 (3.155; Ratten-IgM) und Anti-L3T4 (RL172,4; Ratten-IgM)
- Mäuse wurden i.v. mit 10% &sup7;PFU rekombinanten Vacciniaviren immunisiert. Drei bis 14 Wochen später wurden immune Milzzellen (5x10&sup6;/ml in 24 Schalen enthaltenden Kulturplatten in vollständigem T-Zellenmedium) 6 Tage lang in vitro entweder mit 2,5 x 10&sup6;/ml syngenetischen Milzzellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert waren (1 Stunde, 370, MOI von 10:1), oder 2 x 10&sup5;/ml gp 160 Gen-transfizierten, MHC-identischen Fibroblasten restimuliert. Eine Langzeit-CTL-Linie wurde ebenfalls durch repetitive Stimulation der Immunzellen mit mitomycinbehandelten, gp 160 Gentransfizierten Fibroblasten und 10% Con-A Überstand enthaltendem Medium erzeugt.
- Nach der Kultivierung für 6 Tage wurde die zytolytische Aktivität der restimulierten Zellen mit dem Verfahren von Bennink, et al., Nature, 311: 578-579 (1984) gemessen, wobei eine sechsstündige Untersuchung mit verschiedenen &sup5;¹Cr-gekennzeichneten Targets, die mit verschiedenen Peptidkonzentrationen zu Beginn der Untersuchung gemischt wurden, verwendet wurde. Die prozentspezifische &sup5;¹Cr-Freisetzung wurde als 100 gerechnet (experimentelle Freisetzung - spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontane Freisetzung). Die maximale Freisetzung wurde aus Zellüberständen bestimmt, die durch Zugabe von 5% Triton-X 100 lysiert wurden. Die spontane Freisetzung wurde aus Targetzellen bestimmt, die ohne hinzugefügte Effektorzellen inkubiert wurden.
- 13 bis 23 Reste lange synthetische Peptide wurden unter Verwendung des mehrfachen gleichzeitigen Peptidverfahrens der Festphasen-Peptidsynthese in Polypropylennetz-"Teebeuteln" hergestellt, wie durch Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci.. U.S.A., 82: 5131-35 (1985) beschrieben. Herkömmliche blockierte BOC-Aminosäuren und HF-Spaltung wurden verwendet. Peptide wurden durch Umkehrphasenchromatographie auf C-18 "sep-Pak" Säulen (Waters) entsalzen und durch HPLC analysiert. Sie wurden auf das Fehlen von nichtspezifischer Toxizität oder Mitogenizität in einer Lymphknoten T-Zell-Proliferationsuntersuchung voruntersucht.
- Alternativ wird Env-K&sub1; auch durch im Handel erhältliche Peptidsynthesizer, wie z.B. Applied Biosystems Model 430A, synthetisiert.
- Bedingungen zur Auswahl von Maus-CTL, die für HIV gp 160 spezifisch sind. Die Fähigkeit von rekombinanten Vacciniaviren, für die Produkte von eingefügten viralen Genen spezifische CTL anzuregen und zu stimulieren, wurde verwendet, um CTL zu erzeugen, die für HIV gp 160 spezifisch sind, und zwar unter Verwendung von BALB/c (H-2d)-Mäusen. Die Spezifität für gp 160 wurde in drei Ebenen gefunden -- Lymphozytenanregung, Restimulation und Effektorfunktion (Tabelle 1). Somit konnte nur das rekombinante Vacciniavirus, das gp 160 (vSC-25) exprimiert, nicht das rekombinante Vacciniavirus, das das bakterielle lacz Gen (vSC-8) enthält, Mäuse zur Entwicklung von CTL anzuregen, die in der Lage sind, die gp 160 exprimierenden Fibroblasten, 15-12 (vergleiche Gruppen 2 und 4 und Gruppen 5 und 6) zu töten. Entsprechend konnten nur syngenetische vSC-25 infizierte Zellen oder das gp 160 exprimierende Transfektant 15-12, jedoch nicht Zellen, die mit dem Kontroll-Vacciniavirus vSC-8 infiziert waren, Immun-T-Zellen in vitro zur Tötung des spezifischen Targets restimulieren (Gruppen 4 und 6 gegenüber Gruppe 3). CTL von gp 160-angeregten. und restimulierten Milzzellen töteten vorzugsweise gp 160 exprimierende Targets gegenüber Kontroll-H-2-angepaßten Targets (Gruppen 4 und 6). Die geringfügige, aber signifikante unspezifische Tötung von Kontrolltargets (18 neo) durch vSC- 25-restimulierte Milzzellen trat nicht auf, wenn die Restimulation mit dem Transfektanten eher als mit Vaccinia-infizierten Zellen durchgeführten wurde. Vaccinia-(vSC-25)-infizierte Targets dienten als eine positive Kontrollgruppe. Schließlich wurde eine Langzeitlinie von CTL-Effektoren, die für gp 160 exprimierende Targets spezifisch sind, durch repetitive Stimulation von Milzzellen von vSC-25 immunisierten Mäusen mit 15-12 Transfektanten und Con A Überstand (Gruppe 7) geschaffen.
