DE69522216T2

DE69522216T2 - Zielzellen-bindende chimäre Peptide

Info

Publication number: DE69522216T2
Application number: DE69522216T
Authority: DE
Inventors: Donald Leonard Nicholas Cardy; Frank Joseph Carr
Original assignee: Biovation Ltd
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2015-05-16
Also published as: ES2162917T3; EP0759944B1; AU701302B2; JPH10500670A; CA2190101A1; WO1995031483A1; ATE204300T1; US20060099216A1; AU2452195A; DK0759944T3; DE69522216D1; US20020106370A1; EP0759944A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Polypeptide, die an eine Targetzelle binden sollen, die chimären Polypeptide enthaltende Impfstoffe, sowie ein Verfahren zur Modulation der Immunreaktion eines Menschen oder Tieres.
Die Erfindung betrifft insbesondere chimäre Polypeptide, die wirksam ein oder mehrere Effektormoleküle an eine Targetzelle zur anschließenden Internalisierung durch die Zelle abgeben sollen. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung rekombinante Antikörpermoleküle mit immundominanten Peptidsequenzen, wobei diese Antikörpermoleküle über internalisierende Antigene oder Rezeptoren in Zellen eindringen und anschließend so prozessiert werden, daß sie Peptide für die Antigenpräsentation freisetzen, was entweder zur Induktion oder zur Hemmung einer Immunreaktion führt. Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten unter Verwendung dieser neuen Typen von rekombinanten Antikörpern oder Proteinen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Moleküle.

