KR20190068529A - 폴리오마바이러스에 대한 면역요법 - Google Patents

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Abstract

본원은 암 또는 폴리오마바이러스 감염의 치료에 유용한 폴리오마바이러스 에피토프와 관련된 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

폴리오마바이러스에 대한 면역요법
본 출원은 2016년 9월 9일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/385456호를 우선권으로 주장하며, 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
폴리오마바이러스(polyomavirus)는 광범위한 포유류 종을 감염시키는 아주 흔한 바이러스이다. 현재 BK 폴리오마바이러스(BKV), 존 커닝햄 폴리오마바이러스(John Cunningham polyomavirus(JCV)), 및 메르켈 세포 폴리오마바이러스(Merkel cell polyomavirus(MCV))를 포함하여 별개의 12종 초과의 인간 폴리오마바이러스가 확인되었다.
대부분의 인간 폴리오마바이러스 질환은, 면역능력이 있는(immunocompetent) 숙주에서는 임상적으로 명백한 질환이 일반적으로 드물지만, 유년기에는 발병한다. BKV와 JCV 바이러스는 전형적으로 림프 기관, 뉴런 조직 및 신장에 잠재적으로 잠복해 있다. 그러나, 면역 억제(immunosuppression)의 상황에서 JCV와 BKV 모두 재활성화되어 유의한 장기 질환으로 진행될 수 있다. 예를 들어, BKV는 urotheliotorpic이고 BKV의 재활성화는 BK 폴리오마바이러스 관련 신장병증(nephropathy)으로 알려진 간질성 신염(interstitial nephritis)을 유발하는데, 이는 빨리 인지되지 않는 경우, 전형적으로 높은 이식편 소실(graft loss)과 관련이 있다. 신경성 JC바이러스는 뇌에 침투하여 사망률이 높은 중추신경계의 탈수초성 질환인 진행성 다초점 백질 뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy)을 유발할 수 있다. 다양한 폴리오마바이러스는 또한 다른 형태의 암과도 관련이 있다. 예를 들어, MCV는 드물지만 공격적인 형태의 피부암인 메르켈 세포암과 관련이 있다. 폴리오마바이러스 치료를 위한 효과적인 항바이러스제는 알려져 있지 않다. 따라서, 폴리오마바이러스 감염 및/또는 폴리오마바이러스 관련 암을 치료하고 예방하기 위한 새로운 치료법이 필요하다.
요약
본원은 T 림프구(예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL) 및/또는 헬퍼 T 림프구(T 세포))에 의해 인식되면서, 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 바이러스 감염) 및/또는 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암 예컨대, BKV, JCV 또는 MCV 관련 암)의 예방 및/또는 치료에 유용한, 폴리오마바이러스 에피토프(예를 들어, 표 1, 2, 3, 4 및/또는 5에 열거된 에피토프)와 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물 및 방법은 BKV 에피토프(예를 들어, 표 1에 열거된 에피토프)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물 및 방법은 JCV 에피토프(예를 들어, 표 2에 열거된 에피토프)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물 및 방법은 바이러스 균주 내에서 및/또는 관련된 바이러스 균주 전체에 걸쳐 발견된 서열 변이체를 포함하는 하이브리드 에피토프(예를 들어, 표 3에 열거된 에피토프)에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본원은 하나 이상의 BKV 항원의 하나 이상의 에피토프(예를 들어, LTA, STA 또는 VP1 바이러스 항원의 에피토프, 예컨대, 표 1에 열거된 에피토프), 하나 이상의 JCV 항원의 하나 이상의 에피토프(예를 들어, LTA, STA 또는 VP1 바이러스 항원의 에피토프 예컨대, 표 2에 열거된 에피토프) 및/또는 하나 이상의 하이브리드(hybrid) 에피토프(예를 들어, 표 3에 열거된 에피토프)를 포함하는 단백질(예를 들어, 단리된 단백질)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 이러한 다수의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 다수의 에피토프 중 2개 이상 사이에 개재 아미노산(intervening amino acid) 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 대상체(예를 들어, 포유동물 대상체 예컨대, 인간 대상체)에 투여 시 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에피토프는 인간 개체군에 대해 넓은 커버리지(coverage)를 제공하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 HLA-Al, -A2, -A3, -A11, -A23, -A24, -A26, -A29, -A30, -B7, -B8, -B27, -B35, -B38, -B40, -B41, -B44, -B51, -B56, -B57 또는 -B58에 대한 HLA 클래스 I 제한을 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 HLA-DP, -DM, -DOA, -DOB, -DQ 또는 -DR에 대한 HLA 클래스 II 제한을 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 HLA-DRB 또는 -DQB에 대한 HLA 클래스 II 제한을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단백질은 서열번호 5, 6, 36, 41 및 42로 기재된 에피토프 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 양태에서, 본원은 본원에 개시된 단백질을 코딩하는 핵산(예를 들어, 단리된 핵산)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 이러한 핵산을 포함하는 발현 구조체(expression construct)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 상기 발현 구조체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 본원에 제공된 숙주 세포에서 단리된 단백질을 발현하는 단계 및 단리된 단백질을 적어도 부분적으로 정제하는 단계를 포함하는, 단리된 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 핵산을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 양태에서, 본원은 HLA(예를 들어, 클래스 I HLA, 클래스 II HLA)에 제시되는 본원에 기재된 에피토프에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 T 림프구(예를 들어, 단리된 T 림프구, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)을 위한 BK 바이러스-특이적 T 림프구를 확장시키는 방법으로서, 상기 방법은 (i) 대상체로부터 단리된, T 림프구를 포함하는 하나 이상의 세포를, 본원에 제공된 에피토프를 제시하는 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및 (ii) BK 바이러스-특이적 T 림프구가 상기 하나 이상의 세포로부터 확장되는 조건 하에서, 상기 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 세포를 배양하는 단계는 IL-21의 존재 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30ng/ml 이상의 IL-21 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100ng/ml 이하의 IL-21에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 10 내지 50, 20 내지 40, 25 내지 35 또는 약 30 ng/ml의 IL-21에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 30ng/ml의 IL-21에서 배양된다. 특정 실시양태에서, IL-21의 부재 하의 확장과 비교하여, IL-21의 존재 하의 확장은 확장된 T 림프구 집단의 폴리오마바이러스-특이적 CD8 T 세포의 절대 갯수(absolute number) 대 폴리오마바이러스-특이적 CD4 T 세포의 절대 갯수의 비를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 본원은 대상체에 본원에 제공된 단백질, 핵산, T 세포 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 감염)을 치료 또는 예방하는 방법, 및/또는 폴리오마바이러스 관련 암(예를 들어, BKV-관련, JCV-관련 또는 MCV-관련 암)을 치료하는 방법, 및/또는 대상체에서 T 림프구 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 면역약화(immunocompromised)되어 있다.
특정 양태에서, 본원은 대상체로부터 단리된 T 림프구를 본원에 제공된 단리된 단백질과 접촉시킴으로써 BKV-특이적 T 림프구의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 BK 바이러스 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 방법에 따른 대상체의 BK 바이러스 감염을 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유 동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 면역약화되어 있다.
특정 양태에서, 본원은 대상체의 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암 예컨대, BKV-, JCV- 또는 MCV-관련 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포독성 T 세포(CTL)를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 하나 이상의 에피토프가 제한된 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen(HLA))을 발현한다. 일부 실시양태에서, CTL은 대상체에서 자가유래(autologous)된다. 일부 실시양태에서, CTL은 대상체에서 자가유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, CTL은 CTL 라이브러리 또는 은행(bank)으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 포함하는 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 제시하는 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 하나 이상의 에피토프가 제한된 인간 백혈구 항원(HLA)을 발현한다.
특정 양태에서, 본원은 대상체의 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, MCV 또는 JCV 감염)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 면역약화되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 표 1, 표 2 및 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 인식하는 TCR을 포함하는 CTL을 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 하나 이상의 에피토프가 제한되는 HLA를 발현한다. 일부 실시양태에서, CTL은 대상체에서 자가유래된다. 일부 실시양태에서, CTL은 대상체에서 자가유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, CTL은 CTL 라이브러리 또는 은행으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 포함하는 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 제시하는 항원 제시 세포(APC)를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 하나 이상의 에피토프가 제한되는 인간 백혈구 항원(HLA)을 발현한다.
일부 양태에서, 본원은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 CTL 집단을 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 제시하는 APC 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, APC는 B 세포, 항원 제시 T 세포, 수지상 세포 및/또는 인공적인 항원 제시 세포, 예컨대, aK562 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 항원 제시 세포(예를 들어, aK562 세포)는 CD80, CD83, 41BB-L 및/또는 CD86을 발현한다. 일부 실시양태에서, 본원은 대상체에 본원에 기재된 APC를 투여함을 포함하는, 대상체의 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암 예컨대, BKV, JCV 또는 MCV 관련 암) 및/또는 폴리오마바이러스(예를 들어, BKV, JVK 또는 MCV) 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본원은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 본원은 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 또는 RNA 분자)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터)이다. 일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원은 CTL을, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 제시하는 APC와 접촉시킴을 포함하는, 폴리오마바이러스-특이적 CTL(예를 들어, BKV 특이적 또는 JCV 특이적 CTL)의 증식을 발생, 활성화 및/또는 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CTL은 시험관 내에서 APC와 접촉된다. 일부 실시양태에서, APC는 B 세포, 항원 제시 T 세포, 수지상 세포 및/또는 인공적인 항원 제시 세포, 예컨대, aK562 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 항원 제시 세포(예를 들어, aK562 세포)는 CD80, CD83, 41BB-L 및/또는 CD86을 발현한다. 일부 실시양태에서, CTL은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 APC에 접촉된다.
일부 실시양태에서, 본원은 APC를, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드, 및/또는 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30종 또는 그 이상)의 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 접촉시킴을 포함하는, 본원에 제공된 에피토프를 제시하는 APC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, APC는 하나 이상의 에피토프가 제한된 HLA를 발현한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피토프는 2종 이상의 폴리오마바이러스에 공유된 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공유된 에피토프는 2종 이상의 폴리오마바이러스 간에 서열 상동성 영역을 포함하고, 서열 상동성 영역은 에피토프 서열의 전장(full length)에 걸쳐 3, 4, 5, 6 또는 7개 이상의 아미노산이 존재한다. 일부 실시양태에서, 2종의 폴리오마바이러스는 BKV 및 JCV이다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 아미노산은 LLL이다.
다른 양태에서, 본원은 대상체로부터 샘플(예를 들어, 혈액 또는 종양 샘플)을 단리하는 단계 및 본원에 제공된 에피토프 또는 본원에 제공된 에피토프를 코딩하는 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 본원에 제공된 치료 방법(예를 들어, 본원에 제공된 CTL, APC, 백신 조성물의 투여)에 적합한 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체가 본원에 기재된 하나 이상의 에피토프가 제한된 HLA를 발현하는 경우, 대상체가 본원에 제공된 치료 방법에 적합한 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법에 적합한 것으로 확인된 대상체는 치료 방법을 사용하여 치료된다.
도 1은 BKV 특이적 T 세포의 시험관 내 확장(expansion)을 도시한다. 도트 블랏(dot blot)은 BKV 항원과 함께 PBMC를 성장시킨 후에 BKV 특이적 T 세포에 의한 IFN-
Figure pct00001
의 검출가능한 발현을 도시하고, CMV는 양성 대조군으로 도시된다.
도 2는 BKV 항원에 대한 T 세포 반응을 도시한다. 그래프는 건강한 개체의 BKV 항원에 대한 전반적인 T 세포 반응을 도시한다.