- Eine Reihe von 41 überlappenden Peptiden in 17 Clustern, die 46% der HIV gp 160 env Proteinsequenz abdecken, ausgewählt unter Verwendung des Amphipathizitätsalgorithmus zur Suche nach immundominanten T-Helferzellepitopen, die jedoch einige zusätzliche Regionen der Sequenz als Kontrolle enthielten, wurden synthetisiert, um Helferepitope zu untersuchen und wurde verwendet, um auch nach CTL-Epitopen zu suchen. Um die T-Zellepitope zu identifizieren, die durch gp 160-spezifische BALB/c CTL erkannt wurden, wurden verschiedene Konzentrationen von Peptid zu den Effektoren und &sup5;¹Cr-markierten Fibroblasten. Tumortargets zu Beginn der Versuchskultur zugegeben. Die zytotoxische Aktivität der drei Typen von Effektorzellen wurde gemessen: vSC-25-immune Milzzellen, die einmal in vitro entweder mit dem 15-12 Transfektanten oder mit vSC-25 infizierten autologen Zellen (vermutlich polyklonale Effektorpopulationen) stimuliert wurden, und die Langzeit-CTL-Linie (möglicherweise eine oligoklonale Population). Die Resultate zeigen, daß unter den verschiedenen geprüften Peptiden nur eines (Nr. 18, daher Env-K&sub1; genannt), H-2d Targetzellen für hohe Niveaus von spezifischer Tötung durch alle drei Typen von Effektoren sensibilisieren konnte (Tabelle 2). Daher wird der Schluß gezogen, daß die im Peptid Env-K&sub1; enthaltene Sequenz ein immundominantes Epitop von gp 160 für zytotoxische Zellen des H-2d Haplotyps enthält. Einige andere Peptide (Nr. 21, Nr. 41, Nr. 42, Nr. 47) schienen in sehr geringem Umfang Targetzellen zu sensibilisieren, aber diese Effekte waren im Vergleich zu der Aktivität von Env-K&sub1; nicht signifikant. Env- K&sub1; hat sich als überraschend wirkungsvoll bei der Sensibilisierung von Targets zur Tötung durch HIV spezifische CTL bei sehr niedrigen Konzentrationen des Peptids gezeigt. Beispielsweise war bei 0,1 µM Peptid die Tötung noch auf einem Plateau und erst bei 0,01 µM Peptid fiel die Tötung auf halbmaximal ab (Fig. 1). Alle aktiven Peptide wurden als zur Bildung einer amphipathischen Helix fähig identifiziert.
- Die Behandlung der CTL-Effektorzellen mit monoklonalem Antikörper anti-Lyt 2 plus Kaninchenkomplement, aber nicht mit anti-L3T4 Antikörper plus Komplement oder Komplement alleine führte zum Verlust der Tötungsaktivität an entweder den 15-12 Fibroblasten, die mit gp 160-Gen transfiziert waren, oder den Kontrollfibroblasten, die in der Anwesenheit von Env-K&sub1; inkubiert wurden (Fig. 2). Diese Daten zeigen, daß die Effektorzellen, die HIV Hüll-gp 160-Protein exprimierende Zellen in unserem System erkennen und töten, einschließlich derjenigen, die für Env-K&sub1; spezifisch. sind, herkömmliche Lyt2+L3T4-(-CD8+CD4-) CTL sind.
- Die in diesen Versuchen als Targets verwendeten Fibroblasten exprimieren MHC Genprodukte der Klasse I, jedoch nicht der Klasse II. Daher war es wahrscheinlich, daß die gp 160-spezifischen CTL, die in der Lage sind, die 15-12 Transfektanten oder die peptidtragenden Fibroblasten zu lysieren, Klasse 1 MHC Molekül-restringiert sind, wie es für Lyt2+ beeinflußte T-Zellen üblich ist. In dem H-2d Haplotyp ist von drei wichtigen Klasse I Molekülen bekannt, daß sie als Restriktionselemente verwendet werden, Kd, Dd und Ld. Um zu bestimmen, welches von diesen mit der Erkennung von Env-K&sub1; zu tun hatte, verwendeten wir zwei L-Zellen (H-2k) Transfektanten, T1.1.1 und T4.8.3, die Ld bzw. Dd exprimieren. Figur 3 zeigt, daß die Erkennung von Env-K&sub1; durch das Klasse I Dd Molekül, nicht das Ld Molekül restringiert wird.