Hintergrund der Erfindung

Die Entdeckung, daß T-Zellen Antigene als Peptide, die an "major histocompatability complex"(MHC)-Moleküle gebunden sind, erkennen, führte zu Versuchen, definierte synthetische Peptide, die immundominanten T-Zellen-Epitopen entsprechen, zur Aktivierung oder Tolerisierung von T-Zellen an spezifische Antigene zu verwenden. Im allgemeinen ging man so vor, daß man mit dem immunogenen Peptid immunisierte, um eine T-Zellen-Reaktion zu induzieren, wobei man sich auf professionelle Immunsystemzellen verließ, um eine T-Zellen-Reaktion mit entweder einer vornehmlichen Reaktion durch CD8+ -zytotoxische T- Lymphozyten (CTL) für Peptide, die zusammen mit Molekülen der MHC-Klasse I präsentiert werden, oder einer vornehmlichen CD4+ -Helfer-T-Zellen-Reaktion für Peptide, die zusammen mit Molekülen der MHC-Klasse II präsentiert werden, zu induzieren. zur Behandlung von Krebs besteht zur Zeit starkes Interesse an der Induktion (bzw. dem adoptiven Transfer) von CTL, die für tumorassoziierte Antigene, wie das MAGE-1-Antigen, das von einem Großteil der menschlichen Melanom-Tumore produziert wird, spezifisch sind (von der Bruggen et al., 1991 Science 254, 1643). Außerdem besteht ein Interesse an der Identifikation von Peptiden, die mit Krankheiten wie Autoimmunität assoziiert sind, um durch Verabreichung des Autoimmunpeptids und der anschließenden Präsentation und Überstimulierung, die zur Außerkraftsetzung der peptidspezifischen CTL führt, Toleranz zu induzieren (z.B. Aichele et al., 1994 PNAS 91, 444). Außerdem besteht ein Interesse an der Identifikation von mit Krankheiten wie Allergie assoziierten Peptiden, um eine von dem Allergen induzierte TH1-Reaktion durch Immunisierung mit einem Peptidhomolog des TH1-induzierenden Epitops in eine TH2-Reaktion überzuführen. Ein weiterer Ansatz besteht in der Immunisierung mit veränderten Peptiden, die bei der Präsentation eine bestimmte T-Zelle binden, jedoch nicht aktivieren können und so schädigenden Reaktionen solcher T-Zellen entgegenwirken.
Die Erfinder sind der Meinung, daß die direkte Verwendung von Peptiden für die Aktivierung oder Toleranz spezifischer T-Zellen an Antigene, die an Krankheitsereignissen beteiligt sind, in dreierlei Form Grenzen gesetzt sind. Erstens ist die peptidinduzierte Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen für die anschließende Zerstörung abartiger krankheitsassoziierter Targetzellen auf Targetzellen beschränkt, die das entsprechende Peptid präsentieren, üblicherweise professionelle (konstitutive) oder fakultative Antigen- präsentierende Zellen sowie Zellen, die abnormale Antigene exprimieren, wie Krebszellen, die das MAGE-1- Antigen exprimieren. Es ist daher zur Zeit nicht möglich, die Aktivierung von T-Zellen durch eine Antigenpräsentation von spezifisch ausgewählten Zelltypen zu steuern. Zweitens ist die peptidinduzierte Aktivierung oder Toleranz auf die wirksame Peptidaufnahme und -präsentation durch professionelle oder fakultative Antigen-präsentierende Zellen angewiesen; die Wirksamkeit der Präsentation hängt stark von Faktoren wie der Peptidkonzentration und der Peptidformulierung mit Adjuvantien ab, die von Peptid zu Peptid verschieden sind und nicht immer zu einer spezifischen T-Zellen-Reaktion führen. Drittens ist die Peptidpräsentation auf MHC beschränkt und hängt von dem jeweiligen HLA-Typ ab, und die Aktivierung oder Toleranz von T-Zellen für ein bestimmtes immundominantes Peptid hängt daher vom HLA-Typ des Individuums ab. Weiterhin werden exogen zugesetzte Peptide (wie sie in Impfstoffen verwendet werden) normalerweise von Zellen so aufgenommen und prozessiert, daß sie dem Immunsystem nur in Assoziation mit Antigenen der MHC-Klasse II präsentiert werden - exogen zugesetzte Peptide weisen die Tendenz auf, nicht in den Prozessierungsweg, der zu einer Assoziation mit Antigenen der MHC-Klasse I führt, einzugehen, wobei diese Assoziation jedoch für das Hervorrufen einer CTL-Reaktion wesentlich ist. Für dieses Problem wurde bis jetzt noch kein zufriedenstellender Lösungsversuch unternommen.
Siegall et al. (1994) J Immunol 152, 2377-2384 beschreibt ein Fusionsprotein, das drei Bestandteile enthält: einen Translokations/Effektor-Abschnitt aus dem Pseudomonas-Endotoxin A sowie einen bindenden Abschnitt, der von einem Immunglobulinmolekül stammt.
Scardino et al. (1994) Immunol 81, 167-170 beschreibt ein Hybridmolekül mit dem von HIV abgeleiteten gp120-Molekül als bindenden Abschnitt, der mit einem Antigen (HBenvAg) gekoppelt ist. Kein Translokationsabschnitt ist erwähnt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein chimäres Polypeptid, umfassend einen bindenden Abschnitt mit spezifischer Bindungsaffinität für eine eukaryontische Targetzell- Oberflächenkomponente sowie einen Effektor-Abschnitt, bestehend aus einer oder mehreren Kopien eines immunogenen Peptids bereit; wobei die Bindung des Polypeptids an die Zelloberflächenkomponente die Internalisierung zumindest des Effektor-Abschnitts induziert wird, so daß das immunogene Peptid von MHC-Molekülen auf der Oberfläche der Targetzelle präsentiert werden kann.
Das chimäre Polypeptid kann umfassen: einen bindenden Abschnitt von einer ersten Quelle, mit spezifischer Bindungsaffinität für eine eukaryontische Targetzell-Oberflächenkomponente, und einen Effektor- Abschnitt aus einer zweiten Quelle, umfassend eine Aminosäuresequenz (ein Peptid), das fähig ist, eine biologische Wirkung auszuüben; sowie einen Translokationsabschnitt aus einer dritten Quelle, wobei der Translokationsabschnitt neben dem Effektor- Abschnitt liegt; wobei durch Bindung des Polypeptids an die Zelloberflächenkomponente die Internalisierung zumindest des Effektor-Abschnitts und des Translokationsabschnitts induziert wird, so daß der Effektor-Abschnitt in das Cytosol der Targetzelle eindringt, so daß das Peptid seine biologische Wirksamkeit ausüben kann.
Typischerweise wird das ganze chimäre Polypeptid internalisiert, dies ist jedoch nicht unbedingt erforderlich.
Der bindende Abschnitt umfaßt ein Immunglobulinmolekül (z.B. einen Antikörper) oder einen wirksamen Abschnitt davon. Der Ausdruck "Wirksamer Abschnitt" soll diejenigen Abschnitte von Immunglobulinmolekülen bezeichnen, die ein gewisses Ausmaß an spezifischer Bindungsaffinität beibehalten; dazu zählen Fab-, Fv-, SCA- und scFv-Fragmente.
Die von der Aminosäuresequenz vermittelte biologische Wirkung ist eine immunmodulatorische Wirkung. Die Aminosäuresequenz, die fähig ist, eine immunmodulatorische Wirkung auszuüben, ist vorzugsweise ein immundominantes Peptid, typischerweise ein T- Zellen-Epitop. Der Effektor-Abschnitt kann eine einzelne Aminosäuresequenz, die fähig ist, eine immunmodulatorische Wirkung auszuüben, oder mehrere solcher Sequenzen umfassen. Umfaßt der Effektor- Abschnitt des chimären Polypeptids mehrere solcher Aminosäuresequenzen, so können diese in Form einer einzelnen "Domänen"-artigen Struktur verbunden sein oder an unterschiedlichen Stellen in dem Polypeptid liegen. Auf ähnliche Weise kann es sich dann, wenn der Effektor-Abschnitt mehrere Aminosäuresequenzen umfaßt, um Wiederholungen der gleichen Sequenz oder um einzelne Kopien mehrerer unterschiedlicher Aminosäuresequenzen handeln.
Bequemerweise enthält der Effektor-Abschnitt auch ein Signal, das die Aminosäuresequenz auf ein bestimmtes Zellkompartiment richtet. Solche Signale werden unten genauer beschrieben.