도 3은 거대 T 항원(large T antigen(LTA))에 대한 펩타이드 매트릭스(matrix) 뿐만 아니라 매트릭스 형식(format)을 따르는 펩타이드 풀(pool)의 구성(composition)을 도시한다.
도 4는 본원에 기재된 에피토프 맵핑의 과정을 도시하는 흐름도이다.
도 5에는 5개의 패널이 있으며, HLA B*39 에피토프의 에피토프 맵핑을 도시한다. 패널 A는 STA OPP에 대한 CD8+ T 세포 반응의 FACS 블랏을 도시한다. 패널 B는 매트릭스 상에서 겹쳤을(overlay) 때 반응하는 STA pep 풀 4와 10은, STA22 펩타이드가 상기 풀들 사이의 공통 펩타이드임을 도시한다. ST22 자극을 이용한 ICS 검정은 매트릭스 옆에 나타낸 FACS 블랏에 도시한 반응을 보여준다. 패널 C는 ST22 펩타이드의 둘 중 한쪽으로부터 아미노산을 절단(trimming)함에 의한 정교한 에피토프 매핑(mapping)을 도시한다. 패널 D는 절단 과정으로부터의 대응하는 펩타이드를 적정하여 VHCPCMLCQL이 에피토프 서열임을 나타내는, 펩타이드의 가장 면역원성있는(immunogenic) 부분을 관찰하는 것을 도시한다. 패널 E는, 펩타이드 로딩(loading)된 HLA 제한된 LCL을 사용한 항원 제시 검정은, 상기 펩타이드가 HLA B*39임을 나타낸다.
도 6은 BKV 및 CMV 특이적 T 세포의 전사 조절인자(regulator)를 도시한다. 히스토그램은 T bet, Eomes, 그랜자임 B(granzyme B) 및 퍼포린(perforin)의 발현에 대한 CMV 및 BKV 특이적 T 세포의 비교를 도시한다. 히스토그램 선은 명시된 바와 같이 CMV 특이적 T 세포 및 BKV 특이적 T 세포에서의 발현을 도시한다.
도 7은 풀링(pooling)된 BKV 에피토프(표 1 참조)로 자극한 후의 BKV 특이적 T 세포의 시험관 내 확장을 도시한다. 건강한 지원자의 PBMC를 합성 BKV 펩타이드로 1시간 동안 자극한 후, 상이한 사이토카인 조합의 존재 하에서 12 내지 14일 동안 배양하였다. 이들은 IL-2(10ng/ml), IL-21(30ng/ml), IL7(10ng/ml), IL12(10ng/ml) 및/또는 IL15(10ng/ml)를 포함하였다. 이들 T 세포의 BKV 특이성은 표준 세포 내 사이토카인 검정을 사용하여 평가하였다.
도 8은 BKV와, JCV LTA, STA 및 VP1 아미노산 서열 간에 공통 서열(consensus sequence) 정렬을 도시한다.
도 9는 BKV와, MCV LTA, STA 및 VP1 아미노산 서열 간에 공통 서열 정렬을 도시한다.
도 10은 IL2, 또는 IL2와 IL21의 존재 하에 성장한 BKV 특이적 T 세포의 전사 인자 및 이펙터 분자 프로파일을 도시한다. 고(high) 그랜자임 세포 및 고 T bet 세포의 빈도는 IL-2와 IL-21의 존재 하에 성장한 세포에서 더 높았다.
도 11은 IL-2, 또는 IL2와 IL-21의 존재 하에 성장한 CD4 및 CD8 T 세포의 IFN-γ 발현을 도시하며, 이는 BKV 에피토프를 사용하여 특이성에 대해 분석하였다.
도 12는 IL-2, 또는 IL-2와 IL-21의 존재 하에 배양한 후의 CD4 및 CD8 세포의 갯수를 도시한다. BKV 특이적 CD4+ T 세포의 총 갯수는 IL2 단독으로 성장한 배양물과 비교하여 IL-2와 IL-21 존재 하에 성장한 배양물에서 감소하였다.
도 13은 CD8+ 및 CD4+ T 세포 집단 둘 다에서 CD25+ 세포의 백분율이 IL-2와 IL-21의 존재 하에 성장한 세포와 비교하여 IL-2 단독의 존재 하에 성장한 T 세포에서 더 높았음을 도시한다.
도 14는 CD4+ CD25hi CD127low 세포(Treg 세포)의 뉴로필린1 발현을 도시한다.
도 15는 BKV/JCV 교차-반응성을 나타내는 예시적인 에피토프로부터의 대표적인 IFN-γ 발현 데이터를 도시한다.
도 16은 JCV 에피토프를 사용하여 확장되고 다양한 농도의 JCV 에피토프 또는 이에 상응하는 BKV 에피토프 둘 중 하나를 사용하여 면역회상(recall)된 세포의 대표적인 IFN-γ 발현 데이터를 도시한다.
일반적인 사항
본원은 T 림프구(예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL) 및/또는 헬퍼 T 림프구)에 의해 인식되고 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 바이러스 감염) 및/또는 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암, 예컨대, BKV, JCV 또는 MCV 관련 암)의 예방 및/또는 치료에 유용한, 폴리오마바이러스 에피토프(예를 들어, 표 1, 2, 3, 4 및/또는 5에 열거된 에피토프)와 관련된 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물 및 방법은 BKV 에피토프(예를 들어, 표 1에 열거된 에피토프)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 JCV 에피토프(예를 들어, 표 2에 열거된 에피토프)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물 및 방법은 BKV 및 JCV 에피토프(예를 들어, 표 3에 열거된 에피토프) 내에서 또는 전체에 걸쳐 발견되는 변이체를 포함하는 하이브리드(hybrid) 에피토프에 관한 것이다.
정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구항에 사용된 특정 용어는 여기에 수집된다.
본원에서 사용된 단수형은 하나 또는 하나 초과의(즉, 하나 이상의) 문법적 대상을 지칭한다. 예로, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "투여하는"은 약학 약제 또는 조성물을 대상체에 제공하는 것을 의미하고, 전문 의료진이 투여하는 것 및 자가투여하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 약제는 예를 들어, 본원에 기재된 펩타이드, 본원에 제공된 항원 제시 세포 및/또는 본원에 제공된 CTL을 함유할 수 있다.
용어 "아미노산"은 아미노 작용기 및 산 작용기 모두를 포함하고 자연 발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는 자연 또는 합성의 모든 분자를 포괄하고자 한다. 예시적인 아미노산은 자연 발생 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동족체; 변형된 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 전술한 임의의 것의 모든 입체 이성질체를 포함한다.
용어 "결합하는" 또는 "상호작용하는"은 2개의 분자들 사이의, 예컨대, TCR과 펩타이드/HLA 사이의, 예컨대, 생리학적 조건 하에서 정전기, 소수성, 이온성 및/또는 수소결합 상호작용으로 인한 안정한 회합(association)일 수 있는 회합을 지칭한다. TCR은 에피토프가 적절한 HLA 위에 제시될 때 결합할 수 있는, T 세포 에피토프를 "인식한다".
용어 "생물학적 샘플(sample)", "조직 샘플", 또는 단순히 "샘플"은 각각 대상체의 조직으로부터 수득된 세포의 수집물을 지칭한다. 조직 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기, 조직 샘플, 생체 검사, 또는 흡입물로부터의 고형 조직; 혈액이나 임의의 혈액 성분, 혈청, 혈액; 뇌척수액, 양수, 복막액이나 간질액, 소변, 타액, 대변, 눈물과 같은 체액; 또는 대상체의 임신 또는 발달 중 임의의 때(time)의 세포일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 고형 종양 및 혈액 매개 종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 암은 피부, 조직, 장기, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 질환을 포함한다. 용어 "암"은 초기 암 및 전이 암을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "상동(homologous)"은 동일한 서열 가닥의 2개 영역 사이 또는 2개의 상이한 서열 가닥의 영역들 사이의 서열(예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열) 유사성을 지칭한다. 용어 "상동"은 또한 동일한 서열 가닥의 두 영역 사이 또는 2개의 상이한 서열 가닥의 영역들 사이의 서열 유사성을 지칭하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 양쪽 영역의 아미노산 잔기 위치가 동일한 아미노산 잔기로 점유되면, 그 영역은 그 위치에서 상동이다. 각 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기 위치가 동일한 잔기로 점유되는 경우 제1 영역은 제2 영역에 상동이다. 두 영역 사이의 상동성(homology)은 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기로 점유되는 두 영역의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 위치의 비율로 표현된다. 예로, 뉴클레오타이드 서열 5'-ATTGCC-3'을 갖는 영역 및 뉴클레오타이드 서열 5'-TATGGC-3'을 갖는 영역은 50%의 상동성을 공유한다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고, 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이로써 각 부분의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상은 동일한 뉴클레오타이드 잔기로 점유된다. 보다 바람직하게는, 각 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기 위치는 동일한 뉴클레오타이드 잔기로 점유된다.
용어 "단리된(isolated)"은 자연 상태에서 제거되었거나 그렇지 않으면 인간이 조작한 물질을 지칭한다. 단리된 물질은 자연 상태에서 통상적으로 동반되는 구성 요소를 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않을 수 있거나, 자연 상태에서 통상적으로 동반되는 구성 요소와 함께 인공적인 상태가 되도록 조작될 수 있다.
용어 "펩타이드"는, 특정 실시양태에서, (1) 자연에서 통상적으로 발견되는 단백질과 관련되지 않거나, (2) 통상적으로 발생하는 세포로부터 단리되거나, (3) 동일한 세포 공급원의 다른 단백질 없이 단리되거나, (4) 상이한 종의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (5) 자연으로 발생되지 않는 것으로서, 재조합 DNA 또는 RNA로 제조되거나 합성 기원인 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 이의 조합을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면 군체(grouping)로 구성된다. 특정 에피토프는 항체가 결합할 수 있는 아미노산의 특정 서열에 의해 정의될 수 있다.
본원에서 사용된 어구 "약학적으로 허용가능한"은, 합리적인 유익/유해 비율(benefit/risk ratio)에 비례하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한, 그의 약제, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에서 사용된 어구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 하나의 장기나 신체의 일부로부터 다른 장기나 신체의 일부로 약제를 이동하거나 수송하는 것과 관련된, 액체나 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능한"이어야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; (4) 분말화된 트라가칸트(tragacanth); (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 콩기름과 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액(Ringer's solution); (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 (22) 약학 제형에 사용되는 다른 비독성 상용성 물질.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 중합체성 형태의 뉴클레오타이드인, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 결합 분석으로부터 정의된 좌위(좌위들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예컨대, 표지화(labeling) 성분과의 접합(conjugation)에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본원에 제공된 모든 핵산 서열에서, U 뉴클레오타이드는 T 뉴클레오타이드와 상호 교환 가능하다.
본원에서 사용된, 병태를 "예방하다"라는 치료법은, 화합물이 질병 또는 병태가 발병하기 전에 통계 표본(sample)에 투여될 때, 처리되지 않은 대조군 표본에 비해 처리된 표본에서 질병이나 병태의 발생을 감소시키거나 처리되지 않은 대조군 표본에 비해 질병이나 병태의 하나 이상의 징후의 발병을 지연시키거나 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 "특이적 결합"은 항체가 예정된 항원에 결합하는 능력 또는 펩타이드가 예정된 결합 파트너에 결합하는 능력을 지칭한다. 전형적으로, 항체 또는 펩타이드는 약 10-7 M 이하의 KD에 상응하는 친화력으로 이의 예정된 항원 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하고, 비특이적이고 관련성이 없는 항원/결합 파트너(예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합의 친화력보다 10배 이상, 100배 이하 또는 1000배 이상 작은 (KD로 표현되는 바와 같은) 친화력으로 예정된 항원/결합 파트너에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 치료 또는 요법을 위해 선택된 인간 또는 인간 이외의 동물을 의미한다.