- Wir untersuchten einen zweiten Haplotyp, H-2k, unter Verwendung desselben Protokolls wie im Fall von H-2d. L-Zellen (H-2k) wurden in ähnlicher Weise transfiziert und es wurde gezeigt, daß sie das gp 160 Gen exprimieren, aber es konnte keine zytotoxische Aktivität gegen diese Targets unter Verwendung von Milzzellen von vSC-25-immunen BALB.K (H-2k)-Mäusen entdeckt werden, die in vitro mit syngenetischen vSC-25-infizierten Milzzellen oder mit dem L- Zellen-Transfektanten selbst stimuliert wurden (Tabelle 3). In ähnlicher Weise erzeugte keines der getesteten Peptide Targets, die durch derartige Effektorzellen getötet werden konnten (Tabelle 2). Trotz dem Fehlen der gp 160-spezifischen CTL-Aktivität wurden die BALB.K Mäuse in effektiver Weise angeregt und restimuliert, da sie potente vacciniaspezifische CTL produzierten (Tabelle 3, aus demselben Experiment wie Tabelle 2). Ähnliche Ergebnisse wurden mit C3H (H-2k) Mäusen erzielt (Tabelle 3 und nicht gezeigte Daten). Da BALB.K Mäuse mit ansprechenden BALB/c Mäusen kongenetisch sind, aber den H-2k Haplotyp tragen, ist der Unterschied im Ansprechverhalten MHC-verbunden. Diese Resuitate legen nahe, daß H-2k gering auf CTL für gp 160 gemäß den vorliegenden Untersuchungsbedingungen anspricht, im Gegensatz zu H-2d, bei dem es sich um einen stark ansprechenden Haplotyp handelt.
- Das Peptid Env-K&sub1; wurde auf seine Fähigkeit zur Stimulation der in vitro Proliferation der CTL-Linie getestet, für die vorstehend gezeigt wurde, daß sie für die Hülle von HIV spezifisch ist. Die Daten in Fig. 4 zeigen, daß Env-K&sub1; die Proliferation dieser HIV-spezifischen CTL-Zellen stimuliert, wie durch die Inkorporation von trituertem Thymidin in DNA gemessen, und daß diese Stimulation in Anwesenheit des Lymphokins Interleukin-2(IL-2) verstärkt wird.
- Wenn eine Person, bei der der Verdacht besteht, daß sie AIDS ausgesetzt ist, auf HIV Antikörper getestet wird und als seronegativ festgestellt wird, ist es immer noch möglich, daß diese Person das Virus trägt, aber keine Antikörper erzeugt hat, da ein bestimmter Prozentsatz von dem Virus ausgesetzten Individuen über einen beträchtlichen Zeitraum nach der Aussetzung keine Antikörper entwickelt und einige möglicherweise niemals Antikörper entwickeln. Dessenungeachtet kann diese Person eine zellvermittelte Immunantwort in Form von CTL, die für die Hülle des Virus spezifisch sind, entwickelt haben. Da die CTL dieser Person nicht nur für das Virus, sondern auch für die Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Antigene des Individuums spezifisch sind, ist es nicht möglich, auf diese auf transfizierten Tumortargets zu prüfen, wie dies im Fall der Mäuse erfolgt ist, sofern man nicht das Glück hat, einen transfizierten Tumor zu haben, der. dieselben MHC (HLA) Moleküle wie das zu testende Individuum hat. Da so viele Human-HLA-Typen existieren, ist es nicht durchführbar, transfizierte Zellen je des Typs verfügbar zu haben.. Obgleich es miglich ist, eine transformierte Tumorlinie von dem Individuum zu erzeugen und diese mit HIV Genen zu transfizieren, ist dies ein sehr schwieriger, zeitaufwendiger und arbeitsintensiver Prozeß und wäre nicht für eine große Anzahl von Menschen ausführbar. Das Infizieren der Zellen des Individuums mit HIV erfordert den geeigneten Zelltyp, der infiziert werden kann, und würde eine Gefahr für die Labormitarbeiter darstellen, die das konzentrierte Virus handhaben. Die Verwendung der vorstehend beschriebenen Vacciniarekombinante kann viele falsch positive Resultate ergeben, da die meisten in den Vereinigten Staaten von Amerika vor 1972 geborenen Individuen mit Vaccinia als eine Pockenimpfung immunisiert wurden und so vacciniaspezifische CTL haben. Gereinigte Proteine werden allgemein nicht durch Zellen in der Weise aufgenommen, daß sie Targets für CTL werden würden. Kleine Peptide, wie etwa Env-K&sub1;, sind jedoch in der Lage, Targets für CTL zu sensibilisieren, wie wir vorstehend gezeigt haben. Daher wäre es relativ einfach, Env- K&sub1; als ein diagnostisches Reagens zum Test auf die Anwesenheit von HIV-spezifischen CTL im