JPH03503166A - 抗ｈｉｖ応答を喚起する合成抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ＨＩＶ抗体を喚起する合成抗原 技術分野 本発明は、一般に、エイズ用ワクチンおよび診断または予後試薬の分野に関する 。より詳細には、本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）抗原に対するＴ 細胞による細胞毒性およびＨＩＶ特異性ＣＴＬの増殖を引き出す合成オリゴペプ チドに関する。

背景技術 後天性免疫不全症候群（エイズ）と戦う各種の戦略が、開発されつつある。ヒト 免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）のエンベロープタンパク質は、抗ＨＩＶ抗体を発 生するために抗原剤として使用されている。このアプローチは、ウィルスに対す る中和抗体を引き出すという機構に重点を置いている。

しかしながら、ＨＩＶ感染の異なる形態は、ＨＩＶの直接細胞対細胞伝達である 。かかる細胞媒介機構は、細胞外ウィルスによる新たな感染を必要としない。従 って、抗体によるウィルスの接近性および中和に依存する治療法は、細胞媒介感 染の場合には有効ではないであろう。

細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ウィルス感染に対する抵抗において重要な 役割を果たすことが報告されている（カスト等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６４ ニア２３−７４８　（１９８６））。しかしながら、標的（ＨＩ　Ｖ−抗原発現 細胞）を選択的に殺すためにＴ細胞の増大された産生を模擬する合成ペプチドは 、従来、知られていないか、同定されていない。

発明の開示 それゆえ、本発明の目的は、ＨＩＶ抗原発現細胞に対して特異的に細胞障害Ｔ細 胞を刺激することができる単離合成ペプチドを提供することにある。単純化のた めに、本発明のペプチドは、ここでｒＥｎｖ−ＫＩＪと示す。

本発明の更に他の目的は、ＨＩＶ特異性ＣＴＬの産生を刺激するために抗原量の Ｅｎｖ−に１ペプチドを含む医薬組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、ＨＩＶを検知するかＨＩＶ感染経路を予測するための診断 または予後キットを提供することにある。

本発明のなお更に他の目的は、ＨＩＶ感染を受けやすい宿主に、ＨＩＶ特異性Ｃ ＴＬを産生するのに有効な量のＥ　ｎ　ｖ　−Ｋ　１ペプチドを投与することを 特徴とするＨＩＶ感染の予防法を提供することにある。

本発明の他の目的および利点は、本発明の詳細な説明から明らかになるであろう 。

図面の簡単な説明 本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および付随の利点の多くは、添付図 面と関連して考慮する時に下記の詳細な説明を読む際により良く理解されるであ ろう。

第１図は、エンベロー　ブ特異性ＣＴＬ用標的の感作用Ｅｎｖ　　Ｋ１の投与量 一応答を示す。エフェクターＣＴＬ系統細胞（５Ｘ１０４／ウエル）を５１ＣＲ 標識新生遺伝子移入ＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３繊維芽細胞（Ｈ−２ｄ）標的細胞（５Ｘ １０３／ウエル）の存在下で各種の濃度のＥｎｖ−に工を有する検定培養液に加 えた。３７℃で６時間インキュベーション後、培養上澄みを収穫し、放射能をγ 計数装置で測定した。特異性５１ｃ、放出を後述のように計算した。標的細胞用 自然放出は、２５％未満であった。

第２図は、Ｅ　ｎ　ｖ　−Ｋ　１含有細胞に特異性のＨ，−２ＣＴＬ系統の表現 型を示す。５１ｃ、標識ＢＡＬ３／ｃ３Ｔ３新生遺伝子トランスフエクタント５ Ｘ１０３をＥｎｖ　　ＫＩ　　ＩＭの存在下で数種のエフェクター標的比率で長 期抗ｇｐ１６０ｃＴＬ系統からの細胞と共に培養した。エフェクター細胞をモノ クローナル抗体抗Ｌ３Ｔ４プラス補体（■−■）、抗Ｌｙｔ２プラス補体（◇− 〇）または補体のみ（◆−◆）で前処理した。（ローロ）は、未処理コントロー ル群を示す。

第３図は、ペプチドＥ　ｎ　ｖ　−Ｋ　１に特異性のＣＴＬがクラス１分子Ｄｄ によって制限されることを示す。長期系統からのエフェクター細胞５Ｘ１０４を 各種の濃度のＥｎｖ−Ｋ　　の存在下で５１ｃｒ標識標的５×１０３と共に培養 した。Ｔ１．１．１．　　（◆−◆）およびＴ４．８．３　（■−■）は、それ ぞれＬ　およびＤｄを発現するし細胞Ｈ−２ｋ）ランスフェクタントを示す。

新生遺伝子移入３７３繊維芽細胞、１８−ネオ、（Ｋｄ、Ｌｄ、Ｄｄ）（ローロ ）を正のコントロールとして使用し、新生遺伝子移入し細胞、Ｌ２８、ＣＫ　ｋ 　、　Ｄｋ　）（◇−◇）を負の標的コントロールとして使用した。ペプチドの 不在下での特異性溶解は、４種の標的の場合にそれぞれ−０，２，０，３，１， ５および０．０２％であった。自然放出は、１４．６〜１６．６％であった。