Außerdem stellt die Erfindung einen Impfstoff mit dem oben definierten chimären Polypeptid sowie ein Verfahren zur Regulierung der Immunreaktion eines Menschen oder Tieres bereit. Ebenfalls in den Schutzbereich des Patents fällt ein Verfahren zur Herstellung der oben definierten chimären Polypeptide.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung nicht darauf angewiesen, daß einzelne Peptide aufgenommen und von professionellen oder fakultativen Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert werden, sondern es werden Antikörper oder Proteinmoleküle, die für die Internalisierung von Antigenen oder Rezeptoren auf einem beliebigen Zelltyp spezifisch sind, zur internen Abgabe eines oder mehrerer Peptide an diese Zellen verwendet. Bei Verdau und Prozessierung der rekombinanten Antikörper/Protein-Peptid-Moleküle können die Peptide dann durch geeignete MHC-Moleküle an die Zelloberfläche transportiert bzw. darauf präsentiert werden oder eine Wechselwirkung mit anderen intrazellulären Molekülen eingehen und innerhalb der Zelle verbleiben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von Antikörpern oder Proteinmolekülen, die durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden und innerhalb des Proteins die Sequenz eines oder mehrerer immundominanter Peptide beinhalten. Die Erfindung stellt so zum ersten Mal ein Mittel für das Targeting der Antigen-Präsentation an eine bestimmte ausgewählte Zelle bereit, wobei die Hauptanforderung aus einem internalisierenden Antigen bzw. Rezeptor, das bzw. der an einen Antikörper bzw. ein Protein, der bzw. das das zu präsentierende Peptidantigen enthält idealerweise in multiplen Kopien), gebunden ist, besteht.
Die vorliegende Erfindung weist mehrere Vorteile für die Aktivierung oder Toleranz von T-Zellen auf. Erstens können diese Peptide dadurch, daß ein Antikörper oder Protein zur Abgabe des immundominanten Peptids verwendet werden kann, über ein internalisierendes Antigen an Zellen abgegeben werden, die üblicherweise solche Peptide nicht präsentieren. Bei Krebszellen kann so zum Beispiel eine Krebszelle ein oder mehrere Peptide präsentieren, die so konstruiert sind, daß sie CTL aktivieren und die Krebszelle infolgedessen zerstört wird. Bei normalen Zellen, die durch CTL auf dem Weg der Autoimmunität zerstört werden, können diese Peptide über ein internalisierendes Antigen bzw. einen internalisierenden Rezeptor entweder in Form hoher Dosen normaler immundominanter Peptide zur Induktion von Toleranz durch Außerkraftsetzung der üblicherweise zerstörend wirkenden CTL oder in Form veränderter Peptide, die der mit der Krankheit assoziierten Aktivierung der T-Zellen entgegenwirken, abgegeben werden. Zweitens können mehrere verschiedene Peptidsequenzen oder multiple Kopien der gleichen Peptidsequenz mit einem einzelnen Antikörper oder Proteinmolekül assoziiert sein und es so ermöglichen, daß entweder eine Auswahl von Peptiden zur Präsentation durch den jeweiligen MHC-Haplotyp in dem immunisierten Individuum besteht oder daß eine hohe Dosis des Peptids über multiple Kopien auf dem Antikörpermolekül wirksam abgegeben wird. Drittens können dadurch, daß man einen Antikörper oder ein Protein zur Abgabe von immundominanten Peptiden verwendet, diese Peptide über - ein internalisierendes Antigen wirksam an spezifische professionelle Antigenpräsentierende Zellen abgegeben werden, was eine Alternative zu der weniger spezifischen Endozytose durch diese Zellen darstellt; spezifische Antigenpräsentierende Zellen können so adressiert werden, um die Art der Immunreaktion auf das immundominante Peptid besser zu steuern.
Es versteht sich, daß erfindungsgemäße Antikörper oder Proteine zur Abgabe von Peptiden in Zellen verwendet werden können, entweder für die anschließende Bindung an, und Präsentation durch, MHC- Moleküle, oder zur Bindung an spezifische intrazelluläre Moleküle, um Wirkungen wie die Blockierung intrazellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen (wie denjenigen, die an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt sind) hervorzurufen. Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung MHC-Klasse-I- sowie -Klasse-II-restringierte immundominante Peptide betrifft und gegebenenfalls auf die gezielte Induktion einer Immunreaktion auf viele unterschiedliche Antigene bei vielen unterschiedlichen Leiden wie Krebs (Induktion von CTL durch Krebszellen), Autoimmunität (Antagonismus zur Aktivierung von T-Zellen oder Toleranzinduktion), Infektion (Induktion von CTL durch infizierte Zellen, Antagonismus der T-Helfer-Zellen- Aktivierung durch Superantigen), Allergie (Umwandlung einer TH2- in eine TH1-Reaktion durch das immundominante Peptid) sowie Entzündung (Antagonismus der T-Zellen-Aktivierung) angewendet werden kann. Es versteht sich auch, daß zu den durch die vorliegende Erfindung hergestellten Antikörpern oder Proteinen auch die sogenannten "universalen" immundominanten Peptide (z.B. Tetanustoxin- und Influenzanukleoproteinpeptide), gegen die viele Individuen bereits durch Impfung oder Infektion sensibilisiert sein könnten, zählen könnten. Es versteht sich auch, daß es für die wirksame Präsentation von mit MHC der Klasse I assoziierten Peptiden durch Antikörper oder Proteine, die mittels der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, erforderlich sein kann, Sequenzen, die den Eintritt dieser Peptide in das Zytoplasma aus Kompartimenten wie den Endosomen oder den Trans-Golgi-Komplex ermöglichen, in das Molekül aufzunehmen und daß bestimmte Sequenzen (oder Domänen) dieser Art bereits aus der Literatur bekannt sind (wie die Translokationsdomänen von Toxinen wie dem Pseudomonas-Exotoxin (Donnelly et al., 1993 PNAS 90, 3530), das HIV-1-tat-Protein (Fawell et al., 1994 PNAS 91, 664) oder die endosomenstörenden Funktionen von Viren wie Adenovirus (Curiel et al., 1991 PNAS 88, 8850). Es versteht sich auch, daß zu den mittels der vorliegenden Erfindung hergestellten Antikörpern oder Proteinen auch ein Gemisch unterschiedlicher Peptide, die mit unterschiedlichen MHC-Klasse-I- oder -Klasse-II-Molekülen assoziieren und so die Chancen vergrößern, eine Immunreaktion in unterschiedlichen Populationsgruppen, die unterschiedliche HLA-Typen tragen, zu induzieren, zählen könnte. Es versteht sich auch, daß die erfindungsgemäßen Antikörper oder Proteine in unterschiedlichen Arten zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten verwendet werden könnten, darunter die Abgabe von Peptiden ex vivo zur Induktion von CTL vor der adoptiven Immuntherapie und zur Förderung der Fähigkeit von Zellen, die bereits das spezifische Peptid bzw. die spezifischen Peptide bzw. dessen/deren Analoge präsentieren, zur Aktivierung, Blockierung oder Außerkraftsetzung von T-Zellen. Es versteht sich, daß erfindungsgemäße Antikörper oder Proteine an professionelle Antigen-präsentierende Zellen wie zum Beispiel Makrophagen (z.B. über den FcRI-Rezeptor) sowie B-Zellen (z.B. über Oberflächenimmunglobulinmoleküle) adressiert werden könnten. Schließlich versteht sich, daß die erfindungsgemäßen Antikörper oder Proteine zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten verwendet werden könnten, entweder allein oder in Kombination mit anderen Molekülen, die die Wechselwirkung mit T-Zellen verstärken, wie Molekülen, die die Expression von- MHC der Klasse I und der Klasse II in gewissen Zelltypen hinaufregulieren, wie zum Beispiel Interferon-gamma, oder daß die erfindungsgemäßen Antikörper oder Proteine selbst als Impfstoffe verwendet werden könnten, und zwar dadurch, daß benachbarte immundominante B- und T-Zellen-Epitope, gegebenenfalls als mehrfache Kopien und an professionelle Antigen-präsentierende Zellen adressiert, aufgenommen werden.
Für den Fachmann versteht sich, daß eine Reihe internalisierender Antigene von den erfindungsgemäßen Polypeptiden zur intrazellulären Abgabe von Peptiden an bestimmte Zellen adressiert werden könnten. Zum Beispiel könnten MHC-Klasse-I- oder -Klasse-II-Moleküle an professionelle Antigen-präsentierende Zellen adressiert werden, um zum Beispiel eine starke Immunreaktion gegen die abgegebenen Peptide zu fördern und um die Peptide ohne ein Adjuvans an diese Zellen abzugeben. Weiterhin könnten andere professionelle Antigenpräsentierende Zellen adressiert werden, wie zum Beispiel Schleimhautzellen und Dendritenzellen, und bestimmte Untergruppen von Lymphozyten könnten dadurch adressiert werden, daß man Antikörper verwendet, die an die Lymphozytenzelloberfläche, die Antigene wie Oberflächenimmunglobuline (sIg) internalisiert, binden.
