WO2017086354A1 - Ｈｌａ－ａ１１拘束性細胞傷害性ｔ細胞エピトープペプチド - Google Patents

Ｈｌａ－ａ１１拘束性細胞傷害性ｔ細胞エピトープペプチド Download PDF

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peptide
pbf
hla
cytotoxic
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棟梁 李
一絵 中野
真悟 田路
智英 塚原
俊彦 鳥越
昇志 佐藤
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北海道公立大学法人札幌医科大学
株式会社医学生物学研究所
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an HLA-A11-restricted cytotoxic T cell (cytotoxic T lymphocyte) (hereinafter also referred to as CTL) epitope peptide. More specifically, the present invention relates to an epitope peptide that can be specifically recognized by a CTL that targets a cancer (PBF positive cancer) that expresses Papillomavirus Binding Factor (hereinafter also referred to as PBF), which is an osteosarcoma-specific antigen.
  • PPF Papillomavirus Binding Factor
  • a vaccine for treating or preventing PBF-positive cancer using the peptide a method for inducing the CTL, a passive immunotherapeutic agent using the CTL and a method for producing the same, a method for quantifying the CTL, and a method for use in the method Related to the kit.
  • Osteosarcoma (osteosarcoma / osteogenic sarcoma) is a malignant tumor that occurs in bone itself. It is the most common malignant tumor of the bone and represents 56% of bone tumors (Non-patent Document 1).
  • Osteosarcoma is a cancer that occurs mostly in children and young people and occurs at the epiphysis and metaphysis center, where metabolism around the knee and joints is fostering. These sites are highly painful and bones are destroyed as the tumor grows. In addition, it is the third most common malignant tumor among cancers affecting adolescence (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 3 the age-related epidemiological survey of osteosarcoma has the highest prevalence after age 10-30 and over 60 (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 3 the number of elderly patients with bone and soft tissue disease and bone malignant tumors is expected to increase year by year.
  • the cause of osteosarcoma is related to various factors as seen in other cancer types, and the specific cause has not been determined.
  • Clinical findings include osteoblasts and osteoclasts involved in bone formation, bone growth, and bone metabolism, changing the morphology of malignant osteosarcoma cells and causing the production of neoplastic bone or osteoid matrix, Various image findings and pathological findings are observed. As a result, the histological classification of osteosarcoma is complex and difficult to diagnose and treat.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 Non-Patent Documents 4 and 5).
  • many osteosarcomas produce metastases at a high rate. Lung metastases are the most common, and about 90% of relapses due to distant metastases are lung metastases.
  • Non-patent Document 6 Many metastatic osteosarcomas are resistant to chemotherapy, and more than 30% of them show no response to chemotherapeutic agents and are very difficult to rescue (Non-Patent Document 7). , 8, 9, 10). Therefore, the prognosis of patients with metastatic osteosarcoma is very poor, and even when adjuvant chemotherapy before and after surgery is introduced, the 5-year recurrence-free survival rate is only 20% (Non-patent Document 11).
  • Non-Patent Documents 12, 13, and 14 high-dose methotrexate (MTX), cisplatin (CDDP), doxorubicin (DXR), and ifosfamide (IFM) have been confirmed to be useful as chemotherapeutic agents used before and after surgery.
  • MTX methotrexate
  • CDDP cisplatin
  • DXR doxorubicin
  • IFM ifosfamide
  • Non-patent Document 16 The history of immunotherapy is old, and treatment of malignant tumors using Corey's vaccine in 1893 is the first literature report (Non-patent Document 16). Since then, from the late 1960s to the present, with the rapid development of immunology, new knowledge has been rapidly accumulated and contributed greatly to the clinical development of cancer immunotherapy.
  • Non-patent Documents 17, 18, 19, 20 BCG vaccine and Maruyama vaccine therapy
  • Non-patent Documents 21, 22, 23, 24 BCG vaccine and Maruyama vaccine therapy
  • Non-patent Documents 25, and 26 BCG vaccine and Maruyama vaccine therapy
  • Immunstimulants focusing on the action of immunostimulants, interferon and interleukin therapy
  • Non-patent Documents 25, and 26 anti-tumor monoclonal antibody therapy using immune reaction
  • immune cell therapy aiming at acquisition of anti-tumor activity, cancer vaccine therapy, genetically modified T cell therapy, etc.
  • Non-Patent Documents 27, 28, 29, 30, 31, 32 Due to these progressive clinical studies, immunotherapy is of great interest as a new cancer treatment strategy.
  • a gene library that is expressed in an osteosarcoma cell line is constructed, and 293T cells that are transiently expressed by gene transfer are used as target cells, and cloning is performed using the cytotoxic activity of CTL clones as an index.
  • the method identified PBF, an osteosarcoma-specific antigen, for the first time in the world in 2004. Furthermore, PBF-specific HLA-B55 or HLA-A24-restricted CTL epitopes were respectively identified (Non-patent document 34, Non-patent document 35, Patent document 1, and Patent document 2). Furthermore, in 2009, HLA-A2-restricted PBF-specific CTL epitopes were also successfully identified (Non-patent Document 38, Patent Document 3).
  • Non-patent Document 35 Furthermore, in the analysis of PBF expression using cancer tissues other than osteosarcoma, high expression of PBF has been observed in lung cancer, stomach cancer, breast cancer, liver cancer, etc., and PBF is used for such epithelial cancers. However, it has been shown to be a promising target for immunotherapy (Non-patent Document 34).
  • PBF which is an osteosarcoma-specific antigen identified by the inventors, is composed of a molecular weight of about 55 kDa and a total length of 513 amino acids, and is a both nuclear and cytoplasmic localized protein.
  • PBF was first reported as a transcription factor that controls the promoter activity of human papillomavirus (type 8) and was named Papillomavirus Binding Factor (Non-patent Document 36).
  • Papillomavirus Binding Factor Non-patent Document 36
  • PBF also has a zinc finger domain and is also called zinc finger protein 395 (ZNF395).
  • Non-patent Document 37 The inventors have not only controlled the promoter activity of human papillomavirus (type 8), but also induced apoptotic cell death via a caspase 9-independent pathway, and the apoptosis regulators Scythe / BAT3 and PBF Has been reported to be an important factor for the survival of osteosarcoma cells (Non-patent Document 37).
  • the inventors have been conducting clinical trials of osteosarcoma peptide cancer vaccine for HLA-A24 and HLA-A2 carriers since 2009 using the CTL epitope peptide of PBF (UMIN clinical trial registration system).
  • Test ID UMIN000000162, UMIN000000163).
  • Immunotherapy is a treatment method that activates the immune power of patients and specifically attacks and eliminates target cancer cells or virus-infected cells. is there.
  • Cytotoxic T cells (CTLs) play a central role in specifically attacking these target cells.
  • CTL Cytotoxic T cells
  • TCR T cell receptor
  • TCR does not directly recognize cancer antigens or virus particles themselves, but HLA (human leukocyte type antigen) expressed on the membrane surface of target cells and, in the case of tumor cells, derived from cancer antigens or viruses
  • HLA human leukocyte type antigen
  • CTL recognizes the target cell and exerts a killing effect by binding to a complex with a peptide (epitope peptide) consisting of 8 to 10 amino acids derived from a virus.
  • HLA is broadly classified into class I and class II, HLA class I and peptide complexes are recognized by TCR expressed on CD8 positive T cells, and HLA class II and peptide complexes are expressed on CD4 positive T cells. And an immune response is elicited.
  • HLA class I is further divided into a classical classification called HLA-A, B, C and a non-classical classification called HLA-E, F, G.
  • HLA-A classical classification
  • B C
  • HLA-E non-classical classification
  • HLA-E non-classical classification
  • HLA-A24, HLA-A2 and HLA-A11 in Southeast Asia are 32.1%, 24.5% and 23.7%, respectively (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /Projects/gv/mhc/ihwg.cgi).
  • HLA-A24 and HLA-A2-restricted CTL epitopes of PBF have already conducted clinical trials for osteosarcoma peptide cancer vaccines.
  • HLA-A11 restricted CTL epitope there are patients with HLA-A11 holders who were unable to enter clinical trials.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and identifies an epitope peptide that is specifically recognized by cytotoxic T cells (CTLs) that target PBF-positive cancer and exhibit HLA-A11 restriction.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • the purpose is to do.
  • a vaccine for treating or preventing PBF positive cancer using the peptide a method for inducing the CTL, a passive immunotherapeutic agent using the CTL and a method for producing the same, a method for quantifying the CTL, and the method
  • the purpose is to provide a kit to be used.
  • the present inventors have intensively studied about the cancer antigenicity, that is, the CTL inducing ability of various peptides derived from PBF.
  • the PBF-derived peptide specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 6 can induce HLA-A11-restricted CTL.
  • the peptide specified by the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 or 6 it was also confirmed that the induced CTL showed cytotoxic activity.
  • homology search was performed on these four amino acid sequences, a sequence showing high homology to these sequences and having the most important amino acid (anchor motif) in binding to the HLA-A11 molecule.
  • the peptide specified by the amino acid sequence described in No. 13 or 14 was also successfully extracted.
  • the present invention has been made based on such findings, and in a specific aspect, for example, relates to the following invention.
  • ⁇ 1> A peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 6, 1, 2, 14 or 13 and capable of forming a complex with an HLA-A11 molecule, wherein the complex is on the surface
  • ⁇ 2> An amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, 6, 1, 2, 14 or 13, comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted, and HLA- A peptide capable of forming a complex with an A11 molecule, wherein cells presenting the complex on the surface can induce cytotoxic T cells that specifically recognize the complex .
  • ⁇ 3> A nucleic acid encoding the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • ⁇ 4> An expression vector containing a nucleic acid encoding the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • a vaccine for treating or preventing PBF-positive cancer comprising the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> as an active ingredient.
  • a vaccine for treating or preventing PBF-positive cancer comprising a nucleic acid encoding the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> as an active ingredient.
  • a vaccine for treating or preventing PBF-positive cancer comprising, as an active ingredient, an antigen-presenting cell that presents on its surface a complex of the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> and an HLA-A11 molecule .
  • Cytotoxicity obtained by stimulating peripheral blood mononuclear cells with the antigen-presenting cells presenting on the surface the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> or a complex of the peptide and HLA-A11 molecule A passive immunotherapeutic agent for PBF-positive cancer containing sex T cells.
  • a complex of the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> and an HLA-A11 molecule complex or a multimer of the complex and a peripheral blood mononuclear cell are reacted with the complex or the multimer.
  • a passive immunotherapeutic agent for PBF-positive cancer comprising cytotoxic T cells obtained by forming a conjugate in which cytotoxic T cells are bound and isolated from the conjugate.
  • Cytotoxic T by stimulating peripheral blood mononuclear cells with the antigen-presenting cells presenting on the surface the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> or a complex of the peptide and HLA-A11 molecule
  • the manufacturing method of the passive immunotherapy agent for treating PBF positive cancer including the process of acquiring a cell.
  • a complex of the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> and an HLA-A11 molecule or a multimer of the complex and a peripheral blood mononuclear cell are reacted with each other to produce the complex or the multimer.
  • a method for producing a passive immunotherapeutic agent for treating PBF-positive cancer comprising a step of forming a conjugate in which cytotoxic T cells are bound, and isolating cytotoxic T cells from the conjugate.
  • Peripheral blood mononuclear cells are stimulated with the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, and cytotoxic T cells targeting PBF positive cancer cells are obtained, and the cytotoxic T cells are produced.
  • a method for quantifying cytotoxic T cells targeting PBF-positive cancer cells wherein the amount of at least one molecule selected from the group consisting of cytokines, chemokines and cell surface proteins is measured.
  • ⁇ 13> A method for inducing cytotoxic T cells targeting PBF-positive cancer, wherein the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> is used to induce cytotoxic T cells.
  • ⁇ 14> a step of inducing cytotoxic T cells using the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2>; Detecting cytotoxic T cells induced in the step, A method for quantifying cytotoxic T cells targeting PBF positive cancer.
  • ⁇ 15> Targeting a PBF-positive cancer cell, wherein the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> is contacted with peripheral blood mononuclear cells in a medium to induce cytotoxic T cells. To induce cytotoxic T cells.
  • ⁇ 16> a step of contacting the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> with peripheral blood mononuclear cells in a medium to induce cytotoxic T cells; Detecting cytotoxic T cells induced in the step, A method for quantifying cytotoxic T cells targeting PBF positive cancer.
  • ⁇ 17> A PBF positive cancer in which a complex of the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2> and an HLA-A11 molecule or a multimer of the complex is reacted with a peripheral blood mononuclear cell or a cancer sample. For quantifying cytotoxic T-cells targeting the target.
  • kits for inducing cytotoxic T cells targeting PBF-positive cancer comprising the peptide according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • CTL targeting PBF positive cancer can be specifically recognized by an HLA-A11 restricted epitope peptide, a vaccine for treating or preventing PBF positive cancer using the peptide, It is possible to provide a method for inducing CTL, a passive immunotherapeutic agent using the CTL and a method for producing the same, a method for quantifying the CTL, and a kit used for the method.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (first stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (second stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (third stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (first stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (second stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (third stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (first stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (second stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (first stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • FIG. 3 is a diagram showing detection of PBF-specific CTL (second stage) using the prepared MHC-tetramer reagent.
  • Confirmation of cross-reactivity of ASV or SVL specific CTL It is a figure which shows examination of the intracellular IFN ⁇ production cell quantification method using a control peptide. It is a figure which shows the confirmation (sequence number: 4) of PBF specific CTL induction
  • the PBF-derived peptide specified by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 6 can form a complex with the HLA-A11 molecule, Cytotoxic T cells that recognize cells presenting the complex on the surface can be induced.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13 shows high homology with that described in SEQ ID NO: 1 or 2
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 is similar to that described in SEQ ID NO: 6. Shows high homology.
  • these highly homologous amino acid sequences have the most important amino acid (anchor motif) in binding to the HLA-A11 molecule.
  • the present invention provides a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 13, or 14 and capable of forming a complex with an HLA-A11 molecule, Provided is a peptide in which cells presenting on the surface can induce cytotoxic T cells that specifically recognize the complex.
  • peptide means a molecular chain bonded to each other by a peptide bond between an ⁇ -amino group and a carboxyl group of adjacent amino acid residues.
  • Peptides are not meant to be of a specific length and can be of various lengths. Further, it may be in an uncharged or salt form, and the “amino acid” constituting the peptide may be a natural type or a non-natural type, and may be an analog (N-acylated product of an amino acid). O-acylated product, esterified product, acid amidated product, alkylated product, etc.).
  • HLA-A11 is a molecule belonging to class Ia of a major histocompatibility antigen (major histocompatibility complex antigen, MHC molecule, MHC antigen) derived from human, for example, HLA-A * 11: 01, Examples include gene products from HLA-A * 11: 02, HLA-A * 11: 03, HLA-A * 11: 04, and the like.
  • cytotoxic T cell is a cell also referred to as “CTL”, which is a T cell expressing CD8 which is a cell surface protein (CD8 positive T cell, CD8 + T cell), and presents an antigen.
  • CTL a T cell expressing CD8 which is a cell surface protein (CD8 positive T cell, CD8 + T cell), and presents an antigen.
  • an antigen presented by a cell is recognized and activated, the cell can damage a cell having the antigen.
  • such cytotoxic activity includes cells that can be exerted under circumstances where the immune checkpoint mechanism is suppressed (released). It is.
  • epipe peptide means an antigenic polypeptide having an activity of inducing proliferation, differentiation and / or activation of CD8-positive T cells.
  • the length of the epitope peptide of the present invention is not particularly limited, but is usually 5 to 30 amino acids, preferably 6 to 25 amino acids, more preferably 8 to 20 amino acids, and particularly preferably 9 or 10 amino acids. It is.
  • PBF is a protein called osteosarcoma-specific antigen, papillomavirus binding factor, ZNF395, and is typically a GenBank accession number: A protein consisting of an amino acid sequence specified by AAH01237.1 (a protein encoded by a nucleotide sequence specified by GenBank accession number: BC001237.1). It should also be understood that in addition to those having such typical amino acid sequences, PBF proteins may have naturally mutated amino acids.
  • SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 6, A peptide that includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence described in 13 or 14, and can form a complex with an HLA-A11 molecule.
  • a peptide capable of inducing a cytotoxic T cell that specifically recognizes the complex by a cell presenting the complex on the surface is also included in the present invention.
  • the substitution, deletion, insertion or addition of the amino acid sequence is usually within 10 amino acids, preferably within 7 amino acids, more preferably within 5 amino acids, still more preferably within 3 amino acids (for example, within 2 amino acids, 1 amino acid).
  • Examples of such amino acid modification purposes include: 1. Changes to increase affinity with HLA (Rosenberg SA et al, Nat Med. 1998; 4: 321-327, Berzofsky JA et al, Nat Rev Immunol. 2001; 1: 209-219), 2. Changes to improve TCR recognition (Fong L et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98: 8809-8814, Rivoltini L et al, Cancer Res. 1999; 59: 301-306), 3. Changes to avoid metabolism by peptide-degrading enzymes and the like in serum (Berzofsky JA et al, Nat Rev Immunol. 2001; 1: 209-219, Parmani G et al, J Natl Cancer Inst. 2002; 94: 805-818 , Brinkeroff LH et al, Int J Cancer. 1999; 83: 326-334).
  • the second, ninth or tenth amino acid from the N-terminal side of the epitope peptide is the most important amino acid for binding to the HLA class I molecule presenting it, and is called an anchor motif.
  • This anchor motif varies depending on the type of each HLA class I molecule, but as a peptide that binds to the HLA-A11 molecule, either Ile, Met, Ser, Thr, or Val is located at the second position from the N-terminus.
  • a peptide having 9 to 10 amino acids most commonly known, is a peptide in which either Lys or Arg is arranged at the 9th or 10th position (Rapin N et al, Curr Protocol Immunol 2010; Chapter 18: Unit 18.17.). Therefore, also in the epitope peptide of the present invention, the length is 9 to 10 amino acids, and the second and ninth or tenth positions from the N-terminal are preferably the specific amino acids.
  • the epitope peptide of the present invention can be used in the form of a complex to which saccharides, polyethylene glycol, lipids and the like are added, a derivative by a radioisotope, or a polymer.
  • the N-terminus of the antigen peptide and the free amino group may be a formyl group.
  • An acetyl group, a t-butoxycarbonyl (t-Boc) group, etc. may be bonded to the C-terminus or free carboxyl group of the antigen peptide, such as a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group, etc. May be combined.
  • the epitope peptide of the present invention may be subjected to various modifications that can facilitate introduction into the living body.
  • a PT (Protein Transduction) domain is famous as an example of various modifications that can be easily introduced into a living body.
  • the PT domain of HIV is a peptide composed of 49th to 57th amino acids of the Tat protein (Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg, amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15). It has been reported that this PT domain can be easily introduced into cells by adding to the N-terminal and / or C-terminal of the target protein or peptide (Ryu J et al, Mol Cells. 2003). 16: 385-391, Kim DT et al, J Immunol. 1997; 159: 1666-1668).
  • HLA class I molecules Most antigens presented through HLA class I molecules are degraded by cytoplasmic proteasomes, then transferred to TAP (transporter in antigen processing), and associated with TAP in the rough endoplasmic reticulum. It binds to class I molecules and is transported to the cell surface by exocytosis via the Golgi apparatus. Therefore, it is possible to efficiently present antigens by fusing HSP (heat shock protein) 70, HSP90, or gp96, which are chaperones acting in a series of these antigen presentation pathways, and the target peptide or protein. Yes (Basu S et al, Immunity. 2001; 14: 303-313).
  • HSP heat shock protein
  • the epitope peptide modified as described above (hereinafter also referred to as a modified peptide) can exhibit a desired activity in a living body can be evaluated, for example, by performing the following analysis. it can.
  • Peripheral blood mononuclear cells isolated from a healthy person are suspended in an appropriate medium at a cell concentration of 1 to 3 ⁇ 10 6 / mL.
  • the modified peptide is added alone or mixed with several kinds of modified peptides, for example, added at a concentration of 1 to 100 ⁇ g / mL, and dispensed to a 96-well culture plate at 100 ⁇ L / well.
  • the modified peptides used can be identified as antigenic peptides (epitope peptides) having CTL inducing ability.
  • T cells transferred from the thymus are activated and differentiated into effector T cells only upon antigen stimulation by antigen-presenting cells such as dendritic cells and macrophages.
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells and macrophages.
  • CTL that can be stained with MHC-monomer or MHC-multimer, which will be described later, is detected, it means that the effector / memory type CTL is originally present in the donor PBMC. This suggests that an immune response via an antigenic peptide is elicited in vivo.
  • [MHC-monomer and its multimer] in the present invention, as described above, in evaluating the binding of the epitope peptide to the HLA-A11 molecule, and as described later, inducing CTL targeting PBF-positive cancer and quantifying CTL.
  • the complex (MHC-monomer) composed of the epitope peptide of the present invention and the HLA-A11 molecule (its extracellular region and ⁇ 2m), and the multimer (MHC-multimer) of the complex are useful. .
  • the MHC-monomer and the multimer thereof containing the epitope peptide of the present invention can be prepared by, for example, a known method (US Patent Number 5,635,363, French Application Number FR9911133). More specifically, the MHC-monomer, which is a ternary complex of the extracellular region of the HLA-A11 molecule purified from a gene recombinant host for protein expression and ⁇ 2m, and the epitope peptide of the present invention, is added to the folding solution. To form.
  • a biotin-binding site is added in advance to the C-terminus of the extracellular region of the recombinant HLA-A11 molecule, and biotin is added to this site after MHC-monomer formation.
  • MHC-multimers can be prepared by mixing commercially available dye-labeled streptavidin and biotinylated MHC-monomers in the desired molar ratio (eg 1: 4 when forming tetramers). .
  • the differentiation stage of CTL can be examined (Seder RA et al, Nat Immunol. 2003; 4 : 835-842). Alternatively, it can be used for functional evaluation of CTL by combining with intracellular cytokine staining method.
  • CMV cytomegalovirus
  • the number of MHC monomers forming the MHC multimer is not particularly limited, but is usually 2 to 10, preferably 4 to 8, more preferably 4 (MHC tetramer reagent) or 5 (MHC pentamer reagent), particularly preferably 4.
  • TAP transporter associated with antigen processing
  • HLA class I molecules HLA class I molecules to the cell membrane surface.
  • TAP transporter associated with antigen processing
  • a TAP gene-deficient cell line deficient in this TAP molecule cannot express peptide fragments, which are degradation products of endogenous proteins, on the cell membrane surface.
  • human lymphoblastoid cell line T2 which is a typical TAP gene-deficient cell line, or a cell line (T2-A11) in which HLA-A11 molecule is introduced into T2 is expressed on the cell membrane surface. Very unstable.
  • the HLA-A11 molecule when bound to an externally supplied peptide, the HLA-A11 molecule is stabilized on the cell membrane surface.
  • the TAP gene-deficient cell line can be used in experiments for verifying the binding property between HLA-A11 molecules and externally supplied peptides. Specifically, a mixed culture of a TAP gene-deficient cell line and a modified peptide, staining with an anti-HLA-A11 antibody, and calculating the change in the expression intensity of the HLA-A11 molecule by flow cytometry, the target HLA -The binding property between the A11 molecule and the modified peptide can be examined.
  • the modified peptide added to the HLA-A11 molecule expressed by the TAP gene-deficient cell line When the modified peptide added to the HLA-A11 molecule expressed by the TAP gene-deficient cell line is bound, the complex of the HLA-A11 molecule and the peptide is stabilized on the cell membrane surface, and when stained with an anti-HLA-A11 antibody, -Enhanced expression of the A11 molecule is observed.
  • the added modified peptide does not bind to the HLA-A11 molecule, the HLA-A11 molecule on the cell membrane surface is unstable, and even when stained with an anti-HLA-A11 antibody, the expression of the HLA-A11 molecule No enhancement is confirmed. Using such a method, it is possible to verify the binding property of the modified peptide to the HLA-A11 molecule.
  • the epitope peptide of the present invention containing the above modified peptide can be prepared by various conventional peptide synthesis methods.
  • an organic chemical synthesis method such as a solid phase peptide synthesis method, or a nucleic acid encoding a peptide can be prepared and prepared using recombinant DNA technology.
  • combination by a commercially available chemical synthesizer is also possible.
  • the present invention also includes a nucleic acid encoding the epitope peptide of the present invention, or an expression vector containing the nucleic acid.
  • the nucleic acid encoding the epitope peptide of the present invention is important for producing the epitope peptide in a host using a gene recombination technique.
  • the use frequency (codon usage) of the amino acid codon differs between hosts, it is desirable to change the amino acid codon so that it matches the codon usage of the host to be produced.
  • the nucleic acid encoding the epitope peptide of the present invention is also important as a vaccine, and can be transferred as a bare nucleic acid or transferred using an appropriate virus or bacterial vector (Berzovsky JA et al, J Clin). Invest. 2004; 114: 450-462, Berzofsky JA et al, J Clin Invest. 2004; 113: 1515-1525).
  • Suitable bacterial vectors include, for example, vectors derived from Salmonella subspecies bacteria.
  • Suitable viral vectors are, for example, retroviral vectors, EBV vectors, vaccinia vectors, Sendai virus vectors, lentiviral vectors.
  • a suitable vaccinia vector is a modified vaccinia ankara vector.
  • the vector which can express the epitope peptide of this invention can be illustrated.
  • the vector is usually a vector carrying a DNA construct having a structure in which the nucleic acid of the present invention is operably linked downstream of a promoter.
  • the epitope peptide of the present invention can be used as a peptide vaccine in active immunotherapy. That is, a vaccine comprising the epitope peptide of the present invention is administered to a patient, and a CTL that recognizes a complex of the peptide and HLA-A11 molecule is proliferated in the body, which is useful for prevention and treatment of PBF positive cancer. be able to.
  • the epitope peptide to be used can be used alone, or two or more kinds of peptides can be mixed or linked according to the purpose of use of the vaccine.
  • the antigen-presenting cell on which the epitope peptide of the present invention is presented can be used as a vaccine in active immunotherapy.
  • the “antigen-presenting cell” means, for example, a dendritic cell, a B cell, a macrophage, a certain type of T cell, etc., and a cell that expresses an HLA molecule to which the peptide can bind on its cell surface , Means having CTL inducibility.
  • Antigen-presenting cells on which epitope peptides are presented 1.
  • Epitope peptide pulse antigen-presenting cells prepared by mixing antigen-presenting cells and epitope peptides in an appropriate culture solution, for example, for 30 minutes to 1 hour.
  • “Artificially prepared artificial antigen-presenting cells with antigen-presenting ability” means, for example, that a complex of HLA-A11 molecule and CTL epitope peptide is immobilized on beads such as lipid bilayer membrane, plastic or latex, and CTL
  • a costimulatory molecule such as CD80, CD83, or CD86 that can stimulate or an antibody that acts agonistically on CD28, which is a T cell ligand that binds to the costimulatory molecule (Oelke M et al., Nat Med. 2003; 9: 619-624, Walter S et al., J Immunol. 2003; 171: 4974-4978, Oosten LE et al., Blood 2004; 104: 224-226).
  • the nucleic acid encoding the epitope peptide of the present invention can be used for DNA vaccine, recombinant virus vector vaccine, etc. in active immunotherapy.
  • it is desirable to change the nucleic acid sequence of the epitope peptide to a recombinant vaccine or a codon usage suitable for the host that produces the recombinant virus vaccine (Casimiro, DR et al. J. Virol., 2003). 77: 6305-6313, Berzofsky JA et al, J Clin Invest. 2004; 114: 450-462).
  • the epitope peptide of the present invention can be used for the preparation of a passive immunotherapeutic agent. That is, using the epitope peptide of the present invention, CTL targeting PBF positive cancer is prepared as follows, and purified as necessary to increase the purity, and the cells are further purified with human albumin-containing PBS or the like. Can be used as a passive immunotherapeutic agent for PBF-positive cancer.
  • CTL preparation method 1 PBMC is reacted with an appropriate concentration of the MHC multimer of the present invention. Since the PBF-specific CTL bound to the MHC multimer is stained with a labeling dye, only the stained CTL is isolated using a cell sorter, a microscope or the like. The isolated PBF-specific CTL is stimulated with anti-CD3 antibodies, T cell stimulating agents such as PHA and IL-2, and antigen-presenting cells whose proliferation ability has been lost by X-ray irradiation or mitomycin treatment. Proliferate to ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • CTL preparation method 2 The MHC-monomer and / or MHC multimer of the present invention is immobilized on a sterile plate or the like, and PBMC is cultured on the immobilized plate. In order to isolate CTL bound to the MHC-monomer and / or MHC multimer immobilized on the plate, the remaining CTL remaining on the plate after washing away other cells that are not bound and floating. Only suspend in fresh medium.
  • the CTL isolated in this way is stimulated and proliferated with T cell stimulating agents such as anti-CD3 antibody, PHA and IL-2, and antigen-presenting cells whose proliferation ability has been lost by X-ray irradiation or mitomycin treatment, Ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • CTL preparation method 3 An antibody that acts agonistically on the MHC-monomer and / or MHC multimer of the present invention and CD28, a costimulatory molecule such as CD80, CD83, CD86, or a T cell side ligand that binds to the costimulatory molecule.
  • Etc. are immobilized on a sterile plate or the like, and PBMC is cultured on the immobilized plate.
  • IL-2 is added to the medium and cultured in a 5% CO 2 constant temperature bath at 37 ° C. for 7 to 14 days. The cultured cells are collected and cultured on a new solid phase plate. By repeating this operation, the number of CTLs required for passive immunotherapy is secured.
  • CTL preparation method 4 Stimulate PBMCs or T cells directly with the epitope peptide of the present invention, or stimulate them with antigen-presenting cells pulsed with the peptide, gene-introduced antigen-presenting cells, or artificially prepared antigen-presenting cells with antigen-presenting ability . Then, for example, CTL induced by stimulation is cultured at 37 ° C. for 7 to 14 days in a 5% CO 2 thermostat. Stimulation with epitope peptide and IL-2 or antigen-presenting cells and IL-2 is repeated once a week to ensure the number of CTLs necessary for passive immunotherapy.
  • the peptide and peripheral blood mononuclear cells are preferably contacted in a medium, and contacted in a medium containing plasma. It is more preferable.
  • a culture medium at the time of preparing CTL A well-known culture medium (for example, RPMI1640 culture medium) can be used suitably.
  • the concentration of plasma in the medium is preferably 1 to 10%, more preferably 3 to 10%, further preferably 5 to 10%, and sufficient plasma for long-term culture. From the viewpoint of easily securing the amount, it is particularly preferably 5%.
  • CTL induced by the CTL preparation method to label the MHC-monomer and / or MHC-multimer It is possible to separate the antibody against the dye using a secondary antibody magnetically labeled.
  • a magnetically labeled secondary antibody and a magnetically labeled cell separation apparatus are available from, for example, Dynal and Miltenyi Biotec GmbH.
  • CTL targeting PBF positive cancer isolated in this way is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., and the number of cells necessary for passive immunotherapy is secured. .
  • CTLs that target PBF-positive cancers can purify the CTLs using cytokines and the like that are released.
  • cytokines and the like that are released.
  • a kit available from Miltenyi Biotec GmbH a cytokine released from CTL is captured on a cell surface with a specific antibody, stained with an anti-cytokine-labeled antibody, and then magnetically labeled labeling substance-specific After reacting with the antibody, it can be purified using a magnetically labeled cell separator.
  • CTL targeting PBF positive cancer isolated in this way is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., and the number of cells necessary for passive immunotherapy is secured. .
  • Cell surface proteins eg, CD137, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.
  • whose expression is enhanced by specific stimulation have been reported on the cell surface of purified CTLs using cell surface protein-specific antibodies (Betts MR et al., J Immunol Methods. 2003; 281: 65-78, Trimble LA et al., J Virol. 2000; 74: 7320-7330).
  • By magnetically labeling such specific antibodies against cell surface proteins it is possible to purify CTL using a magnetic separation device or the like.
  • CTL can be similarly purified by magnetically labeling such an anti-IgG antibody against the antibody.
  • CTL can be purified by coating these antibodies on a plastic plate for culturing, culturing stimulated PBMC using this plate, and washing away the cell population that did not bind to the plate.
  • CTL targeting PBF positive cancer isolated in this way is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., and the number of cells necessary for passive immunotherapy is secured.
  • a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc.
  • the cytotoxic activity of the CTL cells prepared in this way is, for example, IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kit (MBL) for labeling target cells with the fluorescent dye CFSE (Dojin Chemical) or LDH released from target cells. It is also possible to measure using Cytotoxicity Detection Kit (Roche) or the like that measures (lactate dehydrogenase). Further, it can be measured by a chromium release assay in which target cells are labeled and used with 51 Cr which is a radioisotope.
  • MBL IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kit
  • CFSE Dojin Chemical
  • LDH released from target cells LDH released from target cells. It is also possible to measure using Cytotoxicity Detection Kit (Roche) or the like that measures (lactate dehydrogenase). Further, it can be measured by a chromium release assay in which target cells are labeled and used with 51 Cr which is a radioisotope.
  • the present invention also provides a kit for inducing cytotoxic T cells targeting PBF-positive cancer, which comprises the epitope peptide of the present invention, which is useful in the various methods described above.
  • the epitope peptide of the present invention may be contained in the form of an MHC monomer, an MHC-multimer, or an antigen-presenting cell on which the peptide is presented.
  • PBMC reacted with the peptide and a reagent for detecting the peptide may be included in the kit of the present invention.
  • a medium for culturing CTLs, a T cell stimulating agent for amplifying CTLs, and the like may be included.
  • the epitope peptide of the present invention the nucleic acid encoding the peptide, and the antigen-presenting cell on which the peptide is presented are useful in active immunotherapy for PBF-positive cancer.
  • CTLs induced by the antigen-presenting cells are useful in passive immunotherapy for PBF positive cancer.
  • the present invention also provides a cancer vaccine containing the epitope peptide of the present invention and an anticancer agent containing the CTL cell of the present invention as an active ingredient (hereinafter also collectively referred to as an anticancer agent or the like). it can.
  • the “PBF positive cancer” to be treated or prevented by the anticancer agent of the present invention may be any substance that expresses PBF, and examples thereof include osteosarcoma, lung cancer, stomach cancer, breast cancer, and liver. Can be mentioned.
  • the cells (antigen-presenting cells and CTL) contained in the anticancer agent or the like of the present invention may be independently derived from the subject to which the drug is administered (autologous), and It may be a homogenous relationship in which the subject and the HLA type match.
  • the anticancer agent and the like of the present invention are various excipients and other pharmaceuticals that are generally used for pharmaceutical preparations as long as they do not inhibit the action of the epitope peptide of the present invention and cells.
  • An active ingredient etc. may be included and it can formulate using a well-known method in this field
  • an anticancer agent there are an injection or a solid preparation containing the epitope peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the epitope peptide can be formulated in a neutral or salt form.
  • the pharmaceutically acceptable salt include inorganic salts such as hydrochloric acid and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid and tartaric acid.
  • the antigen-presenting cell or CTL of the present invention is pharmaceutically acceptable and is compatible with the peptide or the activity of the cell, such as water, saline, dextrose, ethanol, glycerol, liquid medium, DMSO (dimethyl sulfoxide) and other adjuvants (for example, aluminum hydroxide, KLH, MPL, QS21, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, aluminum phosphate, BCG, alum, CLR agonist such as CpG DNA) Etc., or a combination thereof can be used.
  • adjuvants such as albumin, a wetting agent, and an emulsifier, as needed.
  • cytokines for example, IL-12, IL-18, GM-CSF, IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , Flt3 ligand
  • IL-12, IL-18, GM-CSF, IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , Flt3 ligand may be added as an immune enhancer.
  • the anticancer agent and the like of the present invention can be administered by parenteral administration or oral administration, but parenteral administration is generally preferred.
  • Parenteral administration includes nasal administration, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intravenous injection, injection for local injection of affected area, suppository and the like.
  • parenteral administration it can be prepared as a mixture with excipients such as starch, mannitol, lactose, magnesium stearate, and cellulose.
  • the anticancer agent of the present invention may be used in combination with a known pharmaceutical composition used for treatment or prevention of cancer.
  • the anticancer agent of the present invention is usually used for human subjects, it can be used for other animals (various domestic animals, poultry, pets, laboratory animals, etc.).
  • the subject to which the anticancer agent of the present invention is administered is not particularly limited, and may be not only those suffering from PBF positive cancer but also those not suffering.
  • the cancer may be treated by surgery, chemotherapy, radiation therapy, or the like.
  • the anticancer agent or the like of the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • the dose to be administered depends on the subject to be treated and the immune system, and the required dose is determined by the judgment of the clinician.
  • an appropriate dose is 1 to 100 mg of epitope peptide per patient, and a content of 10 6 to 10 9 for CTL targeting antigen presenting cells or PBF positive cancer on which the peptide is presented.
  • the administration interval can be set according to the subject and purpose.
  • immune checkpoint inhibition such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA4 antibody, etc. from the viewpoint of canceling immunological unresponsiveness of CTL by the immune tolerance mechanism
  • An agent can be used in combination or as required.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing PBF-positive cancer in a subject, characterized by administering the anticancer agent or the like of the present invention to the subject.
  • the product such as the anticancer agent of the present invention or its instructions may be labeled with an indication that it is used for the treatment or prevention of cancer.
  • labeled product or instructions means that the product body, container, packaging, etc. are marked, or instructions, package inserts, promotional materials, or other printed materials that disclose product information. It means that the display is attached to.
  • the indication of being used for the treatment or prevention of cancer the growth of cancer is suppressed by the epitope polypeptide of the present invention, the antigen-presenting cell on which the peptide is presented, or the CTL induced by the antigen-presenting cell or the like. Information about the mechanism by which cell death etc. is induced can be included.
  • Quantification of CTL targeting PBF positive cancer Knowing whether CTLs targeting PBF-positive cancers are present in the peripheral blood or tumor area of cancer patients, or knowing the fluctuations in the amount of vaccine, the dose of vaccine, the number of inoculations, the interval between inoculations, etc. Very important in deciding. Quantitative measurement of CTLs targeting PBF-positive cancer in patients administered with vaccines or passive immunotherapy agents prepared using the epitope peptides of the present invention is an effective component of vaccines and passive immunotherapy agents It is the same meaning as measuring. Furthermore, it is also important in the quality assay for measuring the amount of active ingredients in the preparation process of the passive immunotherapeutic agent provided in the present invention and the final preparation. Quantification of CTL targeting PBF positive cancer can be performed by the following three methods using the epitope peptide of the present invention.
  • Quantification method 1 CTL targeting PBF positive cancer in peripheral blood using MHC-monomer and / or MHC-multimer (hereinafter also collectively referred to as MHC-multimer etc.) produced using the epitope peptide of the present invention Can be quantified.
  • the quantification can be performed, for example, as follows. Peripheral blood, PBMC or cancer sample is reacted with an appropriate concentration of MHC-multimer or the like. Since the CTL bound to the MHC-multimer and the like is stained with the labeling dye, it is counted using a flow cytometer, a microscope or the like.
  • T cell subsets can also be determined simultaneously.
  • cancer sample means a sample containing cancer cells isolated by surgery or biopsy, and may be a tumor tissue composed only of cancer cells, It may be a tissue containing non-cancer cells around the tumor tissue. Further, it may be a tumor tissue infiltrating lymphocyte. Tumor tissue infiltrating lymphocytes mean lymphocytes isolated from tumor tissue excised from a subject suffering from cancer or collected pleural and ascitic fluid.
  • Quantification method 2 It is a method for quantifying cytokines and / or chemokines such as IFN ⁇ (interferon gamma), TNF ⁇ (tumor necrosis factor alpha), and interleukin produced by CTL by stimulating PBMC with the epitope peptide of the present invention. A specific method will be described below using IFN ⁇ as an example.
  • PBMC Intracellular IFN ⁇ producing cell quantification method
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • an intracellular protein transport inhibitor eg, Brefeldin A, Monensin, etc.
  • T cell marker antibody anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody
  • MHC-multimer fix the cells, perform membrane permeabilization, and react with dye-labeled anti-IFN ⁇ antibody .
  • Analysis is performed using a flow cytometer or the like, and the percentage of IFN ⁇ positive cells in total cells, T cells, or positive cells such as MHC-multimers is quantified.
  • PBMC PBMC are plated on a 96-well MultiScreen-HA plate (Millipore) on which an anti-IFN ⁇ antibody is immobilized. Thereafter, the epitope peptide of the present invention are cultured for 20 hours at 5% CO 2 constant temperature bath incubator at 37 ° C. was placed in each well. The next day, the plate is washed and reacted with anti-IFN ⁇ antibody and peroxidase-labeled anti-IgG antibody in this order. Further, a substrate of peroxidase is added, the IFN ⁇ spot is visualized by color development, and quantified by counting using a stereomicroscope or an ELISPOT analyzer (CTL).
  • CTL ELISPOT analyzer
  • PBMC PBMC are suspended in a suitable medium at a cell concentration of approximately 2 ⁇ 10 6 / mL, and the epitope peptide of the present invention is added. Incubate for 24-48 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 thermostat. After the culture, the IFN ⁇ concentration contained in the culture supernatant is quantified using a commercially available ELISA kit (for example, Quantikine ELISA Human IFN ⁇ Immunoassay manufactured by R & D Systems).
  • a commercially available ELISA kit for example, Quantikine ELISA Human IFN ⁇ Immunoassay manufactured by R & D Systems.
  • Quantification method 3 Quantification is performed using cell surface protein specific antibodies.
  • CTL specifically recognizing the epitope peptide of the present invention has been reported to be stimulated by binding with the peptide and to enhance the expression of cell surface proteins (eg CD137, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.). . Therefore, by mixing PBMC stimulated with the epitope peptide of the present invention and the like and a labeled antibody that specifically recognizes a cell surface protein, CTL binds to the labeled antibody and is stained with a labeled dye. Stained CTL can be counted and quantified using a flow cytometer, a microscope or the like. Further, by adding an anti-CD3 antibody, an anti-CD4 antibody, an anti-CD8 antibody or the like labeled with a dye different from the labeled antibody, the T cell subset of CTL can be simultaneously determined.
  • a monoclonal antibody specific to a complex (MHC-monomer) consisting of the epitope peptide of the present invention, the extracellular region of HLA molecule and ⁇ 2m (hereinafter also referred to as pMHC antibody) presents the epitope peptide of the present invention on the cell membrane surface.
  • pMHC antibody can be used as a diagnostic agent for cancer immunotherapy, and has high specificity by binding an antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter also referred to as ADCC activity) or an anticancer agent. It is also useful as an antibody.
  • the acquisition of pMHC antibody is generally performed by the phage display method.
  • the phage display method is a system for expressing a foreign gene as a fusion protein so as not to lose the infectivity of the phage. It is known that a specific monoclonal antibody can be isolated by using this and expressing and screening an antibody variable region on a phage (Tsukahara T et al., J Biol Chem. 2014; 289: 22035-22047). More specifically, acquisition of a pMHC antibody is performed in the flow of preparation of an antibody library, panning, antibody isolation, and evaluation.
  • a complex of the epitope peptide of the present invention, the extracellular region of the HLA molecule and ⁇ 2m is immobilized on an ELISA plate or the like, or immobilized with a biotin-avidin bond, and a phage library is used for this.
  • a phage library is used for this.
  • the obtained antibody can be evaluated by adding an epitope peptide to the aforementioned TAP gene-deficient strain T2, reacting the antibody, and measuring the average fluorescence intensity with FCM.
  • Table 1 shows the characteristics of HLA-A * 11: 01-restricted PBF-specific CTL epitope candidate peptides.
  • Table 2 also shows peptides used as controls described later.
  • HLA-A * 11 01-restricted epitope peptide derived from pp65 protein of human cytomegalovirus (CMV) was used as a positive control peptide, and survivin-2B HLA-A * 24 was used as a negative control peptide.
  • CMV human cytomegalovirus
  • 02 restricted epitope peptide was used.
  • the “peptide name” in the table was determined based on 3 amino acids from the N-terminal side of each peptide.
  • “Position” indicates a position on the amino acid sequence of a protein derived from PBF or the like.
  • the amount of MHC-monomer formation can be calculated from the peak area obtained by the absorption wavelength of 280 nm.
  • MHC-monomer formation is not confirmed in candidate peptides that do not bind to HLA molecules.
  • a typical gel filtration column analysis example where MHC-monomer formation is observed is shown in FIG.
  • HLA molecules and ⁇ 2m become inclusion bodies in the E. coli expression system, and thus were purified as an insoluble fraction and then used after being solubilized in 8M urea.
  • the hardly soluble HLA molecules that do not lead to MHC-monomer formation are detected as aggregates in 7 to 8 minutes.
  • most of the aggregates are largely removed by filter filtration, which is a pretreatment step of gel filtration column analysis.
  • ⁇ 2m is a soluble protein, solubilized in a folding solution, and is detected around 14 minutes when Superdex 75 10 / 300GL (GE Healthcare) is used for the gel filtration column. After 15 minutes, the composition and peptide of the folding solution are detected.
  • FIG. 2 shows the analysis results after 1, 3, and 7 days of the folding test performed on nine types of peptides in this way.
  • the peak area indicating MHC-monomer formation is shown by a bar graph.
  • the PBF-specific CTL epitope candidate peptides (SEQ ID NOs: 1 to 9) showed sufficient MHC-monomer formation as compared with the negative control.
  • a biotin-binding site is added in advance to the C-terminus of the recombinant HLA class I molecule, and biotin is added to this site after MHC-monomer formation.
  • a commercially available PE-labeled streptavidin and biotinylated MHC-monomer were mixed at a molar ratio of 1: 4 to prepare an MHC-tetramer reagent.
  • the MHC-tetramer reagent produced in this example is abbreviated as, for example, ASV-Tet, which is an MHC- produced using a ternary complex of HLA-A * 11: 01, ASV peptide and ⁇ 2m. Tetramer reagent is shown.
  • HLA-A * 11: 01 It is necessary to examine whether it is possible to amplify PBF-specific CTLs present in the peripheral blood using the peripheral blood of the donor who holds the blood.
  • HLA-A * 11: 01 is determined by Genosearch HLA-A Ver. 2 (MBL) was used to confirm the genotyping of HLA-A, and the following studies were performed using PBMCs derived from 5 healthy adults carrying HLA-A * 11: 01. .
  • MLPC mixed lymphocyte peptide culture
  • the MLPC method is a method for inducing CTL by adding a peptide to a PBMC culture solution (Karanikas V et al., J Immunol. 2003; 171: 4898-4904, Tsukahara T et al., J Transl Med. 2009; 7:44).
  • Peptides are presented to antigen-presenting cells present in PBMC, such as dendritic cells, B cells, macrophages, and certain T cells, and memory-type peptide-specific CTLs contained in PBMC are thought to proliferate upon stimulation. It is done.
  • peripheral blood collected from healthy adults carrying HLA-A * 11: 01 was centrifuged at 3,000 rpm for 5 to 10 minutes, and the plasma portion of the supernatant was collected. Except for the plasma part, PBMCs were separated by a density gradient centrifugation method, which is a conventional method.
  • PBMCs PBMCs were suspended in 10 mL of this medium.
  • 3 to 5 types of peptides among 9 types of PBF-specific CTL epitope candidate peptides were added at a concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the peptide can be changed according to the solubility of the peptide, but in this example, the concentration was 10 ⁇ g / mL.
  • a 96-well U-bottom cell culture micro test plate BECTON DICKINSON
  • the cells were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 constant temperature bath.
  • IL-2 was added at a final concentration of 20-100 U / mL. Thereafter, the CTL induction medium supplemented with IL-2 was appropriately replaced. Confirmation of PBF-specific CTL was carried out around 2 weeks of culture. When induction of PBF-specific CTL could be confirmed, stimulation with peptide pulse antigen-presenting cells or direct stimulation with peptide was attempted to establish a CTL line.
  • the cells were resuspended in 400 ⁇ L of PBS.
  • 7-AAD viability Dye dead cell detection reagent, MBL was added to exclude non-specific fluorescence due to dead cells. The analysis was performed with a flow cytometer within 24 hours.
  • the first stage is induced with 3 to 5 kinds of mixed peptides, and after 2 weeks, a portion of cells in each of the 8 wells is collected for each lane of a 96-well U-bottom cell culture microtest plate. These were mixed and pooled as one sample (lane pool), and Lanes in which a positive cell population was detected were identified using 3 to 5 types of MHC-tetramer mixed reagents corresponding to the induction peptide.
  • 3 to 5 types of MHC-tetramers corresponding to the peptide for induction were obtained by individually collecting cells in 8 wells in the lane in which induction of PBF-specific CTL was confirmed in the first stage.
  • FIG. 3 shows a typical result of confirmation at the first stage after inducing PBF-specific CTL by the MLPC method. That is, three kinds of peptides, CTL epitope candidate peptides QVA, LSA and SLP described in Table 1, were mixed and added to PBMCs of three healthy adults (Donor A, Donor and Donor C), and cultured for about 2 weeks. did. Two weeks later, the lane pool was prepared (lanes 1 to 12), stained with three types of MHC-tetramer mixed reagents (QVA-Tet, LSA-Tet, and SLP-Tet) and CD8-FITC, and the analysis results were obtained. As shown in FIG.
  • the numbers in the dot plot development diagram are (UR + LR) when the area obtained by dividing the development diagram into four is expressed as UL (upper left), UR (upper right), LL (lower left), and LR (lower right). Shows the percentage of UR in minutes.
  • the X-axis is CD8, and the Y-axis is a dot plot development view showing the fluorescence intensity for the MHC-tetramer mixed reagent on a log scale.
  • LSA SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 6 is a PBF-specific CTL epitope peptide exhibiting HLA-A * 11: 01 restriction.
  • the five CTL epitope candidate peptides QVA, QVT, KVL, SSL, and SLP listed in Table 1 were mixed, and two healthy adults (Donor D and Donor E) were mixed. ), And cultured for about 2 weeks. Two weeks later, the lane pool is prepared (lanes 1 to 12), and stained with five types of MHC-tetramer mixed reagents (QVA-Tet, QVT-Tet, KVL-Tet, SSL-Tet and SLP-Tet) and CD8-FITC. The results are shown in FIG. As a result, clear CD8 positive and 5 types of MHC-tetramer mixed reagent positive cell populations were detected in the UR of Donor D Lane 7 and Donor E Lane 2.
  • each well (A to H) of each positive lane and a total of 16 wells of the cell population were individually collected and examined in the second stage similarly stained with 5 types of MHC-tetramer mixed reagents and CD8-FITC.
  • the results are shown in FIG. As a result, specific CTL was detected in B well (7-B) in Lane 7 of Donor D and in C well (2-C) in Lane 2 of Donor E.
  • FIG. 8 shows the results of the analysis at the third stage in which staining was performed individually using each MHC-tetramer reagent.
  • a positive cell population was detected only by staining with QVT-Tet alone.
  • QVT-Tet is compared with the positive rate when stained with five types of MHC-tetramer mixed reagents (QVA-Tet, QVT-Tet, KVL-Tet, SSL-Tet and SLP-Tet). The positive rate when stained alone was about the same.
  • QVT SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 4 is PBF-specific that exhibits HLA-A * 11: 01 restriction. CTL epitope peptide was shown.
  • the inventors mixed three types of peptides, ASV, QVT and SAL, and added them to PBMCs of three healthy adults (Donor A, Donor B and Donor C), and cultured them for about 2 weeks.
  • the lane pool was prepared (lanes 1 to 12), and the results of staining with three types of MHC-tetramer mixed reagents (ASV-Tet, QVT-Tet and SAL-Tet) and CD8-FITC are shown in FIG.
  • ASV-Tet, QVT-Tet and SAL-Tet three types of MHC-tetramer mixed reagents
  • CD8-FITC CD8-FITC
  • FIG. 10 shows the result of staining using a reagent.
  • ASV-Tet As a result, a positive cell population was confirmed only when stained with ASV-Tet alone.
  • MHC-tetramer mixed reagents ASV-Tet, QVT-Tet and SAL-Tet
  • the positive rate of Donor A Lane 7 was 9.02%
  • the positive rate of Donor B Lane 4 was 36.
  • the positive rate of Donor C Lane 4 was 13.84%, whereas the positive rates when stained with ASV-Tet alone were 9.13% and 36.3%, respectively. It was almost equivalent to 33% and 13.74%.
  • ASV SEQ ID NO: 1
  • induced CTL showing HLA-A * 11: 01 restriction
  • Donor A, Donor B In addition, the memory type CTL was present in the peripheral blood of Donor C.
  • the limit of detection of cancer antigen-specific CTLs by the 96-well MLPC method is usually 1 when assuming that the CD8 positive cell rate before induction is 10 to 20%. It becomes ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ 7 .
  • the standard proportion of specific CTL detected is 1 to 3 wells per 96-well plate.
  • FIG. 3 and FIG. 6 there is only one Lane detected positively with the MHC-tetramer mixed reagent, and as shown in FIG. 9, CD8 positive tetramers apparent in all Lane URs.
  • the phenomenon in which a positive cell population is detected is very rare for cancer antigens that are self-antigens.
  • the inventors mixed three types of peptides, SVL, KVL, and SSL, added to the PBMCs of three healthy adults (Donor A, Donor B, and Donor C) and cultured for about 2 weeks.
  • the lane pool was prepared (lanes 1 to 12), and the results of staining with three types of MHC-tetramer mixed reagents (SVL-Tet, KVL-Tet and SSL-Tet) and CD8-FITC are shown in FIG.
  • SVL-Tet, KVL-Tet and SSL-Tet three types of MHC-tetramer mixed reagents
  • CD8-FITC CD8-FITC
  • the analysis was attempted by the step analysis method.
  • the result is shown in FIG. 12 (second stage).
  • Donor A's Lane 6, Donor B's Lane 11 and Donor C's Lane 6 were selected as arbitrary positive Lanes and stained individually using each MHC-tetramer reagent.
  • SVL was obtained.
  • -Positive cell population was confirmed only when stained with Tet alone.
  • SVLSRRLGK (SEQ ID NO: 2) is a peptide in which one amino acid Ala on the N-terminal side of ASVLSRRLGK (SEQ ID NO: 1) is deleted. Therefore, the relationship between ASV and SVL was verified using ASV-specific CTL and SVL-specific CTL. Results obtained by adding ASV or SVL peptides to the same Donor peripheral blood PBMC, inducing CTL specific for each peptide by culturing for about 2 weeks, and confirming cross-reactivity of ASV-Tet and SVL-Tet Is shown in FIG.
  • the ASV-specific CTL induced with ASV had a positive rate of 15.33% when stained with ASV-Tet, but the same cell population was stained with SVL-Tet. In some cases, SVL-specific CTL was detected with a positive rate of 11.47%. Conversely, SVL-specific CTL induced by SVL had a positive rate of 5.67% when detected by SVL-Tet, but a ratio of 11.01% when the same cell population was detected by ASV-Tet ASV specific CTL was detected.
  • SVL-Tet The presence of more specific CTL for ASV not used for induction than for the specific CTL for SVL used for induction, and the cell population in which SVL-specific CTL was detected by ASV-Tet was determined to be SVL-Tet.
  • SVL has a weaker immunostimulatory effect on memory T cells than ASV, and ASV is presented in HLA-A * 11: 01 in vivo. It is thought that it shows strongly that it is. This is apparent from the fact that the frequency of appearance of the tetramer positive cells shown in FIG. 9 is higher than that in FIG. 11 in spite of the induction experiment from the same Donor PBMC in FIG. 9 and FIG.
  • EBV-infected B cell line Culture of B95.8 cell line (obtained from JCRB Cell Bank), which is an EBV-producing cell line, according to a standard method (Kuzushima K et al., Clin Exp Immunol. 1996; 103: 192-198)
  • the supernatant (including live EBV virus) and PBMC were mixed and cultured to establish an EBV-infected B cell line (Lymphoblastoid cell line, hereinafter also referred to as EBV-infected LCL).
  • EBV-infected LCL EBV-infected LCL
  • NIH-CD40L NIH3T3 cells
  • human CD40L was stably expressed by gene transfer and PBMC were co-cultured in the presence of IL-4.
  • NIH-CD40L inhibited growth by 96 Gy X-ray irradiation, and co-culture was repeated every 3 to 4 days (Kondo E et al., J Immunol. 2002; 169: 2164-2171). About 2 weeks later, the expression of HLA molecules and the expression of CD80, CD83 and CD86 were confirmed.
  • PBMC dendritic cells
  • GM-CSF and IL-4 were added thereto, and cultured for 24 hours.
  • TNF ⁇ , IL-1 ⁇ and PGE2 prostaglandin E2 were added, and cultured for 24 to 48 hours.
  • the cells recovered by lightly washing with an appropriate medium or the like were used as dendritic cells (Kondo E et al., J Immunol. 2002; 169: 2164-2171). After 48 hours, the expression of HLA molecules and the expression of CD80, CD83 and CD86 were confirmed.
  • antigen-presenting cells EBV-infected LCL, CD40-B cells, dendritic cells
  • Antigen-presenting cells were prepared in advance from PBMC holding HLA-A * 11: 01.
  • Antigen-presenting cells are suspended in a pulse medium (0.1% human serum albumin / 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol / RPMI 1640) or AIM-V medium (Invitrogen), and a CTL epitope candidate peptide is added at a concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 to 60 minutes with gentle mixing at approximately 15 minute intervals, then washed 3 times with an excessive amount of washing solution (2% fetal calf serum (FCS) / PBS), and unbound to the HLA molecule.
  • the peptide was washed away.
  • FCS fetal calf serum
  • Peptide pulse antigen-presenting cells were treated with a lethal dose of X-ray irradiation or mitomycin C treatment to lose their proliferative ability.
  • IL-2 was examined at the start of culture, 2 days after the start of culture, and 6 days after the start of the culture. In this case, since a good result was obtained, it was added at a concentration of 50 U / mL 2 days after the start of the culture. Stimulation was again applied using peptide pulse antigen-presenting cells 10 to 14 days after the start of culture. Stimulation was performed with peptide-pulsed antigen-presenting cells every 10-14 days, and evaluation of CTL induction was performed approximately 2 weeks and 4 weeks later. When induction of PBF-specific CTL could be confirmed, stimulation was further performed using peptide pulse antigen-presenting cells to establish a CTL line.
  • FIG. 14 shows the results of examining specific CTLs by the MLPC method using a control peptide and examining by the intracellular IFN ⁇ -producing cell quantification method. That is, PBMCs isolated from healthy adult peripheral blood that retains HLA-A * 11: 01 but not HLA-A * 24: 02 are positive controls (epitope peptides derived from HLA-A * 11: 1-restricted CMV pp65, ATP peptide) or negative control peptide (HLA-A * 24: 02-restricted survivin-2B-derived epitope peptide, AYA peptide) was stimulated for 13 days and then re-reacted for 14 hours with each peptide used for stimulation in the presence of Brefeldin A.
  • positive controls epipe peptides derived from HLA-A * 11: 1-restricted CMV pp65, ATP peptide
  • negative control peptide HLA-A * 24: 02-restricted survivin-2B-derived epitop
  • the numbers in the dot plot development diagram indicate the ratio (%) of the cells present in the four divided regions to the whole living cells.
  • IFN ⁇ -positive CD8-positive cells appear in the UR when restimulated with a positive control peptide (lower left), negative It hardly appears even when restimulated with the control peptide (upper left side).
  • CMV pp65-specific CTL The presence of CMV pp65-specific CTL in the cell population stimulated and cultured for 13 days with the positive control peptide is based on the dot plot of the fluorescence intensity against the MHC-tetramer reagent on the X axis and log scale on the Y axis. It is clear from the figure that there is a CD8 positive MHC-tetramer reagent positive cell population in the UR (lower center). On the other hand, it is also clear that survivin-2B-specific CTL does not appear in the cell population to which an HLA-restricted negative control peptide different from Donor allyl is added (upper center).
  • the inventors performed intracellular IFN ⁇ -producing cell quantification in order to evaluate the functionality of CTL induced by the PBF-specific CTL epitope peptide identified by the MHC-tetramer reagent. The results are shown in FIG. 15, FIG. 16, and FIG.
  • the right side of FIG. 15 is a dot plot development view showing the fluorescence intensity for CD8 on the X-axis and IFN ⁇ on the Y-axis in a log scale, and was reproduced using the same peptide as the peptide QVT (SEQ ID NO: 4) used for induction. The result of stimulating and verifying the ability to produce IFN ⁇ is shown. In UR, the ratio (%) of the number of IFN ⁇ positive cells in CD8 positive cells to PBMCs was shown as a numerical value.
  • the left side of FIG. 15 shows the result of staining a non-stimulated cell population (peptide concentration: 0 ⁇ g / mL) with QVT-Tet.
  • CTLs induced with QVT were restimulated with QVT peptide for 14 hours.
  • CD8-positive IFN ⁇ -positive (production) cells were 0.63%, whereas re-stimulation using QVT was proportional to the peptide concentration.
  • the abundance of CD8 positive IFN ⁇ positive cells increased.
  • 14.15% of CD8 positive IFN ⁇ positive (producing) cells were confirmed, showing a clear difference from the unstimulated case.
  • QVT-Tet positive cells since 23.84% of QVT-Tet positive cells exist, it became clear that 59.4% of QVT-Tet positive cells are effector type CTLs that produce IFN ⁇ .
  • the PBF-derived QVT (SEQ ID NO: 4) identified in the present example has a function of proliferating PBF-specific CTL in peripheral blood, and these cell populations have cytotoxic activity and QVT. Since it was detectable by Tet, it was found to be a HLA-A * 11: 01-restricted PBF-specific CTL epitope peptide.
  • PBF-derived LSA (SEQ ID NO: 6) identified in the present invention has a function of proliferating PBF-specific CTL in peripheral blood, and these cell populations have cytotoxic activity and LSA- Since it was detectable with Tet, it was found to be an HLA-A * 11: 01-restricted PBF-specific CTL epitope peptide.
  • FIG. 17 shows the results of ASV and SVL, respectively.
  • the right side of the figure is a dot plot development showing the fluorescence intensity for CD8 on the X-axis and IFN ⁇ on the Y-axis on a log scale. Restimulation was performed using the peptide ASV or SVL used for induction, and the IFN ⁇ production ability was measured. The verified result is shown. In UR, the ratio (%) of the number of IFN ⁇ positive cells in CD8 positive cells to PBMCs was shown as a numerical value.
  • the left side of the figure shows the result of staining a cell population with no stimulation (peptide concentration: 0 ⁇ g / mL) with ASV-Tet or SVL-Tet.
  • the PBF-derived ASV (SEQ ID NO: 1) and SVL (SEQ ID NO: 2) identified in the present invention have a function of proliferating specific CTLs in peripheral blood, and are ASV-Tet or SVL-Tet. Although detectable, these cell populations were found to have no cytotoxic activity.
  • CTL against HCV Hepatitis C virus
  • CTL against cytokines or the like CTL does not produce cytokines or the like, and the proportion of CTLs produced is extremely low. It has been reported that there is a possibility of being scientifically unresponsive (Gruener NH et al., J Virol. 2001; 75: 5550-5558).
  • TGF ⁇ regulatory T cells
  • MDSC bone marrow-derived immunosuppressor cells
  • TGF ⁇ regulatory T cells
  • PD-1 PD-1
  • CTLA-4 CTLA-4
  • TGF ⁇ is a suppressive cytokine secreted by cancer cells and inhibits the proliferation and differentiation of CTL and CD4-positive T cells.
  • PD-1 and CTLA-4 are both molecules on the cell membrane of T cells. When they bind to ligands expressed by cancer cells, inhibitory signals are transmitted and CTLs are inactivated (anergic). CTL).
  • the immune system is reactivated by inhibiting the action of these immunosuppressive molecules by anti-PD-1 antibody and anti-CTLA-4 antibody, and clinical studies are being promoted as a new therapeutic strategy. ing.
  • CTL becomes a memory type T cell and is stored in the host while having cytotoxic activity against the antigen, and is prepared so that it can respond quickly when exposed to the same antigen or foreign substance next time.
  • Immunological unresponsiveness is generally likely to occur when (1) there is a large amount of antigen, (2) the exposure period is long, and (3) the level of inflammatory reaction that occurs simultaneously is low.
  • An example is oral tolerance to food or the like. Typical food allergens include eggs, milk, and buckwheat. But food allergies don't happen to everyone. This is because the intestinal tissue has an immune tolerance mechanism for food components taken orally into the living body. Therefore, the reason why food allergies during infancy are often ameliorated by adolescence is thought to be due to the growth of the gastrointestinal tract accompanying growth and the establishment of appropriate oral tolerance.
  • non-self antigenic peptides having high homology exist in ASV (SEQ ID NO: 1) and SVL (SEQ ID NO: 2), and are induced when they are temporarily or permanently incorporated into healthy individuals. Although some of them existed in the blood as memory-type T cells, it was suggested that they may be immunologically unresponsive due to the mechanism of immune tolerance. Since ASV and SVL have high homology with this non-self antigen peptide, it is considered that memory-type CTLs that cross-react with each other could be efficiently induced. PD-1 and CTLA4 antibody drugs, which are the aforementioned immune checkpoint inhibitors, are said to release such immune tolerance, and by utilizing this cross-reactivity, a large amount of memory CTL exists in the living body. It is considered that ASV and SVL-specific CTL can be used for immunotherapy for PBF-positive cancer.
  • HOS cells HLA-A11 negative
  • HOS cells HLA-A11 negative
  • HOS cells HLA-A11 negative
  • FITC-labeled anti-HLA-A11 antibody abcam
  • the established HLA-A11 stably expressing human osteosarcoma cell line (hereinafter also referred to as A11-expressing HOS cell) confirmed the expression of HLA-A11, which was measured for the cytotoxic activity shown below. Used as target cells.
  • A11-negative HOS cells or A11-expressing HOS cells in culture were centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes and the supernatant was discarded. After adding an appropriate amount of PBS and stirring the cells, the cells were centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was carefully discarded and the cells were suspended in 1 mL PBS. CFSE was added to a final concentration of 0.1 ⁇ M and stained at room temperature for 10 minutes. 1 mL of FCS was added and stirred. 10 mL of PBS was added and centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes.
  • target cells are added per well of a 96-well culture plate, effector cells are added in an amount of 10,000 to 100,000, and 5% CO 2 ⁇ at 37 ° C.
  • the cells were cultured for 5 hours in a thermostatic bath. After culturing, a calcium chloride solution was added at a concentration of 1 mM, stained with fluorescently labeled Annexin V, and the dead cell rate of target cells labeled with CFSE was measured by flow cytometry.
  • FIG. 19 shows the results when PBF-specific CTL induced with peptide QVT (SEQ ID NO: 4) was used for effector cells
  • FIG. 20 shows PBF-specific CTL induced with peptide LSA (SEQ ID NO: 6). This is the result of using.
  • the QVT (SEQ ID NO: 4) peptide-specific CTL cell population or the LSA (SEQ ID NO: 6) peptide-specific CTL cell population is expressed on the membrane surface of the target cell HLA-A * 11: It was confirmed that each PBF peptide presented in 01 was recognized and killed. That is, it was confirmed that CTL cells induced by PBF-derived QVT (SEQ ID NO: 4) or LSA (SEQ ID NO: 6) identified in the present invention have cytotoxic activity against human osteosarcoma cells. It was.
  • ASVLSRRLGP (SEQ ID NO: 12) which is a peptide derived from actinomycetes and a peptide derived from cyanobacteria are peptides having high homology with the peptides specified in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • ASVLSQRLGK (SEQ ID NO: 13) could be found.
  • ASELPPPLHK (SEQ ID NO: 14), which is a peptide derived from Mycobacterium tuberculosis having high homology with the peptide specified by SEQ ID NO: 6 (LSALPPPLHK), could also be found. There was no corresponding peptide having high homology with the peptide specified in SEQ ID NO: 4.
  • Table 3 is the same as in Tables 1 and 2 above.
  • the CTL epitope peptide presented on the HLA class I molecule consists of 8 to 10 amino acids, and the 2nd, 9th and 10th amino acids from the N-terminal side are the most important for binding to the HLA class I molecule. It is an amino acid and is called an anchor motif.
  • an anchor motif As a peptide that binds to the HLA-A11 molecule, either Ile, Met, Ser, Thr, or Val is located at the second position from the N-terminus, and either Lys or Arg is located at the ninth or tenth position.
  • Arranged peptides of 9 to 10 amino acids are best known (Chang CX et al., Eur J Immunol. 2013; 43: 1109-1120).
  • the HLA-A * 11: 101-restricted CTL epitope peptide ASV provided by the present invention is composed of 10 amino acids, Ala Ser Val Leu Ser Arg Arg Leu Gly Lys (SEQ ID NO: 1), and N as an anchor motif. It has Ser second from the end side and Lys tenth.
  • SVL which is a peptide in which one amino acid residue has been removed from the N-terminal side, is composed of 9 amino acids, Ser Val Leu Ser Arg Arg Leu Gly Lys (SEQ ID NO: 2), as an anchor motif. It has Val second from the N-terminal side and Lys ninth.
  • ASV (K10P) (SEQ ID NO: 12), a peptide highly homologous to ASV and SVL, is composed of 10 amino acids, Ala Ser Val Leu Ser Arg Arg Leu Gly Pro, and the 10th Pro is not an anchor motif. Therefore, it is presumed that the possibility of being a CTL epitope is low.
  • ASV (R6Q) (SEQ ID NO: 13) is composed of 10 amino acids, Ala Ser Val Leu Ser Gln Arg Leu Gly Lys, 2nd Ser, 10th Lys, and ASV as a CTL epitope. Or the crossing property with SVL is considered.
  • ASV is derived from a protein called cyanobacterium chromosome partitioning protein ParA (NCBI Reference Sequence: WP — 026087254.1). This protein is involved in chromosome distribution and cell division and is highly conserved in algae.
  • Algae has traditionally been used as a food ingredient around the world. In Southeast Asia, it can be used as a food. In Japan, algae has been used for a long time as a foodstuff. Nori, kombu, seaweed, hijiki, mozuku, and human rush are daily foods. In particular, the consumption of seaweed, a collective term for algae including red algae, green algae, cyanobacteria, etc., is very high worldwide.
  • Algae-derived ASV (R6Q) that is ingested on a daily basis is considered to be cross-reactive with PBF-derived ASV and SVL, which are inherently self-antigens.
  • PBF-derived HLA- As a result of induction with A * 11: 01-restricted CTL epitope peptides ASV and SVL, it is considered that a high frequency and immunologically inactive cell population was proliferated.
  • recent research has reactivated immunity by targeting immunosuppressive molecules by anti-PD-1 antibody and anti-CTLA-4 antibody targeting such immunoinactive cell populations. It became possible to do.
  • ASE which is a peptide highly homologous to LSA (SEQ ID NO: 6), is composed of 10 amino acids Ala Ser Glu Leu Pro Pro Pro Leu His Lys, and the second is Ser. It has Lys at the 10th position, and crossover with LSA is also considered as a CTL epitope.
  • ASE is derived from a protein called the pathogenic bacterium of the human pathogenic UDP-galactofuranoyltransferase GlfT (NCBI Reference Sequence: WP_003902746.1) of the human tuberculosis bacterium Mycobacterium tuberculosis.
  • BCG vaccine has been developed as a preventive vaccine using attenuated bacteria produced by repeated culture of Mycobacterium tuberculosis. BCG vaccine is the only live attenuated vaccine with a preventive effect on tuberculosis and is used all over the world.
  • BCG vaccine therapy is established as one of immunotherapy and applied to cancer treatment.
  • new CTL epitopes ASV (SEQ ID NO: 1), SVL (SEQ ID NO: 2), QVT (SEQ ID NO: 4), and LSA (SEQ ID NO: 6) were identified. These novel CTL epitopes are expected to be applied to PBF positive cancer treatment in the future.
  • a peptide homology search technique was first introduced, and ASV (R6Q) (SEQ ID NO: 13) and ASE (SEQ ID NO: 14) having high homology with PBF-derived CTL peptides were found. .
  • ASV which is an algae-derived peptide
  • R6Q ASV
  • SEQ ID NO: 13 ASV
  • ASE SEQ ID NO: 14
  • LSA LSA
  • an epitope capable of specifically recognizing HLA-A11-restricted cytotoxic T cells (CTL) targeting cancers that express PBF, an osteosarcoma-specific antigen.
  • CTL cytotoxic T cells
  • Peptide, vaccine for treating or preventing PBF positive cancer using the peptide method for inducing CTL, passive immunotherapeutic agent using CTL and method for producing the same, method for quantifying CTL, and method It is possible to provide a kit for use in the above.
  • the present invention is useful in immunotherapy for cancer patients holding HLA-A11.

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Abstract

骨肉腫特異抗原であるＰＢＦを発現するがんを標的とするＨＬＡ－Ａ１１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が特異的に認識するエピトープペプチド、並びに該ペプチドを用いたＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン、前記ＣＴＬの誘導方法、前記ＣＴＬを用いた受動免疫療法剤及びその製造方法、並びに前記ＣＴＬの定量方法及び該方法に使用するキットを提供することを目的とし、鋭意検討した結果、配列番号：１、２、４、６、１３又は１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが、ＨＬＡ－Ａ１１分子に結合して複合体を形成すること、及び当該複合体を提示する細胞によってＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬが誘導されることを見出した。

Description

ＨＬＡ－Ａ１１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド
　本発明は、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、ＣＴＬとも称する）エピトープペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、骨肉腫特異抗原であるＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（以下、ＰＢＦとも称する）を発現するがん（ＰＢＦ陽性がん）を標的とするＣＴＬが、特異的に認識し得るエピトープペプチド、該ペプチドを用いたＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン、前記ＣＴＬの誘導方法、前記ＣＴＬを用いた受動免疫療法剤及びその製造方法、並びに前記ＣＴＬの定量方法及び該方法に使用するキットに関する。
　骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ／ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ）は骨そのものに発生する悪性腫瘍である。骨原発の悪性腫瘍の中で最も多く、骨腫瘍の５６％を示す（非特許文献１）。
　骨肉腫は小児、若年者に多く、膝、関節周辺の新陳代謝が盛んな骨端、骨幹端中心に発生するがんである。これらの発症部位に強い痛みを起こし、腫瘍の成長につれて骨が破壊されてしまう。また、青少年期に罹患するがんの中で３番目に多い悪性腫瘍である（非特許文献２）。
　青少年期において骨格、骨質の形成時に好発する一方、成人や高齢者でも、脊椎や骨盤での発生例や二次性骨肉腫の発生が見られる。アメリカがん協会のレポートによると、骨肉腫の年齢別疫学調査では、１０～３０代の次に６０歳以上の罹患率が高い（非特許文献３）。特に我が国における急速な人口高齢化の進行により、高齢者の骨軟部疾患や骨悪性腫瘍の患者数が年々上昇すると推測される。
　骨肉腫の原因は他のがん種でも見られるように、様々な因子が絡んでおり、特定の原因は突き止められていない。臨床所見では、骨形成・骨成長・骨代謝に関わる骨芽細胞や破骨細胞が病変し、悪性化した骨肉腫細胞の形態を変化させ、腫瘍性の骨若しくは類骨基質の産出を引き起こし、多様な画像所見や病理所見が観察される。そのため、骨肉腫の組織分類は複雑であり、診断と治療に困難をきたす。
　従来、低悪性度の骨肉腫の治療には外科的完全切除のみが有効な治療法として用いられてきた。しかし、高悪性度の骨肉腫は、切除後の５年生存率は１０％と極めて予後不良であった。１９７０年代から手術前後の補助化学療法の導入により、非転移性骨肉腫の治療効果は劇的に改善され、５年間全生存率は７５～７７％と報告されている（非特許文献４、５）。しかし、多くの骨肉腫は高率に転移を生じる。肺転移が最も多く、遠隔転移での再発の約９割が肺転移で、それ以外に骨転移の合併が１～２割である。さらにリンパ節への転移も見られる（非特許文献６）。多くの転移性骨肉腫は化学療法に耐性を示し、さらにそのうちの３０％以上の患者は化学療法剤に対して全く応答性を示さず、救済することは非常に困難である（非特許文献７、８、９、１０）。そのため、転移性骨肉腫患者の予後は非常に悪く、手術前後の補助化学療法等が導入された現在でも、５年間無再発生存率はわずか２０％である（非特許文献１１）。
　非転移性骨肉腫の場合、手術前後に用いられる化学療法剤で有用性が確認されているのは、高用量のメトトレキサート（ＭＴＸ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ドキソルビシン（ＤＸＲ）、イホスファミド（ＩＦＭ）である（非特許文献１２、１３、１４）。それらの抗がん剤は腫瘍増殖の抑制効果があるものの、心筋症、聴覚損失等の重い副作用があり、さらに二次悪性腫瘍を引き起こすリスクがあると報告されている（文献１３、１５）。
　このように、化学療法抵抗性の症例や強い副作用のために治療を継続できない症例も認められる。また、手術による四肢切断は、患者に大きな喪失感と虚脱感を与え、特に発症年齢が低い事から、患者のみならず家族と医師にとっても困難な決断を迫られる状況にある。このような背景で、骨肉腫の新しい治療法の開発が強く求められている。
　ここ十数年間、がん免疫療法は急速に発展し、数多くの臨床研究が世界中で行われている。学術雑誌「サイエンス」では、２０１３年の「ブレイクスルー・オブ・ザ・イヤー」のトップに選ばれる等、従来の外科的措置、放射線療法、化学療法では難治性の悪性腫瘍において、免疫療法は有力な第４の治療法になりうると注目されている。
　免疫療法の歴史は古く、１８９３年にコーリーワクチン（Ｃｏｌｅｙ’ｓ　ｖａｃｃｉｎｅ）を用いた悪性腫瘍の治療が最初の文献報告である（非特許文献１６）。その後、１９６０年代後半から現在に至るまで、免疫学の飛躍的な発展により、新たな知見が急速に蓄積され、がん免疫療法の臨床開発に大きく寄与している。
　例えば、免疫賦活剤の作用に着目したＢＣＧワクチンや丸山ワクチン療法（非特許文献１７、１８、１９、２０）、サイトカインの働きに依拠したインターフェロン、インターロイキン療法（非特許文献２１、２２、２３、２４）、免疫反応を利用した抗腫瘍モノクローナル抗体療法（非特許文献２５、２６）、抗腫瘍活性の獲得を目的とした免疫細胞療法、がんワクチン療法、遺伝子改変Ｔ細胞療法等が開発されてきた（非特許文献２７、２８、２９、３０、３１、３２）。それらの日進月歩の臨床研究によって、免疫療法は新たながん治療戦略として大きな関心が寄せられている。
　特筆すべきは、１９９１年のＭＡＧＥ抗原の発見以来の潮流である。免疫療法の基礎研究は腫瘍特異抗原の発見とその細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープの同定へ大きく方向転換した。そのような背景のなかで、発明者らは世界に先立って骨肉腫特異的がん免疫療法の基礎研究と臨床研究を進めてきた。２００３年には患者由来の骨肉腫細胞株ＯＳ２０００を樹立し、患者の末梢血リンパ球と混合培養することによって、自家骨肉腫細胞と特異的に反応するＣＴＬクローンを樹立した（非特許文献３３）。また、骨肉腫細胞株に発現する遺伝子ライブラリーを構築し、これを遺伝子導入して一過性に発現させた２９３Ｔ細胞を標的細胞に用いて，ＣＴＬクローンによる細胞傷害性活性を指標としたクローニング法によって、２００４年に世界で初めて、骨肉腫特異抗原であるＰＢＦを同定した。更にＰＢＦ特異的ＨＬＡ－Ｂ５５あるいはＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＣＴＬエピトープをそれぞれ同定した（非特許文献３４、非特許文献３５、特許文献１、特許文献２）。更に２００９年にはＨＬＡ－Ａ２拘束性ＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープの同定にも成功している（非特許文献３８、特許文献３）。発明者らは、抗ＰＢＦ抗体を用いた免疫組織学的解析から、ＰＢＦの発現と骨肉腫の予後に相関があることを見出した。患者の骨肉腫生検組織の９２％にＰＢＦが発現し、そのうち、７５％の患者組織ではＰＢＦが過剰発現しており、ＰＢＦが発現している所謂ＰＢＦ陽性患者はＰＢＦが発現していない所謂ＰＢＦ陰性患者より、明らかに予後不良である事が示された（非特許文献３５）。更に骨肉腫以外のがん組織を用いたＰＢＦの発現解析では、肺がん、胃がん、乳がん、肝臓がん等でもＰＢＦの高発現が認められており、ＰＢＦはこの様な上皮系のがんに対しても有望な免疫療法の標的になる可能性が示されている（非特許文献３４）。
　発明者らが同定した骨肉腫特異抗原であるＰＢＦは分子量約５５ｋＤａ、全長５１３個のアミノ酸で構成され、核と細胞質両局在性タンパク質である。ＰＢＦはヒトパピローマウイルス（タイプ８）のプロモーター活性を制御する転写因子として最初に報告され、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒと名付けられた（非特許文献３６）。多くの転写因子やＤＮＡ結合タンパク質と同様に、ＰＢＦもジンクフィンガードメインをもち、ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３９５（ＺＮＦ３９５）とも呼ばれている。
　発明者らは、ＰＢＦはヒトパピローマウイルス（タイプ８）のプロモーター活性を制御するだけでなく、カスパーゼ９非依存的経路を介し、アポトーシス細胞死を誘導し、アポトーシス制御因子であるＳｃｙｔｈｅ／ＢＡＴ３とＰＢＦとの共局在は骨肉腫細胞の生存に重要なファクターであることを報告している（非特許文献３７）。
　発明者らは、ＰＢＦのＣＴＬエピトープペプチドを用いて、２００９年からＨＬＡ－Ａ２４及びＨＬＡ－Ａ２保持者を対象に、骨肉腫ペプチドがんワクチンの臨床試験を実施している（ＵＭＩＮ臨床試験登録システム試験ＩＤ：ＵＭＩＮ０００００１６３２、ＵＭＩＮ０００００１６３３）。
　免疫療法は患者に備わっている免疫力を賦活化させ、標的となるがん細胞あるいはウイルス感染細胞を特異的に攻撃・排除することを利用した治療方法であり、従来の治療方法にない特徴がある。これらの標的となる細胞を特異的に攻撃する中心的な役割を果たしているのが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）である。ＣＴＬが、がん細胞あるいはウイルス感染細胞といった標的細胞を認識する際には、ＣＴＬ細胞膜表面上に発現しているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が重要な役割を担っている。ＴＣＲはがん抗原やウイルス粒子そのものを直接認識するわけではなく、標的細胞の膜表面上に発現しているＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）と、腫瘍細胞の場合はがん抗原由来の、或いはウイルス感染細胞の場合はウイルス由来の８～１０個のアミノ酸からなるペプチド（エピトープペプチド）との複合体に結合することでＣＴＬは標的細胞を認識して殺傷効果を発揮する。ＨＬＡはクラスＩとクラスＩＩに大別され、ＨＬＡクラスＩとペプチドの複合体はＣＤ８陽性Ｔ細胞に発現するＴＣＲに認識され、ＨＬＡクラスＩＩとペプチドの複合体はＣＤ４陽性Ｔ細胞に発現するＴＣＲに認識されて免疫応答が惹起される。ＨＬＡクラスＩは更にＨＬＡ－Ａ，Ｂ，Ｃと呼ばれる古典的分類と、ＨＬＡ－Ｅ，Ｆ，Ｇと呼ばれる非古典的分類に区別される。現在ＩＭＧＴのＨＬＡデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）によると、ＨＬＡ－Ａは２，０４１種類、ＨＬＡ－Ｂは２，６８８種類、ＨＬＡ－Ｃは１，６７７種類のタンパク質が登録されている。しかしながら人種間で偏りがあることが知られており、例えば日本人の約６０％の人がＨＬＡ－Ａ２４を保持しており、ＨＬＡ－Ａ２は白人の５０％以上で、日本人も約２０％が保持している。ＨＬＡ－Ａ１１の保有率は日本人では約１０％であるが、東南アジアでは保有率第３位のアリルとして広い人口分布を示す。東南アジアにおけるＨＬＡ－Ａ２４、　ＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ａ１１の片アリル頻度は、それぞれ３２．１％、２４．５％、２３．７％である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｖ／ｍｈｃ／ｉｈｗｇ．ｃｇｉ）。
　これまで報告されている免疫療法の多くは、世界的にはＨＬＡ－Ａ２を対象とした臨床試験が最も多く、日本国内ではＨＬＡ－Ａ２４を対象者としている場合が多い。アジア圏では平均寿命の延伸によりさらにがん患者が増加すると予想されおり、免疫療法はこれまで以上に治療対象となるＨＬＡ型を多くすることが求められている。これは治療差別を少なくするために重要な事であると考えている。これまでに報告されたＨＬＡ－Ａ１１拘束性のＣＴＬエピトープ数は、ＨＬＡ－Ａ２やＨＬＡ－Ａ２４に比べて極端に少なく、ＨＬＡ－Ａ１１を保有する患者を対象者とした臨床試験の報告例が殆ど存在しない事からも、本発明のＨＬＡ－Ａ１１拘束性を示すＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープの同定の意義は大きいと思われる。
　前述のように、発明者らはＰＢＦのＨＬＡ－Ａ２４およびＨＬＡ－Ａ２拘束性のＣＴＬエピトープを同定し、既に骨肉腫ペプチドがんワクチンの臨床試験を実施している。しかし、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性ＣＴＬエピトープが同定されていなかったため、臨床試験にエントリーできなかったＨＬＡ－Ａ１１保持者の患者が存在している。
特許第５２８１５１５号公報 特許第４４８４７０７号公報 特許第５６０６３２２号公報
Ｈｅ　ＪＰ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｓｉａｎ　Ｐａｃ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｅｖ．　２０１４；１５（１５）：５９６７－５９７６． Ｍｉｒａｂｅｌｌｏ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．　２００９　Ａｐｒ　１；１１５（７）：１５３１－１５４３． Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ／ｏｖｅｒｖｉｅｗｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ Ｓｍｅｌａｎｄ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．　２００３　Ｍａｒ；３９（４）：４８８－４９４． Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．　２００５　Ｄｅｃ　１；２３（３４）：８８４５－８８５２． Ｌｕｅｔｋｅ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ　Ｒｅｖ．　２０１４　Ｍａｙ；４０（４）：５２３－５３２． Ｋａｇｅｒ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．　２００３　Ｍａｙ　１５；２１（１０）：２０１１－２０１８． Ｈａｒｔｉｎｇ　ＭＴ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ　Ｐｅｄｉａｔｒ　Ｓｕｒｇ．　２００６　Ｆｅｂ；１５（１）：２５－２９． Ｂａｃｃｉ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｏｎｃｏｌ．　２００８　Ｎｏｖ　１；９８（６）：４１５－４２０． Ｈｕｇｈｅｓ　ＤＰ　ｅｔ　ａｌ．．Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ．　２００９　Ｄｅｃ；６（１２）：１３１１－１３２１． Ｍａｎｋｉｎ　ＨＪ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎ　Ｏｒｔｈｏｐ　Ｒｅｌａｔ　Ｒｅｓ．　２００４　Ｄｅｃ；（４２９）：２８６－２９１． Ｐｉｃｃｉ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ．　１９９４　Ｊａｎ；４７（１）：８２－９２． Ｓｌｏｅｔ　ｖａｎ　Ｏｌｄｒｕｉｔｅｎｂｏｒｇｈ－Ｏｏｓｔｅｒｂａａｎ　ＭＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｉｊｄｓｃｈｒ　Ｄｉｅｒｇｅｎｅｅｓｋｄ．　１９９４　Ｄｅｃ　１５；１１９（２４）：７５６－７５９． Ｊａｎｅｗａｙ　ＫＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　Ｏｎｃｏｌ．　２０１０　Ｊｕｌ；１１（７）：６７０－６７８． Ｓａｖａｇｅ　ＳＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　２０１３　Ｊｕｌ；４５（７）：７９９－８０３． Ｃｏｌｅｙ，　Ｗ　ｅｔ　ａｌ．．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．　Ｓｃｉ．，　１９０６；　１３１：３７５－４３０ Ｍｏｒｔｏｎ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ．　１９７０　Ｊｕｌ；６８（１）：１５８－１６３；　ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ　１６３－４． Ｍａｔｈｅ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．　１９６７　Ｎｏｖ；３（４）：４２３－４３３． Ｈｅｒｓｈ　ＥＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．　１９７４　Ｓｅｐ；１（３）：２７３－２７８． Ｙａｍａｍｕｒａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　１９７６；２７７（００）：２０９－２２７． Ｇｒｅｓｓｅｒ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　１９６９　Ｊａｎ；３０：２３６－２４２． Ｇｒｅｓｓｅｒ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９６９　Ｍａｙ　１５；６３：５１－５７． Ｋｉｒｋｗｏｏｄ　ＪＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ　１９８５　Ｊｕｌ；１０３：３２－３６． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ＳＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９８７　Ａｐｒ　９；　３１６：　８８９－８９７． Ｍｉｌｌｅｒ　　ｅｔ　ａｌ．，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９８２　Ｍａｒ　４；３０６：５１７－５２２． Ｍｉｎａｓｉａｎ　ＬＭ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ　１９９４　Ｊａｎ　１；８３：５６－６４． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ＳＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９８５　Ｄｅｃ　５；３１３：１４８５－１４９２． Ｔａｍｕｒａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９７　Ｏｃｔ　３；２７８：１１７－１２０． Ｙｅｅ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２００２　Ｄｅｃ　１０；９９：１６１６８－１６１７３． Ｄｕｄｌｅｙ　ＭＥ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００２　Ｏｃｔ　２５；２９８：８５０－８５４． Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　２０１３　Ｍａｒ　２０；５（１７７）：１７７ｒａ３８． Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ　ＪＮ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．２０１５　Ｆｅｂ　２０；３３（６）：５４０－５４９． Ｎａｂｅｔａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｏｒｔｈｏｐ　Ｓｃｉ．２００３；８（４）：５５４－５５９． Ｔｓｕｋａｈａｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２００４　Ａｕｇ　１；６４（１５）：５４４２－５４４８． Ｔｓｕｋａｈａｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．２００８　Ｆｅｂ；９９（２）：３６８－３７５． Ｂｏｅｃｋｌｅ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００２　Ｆｅｂ　１；２９３（１）：１０３－１１７． Ｔｓｕｋａｈａｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ．２００９　Ｊａｎ；１００（１）：４７－５３． Ｔｓｕｋａｈａｒａ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．２００９　Ｊｕｎ　１２；７：４４．
　本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、ＰＢＦ陽性がんを標的とし、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性を示す細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に特異的に認識されるエピトープペプチドを同定することを目的とする。また、該ペプチドを用いたＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン、前記ＣＴＬの誘導方法、前記ＣＴＬを用いた受動免疫療法剤及びその製造方法、並びに前記ＣＴＬの定量方法及び該方法に使用するキットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく、ＰＢＦ由来の種々のペプチドについてがん抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検討を重ねた。その結果、配列番号：１、２、４又は６に記載のアミノ酸配列にて特定される、ＰＢＦ由来のペプチドが、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性のＣＴＬを誘導できることを見出した。また、配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列にて特定されるペプチドに関しては、誘導されたＣＴＬが細胞傷害性活性を示すことも確認した。さらに、これら４つのアミノ酸配列に対して相同性検索を実施したところ、これらの配列に対して高い相同性を示し、ＨＬＡ－Ａ１１分子との結合において最も重要なアミノ酸（アンカーモチーフ）を有する、配列番号：１３又は１４に記載のアミノ酸配列にて特定されるペプチドを抽出することにも成功した。本発明はこのような知見に基づいてなされたものであり、具体的な態様において、例えば以下の発明に関する。
＜１＞　配列番号：４、６、１、２、１４又は１３に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができるペプチドであって、該複合体を表面上に提示する細胞が、該複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる、ペプチド。
＜２＞　配列番号：４、６、１、２、１４又は１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができるペプチドであって、該複合体を表面上に提示する細胞が、該複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる、ペプチド。
＜３＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドをコードする核酸。
＜４＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクター。
＜５＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを有効成分として含む、ＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン。
＜６＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドをコードする核酸を有効成分として含む、ＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン。
＜７＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞を有効成分として含む、ＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン。
＜８＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、末梢血単核球を刺激して得られる細胞傷害性Ｔ細胞を含む、ＰＢＦ陽性がんに対する受動免疫療法剤。
＜９＞　＜１＞若しくは＜２＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体又は該複合体の多量体と、末梢血単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体に細胞傷害性Ｔ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞傷害性Ｔ細胞を含む、ＰＢＦ陽性がんに対する受動免疫療法剤。
＜１０＞　＜１＞若しくは＜２＞に記載のペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、末梢血単核球を刺激して細胞傷害性Ｔ細胞を取得する工程を含む、ＰＢＦ陽性がんを治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
＜１１＞　＜１＞若しくは＜２＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体又は該複合体の多量体と、末梢血単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体に細胞傷害性Ｔ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から細胞傷害性Ｔ細胞を単離する工程を含む、ＰＢＦ陽性がんを治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
＜１２＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドで末梢血単核球を刺激し、ＰＢＦ陽性がん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を取得し、該細胞傷害性Ｔ細胞が産生する、サイトカイン、ケモカイン及び細胞表面タンパク質からなる群から選択される少なくとも１の分子の量を測定する、ＰＢＦ陽性がん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
＜１３＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを使用し、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
＜１４＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを使用し、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する工程と、
　前記工程にて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を検出する工程とを含む、
　ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
＜１５＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドと末梢血単核球とを培地中で接触させ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＰＢＦ陽性がん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
＜１６＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドと末梢血単核球とを培地中で接触させ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するする工程と、
　前記工程にて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を検出する工程とを含む、
　ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
＜１７＞　＜１＞若しくは＜２＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体又は該複合体の多量体と、末梢血単核球又はがん試料とを反応させる、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
＜１８＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドを含む、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導するためのキット。
＜１９＞　＜１＞又は＜２＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体に特異的に結合する抗体。
　本発明によれば、ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬが、特異的に認識し得るＨＬＡ－Ａ１１拘束性エピトープペプチド、該ペプチドを用いたＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン、前記ＣＴＬの誘導方法、前記ＣＴＬを用いた受動免疫療法剤及びその製造方法、並びに前記ＣＴＬの定量方法及び該方法に使用するキットを提供することが可能となる。
ＭＨＣ－モノマー形成が認められる場合の代表的なゲル濾過カラム分析例を示す図である。 ＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドのフォールディングテスト結果を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（１段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（２段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（３段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（１段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（２段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（３段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（１段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（２段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（１段階目）を示す図である。 作製したＭＨＣ－テトラマー試薬によるＰＢＦ特異的ＣＴＬの検出（２段階目）を示す図である。 ＡＳＶあるいはＳＶＬ特異的ＣＴＬの交差反応性の確認 コントロールペプチドを用いた細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法の検討を示す図である。 細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法によるＰＢＦ特異的ＣＴＬ誘導の確認（配列番号：４）を示す図である。 細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法によるＰＢＦ特異的ＣＴＬ誘導の確認（配列番号：６）を示す図である。 細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法によるＰＢＦ特異的ＣＴＬ誘導の確認（配列番号：１、２）を示す図である。 ヒト骨肉腫細胞株ＨＯＳへ遺伝子導入したＨＬＡ－Ａ１１の発現を確認した結果を示すヒストグラムである。 ＰＢＦ特異的ＣＴＬ（配列番号：４）の、ＨＬＡ－Ａ１１発現ヒト骨肉腫細胞株に対する細胞傷害性活性を示すグラフである。 ＰＢＦ特異的ＣＴＬ（配列番号：６）の、ＨＬＡ－Ａ１１発現ヒト骨肉腫細胞株に対する細胞傷害性活性を示すグラフである。
　本発明についてさらに詳細に説明する。
　〔エピトープペプチド〕
　後述の実施例において示す通り、配列番号：１、２、４又は６に記載のアミノ酸配列にて特定される、ＰＢＦ由来のペプチドは、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができ、当該複合体を表面上に提示する細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できる。また、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列は、配列番号：１又は２に記載のそれと高い相同性を示し、また、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列は、配列番号：６に記載のそれと高い相同性を示す。さらに、これら高い相同性を示すアミノ酸配列は、ＨＬＡ－Ａ１１分子との結合において最も重要なアミノ酸（アンカーモチーフ）を有する。
　したがって、本発明は、配列番号：１、２、４、６、１３又は１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができるペプチドであって、該複合体を表面に提示する細胞が、該複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる、ペプチドを提供する。
　本発明において「ペプチド」は、隣接するアミノ酸残基のα－アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した分子鎖を意味する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなく、種々の長さであり得る。また、無電荷又は塩の形態であってもよく、さらに、ペプチドを構成する「アミノ酸」は、天然型であってもよく、非天然型であってもよく、アナログ（アミノ酸のＮ－アシル化物、Ｏ－アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等）であってもよい。
　また、本発明のペプチド（配列番号：１、２、４、６、１３又は１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド等、以下、エピトープペプチドとも称する）に結合し、複合体を形成することができる「ＨＬＡ－Ａ１１」とは、ヒト由来の主要組織適合性抗原（主要組織適合遺伝子複合体抗原、ＭＨＣ分子、ＭＨＣ抗原）のクラスＩａに属する分子であり、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０３、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０４等からの遺伝子産物が挙げられる。
　本発明において「細胞傷害性Ｔ細胞」とは、「ＣＴＬ」とも称する細胞であり、細胞表面蛋白質であるＣＤ８を発現しているＴ細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）であって、抗原提示細胞によって提示された抗原を認識して活性化した場合、同抗原を有する細胞に傷害を与え得る細胞である。なお、後述の実施例における記載の通り、かかる細胞傷害性活性は、免疫チェックポイント機構が抑制（解除）された状況下にて発揮し得る細胞も、本発明にかかる細胞傷害性Ｔ細胞に含まれる。また、本発明において「エピトープペプチド」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖、分化及び／又は活性化を誘導する活性を有する抗原性ポリペプチドを意味する。
　本発明のエピトープペプチドの長さとしては特に制限はないが、通常５～３０アミノ酸であり、好ましくは６～２５アミノ酸であり、より好ましくは８～２０アミノ酸であり、特に好ましくは９又は１０アミノ酸である。
　本発明において「ＰＢＦ」とは、骨肉腫特異抗原　パピローマウィルス結合因子（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ）、ＺＮＦ３９５と称されるタンパク質であって、ヒト由来のものであれば典型的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＨ０１２３７．１にて特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ００１２３７．１にて特定されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質）である。ＰＢＦタンパク質には、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうることも理解されたい。
　さらには、本発明のエピトープペプチドは、望ましい活性（後述の、ＨＬＡ－Ａ１１分子への結合活性、ＣＴＬを誘導する活性等）を保持している限り、配列番号：１、２、４、６、１３又は１４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができるペプチドであって、該複合体を表面に提示する細胞が、該複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる、ペプチドも本発明に含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、通常１０アミノ酸以内、好ましくは７アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
　また、このようなアミノ酸の改変目的としては、例えば、
　１．ＨＬＡとの親和性を高める為の変更（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ＳＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ　Ｍｅｄ．１９９８；４：３２１－３２７、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ＪＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１：２０９－２１９）、
　２．ＴＣＲの認識性を向上させる為の変更（Ｆｏｎｇ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２００１；９８：８８０９－８８１４、Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９９；５９：３０１－３０６）、
　３．血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ＪＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１：２０９－２１９、Ｐａｒｍｉａｎｉ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．２００２；９４：８０５－８１８、Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ　ＬＨ　ｅｔ　ａｌ，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；８３：３２６－３３４）等が挙げられる。
　なお、エピトープペプチドのＮ末端側から２番目と、９あるいは１０番目のアミノ酸は、それを提示するＨＬＡクラスＩ分子との結合に対して最も重要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。このアンカーモチーフは、各々のＨＬＡクラスＩ分子の種類によって異なるが、ＨＬＡ－Ａ１１分子に結合するペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＶａｌのいずれかが配置され、９あるいは１０番目の位置にＬｙｓ又はＡｒｇのいずれかが配置されたペプチドであって、９～１０個のアミノ酸からなるペプチドが最もよく知られている（Ｒａｐｉｎ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔｏｃ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；Ｃｈａｐｔｅｒ　１８：Ｕｎｉｔ　１８．１７．）。そのため、本発明のエピトープペプチドにおいても、その長さは９～１０個のアミノ酸であり、Ｎ末端より２番目、及び９又は１０番目の位置が前記特定のアミノ酸であることが好ましい。
　また、上述の目的の為にペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加的アミノ酸配列が介在するものも含まれる。さらに、本発明のエピトープペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合体等の形態として用いることができる。
　また、ＨＬＡ－Ａ１１分子とエピトープペプチドとの複合体を細胞表面に提示する細胞を、ＣＴＬが特異的に認識できる範囲内であれば、抗原ペプチドのＮ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｏｃ）基等が結合していてもよく、抗原ペプチドのＣ末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、ｔ－ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
　また、本発明のエピトープペプチドは、生体内への導入を容易にしうる各種修飾を施されたものであってもよい。生体内への導入を容易にしうる各種修飾の例としては、ＰＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメインが有名である。ＨＩＶのＰＴドメインは、Ｔａｔタンパク質の４９～５７番目のアミノ酸（Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列）で構成されたペプチドである。このＰＴドメインを目的とするタンパク質あるいはペプチドのＮ末端とＣ末端の両方、またはいずれかに付加することで、容易に細胞内に導入できることが報告されている（Ｒｙｕ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌｓ．２００３；１６：３８５－３９１、Ｋｉｍ　ＤＴ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５９：１６６６－１６６８）。
　ＨＬＡクラスＩ分子を介して提示されるほとんどの抗原は、細胞質内のプロテアソームにより分解された後、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）へと移送され、粗面小胞体内においてＴＡＰに会合しているＨＬＡクラスＩ分子と結合し、ゴルジ装置を経てエクソサイトーシスにより細胞表面へと運搬される。したがって、これら一連の抗原提示経路にて作用するシャペロンであるＨＳＰ（ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｔｅｉｎ）７０やＨＳＰ９０、またはｇｐ９６と目的とするペプチドやタンパク質を融合させることで、効率的に抗原提示させることが可能である（Ｂａｓｕ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１４：３０３－３１３）。
　また、以上のようにして改変が施されたエピトープペプチド（以下、改変ペプチドとも称する）が、生体内で望ましい活性を奏せるか否かは、例えば、以下の分析を行うことにより評価することができる。
　（１）フォールディングテスト
　ＨＬＡ－Ａ１１分子の細胞外領域及びβ２ミクログロブリン（β２ｍ）と、改変ペプチドとを試験管内の適切な溶液（フォールディング溶液）中で混合すると、ＨＬＡ－Ａ１１分子と前記ペプチドとの結合力が高ければ、当該溶液中では、これら３分子の会合反応はスムーズに進行し、３者複合体（以下、ＭＨＣ－モノマーとも称する）が形成される。そして、このＭＨＣ－モノマーは、ゲル濾過カラムで分析することによって検出することができる。一方、ＨＬＡ－Ａ１１分子と改変ペプチドとの結合力が無い場合は、ＭＨＣ－モノマーは殆ど検出されない。したがって、フォールディング溶液を経時的に分析することで、又は熱処理等を行うことで、ＨＬＡ－Ａ１１分子と改変ペプチドの結合性と安定性とを検証することが可能である。
　（２）エピトープペプチド特異的ＣＴＬの検出
　健常人から分離した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ）を適切な培地に１～３×１０６／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、これに改変ペプチドを単独にて、または数種類の改変ペプチドを混合して、例えば、１～１００μｇ／ｍＬの濃度となるように加え、９６ウェル培養プレートに１００μＬ／ウェルとなるように分注する。５％　ＣＯ２恒温槽にて３７℃で培養し、２日後にＩＬ－２を添加する。以後、ペプチドとＩＬ－２による刺激を７～１４日に１度行うことによりＣＴＬを誘導する。このようにして誘導したＣＴＬが改変ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、例えば、後述のＭＨＣ－多量体法等を用いて判定することができ、後述のＭＨＣ－多量体で染色可能なＣＴＬが検出された場合、使用した改変ペプチドはＣＴＬ誘導能を有する抗原性ペプチド（エピトープペプチド）と同定する事が可能である。
　なお、一般的に胸腺から移出したＴ細胞（ナイーブＴ細胞）は樹状細胞やマクロファージ等の抗原提示細胞による抗原刺激を受けて初めて活性化してエフェクターＴ細胞に分化する。単純にＰＢＭＣとペプチドを混合培養するこの方法では、特に人為的に調製した抗原提示細胞を用いていないため、末梢血のナイーブＴ細胞が分化している可能性は低く、ＰＢＭＣに存在していたエフェクター／メモリーＴ細胞がペプチド刺激により増殖していると考えられる。したがって、後述のＭＨＣ－モノマー又はＭＨＣ－多量体で染色可能なＣＴＬが検出された場合は、もともと供血者ＰＢＭＣにエフェクター／メモリータイプのＣＴＬが存在している事を意味しており、恒常的に抗原性ペプチドを介する免疫応答が生体内で惹起されていることを示唆している。
　〔ＭＨＣ－モノマー及びその多量体〕
　本発明においては、上述の通り、エピトープペプチドのＨＬＡ－Ａ１１分子への結合性を評価する上でも、また後述の通り、ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬの誘導、及びＣＴＬを定量化する上でも、本発明のエピトープぺプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子（その細胞外領域及びβ２ｍ）とからなる複合体（ＭＨＣ－モノマー）、並びに当該複合体の多量体（ＭＨＣ－多量体）は、有用である。
　本発明のエピトープペプチドを含む、ＭＨＣ－モノマー及びその多量体は、例えば、公知の方法（ＵＳ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｕｍｂｅｒ　５，６３５，３６３、Ｆｒｅｎｃｈ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＦＲ９９１１１３３）により調製することができる。より具体的には、タンパク質発現用の遺伝子組換え宿主から精製したＨＬＡ－Ａ１１分子の細胞外領域及びβ２ｍと、本発明のエピトープペプチドとの３者の複合体であるＭＨＣ－モノマーをフォールディング溶液内で形成させる。ここで、組換えＨＬＡ－Ａ１１分子の細胞外領域のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ－モノマー形成後この部位にビオチンを付加する。市販の色素標識されたストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣ－モノマーを所望のモル比（例えば、四量体を形成する場合は、１：４）で混合することによってＭＨＣ－多量体を製造することができる。ＭＨＣ－多量体と細胞表面タンパク質に対する抗体（例えば、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７やＣＤ４５ＲＡ等に対する抗体）と組み合わせて用いることで、ＣＴＬの分化段階を調べることができる（Ｓｅｄｅｒ　ＲＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４：８３５－８４２）。あるいは細胞内サイトカイン染色法と組み合わせることで、ＣＴＬの機能性評価に用いることも可能である。例えば、骨髄移植後のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬについては、そのＣＴＬ存在の有無を調べるだけでなく、サイトカイン産生能の強弱を調べることが、抗ウイルス薬投与等のタイミングを計るために有効であると考えられる（Ｏｚｄｅｍｉｒ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ，Ｂｌｏｏｄ　２００２；１００：３６９０－３６９７）。このように特異的なＣＴＬが認識し得るエピトープペプチドを同定し、ＭＨＣ多量体を製造すれば、特異的なＣＴＬの定量と定性が可能になり、診断情報を得る上で多大な貢献が可能になる。
　なお、本発明において、ＭＨＣ多量体を形成するＭＨＣモノマーの数としては特に制限はないが、通常２～１０であり、好ましくは４～８であり、より好ましくは４（ＭＨＣテトラマー試薬）又は５（ＭＨＣペンタマー試薬）であり、特に好ましくは４である。
　（３）培養細胞株を用いた検討
　プロテアソームによるタンパク質分解で生じたペプチド断片はＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）分子により小胞体内腔へと導かれ、ＨＬＡクラスＩ分子に結合し、細胞膜表面へ輸送される。このＴＡＰ分子を欠損した、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、内在性タンパク質の分解産物であるペプチド断片を細胞膜表面に発現できない。また、代表的なＴＡＰ遺伝子欠損細胞株であるヒトリンパ芽球様細胞株Ｔ２、あるいはＴ２にＨＬＡ－Ａ１１分子を遺伝子導入した細胞株（Ｔ２－Ａ１１）のＨＬＡ分子は、細胞膜表面上での発現が非常に不安定である。しかし、外部から供給したペプチドと結合した場合、ＨＬＡ－Ａ１１分子は細胞膜表面上で安定化する。この性質を利用して、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株は、ＨＬＡ－Ａ１１分子と外部から供給したペプチドの結合性を検証する実験に使用することが可能である。具体的には、ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株と改変ペプチドを混合培養後、抗ＨＬＡ－Ａ１１抗体で染色し、フローサイトメトリーでＨＬＡ－Ａ１１分子の発現強度の変化を算出することで、目的とするＨＬＡ－Ａ１１分子と改変ペプチドとの結合性を検討できる。ＴＡＰ遺伝子欠損細胞株が発現するＨＬＡ－Ａ１１分子に添加した改変ペプチドが結合した場合、ＨＬＡ－Ａ１１分子とペプチドの複合体は細胞膜表面上で安定化し、抗ＨＬＡ－Ａ１１抗体で染色した場合、ＨＬＡ－Ａ１１分子の発現増強が観察される。一方、添加した改変ペプチドがＨＬＡ－Ａ１１分子と結合性を示さない場合は、細胞膜表面上のＨＬＡ－Ａ１１分子は不安定であり、抗ＨＬＡ－Ａ１１抗体で染色してもＨＬＡ－Ａ１１分子の発現増強は確認されない。この様な方法を用いて、改変ペプチドのＨＬＡ－Ａ１１分子への結合性を検証することが可能である。
　また、上記ＨＬＡ－Ａ１１分子への結合活性を評価する他、後述の〔ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬの定量〕に記載の方法にて、改変ペプチドがＣＴＬを誘導する活性を有するか否かを評価することもできる。
　また、以上の改変ペプチドを含む、本発明のエピトープペプチドは、従来の各種のペプチド合成方法によって調製され得る。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコードする核酸を調製し、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することも可能である。また、市販の化学合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置）による合成も可能である。
　〔エピトープペプチドをコードする核酸等〕
　本発明には、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸、又は当該核酸を含有する発現ベクターも含まれる。
　本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、遺伝子組換え技術を用いて、当該エピトープペプチドを宿主内で産生させる為に重要である。この場合、宿主間でアミノ酸コドンの使用頻度（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）が異なる為、産生させる宿主のｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅに適合するようアミノ酸コドンを変更することが望ましい。
　また、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、ワクチンとしても重要で、むき出しの核酸として移送することも、適切なウイルスもしくは細菌ベクターを用いて移送することもできる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ＪＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　２００４；１１４：４５０－４６２、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ＪＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．　２００４；１１３：１５１５－１５２５）。適切な細菌ベクターとしては、例えばサルモネラ属亜種の細菌由来のベクターが挙げられる。適切なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、ＥＢＶベクター、ワクシニアベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクターである。適切なワクシニアベクターの１例は、改変ワクシニア・アンカラベクターである。また、本発明のベクターの好ましい態様としては、本発明のエピトープペプチドを発現し得るベクターを例示することができる。該ベクターは、通常、プロモーターの下流に本発明の核酸が機能的に連結された構造のＤＮＡ構築物を担持するベクターである。
　〔能動免疫ワクチン〕
　ペプチドワクチン
　本発明のエピトープペプチドは、能動免疫療法においてペプチドワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のエピトープペプチドを含んでなるワクチンを患者に投与し、当該ペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を認識するＣＴＬを体内で増殖させ、ＰＢＦ陽性がんに対する予防、及び治療に役立てることができる。
　使用するエピトープペプチドは１種のみの使用であっても、あるいはワクチンの使用目的に応じて２種以上のペプチドを混合又は連結して使用することもできる。
　抗原提示細胞を利用したワクチン
　本発明のエピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、能動免疫療法においてワクチンとして用いることができる。「抗原提示細胞」とは、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ある種のＴ細胞等を意味するが、該ペプチドが結合し得るＨＬＡ分子をその細胞表面上に発現する細胞であって、ＣＴＬ誘導能を有するものを意味する。
　「エピトープペプチドが提示された抗原提示細胞」とは、
　　１．適当な培養液中で、抗原提示細胞とエピトープペプチドを、例えば３０分から１時間混合して調製したエピトープペプチドパルス抗原提示細胞
　　２．エピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細胞にエピトープペプチドを提示させた細胞
　　３．人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞
を意味する。「人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞」とは、例えば脂質二重膜やプラスティックあるいはラテックス等のビーズに、ＨＬＡ－Ａ１１分子とＣＴＬエピトープペプチドとの複合体を固定し、ＣＴＬを刺激し得るＣＤ８０、ＣＤ８３やＣＤ８６等の共刺激分子を固定するか、若しくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を固定することで調製可能である（Ｏｅｌｋｅ　Ｍら，Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２００３；９：６１９－６２４、Ｗａｌｔｅｒ　Ｓら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４９７４－４９７８、Ｏｏｓｔｅｎ　ＬＥら，Ｂｌｏｏｄ　２００４；１０４：２２４－２２６）。
　遺伝子ワクチン
　本発明のエピトープペプチドをコードする核酸は、能動免疫療法においてＤＮＡワクチンや組換えウイルスベクターワクチン等に用いることができる。この場合、エピトープペプチドの核酸配列は、組換えワクチンや、組換えウイルスワクチンを産生させる宿主に適合したｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅに変更することが望ましい（Ｃａｓｉｍｉｒｏ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３；７７：６３０５－６３１３、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　ＪＡ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１４：４５０－４６２）。
　〔受動免疫療法剤〕
　本発明のエピトープペプチドは、受動免疫療法剤の調製に用いることができる。すなわち、本発明のエピトープペプチドを用い、下記のようにしてＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬを調製し、また必要に応じて純度を高める為に精製し、さらに当該細胞をヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させることによって、ＰＢＦ陽性がんに対する受動免疫療法剤とすることができる。
　〔ＣＴＬ調製方法〕
　ＣＴＬ調製方法１
　ＰＢＭＣと、適当な濃度の本発明のＭＨＣ多量体を反応させる。ＭＨＣ多量体と結合したＰＢＦ特異的ＣＴＬは標識色素により染色されるので、セルソーター、顕微鏡等を用いて染色されたＣＴＬのみを単離する。このようにして単離されたＰＢＦ特異的ＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
　ＣＴＬ調製方法２
　本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ多量体を無菌プレート等に固相化し、ＰＢＭＣを当該固相化プレートで培養する。プレートに固相化されたＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ多量体に結合したＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残ったＣＴＬだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離されたＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤や、Ｘ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
　ＣＴＬ調製方法３
　本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ多量体と、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の共刺激分子、若しくは、共刺激分子と結合するＴ細胞側のリガンドであるＣＤ２８に対してアゴニスティックに作用する抗体等を無菌プレート等に固相化し、ＰＢＭＣを固相化プレートで培養する。そして、例えば、２日後にＩＬ－２を培地に添加し５％　ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７～１４日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
　ＣＴＬ調製方法４
　ＰＢＭＣあるいはＴ細胞を本発明のエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、又は人工的に調製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。そして、例えば、刺激によって誘導されたＣＴＬを５％　ＣＯ２恒温槽にて３７℃で７～１４日培養する。エピトープペプチドとＩＬ－２、又は抗原提示細胞とＩＬ－２による刺激を週に１度繰り返すことで受動免疫療法に必要な細胞数のＣＴＬを確保する。
　なお、後述の実施例において示す通り、本発明のエピトープペプチドで直接刺激する場合において、当該ペプチドと末梢血単核球とを、培地中で接触させることが好ましく、血漿を含む培地中で接触させることがより好ましい。ＣＴＬを調製する際の培地としては特に制限はなく、公知の培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地）を適宜用いることができる。また、培地中の血漿の濃度は、１～１０％であることが好ましく、３～１０％であることがより好ましく、５～１０％であることがさらに好ましく、長期間の培養において十分な血漿量を確保し易いという観点から、５％であることが特に好ましい。
　［ＣＴＬの精製法］
　ＣＴＬ調製方法において、ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬの割合が低い場合は、随時以下の方法を用いることで当該ＣＴＬを高純度で回収することが可能である。
　ＭＨＣ－多量体による精製
　本発明のＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体と、ＣＴＬ調製方法にて誘導されたＣＴＬを反応させ、ＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体を標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識した２次抗体を用いて分離することが可能である。このような磁気標識した２次抗体と、磁気標識細胞分離装置は、例えばＤｙｎａｌ社やＭｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　ＧｍｂＨ社から入手可能である。このようにして単離されたＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
　分泌されるサイトカインによる精製
　ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬが、放出するサイトカイン等を利用して、当該ＣＴＬを精製することができる。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　ＧｍｂＨ社から入手可能なキットを用いることで、ＣＴＬから放出されるサイトカインを細胞表面で特異抗体により捕捉し、抗サイトカイン標識抗体で染色し、続いて磁気標識した標識物質特異的な抗体で反応させた後、磁気標識細胞分離装置を用いて精製することも可能である。このようにして単離されたＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
　細胞表面タンパク質特異的抗体を用いた精製
　ＣＴＬの細胞表面では、特異的刺激により発現が増強する細胞表面タンパク質（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等）が報告されている（Ｂｅｔｔｓ　ＭＲら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３；２８１：６５－７８、Ｔｒｉｍｂｌｅ　ＬＡら，Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４：７３２０－７３３０）。このような細胞表面タンパク質に対する特異抗体を磁気標識することで、磁気分離装置等を用いてＣＴＬを精製することが可能である。また、このような抗体に対する抗ＩｇＧ抗体等を磁気標識することでも同様にＣＴＬの精製が可能である。あるいは、これら抗体を培養用のプラスティックプレートにコートし、このプレートを用いて刺激を加えたＰＢＭＣを培養し、プレートに結合しなかった細胞集団を洗い流すことでＣＴＬを精製することも可能である。このようにして単離されたＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬは、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する（ＷＯ２００８／０２３７８６　参照のほど）。
　なお、このようにして調製したＣＴＬ細胞の細胞傷害性活性は、例えば、蛍光色素ＣＦＳＥ（同仁化学社）で標的細胞を標識するＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＭＢＬ社）や、標的細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）を測定するＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）等を利用して測定することも可能である。また、放射性同位元素である５１Ｃｒで標的細胞を標識して利用するクロムリリースアッセイにより測定することが可能である。
　［ＣＴＬ誘導キット］
　本発明においては、上述の様々な方法において有用な、本発明のエピトープペプチドを含む、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導するためのキットも提供される。
　かかるキットにおいては、本発明のエピトープペプチドは、ＭＨＣモノマー、ＭＨＣ－多量体、当該ペプチドが提示された抗原提示細胞の態様にて含まれていてもよい。また、本発明のエピトープペプチドの他、当該ペプチドと反応させるＰＢＭＣ、当該ペプチドを検出するための試薬（色素、２次抗体）を、本発明のキットに含めてもよく、さらに、ＰＢＭＣ又は誘導されたＣＴＬを培養するための培地、ＣＴＬを増幅するためのＴ細胞刺激薬剤等を含んでいてもよい。
　［がんワクチン及び抗がん剤、並びにその利用］
　上述の通り、本発明のエピトープペプチド、当該ペプチドをコードする核酸、及び当該ペプチドが提示された抗原提示細胞は、ＰＢＦ陽性がんに対する能動免疫療法において有用である。また、前記抗原提示細胞等によって誘導されたＣＴＬは、ＰＢＦ陽性がんに対する受動免疫療法において有用である。
　したがって、本発明は、本発明のエピトープペプチド等を含むがんワクチン及び本発明のＣＴＬ細胞を有効成分として含有する抗がん剤（以下、抗がん剤等とも総称する）を提供することもできる。
　本発明の抗がん剤等の治療又は予防の対象となる「ＰＢＦ陽性がん」としては、ＰＢＦを発現しているものであればよく、例えば、骨肉腫、肺がん、胃がん、乳がん、肝臓がんが挙げられる。
　また、本発明の抗がん剤等に含まれる細胞（抗原提示細胞及びＣＴＬ）は、各々独立して、当該薬剤が投与される対象に由来するもの（自家）であってもよく、また前記対象とＨＬＡの型が適合する同種異系の関係でもあってもよい。
　本発明の抗がん剤等は、本発明のエピトープペプチド、細胞に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよく、当分野において公知の方法を用いて製剤化することができる。例えば、かかる抗がん剤等としては、本発明のエピトープペプチドを有効成分として含有する注射剤又は固形剤等がある。エピトープペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸等の無機塩、又は、酢酸、酒石酸等の有機酸が挙げられる。また、本発明の抗原提示細胞又はＣＴＬは、製薬上許容され、該ペプチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、液体培地、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）、及びその他のアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ＫＬＨ、ＭＰＬ、ＱＳ２１、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、ＢＣＧ、ミョウバン、ＣｐＧ　ＤＮＡ等のＴＬＲのアゴニスト）等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、上記アジュバント以外にも、免疫増強剤として、各種サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮω、Ｆｌｔ３リガンド）を添加してもよい。
　本発明の抗がん剤等は、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、一般的には非経口投与が好ましい。非経口投与としては経鼻投与や皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射、患部局所注射等の注射剤、座薬等がある。また、経口投与としては、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
　本発明の抗がん剤等は、がんの治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。また、本発明の抗がん剤は、通常ヒトを対象として使用するものだが、他の動物（種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等）を対象とすることができる。また、本発明の抗がん剤等を投与される対象としては特に制限されることなく、ＰＢＦ陽性がんを罹患しているもののみならず、罹患していないものであってもよい。例えば、当該がんの再発予防という観点から、外科的手術、化学療法、放射線療法等によって癌を治療したものであってもよい。
　本発明の抗がん剤等は、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投与量は、患者一人当たり、エピトープペプチドは１～１００ｍｇ、当該ペプチドが提示された抗原提示細胞又はＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬでは１０６～１０９個の含有量とする。また、投与間隔は、対象、目的により設定することができる。
　また、後述の実施例において示す通り、免疫寛容機構によるＣＴＬの免疫学的不応答性を解除するという観点から、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体等の免疫チェックポイント阻害剤を併用することも、必要に応じて行うこともできる。
　本発明は、このように、本発明の抗がん剤等を対象に投与させることを特徴とする、対象におけるＰＢＦ陽性がんの治療又は予防するための方法をも提供する。
　本発明の抗がん剤等の製品又はその説明書は、がんの治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。がんの治療又は予防に用いられる旨の表示においては、本発明のエピトープポリペプチド、該ペプチドが提示された抗原提示細胞、又は前記抗原提示細胞等によって誘導されたＣＴＬによって、がんの増殖抑制、細胞死等が誘導される機序についての情報を含むことができる。
　〔ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬの定量〕
　ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬが、がん患者の末梢血あるいは腫瘍局所に存在するか否か、あるいはその量の変動を知ることは、ワクチン投与量、接種の回数、接種の間隔等を決定する上で非常に重要である。本発明のエピトープペプチドを用いて調製されたワクチンあるいは受動免疫療法剤を投与された患者においてＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬを定量的に測定する事は、ワクチンや受動免疫療法剤の効果成分を測定する事と同じ意味である。更に、本発明で提供される受動免疫療法剤の調製工程及び最終的な製剤の有効成分量を測定する品質検定においても重要である。ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬの定量は、本発明のエピトープペプチドを用いた以下の３つの方法によって行うことができる。
　定量方法１（ＭＨＣ－多量体法等）
　本発明のエピトープペプチドを使用して製造したＭＨＣ－モノマー及び／又はＭＨＣ－多量体（以下、ＭＨＣ－多量体等とも総称する）を用いて、末梢血中のＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬを定量することができる。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。末梢血、ＰＢＭＣ又はがん試料を、適当な濃度のＭＨＣ－多量体等と反応させる。該ＭＨＣ－多量体等と結合したＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。ＭＨＣ－多量体等と反応させる時に、ＭＨＣ－多量体等と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を反応させることで、ＰＢＦ陽性がんを標的とするＣＴＬのＴ細胞サブセットも同時に判定できる。
　本発明において「がん試料」とは、外科的手術又は生検等により単離されたがん細胞を含む試料を意味し、がん細胞のみで構成される腫瘍組織であってもよく、また当該腫瘍組織周辺の非がん細胞を含む組織であってもよい。さらに腫瘍組織浸潤リンパ球であってもよい。なお、腫瘍組織浸潤リンパ球とは、がんを罹患している対象から切除した腫瘍組織中又は採取した胸腹水中から分離したリンパ球のことを意味する。
　定量方法２
　ＰＢＭＣを本発明のエピトープペプチドで刺激することによってＣＴＬが産生するＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）、インターロイキン等のサイトカイン及び／又はケモカインを定量する方法である。以下にＩＦＮγを例にとり具体的に方法を示す。
　２－１　サイトカイン定量による方法１（細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法）
　ＰＢＭＣを適当な培地におよそ２×１０６／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、本発明のエピトープペプチドを加える。さらに細胞内タンパク質輸送阻止剤（例えば、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ　ＡやＭｏｎｅｎｓｉｎ等）を加え、５％　ＣＯ２恒温槽にて３７℃で５～１６時間培養する。培養後、Ｔ細胞マーカー抗体（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体）あるいは、ＭＨＣ－多量体等と反応させ、細胞を固定後、膜透過処理を行い、色素標識抗ＩＦＮγ抗体を反応させる。フローサイトメーター等を用いて解析し、全細胞中、Ｔ細胞中あるいはＭＨＣ－多量体等陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率を定量する。
　２－２　サイトカイン定量による方法２（エリスポットアッセイ）
　抗ＩＦＮγ抗体を固相化した９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＨＡプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にＰＢＭＣをまく。その後、本発明のエピトープペプチドを各ウェルに入れ３７℃の５％　ＣＯ２恒温槽培養器にて２０時間培養する。翌日、プレートを洗浄し、抗ＩＦＮγ抗体、ペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧ抗体の順で反応させる。さらにペルオキシダーゼの基質を加え、発色によりＩＦＮγスポットを可視化し、実体顕微鏡かＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ．社）を用いてカウントすることで定量する。
　２－３　サイトカイン定量による方法３（培養上清中に分泌されたＩＦＮγを定量する方法）
　ＰＢＭＣを適当な培地におよそ２×１０６／ｍＬの細胞濃度で浮遊させ、本発明のエピトープペプチドを加える。５％　ＣＯ２恒温槽にて３７℃で２４～４８時間培養する。培養後、培養上清に含まれるＩＦＮγ濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（例えばＲ＆Ｄシステムズ社のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮγ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を使用して定量する。
　定量方法３
　細胞表面タンパク質特異抗体を用いて定量を行う。本発明のエピトープペプチドを特異的に認識するＣＴＬは、当該ペプチドとの結合により刺激され、細胞表面タンパク質（例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ６３、ＣＤ６９等）の発現が増強することが報告されている。したがって、本発明のエピトープペプチド等で刺激したＰＢＭＣと細胞表面タンパク質を特異的に認識する標識抗体を混合することで、ＣＴＬは標識抗体と結合し、標識色素により染色される。染色されたＣＴＬは、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントし、定量することができる。さらに、標識抗体と異なる色素で標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体等を加えることで、ＣＴＬのＴ細胞サブセットも同時に判定できる。
　〔エピトープペプチド－ＨＬＡ複合体に特異的な抗体〕
　本発明のエピトープペプチドとＨＬＡ分子の細胞外領域及びβ２ｍとからなる複合体（ＭＨＣ－モノマー）に特異的なモノクローナル抗体（以下、ｐＭＨＣ抗体とも称する）は、本発明のエピトープペプチドを細胞膜表面に提示するがん細胞や抗原提示細胞を特異的に検出することができる。このため、ｐＭＨＣ抗体はがん免疫療法の診断薬として使用できるほか、抗体依存性細胞傷害性活性（以下、ＡＤＣＣ活性とも称する）や抗がん剤を結合させること等により、特異性の高い治療用抗体としても有用性がある。
　ｐＭＨＣ抗体の取得は一般的に、ファージディスプレイ法によって行われる。ファージディスプレイ法とは、ファージの感染力を失わせないように外来遺伝子を融合タンパク質として発現させるシステムのことである。これを利用し、ファージに抗体可変領域を発現させスクリーニングすることで、特異的なモノクローナル抗体を分離できることが知られている（Ｔｓｕｋａｈａｒａ　Ｔら，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２０１４；２８９：２２０３５－２２０４７）。より具体的には、ｐＭＨＣ抗体の取得は、抗体ライブラリーの作製、パニング、抗体の単離、評価といった流れで行われる。パニングには、本発明のエピトープペプチドとＨＬＡ分子の細胞外領域及びβ２ｍとの複合体をＥＬＩＳＡプレート等に固相化、あるいはビオチン－アビジン結合で固定したものを使用し、これにファージライブラリーを反応させ、洗浄・溶出を繰り返すことで、本発明のエピトープペプチドとＨＬＡ分子の細胞外領域及びβ２ｍとの複合体に特異的な、結合力の高い抗体を単離できる。得られた抗体は、前述のＴＡＰ遺伝子欠損株Ｔ２にエピトープペプチドを添加し、抗体を反応させ、ＦＣＭで平均蛍光強度を測定すること等により評価可能である。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に断りがない限り、実験法は成書（免疫実験操作法、右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之、南江堂　１９９５）を参考に行った。
　ＨＬＡ－Ａ１１保持者を対象とした、骨肉腫等の悪性腫瘍に対する免疫療法等を提供すべく、当該療法等に有用な、ＨＬＡ－Ａ１１拘束性を示す細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するためのエピトープペプチド（ＣＴＬエピトープペプチド）の同定を、骨肉腫特異抗原であるＰＢＦを対象として試みた。
　すなわち先ず、後述のフォールディングテスト等にて評価すべく、ＰＢＦの配列から表１に記載の９種の配列を任意に選択して合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、表１に、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの特徴を示す。また、表２に後述のコントロールとして用いるペプチドについても示す。陽性コントロール用のペプチドとして、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のｐｐ６５タンパク質由来のＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性エピトープペプチドを用い、陰性コントロール用のペプチドとしては、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性エピトープペプチドを用いた。また、表中の「ペプチド名」は、各ペプチドのＮ末端側からの３アミノ酸に基づき決定した。「位置」は、ＰＢＦ等の由来タンパク質のアミノ酸配列上の位置を示す。
　そして、表１に記載の９種の配列から生体内で機能するＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープを選抜すべく、以下に示す（１）及び（２）の試験を行った。
（１）フォールディングテスト
（２）エピトープペプチド特異的ＣＴＬの検出
　〔フォールディングテスト〕
　発明者らは、表１及び２に記載した１１種類のペプチドを化学的に合成し、フォールディングテストを実施した。具体的には、大腸菌発現系を利用して発現精製したＨＬＡ－Ａ＊１１：０１及びβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）と、合成ペプチドとをフォールディング溶液に添加して混合後、フォールディング溶液を経時的に分取してゲル濾過カラムにて分析を行った。ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１とβ２ｍとＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドとの３者複合体（ＭＨＣ－モノマー）の形成が認められる場合、ＭＨＣ－モノマーは原料よりも分子量が大きいため、ゲル濾過カラム分析での溶出時間が早くなる。また、ＭＨＣ－モノマー形成量は、２８０ｎｍの吸収波長によって得られるピーク面積から算出可能である。一方、ＨＬＡ分子との結合性の無い候補ペプチドではＭＨＣ－モノマー形成が確認されない。ＭＨＣ－モノマー形成が認められる場合の代表的なゲル濾過カラム分析例を図１に示す。
　ゲル濾過カラム分析に際しては、ＨＬＡ分子とβ２ｍは、大腸菌発現系では封入体となるため、不溶性画分として精製した後、８Ｍ尿素に可溶化させ用いた。また、当該分析の結果において、難溶性であるＨＬＡ分子は、ＭＨＣ－モノマー形成に至らないものが凝集体として７～８分に検出される。但し、凝集体の多くはゲル濾過カラム分析の前処理工程であるフィルター濾過により大部分が除去されている。β２ｍは、可溶性タンパク質であり、フォールディング溶液中で可溶化され、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５　１０／３００ＧＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をゲル濾過カラムに用いた場合、１４分付近に検出される。１５分以降にはフォールディング溶液の組成物やペプチドが検出される。フォールディングテスト開始直後（ｄａｙ　０）では１０分付近にＭＨＣ－モノマーのピークは確認されないが、１日後（ｄａｙ　１）、３日後（ｄａｙ　３）とピークが大きくなり、ＭＨＣ－モノマー形成が順調に進行している事が、図１において示されている。
　図２に、このようにして、９種類のペプチドに対して実施したフォールディングテストの１、３、７日後の分析結果を示す。なお、同図においては、ＭＨＣ－モノマー形成を示すピークの面積を棒グラフにて示してある。
　図２に示した結果から明らかな通り、ＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド（配列番号：１～９）は、陰性コントロールと比較して、十分なＭＨＣ－モノマー形成が認められた。
　〔ＰＢＦ特異的ＭＨＣ－テトラマー試薬の製造〕
　次に、後述の［ＰＢＦ特異的ＣＴＬの確認］に用いるため、フォールディングテストの結果に基づき、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１結合性のＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドを用いて、蛍光色素（ＰＥ）標識ＭＨＣ－テトラマー試薬を製造した。具体的には、先ず、タンパク質発現用の遺伝子組換え宿主から精製したＨＬＡクラスＩ分子、β２ｍ及びＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの複合体であるＭＨＣ－モノマーを適切なフォールディング溶液中で形成させる。なお、組換えＨＬＡクラスＩ分子のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ－モノマー形成後この部位にビオチンを付加する。そして、市販のＰＥ標識されたストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣ－モノマーをモル比１：４で混合することによってＭＨＣ－テトラマー試薬を製造した。本実施例で製造したＭＨＣ－テトラマー試薬は例えば、ＡＳＶ－Ｔｅｔと略号で示すが、これは、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１とＡＳＶペプチドとβ２ｍの３者複合体を用いて製造されたＭＨＣ－テトラマー試薬を示す。
　〔エピトープペプチド特異的ＣＴＬの検出〕
　上述の通り、ＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドとして、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１に対して結合モチーフを有する９種類のペプチドを選択した。更にフォールディングテストにより、試験管内でＨＬＡ－Ａ＊１１：０１とβ２ｍと９種類のＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチド各々とが結合し、ＭＨＣ－モノマーを形成する事が判明した。
　次に、これらＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドとＨＬＡ－Ａ＊１１：０１との複合体を認識するＣＴＬが、生体内に存在するかどうかを確認するためには、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を保持する供血者の末梢血を用いて、末梢血中に存在するＰＢＦ特異的ＣＴＬを増幅する事が可能であるかどうかを検討する必要がある。
　供血者がＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を保持するかどうかは、ジェノサーチＨＬＡ－Ａ　Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ社）を用いてＨＬＡ－Ａの遺伝子型判定にて確認した上で、以降の検討を、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を保有する５名の健康成人由来のＰＢＭＣを用いて行った。
　ＭＬＰＣ（混合リンパ球ペプチド培養）法
　ＭＬＰＣ法は、ＰＢＭＣ培養液中にペプチドを添加してＣＴＬを誘導する方法である（Ｋａｒａｎｉｋａｓ　Ｖら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４８９８－４９０４、Ｔｓｕｋａｈａｒａ　Ｔら，Ｊ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．２００９；７：４４）。ＰＢＭＣ中に存在する抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ある種のＴ細胞にペプチドが提示され、ＰＢＭＣに含まれるメモリータイプのペプチド特異的ＣＴＬが刺激を受けて増殖すると考えられる。後述の抗原提示細胞を利用した誘導法と異なり、前もって抗原提示細胞を調製する必要が無い点で区別され、簡便に実施できることが利点である。あえて抗原提示細胞を利用しない事で末梢血中を循環しているメモリー／エフェクター型のＣＴＬを刺激増殖させるシステムである。
　そこで先ず、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を保有する健康成人より採血した末梢血を３，０００ｒｐｍで５～１０分間遠心処理し、上清の血漿部分を回収した。血漿部分以外は従来法である密度勾配遠心法にてＰＢＭＣを分離した。
　なお、ＣＴＬ誘導用の培地として、ＲＰＭＩ１６４０　Ｈｅｐｅｓ　ｍｏｄｉｆｙ（Ｓｉｇｍａ社）に、０．１％　２－メルカプトエタノール、１％　Ｌ－グルタミン、抗生物質として１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンと１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンを加え、さらに前記血漿を５％になるよう添加して調製し、使用した。
　そして、１０ｍＬのこの培地に約３×１０７個の前記ＰＢＭＣを浮遊させた。これに９種類のＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープ候補ペプチドの内、３～５種類のペプチドをそれぞれ１０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。ペプチドの濃度は、ペプチドの溶解度に応じて変更できるが、本実施例においては１０μｇ／ｍＬにて実施した。ＰＢＭＣとペプチドの混合培養は、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレート（ＢＥＣＴＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）を用いた。細胞は３７℃、５％　ＣＯ２恒温槽にて培養した。２日後に２０～１００Ｕ／ｍＬの最終濃度でＩＬ－２の添加を行った。その後適宜ＩＬ－２添加ＣＴＬ誘導培地の交換を行った。ＰＢＦ特異的ＣＴＬの確認は、培養２週間を目処に実施した。ＰＢＦ特異的ＣＴＬの誘導が確認できた場合は、ペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激し、または直接ペプチドで刺激し、ＣＴＬラインの樹立を試みた。
　〔ＰＢＦ特異的ＣＴＬの確認〕
　前述の方法で培養した細胞集団にＰＢＦ特異的なＣＴＬが存在するか否かの検討は、上記にて調製したＭＨＣ－テトラマーを用いて実施した（ＭＨＣ－テトラマー法）。培養後、適量の細胞数に対して１０μＬのＰＥ標識ＭＨＣ－テトラマー試薬と、２０μＬのＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識Ｔ細胞表面抗体（ＣＤ８）等を加えた。その後、穏やかに混合し２～８℃で６０分間または、室温にて３０分間静置した。１．５ｍＬのＰＢＳを加え攪拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＰＢＳに再懸濁した。この際、死細胞による非特異的な蛍光を除外するために、７－ＡＡＤ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｄｙｅ（死細胞検出試薬、ＭＢＬ社）を加えた。２４時間以内にフローサイトメーターにて解析した。
　ＰＢＦ特異的ＣＴＬの確認は３段階で行った。１段階目は、３～５種類の混合ペプチドで誘導し、２週間後、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートの各縦列（Ｌａｎｅ）毎に、８ウェルそれぞれの一部の細胞を回収し、これを混合して１サンプルとしてプールし（レーンプール）、誘導用ペプチドに相応した３～５種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬を用いて陽性細胞集団が検出されるＬａｎｅを同定した。２段階目は、１段階目でＰＢＦ特異的ＣＴＬの誘導が確認されたＬａｎｅにおいて、縦列の８個のウェルの細胞を個別に回収して誘導用ペプチドに相応した３～５種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬で陽性細胞集団が検出されるウェルを同定した。３段階目は、２段階目で同定されたウェルの細胞集団がどのペプチドに対して特異性があるのか検証するために、それぞれのＭＨＣ－テトラマー試薬を用いて別々に検出を実施し、陽性細胞が検出されるＭＨＣ－テトラマー試薬を特定した。この様な方法を用いることで、９６ウェルＵ底細胞培養用マイクロテストプレートの何処のウェルに、どのペプチドに対して特異性を有するＰＢＦ特異的ＣＴＬが誘導されているかを確認した。
　図３にＭＬＰＣ法にてＰＢＦ特異的ＣＴＬを誘導後、１段階目の確認を行った代表的な結果を示す。すなわち、表１に記載したＣＴＬエピトープ候補ペプチドＱＶＡ、ＬＳＡ及びＳＬＰの３種類のペプチドを混合し、３名の健康成人（Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　及びＤｏｎｏｒ　Ｃ）のＰＢＭＣにそれぞれ添加して約２週間培養した。２週間後にレーンプールを調整し（Ｌａｎｅ　１～１２）、３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＱＶＡ－Ｔｅｔ、ＬＳＡ－Ｔｅｔ及びＳＬＰ－Ｔｅｔ）とＣＤ８－ＦＩＴＣとで染色して、解析した結果を図３に示す。
　図３において、ドットプロット展開図中の数字は、展開図を四分割した領域を、ＵＬ（左上）、ＵＲ（右上）、ＬＬ（左下）、ＬＲ（右下）と表記した場合、（ＵＲ＋ＬＲ）分のＵＲの百分率を示す。Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＭＨＣ－テトラマー混合試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で示す。
　図３に示す通り、Ｄｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ１０のＵＲに、明らかなＣＤ８陽性かつ３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬に陽性の細胞集団が検出された。この事は、ＣＴＬ誘導に使用した３種類の混合ペプチドのうち、少なくとも１種類以上の候補ペプチドに対して特異的に反応して増殖するメモリータイプのＰＢＦ特異的ＣＴＬが、Ｄｏｎｏｒ　Ｃの末梢血に存在した事を示している。
　次に２段階目の分析を実施した結果を図４に示す。Ｄｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　１０の各ウェル（１０－Ａ～１０－Ｈ）、合計８ウェルの細胞集団を個別に回収し、同様に３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＱＶＡ－Ｔｅｔ、ＬＳＡ－Ｔｅｔ及びＳＬＰ－Ｔｅｔ）とＣＤ８－ＦＩＴＣで染色した。その結果、Ｄｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　１０のＧウェル（１０－Ｇ）で特異的ＣＴＬが検出された。
　次に３段階目の分析結果を図５に示す。誘導に用いた３種類のペプチドの内、どのペプチドに対して特異性のあるＣＴＬなのか検証するために、Ｄｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　１０のＧウェル（１０－Ｇ）の細胞集団を３種類のそれぞれのＭＨＣ－テトラマー試薬を用いて個別に検出を実施した。その結果、ＬＳＡ－Ｔｅｔで染色した場合のみ、陽性の細胞集団が検出された。より具体的には、３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＱＶＡ－Ｔｅｔ、ＬＳＡ－Ｔｅｔ及びＳＬＰ－Ｔｅｔ）で染色した場合に３．００％の陽性細胞が検出されたのに対して、ＬＳＡ－Ｔｅｔ単独で染色した場合に、ほぼ同程度の陽性率（２．４７％）でＬＳＡ－Ｔｅｔ陽性細胞が検出された。一方、ＱＶＡ－ＴｅｔとＳＬＰ－Ｔｅｔで染色した場合は陽性細胞が検出されなかった。この事からＬＳＡ（配列番号：６）はＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性を示すＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることが示された。
　上記と同様の３段階分析手法を用いて、表１に記載したＣＴＬエピトープ候補ペプチドＱＶＡ、ＱＶＴ、ＫＶＬ、ＳＳＬ及びＳＬＰの５種類のペプチドを混合し、２名の健康成人（Ｄｏｎｏｒ　Ｄ及びＤｏｎｏｒ　Ｅ）のＰＢＭＣにそれぞれ添加し、約２週間培養した。２週間後にレーンプールを調整し（Ｌａｎｅ　１～１２）、５種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＱＶＡ－Ｔｅｔ、ＱＶＴ－Ｔｅｔ、ＫＶＬ－Ｔｅｔ、ＳＳＬ－Ｔｅｔ及びＳＬＰ－Ｔｅｔ）とＣＤ８－ＦＩＴＣで染色した結果を図６に示す。その結果、Ｄｏｎｏｒ　ＤのＬａｎｅ　７とＤｏｎｏｒ　ＥのＬａｎｅ　２のＵＲに、明らかなＣＤ８陽性かつ５種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬陽性の細胞集団が検出された。
　次に、それぞれの陽性Ｌａｎｅの各ウェル（Ａ～Ｈ）、合計１６ウェルの細胞集団を個別に回収し、同様に５種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬とＣＤ８－ＦＩＴＣで染色した２段階目の検討結果を図７に示す。その結果、Ｄｏｎｏｒ　ＤのＬａｎｅ　７ではＢウェル（７－Ｂ）で、Ｄｏｎｏｒ　ＥのＬａｎｅ　２ではＣウェル（２－Ｃ）で特異的ＣＴＬが検出された。
　さらに図８では、それぞれのＭＨＣ－テトラマー試薬を用いて個別に染色を実施した３段階目の分析の結果を示す。図８に示した結果から明らかな通り、ＱＶＴ－Ｔｅｔ単独で染色したのみに陽性細胞集団が検出された。より具体的には、５種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＱＶＡ－Ｔｅｔ、ＱＶＴ－Ｔｅｔ、ＫＶＬ－Ｔｅｔ、ＳＳＬ－Ｔｅｔ及びＳＬＰ－Ｔｅｔ）で染色した場合の陽性率と比較して、ＱＶＴ－Ｔｅｔ単独で染色した場合の陽性率はほぼ同程度であった。一方、ＱＶＡ－Ｔｅｔ、ＫＶＬ－Ｔｅｔ、ＳＳＬ－Ｔｅｔ及びＳＬＰ－Ｔｅｔでは全く陽性細胞が検出されなかったことから、ＱＶＴ（配列番号：４）はＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性を示すＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることが示された。
　次に発明者らはＡＳＶ、ＱＶＴ及びＳＡＬの３種類のペプチドを混合し、３名の健康成人（Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　Ｂ及びＤｏｎｏｒ　Ｃ）のＰＢＭＣにそれぞれ添加して約２週間培養した。２週間後にレーンプールを調整し（Ｌａｎｅ　１～１２）、３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＡＳＶ－Ｔｅｔ、ＱＶＴ－Ｔｅｔ及びＳＡＬ－Ｔｅｔ）とＣＤ８－ＦＩＴＣで染色した結果を図９に示す。その結果、Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　Ｂ及びＤｏｎｏｒ　Ｃの全てのＬａｎｅのＵＲに明らかなＣＤ８陽性かつ３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬陽性の細胞集団が検出された。陽性頻度が高いため、２段階目で実施していた陽性ウェルの同定を省略し、任意にＤｏｎｏｒ　ＡのＬａｎｅ　７、Ｄｏｎｏｒ　ＢのＬａｎｅ　４及びＤｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　４を選択して個別のＭＨＣ－テトラマー試薬を用いた染色を実施した結果を図１０に示す。その結果、ＡＳＶ－Ｔｅｔ単独で染色した場合にのみ陽性細胞集団が確認された。３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＡＳＶ－Ｔｅｔ、ＱＶＴ－Ｔｅｔ及びＳＡＬ－Ｔｅｔ）で染色した場合にＤｏｎｏｒ　ＡのＬａｎｅ　７の陽性率は９．０２％、Ｄｏｎｏｒ　ＢのＬａｎｅ　４の陽性率は３６．３６％、Ｄｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　４の陽性率は１３．８４％の陽性率であったのに対して、ＡＳＶ－Ｔｅｔ単独で染色した場合の陽性率は、それぞれ、９．１３％、３６．３３％、１３．７４％とほぼ同等であった。一方、ＱＶＴ－Ｔｅｔ及びＳＡＬ－Ｔｅｔでは全く陽性細胞が検出されなかったことから、ＡＳＶ（配列番号：１）はＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性を示すＣＴＬを誘導し、Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　Ｂ及びＤｏｎｏｒ　Ｃの末梢血にメモリータイプのＣＴＬが存在した事を示している。
　しかし、発明者らのこれまでの経験では、通常９６ウェルのＭＬＰＣ法にてがん抗原特異的ＣＴＬが検出できる限界は、誘導前のＣＤ８陽性細胞率を１０～２０％と仮定した場合、１～３×１０－７となる。言い換えると、９６ウェルのＭＬＰＣ法において、検出される特異的ＣＴＬの標準的な割合は、９６ウェルプレート１枚につき１個～３個ウェルである。本発明でも図３と図６に示した通り、ＭＨＣ－テトラマー混合試薬で陽性に検出されるＬａｎｅは一つであり、図９で示したように、全てのＬａｎｅのＵＲに明らかなＣＤ８陽性テトラマー陽性の細胞集団が検出される現象は自己抗原であるがん抗原においては非常に珍しいことである。
　次に発明者らは、ＳＶＬ、ＫＶＬ及びＳＳＬの３種類のペプチドを混合し、３名の健康成人（Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　Ｂ及びＤｏｎｏｒ　Ｃ）のＰＢＭＣにそれぞれ添加して約２週間培養した。２週間後にレーンプールを調整し（Ｌａｎｅ　１～１２）、３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬（ＳＶＬ－Ｔｅｔ、ＫＶＬ－Ｔｅｔ及びＳＳＬ－Ｔｅｔ）とＣＤ８－ＦＩＴＣで染色した結果を図１１に示す。その結果、前述の図９の結果よりも陽性率が低いものの、高頻度で各ＬａｎｅのＵＲにＣＤ８陽性かつ３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬陽性の細胞集団が検出されたため、前述の様に２段階解析手法で解析を試みた。その結果は図１２（２段階目）に示す。図１２に示す通り、Ｄｏｎｏｒ　ＡのＬａｎｅ　６、Ｄｏｎｏｒ　ＢのＬａｎｅ　１１及びＤｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　６を任意の陽性Ｌａｎｅとして選択し、それぞれのＭＨＣ－テトラマー試薬を用いて個別に染色を実施した結果、ＳＶＬ－Ｔｅｔ単独で染色した場合のみにおいて陽性細胞集団が確認された。３種類のＭＨＣ－テトラマー混合試薬で染色した場合にＤｏｎｏｒ　ＡのＬａｎｅ　６の陽性率は１．１９％、Ｄｏｎｏｒ　ＢのＬａｎｅ　１１の陽性率は６．７６％、Ｄｏｎｏｒ　ＣのＬａｎｅ　６の陽性率は１．４９％であったのに対し、ＳＶＬ－Ｔｅｔ単独で染色した場合の陽性率は、それぞれ１．６７％、６．４８％、２．０２％でほぼ同程度であった。一方、ＫＶＬ－Ｔｅｔ及びＳＳＬ－Ｔｅｔでは全く陽性細胞が検出されなかったことから、ＳＶＬ（配列番号：２）はＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性を示すＣＴＬを誘導し、Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　Ｂ及びＤｏｎｏｒ　Ｃの末梢血にメモリータイプのＣＴＬが存在した事を示している。
　ＳＶＬＳＲＲＬＧＫ（配列番号：２）はＡＳＶＬＳＲＲＬＧＫ（配列番号：１）のＮ末端側の一つのアミノ酸Ａｌａが欠失したペプチドである。そこで、ＡＳＶとＳＶＬの関係性をＡＳＶ特異的ＣＴＬとＳＶＬ特異的ＣＴＬを用いて検証した。同一のＤｏｎｏｒ末梢血ＰＢＭＣにＡＳＶあるいはＳＶＬのペプチドを添加し、約２週間の培養により、それぞれのペプチドに特異的なＣＴＬを誘導し、ＡＳＶ－ＴｅｔとＳＶＬ－Ｔｅｔの交差反応性を確認した結果を図１３に示す。
　図１３に示した結果から明らかな通り、ＡＳＶで誘導したＡＳＶ特異的ＣＴＬはＡＳＶ－Ｔｅｔで染色した場合、１５．３３％の陽性率であったが、同じ細胞集団をＳＶＬ－Ｔｅｔで染色した場合は１１．４７％の陽性率でＳＶＬ特異的ＣＴＬが検出された。逆にＳＶＬで誘導したＳＶＬ特異的ＣＴＬはＳＶＬ－Ｔｅｔで検出した場合に５．６７％の陽性率であったが、同じ細胞集団をＡＳＶ－Ｔｅｔで検出した場合は、１１．０１％の割合でＡＳＶ特異的ＣＴＬが検出された。誘導に用いたＳＶＬに対する特異的ＣＴＬよりも誘導に用いていないＡＳＶに対する特異的ＣＴＬがより高頻度に存在すること、及びＳＶＬ特異的ＣＴＬをＡＳＶ－Ｔｅｔで検出された細胞集団が、ＳＶＬ－Ｔｅｔで検出された細胞集団よりも蛍光強度が強く検出されたことから、ＳＶＬはＡＳＶよりもメモリーＴ細胞に対する免疫賦活作用が弱く、生体内では、ＡＳＶがＨＬＡ－Ａ＊１１：０１に提示されている事を強く示していると考えられる。この事は図９と図１１で同一ＤｏｎｏｒのＰＢＭＣから誘導実験であるにも関わらず、図９で示されたテトラマー陽性細胞の出現頻度が図１１よりも高い事からも明らかである。
　〔抗原提示細胞を用いた特異的ＣＴＬの増幅〕
　発明者らは個別のＭＨＣ－テトラマー試薬で陽性像が検出されたウェル中のＰＢＦ特異的ＣＴＬを増幅培養する為に、抗原提示細胞（ＥＢＶ感染ＬＣＬ）をパルス用培地に浮遊させ、１０μｇ／ｍＬの濃度でＣＴＬエピトープ候補ペプチドを加え、ペプチドパルス抗原提示細胞を調製した。そして、このペプチドパルス抗原提示細胞とＰＢＦ特異的ＣＴＬを含む細胞集団を混合培養してＣＴＬラインを樹立した。より具体的には、以下に示す通りである。
　〔抗原提示細胞の調製〕
　（１）ＥＢＶ感染Ｂ細胞株の調製
　定法（Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ　Ｋら，Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１０３：１９２－１９８）に従い、ＥＢＶ産生細胞株であるＢ９５．８細胞株（ＪＣＲＢ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋより入手）の培養上清（生ＥＢＶウイルスを含む）とＰＢＭＣとを混合培養し、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ、以下、ＥＢＶ感染ＬＣＬとも称する）を樹立した。約２週間後にＨＬＡ分子の発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＣＤ２０の発現を確認した。
　（２）ＣＤ４０－Ｂ細胞の調製
　ヒトＣＤ４０Ｌを遺伝子導入して安定的に発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＮＩＨ－ＣＤ４０Ｌ）と、ＰＢＭＣとを、ＩＬ－４存在下で共培養した。ＮＩＨ－ＣＤ４０Ｌは９６ＧｙのＸ線照射により増殖阻害し、３～４日毎に共培養を繰り返した（Ｋｏｎｄｏ　Ｅら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６９：２１６４－２１７１）。約２週間後にＨＬＡ分子の発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３とＣＤ８６の発現を確認した。
　（３）樹状細胞の調製
　ＰＢＭＣをプラスティック製の培養皿で３７℃、５％　ＣＯ２恒温槽内にて２時間培養し、培養皿に接着しなかった細胞を軽く洗い流した。これにＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を加え２４時間培養後、続けてＴＮＦαとＩＬ－１β及びＰＧＥ２（プロスタグランジンＥ２）を加え、２４～４８時間培養した。そして、適当な培地等で軽く洗い流して回収できた細胞を樹状細胞とした（Ｋｏｎｄｏ　Ｅら，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６９：２１６４－２１７１）。４８時間後にＨＬＡ分子の発現、ＣＤ８０、ＣＤ８３とＣＤ８６の発現を確認した。
　１）抗原提示細胞を利用した誘導
　上述の通り、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を保持するＰＢＭＣより、抗原提示細胞（ＥＢＶ感染ＬＣＬ、ＣＤ４０－Ｂ細胞、樹状細胞）を予め調製した。抗原提示細胞をパルス用培地（０．１％　ヒト血清アルブミン／５５μＭ　２－メルカプトエタノール／ＲＰＭＩ　１６４０）あるいは、ＡＩＭ－Ｖ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に浮遊させ、１０μｇ／ｍＬの濃度でＣＴＬエピトープ候補ペプチドを加え、およそ１５分間隔で穏やかに混合しながら室温にて３０～６０分間放置後、過剰量の洗浄液（２％　ウシ胎児血清（ＦＣＳ）／ＰＢＳ）にて３回洗浄し、ＨＬＡ分子に未結合のペプチドを洗い流した。この操作を行うことで、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子にＣＴＬエピトープ候補ペプチドが結合すると考えられる（この操作を行った抗原提示細胞をペプチドパルス抗原提示細胞と呼ぶ）。ペプチドパルス抗原提示細胞は、増殖能を失わせる為に、致死量のＸ線照射、またはマイトマイシンＣ処理を行った。これを同一人物から分離したＰＢＭＣ、又はＣＤ８陽性若しくはＣＤ４陽性のＴ細胞と混和し、３７℃、５％　ＣＯ２恒温槽にて培養を行った。用いる培地は、１０％　ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、あるいは１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、または、１～１０％のヒト血漿含有ＲＰＭＩ１６４０培地等の検討を行ったが、本方法においては、１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で良好な結果が得られた。Ｔ細胞の生存の維持と、増殖を補助する目的でＩＬ－２（シオノギ製薬社）を添加した。そのタイミングは通常混合培養開始後７～１４日目とする報告が多く、本発明でＩＬ－２は培養開始時、培養開始２日後、６日後等の検討を行ったが培養開始２日後に投与した場合に良好な結果が得られた為、培養開始２日後に５０Ｕ／ｍＬの濃度で加えた。培養開始１０～１４日後に再度ペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加えた。１０～１４日毎にペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加え、ＣＴＬ誘導の評価は、およそ２週間後と４週間後に実施した。ＰＢＦ特異的ＣＴＬの誘導が確認できた場合は、更にペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加えＣＴＬラインを樹立した。
　〔細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法による特異的ＣＴＬ誘導の確認〕
　前述の方法で増幅した細胞集団の約１／１０～全量を９６穴Ｕ底細胞培養用マイクロテストプレートに移し、誘導に用いたペプチドを最終０．０１～１０μｇ／ｍＬの濃度で加えた。さらに細胞内タンパク質輸送阻止剤としてＢｒｅｆｅｌｄｉｎ　Ａが最終濃度１μｇ／ｍＬになるよう加え、５％　ＣＯ２恒温槽にて３７℃で５～１６時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識ＭＨＣ－テトラマー試薬とＰＣ５（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－Ｃｙ５）標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加え、室温にて１５～３０分間静置した。洗浄後、４％　ホルムアルデヒドにて、４℃で１５分間固定後、過剰量の洗浄液にて洗った。０．１％サポニンにて膜透過処理後、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮγ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加え、室温にて１５～３０分間反応させた。洗浄後、フローサイトメーターを用いて、Ｔ細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率あるいはＭＨＣ－テトラマー試薬陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞率を定量した。
　図１４にコントロールペプチドを用いて、ＭＬＰＣ法にて特異的ＣＴＬを誘導し、細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法にて検討した結果を示す。すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１を保持しＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を保持しない健康成人末梢血から分離したＰＢＭＣを陽性コントロール（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＣＭＶ　ｐｐ６５由来のエピトープペプチド、ＡＴＶペプチド）または陰性コントロールペプチド（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ由来のエピトープペプチド、ＡＹＡペプチド）で１３日間刺激後、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ　Ａ存在下で刺激に用いたそれぞれのペプチドで１４時間再刺激した。これを、ＰＥ標識ＭＨＣ－テトラマー試薬（ＭＢＬ社）、ＰＣ５標識抗ＣＤ８抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮγ抗体で３重染色しフローサイトメーターを用いて解析し、その結果を図１４に示す。
　図１４において、ドットプロット展開図中の数字は、四分割した領域に存在する細胞が全生細胞に占める割合（％）を示す。Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＩＮＦγに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図では、陽性コントロールペプチドで再刺激された場合にＵＲにＩＦＮγ陽性ＣＤ８陽性細胞が出現し（下段左側）、陰性コントロールペプチドで再刺激されても殆ど出現しない（上段左側）。陽性コントロールペプチドで１３日間刺激培養した細胞集団では、ＣＭＶ　ｐｐ６５特異的ＣＴＬが存在していることは、Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＭＨＣ－テトラマー試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図でＵＲにＣＤ８陽性ＭＨＣ－テトラマー試薬陽性細胞集団が存在することから明らかである（下段中央）。一方で、Ｄｏｎｏｒアリルと異なるＨＬＡ拘束性の陰性コントロールペプチドを加えた細胞集団では、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ＣＴＬが出現しないことも明らかである（上段中央）。すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＣＭＶ　ｐｐ６５由来のエピトープペプチドを加えた細胞集団では２９．３７％の特異的ＣＴＬが誘導され、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ由来の　ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性エピトープペプチドを加えた細胞集団では特異的ＣＴＬが誘導されない。この結果は、上記のＩＦＮγの測定結果と合致している。更に、Ｘ軸にＩＦＮγ、Ｙ軸にＭＨＣ－テトラマー試薬に対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図では、陰性コントロールペプチドを加えた場合、ＭＨＣ－テトラマー試薬陽性かつＩＦＮγ陽性の細胞は殆ど存在しないが（上段右側）、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＣＭＶ　ｐｐ６５由来の陽性コントロールペプチドの刺激により誘導されたＣＭＶ　ｐｐ６５特異的ＣＴＬは全細胞集団の２９．３９％（ＵＬ＋ＵＲ）を占めており、その内の７３％［ＵＲ／（ＵＬ＋ＵＲ）］がＩＦＮγを産生する事、言い換えると細胞傷害性活性を有するエフェクタータイプのＣＴＬである事が明らになった。
　この結果より、Ｄｏｎｏｒが保持するＨＬＡ拘束性のＣＴＬエピトープペプチドを加えて培養したＰＢＭＣ中には、再刺激によりＩＦＮγを産生する細胞が誘導され、この細胞はＭＨＣ－テトラマー試薬で染色されることから加えたＣＴＬエピトープペプチドに特異的なＣＴＬであることが明らかである。
　次に、発明者らはＭＨＣ－テトラマー試薬により同定されたＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープペプチドで誘導されたＣＴＬの機能性を評価するために、細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量を実施した。その結果を図１５、図１６と図１７に示す。
　図１５の右段は、Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＩＦＮγに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で、誘導に用いたペプチドＱＶＴ（配列番号：４）と同じペプチドを用いて再刺激して、ＩＦＮγ産生能を検証した結果を示す。ＵＲにＣＤ８陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞数がＰＢＭＣに占める割合（％）を数値で示した。図１５の左段は、未刺激の場合（ペプチド濃度：０μｇ／ｍＬ）の細胞集団をＱＶＴ－Ｔｅｔで染色した結果である。Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にテトラマーに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で、ＵＲにＣＤ８陽性細胞中のテトラマー陽性細胞数がＰＢＭＣに占める割合（％）を数値で示した。
　ＱＶＴ（配列番号：４）で誘導されたＣＴＬに対し、ＱＶＴペプチドを用いて１４時間再刺激を行った。その結果、未刺激の場合（ペプチド濃度：０μｇ／ｍＬ）ではＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞が０．６３％であったのに対し、ＱＶＴを用いた再刺激では、ペプチド濃度に比例して、ＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性細胞の存在率が増加した。１０μｇ／ｍＬのペプチド再刺激では、１４．１５％のＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞が確認され、未刺激の場合と明らかな差が示された。更にＱＶＴ－Ｔｅｔ陽性細胞が２３．８４％存在する事から、ＱＶＴ－Ｔｅｔ陽性細胞の５９．４％がＩＦＮγを産生するエフェクタータイプのＣＴＬである事が明らになった。
　以上より、本実施例で同定されたＰＢＦ由来のＱＶＴ（配列番号：４）は末梢血中のＰＢＦ特異的ＣＴＬを増殖させる機能をもち、これらの細胞集団が細胞傷害性活性を有しかつＱＶＴ－Ｔｅｔで検出可能であったことからＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性のＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることが判明した。
　同様に、ＭＨＣ－テトラマー試薬により同定されたＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであるＬＳＡの細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量を実施した。その結果は図１６に示す。ＬＳＡで誘導されたＣＴＬは、ＬＳＡペプチドを用いて１４時間の再刺激の結果、未刺激の場合（ペプチド濃度：０μｇ／ｍＬ）ではＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞が０．１９％であったのに対し、ペプチド濃度に比例し、ＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞の存在率が増加した。１０μｇ／ｍＬのペプチド再刺激では、４．１９％のＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞が確認され、未刺激の場合と明らかな差が示された。更にＬＳＡ－Ｔｅｔ陽性細胞が２０．３４％存在する事から、ＬＳＡ－Ｔｅｔ陽性細胞の２０．６％がＩＦＮγを産生するエフェクタータイプのＣＴＬである事が明らになった。
　以上より、本発明で同定されたＰＢＦ由来のＬＳＡ（配列番号：６）は末梢血中のＰＢＦ特異的ＣＴＬを増殖させる機能をもち、これらの細胞集団が細胞傷害性活性を有しかつＬＳＡ－Ｔｅｔで検出可能であったことからＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性のＰＢＦ特異的ＣＴＬエピトープペプチドであることが判明した。
　前述のＭＬＰＣ法にてＭＨＣ－テトラマー試薬を用いたＣＴＬエピトープペプチドの同定解析では、ＡＳＶ及びＳＶＬはＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性を示すＣＴＬを誘導し、Ｄｏｎｏｒ　Ａ、Ｄｏｎｏｒ　Ｂ及びＤｏｎｏｒ　Ｃの末梢血にメモリータイプのＣＴＬが存在した事を示した。誘導されたＣＴＬの機能性を評価するために、同様に細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量を実施した。その結果は図１７に示す。
　図１７には、それぞれＡＳＶとＳＶＬの結果を示す。図の右段では、Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にＩＦＮγに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で、誘導に用いたペプチドＡＳＶあるいはＳＶＬを用いて再刺激して、ＩＦＮγ産生能を検証した結果を示した。ＵＲにＣＤ８陽性細胞中のＩＦＮγ陽性細胞数がＰＢＭＣに占める割合（％）を数値で示した。図の左段では、未刺激の場合（ペプチド濃度：０μｇ／ｍＬ）の細胞集団をＡＳＶ－Ｔｅｔ又はＳＶＬ－Ｔｅｔで染色した結果である。Ｘ軸にＣＤ８、Ｙ軸にテトラマーに対する蛍光強度をｌｏｇスケールで示したドットプロット展開図で、ＵＲにＣＤ８陽性細胞中のテトラマー陽性細胞数がＰＢＭＣに占める割合（％）を数値で示した。
　ＡＳＶで誘導されたＣＴＬに対し、ＡＳＶペプチドを用いて１４時間再刺激を行った。その結果、未刺激の場合（ペプチド濃度：０μｇ／ｍＬ）とペプチド再刺激の場合では、ＡＳＶ－Ｔｅｔ陽性細胞が２１．９２％存在するにも関わらず、ＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞は検出されなかった（上段）。ＳＶＬで誘導されたＣＴＬに対して、ＳＶＬペプチドを用いて１４時間再刺激を行って同様の検討を行ったが、未刺激の場合でもペプチド再刺激の場合でも、ＳＶＬ－Ｔｅｔ陽性細胞が５．４８％存在するにも関わらず、ＣＤ８陽性ＩＦＮγ陽性（産生）細胞は検出されなかった（下段）。
　以上より、本発明で同定されたＰＢＦ由来のＡＳＶ（配列番号：１）及びＳＶＬ（配列番号：２）は末梢血中の特異的ＣＴＬを増殖させる機能をもち、ＡＳＶ－Ｔｅｔ又はＳＶＬ－Ｔｅｔで検出可能であったが、これらの細胞集団が細胞傷害性活性を有しないことが明らかになった。
　ＡＳＶ特異的ＣＴＬとＳＶＬ特異的ＣＴＬが示した現象は昔から報告されており、免疫学的に不応答性（ａｎｅｒｇｙ）と呼ばれている。例えば、Ｃ型肝炎では持続感染が維持される原因のひとつとして、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ）に対するＣＴＬは存在するが、ＣＴＬがサイトカイン等を産生していない、あるいは産生するＣＴＬの割合が極めて低く免疫学的に不応答性（ａｎｅｒｇｙ）になっている可能性が報告されている（Ｇｒｕｅｎｅｒ　ＮＨら，Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．２００１；７５：５５５０－５５５８）。
　免疫学的に不応答性になる機序は、単純なメカニズムではないが、免疫チェックポイント分子の存在や制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）、骨髄由来免疫抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ：ＭＤＳＣ）の関与等が報告されている。また、ＣＴＬの活性化を阻害する分子として、ＴＧＦβ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４等が知られている。例えば、ＴＧＦβはがん細胞が分泌する抑制性のサイトカインであり、ＣＴＬやＣＤ４陽性Ｔ細胞の増殖・分化を阻害する。また、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４は共にＴ細胞の細胞膜上の分子であり、それぞれがん細胞が発現するリガンドと結合すると、抑制性のシグナルが伝達され、ＣＴＬが不活性化される（ａｎｅｒｇｉｃ　ＣＴＬ）。近年、抗ＰＤ－１抗体や抗ＣＴＬＡ－４抗体により、これらの免疫抑制分子の働きを阻害することで、免疫系が再活性化することが報告され、新たな治療戦略として臨床検討が進められている。
　本来、ＣＴＬの一部はメモリータイプのＴ細胞となって、抗原に対する細胞傷害性活性を持ったまま宿主内に記憶され、次に同じ抗原や異物に暴露された場合に速やかに対応できるよう備える仕組みをもっている。免疫学的な不応答性は（１）抗原量が多く、（２）暴露される期間が長期で、（３）同時に起こる炎症反応レベルが低い場合に一般に起こりやすいとされている。一例として、食物等に対する経口免疫寛容が挙げられる。食物アレルゲンの代表的なものには卵、牛乳、蕎麦等がある。しかし、食物アレルギーは誰にでも起こるものではない。それは、生体に経口的に摂取した食物成分に対し、免疫寛容機構が腸管組織に備わっているためである。従って、乳幼児期の食物アレルギーが青少年期までに寛解することが多い理由として、生育に伴う消化管の成長と適切な経口免疫寛容の成立によるものが考えられている。
　発明者らが用いているのは、健常人の末梢血であるため、自己抗原であるＰＢＦ特異的メモリータイプＣＴＬの存在頻度は、おおよそ１～３×１０－７と一般に低いと考えられている。しかし、ＡＳＶ（配列番号：１）及びＳＶＬ（配列番号：２）の刺激で、ＣＴＬが高頻度に増殖され、一方で誘導されたＣＴＬが免疫学的に不応答性である事が明らかになった。
　以上より、ＡＳＶ（配列番号：１）及びＳＶＬ（配列番号：２）に相同性の高い非自己抗原ペプチドが存在し、健常人に一時的あるいは恒常的に取り込まれた際に、誘導されたＣＴＬの一部はメモリータイプのＴ細胞となって血中に存在するものの、免疫寛容機構の働きで、免疫学的に不応答性になっている可能性が示唆された。ＡＳＶ及びＳＶＬがこの非自己抗原ペプチドと相同性が高いため、互いに交差反応を示すメモリータイプのＣＴＬを効率的に誘導できたと考えられる。前述の免疫チェックポイント阻害剤である、ＰＤ－１やＣＴＬＡ４抗体医薬は、この様な免疫寛容を解除させるとされており、この交差反応性を利用して、生体内にメモリーＣＴＬが多量に存在するＡＳＶやＳＶＬ特異的ＣＴＬをＰＢＦ陽性がんに対する免疫治療に利用できる可能性があると考えられる。
　〔細胞傷害性活性の測定〕
　さらに、ＰＢＦ由来のＱＶＴ（配列番号：４）又はＬＳＡ（配列番号：６）にて上述の通り誘導されたＣＴＬについて、ヒト骨肉腫細胞株に対する細胞傷害性活性を調べた。
　そのために、先ず、ＰＢＦを発現するヒト骨肉腫由来の細胞株であるＨＯＳ細胞（ＨＬＡ－Ａ１１陰性）にＨＬＡ－Ａ＊１１：０１分子の全長配列を遺伝子導入し、ＨＬＡ－Ａ１１を安定的に発現するＨＯＳ細胞を樹立した。樹立した細胞株に対し、市販のＦＩＴＣにて標識された抗ＨＬＡ－Ａ１１抗体（ａｂｃａｍ社）を用いて、膜表面上での発現確認をした。得られた結果を図１８に示す。この図において、Ｘ軸に蛍光強度を示し、Ｙ軸に細胞計数を示す。図１８に示した通り、樹立したＨＬＡ－Ａ１１安定発現ヒト骨肉腫細胞株（以下、Ａ１１発現ＨＯＳ細胞とも称する）では、ＨＬＡ－Ａ１１の発現が確認され、これを以下に示す細胞傷害性活性測定の標的細胞として用いた。
　次に、細胞傷害性活性についての測定方法を示す。培養中のＡ１１陰性のＨＯＳ細胞あるいはＡ１１発現ＨＯＳ細胞を４００×ｇで５分間遠心して上清を廃棄後、適量のＰＢＳを加えて細胞を撹拌後、４００×ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を注意深く廃棄し、細胞を１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。最終濃度０．１ μＭとなるように、ＣＦＳＥを添加し、室温で１０分間染色した。１ｍＬのＦＣＳを加え撹拌した。１０ｍＬのＰＢＳを加えて、４００×ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を注意深く廃棄し、この操作を３回繰り返して細胞を洗浄した。細胞を適量の培地（１０％　ＦＣＳ／５５μＭ　２－メルカプトエタノール／１％　Ｌ－グルタミン／１００μｇ／ｍＬ　スレプトマイシン／１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ペニシリン／ＲＰＭＩ　１６４０）に再懸濁し、細胞数を数え、それを標的細胞とした。ＰＢＦ由来のＱＶＴ（配列番号：４）又はＬＳＡ（配列番号：６）で誘導された上述のＣＴＬ細胞を適量の培地に再懸濁し、細胞数を数え、それをエフェクター細胞とした。９６ウェル培養プレートの１個のウェル当たり、５，０００個の標的細胞を添加し、エフェクター細胞の量を１０，０００～１００，０００個になるように添加し、３７℃の５％ＣＯ２－恒温槽にて５時間培養した。培養後、塩化カルシウム溶液を１ｍＭの濃度で添加し、蛍光標識したＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖにて染色し、フローサイトメトリーにてＣＦＳＥでラベルされた標的細胞の死細胞率を測定した。
　細胞傷害性活性（％）は次の計算式で算出した。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝［（Ｅ－Ｔ０）／（１００－Ｔ０）］×１００
Ｅは標的細胞とエフェクター細胞を共培養した時のＣＦＳＥ陽性細胞集団中のＡｎｎｅｘｘｉｎ　Ｖ陽性細胞率を示し、Ｔ０は標的細胞のみを培養した時のＣＦＳＥ陽性細胞集団中のＡｎｎｅｘｘｉｎ　Ｖ陽性細胞率を示す。その結果を図１９及び図２０に示す。
　これらの図面において、Ｘ軸にエフェクター細胞の細胞数と標的細胞の細胞数の比（Ｅ／Ｔ　ｒａｔｉｏ）を、Ｙ軸に細胞傷害性活性（％）を示した。図１９はエフェクター細胞にペプチドＱＶＴ（配列番号：４）で誘導されたＰＢＦ特異的ＣＴＬを使用した場合の結果であり、図２０はペプチドＬＳＡ（配列番号：６）で誘導されたＰＢＦ特異的ＣＴＬを使用した場合の結果である。
　ペプチドＱＶＴ（配列番号：４）で誘導されたＰＢＦ特異的ＣＴＬでは、Ｅ／Ｔ比＝２０において５５％の細胞傷害性活性が認められ、ペプチドＬＳＡ（配列番号：６）で誘導されたＰＢＦ特異的ＣＴＬの場合ではＥ／Ｔ比＝２０において３２％の細胞傷害性活性が認められた。一方、ＨＬＡ－Ａ１１を遺伝子導入していないＡ１１陰性のＨＯＳ細胞に対して、細胞傷害性活性はほとんど検出されなかった。以上より、ＱＶＴ（配列番号：４）ペプチド特異的なＣＴＬ細胞集団又はＬＳＡ（配列番号：６）ペプチド特異的なＣＴＬ細胞集団は、標的細胞の膜表面に発現しているＨＬＡ－Ａ＊１１：０１に提示されたＰＢＦペプチドをそれぞれ認識し、殺傷することが確認された。すなわち、本発明で同定されたＰＢＦ由来のＱＶＴ（配列番号：４）又はＬＳＡ（配列番号：６）で誘導されたＣＴＬ細胞はヒト骨肉腫細胞に対し、細胞傷害性活性を持つことが確認された。
　〔ＣＴＬエピトープペプチドの相同性検索〕
　上述の通り同定された、ＰＢＦ特異的ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＣＴＬエピトープペプチド　ＡＳＶ（配列番号：１）、ＳＶＬ（配列番号：２）、ＱＶＴ（配列番号：４）及びＬＳＡ（配列番号：６）について、交差反応を考察するために、さらに相同性検索を行った。すなわち、Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ＭｉｃｒｏｂｉａｌＧｅｎｏｍｅｓ）を用い、相同性の最も高い配列をデータベースから抽出した。その結果、下記表３に示す通り、配列番号：１及び２にて特定されるペプチドと高い相同性を示すペプチドとして、放線菌由来のペプチドであるＡＳＶＬＳＲＲＬＧＰ（配列番号：１２）及び藍藻由来のペプチドであるＡＳＶＬＳＱＲＬＧＫ（配列番号：１３）を見つけることができた。また、配列番号：６（ＬＳＡＬＰＰＰＬＨＫ）にて特定されるペプチドと高い相同性を示す結核菌由来のペプチドであるＡＳＥＬＰＰＰＬＨＫ（配列番号：１４）も見つけることができた。なお、配列番号：４にて特定されるペプチドと高い相同性を示すペプチドとして、該当するものはなかった。また、下記表３における表記は、上記表１及び２と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＨＬＡクラスＩ分子に提示されるＣＴＬエピトープペプチドは、８～１０個のアミノ酸からなり、Ｎ末端側から２番目と、９あるいは１０番目のアミノ酸はＨＬＡクラスＩ分子との結合に対して最も重要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。ＨＬＡ－Ａ１１分子に結合するペプチドとしては、Ｎ末端より２番目の位置にＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＶａｌのいずれかが配置され、９あるいは１０番目の位置にＬｙｓ又はＡｒｇのいずれかが配置されたペプチドであって、９～１０個のアミノ酸からなるペプチドが最もよく知られている（Ｃｈａｎｇ　ＣＸら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４３：１１０９－１１２０）。本発明で提供されるＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＣＴＬエピトープペプチドＡＳＶは、Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ（配列番号：１）という１０個のアミノ酸から構成され、アンカーモチーフとしてＮ末端側から２番目にＳｅｒを、１０番目にＬｙｓを有する。一方で、Ｎ末端側から、１個のアミノ酸残基を削ったペプチドであるＳＶＬは、Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ（配列番号：２）という９個のアミノ酸から構成され、アンカーモチーフとしてＮ末端側から２番目にＶａｌを、９番目にＬｙｓを有する。
　ＡＳＶ、ＳＶＬに相同性の高いペプチドであるＡＳＶ（Ｋ１０Ｐ）（配列番号：１２）はＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏという１０個のアミノ酸から構成され、１０番目のＰｒｏはアンカーモチーフではないため、ＣＴＬエピトープである可能性が低いと推測される。一方、ＡＳＶ（Ｒ６Ｑ）（配列番号：１３）はＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓという１０個のアミノ酸から構成され、２番目にＳｅｒを、１０番目にＬｙｓを有し、ＣＴＬエピトープとしてＡＳＶまたはＳＶＬとの交差性が考えられる。
　ＡＳＶ（Ｒ６Ｑ）はシアノバクテリア（藍藻類）のｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰａｒＡ（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＷＰ＿０２６０８７２５４．１）というタンパク質に由来する。このタンパク質は染色体分配や細胞分裂に関わり、藻類で高く保存されている。
　藻類は、伝統的に世界各地で食材とされてきた。東南アジアでも食材としての利用が散見される。日本では、藻類を食材として利用することは古くから行われている。海苔（ノリ）、コンブ、ワカメ、ヒジキ、モズク、ヒトエグサ等が日常的に摂取する食材になっている。特に紅藻・緑藻・藍藻等を含む藻類の総称である海苔の消費量が世界的にも非常に高い。
　日常的に摂取した藻類由来のＡＳＶ（Ｒ６Ｑ）が本来自己抗原であるＰＢＦ由来のＡＳＶ及びＳＶＬとの免疫反応の交差性が考えられ、その結果、健常人の末梢血に対し、ＰＢＦ由来ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１拘束性ＣＴＬエピトープペプチドＡＳＶ、ＳＶＬで誘導した結果、高い頻度でかつ免疫的不活性の細胞集団が増殖されたと考えられる。前述のように、最近の研究によって、このような免疫的不活性の細胞集団をターゲットに、抗ＰＤ－１抗体や抗ＣＴＬＡ－４抗体による免疫抑制分子を阻害することで、免疫を再活性化することも可能になった。
　最近では、藻類の抗がん作用が注目され、藻類の機能性成分が免疫系へどのような影響を与えるか研究が進められており、古い食材である藻類が再び注目されている。しかし、そのほとんどは粘性多糖類に備わった免疫賦活剤としての機能についての研究であった。本発明で初めて、自己抗原であるＰＢＦタンパク質由来抗原ペプチドと食材である藻類ＰａｒＡタンパク質由来抗原ペプチドの高い相同性を見出し、免疫反応の交差性について考察した。藻類由来ペプチドは抗がん作用の可能性が潜むという従来と異なる新たな研究視点を提供する。
　一方で、ＬＳＡ（配列番号：６）に相同性の高いペプチドであるＡＳＥ（配列番号：１４）はＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓという１０個のアミノ酸から構成され、２番目にＳｅｒを、１０番目にＬｙｓを有し、ＣＴＬエピトープとしてＬＳＡとの交差性も考えられる。
　ＡＳＥはヒト型結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ＵＤＰ－ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ＧｌｆＴ（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＷＰ＿００３９０２７４６．１）というタンパク質に由来し、ヒトの結核の病原菌である。結核菌の培養を繰り返して作製された弱毒化細菌を利用し、予防ワクチンとしてＢＣＧワクチンが開発されている。ＢＣＧワクチンは結核に対する予防効果が認められた唯一の弱毒生菌ワクチンであり、世界中で利用されている。
　しかし、ＢＣＧワクチンの効果は結核予防にとどまらず、がんの治療効果が示されている。１９７９年、肺がん治療の臨床試験に用いられ、その有益性が初めて報告された（Ｙａｍａｍｕｒａ　Ｙら，Ｃａｎｃｅｒ　１９７９；４３：１３１４－１３１９）。１９９１年、ＢＣＧワクチンが膀胱がんの再発予防に強い効果を発揮することが報告された（Ｄ．Ｌ．Ｌａｍｍら，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．１９９１；３２５：１２０５－１２０９）。その後、悪性黒色腫、大腸がん、膀胱がん等の複数のがんに対し、多くの臨床試験が行われ、その有効性が報告されている。現在、ＢＣＧワクチン療法は免疫療法のひとつとして確立され、がん治療に応用されている。
　しかし、ＢＣＧワクチン療法の有効性が示されたものの、その作用機序は不明のままである。従来、ＢＣＧワクチンの抗がん作用は非特異的免疫賦活作用に依拠していると信じられていた。
　本発明で初めて、ＰＢＦタンパク質由来抗原ペプチドであるＬＳＡ（配列番号：６）と結核菌ＧｌｆＴタンパク質由来抗原ペプチドであるＡＳＥ（配列番号：１４）との高い相同性を見出し、免疫反応の交差性について考察した。その観点から、ＢＣＧワクチンの抗がん作用は非特異的免疫賦活作用ではなく、交差反応性による抗原特異的免疫反応を誘導するという新たな作用機序が存在する可能性がある。
　本発明で新たなＣＴＬエピトープＡＳＶ（配列番号：１）、ＳＶＬ（配列番号：２）、ＱＶＴ（配列番号：４）、ＬＳＡ（配列番号：６）を同定した。これらの新規のＣＴＬエピトープはＰＢＦ陽性がん治療に今後応用されると考えられる。また、新規ＣＴＬエピトープの同定にあたり、ペプチド相同性検索手法を初めて導入し、ＰＢＦ由来のＣＴＬペプチドと相同性の高いＡＳＶ（Ｒ６Ｑ）（配列番号：１３）、ＡＳＥ（配列番号：１４）を見出した。免疫反応の交差性の観点から、藻類由来ペプチドであるＡＳＶ（Ｒ６Ｑ）（配列番号：１３）の抗がん作用を提案した。さらに、既に複数の臨床試験で抗がん作用が示されたＢＣＧワクチンの作用秩序について、ＡＳＥ（配列番号：１４）とＬＳＡ（配列番号：６）との交差免疫反応性の考察から、新たな作用秩序を提案した。
　以上説明したように、本発明によれば、骨肉腫特異抗原であるＰＢＦを発現するがんを標的とするＨＬＡ－Ａ１１拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を特異的に認識し得る、エピトープペプチド、並びに該ペプチドを用いたＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン、前記ＣＴＬの誘導方法、前記ＣＴＬを用いた受動免疫療法剤及びその製造方法、並びに前記ＣＴＬの定量方法及び該方法に使用するキットを提供することが可能となる。
　したがって、本発明は、ＨＬＡ－Ａ１１保持のがん患者に対する免疫療法等において有用である。
配列番号：１～１５
＜２２３＞　人工的に合成されたペプチドの配列

Claims (19)

  1. 　配列番号：４、６、１、２、１４又は１３に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができるペプチドであって、該複合体を表面上に提示する細胞が、該複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる、ペプチド。
  2. 　配列番号：４、６、１、２、１４又は１３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ－Ａ１１分子と複合体を形成することができるペプチドであって、該複合体を表面上に提示する細胞が、該複合体を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる、ペプチド。
  3. 　請求項１又は２に記載のペプチドをコードする核酸。
  4. 　請求項１又は２に記載のペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクター。
  5. 　請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含む、ＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン。
  6. 　請求項１又は２に記載のペプチドをコードする核酸を有効成分として含む、ＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン。
  7. 　請求項１又は２に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞を有効成分として含む、ＰＢＦ陽性がんを治療又は予防するためのワクチン。
  8. 　請求項１若しくは２に記載のペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、末梢血単核球を刺激して得られる細胞傷害性Ｔ細胞を含む、ＰＢＦ陽性がんに対する受動免疫療法剤。
  9. 　請求項１若しくは２に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体又は該複合体の多量体と、末梢血単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体に細胞傷害性Ｔ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞傷害性Ｔ細胞を含む、ＰＢＦ陽性がんに対する受動免疫療法剤。
  10. 　請求項１若しくは２に記載のペプチド又は該ペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体を表面上に提示する抗原提示細胞により、末梢血単核球を刺激して細胞傷害性Ｔ細胞を取得する工程を含む、ＰＢＦ陽性がんを治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
  11. 　請求項１若しくは２に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体又は該複合体の多量体と、末梢血単核球とを反応させ、前記複合体又は前記多量体に細胞傷害性Ｔ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から細胞傷害性Ｔ細胞を単離する工程を含む、ＰＢＦ陽性がんを治療するための受動免疫療法剤の製造方法。
  12. 　請求項１又は２に記載のペプチドで末梢血単核球を刺激し、ＰＢＦ陽性がん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を取得し、該細胞傷害性Ｔ細胞が産生する、サイトカイン、ケモカイン及び細胞表面タンパク質からなる群から選択される少なくとも１の分子の量を測定する、ＰＢＦ陽性がん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
  13. 　請求項１又は２に記載のペプチドを使用し、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
  14. 　請求項１又は２に記載のペプチドを使用し、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する工程と、
    　前記工程にて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を検出する工程とを含む、
    　ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
  15. 　請求項１又は２に記載のペプチドと末梢血単核球とを培地中で接触させ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ＰＢＦ陽性がん細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
  16. 　請求項１又は２に記載のペプチドと末梢血単核球とを培地中で接触させ、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するする工程と、
    　前記工程にて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を検出する工程とを含む、
    　ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
  17. 　請求項１若しくは２に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体又は該複合体の多量体と、末梢血単核球又はがん試料とを反応させる、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の定量方法。
  18. 　請求項１又は２に記載のペプチドを含む、ＰＢＦ陽性がんを標的とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導するためのキット。
  19. 　請求項１又は２に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ１１分子との複合体に特異的に結合する抗体。
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