본원에 사용된 어구 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)" 및 "유효량(effective amount)"은 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 유익/유해 비율로 대상체의 세포의 적어도 아개체군에서 원하는 치료 효과를 생성시키는데 효과적인 약제의 양을 의미한다.
대상체의 질환을 "치료하는" 또는 질환을 갖는 대상체를 "치료하는"은 대상체를 약학 치료(예컨대, 약물의 투여)하여, 질환의 하나 이상의 징후가 감소되거나, 또는 그의 악화가 예방되는 것을 지칭한다.
용어 "벡터"는 핵산이 유기체, 세포 또는 세포 구성 요소 사이에서 증식(propagation) 및/또는 전달(transfer)될 수 있는 수단을 지칭한다. 벡터는 자율적으로 복제되거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로 바이러스, 파지미드, 트랜스포존 및 인공적인 염색체 등을 포함한다.
에피토프
특정 실시양태에서, 본원은 HLA 상에 제시될 때 CTL에 의해 인식되는 BKV 에피토프, JCV 에피토프, MCV 에피토프, 및/또는 BKV, JCV 및/또는 MCV 에피토프 사이의 상동인 서열을 포함하는 에피토프와 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 에피토프는 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 바이러스 감염) 및/또는 암(예를 들어, 본원에 제공된 에피토프를 발현하는 폴리오마바이러스 관련 암)의 예방 및/또는 치료에 유용하고/하거나, 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 바이러스 감염) 및/또는 암(예를 들어, 본원에 제공된 에피토프를 발현하는 폴리오마바이러스 관련 암)의 예방 및/또는 치료에 유용한 약제(예를 들어, CTL 및/또는 APC)의 생성을 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 에피토프는 표 1에 열거된 BKV 에피토프 및/또는 표 2에 열거된 JCV 에피토프이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 BKV 에피토프 및 상동 JCV 에피토프 모두로부터의 아미노산 및/또는 상이한 BKV 또는 JCV[여기에 적절한 명사를 삽입] 내에서 발견되는 아미노산 변이체를 포함하는 하이브리드 에피토프이다. 예시적인 하이브리드 에피토프는 표 3에 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 MCV 에피토프(예를 들어, 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프에 상동인 MCV 에피토프)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한 추가의 바이러스(예를 들어, EBV, CMV 또는 ADV)의 에피토프에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 HLA 클래스 I 제한된 T 세포 에피토프이다. 다른 실시양태에서, 에피토프는 HLA 클래스 II 제한된 T 세포 에피토프이다.
[표 1]
예시적인 BKV HLA 클래스 I 및 클래스 II 제한된 T 세포 에피토프
Figure pct00002
*ND: 정의되지 않음
[표 2]
BKV 에피토프 서열에 상동인 JCV로부터의 예시적인 에피토프 서열
Figure pct00003
* BKV 에피토프로부터의 변이체인 아미노산 잔기는 굵게 표시하고 밑줄을 그었다.
** 정의되지 않음
[표 3]
JCV/BKV 하이브리드 에피토프 서열로부터의 예시적인 에피토프 서열
Figure pct00004
** 정의되지 않음
일부 실시양태에서, 본원은 표 1, 표 2 및/또는 표 3의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 펩타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩타이드는 전장(full length) 바이러스 단백질(예를 들어, 전장 BKV, JCV 및/또는 MCV 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 전장 바이러스 단백질이 아니다(예를 들어, 전장 BKV, JCV 및/또는 MCV 단백질이 아니다). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩타이드는 서열 상동성인 BKV 및 JCV 에피토프(예를 들어, 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩타이드는 바이러스 단백질의 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15 또는 10개 미만의 인접 아미노산(contiguous amino acid)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩타이드는 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 2종 이상의 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 펩타이드는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 2종 이상의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27종 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27종 이상의 에피토프)를 포함한다.
특정 양태에서, 본원은 하나 이상의 BKV 또는 JCV 항원의 다수의 에피토프(예를 들어, LTA, STA 또는 VP1 바이러스 항원의 에피토프, 예를 들어, 표 1, 2 또는 3에 열거된 에피토프)를 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 단백질(예를 들어, 단리된 폴리펩타이드 또는 단백질)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드 또는 단백질은 다수의 에피토프 중 2개 이상 사이에 개재 아미노산(intervening amino acid) 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 개재 아미노산 또는 아미노산 서열은 프로테아좀 유리(proteasome liberation) 아미노산 또는 아미노산 서열이다. 프로테아좀 유리 아미노산 또는 아미노산 서열의 비제한적인 예는 AD, K 또는 R이거나, 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개재 아미노산 또는 아미노산 서열은 TAP 인식 모티프이다. 전형적으로, TAP 인식 모티프는 다음 식을 따를 수 있다: (R/N:I/Q:W/Y)n 여기서 n은 1 이상의 임의의 정수이다. TAP 인식 모티브의 비제한적 예는 RIW, RQW, NIW 및 NQY를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프는 프로테아좀 유리 아미노산 서열 및 선택적으로 각 에피토프의 카복시 말단에서의 TAP 인식 모티프에 의해 연결(link)되거나 결합(join)된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가의 바이러스(예를 들어, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus(EBV)), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus(CMV)) 및/또는 아데노바이러스(ADV)) 및 이로부터의 에피토프를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 2종 이상의 바이러스 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 3종 이상의 바이러스 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 4종 이상의 바이러스 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩타이드는 5종 이상의 바이러스 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 펩타이드는 JCV, BKV, MCV, EBV, CMV 및/또는 ADV 중 2, 3, 4 또는 5종 이상의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 제공된 2종 이상의 에피토프를 포함하는 폴리에피토프 단백질(즉, 자연적으로는 연결되지 않는 다수의 T 세포 에피토프를 포함하는 아미노산 잔기의 단일 사슬)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리에피토프 단백질 내 T 세포 에피토프는 아미노산 링커를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리에피토프 단백질 내 T 세포 에피토프는 개재된 아미노산 없이 직접 연결된다. 폴리에피토프 단백질의 예, 폴리에피토프 단백질의 생성 방법 및 폴리에피토프 단백질을 코딩하는 벡터는 Dasari et al., Molecular Therapy - Methods & Clinical Development(2016) 3, 16058에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에서 참고로 원용된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물 및 방법은 표 1 및/또는 2에 열거된 에피토프의 자연 발생된 변이체를 포함하거나 이에 관련된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 에피토프의 2종 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종 이상)의 자연 발생된 변이체를 포함하는 폴리에피토프 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프 서열은 1종 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 이상)의 보존적 서열 변형(conservative sequence modifications)을 제외하고는 본원에 개시된 서열을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 HLA에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 펩타이드와 TCR 사이의 상호 작용에 유의한 영향을 주지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가(예를 들어, 펩타이드의 N 또는 C 말단에 아미노산의 첨가) 및 결실(예를 들어, 펩타이드의 N 또는 C 말단에서의 아미노산의 결실)을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루타민산), 비전하 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경 펩타이드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 TCR 결합의 유지(retention)에 대해 시험될 수 있다. 변형은 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이와 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 항체에 도입될 수 있다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드(예를 들어, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 에피토프를 포함하는 펩타이드)를 제시하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포(APC)(예를 들어, 항원 제시 T 세포, 수지상 세포, B 세포, 대식세포 또는 인공적인 항원 제시 세포, 예컨대, aK562 세포)이다. 본원에 기재된 펩타이드를 제시하는 세포는 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 세포는 펩타이드 섭취를 촉진하도록 펄싱(pulsing)될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 제공된 펩타이드를 코딩하는 핵산으로 형질주입(transfection)된다. 일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 펩타이드로 세포를 펄싱하는 단계를 포함하는, 항원 제시 세포(APC)를 생산하는 방법을 제공한다. 항원 제시 세포를 생산하는 예시적인 예는 WO2013088114에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전체 내용이 본원에 원용된다.
본원에 제공된 펩타이드는 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 적절한 정제 방법에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있고/있거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있고/있거나 표준 펩타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 본원에 기재된 펩타이드는 본 발명의 펩타이드(들)을 코딩하는 뉴클레오타이드의 발현에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 대안으로, 이러한 펩타이드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주의 이종 펩타이드의 발현, 펩타이드의 화학적 합성 및 시험관 내 번역(translation)을 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 추가로 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques(1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J.(1969) J. Am. Chem. Soc. 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255; Kaiser et al.(1989) Science 243:187; Merrifield, B.(1986) Science 232:342; Kent, S. B. H.(1988) Annu. Rev. Biochem. 57:957; 및 Offord, R. E.(1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 원용된다.
핵산 분자
본원은 본원에 기재된 에피토프 및 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 전세포(whole cell), 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 제공된 서열 정보를 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 표 1, 2 또는 3에 열거된 하나 이상의 에피토프의 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드는 표준 합성 기술, 즉, 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 핵산 분자를 함유하는 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 기반의 발현 벡터)를 제공한다. 바이러스 벡터는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 추가의 DNA 절편을 함유할 수 있다. 특정 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터, 에피솜 포유 동물 벡터)는 도입된 숙주 세포에서 자가복제(autonomous replication)가 가능하다. 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정 벡터는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히, "발현 벡터")로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 본원은 발현 벡터에서 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 제공된 핵산을 전사하여, 본원에 기재된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 펩타이드를 발현한다. 핵산 분자는 세포의 게놈에 통합될 수 있거나 염색체 외부에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산 벡터 또는 재조합 아데노바이러스는 표 1, 2 및/또는 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 코딩한다. 예를 들어, 핵산 벡터 또는 재조합 아데노바이러스는 동일한 표의 하나 이상의 에피토프(예를 들어, 표 1의 하나 이상의 에피토프, 표 2의 하나 이상의 에피토프 또는 표 3의 하나 이상의 에피토프)로 구성될 수 있다. 또는, 핵산 벡터 또는 재조합 아데노바이러스는 동일한 표(예를 들어, 표 1)의 하나 이상의 에피토프 및 다른 표(예를 들어, 표 2)의 하나 이상의 에피토프로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산 벡터 또는 재조합 아데노바이러스는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1종 이하의 아미노산과 표 1, 2 또는 3에 열거된 에피토프를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 핵산 벡터는 코돈 최적화를 거친 핵산 서열을 포함한다.이러한 실시양태에서, 코딩 서열은 코딩 서열을 조립하는데 사용된 각각의 핵산의 코돈을 변화시킴으로써 구성된다. 일반적으로, 펩타이드 생산을 위한 코돈 사용을 최적화하는 뉴클레오타이드 서열을 확인하는 방법은 적어도 다음의 단계 (a) 내지 (e)를 포함한다. 단계 (a)에서, 한 부분에 코딩된 아미노산에 대한 코돈의 축중(縮重, degenerate) 형태를 함유하는 폴리펩타이드의 코딩 부분이 올리고머에 제공되고, 상기 올리고머는 확장되어 중첩 서열(overlapping sequence)을 갖는 인접한 코딩 서열을 제공한다. 단계 (b)에서, 올리고머를 처리하여 펩타이드의 코딩 서열의 조립(assembly)에 영향을 미친다. 재조립된 펩타이드는 그의 발현에 영향을 미치는 조절서열(control sequence)에 작동가능하게 연결된 발현 시스템에 포함된다. 단계 (c)에서, 발현 시스템은 상용가능한 숙주 세포의 배양물 내로 형질주입된다. 단계 (d)에서, 형질전환된 숙주 세포로부터 수득된 콜로니가 폴리펩타이드의 생산 수준에 대해 시험되었다. 단계 (e)에서, 폴리펩타이드의 생산량이 가장 높거나 만족스러운 하나 이상의 콜로니가 발현 시스템으로부터 수득된다. 단백질을 코딩하는 발현 시스템의 부분의 서열이 결정된다. 코돈 최적화에 대한 추가 설명은 미국공개특허 제US2010/035768호에 제공되며, 그 전체가 참고로 포함된다.