Es versteht sich für den Fachmann, daß unter Verwendung von rekombinanter DNA immundominante Peptide an vielen unterschiedlichen Stellen in einem Antikörpermolekül aufgenommen werden könnten. Es versteht sich, daß der Einbau bzw. die Konjugation dieser Peptide so sein sollte, daß die erforderliche Antikörperfunktion wie Bindungsaffinität und Clearance nicht beeinträchtigt werden. Es versteht sich jedoch auch, daß die Peptide als Teil eines unvollständigen rekombinanten Antikörperfragments wie eines Fab-, eines Fv- oder eines SCA (single chain-antibody)-Fragments, eingebaut werden könnten. Je nach dem Anwendungszweck könnte es daher bevorzugt sein, die immundominanten Peptide in eine Proteindomäne oder Struktur aufzunehmen, die so konstruiert ist, daß sie entweder die Peptide durch Maskierung einer spezifischen Erkennung durch zirkulierende oder zellgebundene Moleküle entziehen oder die Peptide so offen darbieten, daß statt der direkten Aufnahme durch ein internalisierendes Antigen eine gewisse Immunerkennung möglich ist. Bei Peptiden, die nach Internalisierung und Präsentation (insbesondere MHC-Klasse-II-restringiert) eine gute B- Zellen-Reaktion stimulieren, könnte es bevorzugt sein, die Peptide einer spezifischen Erkennung durch zirkulierende Antikörper mittels Maskierung zu entziehen, um eine vorzeitige Clearance durch das Immunsystem zu vermeiden. Schließlich versteht es sich, daß ein bivalenter (oder multivalenter) Antikörper verwendet werden könnte, der aus einem an das internalisierende Antigen bindenden Abschnitt und einem anderen Abschnitt ohne spezifische Bindungsspezifität, jedoch mit dem immundominanten Peptid entweder innerhalb oder an der Antikörperstruktur (darunter immundominante Peptideinsertion an den übliche Stellen für CDR (complementarity-determining regions; Komplementaritätbestimmende Regionen) besteht.
Die Erfindung soll nun veranschaulichend unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen genauer beschrieben werden, wobei die Fig. 1 bis 9 mehrere mögliche Konstruktionen von Antikörpern darstellen, darunter immundominante Peptide entweder in diskreten multiplen Peptiddomänen (Fig. 1 bis 8) oder als einzelne Peptidsequenzen, die aufgenommen werden, um CDR zu ersetzen (Fig. 9). Diese Figuren sind nicht dahingehend zu verstehen, daß sie einen ausschließlichen Satz von Antikörperkonstruktionen, die immundominante Peptide enthalten, darstellen sowie nicht dahingehend, daß sie den Erfindungsumfang einschränken. Bei diesen Figuren sind Antikörper gezeichnet, die CDR, VH- und VL-Domänen, d.h. variable Regionsdomänen der schweren und leichten Ketten (darunter die CDR), CL- Domänen, d.h. konstante Domänen der leichten Ketten, sowie CH1-3 (d.h. konstante Domänen der schweren Region) umfassen. Die Abschnitte des Moleküls mit den Aminosäuresequenzen, die fähig sind, eine biologische Wirkung auszuüben, sind gepunktet dargestellt.
Fig. 1 zeigt einen Antikörper, bei dem die immundominante Peptiddomäne mit multiplen Kopien des gleichen immundominanten Peptids oder alternativ einzelnen Kopien multipler Peptide (zum Beispiel um für MHC-Restriktion dadurch zu kompensieren, daß ein Bereich von Optionen, die unterschiedliche MHC- Haplotypen abdecken, bereitgestellt werden) neben die Scharnierregion ("H") in den schweren Ketten stromaufwärts von den CH2-Domänen fusioniert wurde;
Fig. 2 zeigt einen Antikörper, bei dem die immundominante Peptiddomäne neben die Scharnierregion in den schweren Ketten fusioniert wurde, wodurch die CH2- und CH3-Domäne unter Bildung eines Fab-Peptid- Hybridantikörpers ersetzt wurde;
Fig. 3 zeigt einen Antikörper, bei dem die immundominante Peptiddomäne neben die Scharnierregion in den schweren Ketten fusioniert wurde, wodurch die CH2-Domänen ersetzt wurden;
Fig. 4 zeigt einen SCA (single-chain antibody; einkettigen Antikörper), bei dem die immundominante Peptiddomäne über einen Linker-Arm neben ein rekombinantes Fv fusioniert wurde;
Fig. 5 zeigt einen Antikörper, bei dem die CH3- Domäne durch die immundominante Peptiddomäne ersetzt wurde;
Fig. 6 zeigt einen Antikörper, bei dem die immundominante Peptiddomäne neben die VL-Region in den leichten Ketten fusioniert wurde, wodurch die CL- Domänen ersetzt wurden;
Fig. 7 zeigt einen Antikörper, bei dem die immundominante Peptiddomäne neben zwischen VH- und CH1- Domänen in den schweren Ketten und zwischen die VL- und CL- Domänen in den leichten Ketten fusioniert wurde;
Fig. 8 zeigt einen bispezifischen Antikörper, der entweder durch Coexpression oder Thiolreduktion/- Oxidation eines Gemischs von Antikörper-Schwerketten hergestellt wurde, wobei in eine die immundominante Peptiddomäne neben die Scharnierregion fusioniert wurde, wodurch die CH2- und CH3-Domänen ersetzt wurden;
Fig. 9 zeigt einen Antikörper, bei dem 6 Kopien (oder 6 Varianten) des immundominanten Peptids unter Ersatz der CDR in die VH/VL-Regionen insertiert wurden; und
Fig. 10 zeigt die typische Organisation einer immundominanten Peptiddomäne für mit HLA-Klasse I assoziierende Peptide, wobei mehrere aneinander gereihte Peptidkopien mit einer Translokationsdomäne (D) und gegebenenfalls einer C-terminalen KDEL-artigen Sequenz fusioniert sind.
Die Peptiddomänen, auf die in Fig. 1 bis 8 Bezug genommen wird und die in Fig. 10 oben dargestellt werden, könnte entweder multiple Wiederholungen des gleichen immundominanten Peptids oder eine Reihe von unterschiedlichen immundominanten Peptidsequenzen innerhalb derselben Domäne umfassen. In jedem Fall können die Peptidsequenzen in Kopf-Schwanz- oder Kopf-Kopf-Anordnung wiederholt sein, vorzugsweise mit geeigneten Aminosäuren, die zwischen den Sequenzwiederholungen liegen und die durch nicht immundominante Sequenzen bereitgestellt werden. In jedem Fall könnte der immundominante Peptidgehalt von schweren und leichten Ketten gleich oder unterschiedlich sein, und Peptiddomänen können zu allen Ketten oder nur zu den beiden schweren oder den beiden leichten Ketten oder nur einer der schweren bzw. leichten Ketten oder als Teil eines bispezifischen (oder multispezifischen) Antikörpers, wobei die Peptiddomäne nur von einer oder mehreren der rekombinanten Ketten, die zur Herstellung des bispezifischen Antikörpers verwendet wurden, abstammen, zugesetzt sein. Man erkennt, daß die Anordnung der immundominanten Peptidsequenzen in der Peptiddomäne eventuell eine Optimierung für unterschiedliche Peptide, die die Domäne beinhaltet, erfordert, und eventuell dahingehend optimiert werden muß, daß eine wirksame Produktion des rekombinanten Antikörpers ohne Störung der antikörperartigen Struktur gewährleistet ist, und daß für den Fachmann solch eine Optimierung relativ einfach durch Ausprobieren durchzuführen sein müßte. Es versteht sich auch, daß eine Optimierung der Antikörper für die wirksame Prozessierung der immundominanten Peptiddomänen ebenfalls erforderlich sein kann. Jedenfalls könnte eine Optimierung unterschiedliche Anordnungen von Peptiden untereinander, unterschiedliche flankierende Aminosäuresequenzen zwischen den immundominanten Peptiden (darunter die Einführung von Sequenzen wie säurelabilen Stellen oder Peptidasestellen zur Förderung der Spaltung bei der internen Prozessierung außerhalb der immundominanten Peptidregionen) sowie unterschiedliche Kombinationen mit anderen Peptid- oder Proteinstrukturen, wie sie aus unterschiedlichen Gründen erforderlich sind (z.B. zur Verhinderung der Fehlfaltung des gesamten Moleküls oder um die immundominanten Peptide entweder internalisiert oder externalisiert in einer kugelförmigen Proteinstruktur zu erhalten), erforderlich machen. Man erkennt auch, daß bei HLA-Klasse-I-assoziierenden Peptiden zum wirksamen Transport in das Zytoplasma und zur Prozessierung darin der Zusatz einer Translokationsdomäne (oder von Translokationsdomänen) neben die Peptide, die in Tandern-Anordnung vorliegen, erforderlich sein könnte.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der möglichen Anwendungen von erfindungsgemäßen Antikörpern und sind nicht als Einschränkung des Erfindungsumfangs aufzufassen.