Peripherieblut eines Individuums zu verwenden. Dies kann durch Standardvorgehensweisen erreicht werden; zunächst erzeugt man PHA- oder ConA-Blasts der Peripherieblut-Lymphozyten des zu testenden Individuums, kennzeichnet diese mit &sup5;¹Cr, wie vorstehend angegeben, inkubiert diese mit dem Peptid Env-K1 unter Standardkulturbedingungen ähnlich den vorstehend angegebenen, jedoch für men schliche CTL Untersuchungen modifiziert, und gibt frische Peripherieblut-Lymphozyten von demselben Individuum hinzu. Nach etwa 6 Stunden mißt man die Menge von &sup5;¹Cr, das in das Kulturmedium freigesetzt wurde, und vergleicht diese mit den identisch behandelten, aber ohne Peptid behandelten Kontrollgruppen oder mit einem Kontrollpeptid ohne frische Lymphozyten und mit der maximalen &sup5;¹Cr Freisetzung, die durch detergente Lyse der Targetzellen erzeugt wurde. Wenn eine spezifische Freisetzung vorhanden ist, kann das Individuum als das HIV-Virustragend beurteilt. werden, obgleich keineantikörper entdeckt werden konnten.
- Obgleich bisher nicht bekannt ist, welche Waffen des Immunsystems, wenn überhaupt, gegen eine HIV-Infektion schützen, ist es wahrscheinlich, daß CTL aus den vorstehend umrissenen Gründen eine wesentliche Rolle spielen. Daher ist es möglich, daß seropositive, aber noch klinisch gesunde Individuen, die CTL haben, die in der Lage sind, virusinfizierte Zellen zu töten, weniger wahrscheinlich klinisches AIDS entwickeln als diejenigen ohne derartige CTL. Daher könnte Env-K&sub1; verwendet werden, um seropositive Individuen in verschiedenen Stadien der Krankheit durch die in dem vorstehenden Abschnitt dargelegten Verfahren in diagnostischer Verwendung zu testen, und wenn eine signifikante Korrelation zwischen dem klinisch gesunden Zustand und der Anwesenheit von für Env-K&sub1; spezifischen CTL existiert, dient dies als ein prognostischer Test, um vorherzusagen, welche serumpositiven Individuen einem größeren oder geringeren Risiko ausgesetzt sind, einen klinischen Immunmangel oder AIDS in vollem Umfang zu entwickeln.
- Da das Peptid Env-K&sub1; Proliferation und Expansion einer Population von HIV-spezifischen CTL stimulieren kann, kann Env-K&sub1; als ein therapeutisches Agens verwendet werden, um die Immunantwort eines Patienten zu verbessern, der bereits mit dem Virus infiziert ist. Eine derartige therapeutische Modalität könnte besser in Zusammenhang mit anderen therapeutischen oder präventiven Strategien zur Kontrolle der Erkrankung verwendet werden.
- Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß zum ersten Mal ein reines, CTL stimulierendes antigenes Produkt in vitro identifiziert und synthetisiert wurde, und zwar ohne Kontakt mit gefährlichen lebenden infektiösen Viren oder von diesen Viren hergeleiteten Produkten, das keines der mit der Händhabung von oder dem Ausgesetztsein gegenüber HIV oder von HIV hergeleiteten Produkten verbundenen Risiken aufweist.
- Ein weiterer bedeutsamer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, daß das Peptid gemäß vorliegender Erfindung es möglich macht, zellvermittelte HIV-Infektion zu entdecken und zu verhindern, die überhaupt keine Antikörper produzieren kann. Somit wären diejenigen Tests, die von der Entdeckung von Anti- HIV-Antikörpern in einer Körperprobe abhangig sind, in jenen Fällen der HIV-Infektion nutzlos, in welchen keine Antikörper erzeugt werden. Das Antigen gemäß vorliegender Erfindung bietet nun ein Mittel zur Erfassung von zellübertragener HIV-Infektion in der Abwesenheit von Antikörpern, was bisher durch die gegenwärtig verwendeten, Antikörper erfassenden Tests nicht möglich war. Wenn der Infektionsmodus wie vorstehend beschrieben eine Zellübertragung ist, wäre gleichermaßen das Neutralisieren von Antikörpern nicht schützend. Somit bietet ein Impfstoff, der das Env-K&sub1; als ein Antigen nutzt, zum ersten Mal ein Verfahren zum Verhindern einer HIV-Infektion nicht durch einen Antikörper-Neutralisierungsmechanismus, sondern durch Tötung von HIV-infizierten Zellen durch Proliferation von CTL, die durch Antigenstimulation von T-Zellen durch Env-K&sub1; erzeugt werden.
- Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Impfstoff in Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung enthält, umfaßt eine wirksame antigene oder therapeutische Menge von Env-K&sub1;, um CTL zu erzeugen, und einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger, wie etwa physiologische Salzlösung, ungiftiger steriler Puffer und dergleichen. Selbstverständlich könnten Additive, wie z.B. Konservierungsmittel, Sterilisierungsmittel, Adjuvantien und dergleichen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, ebenfalls in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten oder zu steigern. Tabelle 1. Anregungs- und Verstärkungserfordernisse für die Induzierung von zytotoxischen T-Zellen und einer Langzeit- CTL-Linienproduktion in H-2d Mäusen* Immunisierung Restimulation E/T Verhältnis % Spezifische Lyse bei Neo Tabelle 1 Fortsetzung
- BALB/c(H-2d) Mäuse wurden i.v. mit 10&sup7; PFU rekombinantem Vacciniavirus angeregt, der das HIV env Protein gp160 (vSC-25) oder das bakterielle lacZ Gen (vSC-8) exprimiert. Die Milzzellen wurden in vitro entweder mit 2,5 x 10&sup6;/ml rekombinantem Vacciniavirus (vSC-25 oder vSC-8)-infizierten syngenetischen Milzzellen oder mit 2 x 10&sup5;/ml gp160 Gen-transfizierten BALB/c3T3 Zellen (15-12) restimuliert. Die CTL Aktivität wurde gegen Neo-Gen transfizierte 3T3 Zellen (18 Neo), 15-12 und vSC-15 infizierte 15-12 Targetzellen (15-12/vSC-25) gemessen. NT: nicht getestet. E/T: Effektor-zu-Target-Verhältnis.
- + Langzeit-CTL-Linie hergestellt durch repetitive Stimulation von vSC-25 immunen Milzzellen mit Transfektant 15-12 plus Lymphokine. Tabelle 2. Identifikation von Target-Epitopen in gp160 in H- 2d und H-2k Mäusen Peptid (Sequenzposition) % Specific &sup5;¹Cr-Freisetzung* Tabelle 2 Fortsetzung Keine Tabelle 2 Fortsetzung
- Als Targets wurden 18Neo Transfektanten (H-2d) plus 10µM synthetisches Peptid für BALB/c Effektoren verwendet und L28 (H-2k) plus 10µM Peptid wurden für BALB.K Effektoren verwendet. Das Verhältnis in Klammern ist das Effektor/Target-Verhältnis. +V25/15-12 bezeichnet Effektorzellen, die von vSC25- immunisierten BALB/c Milzzellen hergeleitet wurden, die in vitro mit dem 15-12 Transfektanten restimuliert wurden (siehe Tabelle 1).++ LINIE bezeichnet die CTL-Linie, die von vSC25- immunisierten BALB/c Milzzellen hergeleitet ist, die repetitiv mit 15-12 und 10% Con-A Überstand stimuliert wurden. Die mit ** markierten Resultate wurden bei einem Effektor-zu-Target-Verhältnis zu 20/1 anstelle von 10/1 erzielt. Die Kontrolle ohne Peptid betrug 3,0% für beide Verhältnisse.
- §V25/V25 bezeichnet Effektorzellen, die von vSC25-immunen BALB/c Milzzellen hergeleitet wurden, die in vitro mit vSC25- infizierten syngenetischen Milzzellen restimuliert wurden.
- V25/V25 bezeichnet die Effektorzellen, die von vSC25-immunen BALB.K Milzzellen hergeleitet wurden, die in vitro mit vSC25- infizierten syngenetischen Milzzellen restimuliert wurden. Kontrollgruppen für BALB.K Zellen von demselben Experiment sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3. H-2k (BALB.K und C3H) Mäuse sprechen nicht auf CTL an, die für gp160 HIV env Transfektanten spezifisch sind, die das HIV Hüllprotein exprimieren.* Immunisierung Restimulation &sup5;¹Cr-Freisetzung(%) (BALB.K)
- BALB.K (H-2k) oder C3H (H-2k) Milzzellen, die mit vSC-25 immunisiert wurden, wurden in vitro entweder mit dem gp160 exprimierenden L-Zellen-Transfektanten, 25-20 oder vSC-25-infizierten syngenetischen Milzzellen geboostet. Nach dem Kultivieren für 6 Tage wurde die zytolytische Aktivität der restimulierten Zellen gegen 25-20 oder neo-gen transfizierte L- Zellen (H-2k), L28, als ein Kontrolltarget oder vSC-25-infizierte 25-20 (25-20/V25) und L28 (L28/V25) als positive Kontrolltargets gemessen.