항원 제시 세포
일부 양태에서, 본원은, 본원에 제공된 하나 이상의 T 세포 에피토프(예를 들어, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상의 T 세포 에피토프)를 (예를 들어, HLA에) 제시하는 APC를 제공한다. 일부 실시양태에서, HLA는 클래스 I HLA이다. 일부 실시양태에서, HLA는 클래스 II HLA이다. 일부 실시양태에서, 클래스 I HLA는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-g, HLA-K 또는 HLA-L인 α쇄 폴리펩타이드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 클래스 II HLA는 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 또는 HLA-DRA인 α쇄 폴리펩타이드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 클래스 II MHLA는 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 또는 HLA-DRB인 β쇄 폴리펩타이드를 갖는다. 일부 실시양태에서, APC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38종 이상의 T 세포 에피토프(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39종 이상의, 표 1, 표 2 및/또는 표 3의 T 세포 에피토프)를 제시한다.
일부 실시양태에서, APC는 B 세포, 항원 제시 T 세포, 수지상 세포 또는 인공적인 항원 제시 세포(예를 들어, aK562 세포)이다. 상기 과정에서 사용되는 수지상 세포는 환자 샘플로부터 PBMC를 획득하여 이를 플라스틱에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 단핵구 집단은 달라붙고, 모든 다른 세포는 씻겨져 나갈 수 있다. 이후, 부착 집단은 IL-4 및 GM-CSF에 의해 분화되어, 단핵구 유래 수지상 세포를 생산한다. 이 세포는 IL-1β, IL-6, PGE-1 및 TNF-α(이들은 수지상 세포의 표면에서 중요한 공동-자극 분자를 상향 조절함)의 첨가에 의해 성숙될 수 있고, 이후 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스와 접촉된다.
일부 실시양태에서, APC는 인공적인 항원 제시 세포, 예컨대, aK562 세포이다. 일부 실시양태에서, 인공적인 항원 제시 세포는 CD80, CD83, 41BB-L 및/또는 CD86을 발현하도록 조작된다. aK562 세포를 포함하는 예시적인 인공적인 항원 제시 세포는 미국공개특허 제2003/0147869호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 원용된다.
특정 양태에서, 본원은 APC를, 본원에 기재된 T 세포 에피토프를 코딩하는 핵산 벡터 및/또는 재조합 아데노바이러스와, 및/또는 본원에 기재된 핵산 벡터 또는 재조합 아데노바이러스에 의해 생산된 폴리에피토프와 접촉시킴을 포함하는, 본원에 기재된 2종 이상의 T 세포 에피토프를 제시하는 APC를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시앙태에서, APC는 방사선-조사(irradiation)된다.
T 세포
특정 양태에서, 본원은 HLA에 제시되는 본원에 개시된 펩타이드(예를 들어, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 에피토프)를 인식하는 TCR(예를 들어, αβTCR 또는 γδTCR)을 발현하는 T 세포 및 T 세포 집단(예를 들어, CD4 T 세포 및/또는 CD8 T 세포)을 제공한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 클래스 I HLA 상에 제시된 본원에 기재된 펩타이드를 인식하는 TCR을 발현하는 CD8 T 세포(CTL)이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 클래스 II HLA에 제시된 본원에 기재된 펩타이드를 인식하는 CD4 T 세포(헬퍼 T 세포)이다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 하나 이상의 에피토프를 인식하는 T 세포(예를 들어, CTL)의 증식을 발생, 활성화 및/또는 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CTL을 포함하는 샘플(즉, PBMC 샘플)은 본원에 제공된 APC(예를 들어, 클래스 I HLA 복합체에 본원에 기재된 BKV 및/또는 JCV 에피토프를 포함하는 펩타이드를 제시하는 APC)와 함께 배양물에서 항온처리하였다. 일부 실시양태에서, T 세포를 함유하는 샘플을 본원에 제공된 APC와 2회 이상 항온처리하였다. 일부 실시양태에서, T 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 APC와 함께 항온처리하였다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 IL-4, IL-7 및/또는 IL-15이다. APC를 사용하여 T 세포의 증식을 유도하는 예시적인 방법은 예를 들어, 미국공개특허 제2015/0017723호에서 제공되며, 이는 본원에 참고로 원용된다.
일부 양태에서, 본원은 하나 이상의 T 세포 에피토프(예를 들어, 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 하나 이상의 T 세포 에피토프)를 인식하는 T 세포 수용체를 집합적으로 포함하는 CTL 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, CTL은 표 1, 표 2 및/또는 표 3의 2종 이상의 T 세포 에피토프를 인식한다. 일부 실시양태에서, CTL 집단은 JCV, BKV, MCV, EBV, CMV, ADV 및/또는 다른 바이러스의 임의의 조합의 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체를 집합적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, CTL 집단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38종 이상의 T 세포 에피토프(표 1의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7종 이상의 T 세포 에피토프 및/또는 표 1, 표 2 및/또는 표 3에 열거된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30종 이상의 에피토프)를 인식하는 T 세포 수용체를 집합적으로 포함한다.
일부 양태에서, 본원은, 본원에 기재된 핵산 벡터, 본원에 기재된 핵산 벡터에 의해 생산된 펩타이드, (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 벡터를 포함하는) 본원에 제공된 CTL 및/또는 APC, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물(예, 치료 조성물)을, 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 감염) 또는 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암, 예컨대, BKV, JVC 또는 MCV 관련 암)을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CTL 및/또는 APC는 대상체에서 자가유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 APC는 대상체에서 자가유래된다. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 APC는 대상체에 투여되기 전에 세포 은행에 저장된다.
약학 조성물
일부 양태에서, 본원은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1의 에피토프를 포함하는) 펩타이드, 핵산, 핵산 벡터, 재조합 아데노바이러스, 항체, CTL 또는 APC를 함유하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물, 예컨대, 백신 조성물) 뿐만 아니라 이러한 약학 조성물을 사용하여 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암, 예컨대, BKV, JVC 또는 MCV 관련 암) 또는 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV, MCV, CMV, EBV 또는 ADV 감염)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 제공된 다수의(예를 들어, 2종 이상의) 약제의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아쥬반트"는 환자 또는 대상체의 면역학적 또는 생리학적 반응에 영향을 미치는 약제를 광범위하게 지칭한다. 예를 들어, 아쥬반트는 시간 경과에 따라 또는 종양과 같은 관심 영역에서 항원의 존재를 증가시키고, 항원 제시 세포 항원의 흡수를 도울 수 있고, 대식세포 및 림프구를 활성화시킬 수 있고, 사이토카인 생산을 도울 수 있다. 면역 반응을 변화시킴으로써, 아쥬반트는 특정 투여량의 면역 상호 작용제의 유효성 또는 안전성을 증가시키기 위해 보다 적은 투여양의 면역 상호 작용제를 허용할 수 있다. 예를 들어, 아쥬반트는 T 세포 고갈을 예방하여 특정 면역 상호 작용제의 유효성 또는 안전성을 증가시킬 수 있다. 아쥬반트의 예는 면역 조절 단백질, 아쥬반트 65, α-GalCer, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 포스페이트, β-글루칸 펩타이드, CpG DNA, GPI-0100, 지질 A, 리포폴리사카라이드, 리포반트(Lipovant), 몬타나이드(Montanide), N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, Pam3CSK4, 퀼 A(quil A) 및 트레할로오스 디마이콜레이트(trehalose dimycolate)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이들 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 본원에 기재된 약제를 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 제형은 본원에 기재된 약제를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 직접적으로 회합시킨 후, 필요하다면 생산물을 성형함으로써 제조된다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 약제와, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 멸균 등장수(sterile isotonic aqueous) 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화제, 또는 사용 직전에 멸균된 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말(이들은 당(sugar), 알콜, 항산화제, 완충액, 세균 발육 억제 물질(bacteriostat), 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁제 또는 농축제를 함유할 수가 있음)을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트를 포함한다. 예를 들어, 적절한 유동성은 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
선택된 투여 경로와 관계없이, 적절한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 약제 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여 형태로 제형화된다.
치료 방법
특정 양태에서, 본원은 암(예를 들어, 폴리오마바이러스 관련 암, 예컨대, BKV-, JCV- 또는 MCV-관련 암) 또는 폴리오마바이러스 감염(예를 들어, BKV, JCV 또는 MCV 감염)을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 CTL, APC, 폴리펩타이드 및/또는 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료된 대상체는 면역약화되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 T 세포 결핍 상태이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종을 앓는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 HIV에 감염되고/되거나 에이즈(AIDS)를 앓는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조직, 장기 및/또는 골수 이식을 경험하였다. 일부 실시양태에서, 대상체는 면역 억제 약물을 투여받고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 화학 요법을 받은 적이 있고/있거나 화학 요법을 받고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 방사선 요법을 받은 적이 있고/있거나 방사선 요법을 받고 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재 된 방법은 임의의 암성 또는 전암성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 본원에 제공된 하나 이상의 BKV, MCV 또는 JCV 에피토프(예를 들어, 표 1, 2 또는 3에 열거된 BKV 또는 JCV 에피토프)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 메르켈 세포 암(Merkel cell carcinoma)이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 대장, 식도, 위장관, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁의 암세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 암은 구체적으로 다음의 조직학적 유형일 수 있으나, 이들에 제한되지는 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 방추형 세포 암종; 소세포 암종; 유두상암; 편평세포 암종; 림프상피 암종; 기저세포암; 섬모기질암; 이행상피암; 유두상 이행상피암; 선암; 악성 가스트린종; 담관암; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암; 섬유주 선암; 샘낭 암종; 샘종성 폴립에서의 선암; 가족성 대장 폴립증 선암; 고형 암종; 악성 유암종; 세기관지-폐포 선암; 유두상 선암종; 색소혐성 암종; 호산성 암종(acidophil carcinoma); 호산성 선암(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 여포 선암종; 유두상 및 여포 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지선암; 귀지선암; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암; 반지 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질암종; 소엽암; 염증성 암종; 유방성 페이젯병(mammary paget's disease); 선방세포 암종; 선편평세포 암종; 선암 w/편평상피화생(adenocarcinoma w/squamous metaplasia); 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포종; 악성 남성모세포종; 세르톨리세포 암종; 악성 간질세포종(malignant leydig cell tumor); 악성 지질세포종; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색세포종; 글로만지오사르코마(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재 확산 흑색종; 거대색소 모반에서의 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 악성 청색모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 기질육종; 악성 혼합 종양; 뮐로(mullerian) 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 간엽종(malignant mesenchymoma); 악성 브레너 종양(malignant brenner tumor); 악성 엽상종; 활막육종; 악성 중피종; 미분화배세포종; 태생기암; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관 육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종(kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 측피질 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종(ewing's sarcoma); 악성 치성 종양; 법랑모세포 치육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 법랑모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병(Hodgkin's disease); 호지킨 림프종; 파라육아종; 소형 림프구성 악성 림프종; 광범위 큰 세포 악성 림프종; 난포 악성 림프종; 균상 식육종; 다른 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포성 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만세포성 백혈병; 거핵아구 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종; 및 모양 세포 백혈병.
일부 실시양태에서, 또한 대상체에 BKV 또는 JCV 복제를 억제하는 항바이러스 약물이 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체에 간사이클로비르(ganciclovir), 발간사이클로비르(valganciclovir), 포스카넷트(foscarnet), 시도포비르(cidofovir), 아시클로비르(acyclovir), 포어미비르젠(formivirsen), 마리바비르(maribavir), BAY 38-4766 또는 GW275175X가 투여된다.
일부 실시양태에서, 또한 대상체에 면역 체크포인트 억제제가 투여된다. 면역 체크포인트 억제는 면역 반응을 예방하거나 하향 조절하기 위해 암세포가 생산할 수 있는 체크포인트를 억제하는 것을 광범위하게 지칭한다. 면역 체크포인트 단백질의 예는 CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 또는 VISTA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 면역 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 단백질에 결합하고 이를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 면역 체크포인트 억제제의 예는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 피딜리주맙(pidilizumab), AMP-224, AMP-514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB-0020718C, AUR-012 및 STI-A1010를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 암 및/또는 BKV, MCV 또는 JCV 감염을 예방하기 위해 예방적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체 내 암세포 또는 BKV-, MCV- 또는 JCV- 감염된 세포의 검출 전 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩타이드, 핵산, CTL 및/또는 APC를 포함하는 조성물의 투여 후에, 전염증성(proinflammatory) 반응이 유도된다. 전염증성 면역 반응은 전염증성 사이토카인 및/또는 케모카인(chemokine) 예를 들어, 인터페론 감마(IFN-γ) 및/또는 인터루킨 2(IL-2)의 생산을 포함한다.
복합 요법(conjunctive therapy)은, 후속 치료가 투여될 때 투여된 제1 약제의 치료 효과가 완전히 사라지지 않는 방식으로, 활성 화합물들의 순차, 동시 및 개별, 및/또는 공동 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 약제는 제1 약제와 함께 공동-제형화되거나 개별적인 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 본원은 본원에 제공된 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법(예를 들어, 본원에 제공된 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 BKV, JCV 또는 MCV 감염 및/또는 암의 치료 방법)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체로부터 샘플(예를 들어, 혈액 샘플, 조직 샘플, 종양 샘플)을 단리하는 단계 및 상기 샘플에서 표 1 또는 2에 열거된 에피토프의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 ELISA 검정, 웨스턴 블랏 검정, FACS 검정, 형광 현미경 검정(fluorescent microscopy assay), 에드만 분해 검정(Edman degradation assay) 및/또는 질량 분광 검정(mass spectrometry assay)(예를 들어, 단백질 서열 분석)을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, BKV 또는 JCV 에피토프의 존재는 BKV, MCV 또는 JCV 에피토프를 코딩하는 핵산을 검출함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, BKV, MCV 또는 JCV 에피토프를 코딩하는 핵산은 핵산 프로브, 핵산 증폭 검정 및/또는 서열 검정(sequencing assay)을 사용하여 검출된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 HLA 형별검사(typing)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체가 본원에 제공된 에피토프가 제한된 HLA를 발현하는 경우, 대상체는 본원에 제공된 방법으로 치료하기에 적합한 것으로 확인된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 (예를 들어, 본원에 제공된 약학 조성물을 대상체에 투여함으로써) 본원에 제공된 치료 방법을 사용하여 확인된 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CTL을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하되, 여기서 CTL은 본원에 제공된 에피토프(즉, 대상체에 의해 발현된 HLA로 제한된 HLA)를 인식하는 TCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프(즉, 대상체에 의해 발현된 HLA로 제한된 HLA)를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 대상체에 투여한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프(즉, 대상체에 의해 발현된 HLA로 제한된 HLA)를 포함하는 폴리펩타이드를 제시하는 APC를 포함하는 조성물을 대상체에 투여한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 에피토프(즉, 대상체에 의해 발현된 HLA로 제한된 HLA)를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 대상체에 투여한다.
실시예
실시예 1 : CD8 + T 세포 반응은 LTA 및 STA에 대해 유도되는 반면, CD4 + T 세포 반응은 LTA, VP1 및 STA에 대해 유도된다
건강한 지원자의 PBMC를 BKV OPP와 함께 항온처리하고 IL-2 및 T 세포 성장 인자(TCGF)의 존재 하에 이들 세포를 14일 동안 배양하였다. 14일 째에, T 세포 배양물은 ICS 검정을 사용하여 BKV 특이성에 대해 평가되었다. 도 1은 BKV 펩타이드와 함께 T 세포를 14일 동안 시험관 내에서 배양한 결과, 바이러스 특이적 T 세포가 확장한다는 것을 도시한다. 일부 경우, 이러한 확장은 CMV 특이적 T 세포에 필적하였다. 시험관 내 확장된 T 세포에 기반한 T 세포 검정의 상세한 요약은 도 2에 제시하였다. 이러한 초기 분석은 CD8+ T 세포 반응이 주로 LTA 및 STA에 대해 유도되는 반면에 CD4+ T 세포 반응은 LTA, VP1 및 STA에 대해 유도되는 것을 분명히 나타낸다. 이러한 관찰 결과를 검증하기 위해 50명의 지원자(검정의 제1 세트로부터의 많은 지원자 포함)에서 T 세포 검정을 반복하였고 이 분석의 요약은 도 2에 나타나있다. 도 2에 나타난 데이터와 일관되게, LTA, STA 및 VP1 항원에 대한 우세한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응이 검출되었다.
실시예 2: T 세포 반응의 추가 특징화
이러한 항원에 대한 T 세포 반응을 특징화하고 HLA 클래스 I 및 클래스 II 제한된 T 세포 반응을 정확하게 매핑(mapping)하기 위해 중첩된 개별 펩타이드(15aa 길이는 10aa로 중첩됨)가 T 세포 에피토프 맵핑을 위한 LTA, STA 및 VP1 단백질을 위해 공급되었다. 2차원 펩타이드 매트릭스를 사용하여 모든 개별 펩타이드를 작은 중첩된 펩타이드 풀에 분포시켰다. 매트릭스는 각 펩타이드가 세로 좌표에서 한 번 나타나는 방식으로 설정되어 있다(도 3). 이러한 펩타이드 풀은 ICS 검정에 사용되었다. ICS 분석 후, 펩타이드 풀에 대한 T 세포 반응을 매트릭스와 비교하여 개별 펩타이드를 확인하였다. 이러한 개별 펩타이드는 잠재적인 BK를 확인하기 위해 T 세포 확장 및 ICS 분석에 대해 추가로 평가되었다. 일단 15mer 펩타이드가 확인되면, 최적의 T 세포 에피토프 서열을 확인하기 위해 에피토프 서열의 최소화(minimalization)를 추가로 수행하였다. 15mer 펩타이드 서열은 N- 및 C- 말단으로부터 최소 9aa 길이 펩타이드로 절단되었다. 최소 펩타이드 서열이 확인되면, 제한 용량 적정 ICS 검정을 사용하여 추가 확인을 수행하였다. 최소 에피토프 서열을 매핑한 후, 에피토프의 HLA 제한은 HLA-매치된(match) LCL 및 HLA-미스매치된(mismatch) LCL이 로딩된 펩타이드를 사용하여 T 세포를 자극함으로써 확인하였다. 에피토프 맵핑의 완전한 과정은 도 4에 제공된 흐름도에 나타나있다.
도 5는 BKV 에피토프 맵핑 과정 중 하나로부터의 대표적인 데이터를 도시한다. 도 5, 패널 A에 나타난 데이터는 건강한 지원자 H26으로부터의 BKV-특이적 T 세포가 STA OPP를 인식함을 도시한다. T 세포 에피토프를 매핑하기 위해, 도 3에 도시된 2개의 2차원 매트릭스에 기반하여 설계된 STA 펩타이드의 하위 풀(12 풀)을 사용하여 추가 분석을 수행하였다. STA 펩타이드를 기반으로 한 세포내 사이토카인 분석 결과, 풀 4와 10은 CD8+ T 세포에 의해 효율적으로 인식되고, 매트릭스 레이아웃에서 겹쳤을(overlay) 때 반응하는(responding) 풀 중에서 STA22 펩타이드가 공통 펩타이드 서열로 나타났다(도 5, 패널 B). 펩타이드 절단(trimming) 과정은 VHCPCMLCQL이 T 세포 에피토프임을 보여준다(도 5, 패널 C 및 D). HLA 매치된 LCL을 사용하는 HLA 제한 분석은 VHCPCMLCQL이 HLA B*39 제한된 에피토프임을 보여준다(도 5, 패널 E). 유사한 에피토프 매핑 과정이 다른 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프에 대해 수행되었다. 이 연구 동안 매핑된 CD8+ 및 CD4+ BKV 에피토프 목록은 표 4 및 5에 각각 나열되어 있다.
[표 4]
CD8 + 에피토프
Figure pct00005
[표 5]
CD4 + 에피토프
Figure pct00006
실시예 3: 건강한 개체 및 이식받는 수령자에서의 BKV 특이적 T 세포의 기능적 및 표현형 특징 규명
최근 몇 년 동안, T-box 전사 인자(T-bet)와 에오메조데르민(eomesodermin (Eomes))은 감염시에 CD8+ T 세포의 운명을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 높은 수준의 T-bet은 세포독성 T 세포 분화 및 항원 특이적 세포에서의 퍼포린 및 그랜자임 B의 상향 조절과 관련되어 있다. 높은 수준의 Eomes는 장기기억 형성과 관련이 있다. 다양한 연구에서 이들의 협동 발현(cooperative expression)이 감염 제어(control)에 중요하다는 것이 밝혀졌다. 마우스 연구에서, 전사 인자들 중 하나의 결실은 감염을 제어하지 못하게 하는 것으로 나타났다. 따라서 급성 및 만성 바이러스 감염시에 T 세포 및 T 세포 분화의 표현형 특징을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 이들 전사 인자의 발현을 연구하는 것이 중요하다. BKV 특이적 T 세포에서의 T-bet 및 Eomes의 발현 패턴은 아직 밝혀지지 않았으며, 이들 T 세포의 전사 인자 분석은 BKV 특이적 T 세포의 분화에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 할 수 있다. T 세포의 기능적 특성에 대한 상세한 연구는 또한 BKV 관련 질환에 대한 효과적인 면역 요법의 개발로 이어질 수 있다. 초기 실험 세트는 T 세포의 분화를 조절하는 T 세포의 전사 인자를 연구하기 시작하였다. ICS를 사용하여 BKV 특이적 T 세포 및 CMV 특이적 T 세포에 대해 T-bet, Eomes, 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현을 검정하였다. 초기 분석은, BKV 특이적 T 세포에서 T bet 발현이 중간 수준에서 낮은 수준으로 나타난 반면, CMV 특이적 T 세포에서는 T-bet 수준이 높게 나타남을 보여준다(도 6). 또한, CMV 특이적 T 세포와 비교하여, BKV 특이적 T 세포에서 Eomes의 발현이 매우 낮음이 발견되었다. 낮은 수준의 퍼포린 및 그랜자임 B는 BKV 특이적 T 세포에서도 관찰되었다. 이 예비 데이터는 BKV 특이적 T 세포가 이펙터(effector) 기능에서 기능적으로 낮을 수 있음을 제안한다. 따라서 BKV 특이적 CTL의 이펙터 기능을 연구하는 것이 내 연구의 초점이 될 것이며, 이러한 내 연구는 효과적인 입양 T 세포 면역 요법을 개발하는데 도움이 될 수도 있다.