Beispiel 1

Die Herstellung von rekombinanten monoklonalen Antikörpern, die sich für die Behandlung und Vorbeugung menschlicher Krankheiten eignen, ist in der Literatur umfassend beschrieben (zum Beispiel: Boulianne et al., 1984 Nature 312, 643; Morrison et al., 1984 PNAS 81, 6851; Reichmann et al., 1988 Nature 332, 323; Queen et al., 1989 PNAS, p10029), und es wurden Verfahren zur Herstellung von ganzen Antikörpern aus Säugetierzellen oder anderen eukaryontischen Zellen sowie zur Herstellung von Antikörperfragmenten (z.B. Fv-, Fab- und SCA- Fragmenten) aus E. coli entwickelt. Zur Herstellung von Antikörpern aus Säugetierzellen können alle in Fig. 1 bis 3 sowie 5 bis 9 dargestellten Antikörperkonstruktionen mittels vorbekannten Verfahren hergestellt werden, darunter einem oder mehreren Klonierungsschritten, um Sequenzen, die für Peptide für die Abgabe in Zellen codieren, in das Antikörpermolekül zu insertieren. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper wie in Fig. 8 dargestellt sind ebenfalls für Säugetierzellen vorbekannt, und bispezifische Antikörperfragmente können auch von Bakterien erzeugt werden. Als Beispiel und um den Nutzen solcher Antikörper für den Impfschutz zu veranschaulichen, wurde ein rekombinanter Antikörper hergestellt, der für die nichtvariable Kette des Klasse-II-MHC-Antigens auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen spezifisch war. Der Ausgangspunkt war die Hybridomzellinie DA6.231 von der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC Nr. 90110606). Die Zellen wurden in RPMI1640 und 10% fetalem Rinderserum gezüchtet. Die Isolation der mRNA und die Klonierung von scFvs (single-chain Fvs) folgte der in einem "Recombinant Phage Antibody System" (Pharmacia, Milton Keynes, Großbritannien) empfohlenen Vorschrift unter Verwendung von Reagentien in einem vom Hersteller bereitgestellten Kit, wobei in den Klonierungsvektor pCANTAB5E und den Helferphagen K07 (die beide Bestandteil des Kits sind) kloniert wurde. Zur Isolation spezifischer scFvs wurde Klasse-II-MHC- Antigen gemäß von Heyningen et al. (1982 Immunogenetics 16, 459-469) hergestellt, wobei der Antikörper DA6.231 zur Aufreinigung des Klasse-II-MHC-Antigens aus DAUDI- Lymphoblastomzellen (ECACC Nr. 85011437) verwendet wurde. Das von 10&sup8; Zellen erhaltene lösliche Antigenpräparat wurde auf 3 · T25 Gewebekulturflaschen (Costar) aufgezogen, so daß die Phagenpartikel anschließend gewaschen und verbleibende bindende Phagenpartikel nach drei Waschschritten wiedergewonnen werden konnten. Klone des wiedergewonnenen Phagen wurden durch anschließende ELISA-Assays mit Klasse-II- Antigen oder unbedeutenden Antigenen, die in 96-Well- Kunststoffmikrotiterplatten absorbiert waren, auf spezifische Bindung an Klasse-II-MHC-Antigen geprüft. Für die Analyse wurde mit Peroxidase markierter anti- M13-Antikörper, wie er in dem Kit von Pharmacia bereitgestellt wird, verwendet. Zur Infektion von HB2151- Zellen wurde schließlich ein einzelner Phagenantikörper mit der Bezeichnung anti-MHCII verwendet, um zu löslichen rekombinanten Phagenantikörpern zu gelangen.
Alle weiteren Schritte der DNA-Manipulation wurden gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, zweite Ausgabe, 1989) durchgeführt. Zur Insertion der Peptidsequenzen wurden synthetische Oligonukleotide mit einem Synthesegerät von Applied Biosystems, Typ 430A, synthetisiert und durch Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Die Sequenzen lauteten folgendermaßen (Seq ID Nr. 1 bis 6):
Die Oligonukleotide P53-U und -L (die für das Peptid KYICNSSCM, das mit p53-CTL reaktionsfähig ist, codieren (Noguchi et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3171-3175)) sowie FLU-U und -L (die für das Influenza- A-Matrixproteinpeptid GILGFVFTL, welches mit influenzaspezifischen CTL reaktionsfähig ist, codieren (Gammon et al., 1992 J Immunol. 148, 7-12)) wurden mit ³²P unter Verwendung von Polynukleotidkinase und ³²P-ATP 5'-markiert und assoziieren gelassen, 4 Stunden mit T4- DNA-Ligase (Life Technologies, Paisley, Großbritannien) bei 37ºC mit sich selbst ligieren gelassen und in einem präparativen Polyacrylamid-Sequenziergel analysiert. Die Banden bei 180 Basenpaaren, die 5 mit sich selbst ligierte Kopien von P53-U/L oder FLU-U/L darstellten, wurden aufgereinigt, mit phosphorylierten NotI-Linkern (Nr. 1127, New England Biolabs, Hitchin, Großbritannien) ligiert und mit NotI (Pharmacia) verdaut.
pCANTAB5-anti-MHCII-scFv-Phagen-DNA wurde mit NotIl (Pharmacia) verdaut. An einige Proben wurden TAT- U- und TAT-L-Oligonukleotide assoziieren gelassen und direkt mit dem mit NotI verdauten Vektor ligiert und zur Transformation von E. coli-TG1-Zellen verwendet. DNA von Rekombinanten, die die TAT-Sequenzen trugen, wurde weiter mit NotI verdaut (anti-MHCII/tat), um anschließend die P53- und FLU-Pentamere zu klonieren. Mit NotI verdauter anti-MHCII oder anti-MHCII/tat wurde mit den gereinigten 180-Basenpaaren-Banden der p53- oder flu-Epitope ligiert und zur Transformation von TG1-Zellen verwendet. Nach der Klonierung und Überprüfung der Bindung an Klasse-II-MHC-Antigen mittels ELISA wurden lösliche Antikörper anweisungsgemäß mit dem Recombinant Phage Antibody System durch Infektion von HB2151-Zellen mit Phagen erzeugt.
Zur Herstellung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), die für das obengenannte p53-abgeleitete Peptid spezifisch sind, wurde wie zur Herstellung von Langzeit-CTL-Linien nach dem in-vivo-Mauspeptidimmunisierungs- und Sensibilisierungsprotokoll von Noguchi et al. (Zitat oben) vorgegangen. Zur Prüfung von Antikörpern auf die Fähigkeit, CTL-Aktivität zu induzieren, verwendete man Sp2/0-Target-Mauszellen (ATCC CRL-1581), die in DMEM und 10% fetalem Rinderserum erhalten wurden. Für die CTL-Assays wurden Zellen in einer Dichte von 5 · 10&sup5; Zellen/ml über Nacht mit 20 uCl (7,4 MBq) &sup5;¹Cr-Chromat markiert. Die Zellen wurden dann pelletiert, in Medium gewaschen und in einer Dichte von 5 · 10&sup5; Zellen/ml in Medium mit Verdünnungen der Antikörperfragmente oder 10 ug/ml Peptid KYICNSSCM ("nur p53-Peptid") 4 Stunden bei 37ºC resuspendiert. Die Zellen wurden dann neu pelletiert, zweimal mit PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) gewaschen und in einer Dichte von 5 · 10³ Zellen in 100 ul in RPMI-1640-Medium plus 10% fetalem Rinderserum in 24-Well-Platten ausplattiert. Dann wurde mit 100 ul CTL versetzt, wodurch man zu Effektor : Target-Verhältnisse von 20 : 1, 10 : 1 und 5 : 1 gelangte, und man inkubierte 4 Stunden bei 37ºC. Nach der Inkubation wurde von jedem Well 100 ul Kulturüberstand vorsichtig in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen und zentrifugiert, und 20 ul-Portionen des Überstands wurden in dreifacher Wiederholung in einem Szintillationszähler gezählt. Der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung wurde mit folgender Formel berechnet: [(Freisetzung durch Effektorzellen - spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung - spontane Freisetzung)] · 100. Man gelangte zu den folgenden Ergebnissen:
Diese Ergebnisse zeigten die Induktion der Zellenlyse im Anschluß an Inkubation mit für Klasse-II- MHC-Moleküle spezifischen Antikörpern, die die p53- Peptidsequenz tragen, jedoch nicht für Anti-MHC-Klasse- II, die die Influenza-Nukleoproteinpeptidsequenz tragen. Die Ergebnisse zeigten auch, daß die Zugabe der tat-Sequenz zu einer verstärkten lytischen Wirksamkeit führte.