Claims (7)
1. Peptid, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden bestehend
aus dem Env-K1-Peptid und Peptiden, die funktionell
äquivalente Varianten des Env-K1-Peptids sind, wobei die Varianten
von dem Env-K1-Peptid durch Addition, Deletion, Substitution
oder Derivatisierung wenigstens einer Aminosäure desselben
hergeleitet sein können und wobei das Env-K1 Peptid die
folgende Aminosäuresequenz hat: Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-
Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys; vorausgesetzt, daß die folgenden
Peptide, die die Sequenz: Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-
Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly-Asn-Met-Arg-Gln-Ala-
His-Cys; Leu-Asn-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Pro-Asn-
Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg;
und Thr-Arg-Pro-Asn-Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-e-Ile-f-f-
Gly-Pro-Gly, in welcher e Arg oder Tyr ist und f Gln, Arg
oder weggelassen ist, haben, ausgeschlossen sind.
2.Pharmazeutische Zusammensetzung zur Induzierung
zytotoxischer Lymphozyten, die spezifisch Zellen erkennen, die Human-
Immunschwächevirus-Antigene exprimieren, umfassend einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Peptid nach
Anspruch 1.
3. Diagnostisches oder prognostisches Kit zur Durchführung
einer Untersuchung zur Entdeckung von zellvermittelter Human-
Immunschwächevirusinfektion, umfassend:
(a) ein Peptid nach Anspruch 1;
(b) ein Mitogen, das zur Stimulierung von
Peripherieblut-Lymphozyten wirksam ist;
(c) eine Markierung zur Entdeckung der Lyse von
Peripherieblut-Lymphozyten; und
(d) Instruktionsmaterial zur Durchführung der prognostischen
oder diagnostischen Untersuchung.
4. Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Verhindern oder
Behandeln einer Human-Immunschwächevirusinfektion in einem
dafür empfänglichen Wirt, wobei die Zusammensetzung eine
ausreichende Menge des Peptids enthält, um in dem Wirt
zytotoxische Lymphozyten zu induzieren, die selektiv nur Zellen
töten, die mit dem Human-Immunschwächevirus infiziert sind.
5. Verfahren zur Diagnose der Infektion eines dafür
empfänglichen Wirtes mit einem Human-Immunschwächevirus (HIV),
umfassend die Schritte:
(a) Inkubieren von autolog markierten
Peripherieblut-Lymphozyten (PBL) von dem Wirt mit einem Peptid nach Anspruch 1, um
T-Zellen in den PBL zu aktivieren, die mit dem Virus
infiziert sind, wobei die Lymphozyten vor der Inkubation mit
einem Mitogen stimuliert wurden und die Markierung die
Erfassung des Prozentsatzes derjenigen PBL, die lysieren, erlaubt;
(b) Hinzugeben von frischen PBL von dem Wirt und Fortführen
der Inkubation für eine Zeitdauer, die ausreicht, daß
zytotoxische
Lymphozyten die aktivierten T-Zellen in den markierten
PBL lysieren;
(c) Erfassung der Anwesenheit von (HIV)-infizierten Zellen
durch Erfassung von lysierten infizierten T-Zellen durch
Messung der Anzahl von markierten PBL, die in Schritt (b)
lysieren, minus der Anzahl der stimulierten PBL, die nach der
Inkubation in Abwesenheit von dem Peptid lysieren, und minus der
Anzahl von markierten PBL, die nach der Inkubation in der
Anwesenheit des Peptids, aber in der Abwesenheit von frischen
PBL lysieren.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die PBL mit &sup5;¹CR markiert
werden und die Lyse durch die Freisetzung von &sup5;¹Cr erfaßt
wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Mitogen ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Phythämagglutinin und
Concanavalin A.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14869288A | 1988-01-26 | 1988-01-26 | |
| PCT/US1989/000172 WO1989007112A1 (en) | 1988-01-26 | 1989-01-17 | A synthetic antigen evoking anti-hiv response |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE68926499D1 DE68926499D1 (de) | 1996-06-20 |
| DE68926499T2 true DE68926499T2 (de) | 1996-12-19 |
Family
ID=22526912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE68926499T Expired - Lifetime DE68926499T2 (de) | 1988-01-26 | 1989-01-17 | Synthetisches antigen zum bewirken einer anti-hiv-reaktion |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0400076B1 (de) |
| JP (1) | JP2569185B2 (de) |
| AT (1) | ATE138077T1 (de) |
| AU (1) | AU621097B2 (de) |
| CA (1) | CA1340907C (de) |