第４図は、Ｉ　Ｌ−２の存在下でのＥ　’ｎ　、　ｖ　−Ｋ　１によるＣＴＬ系 統の増殖の刺激を示す。パネル４Ａは、９６個のウェル平底の培養プレート中で 培地２００μｇ中でマイトマイシンＣ処理（５０ｕ　ｇ／ｍｌ、　３７℃、３０ 分）１８ネオトランスフエクタント（Ｈ−２ｄ）２ｘｌＯ４の存在下で１０％Ｉ Ｌ−２（系統を調製し且つ維持する場合と同じ源）の有無で系統細胞ｌＸ１０４ をＥ　ｎ　ｖ　−Ｋ　１　（ペプチドＮ１１８）０．１ｄＭまたはペプチドなし で刺激したことを示す。３日後、ウェルを３Ｈ−チミジン１μＣＬ　（６，７Ｃ ｉ／ミリモル）でパルス化し、追加の１６時間後、３Ｈ活性をβ−シンチレーシ ョン計数によって測定した。パネル４Ｂは、系統細胞１×１０４を９６個のウェ ル平底の培養プレート中で培地２００μｇ中で照射（３３００ラド）ＢＩＯ，Ｄ ２牌臓細胞（ＳＣ）（Ｈ−２）４ｘ１０５の存在下で１０％！Ｌ−２の有無で０ ．　１Ｍ　　Ｅｎｖ−に１（ペプチド魔１８）またはペプチド魔３０またはペプ チドなしで刺激したことを示す。チミジン組み込みをパネルＡと同様に測定した 。

発明を実施するための最良の形態 本発明の前記目的および各種の目的および利点は、下記配列 Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ− Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ で約１５種のアミノ酸残基を有する単離合成オリゴペプチド、Ｅｎｖ−に１また はその機能的に均等の変異体によって達成される。

特に断らない限り、ここで使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明 が属する当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載の 方法および材料と同様または均等のいかなる方法および材料も、本発明の実施ま たは試験で使用できるが、好ましい方法および材料を今や記載する。後述のすべ ての刊行物は、ここに参照として編入する。特に断らない限り、当業者に周知の 標準法または方法に従う。

ここで使用する「変異体」または「機能的に均等の変特表平３−５０３１６６　 （３） 異体」なる用語は、得られるペプチドがいかなるＨＩＶ単離物に対してもＥｎｖ −に１の機能法と同様の機能法で作用する限り、本発明のオリゴペプチド、Ｅｎ ｖ−に１は、いかなる好適な方法でも、ここに記載のアミノ酸残基の欠失、付加 、置換または誘導化によって修飾できることを意味する。本発明のＥｎｖ−に１ ペプチドのすべてのかかる変異体または誘導体は、それらの機能均等物であると ここで包含され、化学合成および操縦の現代の技術を使用してＥｎｖ−に□のア ミノ酸配列の数種の変化は、必須の生物学的性質を維持しながら、本発明が属す る分野の当業者の範囲内であることが理解される。

Ｅｎｖ−に１のアミノ酸配列を仮定すると、ペプチドは、当業者に周知の市販の ペプチドシンセサイザー（例えば、アプライド・バイオシステムズ拳モデル４３ ０Ａ）を使用して容易且つ好都合に合成する。

材料および方法の詳細について今や記載する。

ＨｅＮ　（Ｈ−２ｋ）マウスをジャクソン・ラボラトリーズ（メーン州バー・ハ ーバ−）から得た。成る実験で使用したＢＡＬＢ、Ｋ　（Ｈ−２ｋ）およびＢ　 Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスをＮＩＨに維持されたコロニーで飼育した。マウスを ６〜１２週齢で使用した。

組換えワクチンウィルス：ｖＳＣ−８（細菌１ａｃＺ遺伝子を含有する組換えワ クチンベクター）、およびｖＳＣ−２５（他のＨＩＶ構造タンパク質または調節 タンパク質なしのＨＴＬＶＩＩＩＢ単離物のＨＩＶｅｎｖグリコタンパク質ｇｐ １６０を発現する組換えワクチンベクター）は、チャクラバルチ等、Ｎａｔｕｒ ｅ、３２０：５３５−５３７　（１９８６）に記載のものと同じであった。

トランスフェクタント：　ｖＳＣ−２５を作るために使用したＨＩＶり０−：／ ＢＨ，８符号化ｇｐ１６０の領域を含有するＥｃｏＲＶフラグメントをＳＶ４０ 誘導発現ベクターｐｃＥＸＶ−３にクローン化した。標準リン酸カルシウム沈殿 法を使用して、このＤＮＡをｐｓＶ２ｎｅｏと一緒にＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　 −３Ｔ　３（Ｈ−２’）またはＤＡＰ、３Ｌ細胞（Ｈ−２ｋ）繊維芽細胞に同時 移入した。トランスフェクタントもＰＳＶ２ｎｅｏ単独を使用して調製した。個 々のクローンを選択Ｇ４１８（ゲネチシン、ギブコ）後に選び、膨張し、プロー ブとしてランダムヘキサマーブライミングによって積置されたＥｃｏＲＢフラグ メントを使用してＲＮＡ雑種形成によるｇｐ１６０遺伝子の発現に関して試験し た。Ｔ１．　１．　１およびＴ４．８．３は、それぞれＬｄおよびＤｄクラスＩ 　　ＭＨＣ分子を発現するＬ細胞トランスフェクタントである。

単クローン抗体（ｍＡｂ）：下記ｍＡｂを使用した：抗Ｌｙｔ２　（３，１５５ ；ラットＩｇＭ）および抗に３Ｔ４　（ＲＬ１７２．４　；ラットＩｇＭ）。

ＣＴＬ発生：マウスを組換えワクチンウィルスの１０％７ＰＦＵで１．ｖ、免疫 した。３〜１４週間後、免疫膵臓細胞（完全なＴ細胞培地中で２４ウエル培養プ レート中の５　Ｘ　１０６／ｍｌ）を組換えワクチンウィルス感染シンジエネイ ック牌臓細胞（１時間、３７’、Ｍｏ１　１０：１）２．５Ｘ１０６／ｍｌまた はｇｐ１６０遺伝子移入ＭＨＣ同−繊維芽細胞２　Ｘ　１０５／ｍｌのいずれか で生体外で６日間再刺激した。長期ＣＴＬ系統も、マイトマイシン処理ｇｐ１６ ０遺伝子移入繊維芽細胞および１０％Ｃｏｎ−Ａ上澄み含有培地での免疫細胞の 反復刺激によって発生した。