Beispiel 2

Um die Nützlichkeit rekombinanter Antikörper, CTL an Krebszellen zu adressieren, zu veranschaulichen, wurde ein rekombinanter Antikörper hergestellt, der für das MBr1-Antigen (Menard et al., 1983 Cancer Research 43, 1295-1300) auf bestimmten Krebszellen spezifisch war. Die Sequenz der variablen Immunglobulinregionen bei dem Maus-Antikörper (Orlandi et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837) wurde als Ausgangspunkt verwendet; sie wurde nach Standardverfahren durch ortsgerichtete Mutagenese der variablen Regionen der Plasmide M13-VHPCR1 und M13-VKPCR1 (Orlandi et al., Zitat oben) erstellt. Die Plasmide MBr1 M13-VHPCR1 und M13-VKPCR1 wurden mit PstI/BstEII bzw. PvuII/BclI verdaut und die kleinen Fragmente wurden einer Gelreinigung unterzogen. Diese Fragmente wurden dann mittels PCR mit dem Pharmacia Phage Antibody System amplifiziert, und die einzelnen Phagenklone wurden mit ELISA auf Bindung an MCF7- Brustkrebszellen (ECACC Nr. 86012803) unter Verwendung des anti-M13-Antikörpers durchmustert. Aus positiven Phagen wurden durch Infektion von HB2151-Zellen lösliche scFvs hergestellt. Anschließend wurden pentamere P53- oder FLU-Sequenzen mit oder ohne das tat-Peptid wie in Beispiel 1 oben in MBr1-spezifische Phagen kloniert.
Humanzytotoxische T-Lymphozyten (CTL), die für das flu-Peptid GILGFVFTL spezifisch waren, stammten von einem normalen HLA-A2-Spender und wurden wie von Bednarea et al., (1991 J. Immunological Methods 139, 41-47) beschrieben, weiter erhalten. Die Antikörper wurden wie in Beispiel 1 mit Effektor : Target- Verhältnissen von 40 : 1, 20 : 1 und 10 : 1 auf die Fähigkeit, eine CTL-Aktivität gegen MCF7-Targetzellen zu induzieren, geprüft. Man gelangte zu den folgenden Ergebnissen:
Diese Ergebnisse zeigten die Induktion der Zellenlyse im Anschluß an Inkubation mit für MBr1- Moleküle spezifischen Antikörpern, die die flu- und tat-Peptidsequenzen tragen, jedoch nicht für Antikörper, die die p53-Peptidsequenz tragen. Ein Nichtvorhandensein der tat-Sequenz führte bei den flu-Peptiden nur zu einer geringfügigen Erhöhung der Zellenlyse durch scFv.

Beispiel 3:

In einem weiteren Beispiel zur Veranschaulichung der Erfindung war es möglich, den Antikörper von Fig. 1 unter Beinhaltung multipler, in Tandern- Anordnung vorliegender Kopien der von den Genen MAGE-1, -2 und -3 (von den Eynde et al., 1989 Int. J. Cancer 44, 643) stammenden CTL-induzierenden Nonapeptiden herzustellen und zwar mit geeigneten Abständen, die von kurzen Folgen nicht immundominanter Aminosäuren zwischen den immundominanten Peptiden bereitgestellt wurden, sowie mit daneben bereitgestellten Translokationsdomänen, wie vom HIV-1-tat-Protein. Dies konnte dann an einen Patienttypen als HLA-A1, welcher einen Krebs mit internalisierendem Antigen (wie Lewis- Y) birgt, so verabreicht werden, daß der Antikörper in den Tumor internalisiert und gegebenenfalls dem Immunsystem die MAGE-Nonapeptide präsentiert. Dies konnte dann MAGE-spezifische CTL aktivieren, die dann den Tumor lysieren; es ist jedoch auch möglich, den Patienten mit MAGE-Peptiden oder einem Antikörper wie in Beispiel 3 vorzuimmunisieren, um MAGE-spezifische CTL auszuweiten und vorzuaktivieren.

Beispiel 4:

Als Alternative zu Beispiel 1 könnten Antikörper auf gleiche Weise hergestellt werden, wobei diese Antikörper jedoch Klasse-II-MHC-restringierte Peptide wie das Tetanustoxinpeptid P2 (Panina-Bordignon et al., 1989 Eur. J. Immunol. 19, 2237) enthalten und denen die Zytoplasma-Translokationsdomäne fehlt. Solche Antikörper würden einem Krebspatienten mit einem entsprechenden HLA-DR-Typ zur Präsentation von P2 verabreicht werden. Ist wiederum der Antikörper für ein internalisierendes Antigen auf den Krebszellen spezifisch, so internalisiert der Antikörper in den Tumor und präsentiert dem Immunsystem gegebenenfalls die P2- Peptide. Dies kann dann P2-spezifische T-Helferzellen dazu aktivieren, Lymphokine freizusetzen und B-Zellen zu aktivieren und kann auch CTL aktivieren, die dann den Tumor lysieren; weiterhin kann eine stärkere Antitumorreaktion erzeugt werden, wenn der Patient mit P2-Peptid oder einem Antikörper wie in Beispiel 3 vorimmunisiert wird, um P2-spezifische CTL zu erweitern und vorzuaktivieren.

Beispiel 5:

Als Alternativen zu den Beispielen 1 und 2 könnten Antikörper auf gleiche Weise hergestellt werden, die jedoch eine Spezifität für ein internalisierendes Antigen auf professionellen Antigen- präsentierenden Zellen aufweisen, wie Spezifität für Klasse-II-MHC-Antigen oder Spezifität für Oberflächen- Ig auf B-Zellen, und die Peptide beinhalten, die zum Beispiel von Krebszellen präsentiert werden (z.B. für MAGE-1-3, ein Großteil der malignen Melanomkarzinome des Menschen). Bei Verabreichung an einen Krebspatienten mit einem entsprechenden MHC-Typ für die Präsentation der innerhalb des Antikörpers getragenen Peptide müßten diese prozessiert und von den Antigenpräsentierenden Zellen dem Immunsystem präsentiert werden, was dann eine Immunreaktion gegen das Krebsantigen, das von den präsentierten Peptiden dargestellt wird, stimulieren würde. Außerdem könnten Antikörper aus den Beispielen 1 und 2 in Kombination mit dem Antikörpertyp dieses Beispiels verwendet werden, um das Antigen für die wirksame Aktivierung der T-Zellen wirksam auf den Targetzellen zu präsentieren.

Beispiel 6

Als Alternativen zu den Beispielen I bis 3 könnten Antikörper auf gleiche Weise zur Verwendung bei Autoimmunerkrankungen hergestellt werden, bei denen die immundominanten Autoimmunpeptide bekannt sind. Zum Beispiel könnten T-Zellen, die an der Verschlimmerung von normalem Gewebe bei der Krankheit beteiligt sind, dadurch zerstört oder gehemmt werden, daß man einen Antikörper schafft, der für ein internalisierendes Antigen auf einer professionellen antikörperproduzierenden Zelle wie in Beispiel 3 spezifisch ist, oder dadurch, daß man die Zellen der Gewebe, die einer Verschlimmerung unterliegen, als Targets verwendet (z.B. bei Basedow-Thyreoiditis die Schilddrüsenzellen über den TSH-Rezeptor). Auf jeden Fall würde der Antikörper multiple Kopien des immundominanten Autoimmunpeptids beinhalten, um Toleranz zu induzieren, oder er würde veränderte Peptide beinhalten, die bei der Präsentation an schädigende T-Zellen binden, diese jedoch nicht aktivieren können, wodurch Autoimmunität verhindert wird.

Beispiel 7:

Als Alternative zu Beispiel 3 könnten Antikörper hergestellt werden, die eine Spezifität für ein internalisierendes Antigen auf professionellen Antigenpräsentierenden Zellen aufweisen, wie Spezifität für Klasse-II-MHC-Antigen oder Spezifität für Oberflächen- Ig auf B-Zellen, und die immundominante Peptide, die von Agentien von Infektionskrankheiten abstammen (z.B. dem HIV-V3-Schleifen-Epitop, der bei vielen HIV- Isolaten konserviert ist), beinhalten. Bei Verabreichung an einen infizierten Patienten mit einem entsprechenden MHC-Typ für die Präsentation der innerhalb des Antikörpers getragenen Peptide müßten diese prozessiert und von den Antigen-präsentierenden Zellen dem Immunsystem präsentiert werden, was dann eine Immunreaktion gegen das infektiöse Agens stimulieren würde. Tatsächlich könnten derartig verwendete Antikörper wirksame Impfstoffagentien als Alternative zu Impfstoffen, die Peptide oder lebende/attenuierte infektiöse Agentien, die von den Antigen-präsentierenden Zellen eventuell nicht wirksam prozessiert werden, enthalten, darstellen.