실시예 4: BKV-특이적 T 세포 확장
BKV-특이적 T 세포를 풀링된(pooling) BKV 에피토프로 자극시킨 후에 시험관 내에서 확장시켰다. 구체적으로, 건강한 지원자의 PBMC를 합성 BKV 펩타이드(표 1)로 1시간 동안 자극한 후, IL-2(10ng/ml), IL-21(30ng/ml), IL7(10ng/ml), IL12(10ng/ml) 및/또는 IL15(10ng/ml)를 포함하는 상이한 사이토카인의 조합의 존재 하에 12 내지 14일 동안 배양하였다. 확장된 T 세포의 BKV 특이성은 표준 세포 내 사이토카인 검정을 사용하여 평가하였다(도 7).
실시예 5: 공통 정렬(alignment)의 생성
본원에 기재된 BKV 에피토프에 상동인 JC 바이러스 에피토프를 확인하기 위해, NCBI Blastp 서열 정렬 프로그램을 사용하여 BKV 및 JCV 거대 T 항원(LTA) 단백질, 소형 T 항원 단백질(STA) 및 VP1 단백질의 아미노산 서열을 각각 정렬하고, 상동 서열을 확인하였다(도 8, 강조 표시된 에피토프). 또한, NCBI Blastp 서열 정렬 프로그램을 사용하여 BKV 및 MCV VP1 단백질의 아미노산 서열을 정렬하여, 상동 서열을 확인하였다(도 9).
실시예 6: IL-21 존재 하의 CTL의 확장
BKV 특이적 T 세포는 건강한 공여자의 PBMC를 사용하여 생성되었다. PBMC는 시험관 내에서 1μg/ml의 농도로 각각의 BKV 펩타이드 풀로 자극하고 37℃, 6.5% CO2에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 2개로 분할하여 2가지 조건에서 배양하였다. 한 부분의 세포는 37℃, 6.5% CO2에서 항온처리된 24웰 플레이트에서 IL21(Milteyni Biotech Ltd) 30ng/ml를 함유하는 R10 배지(RPMI + 10% FCS)에서 성장시켰다. 다른 부분의 세포는 IL-21 없이 R10 배지에서 항온처리하였다. 두 조건에서 성장된 배양물에 2일 째에 재조합 인터루킨-2(Charles River Laboratory, 미국 국립보건원 소재)를 20IU/ml로 함유하는 R10 배지를 보충한 다음, 그 후로부터 20일 째까지 3일 마다 IL-2를 함유하는 배지를 보충하였다.
배양물 내 T 세포를 계수하고, 필요한 양의 세포는 IFN-γ 세포내 사이토카인(ICS) 검정을 위해 사용하고 나머지 세포는 액체 질소에서 저온보존하였다. 약 2 x 105의 CTL을 96 웰 V-바닥 플레이트에 첨가하였다. 골지플러그 브레펠딘 A(Golgiplug Brefeldin A(BD Pharmingen, 미국 캘리포니아주 산 디에고 소재))가 함유된 R10 배지에서 1μg/ml 농도의 각 펩타이드로 세포를 자극하고 37℃, 6.5% CO2에서 4시간 동안 항온처리하였다. BKV 특이적 T 세포는 BKV 펩타이드와 이의 각각의 JCV 변이종으로 면역회상(recall)되었고, JCV 특이적 T 세포에 대해서는 그 반대의 경우로 면역회상되었다. 항온처리 후, 세포를 2% FBS(세척 완충액)를 함유하는 PBS로 세척하고, 펠릿을 FITC-접합된(conjugated) 항-CD4 및 PerCP-Cy5.5 접합된 항-CD8 항체를 함유하는 50㎕의 세척 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세척하고, 고정시키고, Cytofix/Cytoperm 용액(BD Pharmingen)으로 20분 동안 투과화시켰다. 그런 다음 세포를 세척하고 펌워시(Permwash) 완충액으로 희석한 PE-항-IFN-γ 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 염색된 세포를 펌워시 완충액으로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 재현탁시키고, BD LSR Fortessa를 사용하여 수득하였다. 수득 후 분석은 플로우조 소프트웨어(FlowJo software(TreeStar))를 사용하여 수행하였다. 도 11은 세포 집단의 IFN-γ 발현을 제공하고, 도 12는 확장된 배양물 내 CD4 및 CD8 세포의 갯수를 제공한다.
배양물 내 IL-21의 존재가 전사 인자 및 이펙터 분자 발현에 미치는 영향을 시험하였다. 두 조건에서 성장한 약 2 x 105개의 CTL을 96 웰 V-바닥 플레이트에 첨가하였다. 세포를 2% FBS(세척 완충액)를 함유하는 PBS로 세척하고, 펠릿을 각각의 APC 접합된 BKV 특이적 덱스트라머 1㎕를 함유하는 50μL의 PBS에 재현탁시키고 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 그런 다음 PE-Cy7 CD4 및 V500 CD8 항체를 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 고정시키고, 전사 인자 Cytofix/Cytoperm 용액(BD Pharmingen)으로 1시간 동안 투과화시켰다. 이어서 세포를 세척하고 펌워시 완충액으로 희석된 eflour710-항-Eomes 항체, AF100-접합된-항-그랜자임 B, BV421 접합된 항-퍼포린 및 PE 접합된 항-Tbet 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 염색된 세포를 펌워시 완충액으로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 재현탁시키고, BD LSR Fortessa를 사용하여 수득하였다. 수득 후 분석은 플로우조 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 수행하였다. 도 10은 세포 집단의 전사 인자 및 이펙터 분자 발현을 도시한다.
또한, 조절 T 세포의 확장에 대한 IL-21의 존재의 영향을 시험하였다. 두 조건에서 성장한 약 2 x 105개의 CTL을 96 웰 V-바닥 플레이트에 첨가하였다. 세포를 2% FBS(세척 완충액)를 함유하는 PBS로 세척하고, 펠릿을 FITC 접합된 항-CD3, 퍼시픽 블루(pacific blue) 접합된 항-CD4, PEcy7 접합된 항-CD25, PE-접합된 항-뉴로필린 1 및 BV786 접합된 항-CD127 항체를 함유하는 50μL의 PBS에 재현탁시키고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음 세포를 PE-Cy7 CD4 및 V500 CD8 항체와 혼합하고 30분 동안 4℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 고정시키고, FoxP3 Cytofix/Cytoperm 용액(ebiosciences Ltd)으로 1시간 동안 투과화시켰다. 그런 다음 세포를 세척하고 펌워시 완충액으로 희석된 APC 접합된 항-FoxP3 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 염색된 세포를 펌워시 완충액으로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 재현탁시키고 BD LSR Fortessa를 사용하여 수득하였다. 수득 후 분석은 플로우조 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 수행하였다. 도 13 및 도 14는 세포 집단 내의 조절 T 세포의 존재를 도시한다.
실시예 7: T 세포 교차-반응성(Cross-Reactivity)
매핑된 BKV 에피토프에 대한 JCV 변이체를 합성하였다. BKV 및 JCV 특이적 T 세포는 건강한 공여자의 PBMC를 사용하여 생성하였다. PBMC를 세척하고 R10(RPMI + 10% FCS)에 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 개별적으로 1μg/ml 농도로 BKV 및 JCV 펩타이드로 시험관 내에서 자극하고 37℃, 6.5% CO2에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 세척하고 37℃, 6.5% CO2에서 항온처리한 24 웰 플레이트에서 14일 동안 성장시켰다. 배양물에 재조합 인터루킨-2(Charles River Laboratory, 미국 국립보건원 소재)를 20IU/ml로 함유하는 R10 배지를 2일 째에 보충한 다음, 그 후로부터 14일 째까지 3일 마다 IL-2를 함유하는 R10 배지를 보충하였다. 14일 째에, 트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion method)을 사용하여 배양물 내 T 세포를 계수하고 필요한 양의 세포는 IFN-γ 세포 내 사이토카인(ICS) 검정을 위해 사용하고 나머지 세포는 액체 질소에서 저온보존하였다.
T 세포 교차 반응성은 BKV 또는 JCV 에피토프로 T 세포-재자극한 다음에 IFN-γ 발현을 측정함으로써 결정하였다. 약 2 x 105의 CTL을 96 웰 V-바닥 플레이트에 첨가하였다. 골지플러그 브레펠딘 A(BD Pharmingen, 미국 캘리포니아주 산 디에고 소재)가 함유된 R10 배지에서 1μg/ml 농도의 각 펩타이드로 세포를 자극하고 37℃, 6.5% CO2에서 4시간 동안 항온처리하였다. BKV 특이적 T 세포는 BKV 펩타이드와 이의 각각의 JCV 변이종으로 면역회상되었고, JCV 특이적 T 세포에 대해서는 그 반대의 경우로 면역회상되었다. 항온처리 후, 세포를 2% FBS(세척 완충액)를 함유하는 PBS로 세척하고, 펠릿을 FITC-접합된 항-CD4 및 PerCP-Cy5.5 접합된 항-CD8 항체를 함유하는 50㎕의 세척 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세척하고, 고정시키고, Cytofix/Cytoperm 용액(BD Pharmingen)으로 20분 동안 투과화시켰다. 그 다음, 세포를 세척하고 펌워시 완충액에 희석한 PE-항-IFN-γ 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 염색된 세포를 펌워시 완충액으로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 재현탁시키고, BD LSR Fortessa를 사용하여 수득하였다. 수득 후 분석은 플로우조 소프트웨어(TreeStar)를 사용하여 수행하였다. 도 15는 대표적인 IFN-γ 발현 데이터를 도시한다.
BKV 및 JCV 특이적 T 세포 둘 다에 반응하는 펩타이드를 제한 투여량 적정 검정을 사용하여 결합활성(avidity)에 대해 추가로 분석하였다. 펩타이드를 1㎍/㎖으로부터 10-5㎍/㎖의 농도까지 10배 적정하였다. 이 후, 이러한 적정한 펩타이드는 표준 IFN-γ 세포 내 사이토카인 검정에서 BKV 및 JCV 특이적 CTL을 면역회상하기 위해 사용되었다. 도 16은 대표적인 적정 검정 데이터를 도시한다.
에피토프 교차 반응성은 표 6(CD8 에피토프에 대해) 및 표 7(CD4 에피토프에 대해)에서 제공된다 .