| DE (1) | DE68926499T2 (de) |
| IL (1) | IL89012A (de) |
| WO (1) | WO1989007112A1 (de) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5030449A (en) * | 1988-07-21 | 1991-07-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Synthetic vaccine against AIDS virus |
| US5976541A (en) * | 1988-01-26 | 1999-11-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Potent peptide for stimulation of cytotoxic T lymphocytes specific for the HIV-1 envelope |
| US5128319A (en) | 1987-08-28 | 1992-07-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Prophylaxis and therapy of acquired immunodeficiency syndrome |
| US6210873B1 (en) | 1987-08-28 | 2001-04-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the priming of specific cytotoxic T-lymphocyte response |
| US5763160A (en) * | 1988-02-12 | 1998-06-09 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides and process of using same for the detection of antibodies to human immunodeficiency virus (HIV) gp120 envelope protein, diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions and as vaccines |
| EP0339504A3 (de) * | 1988-04-26 | 1990-09-12 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | Menschliches immunoinsuffizientes Virus (HIV) env-codiertes Peptid, welches im Stande ist, die HIV hemmenden Antikörper bei Säugetieren hervorzurufen |
| US5562905A (en) * | 1988-04-26 | 1996-10-08 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals |
| US5882853A (en) * | 1989-09-01 | 1999-03-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of evaluating HTLV-I-specific T cell responses |
| US5603933A (en) * | 1993-08-31 | 1997-02-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | CD4 peptides for binding to viral envelope proteins |
| CA2350911A1 (en) | 1998-11-16 | 2000-05-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hiv-specific t-cell induction |
| US7420028B2 (en) | 2001-03-27 | 2008-09-02 | Samuel Bogoch | Replikins and methods of identifying replikin-containing sequences |
| US7189800B2 (en) | 2001-03-27 | 2007-03-13 | Samuel Bogoch | Replikin peptides in rapid replication of glioma cells and in influenza epidemics |
| US7894999B2 (en) | 2001-03-27 | 2011-02-22 | Samuel Bogoch | Systems and methods for identifying Replikin Scaffolds and uses of said Replikin Scaffolds |
| US7774144B2 (en) | 2001-10-26 | 2010-08-10 | Samuel Bogoch | System and method for identifying complex patterns of amino acids |
| EP2348040A1 (de) * | 2001-07-09 | 2011-07-27 | Samuel Bogoch | Replikin-Peptide und Verwendung davon |
| US8494781B2 (en) | 2003-06-06 | 2013-07-23 | Samuel Bogoch | Systems and methods for identifying replikin scaffolds and uses of said replikin scaffolds |
| US9254315B2 (en) | 2004-04-28 | 2016-02-09 | Samuel Bogoch | Systems and methods for identifying replikin scaffolds and uses of said replikin scaffolds |
| EP2092059A4 (de) | 2006-10-24 | 2012-03-28 | Bogoch Samuel | Verfahren zur vorhersage von influenza-ausbrüchen durch korrelation eines erhöhten replikin-spiegels in white-spot- und/oder taura-viren bei krabben |
| AU2008266702A1 (en) | 2007-05-30 | 2008-12-24 | Elenore S. Bogoch | Synthetic replikin peptides against pathogenic infection of invertebrates in aquaculture |
| US9233148B2 (en) | 2009-01-09 | 2016-01-12 | Samuel Bogoch | Replikin-based compounds for prevention and treatment of influenza and methods of differentiating infectivity and lethality in influenza |
| AU2012283914A1 (en) | 2011-07-20 | 2014-01-30 | Bogoch, Elanore S. | Peptides shared among lethal cancers and therapeutic compositions comprising said peptides |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0387914B1 (de) * | 1984-10-18 | 1993-08-04 | Institut Pasteur | Hüllenantigene vom menschlichen Immunodefizienz-Virus und deren Verwendungen |
| EP0245362B1 (de) * | 1985-10-24 | 1994-06-29 | Ronald C. Kennedy | Synthetische peptide und deren verwendung zur diagnose und impfung für aids und arc |
| WO1987007616A1 (en) * | 1986-06-12 | 1987-12-17 | Biogen N.V. | Peptides involved in the pathogenesis of hiv infection |
| NZ221440A (en) * | 1986-08-20 | 1991-11-26 | Genetic Systems Corp | Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections |
| JPH0762031B2 (ja) * | 1986-12-30 | 1995-07-05 | アメリカ合衆国 | エイズウイルスおよびエイズウイルスのタンパク質に対する細胞性免疫を誘導する合成ペプチド |