ＣＴＬ検定：６日間培養後、検定の初めに各種の濃度のペプチドと混合された各 種の５１Ｃｒ標識標的での６時間検定を使用して、再刺激細胞の細胞溶解活性を ベニンク等、Ｎａｔｕｒｅ、３１１：５７８−５７９（１９８４）の方法によっ て測定した。特異性５１ｃ、放出率を１００（実験放出−自然放出）／（最大放 出−自然放出）として計算した。最大放出を５％トリトンＸ１００の添加によっ て溶解された細胞の上澄みから測定した。自然放出をエフェクター細胞を添加せ ずにインキユベーションされた標的細胞から測定した。

ペプチド合成：ヒユーテン、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ。

（１９８５）に記載のようなポリプロピレンメツシュ「ティーバッグ」中での固 相ペプチド合成の多重同時ペプチド法を使用して、合成ペプチド１３〜２３残基 を生成した。通常のブロックトＢＯＣアミノ酸およびＨＦ切断を使用した。ペプ チドをＣ−１８ｒｓ　ｅｐ−ＰａｋＪカラム（ウォーターズ）上での逆相クロマ トグラフィーによって脱塩し、ＨＰＬＣによって分析した。それらをリンパｗＪ Ｔ細胞増殖検定において非特異性毒性または有糸分裂誘発性の欠如に関して予備 選抜した。

或いは、Ｅ　ｎ　ｖ　　Ｋ　１も、アプライドΦバイオシステムズ・モデル４３ ０Ａなどの市販のベプチドシンセサーザーによって合成する。

ペプチドＥｎｖ−ＫｌがＨＩＶエンベロープ特異性ＣＴＬ用免疫優性エピトープ であり、ＨＩＶ特異性ＨＩＶｇｐ１６０に特異性のネズミＣＴＬを引き出すため の条件。挿入されたウィルス遺伝子の産生物に特異性のＣＴＬをブライミングし 且つ刺激する組換えワクチンウィルスの能力は、ＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ−２’）ｖ ウスを使用してＨＩＶｇｐ１６０に特異性のＣＴＬを発生するために使用した。

ｇｐ１６０に対する特異性は、３つのレベル：リンパ球ブライミング、再刺激、 およびエフェクター機能で見出された（表１）。かくて、ｇｐ１６０を発現する 組換えワクチンウィルス（ｖＳＣ−２５）のみ、細菌１　ａｃＺを含有する組換 えワクチンウィルスなしくｖｓｃ−８）は、ｇｐ１６０発現繊維芽細胞１５−１ ２を殺すことができるＣＴＬの発生のためにマウスをブライミングできた（群２ および４、と群５および６を比較）。同様に、シンジエネイックｖＳＶ−２５感 染細胞のみ、またはｇｐ１６０発現トランスフエクタント１５−１２　（Ｌかし 、コントロールワクチンウィルスｖＳＣ−８で感染された細胞ではない）は、免 疫Ｔ細胞を生体外で再刺激して特異性標的（群４および６ｖｓ群３）を殺すこと ができた。ｇｌ）１６０ブライミング再刺激牌臓細胞からのＣＴＬは、コントロ ールＨ−２マツチ標的に対してｇｐ１６０発現標的を優先的に殺した（群４およ び６）。ｖＳＣ−２５再刺激膵臓細胞によるコントロール標的（１８ネオ）のさ さやかではあるが有意の非特異性キリングは、ワクチン感染細胞よりもむしろト ランスフェクタントを使用して再刺激を行う時に不在であった。ワクチン（ｖｓ Ｖ−２５）感染標的は、正のコントロールとして役立った。最後に、ｇｐ−１６ ０発現標的に特異性のＣＴＬエフェクターの長期系統は、ｖＳＣ〜２５免疫マウ スからの膵臓細胞を１５−１２トランスフエクタントおよびＣｏｎＡ上澄み（群 ７）で反復して刺激することによって確立された。

ｐ１６０上の免疫優性ＣＴＬエピトープの同定。免疫優性ヘルパーＴ細胞エピト ープを捜すために両親媒性アルゴリズムの使用によって選ばれるが配列の若干の 追加の領域をコントロールとして包含するＨＩＶｇｐ１６０ｅｎｖタンパク質配 列の４６％を覆う１７個のクラスター中の一連の４１個の重複ペプチドは、ヘル パーエピトープを研究するために合成し、ＣＴＬエピトープも捜すために使用し た。ｇｐ１６０特異性ＢＡＬＢ／ｃＣＴＬによって認識されたＴ細胞エピトープ を同定するために、各種の濃度のペプチドを検定培養の初めにエフェクターおよ び５１ｃ、標識繊維芽細胞腫瘍標的に加えた。３種のエフェクター細胞の細胞毒 性活性を測定した：ｖＳＣ−２５免疫牌臓細胞が１５−１２トランスフエランド またはｖＳＣ−２５感染オートロガス細胞（多分、ポリクローナルエフェクター 母集団）および長期ＣＴＬ系統（多分、オリゴクローナル母集団）で生体外で一 度刺激した。結果は、試験した各種のペプチドのうちで、１つのみ（＆１８、以 下でＥｎｖ−に１と呼ばれる）が、すべての３種のエフェクターによる高水準の 特異性キリングのためにＨ−２ｄ標的細胞を感作できた（表２）。

それゆえ、ペプチドＥｎｖ−に１に含有される配列は、Ｈ−２ｄハブロタイブの 細胞障害細胞用ｇｐ１６０の免疫優性エピトープを含有する。若干の他のペプチ ド（ｋ２１％ＰｋＬ４１、胤４２、嵐４７）は標的細胞をささいに感作するらし いが、これらの効果は、Ｅｎｖ−に１の活性と比較して取るに足らなかった。Ｅ ｎｖ−に１は、非常に低い濃度のペプチドでＨＩＶ特異性ＣＴＬによって殺すた めに標的を感作する際に驚異的な程効能があることが見出された。例えば、０． １μＭペプチドにおいては、殺すことは依然としてプラトーであり、０．０１μ Ｍペプチドにおいてのみ、殺すことは、半極大に落下した（第１図）。活性ペプ チドのすべては、両親媒性螺旋を形成することができると同定された。

表面表現型および抗ｇｐ１６０ｃＴＬのクラス■ＭＨＣ制限。　抗Ｌｙｔ２モノ クローナル抗体プラスウサギ補体（しかし、抗Ｌ３Ｔ４抗体プラス補体または補 体単独ではなく）でのＣＴＬエフェクター細胞の処理は、ｇｐ１６０遺伝子が移 入した１５−１２繊維芽細胞またはＥｎｖ−に１の存在下でインキュベーション されたコントロール繊維芽細胞のいずれかでのキリング活性の損失をもたらした （第２図）。これらのデータは、Ｅｎｖ−Ｋｌに特異性のものを含めてＨＩＶエ ンベロープｇｐ１６０タンパク質発現細胞を本来で認識し且つ殺すエフェクター 細胞が通常のＬｙｔ２＋Ｌ３Ｔ４＋　（ＣＤ８＋ＣＤ４−）ＣＴＬであることを 示す。

これらの実験で標的として使用する繊維芽細胞は、クラスＩ　（Ｌかし、クラス ■ではない）ＭＨＣ遺伝子産生物を発現する。それゆえ、１５−１２）ランスフ エクタントまたはペプチド含有線維芽細胞を溶解することができるｇｐ１６０特 異性ＣＴＬは、Ｌｙｔ２＋効果Ｔ細胞の場合に通常のように、クラスＩ　　ＭＭ Ｃ分子制限するらしかった。Ｈ−２ｄハブロタイブにおいては、制限エレメント として使用することが既知の３つの主要なりラス１分子、Ｋｄ、Ｄｄ、およびＬ ｄがある。これらのどれがＥｎｖ　　Ｋ１の認識で包含されるかを測定するため に、２種のし細胞（Ｈ−２ｋ）　　トランスフェクタント、それぞれＬｄまたは Ｄｄを発現するＴ１．１．１およびＴ４．８．３を使用した。第３図は、Ｅｎｖ −に、の認識がクラスＩ　　Ｄｄ分子（Ｌｄ分子ではなく）によって制限される ことを実証する。

じプロトコールを使用して、第二ハブロタイブ、Ｈ−２ｋを研究した。Ｌ細胞（ Ｈ−２ｋ）にｇｐ１６０遺伝子を同様に移入し、発現するために示したが、細胞 毒性活性は、シンジェネイックｖｓｃ−２５感染膵臓細胞またはＬ細胞トランス フェランド自体で生体外で刺激されたｖｓｃ−２５免疫ＢＡＬＢ、Ｋ　（Ｈ−２ ｋ）？ウスからの膵臓細胞を使用して、これらの標的に対して検出できた（表３ ）。同様に、試験したペプチドは、かかるエフェクター細胞によって殺すことが できる標的を生じなかった（表２）。ｇｐ１６０特異性ＣＴＬ活性の欠如にも拘 らず、ＢＡＬＢ、にマウスは、効力あるワクチン特異性ＣＴＬを産生ずるので、 有効にブライミングされ且つ再刺激された（表２と同じ実験からの表３）。同様 の結果は、Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）マウスの場合に得られた（表３および図示しない データ）。ＢＡＬＢ、にマウスがＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃレスボンダーマウスに コンジェニックであるが、Ｈ−２にハブロタイブを含有するので、応答の差は、 ＭＨＣ関連である。これらの結果は、Ｈ−２ｋが高いレスボンダーハブロタイブ であるＨ−２’と対称的に本条件下で検定する時にｇｐ１６０に対してＣＴＬ低 レスボンダーであることを示唆する。

Ｅｎｖ−ＫｌがＨＩＶのエンベロープに特異性のＣＴＬの増殖を刺激することの 実証。ペプチドＥ　ｎ　ｖ　　Ｋ　１をＨＩＶのエンベロープに特異性であるこ とが上で実証されたＣＴＬ系統の生体外増殖を刺激する能力に関して試験した。

第４図中のデータは、Ｅ　ｎ　Ｖ　−Ｋ　１が三重水素化チミジンのＤＮＡへの 組込みによって測定した時にこれらのＨＩＶ特異性ＣＴＬ細胞の増殖を刺激する こと、およびこの刺激がリンホカインインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在 下で高められることを実証する。

診断試薬としてのＥｎｖ−Ｋｌ。エイズにさらされていると思われるヒトをＨＩ Ｖに対する抗体に関して試験し且つ血清反応陰性であると決定されるならば、ヒ トは、ウィルスをキャリーするが抗体を産生じていないことが依然として可能で ある。その理由は、さらされた個体の成る％が暴露後に有意な時間抗体を発生せ ず且つ若干が抗体を決して発生しないことがあるからである。それにも拘らず、 そのヒトは、ウィルスのエンベロープに特異性のＣＴＬの形態で細胞媒介免疫応 答を生ずることがある。ヒトのＣＴＬがウィルスだけではなく個体の主要な組織 適合性複合体（ＭＨＣ）抗原にも特異性であるので、ＭＭＣ（ＨＬＡ）分子を試 験すべき個体と共有する移入腫瘍を有するのに十分な程ラッキーでない限り、マ ウスの場合に行ったように移入腫瘍標的についてこれらを試験することは可能で はない。非常に多くにヒトＨＬＡ型があるので、入手できるすべての種類の移入 細胞を有することは可能ではない。形質転換腫瘍系統を個体から産生じ且つそれ にＨＩＶ遺伝子を移入することは可能であるが、このことは、非常に困難な時間 がかかる労力のいる方法であり且つ大多数の人々の場合には行うことは可能では ないであろう。個体の細胞をＨＩＶで感染することは、感染できる適当な細胞種 類を必要とし且つ実験研究者が濃縮ウィルスを処理することは危険であろう。