[표 6]
예시적인 CD8 에피토프의 BKV/JCV 교차-반응성
Figure pct00007
[표 7]
예시적인 CD4 에피토프의 BKV/JCV 교차 반응성
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> ATARA BIOTHERAPEUTICS, INC. THE COUNCIL OF THE QUEENSLAND INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH <120> IMMUNOTHERAPY FOR POLYOMAVIRUS <130> QAH-01325 <140> PCT/US2017/050686 <141> 2017-09-08 <150> 62/385,456 <151> 2016-09-09 <160> 175 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 1 Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro Lys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 2 Ala Val Asp Thr Val Leu Ala Lys Lys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 3 Cys Tyr Cys Ile Asp Cys Phe Thr Gln 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 4 Leu Pro Leu Met Arg Lys Ala Tyr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 5 Phe Pro Leu Cys Pro Asp Thr Leu Tyr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 6 Thr Leu Tyr Cys Lys Glu Trp Pro Ile 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> V or G <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> K or I <400> 7 Glu Pro Leu Xaa Trp Xaa Asp Cys Tyr 1 5 <210> 8 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Met Val Val Phe Glu Asp 340 345 350 Val Lys Gly Thr Gly Ala Glu Ser Lys Asp Leu Pro Ser Gly His Gly 355 360 365 Ile Asn Asn Leu Asp Ser Leu Arg Asp Tyr Leu Asp Gly Ser Val Lys 370 375 380 Val Asn Leu Glu Lys Lys His Leu Asn Lys Arg Thr Gln Ile Phe Pro 385 390 395 400 Pro Gly Leu Val Thr Met Asn Glu Tyr Pro Val Pro Lys Thr Leu Gln 405 410 415 Ala Arg Phe Val Arg Gln Ile Asp Phe Arg Pro Lys Ile Tyr Leu Arg 420 425 430 Lys Ser Leu Gln Asn Ser Glu Phe Leu Leu Glu Lys Arg Ile Leu Gln 435 440 445 Ser Gly Met Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ile Trp Phe Arg Pro Val Ala 450 455 460 Asp Phe Ala Thr Asp Ile Gln Ser Arg Ile Val Glu Trp Lys Glu Arg 465 470 475 480 Leu Asp Ser Glu Ile Ser Met Tyr Thr Phe Ser Arg Met Lys Tyr Asn 485 490 495 Ile Cys Met Gly Lys 500 <210> 147 <211> 493 <212> PRT <213> Merkel cell polyomavirus <400> 147 Ser Thr Pro Pro Lys Pro Lys Lys Asn Arg Glu Thr Pro Val Pro Thr 1 5 10 15 Asp Phe Pro Ile Asp Leu Ser Asp Tyr Leu Ser His Ala Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Lys Thr Val Ser Cys Phe Ala Ile Tyr Thr Thr Ser Asp Lys Ala 35 40 45 Ile Glu Leu Tyr Asp Lys Ile Glu Lys Phe Lys Val Asp Phe Lys Ser 50 55 60 Arg His Ala Cys Glu Leu Gly Cys Ile Leu Leu Phe Ile Thr Leu Ser 65 70 75 80 Lys His Arg Val Ser Ala Ile Lys Asn Phe Cys Ser Thr Phe Cys Thr 85 90 95 Ile Ser Phe Leu Ile Cys Lys Gly Val Asn Lys Met Pro Glu Met Tyr 100 105 110 Asn Asn Leu Cys Lys Pro Pro Tyr Lys Leu Leu Gln Glu Asn Lys Pro 115 120 125 Leu Leu Asn Tyr Glu Phe Gln Glu Lys Glu Lys Glu Ala Ser Cys Asn 130 135 140 Trp Asn Leu Val Ala Glu Phe Ala Cys Glu Tyr Glu Leu Asp Asp His 145 150 155 160 Phe Ile Ile Leu Ala His Tyr Leu Asp Phe Ala Lys Pro Phe Pro Cys 165 170 175 Gln Lys Cys Glu Asn Arg Ser Arg Leu Lys Pro His Lys Ala His Glu 180 185 190 Ala His His Ser Asn Ala Lys Leu Phe Tyr Glu Ser Lys Ser Gln Lys 195 200 205 Thr Ile Cys Gln Gln Ala Ala Asp Thr Val Leu Ala Lys Arg Arg Leu 210 215 220 Glu Met Leu Glu Met Thr Arg Thr Glu Met Leu Cys Lys Lys Phe Lys 225 230 235 240 Lys His Leu Glu Arg Leu Arg Asp Leu Asp 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Leu Trp Ser Lys Phe Gln Gln 50 55 60 Asn Ile His Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Met Phe Asp Glu Val Asp 65 70 75 80 Glu Ala Pro Ile Tyr Gly Thr Thr Lys Phe Lys Glu Trp Trp Arg Ser 85 90 95 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 150 Phe Lys Arg Pro Lys Thr Pro Pro Pro 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Merkel cell polyomavirus <400> 151 Phe Thr Thr Pro Lys Thr Pro Pro Pro 1 5 <210> 152 <211> 30 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 152 Glu Thr Glu Asp Ser Gly His Gly Ser Ser Thr Glu Ser Gln Ser Gln 1 5 10 15 Cys Ser Ser Gln Val Ser Asp Thr Ser Ala Pro Ala Glu Asp 20 25 30 <210> 153 <211> 30 <212> PRT <213> Merkel cell polyomavirus <400> 153 Glu Thr Thr Asn Ser Gly Arg Glu Ser Ser Thr Pro Asn Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Pro Arg Asn Ser Ser Arg Thr Asp Gly Thr Trp Glu Asp 20 25 30 <210> 154 <211> 172 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 154 Met Asp Lys Val Leu Asn Arg Glu Glu Ser Met Glu Leu Met Asp Leu 1 5 10 15 Leu Gly Leu Glu Arg Ala Ala Trp Gly Asn Leu Pro Leu Met Arg Lys 20 25 30 Ala Tyr Leu Arg Lys Cys Lys Glu Phe His Pro Asp Lys Gly Gly Asp 35 40 45 Glu Asp Lys Met Lys Arg Met Asn Thr Leu Tyr Lys Lys Met Glu Gln 50 55 60 Asp Val Lys Val Ala His Gln Pro Asp Phe Gly Thr Trp Ser Ser Ser 65 70 75 80 Glu Val Cys Ala Asp Phe Pro Leu Cys Pro Asp Thr Leu Tyr Cys Lys 85 90 95 Glu Trp Pro Ile Cys Ser Lys Lys Pro Ser Val His Cys Pro Cys Met 100 105 110 Leu Cys Gln Leu Arg Leu Arg His Leu Asn Arg Lys Phe Leu Arg Lys 115 120 125 Glu Pro Leu Val Trp Ile Asp Cys Tyr Cys Ile Asp Cys Phe Thr Gln 130 135 140 Trp Phe Gly Leu Asp Leu Thr Glu Glu Thr Leu Gln Trp Trp Val Gln 145 150 155 160 Ile Ile Gly Glu Thr Pro Phe Arg Asp Leu Lys Leu 165 170 <210> 155 <211> 183 <212> PRT <213> Merkel cell polyomavirus <400> 155 Met Asp Leu Val Leu Asn Arg Lys Glu Arg Glu Ala Leu Cys Lys Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ile Ala Pro Asn Cys Tyr Gly Asn Ile Pro Leu Met Lys Ala 20 25 30 Ala Phe Lys Arg Ser Cys Leu Lys His His Pro Asp Lys Gly Gly Asn 35 40 45 Pro Val Ile Met Met Glu Leu Asn Thr Leu Trp Ser Lys Phe Gln Gln 50 55 60 Asn Ile His Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Met Phe Asp Glu Val Ser 65 70 75 80 Thr Lys Phe Pro Trp Glu Glu Tyr Gly Thr Leu Lys Asp Tyr Met Gln 85 90 95 Ser Gly Tyr Asn Ala Arg Phe Cys Arg Gly Pro Gly Cys Met Leu Lys 100 105 110 Gln Leu Arg Asp Ser Lys Cys Ala Cys Ile Ser Cys Lys Leu Ser Arg 115 120 125 Gln His Cys Ser Leu Lys Thr Leu Lys Gln Lys Asn Cys Leu Thr Trp 130 135 140 Gly Glu Cys Phe Cys Tyr Gln Cys Phe Ile Leu Trp Phe Gly Phe Pro 145 150 155 160 Pro Thr Trp Glu Ser Phe Asp Trp Trp Gln Lys Thr Leu Glu Glu Thr 165 170 175 Asp Tyr Cys Leu Leu His Leu 180 <210> 156 <211> 359 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 156 Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Cys Pro Gly Ala Ala Pro Lys 1 5 10 15 Lys Pro Lys Glu Pro Val Gln Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys Gly Gly 20 25 30 Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr Gly Val Asp Ala Ile Thr Glu Val 35 40 45 Glu Cys Phe Leu Asn Pro Glu Met Gly Asp Pro Asp Glu Asn Leu Arg 50 55 60 Gly Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ala Glu Asn Asp Phe Ser Ser Asp Ser 65 70 75 80 Pro Glu Arg Lys Met Leu Pro Cys Tyr Ser Thr Ala Arg Ile Pro Leu 85 90 95 Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr Cys Gly Asn Leu Leu Met Trp Glu 100 105 110 Ala Val Thr Val Gln Thr Glu Val Ile Gly Ile Thr Ser Met Leu Asn 115 120 125 Leu His Ala Gly Ser Gln Lys Val His Glu His Gly Gly Gly Lys Pro 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Asn Phe His Phe Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu 145 150 155 160 Glu Met Gln Gly Val Leu Met Asn Tyr Arg Ser Lys Tyr Pro Asp Gly 165 170 175 Thr Ile Thr Pro Lys Asn Pro Thr Ala Gln Ser Gln Val Met Asn Thr 180 185 190 Asp His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Val Glu Cys 195 200 205 Trp Val Pro Asp Pro Ser Arg Asn Glu Asn Ala Arg Tyr Phe Gly Thr 210 215 220 Phe Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Val Thr Asn Thr 225 230 235 240 Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Gln Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys 245 250 255 Ala Asp Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ala Asp Ile Cys Gly Leu Phe Thr 260 265 270 Asn Ser Ser Gly Thr Gln Gln Trp Arg Gly Leu Ala Arg 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<213> BK polyomavirus <400> 165 Arg Leu Asp Ser Glu Ile Ser Met Tyr 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 166 Ser Val Lys Val Asn Leu Glu Lys Lys 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 167 Ala Tyr Leu Arg Lys Cys Lys Glu Phe 1 5 <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 168 Asp Ile Cys Gly Leu Phe Thr Asn Ser Ser Gly Thr Gln Gln Trp 1 5 10 15 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> BK polyomavirus <400> 169 Asn Leu Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Val 1 5 10 <210> 170 <211> 11 <212> PRT <213> John Cunningham polyomavirus <400> 170 Asn Arg Glu Glu Ser Met Glu Leu Met Asp Leu 1 5 10 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> John Cunningham polyomavirus <400> 171 Ser Pro Leu Val Trp Ile Asp Cys Tyr 1 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> John Cunningham polyomavirus <400> 172 Leu Leu Ile Arg Gly Gly Val Glu Val 1 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> John Cunningham polyomavirus <400> 173 Ser Ile Thr Glu Val Glu Cys Phe Leu 1 5 <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> John Cunningham polyomavirus <400> 174 Asn Ile Leu Met Trp Glu Ala Val Thr Leu 1 5 10 <210> 175 <211> 15 <212> PRT <213> John Cunningham polyomavirus <400> 175 Leu Asn Ile Pro Lys Lys Arg Tyr Trp Leu Phe Lys Gly Pro Ile 1 5 10 15

Claims (141)

  1. 표 1 내지 표 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1에 열거된 BK 바이러스(BKV) 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 2에 열거된 JC 바이러스(JCV) 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 3에 따른 하이브리드 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드가 표 1 내지 표 3에 열거된 다수의 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 다수의 에피토프가 표 1에 열거된 다수의 BKV 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  7. 제5항에 있어서, 다수의 에피토프가 표 2에 열거된 다수의 JCV 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  8. 제5항에 있어서, 다수의 에피토프가 표 1에 열거된 BKV 에피토프 및 표 2에 열거된 JCV 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  9. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 에피토프 중 2개 이상 사이에 개재 아미노산 서열을 추가로 포함하는 단리된 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 대상체에 투여시 면역 반응을 유도할 수 있는 단리된 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 인간 개체군에 대해 넓은 커버리지(coverage)를 제공하도록 선택된 단리된 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 에피토프가 HLA-Al, -A2, -A3, -A11, -A23, -A24, -A26, -A29, -A30, -B7, -B8, -B27, -B35, -B38, -B40, -B41, -B44, -B51, -B56, -B57 또는 -B58에 대한 HLA 클래스 I 제한을 갖는 단리된 단백질.
  13. 제11항에 있어서, 에피토프가 HLA-DP, -DM, -DOA, -DOB, -DQ 또는 -DR에 대한 HLA 클래스 II 제한을 갖는 단리된 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 에피토프가 HLA-DRB 또는 -DQB에 대한 HLA 클래스 II 제한을 갖는 단리된 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 단백질이 서열번호 5, 6, 36, 41 및 42에 기재된 에피토프 아미노산 서열을 포함하는 단리된 단백질.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 단백질이 서열번호 5, 6, 36, 41 및 42에 기재된 에피토프 아미노산 서열로 필수적으로 구성된, 단리된 단백질.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 단백질이 서열번호 5, 6, 36, 41 및 42에 기재된 에피토프 아미노산 서열로 구성된, 단리된 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 단백질이 메르켈 세포 바이러스(MCV)의 하나 이상의 에피토프를 추가로 포함하는 단리된 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비-폴리오마바이러스(non-polyomavirus)의 하나 이상의 에피토프를 추가로 포함하는 단리된 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프가 아데노바이러스(ADV), 엡스타인 바 바이러스(EBV) 또는 거대 세포 바이러스(CMV) 중 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단리된 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 단리된 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  22. 제21항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 구조체.
  23. 제22항의 발현 구조체를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제23항의 숙주 세포에서 단리된 단백질을 발현시키는 단계 및 단리된 단백질을 적어도 부분적으로 정제하는 단계를 포함하는, 단리된 단백질을 생산하는 방법.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제21항의 단리된 핵산을 포함하는 약학 조성물.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  29. 제25항 또는 제26항의 약학 조성물, 또는 제27항 또는 제28항의 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 폴리오마바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 폴리오마바이러스 감염이 BK 바이러스(BKV) 감염인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 폴리오마바이러스 감염이 JC 바이러스(JCV) 감염인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 폴리오마바이러스 감염이 메르켈 세포 바이러스(MCV) 감염인 방법.
  33. 제25항 또는 제26항의 약학 조성물, 또는 제27항 또는 제28항의 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 폴리오마바이러스 관련 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 폴리오마바이러스 관련 암이 BKV 관련 암인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 폴리오마바이러스 관련 암이 JCV 관련 암인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 폴리오마바이러스 관련 암이 MCV 관련 암인 방법.
  37. 제25항 또는 제26항의 약학 조성물, 또는 제27항 또는 제28항의 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체에서 T 림프구 면역 반응을 유도하는 방법.
  38. 입양 면역 요법을 위한 BK 바이러스 특이적 T 림프구를 확장시키는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 단리된 하나 이상의 세포를 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) BK 바이러스 특이적 T 림프구가 상기 하나 이상의 세포로부터 확장되는 조건 하에서, 상기 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 입양 면역 요법을 위한 JC 바이러스 특이적 T 림프구를 확장시키는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 단리된 하나 이상의 세포를 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (ii) JC 바이러스 특이적 T 림프구가 상기 하나 이상의 세포로부터 확장되는 조건 하에서, 상기 하나 이상의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항의 확장된 T 림프구를 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 폴리오마바이러스 감염 또는 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 폴리오마바이러스 감염이 BKV 감염인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 폴리오마바이러스 감염이 JCV 감염인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 폴리오마바이러스 감염이 MCV 감염인 방법.
  44. 제38항 또는 제39항의 확장된 BK 바이러스 특이적 T 림프구를 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 폴리오마바이러스 관련 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 폴리오마바이러스 관련 암이 BKV 관련 암인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 폴리오마바이러스 관련 암이 JCV 관련 암인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 폴리오마바이러스 관련 암이 MCV 관련 암인 방법.
  48. 대상체로부터 단리된 T 림프구를 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 단백질과 접촉시킴으로써 BKV 특이적 T 림프구의 존재를 검출함을 포함하는, 대상체에서 BK 바이러스 감염을 검출하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 제29항 또는 제47항의 방법에 따른 대상체의 BK 바이러스 감염을 치료함을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  52. 제29항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 면역약화(immunocompromised)되어 있는 방법.
  53. 표 1 내지 표 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체 (TCR)를 포함하는 세포독성 T 세포(CTL)를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1에 열거된 BK 바이러스(BKV) 에피토프를 포함하는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 2에 열거된 JC 바이러스(JCV) 에피토프를 포함하는 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 3에 따른 하이브리드 에피토프를 포함하는 방법.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폴리오마바이러스 관련 암인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 폴리오마바이러스가 BK 바이러스(BKV)인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 폴리오마바이러스가 JC 바이러스(JCV)인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 폴리오마바이러스가 메르켈 세포 바이러스(MCV)인 방법.
  61. 표 1 내지 표 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 세포독성 T 세포(CTL)를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체에서 폴리오마바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1에 열거된 BK 바이러스(BKV) 에피토프를 포함하는 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 2에 열거된 JC 바이러스(JCV) 에피토프를 포함하는 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 3에 따른 하이브리드 에피토프를 포함하는 방법.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스가 BK 바이러스(BKV)인 방법.
  66. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스가 JC 바이러스(JCV)인 방법.
  67. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스가 메르켈 세포 바이러스(MCV)인 방법.
  68. 제53항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 2종 이상의 폴리오마바이러스에 공유된 에피토프를 인식하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 공유된 에피토프가 2종 이상의 폴리오마바이러스 간에 서열 상동성 영역을 포함하고, 서열 상동성 영역은 에피토프 서열 전장에 걸쳐 3개 이상의 아미노산이 존재하는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 2종의 폴리오마바이러스가 BKV 및 JCV인 방법.
  71. 제53항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 TCR이 BKV 또는 JCV의 VP1 에피토프를 인식하는 방법.
  72. 제53항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 TCR이 BKV 또는 JCV의 LTA 에피토프를 인식하는 방법.
  73. 제53항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 TCR이 BKV 또는 JCV의 STA 에피토프를 인식하는 방법.
  74. 제53항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 2종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 5종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 10종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3, 또는 표 2에 열거된 에피토프 중 15종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 20종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 25종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, CTL이 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 30종 이상을 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  81. 제53항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 MCV 에피토프를 인식하는 TCR을 집합적으로 포함하는 방법.
  82. 제53항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 2종 이상의 상이한 바이러스의 에피토프를 집합적으로 인식하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, TCR이 3종 이상의 상이한 바이러스의 에피토프를 집합적으로 인식하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, TCR이 4종 이상의 상이한 바이러스의 에피토프를 집합적으로 인식하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, TCR이 5종 이상의 상이한 바이러스의 에피토프를 집합적으로 인식하는 방법.
  86. 제53항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프를 집합적으로 인식하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프가 아데노바이러스(ADV), 엡스타인 바 바이러스(EBV) 또는 거대 세포 바이러스(CMV) 중 하나 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  88. 제53항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 하나 이상의 에피토프가 제한되는 인간 백혈구 항원(HLA)을 발현시키는 방법.
  89. 제53항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 대상체에서 자가유래(autologous)되는 방법.
  90. 제53항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 대상체에서 자가유래되지 않는 방법.
  91. 제90항에 있어서, CTL이 CTL 라이브러리 또는 은행(bank)으로부터 수득되는 방법.
  92. 제53항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 면역약화되어 있는 방법.
  93. 표 1 내지 표 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리오마바이러스 펩타이드를 제시하는 항원 제시 세포(APC)와 CTL을 접촉시키는 단계를 포함하는, 폴리오마바이러스 특이적 세포독성 T 세포(CTL)의 증식을 유도하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1에 열거된 BK 바이러스(BKV) 에피토프를 포함하는 방법.
  95. 제93항 또는 제94항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 2에 열거된 JC 바이러스(JCV) 에피토프를 포함하는 방법.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 3에 따른 하이브리드 에피토프를 포함하는 방법.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 시험관 내에서 APC와 접촉되는 방법.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스 특이적 CTL이 2종 이상의 폴리오마바이러스에 대해 특이적인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 2종 이상의 폴리오마바이러스가 BKV, JCV 및 MKV 중 2종 이상을 포함하는 방법.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프가 아데노 바이러스(ADV), 엡스타인 바 바이러스(EBV) 또는 거대 세포 바이러스(CMV)의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  102. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 APC에 접촉되는 방법.
  103. 제93항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, APC가 B 세포를 포함하는 방법.
  104. 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, APC가 항원 제시 T 세포를 포함하는 방법.
  105. 제93항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, APC가 수지상 세포를 포함하는 방법.
  106. 제93항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, APC가 aK562 세포를 포함하는 방법.
  107. 제93항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, CTL이 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 샘플로부터의 것인 방법.
  108. 표 1 내지 표 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1에 열거된 BK 바이러스 (BKV) 에피토프를 포함하는 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 2에 열거된 JC 바이러스(JCV) 에피토프를 포함하는 방법.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 3에 따른 하이브리드 에피토프를 포함하는 방법.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폴리오마바이러스 관련 암인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 폴리오마바이러스가 BK 바이러스(BKV)인 방법.
  114. 제112항에 있어서, 폴리오마바이러스가 JC 바이러스(JCV)인 방법.
  115. 제112항에 있어서, 폴리오마바이러스가 메르켈 세포 바이러스(MCV)인 방법.
  116. 표 1 내지 표 3에 열거된 하나 이상의 에피토프를 포함하는 백신 조성물을 대상체에 투여함을 포함하는, 대상체의 폴리오마바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1에 열거된 BK 바이러스(BKV) 에피토프를 포함하는 방법.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 2에 열거된 JC 바이러스(JCV) 에피토프를 포함하는 방법.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 3에 따른 하이브리드 에피토프를 포함하는 방법.
  120. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스가 BK 바이러스(BKV)인 방법.
  121. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스가 JC 바이러스(JCV)인 방법.
  122. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리오마바이러스가 메르켈 세포 바이러스(MCV)인 방법.
  123. 제108항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 2종 이상의 폴리오마바이러스에 공유된 에피토프를 포함하는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 공유된 에피토프가 2종 이상의 폴리오마바이러스 간에 서열 상동성 영역을 포함하고, 서열 상동성 영역은 에피토프 서열 전장에 걸쳐 3종 이상의 아미노산이 존재하는 방법.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 2종의 폴리오마바이러스가 BKV 및 JCV인 방법.
  126. 제108항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물이 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프를 추가로 포함하는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 비-폴리오마바이러스의 하나 이상의 에피토프가 아데노 바이러스(ADV), 엡스타인 바 바이러스(EBV) 또는 거대 세포 바이러스(CMV)의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  128. 제108항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 2종 이상을 포함하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1 내지 표 3에 열거된 에피토프 중 5종 이상을 포함하는 방법.
  130. 제129항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1 내지 표 3에 열거된 10종 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  131. 제130항에 있어서, 상기 하나 이상의 에피토프가 표 1 내지 표 3에 열거된 15종 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  132. 제131항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1 내지 표 3에 열거된 20종 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  133. 제132항에 있어서, 하나 이상의 에피토프가 표 1 내지 표 3에 열거된 25종 이상의 에피토프를 포함하는 방법.
  134. 제108항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 하나 이상의 에피토프가 제한되는 인간 백혈구 항원(HLA)을 발현시키는 방법.
  135. 제108항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 조성물이 아쥬반트를 추가로 포함하는 방법.
  136. 제108항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 면역약화되어 있는 방법.
  137. 제53항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  138. 제38항 또는 제39항에 있어서, 세포를 IL-21의 존재 하에 배양하는 방법.
  139. 제138항에 있어서, IL-21이 약 30ng/ml의 농도로 존재하는 방법.
  140. 제93항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, IL-21의 존재 하에 CTL을 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  141. 제140항에 있어서, IL-21이 약 30ng/ml의 농도로 존재하는 방법.
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