Beispiel 8:

Als Alternative zu Beispiel 3 könnten Antikörper mit Spezifität für ein internalisierendes Antigen auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen hergestellt werden, die immundominante Peptide, die von Allergenen, welche normalerweise eine TH2-Allergenreaktion induzieren, abstammen, beinhalten. Bei Verabreichung vorzugsweise an die Schleimhautoberflächen eines sensibilisierten Patienten mit einem entsprechenden MHC-Typ für die Präsentation der innerhalb des Antikörpers getragenen Peptide müßten diese prozessiert und von den Antigen-präsentierenden Zellen dem Immunsystem präsentiert werden, was dann vorzugsweise die Induktion von TH1-Zellen statt TH2-Zellen stimulieren würde, um so die Allergenreaktion auf das Allergen zu mildern. Tatsächlich könnten auf diese Weise verwendete Antikörper wirksame Impfstoffagentien als Alternative zur Impfung mit Allergenpräparaten, die von den Antigen-präsentierenden Zellen eventuell nicht wirksam prozessiert werden, darstellen.

Beispiel 9:

Als Alternative zu Beispiel 3 könnten Antikörper mit einer Spezifität für ein internalisierendes Antigen auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen hergestellt werden, die immundominante Peptide beinhalten, welche von Autoimmunantigenen, die üblicherweise eine T-Helfer-Reaktion induzieren, abstammen. Bei Verabreichung an einen betroffenen Patienten mit einem entsprechenden MHC-Typ für die Präsentation der innerhalb des Antikörpers getragenen Peptide müßten diese prozessiert und von den Antigen-präsentierenden Zellen dem Immunsystem präsentiert werden, was dann eine Toleranz bei den für die Autoimmunreaktion verantwortlichen T-Helfer-Klonen induzieren würde. Tatsächlich könnten auf diese Weise verwendete Antikörper wirksame Alternativen zu Peptidimpfstoffen darstellen.

SEQUENZBESCHREIBUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: ECLAGEN LIMITED
(B) STRASSE: Marischal College, Broad Street
(C) STADT: Aberdeen
(D) LAND: Großbritannien
(F) POSTLEITZAHL: AB9 1AS
(G) TELEFON: (01224) 273002
(H) FAX: (01224) 273198
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verbesserungen bei oder in bezug auf Peptidabgabe
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENSPEICHER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID N0: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 1:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID N0: 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
ERSATZBLATT (REGEL 26) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 2:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID N0: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
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(2) INFORMATION ZU SEQ ID N0: 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 4:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID N0: 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 5:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID N0: 6:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
ERSATZBLATT (REGEL 26)
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 6:
ERSATZBLATT (REGEL 26)

Claims

1. Chimäres Polypeptid, umfassend: einen bindenden Abschnitt, enthaltend ein Immunglobulinmolekül oder einen wirksamen Teil davon, mit spezifischer Bindungsaffinität für eine eukaryontische Targetzell- Oberflächenkomponente, und einen Effektor-Abschnitt, bestehend aus einer oder mehreren Kopien eines immunogenen Peptids; wobei durch Bindung des Polypeptids an die Zelloberflächenkomponente die Internalisierung zumindest des Effektor-Abschnitts induziert wird, so daß das immunogene Peptid von MHC- Molekülen auf der Oberfläche der Targetzelle präsentiert werden kann.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem es sich bei der Zelloberflächenkomponente um ein Antigen oder ein Rezeptormolekül handelt.

3. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Peptid nach der Internalisierung in Assoziation mit einem Klasse-I-MHC-Antigen auf der Oberfläche der Targetzelle präsentiert wird, so daß eine CTL-Reaktion moduliert werden kann.

4. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Peptid nach der Internalisierung in Assoziation mit einem Klasse-II-MHC-Antigen auf der Oberfläche der Targetzelle präsentiert wird, so daß eine T-Helferzellen-Reaktion moduliert werden kann.

5. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Effektor-Abschnitt ein oder mehrere immundominante T-Zellpeptid-Epitope enthält.

6. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Effektor-Abschnitt mehrere Wiederholungen des gleichen Peptids, das einen immunmodulierenden Effekt ausüben kann, enthält.

7. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Effektor-Abschnitt mehrere verschiedene Peptide enthält, derart, daß die verschiedenen Peptide von den entsprechenden MHC- Antigenen eines unterschiedlichen Haplotyps präsentiert werden können.

8. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Zelloberflächenkomponente aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: MHC-Klasse-I- Antigen; MHC-Klasse-II-Antigen; FcRI-Rezeptor; B- Zellen-Oberflächenimmunglobulin; Lewis-Y-Antigen; TSH- Rezeptor und MBrl-Antigen.

9. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Effektor-Abschnitt eine aus der folgenden Gruppe ausgewählte Peptideinheit(en) enthält: MAGE-1-, -2- oder -3-Antigen; Tetanustoxin-P2-Peptid; HIV-V3-Schleifen-Epitop; p53-Anti-Onkogen; Protein; Matrixprotein des Influenzavirus; und Nukleoprotein des Influenzavirus.

10. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin enthaltend ein Signal, mit dem die Peptideinheit(en) auf ein bestimmtes Zellkompartiment gerichtet wird.

11. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend einen Translokationsabschnitt, der sich von der Translokationsdomäne eines bakteriellen Exotoxins oder eines HIV-tat-Protein oder der Endosomenunterbrechungsfunktion eines Adenovirus ableitet.

12. Polypeptid nach Anspruch 11, bei dem sich das Signal von der Translokationsdomäne des Pseudomonas- Exotoxins ableitet.

13. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem es sich bei der Targetzelle um eine "professionelle" Antigen-präsentierende Zelle (APC) handelt.

14. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem es sich bei der Targetzelle um eine anomale, virusinfizierte oder in anderer Weise erkrankte Zelle handelt.

15. Polypeptid nach Anspruch 14, bei dem es sich bei der Targetzelle um eine Tumorzelle handelt.

16. Polypeptid nach Anspruch 14 oder 15, bei dem es sich bei der Zelloberflächenkomponente um ein tumorassoziiertes Antigen handelt.

17. Impfstoff zur Stimulierung einer Immunreaktion; enthaltend eine wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche zusammen mit einem physiologisch unbedenklichen Trägerstoff.

18. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Immunreaktion eines Menschen oder Tieres.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei durch die Verabreichung des Medikaments die Targetzelle dazu veranlaßt wird, auf ihrer Oberfläche zusammen mit einem MHC-Antigen eine Aminosäuresequenz zu präsentieren, die normalerweise nicht von der Targetzelle präsentiert werden würde.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei durch die Verabreichung des Medikaments die Targetzelle dazu veranlaßt wird, ein CTL-Epitop zu präsentieren, das dem Patienten fremd ist.

21. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Verwendung in der Medizin.