１９７２年以前に生まれた米国での大抵の個体が痘癒予防接種とし、てワクチン で免疫し、このようにワクチン特異性ＣＴＬを有するであろうから、前記ワクチ ン組換え体の使用は、多くの偽陽性結果を与えることがある。精製タンパク質は 、一般に、ＣＴＬ用標的にさせるような方法で細胞によって取り上げられない。

しかしながら、Ｅｎｖ−に１などの小ペプチドは、前記したように、ＣＴＬ用標 的を感作することができる。それゆえ、個体の末梢血液中のＨＩＶ特異性ＣＴＬ の存在に関して試験するために診断試薬としてＥｎｖ−に１を使用することは比 較的単純であろう。このことは、標準法によって達成できる。先ず、試験すべき 個体の末梢血液リンパ球のＰＨＡまたはＣｏｎＡ芽球を産生し、これらを前記の ように５１Ｃｒで標識し、これらを前記条件と同様であるがヒトＣＴＬ検定の場 合には修正された標準培養条件下でペプチドＥｎｖ−に１と共にインキュベージ ジンし、同じ個体からの新鮮な末梢血液リンパ球を加える。約６時間後、培地に 放出された５１ｃｒの量を測定し、これを同一に処理されるがペプチドのないコ ントロール、新鮮なリンパ球のないコントロールペプチド、または標的細胞の洗 剤溶解によって生じた最大５１Ｃｒ放出と比較する。

特異性放出があるならば、個体は、抗体が検出できないとしても、ＨＩＶウィル スをキャリーしていると判定できる。

予後試薬としてのＥｎｖ−Ｋｌ。免疫系のアームがあったとしてもＨＩＶ感染に 対して保護することは未だ知られていないが、ＣＴＬは、前記理由で有意な役割 を果たすらしい。それゆえ、ウィルス感染細胞を殺すことができるＣＴＬを有す る血清反応陽性であるが依然として臨床的に健康な個体は、かかるＣＴＬのない ものよりも臨床的エイズを発生しないらしいことが可能である。それゆえ、Ｅｎ ｖ−に１は、血清反応陽性個体を疾患の各種の段階において診断用途についての 前記章で指摘した方法によって試験するために使用でき、そして健康な臨床的状 態とＥｎｖ−に工に特異性のＣＴＬの存在との間に有意相関が存在するならば、 このことは、どの血清反応陽性個体が臨床的免疫不全または完全に発達したエイ ズを発生する多少のリスクにあるかを予測するために予後試験として役立つであ ろう。

治療薬としてのＥｎｖ−Ｋｌ：ペプチドＥ　ｎ　ｖ　−Ｋ　１は、ＨＩＶ特異性 ＣＴＬの母集団の増殖および膨張を刺激できるので、Ｅ　ｎ　ｖ　　Ｋ　１は、 ウィルスで既に感染された患者の免疫応答を高めるために治療薬として使用でき る。かかる治療法は、疾患のコントロール用の他の治療または予防戦略と共によ り良く使用できた。

本発明の利点は、初めて、純粋なＣＴＬ刺激性抗原性産生物が危険な生感染性ウ ィルスまたはかかるウィルスに由来する産生物との接触なしに同定され且つ生体 外で合成されること、それがＨＩＶまたはＨＩＶ誘導産生物の取扱または暴露に おいて包含されるリスクを有していないことである。

本発明の別の有意なアスペクトは、本発明のペプチドが抗体を全く産生じないこ とがある細胞媒介ＨＩＶ感染を検出し且つ予防することを可能にすることである 。従って、体試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出に依存する試験は、抗体が産生されな いＨＩＶ感染の場合には有用ではないであろう。本発明の抗原は、細胞伝達ＨＩ Ｖ感染を抗体の不在下で検出する手段（これは現在使用されている抗体検出試験 によっては従来可能ではなかった）を今や提供する。同様に、感染法が前記のよ うに細胞伝達である時には、中和抗体は、保護性ではないであろう。従って、抗 原としてＥｎｖ−に１を使用したワクチンは、初めて、すＨＩＶ感染細胞を殺す ことによって、ＨＩＶ感染を予防する方法を提供する。

本発明に係るワクチンを配合した医薬組成物は、ＣＴＬを産生ずるのに有効な抗 原性または治療量のＥｎｖ−に１および生理食塩水、無毒性滅菌緩衝液などの製 薬上許容可能な担体を含む。勿論、当業者に周知の防腐剤、滅菌剤、アジュバン トなどの添加剤も、組成物の効能を維持または増大するために医薬組成物に配合 できた。

ここに記載の例および態様は例示の目的のためのものであること、およびそれに 鑑みて各種の修正または変更は当業者に示唆されるであろうし且つ本願の精神お よび範囲および添付請求の範囲の範囲内に包含されることが理解される。

表Ｌ　　Ｈ−２ｄマウスにおける細胞障害Ｔ細胞誘導および長期ＣＴＬ系免疫化 　　再刺激　　比率　　１８ネオ　　１５−１２　　１５−１２／ｖＳＣ２５ｖ ＳＣ−８ｖＳｃ−８４０／１　　　　Ｂ、３　　　　２．３　　　　７０．９１ ３７１　　　１７　　　−２．６　　　　５８４４７１　　　１．１３　　　− ４．２　　　　４２．３ｖ９Ｃ−８ｖｓｃ−２５４０／ｌ　　　１５．１　　　 ２７．３　　　　８５．８１３／ｌ　　　　Ｂ、３　　　　８．４　　　　５９ ．２４／ｌ　　　　３．３　　　　１．０　　　　４７．１ｖＳＣ−２５ｖｓｃ −８４０／１　　　８．０　　　　１．１　　　　７３．９１３／ｌ　　　　１ ｇ　　　　−０，９５８，３４／１　　　２．１　　　−２．９　　　　４１． １ｖＳＣ−２５ｖＳＣ−２５４０／１　　２６．１　　　４９．３　　　　６８ ．２１３／ｌ　　　１１．４　　　２５．５　　　　５６．９４／１　　　４． ２　　　１２゜ｌ　　　　　４！１１．Ｏｖ’５Ｃ−８１５−１２４０７１Ｏ， ８−２，８１１，４１３７１２，６−１，６９，０ ４７１１，８−１，３５，２ ｖＳＣ−２５１５−１２４０／ｌ　　　　Ｂ、２　　　５５．９　　　　５４． ４１ｇ／ｌ　　　　３．２　　　３８．９　　　　４８．３４／１　　　２．１ 　　　２４．９　　　　　３．１ＶＳＣ−２５１５−１２”　　　　４０／ｌ　 　　　　　１５．０　　　　　　４４．Ｏｒ２０／１　　　４．５　　　３９． Ｉ　　　　　　ＮＴ１０／１　　　５．５　　　３３．５　　　　　　ＮＴ５／ ｌ　　　　２．１　　　３３．２　　　　　　ＮＴＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ−２ｄ） ？ウスをＨＩＶｅｎｖタンパク質ｇｐ１６０　（ｖＳＣ−２５）または細菌１ａ ｃＺ遺伝子（ｖＳＣ−８）を発現する組換えワクチンウィルス１０７ＰＦＵで１ ．ｖ、プライミングした。

膵臓細胞を組換えワクチンウィルス（ｖｓｃ−２５またはｖＳＣ−８）感染シン ジェネイック膵臓細胞２，５ＸＩＯ６／ｍｌまたはｇｐ１６０遺伝子移入ＢＡＬ Ｂ／ｃ３Ｔ３細胞（１５−１２）２Ｘ１０５／ｍｌのいずれかで生体外で再刺激 した。

ＣＴＬ活性を新生遺伝子移入３７３細胞（１８ネオ）、１５−１２およびｖＳＣ −２５感染１５−１２標的細胞（１５−１２／ｖＳＣ−２５）に対して測定した 。

ＮＴ：試験せず。Ｅ／Ｔ　：エフエクタ一対標的比。

＋トランスフェクタント１５−１２プラスリンホカインでのｖｓｃ−２５免疫膵 臓細胞の反復刺激によって産生された長期ＣＴＬ系統 表２　　Ｈ−２ｄおよびＨ−２にマウスにおけるｇｐ１６０中の標的エピトープ １（９３−１０７）　　　　４．０　　　　１．８　　　　　１．７　　　　　 １．０２（９８−１１２）　　　３．３　　　　４．５　　　　　２．８　　　 　　０．９３（１０２−１１６）　　　５．７　　　　５．０　　　　　０．８ 　　　　　０．８４　（ｌｏｇ−１１７＞　　　１．８　　　　０．０　　　　 −０．８　　　　　０．４５（１０５−１１７）　　　　０．５　　　　０．５ 　　　　　３．６　　　　−０．２７（１０７−１２１）　　　　１．２　　　 −１．１★★　　　２．８　　　　　０．１ｌｉ８（１１２−１２７）　　　　 ５．１　　　　３．３　　　　　７．５　　　　　　Ｇ。２９（１４１−１５５ ）　　　　４．７　　　　０．４　　　　−２．２　　　　　０．１１０　（１ ５７−１７１）　　　−１，７−６，５★★　　　０．５　　　　　０．６１１ （２３１−２４５）　　　　４．４　　　　１．４　　　　　２．５　　　　　 ０Ｊ１２　（２３Ｂ−２５０）　　　　２．０　　　　３．３　　　　　４．８ 　　　　　　Ｌ、Ｓ１４　（２５２−２７１＞　　　　２．０　　　　０．４　 　　　−１．８　　　　　１．２１７（２６７−２８２）　　　　５．８　　　 　４．５　　　　　４．１　　　　−０．４１８　（８０ｇ−１２２）　　　肛 、８　　　　５６．４　　　　５２．５　　　　　１．８１９　（３１７−３３ １）　　　−３，０−０，６★★　　−２，２０，９２０（８３５−３４９）　 　　［ｉ、４　　　　０．３　　　　　５．８　　　　　０．０２１（３４３− ３５７）　　　ＩＯＪ　　　　　１１．４★★　　　１４．１　　　　　０．５ ２２　（３５４−８６８）　　　→、１　　　−３．５　　　　−０．６　　　 　　０．７２３　（３Ｂ２−３７６＞　　　　０．９　　　　５．９★★　　　 ０．５　　　　　０．７２６　（４２１−４１８）　　　−２，８−４，４１， ８１，１２８（４２５−４３９＞　　　　２．６　　　−１．２★★　　　刊、 １　　　　　０Ｊ表２続き ２９（４３０−４４４）　　　３．２　　　１．８　　　　０．２　　　　１． ０３０　（４７Ｂ−４９の　　　５．２　　　　３．９★★　　　−１，００， ８３３（４８５−４９９＞　　　６．０　　　１．９　　　−０．４　　　　０ ．７３５　（５５３−５７４）　　−３，１−５Ｊ★★　−１，２Ｑ、１１３６ （８１２−８２１１）　　　２．１　　１０．１★★　−３，０１，０３７（８ １９−８３３）　　　１．７　　　８．９　　　　０．８　　　　２．１３９　 （８２９−６４３）　　　７．７　　　４．８★★　　０．４　　　０．８４０ 　（６３２−８４８）　　　−０，５−０，４−１，９０，２４１（８３７−８ ５１）　　　７．９　　　９．７★六　　０．７　　　２，２４２　（６５７− ８７１）　　　１２．０　　　　Ｂ、３　　　　７．０　　　　２．２−−一■ ■−帽−−−−−−１−１−一４Ｂ（Ｅｉ８２−８７６）　　　２．３　　　− ０．１　　　　−０．２　　　　１．７４７（７８０−７９４）　　　９．９　 　１０．５★★　　−１，５１，１５０（７９４−８０８）　　−４，７１，８ ★★　　−０，６０，４５１（７９９−８１３）　　　１．２　　　２．８　　 　　０．１　　　　０．９５２　（８２１−８３５）　　　３．９　　　０．８ 　　　　１．９　　　　０．６５３　（８２７−８４１）　　　０．５　　　３ ．４★★　　−２，０−０，１５５（８３４−８４８）　　　３．１　　　４． ４★★　　−４，４０，０５６（１１３９−８５３）　　　２．８　　　１．９ 　　　−３．６　　　−０．８５７（Ｓ４２−８５８）　　　０．６　　−１． ２★★−１，４０，１★標的として、１８ネオトランスフエクタント（Ｈ−２ｄ ）プラス１０μＭ合成ペプチドをＢＡＬＢ／Ｃエフェクターのために使用し、Ｌ ２８　（Ｈ−２ｋ）プラス１０μＭペプチドをＢＡＬＢ、にエフェクターのため に使用した。カッコ内の比率は、エフェクター／標的比である。

Ｖ２５／１５−１２は、１５−１２１−ランスフエクタントで生体外で再刺激さ れたｖＳＣ２５免疫化ＢＡＬＢ／Ｃ牌臓細胞に由来するエフェクター細胞を示す （表１参照）。

系統は、１５−１２および１０％Ｃｏｎ−Ａ上澄みで反復して刺激されたｖＳＣ ２５免疫化Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ膵臓細胞に由来するＣＴＬ系統を示す。

マーク★★を付けた結果は、１０／１の代わりにエフェクタ一対標的比２０／１ で得られた。ペプチドなしのコントロールは、両方の比率の場合に３，０％であ った。

Ｖ２５／Ｖ２５は、ｖＳＣ−２５感染シンジエネイツク牌臓細胞で生体外で再刺 激されたｖＳＣ２５免疫ＢＡＬ　Ｂ　／　ｃ膵臓細胞に由来するエフェクター細 胞を示す。

Ｖ２５／Ｖ２５は、ｖＳＣ２５感染シンジェネイック膵臓細胞で生体外で再刺激 されたｖＳＣ２５免疫ＢＡＬＢ、　Ｋ膵臓細胞に由来するエフェクター細胞を示 す。同じ実験からのＢＡＬＢ、にの場合のコントロールは表３にある。

表３゜Ｈ−２ｋ（Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ、　ＫオヨＣＦＣ３Ｈ）　マ’７スハＨＩ　Ｖ エンへｏ−フタンパク質を発現するｇｐ１６０ＨＩＶｅｎｖ　トランスフエクタ ント免疫化　　　　再刺激　　　比率　　２５−２ＯＬ２８　２５−２０／Ｖ２ ５　　Ｌ２８／Ｖ２５ｖＳＣ−２５ＶＳＣ−２５感染　　８０／ｌ　　　１．２ 　　０．５　　５８．２　　　５７．７（ＢＡｕ３．Ｋ）　　　　　　　　　４ ０／１　　１Ｊ　　　Ｏ，８４７，３４４，４２０／１　　０．７　　０．６　 　３９．４　　　　Ｂ９．０ｖｓｃ−２５ｖｓｃ−２５感染　　８０／ｌ　　　 ３．７　　１．７　　　Ｎ、Ｔ、　　　　８０．１（Ｃ３Ｈ）　　　　　　　　 　　　４０１１　　１．９　　０．４　　　Ｎ、Ｔ、　　　　５１．９２０／１ 　　−０．１　　０．Ｉ　　　Ｎ、↑、　　　　４１．５ｖｓｃ−２５２５−２ ０ａｌｌ／１　　１１４　　１５．７　　　Ｎ、Ｔ、　　　　３５．７（Ｃ３Ｈ ）　　　　　　　　　　　２０／ｌ　　　Ｂ、８　　８．５　　　Ｎ、Ｔ、　　 　　ＩＢ、７７／１　　３．９　　２．３　　　Ｎ、Ｔ、　　　　５．８ｖＳＣ −２５で免疫されたＢＡＬＢ、Ｋ　（Ｈ−２ｋ）またはＣ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）をｇ ｐ１６０発現り細胞トランスフェクタント、２５−２０．またはｖＳＣ−２５感 染シンジエネイツク牌臓細胞のいずれかで生体外で急増した。６日間培養後、再 刺激細胞の細胞溶解活性をコントロール標的としての２５−２０または新生遺伝 子移入し細胞（Ｈ−２ｋ）　、Ｌ−２８または陽性コントロール標的として（７ ）ｖＳＣ−２５感染２５−２０　（２５−２０／Ｖ２５）およびＬ２８　（Ｌ２ ８／Ｖ２５）に対して測定した。

ＦＩＧ、　　１ 、ｏｏｉ　　　　　、ｏｌ、ｉ　　　　　　ｉ　　　　　　１゜公７°？　Ｅ− ｔ８　；Ｊ　Ｊ　　（１Ｍ）３０／１　　　１０／１　　　　３／１　　　　１ ／ＩＥ／Ｔ柁 ＦＩＧ、３ 公７゛デｈ″１８ノ眉Ｘ　　　（μＭンＦＩＧ、４Ａ　（ＡＰＣれ？め１８子Ｔ ）Ｄｍ ｐｍ 補正帯の翻訳文提出書（特許法第１８４条の幻平成　２　年　７　月　２６日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿　　　　　　　　　　１１、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　　８９１００１７２ ２、発明の名称 抗ＨＩＶ応答を喚起する合成抗原 ３、特許出願人 住所　　アメリカ合衆国バージニア用、スプリングフィールド、ポート、ロイヤ ル、ロード、５−２８５ 名　称　　　アメリカ合衆国 ４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 ６、　添付書類の目録 （１）　　補正帯の翻訳文　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　通請求の 範囲 １、Ｅｎｖ−Ｋ　　ペプチド、およびＥｎｖ−に１ペプチドの機能的に均等の変 異体であるペプチドからなるペプチドの群から選ばれるペプチドであって、前記 変異体はそれらの少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、置換、または誘導化 によってＥｎｖ−に１ペプチドから誘導でき且つＥ　ｎ　ｖ　−Ｋ　１ペプチド は下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ　−１１ｅ−Ｇｌｙ　　［、 ｙ６を有することを特徴とするペプチド。

２、　製薬上許容可能な担体および請求項１に記載のペプチドを含むことを特徴 とするヒト免疫不全ウィルス抗原を発現する細胞を特異的に認識する細胞障害性 リンパ球を誘導するための医薬組成物。

３、　　　（ａ）請求項１に記載のペプチド；（ｂ）末梢血液リンパ球を刺激す るのに有効であるミトゲン； （ｃ）末梢血液リンパ球の溶解を検出するための標識；および （ｄ）予後または診断検定を行うための指図物質を含むことを特徴とする細胞媒 介ヒト免疫不全ウィルス感染を検出ための検定を行うための診断または予後キッ ト。

４、　　ウィルスによる感染を受けやすい宿主に、有効な量の請求項１に記載の ペプチドを投与し、前記量はヒト免疫不全ウィルスで感染された細胞のみを選択 的に殺す細胞障害性リンパ球を前記宿主中で誘導するのに十分であることを特徴 とするヒト免疫不全ウィルス感染を予防または治療するための方法。

５、　　　（ａ）宿主からのオートロガス標識末梢血液リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ） を請求項１に記載のペプチドと共にインキュベーションして、前記ウィルスで感 染された前記ＰＢＬ中のＴ細胞を活性化しく前記リンパ球はインキュベーション 前にミトゲンで刺激され且つ前記標識は溶解する前記ＰＢＬの％の検出を可能に する）；（ｂ）前記宿主からの新鮮なＰＢＬを加え、インキュベージジンを、細 胞障害性リンパ球が前記標識ＰＢＬ中の前記活性化Ｔ細胞を溶解するのに十分な 時間続け；（Ｃ）工程（ｂ）で溶解する標識ＰＢＬの数マイナス前記ペプチドの 不在下でのインキュベーション後に溶解する刺激ＰＢＬの数、そしてマイナス前 記ペプチドの存在下であるが新鮮なＰＢＬの不在下でのインキュベーション後に 溶解する標識ＰＢＬの数を測定することにより溶解感染Ｔ細胞を検出することに よって、（ＨＩ　Ｖ）感染細胞の存在を検出する ことを特徴とするヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）での感受性宿主の感染を診 断するための方法。

６．　前記ＰＢＬを５１ｃ、で標識し、溶解を前記５１Ｃｒの放出によって検出 する、請求項５に記載の方法。

７、　前記ミトゲンが、フィトヘマグルチニンおよびコンカナバリンＡからなる 群から選ばれる、請求項６に記載の方法。

−国際調査報告 一１″□１１１“２■ゴノお８９００１７２　　−

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ抗原発現細胞に対して細胞毒性のＴ細胞を刺激する下記アミノ酸配列 【配列があります】 のＥｎｖ−Ｋ１ペプチド、またはその機能的に均等の変異体。
2. ２．ＨＩＶ特異性ＣＴＬを産生するのに有効な量の請求項１に記載のペプチド、 および製薬上許容可能な担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
3. ３．Ｅｎｖ−Ｋ１ペプチドを含有する容器および細胞媒介ＨＩＶ感染を検出ため の診断または予後検定を行うための指図物質を含むことを特徴とする細胞媒介Ｈ ＩＶ感染を検出するための診断または予後キット。
4. ４．ＨＩＶ感染を受けやすい宿主に、ＨＩＶ感染細胞のみを選択的に殺すＨＩＶ 特異性ＣＴＬを産生するための抗原量の請求項１に記載のペプチドを投与するこ とを特徴とするＨＩＶ感染の予防法。
5. ５．（ａ）オートロガスフィトヘマグルチニンまたはコンカナバリンＡリンパ芽 球を５１Ｃｒクロメートと共にＥｎｖ−Ｋ１の有無でインキュベーションするこ とによって、オートロガス５１Ｃｒ標識標的を調製し、（ｂ）リンパ球を前記標 的と共に約６時間インキュベーションし、５１Ｃｒ放出を測定することによって 、末梢血液リンパ球をＨＩＶ特異性ＣＴＬの存在に関して試験する（５１Ｃｒの 放出は、Ｅｎｖ−Ｋ１の不在下よりも存在下で大きいならば、ＨＩＶ特異性ＣＴ Ｌの存在を指示する） ことを特徴とするＨＩＶ感染の診断法。