| EP0366718B1 (de) * | 1987-05-29 | 1995-05-10 | Tanox Biosystems, Inc. | Hiv-1 neutralisierende monoklonale antikörper |
| IL87391A0 (en) * | 1987-08-27 | 1989-01-31 | Repligen Corp | Hiv proteins and peptides,dna coding therefor,vectors comprising such dna,the use of the proteins and peptides in diagnosis of aids and vaccine compositions containing them |
-
1989
- 1989-01-17 AT AT89903389T patent/ATE138077T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-17 WO PCT/US1989/000172 patent/WO1989007112A1/en active IP Right Grant
- 1989-01-17 JP JP1502867A patent/JP2569185B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 DE DE68926499T patent/DE68926499T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 AU AU32044/89A patent/AU621097B2/en not_active Expired
- 1989-01-17 EP EP89903389A patent/EP0400076B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-18 CA CA000588557A patent/CA1340907C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-20 IL IL89012A patent/IL89012A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03503166A (ja) | 1991-07-18 |
| AU3204489A (en) | 1989-08-25 |
| EP0400076A4 (en) | 1991-11-13 |
| ATE138077T1 (de) | 1996-06-15 |
| DE68926499D1 (de) | 1996-06-20 |
| CA1340907C (en) | 2000-02-22 |
| IL89012A (en) | 1993-07-08 |
| JP2569185B2 (ja) | 1997-01-08 |
| EP0400076B1 (de) | 1996-05-15 |
| WO1989007112A1 (en) | 1989-08-10 |
| EP0400076A1 (de) | 1990-12-05 |
| AU621097B2 (en) | 1992-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE68926499T2 (de) | Synthetisches antigen zum bewirken einer anti-hiv-reaktion | |
| DE3854952T2 (de) | Mykobakterielle rekombinanten und peptide | |
| DE69826304T2 (de) | Immunoreaktive peptid ctl epitope von menschlichem cytomegalovirus | |
| DE69333348T2 (de) | Anti-idiotypischer Antikörper und seine Verwendung zur Diagnose und Therapie bei HIV-bezogenen Krankheiten | |
| DE69105627T2 (de) | Immunreagenzien reaktiv mit einem konservierten Epitope des humanen Immundefizienzviruses I (HIV-I) GP120 und Verfahren zu deren Verwendung. | |
| DE3787002T2 (de) | Synthetische Peptide, die zelluläre Immunität gegen den AIDS-Virus und dessen Proteine erzeugen. | |
| DE69435075T2 (de) | Immunogene chimäre umfassend nucleinsäuresequenzen, die signalsequenzpeptide des endoplasmatischen reticulums und mindestens ein anderes peptid codieren, deren verwendung in impfstoffen und zur behandlung von krankheiten | |
| DE69433422T2 (de) | Monoklonaler anti-hiv antikörper | |
| DE69838486T2 (de) | Hiv-1 tat oder deren derivate für prophylaktische und therapeutische impfung | |
| DE68928130T2 (de) | Synthetische vom HIV-GP120-env-Protein abgeleitete Peptide und ihre Anwendung | |
| DE69535075T2 (de) | Antigen-markierte nicht-infektiöse retrovirus-ähnlige partikel | |
| CA2173138A1 (en) | Peptide capable of inducing immune response against hiv and aids preventive or remedy containing the peptide | |
| AT398080B (de) | Immortalisierte zellinie, verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur herstellung von monoklonalen antikörpern sowie diagnoseverfahren und -mittel | |
| DE68925660T2 (de) | Peptidfragmente von HIV | |
| DE69127694T2 (de) | Herstellung und verwendung von transfer-faktor | |
| DE69728289T2 (de) | Immunreaktive ctl-peptidepitope von humanem cytomegalovirus | |
| DE69610295T3 (de) | Von einem retroviralen regulationsprotein abstammende, detoxifierte immunogene, dagegen gerichtete antikörper, verfahren zur deren herstellung und diese immunogene oder antikörper enthaltende, pharmazeutische zusammensetzungen. | |
| DE69833686T2 (de) | Konstitutive expression von nicht-infektiöser hiv-ähnlicher teilchen | |
| DE69007571T2 (de) | Peptidfragmente von HIV. | |
| DE69434961T2 (de) | Funktion und aktivität des viralen proteins r (vpr) | |
| DE60109633T2 (de) | Immunreaktive peptidische ctl-epitope aus dem menschlichen cytomegalovirus pp150 | |
| DE69124215T2 (de) | Primaten-lentivirus impfstoffe | |
| DE60028248T2 (de) | Verfahren zur Reduzierung der Immunogenität von Staphylokinase durch Entfernen von T-Zell-Epitopen | |
| JPH10503473A (ja) | 細胞傷害性ｔリンパ球刺激およびｈｃｖ曝露診断用ｃ型肝炎ウイルスコアペプチド | |
| DE69633233T2 (de) | Multivalenter impstoff gegen bovines coronavirus und methode zur behandlung einer infektion mit bovinem coronavirus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition |