TW201735771A - Ｈｌａ－ａ１１限制性細胞毒性ｔ細胞表位胜肽 - Google Patents
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Abstract
本發明以提供以表現骨肉瘤特異抗原PBF之癌為標靶之HLA-A11限制性細胞毒性T細胞(CTL)特異性地識別的表位胜肽、與利用該胜肽之用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗、前述CTL的誘導方法、利用前述CTL的被動免疫療法劑及其製造方法、與前述CTL的定量方法及該方法中使用的套組為目的，經過專注研究後，結果發現由在序列編號：1、2、4、6、13或14中記載之胺基酸序列構成的胜肽會結合至HLA-A11分子並形成複合體，以及以PBF陽性癌為標靶之CTL被呈現該複合體的細胞所誘導。
Description
本發明與HLA-A11限制性細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，以下，亦稱為CTL)表位胜肽有關。更詳細地來說，本發明與以表現骨肉瘤特異抗原Papillomavirus Binding Factor(以下，亦稱為PBF)之癌(PBF陽性癌)為標靶之CTL可特異性地識別的表位胜肽、利用該胜肽之用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗、前述CTL的誘導方法、利用前述CTL的被動免疫療法劑及其製造方法、與前述CTL的定量方法及該方法中使用的套組有關。
骨肉瘤(osteosarcoma/osteogenic sarcoma)為產生在骨骼本身的惡性腫瘤。在骨原發性惡性腫瘤之中所占比例最多，占骨癌的56%(非專利文獻1)。
骨肉瘤為好發於幼兒、年輕人，為以膝蓋、關節周邊新陳代謝旺盛的骨骼末端、骨幹末端為中心而產生的癌。骨肉瘤會在這些發病部位引起強烈疼痛，而且隨著腫瘤的成長骨骼會被破壞殆盡。此外，骨肉瘤是青少年
時期所罹患的癌症之中第三多的惡性腫瘤(非專利文獻2)。
骨肉瘤不僅好發於青少年時期骨骼、骨質形成時，即使是成年人或年長者，也可觀察到骨肉瘤在脊椎或骨盤的產生例或二次性骨肉瘤的產生。根據美國癌症協會的報告，在骨肉瘤的年齡別流行病學調查中，60歲以上的罹患率之高僅次於10~30幾歲(非專利文獻3)。尤其，因本國人口高齡化的進展快速，推測年長者的骨骼軟組織或骨骼惡性腫瘤的患者人數會逐年上升。
如同其他癌種所見，骨肉瘤的原因與各種因子密切相關，無法歸因於特定的原因。於臨床所見，觀察到參與骨形成.骨成長.骨代謝之成骨細胞或破骨細胞病變，改變惡性化後之骨肉瘤細胞的型態，並引發腫瘤性的骨骼或類骨基質的產生，各式各樣的影像所見或病理所見。因此，骨肉瘤的組織分類複雜，導致診斷與治療的困難。
傳統上，低惡性度骨肉瘤的治療僅採用外科的完全切除作為有效的治療方法。然而，高惡性度的骨肉瘤的切除後5年存活率為10%，預後極為不良。自從1970年代導入手術前後的輔助化學療法，非轉移性骨肉瘤的治療效果顯著改善，有報告指出5年內整體存活率為75~77%(非專利文獻4、5)。然而，大多數的骨肉瘤有很高的機率會發生轉移，以肺部轉移為最多，遠處轉移的復發中有約9成為肺轉移，除此之外骨轉移的合併為1~2
成。而且，亦可發現淋巴結的轉移(非專利文獻6)。多數的轉移性骨肉瘤對化學療法表現出耐受性，而且其中30%以上的患者對化學療法劑完全沒有回應性，非常難以救治(非專利文獻7、8、9、10)。因此，轉移性骨肉瘤患者的預後非常差，即使是在已導入手術前後之輔助化學療法等的今天，5年內無復發存活率也僅有20%(非專利文獻11)。
在非轉移性骨肉瘤的情況，手術前後所使用的化學療法劑且有用性獲得確認者為高劑量之胺甲喋呤(MTX)、順鉑(CDDP)、阿黴素(DXR)、異環磷醯胺(IFM)(非專利文獻12、13、14)。儘管彼等抗癌劑有腫瘤生長的抑制效果，但有報告指出有心肌症、聽覺損失等的嚴重副作用，並且有引發二次惡性腫瘤的風險(非專利文獻13、15)。
在此情況下，亦觀察到化學療法抗性的病例或因強烈副作用而無法繼續治療的病例。此外，因手術將四肢截肢，會帶給患者很大的喪失感與虛脫感，尤其由於發病年齡低，所以不僅患者，家人與醫生也須面對非常困難的抉擇。在這樣的背景之下，迫切需求骨肉瘤新療法的開發。
這十幾年間，癌症免疫療法快速發展，世界上已有許多臨床研究正在進行中。在學術期刊「Science」被選為2013年的「重大科學突破(譯註：Breakthrough of the Year)」之首等，免疫療法因為有可能成為在難以藉
傳統外科處置、放射線療法、化學療法治療之惡性腫瘤領域的強有力的第4種治療法而受到矚目。
免疫療法的歷史悠久，最早的文獻報告為1893年使用科利疫苗(Coley’s vaccine)之惡性腫瘤治療(非專利文獻16)。其後，從1960年代後半至今，由於免疫學飛躍式的發展迅速累積新的發現，對癌症免疫療法的臨床開發有很大的貢獻。
例如，開發了著眼於免疫賦活劑的作用之BCG疫苗或丸山疫苗療法(非專利文獻17、18、19、20)、藉助細胞激素的作用之干擾素、介白素療法(非專利文獻21、22、23、24)、利用免疫反應之抗腫瘤單株抗體療法(非專利文獻25、26)、以獲得抗腫瘤活性為目的之免疫細胞療法、癌症疫苗療法、基因修飾T細胞療法等(非專利文獻27、28、29、30、31、32)。因為這些日新月異的臨床研究，免疫療法作為一種新的癌症治療策略而受到很大的關注。
特別值得注意的是，自1991年發現MAGE抗原以來的的潮流。免疫療法的基礎研究方向大大地轉往腫瘤特異抗原的發現與其細胞毒性T細胞(CTL)抗原決定基的鑑定。在這樣的背景下，發明者群已領先全世界展開骨肉瘤特異性癌症免疫療法的基礎研究與臨床研究。於2003年建立來自患者之骨肉瘤細胞株OS2000，經由與患者的末梢血液淋巴球混合培養來建立特異性地與本身骨肉瘤細胞反應之CTL克隆(非專利文獻33)。並且，構築
表現骨肉瘤細胞株之基因庫，使用將之基因轉殖而暫時性地表現的293T細胞為標靶細胞，以CTL克隆的細胞毒性活性作為指標的選殖法，於2004年世界上首次鑑定骨肉瘤特異抗原PBF。並且分別鑑定PBF特異性HLA-B55或HLA-A24限制性CTL抗原決定基(非專利文獻34、非專利文獻35、專利文獻1、專利文獻2)。並且，在2009年HLA-A2限制性PBF特異性CTL抗原決定基的鑑定也成功了。(非專利文獻38、專利文獻3)。發明者群由使用抗PBF抗體之免疫組織學分析發現，PBF的表現與骨肉瘤的預後有關。患者的骨肉瘤活組織檢驗組織的92%表現PBF，其中75%的患者組織中PBF表現過剩，顯示表現PBF的所謂PBF陽性患者比不表現PBF的所謂PBF陰性患者明顯預後不良(非專利文獻35)。而且在使用骨肉瘤以外的癌組織的PBF表現分析中，也在肺癌、胃癌、乳癌、肝癌等觀察到PBF的高表現，顯示對於這種上皮系的癌症PBF也有成為有希望的免疫療法標靶的可能性(非專利文獻34)。
發明者群鑑定之骨肉瘤特異抗原PBF為分子量約55kDa，由全長513個胺基酸所構成之細胞核與細胞質雙局部化蛋白質。PBF最早被報告為控制人類乳頭狀瘤病毒(第8型)的啟動子活性之轉錄因子，並被取名為Papillomavirus Binding Factor(非專利文獻36)。和許多轉錄因子或DNA結合蛋白質一樣，PBF也有鋅指結構域，亦被稱為zinc finger protein 395(ZNF395)。
發明者群報告了PBF不僅控制人類乳頭狀瘤病毒(第8型)的啟動子活性，還會透過凋亡蛋白酶9非依存性路徑，誘導細胞凋亡細胞死，細胞凋亡控制因子Scythe/BAT3與PBF的共同局部化對骨肉瘤細胞的生存而言為重要的因子(非專利文獻37)。
發明者群自2009年起，以HLA-A24及HLA-A2保持者為對象，使用PBF的CTL表位胜肽實施骨肉瘤胜肽癌症疫苗的臨床試驗(日本UMIN臨床試驗登錄系統試驗ID：UMIN000001632、UMIN000001633)。
免疫療法為一種利用使患者具備的免疫力賦活化，特異性地攻擊‧排除標靶癌細胞或病毒感染細胞之治療方法，具有傳統治療方法沒有的特徵。負責特異性地攻擊這些標靶細胞的主要任務的是細胞毒性T細胞(CTL)。在CTL識別癌細胞或病毒感染細胞這些標靶細胞時，在CTL細胞膜表面上表現之T細胞受體(TCR)擔負著重要的任務。TCR並非直接識別癌症抗原或病毒粒子本身，而是藉由與在標靶細胞的膜表面上表現的HLA(人類白血球抗原)，還有在腫瘤細胞的情況下為來自癌症抗原、或在病毒感染細胞的情況下為來自病毒之由8~10個胺基酸組成的胜肽(表位胜肽)結合為複合體，CTL會識別標靶細胞並發揮殺傷效果。HLA大致分為第I型與第II型，HLA第I型與胜肽的複合體會被在CD8陽性T細胞表現之TCR識別，HLA第II型與胜肽的複合體會被在CD4陽性T細胞表現之TCR識別並引起免疫反應。HLA還有被區分為稱
為HLA-A,B,C的古典分類，與稱為HLA-E,F,G的非古典分類。根據現在IMGT的HLA數據庫(http：//www.imgt.org/)，HLA-A有2,041種、HLA-B有2,688種、HLA-C有1,677種的蛋白質被登錄。然而已知在人種間有偏向，例如日本人約有60%的人保持HLA-A24，HLA-A2為白人的50%以上，日本人也有約20%的人保持。
HLA-A11的保有率在日本人約為10%，在東南亞作為保有率第3名之等位基因顯現出廣泛的人口分布。東南亞的HLA-A24、HLA-A2及HLA-A11的單等位基因頻率各為32.1%、24.5%、23.7%(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/ihwg.cgi)。
以往報告的多數免疫療法中，世界上以HLA-A2為對象的臨床試驗最多，而日本國內則是以HLA-A24為對象的情況較多。隨著亞洲地區平均壽命的延長，癌症患者預料將會增加，免疫療法比以往更加被要求要增加治療對象的HLA型。為了減少治療歧視這是一件很重要的事。以往報告的HLA-A11限制性CTL抗原決定基數量與HLA-A2或HLA-A24相比極端地少，也由於幾乎沒有以保有HLA-A11的患者為對象之臨床試驗的報告例，因此認為本發明之表現出HLA-A11限制性的PBF特異性CTL抗原決定基的鑑定意義重大。
如前述，發明者群鑑定PBF的HLA-A24及HLA-A2限制性CTL抗原決定基，並且已在實施骨肉瘤胜肽癌症疫苗的臨床試驗。然而，由於HLA-A11限制性的
CTL抗原決定基尚未被鑑定，所以存在無法參加臨床試驗之HLA-A11保持者的患者。
專利文獻1：日本特許第5281515號公報
專利文獻2：日本特許第4484707號公報
專利文獻3：日本特許第5606322號公報
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本發明為有鑑於這樣的狀況而完成者，以PBF陽性癌為標靶，並以鑑定被表現出HLA-A11限制性之細胞毒性T細胞(CTL)特異性地識別之表位胜肽為目
的。而且，以提供利用該胜肽之用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗、前述CTL的誘導方法、利用前述CTL的被動免疫療法劑及其製造方法、與前述CTL的定量方法及該方法中使用的套組為目的。
本發明者群為了達成前述目的，對於來自PBF的各種胜肽，針對癌症抗原性，即CTL誘導能力反覆進行專注研究。其結果發現被在序列編號：1、2、4或6中記載之胺基酸序列決定之來自PBF的胜肽能夠誘導HLA-A11限制性的CTL。此外，有關被在序列編號：4或6中記載之胺基酸序列決定之胜肽，還確認了被誘導之CTL表現出細胞毒性活性。而且，在更進一步對這4個胺基酸序列進行同源性檢索時，對此等序列表現出高同源性，還成功萃取出具有與HLA-A11分子的結合中最重要的胺基酸(錨定模體)之被在序列編號：13或14中記載之胺基酸序列決定之胜肽。本發明為根據這樣的發現而完成者，在具體的態樣中，例如與以下的發明有關。
<1>一種胜肽，其包含在序列編號：4、6、1、2、14或13中記載之胺基酸序列，且為能與HLA-A11分子形成複合體之胜肽，而且在表面呈現該複合體之細胞可誘導特異性地識別該複合體的細胞毒性T細胞。
<2>一種胜肽，其包含在序列編號：4、6、1、2、14或13中記載之胺基酸序列中有1個或複數個胺基酸被
置換、缺失、添加及/或插入之胺基酸序列，且為能與HLA-A11分子形成複合體之胜肽，而且在表面呈現該複合體之細胞可誘導特異性地識別該複合體的細胞毒性T細胞。
<3>一種核酸，其編碼<1>或<2>之胜肽。
<4>一種表現載體，其含有編碼<1>或<2>之胜肽的核酸。
<5>一種用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗，其包含<1>或<2>之胜肽作為有效成分。
<6>一種用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗，其包含編碼<1>或<2>之胜肽的核酸作為有效成分。
<7>一種用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗，其包含在表面呈現<1>或<2>之胜肽與HLA-A11分子的複合體之抗原呈現細胞做為有效成分。
<8>一種針對PBF陽性癌的被動免疫療法劑，其包含能夠以<1>或<2>之胜肽或在表面呈現該胜肽與HLA-A11分子的複合體之抗原呈現細胞來刺激末梢血液單核細胞而得到的細胞毒性T細胞。
<9>一種針對PBF陽性癌的被動免疫療法劑，其包含使<1>或<2>之胜肽與HLA-A11分子的複合體或該複合體的多聚體和末梢血液單核細胞反應，形成細胞毒性T細胞結合至前述複合體或前述多聚體之結合體，而能夠從該結合體分離而得到的細胞毒性T細胞。
<10>一種用以治療PBF陽性癌之被動免疫療法劑的
製造方法，其包含以<1>或<2>之胜肽或在表面呈現該胜肽與HLA-A11分子的複合體之抗原呈現細胞來刺激末梢血液單核細胞並取得細胞毒性T細胞的步驟。
<11>一種用以治療PBF陽性癌之被動免疫療法劑的製造方法，其包含使<1>或<2>之胜肽與HLA-A11分子的複合體或該複合體的多聚體和末梢血液單核細胞反應，形成細胞毒性T細胞結合至前述複合體或前述多聚體之結合體，並從該結合體分離出細胞毒性T細胞的步驟。
<12>一種以PBF陽性癌細胞為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其以<1>或<2>之胜肽刺激末梢血液單核細胞，取得以PBF陽性癌細胞為標靶之細胞毒性T細胞，並測量選自由該細胞毒性T細胞所產生的細胞激素、趨化激素及細胞表面蛋白質所成群之至少1種分子的量。
<13>一種誘導以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的方法，其特徵係使用<1>或<2>之胜肽誘導細胞毒性T細胞。
<14>一種以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其包含使用<1>或<2>之胜肽誘導細胞毒性T細胞的步驟，與檢測在前述步驟中被誘導之細胞毒性T細胞的步驟。
<15>一種誘導以PBF陽性癌細胞為標靶之細胞毒性T細胞的方法，其特徵係使<1>或<2>之胜肽與末梢血液單核細胞在培養基中接觸，並誘導細胞毒性T細胞。
<16>一種以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其包含使<1>或<2>之胜肽與末梢血液單核細胞在培養基中接觸，並誘導細胞毒性T細胞的步驟，與檢測在前述步驟中被誘導之細胞毒性T細胞的步驟。
<17>一種以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其使<1>或<2>之胜肽與HLA-A11分子的複合體或該複合體的多聚體和末梢血液單核細胞或癌試料反應。
<18>一種用以誘導以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的套組，其包含<1>或<2>之胜肽。
<19>一種抗體，其特異性地結合至<1>或<2>之胜肽與HLA-A11分子的複合體。
藉由本發明，實現提供以PBF陽性癌為標靶之CTL可特異性地識別的HLA-A11限制性表位胜肽、利用該胜肽之用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗、前述CTL的誘導方法、利用前述CTL的被動免疫療法劑及其製造方法、與前述CTL的定量方法及該方法中使用的套組。
[圖1]MHC-單體的形成獲得確認時的代表性凝膠過濾管柱分析例之示意圖。
[圖2]PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽的摺疊測試結果之示意圖。
[圖3]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第1階段)之示意圖。
[圖4]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第2階段)之示意圖。
[圖5]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第3階段)之示意圖。
[圖6]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第1階段)之示意圖。
[圖7]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第2階段)之示意圖。
[圖8]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第3階段)之示意圖。
[圖9]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第1階段)之示意圖。
[圖10]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第2階段)之示意圖。
[圖11]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性CTL的檢測(第1階段)之示意圖。
[圖12]利用製成的MHC-四聚體試劑之PBF特異性
CTL的檢測(第2階段)之示意圖。
[圖13]ASV或SVL特異性CTL之交叉反應性的確認
[圖14]使用對照組胜肽探討細胞內IFNγ產生細胞定量法之示意圖。
[圖15]利用細胞內IFNγ產生細胞定量法之PBF特異性CTL誘導的確認(序列編號：4)之示意圖。
[圖16]利用細胞內IFNγ產生細胞定量法之PBF特異性CTL誘導的確認(序列編號：6)之示意圖。
[圖17]利用細胞內IFNγ產生細胞定量法之PBF特異性CTL誘導的確認(序列編號：1、2)之示意圖。
[圖18]圖示確認基因轉殖至人類骨肉瘤細胞株HOS之HLA-A11的表現的結果之直方圖。
[圖19]圖示PBF特異性CTL(序列編號：4)對表現HLA-A11之人類骨肉瘤細胞株的細胞毒性活性之圖表。
[圖20]圖示PBF特異性CTL(序列編號：6)對表現HLA-A11之人類骨肉瘤細胞株的細胞毒性活性之圖表。
針對本發明進行更詳細的說明。
如後述實施例所示，被在序列編號：1、2、4或6中
記載之胺基酸序列決定之來自PBF的胜肽能與HLA-A11分子形成複合體，且能誘導識別在表面上呈現該複合體之細胞的細胞毒性T細胞。此外，在序列編號：13中記載之胺基酸序列表現出與在序列編號：1、2中記載之胺基酸序列的高同源性；此外，在序列編號：14中記載之胺基酸序列表現出與在序列編號：6中記載之胺基酸序列的高同源性。而且，此等表現出高同源性之胺基酸序列更進一步具有與HLA-A11分子的結合中最重要的胺基酸(錨定模體)。
因此，本發明提供一種胜肽，其包含在序列編號：1、2、4、6、13或14中記載之胺基酸序列，且為能與HLA-A11分子形成複合體之胜肽，而且在表面呈現該複合體之細胞可誘導特異性地識別該複合體的細胞毒性T細胞。
本發明中所謂「胜肽」，意指相鄰的胺基酸殘基以α-胺基與羧基之間的胜肽鍵互相結合之分子鏈。胜肽不代表特定長度者，可為各種長度。此外，亦可為無電荷或鹽的型態，並且構成胜肽之「胺基酸」可為天然型亦可為非天然型，亦可為類似物(胺基酸的N-醯化物、O-醯化物、酯化物、醯胺化物、烷基化等)。
此外，結合至本發明之胜肽(由在序列編號：1、2、4、6、13或14中記載之胺基酸序列構成的胜肽等，以下亦稱為表位胜肽)，並能形成複合體之所謂的「HLA-A11」，為屬於來自人類主要組織相容性抗原(主
要組織相容基因複合體抗原、MHC分子、MHC抗原)的第Ia型的分子，例如可舉出來自HLA-A*11：01、HLA-A*11：02、HLA-A*11：03、HLA-A*11：04等的基因產物。
本發明中所謂「細胞毒性T細胞」，為亦稱為「CTL」之細胞，且為表現細胞表面蛋白質CD8之T細胞(CD8陽性T細胞、CD8+T細胞)，且為在識別被抗原呈現細胞呈現之抗原並活性化的情況下，能夠傷害具有相同抗原之細胞的細胞。再者，如後述之實施例中所記載，此細胞毒性活性為，在免疫檢查點機制被抑制(解除)的狀況下能夠發揮的細胞也被包含於本發明之細胞毒性T細胞。此外，本發明中所謂「表位胜肽」，意指具有誘導CD8陽性T細胞的生長、分化及/或活性化之活性的抗原性多肽。
作為本發明之表位胜肽的長度雖無特殊限制，但通常為5~30胺基酸，以6~25胺基酸為佳，以8~20胺基酸為更佳，以9或10胺基酸為特佳。
本發明中所謂「PBF」，為骨肉瘤特異抗原乳頭狀瘤病毒結合因子(Papillomavirus Binding Factor)，被稱為ZNF395之蛋白質，若為來自人類者，則典型地來說為由以GenBank登錄號：AAH01237.1決定之胺基酸序列構成之蛋白質(以GenBank登錄號：BC001237.1決定之核苷酸序列所編碼的蛋白質)。PBF蛋白質中除了這種具有典型的胺基酸序列者以外，還應該理解在自然條件下
PBF蛋白質中亦可能存在胺基酸突變者。
此外，本發明之表位胜肽，只要是保持期望的活性(後述之結合至HLA-A11分子的活性、誘導CTL的活性等)，在序列編號：1、2、4、6、13或14中記載之胺基酸序列中包含有1個或複數個胺基酸被置換、缺失、添加及/或插入之胺基酸序列，且能與HLA-A11分子形成複合體之胜肽，而且在表面呈現該複合體之細胞可誘導特異性地識別該複合體的細胞毒性T細胞之胜肽亦被包含於本發明中。胺基酸序列的置換、缺失、添加或插入通常為10胺基酸以內，以7胺基酸以內為佳，以5胺基酸以內為更佳，以3胺基酸以內(例如，2胺基酸以內，1胺基酸)為進一步更佳。
此外，以這樣的胺基酸修飾為目的，例如，可列舉出
1.用以提高與HLA之親和性的變更(Rosenberg SA et al,Nat Med.1998；4：321-327,Berzofsky JA et al,Nat Rev Immunol.2001；1：209-219)，2.用以提升TCR之識別性的變更(Fong L et al,Proc Natl Acad Sci USA.2001；98：8809-8814,Rivoltini L et al,Cancer Res.1999；59：301-306)，3.用以迴避血清中胜肽分解酵素等之代謝的變更(Berzofsky JA et al,Nat Rev Immunol.2001；1：209-219,Parmiani G et al,J Natl Cancer Inst.2002；94：805-818,Brinckerhoff LH et al,Int J Cancer.1999；83：326-334)
等。
再者，從表位胜肽的N端算起的第2個、與第9或第10個胺基酸為對於與呈現該表位胜肽之HLA第I型分子的結合而言最重要的胺基酸，被稱為錨定模體。此錨定模體因各HLA第I型分子的種類而異，但做為與HLA-A11分子結合之胜肽，為在從N端算起的第2個位置上配置Ile、Met、Ser、Thr、或Val中任何一者，在第9或第10個位置上配置Lys或Arg中任何一者之胜肽，且由9~10個胺基酸構成的胜肽最為人所熟知(Rapin N et al,Curr Protoc Immunol.2010；Chapter 18：Unit 18.17.)。因此，本發明之表位胜肽亦以長度9~10個的胺基酸，且從N端算起的第2個、及第9或第10個位置上為前述特定胺基酸為佳。
此外，為了上述之目的而在胜肽的N端或C端介入添加的胺基酸序列者亦被包含在內。而且，本發明之表位胜肽可作為添加糖類、聚乙二醇、脂質等之複合體、放射性同位素的誘導體、或聚合物等的型態使用。
此外，只要是在CTL能夠特異性地識別在細胞表面呈現HLA-A11分子與表位胜肽的複合體之細胞的範圍內，抗原胜肽的N端或游離的胺基亦可與甲醯基、乙醯基、t-丁氧基羰(t-Boc)基等結合，抗原胜肽的C端或游離羧基亦可與甲基、乙基、t-丁基、苄基等結合。
此外，本發明之表位胜肽，亦可為被施以便於導入活體內之各種修飾者。作為便於導入活體內之各種
修飾的例子，PT(Protein Transduction)結構域是有名的。HIV的PT結構域為由Tat蛋白質的第49~57個胺基酸(Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg，在序列編號：15中記載之胺基酸序列)構成之胜肽。報告指出藉由將此PT結構域添加至作為目的之蛋白質或胜肽的N端與C端兩方，或任何一方，可以容易地導入細胞內(Ryu J et al,Mol Cells.2003；16：385-391，Kim DT et al,J Immunol.1997；159：1666-1668)。
幾乎所有透過HLA第I型分子而被呈現的抗原在被細胞質內的蛋白酶體分解後，會被移送至TAP(transporter in antigen processing)，在粒狀內質網內與和TAP締合之HLA第I型分子結合，經過高基氏體而被胞外分泌往細胞表面搬運。因此，藉由使以在這一連串的抗原呈現路徑中發揮作用之伴護蛋白HSP(heat shock prtein)70或HSP90、或gp96為目的之胜肽或蛋白質融合，可有效率地呈現抗原(Basu S et al,Immunity.2001；14：303-313)。
此外，如上述被施以修飾之表位胜肽(以下，亦稱為修飾胜肽)，是否能在活體內發揮期望的活性，可藉由進行例如以下之分析來評價。
將HLA-A11分子的胞外區域及β2微球蛋白(β2m)、與修飾胜肽在試管內的適當溶液(摺疊溶液)
中混合，若HLA-A11分子與前述胜肽的結合力高，則該溶液中此等3種分子的締合反應即會順利進行，並形成3者的複合體(以下，亦稱為MHC-單體)。接著，可經由以凝膠過濾管柱分析來檢測此MHC-單體。相反地，在HLA-A11分子與修飾胜肽沒有結合力的情況下，則幾乎無法檢測出MHC-單體。因此，藉由隨著時間的變化分析摺疊溶液，或藉由進行熱處理等，可檢驗HLA-A11分子與修飾胜肽的結合性與安定性。
以1~3×106/mL的細胞濃度使分離自健康正常人的末梢血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells；PBMC)在適當的培養基中漂浮，將修飾胜肽單獨、或混合數種修飾胜肽，以達到例如1~100μg/mL的濃度的方式加入其中，並以達到100μL/孔的方式分注至96孔培養板。於5% CO2的恆溫槽中在37℃下培養，2天後添加IL-2。以後，在7~14天內進行1次胜肽與IL-2的刺激以誘導CTL。以這樣的方式誘導之CTL對修飾胜肽是否有特異性的探討，可利用例如後述之MHC-多聚體法等來判定，而且在檢測出能以後述之MHC-多聚體染色之CTL時，可鑑定所使用之修飾胜肽為具有CTL誘導能力之抗原性胜肽(表位胜肽)。
再者，一般性地從胸腺移出之T細胞(初始T細胞)會受到樹狀細胞或巨噬細胞等抗原呈現細胞的抗
原刺激而首次活性化並分化為效應T細胞。這個單純地將PBMC與胜肽混合培養的方法中，因為沒有特地使用人為調製的抗原呈現細胞，所以末梢血液的初始T細胞分化的可能性低，PBMC中存在的效應/記憶T細胞會被認為是因胜肽刺激而生長。因此，在檢測出能以後述之MHC-單體或MHC-多聚體染色之CTL的時，代表供血者PBMC中原本就存在效應/記憶型的CTL，暗示透過抗原性胜肽之免疫反應在活體內不斷地被引起。
於本發明，無論是如上述所示在評價表位胜肽的HLA-A11分子結合性方面，還是如後述所示在以PBF陽性癌為標靶之CTL的誘導及定量化CTL方面，本發明之由表位胜肽與HLA-A11分子(該胞外區域及β2m)構成的複合體(MHC-單體)、以及該複合體的多聚體(MHC-多聚體)都是有用的。
包含本發明之表位胜肽之MHC-單體及其多聚體，例如可依照為公眾所知的方法(US Patent Number 5,635,363，French Application Number FR9911133)來調製。更具體地來說，為使精製自蛋白質表現用基因重組宿主之HLA-A11分子的胞外區域及β2m，與本發明之表位胜肽這3者的複合體之MHC-單體在摺疊溶液中形成。在這裡，預先在基因重組HLA-A11分子的胞外區域的C端添加生物素結合部位，並在MHC-單體形成後在這個部位
添加生物素。經由將市售的色素標識鏈親和素與生物素化MHC-單體以所期望的莫耳比(例如，在形成四聚體的情況下為1：4)混合可製造MHC-多聚體。藉由組合使用針對MHC-多聚體與細胞表面蛋白質之抗體(例如，針對CD62L、CCR7或CD45RA等的抗體)，可調查CTL的分化階段(Seder RA et al,Nat Immunol.2003；4：835-842)。或者藉由與細胞內細胞激素染色法組合，也可用於CTL的功能性評價。例如，關於骨髓移植後的巨細胞病毒(CMV)特異性CTL，不僅調查該CTL是否存在，調查細胞激素產生能力的強弱被認為對於推測投與抗病毒藥等的時機是有效的(Ozdemir E et al.Blood 2002；100：3690-3697)。若像這樣鑑定特異性的CTL可識別之表位胜肽，並製造MHC-多聚體，則可實現特異性的CTL的定量與定性，並在取得診斷資訊方面做出莫大的貢獻。
再者，本發明中作為形成MHC多聚體之MHC單體的數量雖無特殊限制，但通常為2~10，以4~8為佳，以4(MHC四聚體試劑)或5(MHC五聚體試劑)為更佳，以4為特佳。
因蛋白酶體之蛋白質分解而產生的胜肽片段經由TAP(transporter associated with antigen processing)分子被導往內質網內腔，結合至HLA第I型分子，並被輸送至細胞膜表面。缺少此TAP分子之TAP基因缺陷細胞
株則無法在細胞膜表面表現內在性蛋白質的分解產物胜肽片段。此外，代表性的TAP基因缺陷細胞株人類淋巴母細胞樣細胞株T2，或將HLA-A11分子基因轉殖至T2之細胞株(T2-A11)的HLA分子，在細胞膜表面上的表現是非常不安定的。然而，在與從外部供給的胜肽結合的情況下，HLA-A11分子會在細胞膜表面上安定化。利用此性質，TAP基因缺陷細胞株可以使用於檢驗HLA-A11分子與從外部供給的胜肽之結合性的實驗。具體地來說，混合培養TAP基因缺陷細胞株與修飾胜肽，以抗HLA-A11抗體染色，以流式細胞儀算出HLA-A11分子表現強度的變化，藉此可探討作為標靶之HLA-A11分子與修飾胜肽的結合性。當添加的修飾胜肽結合至TAP基因缺陷細胞株表現的HLA-A11分子時，HLA-A11分子與胜肽的複合體在細胞膜表面上安定化，而且在以抗HLA-A11抗體染色時會觀察到HLA-A11分子的表現增強。相反地，當添加的修飾胜肽不顯示出與HLA-A11分子的結合性時，細胞膜表面上的HLA-A11分子不安定，即使以抗HLA-A11抗體染色也無法觀察到HLA-A11分子的表現增強。使用這樣的方法可以檢驗修飾胜肽對HLA-A11分子的結合性。
此外，除了評價上述對HLA-A11分子的結合性，亦可經由在後述之〔以PBF陽性癌為標靶之CTL的定量]中記載的方法，評價修飾胜肽是否具有誘導CTL的活性。
此外，包含以上的修飾胜肽，本發明之表位胜肽可經由傳統的各種胜肽合成方法調製。例如，固相胜肽合成法等的有機化學合成法，或者，亦可調製編碼胜肽的核酸，並利用基因重組DNA技術來調製。此外，亦可經由市售的化學合成設備(例如應用生命系統股份有限公司(Applied Biosystems)的胜肽合成設備)合成。
編碼本發明之表位胜肽的核酸，或含有該核酸之表現載體亦被包含於本發明中。
編碼本發明之表位胜肽的核酸，對於為了利用基因重組技術，在宿主內產生該表位胜肽而言很重要。
在此情況下，由於宿主間胺基酸密碼子的使用頻率(codon usage)不同，因此需要變更胺基酸密碼子以適合產生表位胜肽的宿主的codon usage。
此外，編碼本發明之表位胜肽的核酸作為疫苗也是很重要的，作為裸露的核酸移送時亦可使用適當的病毒或細菌載體來移送(Berzofsky JA et al,J Clin Invest.2004；114：450-462，Berzofsky JA et al,J Clin Invest.2004；113：1515-1525)。作為適當的細菌載體，例如可舉出來自沙門桿菌屬亞種之細菌的載體。作為適當的病毒載體，例如為逆轉錄病載體、EBV載體、牛痘載體、仙台病毒載體、慢病毒載體。適當的牛痘載體的其中1例為修飾牛痘‧安卡拉載體。此外，作為本發明之載體的理想態
樣，可舉出能夠表現本發明之表位胜肽為例。該載體，通常為在啟動子的下游擔載被本發明之核酸功能性地連結之構造的DNA構建體的載體。
本發明之表位胜肽，可作為主動免疫療法中的胜肽疫苗使用。即，對患者投與包含本發明之表位胜肽而成之疫苗，可以使識別該胜肽與HLA-A11分子之複合體的CTL在體內生長，並有助於對PBF陽性癌的預防、及治療。
所使用的表位胜肽可僅使用1種，或者亦可視疫苗的使用目的混合或連結2種以上的胜肽並使用。
呈現本發明之表位胜肽之抗原呈現細胞可作為主動免疫療法中的疫苗使用。所謂「抗原呈現細胞」，雖然代表例如樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞、某種T細胞等，但代表在細胞表面上表現該胜肽可結合之HLA分子之細胞，且為具有CTL誘導能力者。
所謂「呈現表位胜肽之抗原呈現細胞」，意指
1.在適當的培養液中，將抗原呈現細胞與表位胜肽混合例如30分鐘至1個小時調製而成的表位胜肽衝擊(譯註：pulse)抗原呈現細胞
2.使用編碼表位胜肽之核酸，藉由基因轉殖等使抗原呈現細胞呈現表位胜肽之細胞
3.人工調製之具有抗原呈現能力的人工抗原呈現細胞。所謂「人工調製而成之具有抗原呈現能力的人工抗原呈現細胞」，例如可藉由在脂質雙層膜或塑膠或者乳膠等的珠粒上固定HLA-A11與CTL表位胜肽的複合體，並固定可刺激CTL之CD80、CD83或CD86等的共刺激分子，或者固定對於與共刺激分子結合之T細胞方面的配位子CD28有激動作用之抗體等來調製(Oelke M et al,Nat Med.2003；9：619-624，Walter S et al,J Immunol.2003；171：4974-4978，Oosten LE et al,Blood.2004；104：224-226)。
編碼本發明之表位胜肽的核酸可用於主動免疫療法中的DNA疫苗或基因重組病毒載體疫苗等。在此情況下，表位胜肽的核酸序列需要變更為適合產生基因重組疫苗或基因重組病毒疫苗之宿主的codon usage(Casimiro,D.R.et al,J.Virol.2003；77：6305-6313，Berzofsky JA et al,J Clin Invest.2004；114：450-462)。
本發明之表位胜肽可用於被動免疫療法劑的調製。即，可使用本發明之表位胜肽，以下列方式調製以PBF
陽性癌為標靶之CTL，並且視需要精製以提高純度，經由更進一步將該細胞懸浮於含有人類白蛋白之PBS等，製成針對PBF陽性癌之被動免疫療法劑。
使PBMC與適當濃度的本發明之MHC多聚體反應。由於與MHC多聚體結合之PBF特異性CTL會被標識色素染色，所以使用細胞篩選器、顯微鏡等僅將被染色的CTL分離出來。被以這樣的方式分離的PBF特異性CTL，藉抗CD3抗體、PHA、IL-2等的T細胞刺激藥劑、或藉因X光照射或者絲裂黴素處理等而喪失生長能力的抗原呈現細胞刺激生長，確保被動免疫療法中所需要的細胞數。
將本發明之MHC-單體及/或MHC多聚體在無菌培養板等固相化，並在該固相化培養板中培養PBMC。為了將結合至培養板中被固相化的MHC-單體及/或MHC多聚體之CTL分離出來，將沒有結合的其他漂浮細胞洗去後，僅將培養板上殘留的CTL懸浮於新的培養基中。以這樣的方式分離的CTL，藉抗CD3抗體、PHA、IL-2等的T細胞刺激藥劑、或藉因X光照射或者絲裂黴素處理等而喪失生長能力的抗原呈現細胞刺激生長，確保被動免疫療法中所需要的細胞數。
將本發明之MHC-單體及/或MHC多聚體，和CD80、CD83、CD86等的共刺激分子、在無菌培養板等固相化，或者和與對於和共刺激分子結合之T細胞方面的配位子CD28有激動作用之抗體等在無菌培養板等固相化，並在該固相化培養板中培養PBMC。接著，例如在2天後添加IL-2至培養基中並於5% CO2的恆溫槽中在37℃下培養7~14天。回收培養細胞並在新的固相化培養板上繼續培養。藉由重複進行此操作來確保被動免疫療法中所需要之細胞數的CTL。
以本發明之表位胜肽直接刺激PBMC或T細胞，或是以衝擊(譯註：pulse)該胜肽之抗原呈現細胞，基因轉殖抗原呈現細胞，或者人工調製之具有抗原呈現能力的人工抗原呈現細胞刺激。接著，例如於5% CO2的恆溫槽中在37℃下培養經由刺激而被誘導之CTL 7~14天。藉由重複進行每周1次以表位胜肽與IL-2、或與抗原呈現細胞IL-2的刺激來確保被動免疫療法中所需要之細胞數的CTL。
再者，如後述之實施例中所示，在以本發明之表位胜肽直接刺激的情況中，以使該胜肽與末梢血液單核細胞在培養基中接觸為佳，以在含有血漿之培養基中接
觸為更佳。作為調製CTL時的培養基並無特殊限制，可適當使用為公眾所知的培養基(例如，RPMI1640培養基)。此外，培養基中的血漿濃度以1~10%為佳，以3~10%為更佳，以5~10%為進一步更佳，從長期培養時容易確保充分血漿量的觀點來看，以5%為特佳。
於CTL的調製方法，當以PBF陽性癌為標靶之CTL的比例低時，可隨時藉由利用以下的方法以高純度回收該CTL。
可使本發明之MHC-單體及/或MHC-多聚體與透過CTL調製方法誘導之CTL反應，並使用磁性標識針對標識MHC-單體及/或MHC-多聚體之標識色素的抗體的2次抗體等來分離。這樣的磁性標識2次抗體與磁性標識細胞分離設備，例如可從Dynal公司或Miltenyi Biotec GmbH公司取得。以這樣的方式分離之以PBF陽性癌為標靶之CTL，藉抗CD3抗體、PHA、IL-2等的T細胞刺激藥劑刺激生長，確保被動免疫療法中所需要的細胞數。
以PBF陽性癌為標靶之CTL，可利用釋放出來的細胞激素等來精製該CTL。例如，亦可藉由使用可從
Miltenyi Biotec GmbH公司取得之套組，在細胞表面用特異抗體捕捉從CTL釋放出來的細胞激素，並以抗細胞激素標識抗體染色，接著以磁性標識之標識物質特異性抗體使之反應後，利用磁性標識細胞分離設備來精製。以這樣的方式分離之以PBF陽性癌為標靶之CTL，藉抗CD3抗體、PHA、IL-2等的T細胞刺激藥劑刺激生長，確保被動免疫療法中所需要的細胞數。
報告指出CTL的細胞表面有表現因特異性刺激而增強之細胞表面蛋白質(例如，CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)(Betts MR et al,J Immunol Methods.2003；281：65-78，Trimble LA et al,J Virol.2000；74：7320-7330)。可藉由磁性標識針對這樣的細胞表面蛋白質的特異抗體，使用磁性分離設備等來精製CTL。此外，藉由磁性標識針對這樣的抗體的抗IgG抗體等也同樣可以精製CTL。或者，亦可將此等抗體塗布於培養用塑膠培養板上，並培養用此培養板施加刺激之PBMC，藉由洗去沒有與培養板結合之細胞群來精製CTL。以這樣的方式分離之以PBF陽性癌為標靶之CTL，藉抗CD3抗體、PHA、IL-2等的T細胞刺激藥劑刺激生長，確保被動免疫療法中所需要的細胞數(請參考WO2008/023786)。
再者，以這樣的方式調製之CTL細胞的細胞
毒性活性，例如，亦可利用以螢光色素CFSE(Dojindo Laboratories)標識標靶細胞之IMMUNOCYTO Cytotoxicity Detection Kit(Medical & Biological Laboratories Co.,Ltd.)，或是利用測量從標靶細胞被釋放出來的LDH(乳酸脫氫酶)之Cytotoxicity Detection Kit(Roche公司)等來測量。此外，可經由以放射性同位素51Cr標識並利用標靶細胞之鉻釋放分析來測量。
於本發明，亦提供用以誘導在上述各種方法中有用、且包含本發明之表位胜肽的以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的套組。
於該套組，本發明之表位胜肽亦可以MHC單體、MHC-多聚體、呈現該胜肽之抗原呈現細胞的態樣被包含在內。此外，除了本發明之表位胜肽以外，使之與該胜肽反應的PBMC、用以檢測該胜肽的試劑(色素、2次抗體)亦可被包含於本發明之套組中，而且，亦可包含用以培養PBMC或被誘導之CTL的培養基、用以放大CTL之T細胞刺激藥劑等。
如上述所示，本發明之表位胜肽，編碼該胜肽之核酸，及呈現該胜肽之抗原呈現細胞在針對PBF陽性癌之主動免疫療法中是有用的。此外，以前述抗原呈現細胞等
誘導之CTL在針對PBF陽性癌之被動免疫療法中是有用的。
因此，本發明亦可提供包含本發明之表位胜肽等之癌症疫苗以及含有本發明之CTL細胞作為有效成分之抗癌劑(以下，有時亦統稱為抗癌劑等)。
作為本發明之抗癌劑等的治療或預防對象之「PBF陽性癌」，只要是表現PBF者即可，例如可舉出骨肉瘤、肺癌、胃癌、乳癌、肝癌。
此外，被包含於本發明之抗癌劑等的細胞(抗原呈現細胞及CTL)，可為各自獨立、來自被投與該藥劑之對象者(本身)，而且亦可為與前述對象HLA的類型適合之同種異體關係。
在不阻礙此等作用的範圍內，本發明之抗癌劑等亦可在本發明之表位胜肽、細胞中包含為了醫藥的製劑化而被普遍利用之各種賦形劑或其他醫藥活性成分等，並可使用在該領域為公眾所知的方法來製劑化。例如，作為這種抗癌劑等，有含有本發明之表位胜肽做為有效成分的注射劑或固形劑等。表位胜肽能以中性或鹽的型態進行處方，例如，作為可在藥學上被容許的鹽，可舉出鹽酸、磷酸等的無機鹽，或醋酸、酒石酸等的有機酸。此外，本發明之抗原呈現細胞或CTL亦可與在製藥上被容許，且與該胜肽或該細胞的活性具有相容性之賦形劑，例如，水、食鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油、液體培養基、DMSO(二甲亞碸)、及其他的佐劑(例如，氫氧化鋁、KLH、
MPL、QS21、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、磷酸鋁、BCG、明礬、CpG DNA等的TLR的促效劑)等混合使用、或與此等之組合物混合使用。而且，亦可視需要添加白蛋白、潤濕劑、乳化劑等的輔助劑。此外，除了上述佐劑以外，亦可添加各種細胞激素(例如，IL-12、IL-18、GM-CSF、IFNγ、IFNα、IFNβ、IFNω、Flt3配位子)作為免疫增強劑。
本發明之抗癌劑等，雖能以非經口投與及經口投與來投與，但一般而言以非經口投與為佳。作為非經口投與有經鼻投與或皮下注射、皮內注射、肌內注射、靜脈注射、患處局部注射等的注射劑、栓劑等。此外，作為經口投與可作為與澱粉、甘露糖醇、乳糖、硬脂酸鎂、纖維素等的賦形劑之混合物來調製。
本發明之抗癌劑等，亦可與癌症的治療或預防中所使用的為公眾所知的醫藥組成物合併使用。此外，本發明之抗癌劑通常雖為以人類為對象而使用者，但能以其他的動物(各種家畜、家禽、寵物、實驗用動物等)為對象。此外，作為被投與本發明之抗癌劑等的對象並無特殊限制，不限罹患PBF陽性癌者，亦可為未罹患者。例如，從預防該癌症復發的觀點來看，亦可為曾經以外科手術、化學療法、放射線療法等治療癌症者。
本發明之抗癌劑等是以治療上有效的量投與。投與的量取決於治療對象、免疫系統，且必要的投與量是由臨床醫師的判斷決定。通常，適當的投與量為每一
位患者表位胜肽1~100mg，在呈現該胜肽之抗原呈現細胞或以PBF陽性癌為標靶之CTL設為106~109個的含有量。此外，投與間隔可由對象、目的設定。
此外，如後述之實施例中所示，從解除免疫耐受性機制造成CTL在免疫學上的無應答性的觀點來看，亦可視需要進行抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體等的免疫檢查點抑制劑的合併使用。
因此，本發明亦提供一種用以治療或預防對象的PBF陽性癌的方法，其特徵為以這樣的方式使本發明之抗癌劑等投與至對象中。
本發明之抗癌劑等的製品或其說明書，可為附有主旨為用於癌症的治療或預防之聲明者。這裡所謂「在製品或說明書中附聲明」，意指將聲明附在製品本身、容器、包裝等，或是將聲明附在揭露製品資訊的說明書、附屬文件、宣傳品、其他印刷物等。在主旨為用於癌症的治療或預防之聲明中，可包含經由以本發明之表位胜肽、呈現該胜肽之抗原呈現細胞、或前述抗原呈現細胞等誘導之CTL，誘導癌症的生長抑制、細胞死等的機制的相關資訊。
知悉以PBF陽性癌為標靶之CTL是否存在於癌症患者的末梢血液或腫瘤局部，或者其數量的變動，對於決定疫苗的投與量、接種次數、接種間隔等而言非常重要。在
被投與使用本發明之表位胜肽調製之疫苗或被動免疫療法劑的患者中定量地測量以PBF陽性癌為標靶之CTL，和測量疫苗或被動免疫療法劑的效果成分(譯註：effect component)意義相同。而且，對於本發明中所提供之被動免疫療法劑的調製步驟及測量最終製劑之有效成分量的品質鑑定而言也是重要的。以PBF陽性癌為標靶之CTL的定量可經由利用本發明之表位胜肽之以下3個方法來進行。
可利用使用本發明之表位胜肽製造的MHC-單體及/或MHC-多聚體(以下，有時亦統稱為MHC-多聚體等)定量末梢血液中以PBF陽性癌為標靶之CTL。定量例如能以以下的方式實施。使末梢血液，PBMC或癌試料與適當濃度之MHC-多聚體等反應。由於與該MHC-多聚體等結合之CTL會被標識色素染色，所以可使用流式細胞儀、顯微鏡等來計數。在使之與MHC-多聚體等反應時，藉由使之與被以和MHC-多聚體等不同的色素標識之抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等反應，亦可以同時判定以PBF陽性癌為標靶之CTL的T細胞子群。
本發明中所謂「癌試料」意指被以外科手術或生物檢體等活組織檢驗等分離之包含癌細胞的試料，可為僅以癌細胞構成之腫瘤組織，而且亦可為包含該腫瘤組織周圍之非癌細胞的組織。此外亦可為腫瘤組織浸潤淋巴
球。再者，所謂腫瘤組織浸潤淋巴球，意指從罹癌對象切除之腫瘤組織中或從收集到的胸腹水中分離來出來的淋巴球。
一種定量以本發明之表位胜肽刺激PBMC，CTL因而產生之IFNγ(干擾素γ)、TNFα(腫瘤壞死因子α)、介白素等的細胞激素及/或趨化激素的方法。以下舉IFNγ為例具體地展示方法。
使PBMC以約2×106/mL的細胞濃度漂浮於適當的培養基中，並添加本發明之表位胜肽。進一步添加細胞內蛋白質輸送抑制劑(例如，Brefeldin A或Monensin等)，於5% CO2的恆溫槽中在37℃下培養5~16小時。培養後，使之與T細胞標記抗體(抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體)或MHC-多聚體等反應，將細胞固定後，進行膜透過處理，並使色素標識抗IFNγ抗體反應。
使用流式細胞儀等分析，定量全細胞中、T細胞中或MHC-多聚體等陽性細胞中的IFNγ陽性細胞率。
在將IFNγ抗體固相化之96孔MultiScreen-HA培養板
(Millipore公司)中播入PBMC。其後，將本發明之表位
胜肽加入各孔並於37℃之5% CO2的恆溫槽培養器中培養20小時。隔天，洗淨培養板，以抗IFNγ抗體、過氧化酶標識抗IgG抗體的順序使之反應。進一步添加過氧化酶的受質，經由呈色而將IFNγ可視化，並藉由使用立體顯微鏡或ELISPOT分析儀(Cellular Technology Limited)計數來定量。
使PBMC以約2×106/mL的細胞濃度漂浮於適當的培養基中，並添加本發明之表位胜肽。於5% CO2的恆溫槽中在37℃下培養24~48小時。培養後，使用市售之ELISA套組(例如R&D Systems,Inc.的Quantikine ELISA Human IFNγ Immunoassay)定量培養上清液中所含之IFNγ濃度。
使用細胞表面蛋白質特異抗體進行定量。報告指出特異性地識別本發明之表位胜肽的CTL經由與該胜肽的結合而被刺激，細胞表面蛋白質(例如CD137、CD107a、CD107b、CD63、CD69等)的表現會增強。因此，藉由混合以本發明之表位胜肽等刺激之PBMC與特異性地識別細胞表面蛋白質之標識抗體，CTL會與標識抗體結合，並被
標識色素染色。被染色之CTL可使用流式細胞儀、顯微鏡等來計數並定量。而且，藉由添加以與標識抗體不同的色素標識之抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等，亦可以同時判定CTL的T細胞子群。
對由本發明之表位胜肽與HLA分子的胞外區域及β2m構成之複合體(MHC-單體)特異之單株抗體(以下，亦稱為pMHC抗體)，可特異性地檢測在細胞膜表面呈現本發明之表位胜肽之癌細胞或抗原呈現細胞。因此，pMHC抗體除了可作為癌症免疫療法的診斷藥使用以外，經由使之與抗體依存性細胞毒性活性(以下，亦稱為ADCC活性)或抗癌劑結合，亦具作為特異性高之治療用抗體的有用性。
一般而言pMHC抗體的取得依照噬菌體顯示法來進行。所謂噬菌體顯示法，為以不使噬菌體失去感染力的方式，使外來基因以融合蛋白質的形式表現。已知可利用此方法使噬菌體表現抗體可變區域並進行篩選，藉此分離出特異性的單株抗體(Tsukahara T et al,J Biol Chem.2014；289：22035-22047)。更具體地來說，是以pMHC抗體的取得、抗體基因庫的製作、淘洗、抗體的分離、評價之流程進行。於淘洗步驟，可使用將本發明之表位胜肽與HLA分子的胞外區域及β2m之複合體在ELISA板上固相化、或以生物素-抗生物素結合固定者，使噬菌
體基因庫在其中反應，並重複洗淨‧沖提，藉此分離出對本發明之表位胜肽與HLA分子的胞外區域及β2m之複合體特異且結合力高的抗體。所得到的抗體，可經由在前述TAP基因缺陷株T2中添加表位胜肽，使抗體反應，並以FCM測量平均螢光強度等來評價。
再者，本說明書中被引用的所有先前技術文獻，作為參考而被併入本說明書中。
以下出示實施例來具體說明本發明，但本發明並不受此等所限。只要沒有特殊聲明，實驗方法參考教科書(Immunization Experiments Procedures(原文：免疫實驗操作法)，Shunsuke Migita,Susumu Konda,Tasuku Honjo,Toshiyuki Hamaoka,Nankodo Co.,Ltd.1995)進行。
本發明為了提供以HLA-A11保持者為對象之針對骨肉瘤等惡性腫瘤之免疫療法等，以骨肉瘤特異抗原PBF為對象，嘗試鑑定對該療法等有用之用以誘導表現HLA-A11限制性之細胞毒性T細胞的表位胜肽(CTL表位胜肽)。
即，為了以後述之摺疊測試等評價，從PBF的序列中任意選擇表1中記載的9種序列合成。
再者，表1中顯示出HLA-A*11：01限制性PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽的特徵。此外，表2中亦列出用作後述之對照組的胜肽。做為正對照用之胜肽，使用來自人類巨細胞病毒(CMV)的pp65蛋白質之HLA-A*11：01限制性限制性表位胜肽，作為負對照用之胜肽，使用survivin-2B的HLA-A*24：02限制性表位胜肽。此外，表中的「胜肽名」根據從各胜肽的N端開始的3個胺基酸決定。「位置」，代表PBF等在來源蛋白質之胺基酸序列上的位置。
接著，為了從表1中記載的9種序列中選拔出在活體內發揮功能之PBF特異性CTL抗原決定基，進行下列(1)及(2)的試驗。
(1)摺疊測試
(2)表位胜肽特異性CTL的檢測
發明者群化學合成表1及2中記載之11種胜肽，並實施摺疊測試。具體地來說，為將利用大腸桿菌表現系統表現並精製之HLA-A*11：01及β2微球蛋白(β2m)、與合成胜肽添加至摺疊溶液中混合後，隨著時間的變化分離取樣摺疊溶液並以過濾管柱分析。當HLA-A*11：01與β2m與PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽這3者的複合體(MHC-單體)的形成獲得確認時，由於MHC-單體的分子量比原料大，所以在凝膠過濾管柱分析中的沖提時間變快。此外，MHC-單體形成量，可從以280nm吸收波長得到的峰面積算出。相反地，在不具與HLA-A11分子之結合性的候選胜肽方面MHC-單體的形成則未獲得確認。MHC-單體的形成獲得確認時的代表性凝膠過濾管柱分析例示於圖1。
凝膠過濾管柱分析時，由於HLA分子與β2m在大腸菌表現系統為包涵體，所以精製為不溶性區分後，使之可溶於8M尿素中使用。此外，該分析的結果中，難溶性HLA分子雖不會形成MHC-單體但作為凝聚體會在7~8分鐘被檢測出來。然而，多數凝聚體會被凝膠過濾管柱分析的前處理步驟之過濾器過濾而被除去大部分。β2m為可溶性蛋白質，在摺疊溶液中被可溶化，在使用
Superdex75 10/300GL(GE Healthcare公司)為凝膠過濾管柱的情況下，會在14分鐘左右被檢測出來。15分鐘以後會檢測出摺疊溶液的組成物或胜肽。圖1中所示為：在摺疊測試剛開始(day 0)的10分鐘左右，MHC-單體的波峰無法獲得確認，但在1天後(day 1)、3天後(day 3)波峰變大，MHC-單體的形成正順利進行中。
於圖2，展示以這樣的方式對9種胜肽實施摺疊測試的1、3、7天後的分析結果。再者，該圖中以長條圖表示代表MHC-單體形成之波峰的面積。
如圖2所示結果顯示，與負對照組相比，PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽(序列編號：1~9)確認有充分的MHC-單體形成。
接下來，為了在後述之〔PBF特異性CTL的確認]中使用，根據摺疊測試的結果，使用HLA-A*11：01結合性之PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽，製造螢光色素(PE)標識MHC-四聚體試劑。具體地來說，首先，使精製自蛋白質表現用基因重組宿主的HLA第I型分子、β2m及PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽的複合體MHC-單體在適當的摺疊溶液中形成。再者，預先在基因重組HLA第I型分子的C端添加生物素結合部位，並在MHC-單體形成後在這個部位添加生物素。接著，經由將市售的PE標識鏈親和素與生物素化MHC-單體按照莫耳
比1：4混合來製造MHC-四聚體試劑。本實施例中製造的MHC-四聚體試劑例如以ASV-Tet縮寫表示，這代表使用HLA-A*11：01與ASV胜肽與β2m這3者的複合體製造的MHC-四聚體試劑。
如上述，選擇具有對HLA-A*11：01結合模體的9種胜肽作為PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽。進一步經由摺疊測試可知，試管內HLA-A*11：01與β2m與9種PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽會各自結合並形成MHC-單體。
接下來，為了確認識別此等PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽與HLA-A*11：01的複合體之CTL是否存在於活體內，有必要探討是否有可能利用保持HLA-A*11：01之供血者的末梢血液來放大存在於末梢血液中的PBF特異性CTL。
使用Genosearch HLA-A Ver.2(Medical &
Biological Laboratories Co.,LTD.)並以HLA-A基因型判定來確認供血者是否保有HLA-A*11：01後，使用來自保有HLA-A*11：01之5名健康成人的PBMC來進行其後的探討。
MLPC法為在PBMC培養液中添加胜肽並誘導CTL
的方法(Karanikas V et al,J Immunol.2003；171：4898-4904，Tsukahara T et al,J Transl Med.2009；7：44)。胜肽被存在於PBMC中的抗原呈現細胞，例如，樹狀細胞、B細胞、巨噬細胞、某種T細胞呈現，而PBMC中所含的記憶型胜肽特異性CTL被認為會受到刺激而生長。與後述之利用抗原呈現細胞的誘導法不同，在不需事先調製抗原呈現細胞這一點上有所區別，優點是可以簡便地實施。
為一種藉由刻意不使用抗原呈現細胞來刺激並使在末梢血液中循環之記憶/效應型CTL生長的方法。
於是首先，將採自保有HLA-A*11：01之健康成人的末梢血液在3,000rpm的條件下進行5~10分鐘離心處理，並回收上清液的血漿部分。血漿部分以外則以傳統方法之密度梯度離心法分離出PBMC。
再者，作為CTL誘導用培養基，於RPMI1640 Hepes modify(Sigma公司)中添加0.1% 2-巰基丙醇、1% L-麩醯胺酸、作為抗生素之100μg/mL鏈黴素與100units/mL青黴素，並更進一步以達到5%的方式添加前述血漿來調製並使用。
接著，使約3×107個的前述PBMC漂浮於10mL的此培養基中。將9種PBF特異性CTL抗原決定基候選胜肽中的3~5種胜肽各以10μg/mL的濃度加入其中。胜肽的濃度雖可視胜肽的溶解度變更，但本實施例中以10μg/mL來實施。PBMC與胜肽的混合培養使用96孔U底細胞培養用微量培養板(Becton,Dickinson and
Company)。細胞在37℃、5% CO2恆溫槽中培養。2天後以最終濃度20~100U/mL進行IL-2的添加。其後適當地進行IL-2添加CTL誘導培養基的更換。PBF特異性CTL的確認以培養2周為目標實施。當PBF特異性CTL的誘導獲得確認時，使用胜肽衝擊(譯註：pulse)抗原呈現細胞刺激，或直接以胜肽刺激，並嘗試建立CTL系。
以前述方法培養之細胞群中是否存在PBF特異性CTL的探討，使用以上述方法調製之MHC-四聚體實施(MHC-四聚體法)。培養後，對適量的細胞數添加10μL的PE標識MHC-四聚體試劑與20μL之FITC(fluorescein isothiocyanate)標識T細胞表面抗體(CD8)等。其後，溫和地混合並在2~8℃下靜置60分鐘，或在室溫下靜置30分鐘。添加1.5mL的PBS並攪拌後，在3,000rpm的條件下離心分離5分鐘。將上清液吸取廢棄後，將細胞再次懸浮於400μL之PBS。此時，為了去除來自死細胞之非特異性螢光，添加7-AAD viability Dye(死細胞檢測試劑，Medical & Biological Laboratories Co.,Ltd.)。在24小時內以流式細胞儀分析。
以3階段進行PBF特異性CTL的確認。第1階段，以3~5種的混合胜肽誘導，並在2周後，每條96孔U底細胞培養用微量培養板的各縱列(Lane)，各回收8孔的一部分細胞，將之混和後匯集(譯註：pool)做為
1個樣本(列匯集(譯註：lane pool))，使用相應於誘導用胜肽之3~5種MHC-四聚體混合試劑鑑定檢測出陽性細胞群之Lane。第2階段，在第1階段中PBF特異性CTL的誘導獲得確認之Lane，將縱列的8孔的細胞分別回收並以相應於誘導用胜肽之3~5種MHC-四聚體混合試劑鑑定檢測出陽性細胞群之孔。第3階段，為了檢驗在第2階段被鑑定之孔的細胞群對哪個胜肽具有特異性，使用各個MHC-四聚體試劑分別實施檢測，並特定檢測出陽性細胞的MHC-四聚體試劑。藉由使用這樣的方法，確認在96孔U底細胞培養用微量培養板的哪個位置的孔，對哪個胜肽具有特異性之PBF特異性CTL被誘導。
於圖3，展示以MLPC法誘導PBF特異性CTL後，進行第1階段之確認後的代表性結果。即，混合在表1中記載之CTL抗原決定基候選胜肽QVA、LSA及SLP這3種胜肽，各添加至3名健康成人(Donor A、Donor B及Donor C)的PBMC中培養約2周。2周後調整列匯集(譯註：lane pool)(Lane 1~12)，並將以3種MHC-四聚體混合試劑(QVA-Tet、LSA-Tet及SLP-Tet)與CD8-FITC染色並分析之結果示於圖3。
圖3中，點圖展開圖中的數字代表當以UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)標記將展開圖分成四等分的區域時，(UR+LR)部分的UR的百分比。以X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之MHC-四聚體混合試劑螢光強度的
點圖展開圖圖示。
如圖3所示，在Donor C的Lane 10的UR檢測出明顯的CD8陽性且對3種MHC-四聚體混合試劑陽性的細胞群。這表示，Donor C的末梢血液中存在對於在CTL誘導時使用的3種混合胜肽之中的至少1種以上的候選胜肽特異性地反應並生長之記憶型的PBF特異性CTL。
接下來將實施第2階段分析的結果示於圖4。
分別回收Donor C的Lane 10的各孔(10-A~10-H)，合計8孔的細胞群，並同樣地以3種MHC-四聚體混合試劑(QVA-Tet、LSA-Tet及SLP-Tet)與CD8-FITC染色。其結果，於Donor C的Lane 10的G孔(10-G)檢測出特異性CTL。
接下來將第3階段的分析的結果示於圖5。為了檢驗CTL對用於誘導的3種胜肽之中的哪種胜肽有特異性，使用3種之各個MHC-四聚體試劑並分別實施Donor C的Lane 10的G孔(10-G)細胞群的檢測。其結果，陽性的細胞群僅在以LSA-Tet染色時被檢測出來。更具體地來說，相對於在以3種MHC-四聚體混合試劑(QVA-Tet、LSA-Tet及SLP-Tet)染色時檢測出3%的陽性細胞，在單獨以LSA-Tet染色時，LSA-Tet陽性細胞是以幾乎相同程度的陽性率(2.47%)被檢測出來。相反地，在以QVA-Tet與SLP-Tet染色時則無陽性細胞被檢測出來。由此顯示LSA(序列編號：6)為表現HLA-
A*11：01限制性之PBF特異性CTL表位胜肽。
使用與上述相同的3階段分析手法，混合在表1中記載之CTL抗原決定基候選胜肽QVA、QVT、KVL、SSL及SLP這5種胜肽，各添加至2名健康成人(Donor D及Donor E)的PBMC中培養約2周。2周後調整列匯集(譯註：lane pool)(Lane 1~12)，並將以5種MHC-四聚體混合試劑(QVA-Tet、QVT-Tet、KVL-Tet、SSL-Tet及SLP-Tet)與CD8-FITC染色之結果示於圖6。其結果，在Donor D的Lane 7與Donor E的Lane 2的UR檢測出明顯的CD8陽性且對5種MHC-四聚體混合試劑陽性的細胞群。
接下來，將分別回收各陽性Lane的各孔(A~H)，合計16孔的細胞群，並同樣地以5種MHC-四聚體混合試劑與CD8-FITC染色之第2階段的探討結果示於圖7。其結果，在Donor D的Lane 7於B孔(7-B)、在Donor E的Lane 2於C孔(2-C)檢測出特異性CTL。
進一步於圖8，展示使用各個MHC-四聚體試劑並分別實施染色之第3階段分析的結果。如圖8所示結果顯示，陽性細胞群僅在單獨以QVT-Tet染色時被檢測出來。更具體地來說，與在以5種MHC-四聚體混合試劑(QVA-Tet、QVT-Tet、KVL-Tet、SSL-Tet及SLP-Tet)染色時的陽性率相比，在單獨以QVT-Tet染色時的陽性率程度為幾乎相同。相反地，在QVA-Tet、KVL-Tet、SSL-Tet及SLP-Tet則完全無陽性細胞被檢測出來，因此顯示
QVT(序列編號：4)為表現HLA-A*11：01限制性之PBF特異性CTL表位胜肽。
接下來發明者群混合ASV、QVT及SAL這3種胜肽，各添加至3名健康成人(Donor A、Donor B及Donor C)的PBMC中培養約2周。2周後調整列匯集(譯註：lane pool)(Lane 1~12)，並將以3種MHC-四聚體混合試劑(ASV-Tet、QVT-Tet及SAL-Tet)與CD8-FITC染色之結果示於圖9。其結果，在Donor A、Donor B及Donor C的所有Lane的UR均檢測出明顯的CD8陽性且對3種MHC-四聚體混合試劑陽性之細胞群。由於陽性頻率高，所以省略在第2階段實施之陽性孔鑑定，將任意地選擇Donor A的Lane 7、Donor B的Lane 4及Donor C的Lane 4，並使用個別MHC-四聚體試劑實施染色之結果示於圖10。其結果，陽性細胞群僅在單獨以ASV-Tet染色時下被檢測出來。相對於在以3種MHC-四聚體混合試劑(ASV-Tet、QVT-Tet及SAL-Tet)染色時，Donor A的Lane 7的陽性率為9.02%、Donor B的Lane 4的陽性率36.36%、Donor C的Lane 4的陽性率13.84%，在單獨以ASV-Tet染色時的陽性率各為9.13%、36.33%、13.74%，乃幾乎相同。相反地，在QVT-Tet及SAL-Tet則完全無陽性細胞被檢測出來，因此顯示ASV(序列編號：1)誘導表現HLA-A*11：01限制性之CTL，且Donor A、Donor B及Donor C的末梢血液中存在記憶型的CTL。
然而，以發明者群至今為止的經驗，若假設
誘導前的CD8陽性細胞率為10~20%，則能以一般96孔的MLPC法檢測癌症抗原特異性CTL的極限為1~3×10-7。換句話說，在96孔的MLPC法中被檢測出來之特異性CTL的標準比例為每1片96孔板1~3個孔。本發明亦如圖3與圖6所示，以MHC-四聚體混合試劑檢測出陽性的Lane為1個，如圖9所示的所有Lane的UR均檢測出明顯CD8陽性四聚體陽性的細胞群的現象在自體抗原癌抗原是非常罕見的。
接下來發明者群混合SVL、KVL及SSL這3種胜肽，各添加至3名健康成人(Donor A、Donor B及Donor C)的PBMC中培養約2周。2周後調整列匯集(譯註：lane pool)(Lane 1~12)，並將以3種MHC-四聚體混合試劑(SVL-Tet、KVL-Tet及SSL-Tet)與CD8-FITC染色之結果示於圖11。其結果，陽性率雖比前述圖9的結果低，但由於各Lane的UR以高頻率檢測出CD8陽性且對3種MHC-四聚體混合試劑陽性的細胞群，所以嘗試如前述以2階段分析手法分析。其結果示於圖12(第2階段)。如圖12所示，選擇Donor A的Lane 6、Donor B的Lane 11及Donor C的Lane 6作為任意之陽性Lane，使用各個MHC-四聚體試劑並分別實施染色的結果，陽性細胞群僅在單獨以SVL-Tet染色時下被確認。相對於在以3種MHC-四聚體混合試劑染色時，Donor A的Lane 6的陽性率為1.19%、Donor B的Lane 11的陽性率6.76%、Donor C的Lane 6的陽性率1.49%，在單獨以SVL-Tet染色時的陽性率各為1.67%、6.48%、2.02%，乃
幾乎相同程度。相反地，在KVL-Tet及SSL-Tet則完全無陽性細胞被檢測出來，因此顯示SVL(序列編號：2)誘導表現HLA-A*11：01限制性之CTL，且Donor A、Donor B及Donor C的末梢血液中存在記憶型的CTL。
SVLSRRLGK(序列編號：2)為ASVLSRRLGK(序列編號：1)的N端的一個胺基酸Ala缺失之胜肽。
因此，利用ASV特異性CTL與SVL特異性CTL來檢驗ASV與SVL的關聯性。將ASV或SVL胜肽添加至同一個Donor末梢血液PBMC，經由約2周的培養，誘導對各個胜肽特異之CTL，並將確認ASV-Tet與SVL-Tet之交叉反應性的結果示於圖13。
如圖13所示結果顯示，以ASV-Tet染色用ASV誘導之ASV特異性CTL時為15.33%的陽性率，然而以SVL-Tet將同樣細胞群染色時SVL特異性CTL是以11.47%的陽性率被檢測出來。相反地以SVL-Tet檢測用SVL誘導之SVL特異性CTL時為5.67%的陽性率，然而以ASV-Tet檢測同樣細胞群時ASV特異性CTL是以11.01%的比例被檢測出來。因為對沒有用於誘導之ASV特異性的CTL，以比對用於誘導之SVL特異性的CTL更高的頻率存在，以及以ASV-Tet檢測出SVL特異性CTL之細胞群，比以SVL-Tet檢測出的細胞群被檢測出更強的螢光強度，所以判斷SVL對記憶型T細胞的免疫賦活作用比ASV對記憶型T細胞的免疫賦活作用弱，且在活體中強烈顯示ASV會被HLA-A*11：01呈現。這從圖9與
圖11即使是來自同樣Donor的PBMC誘導實驗，圖9所示四聚體陽性細胞的出現頻率卻比圖11更高亦可得知。
發明者群為了放大培養陽性像被個別的MHC-四聚體試劑檢驗出來的孔中的PBF特異性CTL，使抗原呈現細胞(EBV感染LCL)漂浮於衝擊(譯註：pulse)用培養基中，以10μg/mL的濃度添加CTL抗原決定基候選胜肽，調製胜肽衝擊抗原呈現細胞。接著，混合培養此胜肽衝擊抗原呈現細胞與包含PBF特異性CTL之細胞群並建立CTL系。更具體地來說，如以下所示。
依照既定方法(Kuzushima K et al,Clin Exp Immunol.1996；103：192-198)，混合培養EBV產生細胞株B95.8細胞株(取自JCRB Cell Bank)的培養上清液(包含生EBV病毒)與PBMC，建立EBV感染B細胞株(Lymphoblastoid cell line，以下，亦稱為EBV感染LCL)。在約2周後確認HLA分子的表現、CD80、CD83、CD86及CD20的表現。
將基因轉殖人類CD40L並使之安定表現之NIH3T3細
胞(NIH-CD40L)與PBMC在IL-4存在的條件下共同培養。NIH-CD40L以96Gy的X光照射抑制生長，每3~4天重複進行共同培養(Kondo E et al,J Immunol.2002；169：2164-2171)。在約2周後確認HLA分子的表現、CD80、CD83及CD86的表現。
以塑膠製培養皿將PBMC在37℃、5% CO2恆溫槽中培養2小時，並且輕輕洗去沒有黏著在培養皿之細胞。將GM-CSF與IL-4加入其中並培養24小時後，接著添加TNFα與IL-1β及PGE2(前列腺素E2)，培養24~48小時。接著，將以適當的培養基等輕輕沖洗後可回收的細胞當作樹狀細胞(Kondo et al,J Immunol.2002；169：2164-2171)。在48小時後確認HLA分子的表現、CD80、CD83及CD86的表現。
如上述，預先從保持HLA-A*11：01之PBMC調製抗原呈現細胞(EBV感染LCL、CD40-B細胞、樹狀細胞)。使抗原呈現細胞漂浮於衝擊(譯註：pulse)用培養基(0.1%人類血清白蛋白/55μM 2-巰基丙醇/RPMI 1640)或AIM-V medium(Invitrogen公司)中，以10μg/mL的濃度添加CTL抗原決定基候選胜肽，每隔約15分鐘溫和地混合同時在室溫下放置30~60分鐘後，以
過量的洗淨液(2%牛胎兒血清(FCS)/PBS)洗淨3次，洗去未結合至HLA分子之胜肽。藉由進行此操作，CTL抗原決定基候選胜肽被認為會結合至抗原呈現細胞上的HLA分子(進行過此操作之抗原呈現細胞稱為胜肽衝擊抗原呈現細胞)。為了使胜肽衝擊抗原呈現細胞失去生長能力，進行致死量的X光照射或者絲裂黴素C處理。
將之與分離自同一人物之PBMC，或者CD8陽性或CD4陽性之T細胞混合，在37℃、5% CO2恆溫槽中進行培養。使用的培養基，雖進行過含有10% FCS之RPMI1640培養基、或含有10%人類血清之RPMI1640培養基、或者含有1~10%人類血清之RPMI1640培養基等的探討，但在本方法中，使用含有10%人類血清之RPMI1640培養基可得到良好的結果。以T細胞生存的維持與輔助生長為目的添加IL-2(Shionogi & Co.,Ltd.)。許多報告通常將添加時機設為混合培養開始後第7~14天，於本發明雖進行過在培養開始時、培養開始2天後、6天後等投與IL-2的探討，但由於在培養開始2天後投與的情況下可得到良好的效果，所以在培養開始2天後以50U/mL的濃度添加。培養開始10~14天後再次使用胜肽衝擊(譯註：pulse)抗原呈現細胞加以刺激。每10~14天使用胜肽衝擊抗原呈現細胞加以刺激，CTL誘導的評價在約2周後與4周後實施。當PBF特異性CTL的誘導獲得確認時，更進一步使用胜肽衝擊抗原呈現細胞加以刺激並建立CTL系。
將以前述方法放大之細胞群的約1/10~全量移至96孔U底細胞培養用微量培養板，並以最終0.01~10μg/mL的濃度添加用於誘導之胜肽。進一步以達到最終濃度1μg/mL的方式添加Brefeldin A作為細胞內蛋白質輸送抑制劑，於5% CO2的恆溫槽中在37℃下培養5~16小時。
培養後將細胞洗淨，添加PE(phycoerythrin)標識MHC-四聚體試劑與PC5(phycoerythrin-Cy5)標識抗CD8抗體(Beckman Coulter,Inc.)，在室溫下靜置15~30分鐘。
洗淨後以4%甲醛在℃下固定15分鐘後，以過量的洗淨液清洗。以0.1%皂素進行膜透過處理後，添加FITC標識抗IFNγ抗體(Beckman Coulter,Inc.)，在室溫下使之反應15~30分鐘。洗淨後，使用流式細胞儀定量T細胞中的IFNγ陽性細胞率或MHC-四聚體試劑陽性細胞中的IFNγ陽性細胞率。
圖14中展示使用對照組胜肽，以MLPC法誘導特異性CTL，並以細胞內IFNγ產生細胞定量法探討的結果。即，將分離自保持HLA-A*11：01而不保持HLA-A*24：02之健康成人末梢血液的PBMC以正對照(HLA-A*11：01限制性來自CMV pp65之表位胜肽，ATV胜肽)或者負對照(HLA-A*24：02限制性來自survivin-2B之表位胜肽，AYA胜肽)刺激13天後，在Brefeldin A存在下以用於刺激的各個胜肽再次刺激14小時。以PE標
識MHC-四聚體試劑(Medical & Biological Laboratories Co.,LTD.)、PC5標識抗CD8抗體、FITC標識抗IFNγ抗體將之3重染色並使用流式細胞儀分析，其結果示於圖14。
圖14中，點圖展開圖中的數字代表在分成四等分的區域中存在的細胞占全部生細胞的比例(%)。在X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之IFNγ螢光強度的點圖展開圖中，被正對照胜肽再次刺激時UR內出現IFNγ陽性CD8陽性細胞(下方左側)，而即使被負對照胜肽再次刺激也幾乎沒有出現(上方左側)。從X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之MHC-四聚體試劑螢光強度的點圖展開圖中UR內存在CD8陽性細胞MHC-四聚體試劑陽性細胞群可知，以正對照胜肽刺激培養13天的細胞群中存在CMV pp65特異性CTL(下方中央)。另一方面，在添加與Donor等位基因不同的HLA限制性負對照胜肽的細胞群，也顯示出survivin-2B特異性CTL沒有出現(上方中央)。即，在添加HLA-A*11：01限制性來自CMV pp65之表位胜肽的細胞群中有29.37%的特異性CTL被誘導，添加來自survivin-2B之HLA-A*24：02限制性表位胜肽的細胞團則無特異性CTL被誘導。此結果與上述IFNγ的測量結果一致。而且，X軸代表對數尺度表示之IFNγ螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之MHC-四聚體試劑螢光強度的點圖展開圖中顯示，添加負對照胜肽時雖然
MHC-四聚體試劑陽性且IFNγ陽性的細胞幾乎不存在(上方右側)，但因HLA-A*11：01限制性來自CMV pp65之正對照胜肽的刺激而被誘導的CMV pp65特異性CTL占全細胞群的29.39%(UL+UR)，其中的73%[UR/(UL+UR)]會產生IFNγ，換言之為具有細胞毒性活性之效應型CTL。
由此結果可知，在添加Donor保持之HLA限制性CTL表位胜肽並培養之PBMC中，產生IFNγ的細胞因再次刺激而被誘導，此細胞被MHC-四聚體試劑染色因此乃對所添加之CTL表位胜肽特異性的CTL。
接下來，發明者群為了評價經MHC-四聚體試劑鑑定之以PBF特異性CTL表位胜肽誘導的CTL的功能，實施細胞內IFNγ產生細胞定量。其結果示於圖15、圖16與圖17。
圖15的右方為X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之IFNγ螢光強度的點圖展開圖，使用與用於誘導之胜肽QVT(序列編號：4)相同之胜肽再次刺激，並展示檢驗IFNγ產生能力的結果。
以數值表示UR內CD8陽性細胞中的IFNγ陽性細胞數在PBMC中所占比例(%)。圖15的左方為以QVT-Tet染色未刺激時(胜肽濃度：0μg/mL)的細胞群的結果。在X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之四聚體螢光強度的點圖展開圖中，以數值表示UR內CD8陽性細胞中的四聚體陽性細胞數在PBMC中所
占比例(%)。
針對以QVT(序列編號：4)誘導之CTL，使用QVT胜肽進行14小時的再次刺激。其結果，相對於未刺激時(胜肽濃度：0μg/mL)CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞為0.63%，使用QVT再次刺激時CD8陽性IFNγ陽性細胞的存在率和胜肽濃度成正比增加。在10μg/mL的胜肽再次刺激，14.15%的CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞獲得確認，表現出與未刺激時的明顯差異。而且從QVT-Tet陽性細胞存在23.84%可知，QVT-Tet陽性細胞的59.4%為產生IFNγ之效應型CTL。
由上可知，本實施例中鑑定之來自PBF的QVT(序列編號：4)具有使末梢血液中的PBF特異性CTL生長的功能，因為這些細胞群具有細胞毒性活性而且能以QVT-Tet檢測，所以可知為HLA-A*11：01限制性之PBF特異性CTL表位胜肽。
同樣地，實施經MHC-四聚體試劑鑑定之PBF特異性CTL表位胜肽誘導LSA的細胞內IFNγ產生細胞定量。其結果示於圖16。使用LSA胜肽再次刺激以LSA誘導之CTL 14小時的結果，相對於未刺激時(胜肽濃度：0μg/mL)CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞為0.19%，CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞的存在率和胜肽濃度成正比增加。在10μg/mL的胜肽再次刺激，4.19%的CD8陽性IFNγ陽性(產生)細胞獲得確認，表現出與未刺激時的明顯差異。而且從LSA-Tet陽性細胞存在20.34%可知，
LSA-Tet陽性細胞的20.6%為產生IFNγ之效應型CTL。
由上可知，本實施例中鑑定之來自PBF的LSA(序列編號：6)具有使末梢血液中的PBF特異性CTL生長的功能，因為這些細胞群具有細胞毒性活性而且能以LSA-Tet檢測，所以可知為HLA-A*11：01限制性之PBF特異性CTL表位胜肽。
在以前述MLPC法使用MHC-四聚體試劑之CTL表位胜肽的鑑定分析中顯示，ASV及SVL誘導表現HLA-A*11：01限制性之CTL，且Donor A、Donor B及Donor C的末梢血液中存在記憶型的CTL。為了評價被誘導之CTL的功能，以同樣方式實施細胞內IFNγ產生細胞定量。其結果示於圖17。
於圖17，分別展示ASV與SVL的結果。於圖的右方，以X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之IFNγ螢光強度的點圖展開圖，展示使用用於誘導之胜肽ASV或胜肽SVL再次刺激並檢驗IFNγ產生能力的結果。以數值表示UR內CD8陽性細胞中的IFNγ陽性細胞數在PBMC中所占比例(%)。圖的左方為以ASV-Tet或SVL-Tet染色未刺激時(胜肽濃度：0μg/mL)的細胞群的結果。在X軸代表對數尺度表示之CD8螢光強度、Y軸代表對數尺度表示之四聚體螢光強度的點圖展開圖中，以數值表示UR內CD8陽性細胞中的四聚體陽性細胞數在PBMC中所占比例(%)。
針對以ASV誘導之CTL，使用ASV胜肽進行
14小時的再次刺激。其結果，未刺激時(胜肽濃度：0μg/mL)與胜肽再次刺激時，即使ASV-Tet陽性細胞存在21.92%，CD8陽性IFNγ陽性(產生)卻沒有被檢測出來(上方)。針對以SVL誘導之CTL，使用SVL胜肽進行14小時的再次刺激並進行同樣的探討，但無論是在未刺激時或胜肽再次刺激時，即使SVL-Tet陽性細胞存在5.48%，CD8陽性IFNγ陽性(產生)卻沒有被檢測出來(下方)。
由上可知，本實施例中鑑定之來自PBF的ASV(序列編號：1)及SVL(序列編號：2)具有使末梢血液中的特異性CTL生長的功能，雖然能以ASV-Tet或SVL-Tet檢測，但這些細胞群不具有細胞毒性活性。
ASV特異性CTL與SVL特異性CTL所顯示的現象從以前就有報告提及，被稱為免疫學上的無應答性(anergy)。例如，作為維持C型肝炎持續感染的原因之一，有報告指出雖然有針對HCV(Hepatitis C Virus)的CTL存在，但CTL不產生細胞激素，或是產生的CTL的比例極低而變成免疫學上的無應答性(anergy)的可能性(Gruener NH et al,J Virol.2001；75：5550-5558)。
變成免疫學上的無應答性的機制並非單純的機制，但有報告指出與免疫檢查點分子的存在或調節性T細胞(Tregs)、來自骨髓的免疫抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells：MDSC)的關聯等。此外，作為阻礙CTL的活性化的分子，已知有TGFβ、PD-1、CTLA-
4等。例如，TGFβ為癌細胞分泌之抑制性細胞激素，會阻礙CTL或CD4陽性T細胞的生長‧分化。此外，PD-1、CTLA-4皆為T細胞之細胞膜上的分子，一旦分別與癌細胞所表現之配位子結合，傳達出抑制性的訊號，CTL即會被失活(anergic CTL)。近年，有報告指出藉由利用抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體來阻礙此等免疫抑制分子的作用，免疫系會再活性化，而且做為一種新的治療策略已展開臨床研究。
本來，CTL的一部分為記憶型的T細胞，保持針對抗原的細胞毒性而在宿主內被記憶，具備在下一次暴露於抗原或異物時可以快速對應的機制。一般認為免疫學上的無應答性在(1)抗原量多，(2)暴露期間為長期，(3)同時發生的發炎反應程度低時容易發生。作為其中一例，可舉出對食物等的經口免疫耐受性。代表性的食物過敏原有蛋、牛奶、蕎麥等。然而食物過敏並不是任誰都會發生的。那是因為，在腸道組織中具備對於被活體經口攝取之食物成分的免疫耐受機制。因此，伴隨生長之消化道的成長與適當的經口免疫耐受的建立，被認為是嬰幼兒時期的食物過敏大多會在青少年時期前緩解的理由。
由於發明者群使用的是健康正常人的末梢血液，所以自體抗原PBF特異性記憶型CTL的存在頻率大約是1~3×10-7一般來說被認為是低的。然而，藉由ASV(序列編號：1)及SVL(序列編號：2)的刺激，顯示了CTL會生長至高頻率，但被誘導的CTL在免疫學上為無
應答性。
以上結果暗示，存在與ASV(序列編號：1)及SVL(序列編號：2)相同性高的非自體抗原胜肽，當暫時性或永久地被帶進健康正常人時，被誘導的CTL的一部分雖會成為記憶型T細胞而存在於血液中，但因為免疫耐受機制的作用而有成為免疫學上無應答性的可能性。
由於ASV及SVL與此非自體抗原的相同性高，所以被認為可以有效誘導出相互表現交叉反應之記憶型CTL。前述之免疫檢查點阻礙劑PD-1或CTLA4抗體醫藥被認為會解除這樣的免疫耐受，利用此交叉反應性，活體內記憶-CTL大量存在之ASV或SVL特異性CTL被認為有可利用於針對PBF陽性癌之免疫治療的可能性。
更進一步，針對如上述被來自PBF之QVT(序列編號：4)或LSA(序列編號：6)誘導之CTL，調查對人類骨肉瘤細胞株的細胞毒性活性。
為此，首先將HLA-A*11：01分子的全長序列基因轉殖至表現PBF之來自人類骨肉瘤的細胞株HOS細胞(HLA-A11陰性)，並建立穩定地表現HLA-A11之HOS細胞。針對建立好的細胞株，使用市售被FITC標識之抗HLA-A11抗體(abcam公司)，確認了在膜表面上的表現。將所得到的結果示於圖18。於此圖，X軸代表螢光強度，Y軸代表細胞計數。如圖18所示，在所建立之
穩定表現HLA-A11的人類骨肉瘤細胞株(以下，亦稱為A11表現HOS細胞)，HLA-A11的表現獲得確認，使用此細胞作為下列細胞毒性活性測量的標靶細胞。
接下來，展示細胞毒性活性的測量方法。將培養中的A11陰性的HOS細胞或A11表現HOS細胞在400×g的條件下離心5分鐘並將上清液廢棄後，添加適量的PBS並攪拌細胞後，在400×g的條件下離心5分鐘。
離心後，仔細將上清液廢棄，將細胞懸浮於1mL之PBS。以最終濃度達到0.1μM的方式添加CFSE，並在室溫下染色10分鐘。添加1mL的FCS並攪拌。添加10mL的PBS，在400×g的條件下離心5分鐘。離心後，仔細將上清液廢棄，重複此操作3次並將細胞洗淨。將細胞再次懸浮於適量的培養基(10% FCS/55μM 2-巰基丙醇/1% L-麩胺酸/100μg/mL鏈黴素/100units/mL青黴素/RPMI 1640)，計算細胞數，並以此為標靶細胞。將以來自PBF之QVT(序列編號：4)或LSA(序列編號：6)誘導之上述CTL細胞再次懸浮於適量的培養基中，計算細胞數，並以此為效應細胞。96孔培養板的每1個孔添加5,000個標靶細胞，並以數量達到10,000~100,000個的方式添加效應細胞，於37℃的5% CO2的恆溫槽中培養5小時。培養後，以1mM的濃度添加氯化鈣溶液，以螢光標識Annexin V染色，並以流式細胞儀測量被CFSE標籤之標靶細胞的死細胞率。
以接下來的算式算出細胞毒性活性(%)。
Cytotoxicity=[(E-T0)/(100-T0)]×100
E代表共同培養標靶細胞與效應細胞時的CFSE陽性細胞群中的Annexin V陽性細胞率，T0代表僅培養標靶細胞時的CFSE陽性細胞群中的Annexin V陽性細胞率。其結果示於圖19及圖20。
此等圖式中，X軸代表效應細胞的細胞數與標的細胞的細胞數的比(E/T ratio)，Y軸代表細胞毒性活性(%)。圖19為對效應細胞使用以胜肽QVT(序列編號：4)誘導之PBF特異性CTL時的結果，圖20為使用以LSA(序列編號：6)誘導之PBF特異性CTL時的結果。
於以胜肽QVT(序列編號：4)誘導之PBF特異性CTL，在E/T比=20觀察到55%的細胞毒性活性，於以胜肽LSA(序列編號：6)誘導之PBF特異性CTL，在E/T比=20觀察到32%的細胞毒性活性。相反地，對於沒有基因轉殖HLA-A11之A11陰性HOS細胞則幾乎沒有檢測出細胞毒性活性。根據以上結果，確認了QVT(序列編號：4)胜肽特異性的CTL細胞群或LSA(序列編號：6)胜肽特異性的CTL細胞群，會分別辨識並殺傷被在標靶細胞的膜表面表現的HLA-A*11：01呈現之PBF胜肽。
即，以本發明鑑定之以來自PBF的QVT(序列編號：4)或LSA(序列編號：6)誘導的CTL具有對人類骨肉瘤細胞的細胞毒性活性。
為了針對如上述鑑定之PBF特異性HLA-A*11：01限制性CTL表位胜肽ASV(序列編號：1)、SVL(序列編號：2)、QVT(序列編號：4)或LSA(序列編號：6)考察交叉反應，進一步進行同源性檢索。即，使用Basic Local Alignment Search Tool(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=Micro bialGenomes)，從資料庫中擷取同源性最高的序列。其結果，如下列表3中所示，做為顯示與以序列編號：1及2決定之胜肽高同源性之胜肽，可找到來自放線菌的胜肽ASVLSRRLGP(序列編號：12)及來自藍綠藻的胜肽ASVLSQRLGK(序列編號：13)。此外，亦可找到顯示與以序列編號：6(LSALPPPLHK)決定之胜肽高同源性之來自結核菌的胜肽ASELPPPLHK(序列編號：14)。
再者，沒有做為顯示與以序列編號：4決定之胜肽高同源性之胜肽的對應者。此外，下列表3中的標記與上述表1及表2相同。
以HLA第I型分子呈現之CTL表位胜肽由8~10個胺基酸構成，從N端算起的第2個、與第9或第
10個胺基酸為對於與HLA第I型分子的結合而言最重要的胺基酸，被稱為錨定模體。做為與HLA-A11分子結合之胜肽，為在從N端算起的第2個位置上配置Ile、Met、Ser、Thr、或Val中任何一者，在第9或第10個位置上配置Lys或Arg中任何一者之胜肽，且由9~10個胺基酸構成的胜肽最為人所熟知(Chang CX et al,Eur J Immunol.2013；43：1109-1120)。本發明提供之HLA-A*11：01限制性CTL表位胜肽ASV，由Ala Ser Val Leu Ser Arg Arg Leu Gly Lys(序列編號：1)這10個胺基酸所構成，做為錨定模體在從N端算起的第2個位置有Ser，第10個位置上有Lys。另一方面，去掉從N端算起的第1個胺基酸殘基的胜肽SVL，由Ser Val Leu Ser Arg Arg Leu Gly Lys(序列編號：2)這9個胺基酸所構成，做為錨定模體在從N端算起的第2個位置有Val，第9個位置上有Lys。
與ASV、SVL同源性高的胜肽ASV(K10P)(序列編號：12)由Ala Ser Val Leu Ser Arg Arg Leu Gly Pro這10個胺基酸所構成，因為在第10個位置的Pro並非錨定模體，所以推測其為CTL抗原決定基的可能性低。另一方面，ASV(R6Q)(序列編號：13)由Ala Ser Val Leu Ser Gln Arg Leu Gly Lys這10個胺基酸所構成，因為在第2個位置有Ser，在第10個位置有Lys，被認為做為CTL抗原決定基有與ASV或SVL的交叉性。
ASV(R6Q)來自藍綠藻植物門(藍綠藻類)
的chromosome partitioning protein ParA(NCBI Reference Sequence：WP_026087254.1)這種蛋白質。此蛋白質參與染色體分配或細胞分裂，被高度保存在藻類中。
藻類傳統上已在世界各地被當作食材。做為食材的利用也散見於東南亞。在日本，自古以來即利用藻類做為食材。海苔(紫菜)、昆布、裙帶菜、羊栖菜、水雲、礁膜等已成日常攝取的食材。尤其是，包含紅藻‧綠藻‧藍綠藻等藻類的統稱的海苔在世界上的消費量也非常高。
來自日常攝取之藻類的ASV(R6Q)被認為有與來自原來自體抗原PBF之ASV或SVL的免疫反應的交叉性，因此，以來自PBF之HLA-A*11：01限制性CTL表位胜肽ASV、SVL對健康正常人的末梢血液進行誘導的結果，被認為高頻率且免疫上失活的細胞團將會生長。如前述，根據最近的研究，亦有可能以這樣的免疫失活的細胞群為標靶，藉由以抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體阻礙免疫抑制分子，將免疫再次活性化。
最近，藻類的抗癌作用受到矚目，並已展開研究藻類的功能性成分會對免疫系統造成何種影響的研究，古老的食材藻類再次受到矚目。然而，其中大多數都是針對黏多醣類所具備之作為免疫賦活劑的功能的研究。
本發明首次發現來自自體抗原PBF蛋白質之抗原胜肽與來自食材藻類ParA蛋白質之抗原胜肽的高同源性，並針對免疫反應的交叉性考察。提供來自藻類的胜肽潛在抗癌
作用的可能性這個不同於以往的嶄新研究觀點。
另一方面，與LSA(序列編號：6)同源性高的胜肽ASE(序列編號：14)由Ala Ser Glu Leu Pro Pro Pro Lue His Lys這10個胺基酸構成，第2個位置上有Ser，第10個位置上有Lys，也被認為做為CTL抗原決定基有與LSA的交叉性。
ASE來自人類型結核桿菌Mycobacterium
tuberculosis的bifunctional UDP-galactofuranosyl transferase GlfT(NCBI Reference Sequence：WP_003902746.1)這個蛋白質，為人類的結核病的病原菌。利用重複結核桿菌的培養而製成的減毒化細菌，BCG疫苗被開發為預防疫苗。
BCG疫苗為對結核病的預防效果獲得承認的唯一的減毒活菌疫苗，在全世界被利用。
然而，BCG疫苗的效果不僅止於結核病預防，還顯示出癌症的治療效果。1979年，用於肺癌治療的臨床試驗，其益處被首次發表(Yamamura Y et al,Cancer.1979；43：1314-1319)。1991年，有報告指出BCG疫苗發揮預防膀胱癌復發的強烈效果(D.L.Lamm et al,N Engl J Med.1991；325：1205-1209)。其後，對惡性黑色素瘤、大腸癌、膀胱癌等複數種的癌症進行許多臨床試驗，其有效性獲得發表。現在，BCG疫苗療法被確立為免疫療法之一，並且被應用在癌症治療。
然而，BCG疫苗療法雖然顯示出有效性，其作用機制卻仍然不明朗。以往相信BCG疫苗的抗癌作用
藉助於非特異性的免疫賦活作用。
本發明首次發現來自PBF蛋白質之抗原胜肽LSA(序列編號：6)與來自結核桿菌GlfT蛋白質之抗原胜肽ASE(序列編號：14)的高同源性，並針對免疫反應的交叉性考察。由此觀點來看，BCG疫苗的抗癌作用並非非特異性的免疫賦活作用，而是有因交叉反應性而誘導抗原特異性免疫反應這個新的作用機制存在的可能性。
本發明中鑑定了新的CTL抗原決定基ASV(序列編號：1)、SVL(序列編號：2)、QVT(序列編號：4)、LSA(序列編號：6)。此等新穎的CTL抗原決定基被認為今後將會被應用於PEF陽性癌治療。此外，在新穎CTL抗原決定基的鑑定，初次導入胜肽同源性檢索手法，並發現了與來自PBF之CTL胜肽同源性高的ASV(R6Q)(序列編號：13)、ASE(序列編號：14)。從免疫反應的交叉性的觀點來看，提出了來自藻類的胜肽ASV(R6Q)(序列編號：13)的抗癌作用。此外，針對在既有的複數項臨床試驗中顯示抗癌作用之BCG疫苗的作用秩序，根據ASE(序列編號：14)與LSA(序列編號：6)的交叉免疫反應性的考察，提出了新的作用秩序。
如以上說明，藉由本發明，實現提供以表現骨肉瘤特異抗原PBF之癌為標靶之HLA-A11限制性細胞
毒性T細胞(CTL)可特異性地識別的表位胜肽、利用該胜肽之用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗、前述CTL的誘導方法、利用前述CTL的被動免疫療法劑及其製造方法、與前述CTL的定量方法及該方法中使用的套組。
因此，本發明在針對HLA-A11保持之癌症患者的免疫療法等中有用的。
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<223> 一個人工合成胜肽的序列
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<223> 一個人工合成胜肽的序列
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<223> 一個人工合成胜肽的序列
<400> 15
Claims (19)
- 一種胜肽，其包含在序列編號：4、6、1、2、14或13中記載之胺基酸序列，且為能與HLA-A11分子形成複合體之胜肽，而且在表面呈現該複合體之細胞可誘導特異性地識別該複合體的細胞毒性T細胞。
- 一種胜肽，其包含在序列編號：4、6、1、2、14或13中記載之胺基酸序列中有1個或複數個胺基酸被置換、缺失、添加及/或插入之胺基酸序列，且為能與HLA-A11分子形成複合體之胜肽，而且在表面呈現該複合體之細胞可誘導特異性地識別該複合體的細胞毒性T細胞。
- 一種核酸，其編碼請求項1或2之胜肽。
- 一種表現載體，其含有編碼請求項1或2之胜肽的核酸。
- 一種用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗，其包含請求項1或2之胜肽作為有效成分。
- 一種用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗，其包含編碼請求項1或2之胜肽的核酸作為有效成分。
- 一種用以治療或預防PBF陽性癌的疫苗，其包含在表面呈現請求項1或2之胜肽與HLA-A11分子的複合體之抗原呈現細胞做為有效成分。
- 一種針對PBF陽性癌的被動免疫療法劑，其包含能夠以請求項1或2之胜肽或在表面呈現該胜肽與HLA-A11分子的複合體之抗原呈現細胞來刺激末梢血液單核細胞而得到的細胞毒性T細胞。
- 一種針對PBF陽性癌的被動免疫療法劑，其包含使請求項1或2之胜肽與HLA-A11分子的複合體或該複合體的多聚體和末梢血液單核細胞反應，形成細胞毒性T細胞結合至前述複合體或前述多聚體之結合體，而能夠從該結合體分離而得到的細胞毒性T細胞。
- 一種用以治療PBF陽性癌之被動免疫療法劑的製造方法，其包含以請求項1或2之胜肽或在表面呈現該胜肽與HLA-A11分子的複合體之抗原呈現細胞來刺激末梢血液單核細胞並取得細胞毒性T細胞的步驟。
- 一種用以治療PBF陽性癌之被動免疫療法劑的製造方法，其包含使請求項1或2之胜肽與HLA-A11分子的複合體或該複合體的多聚體和末梢血液單核細胞反應，形成細胞毒性T細胞結合至前述複合體或前述多聚體之結合體，並從該結合體分離出細胞毒性T細胞的步驟。
- 一種以PBF陽性癌細胞為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其以請求項1或2之胜肽刺激末梢血液單核細胞，取得以PBF陽性癌細胞為標靶之細胞毒性T細胞，並測量選自由該細胞毒性T細胞所產生的細胞激素、趨化激素及細胞表面蛋白質所成群之至少1種分子的量。
- 一種誘導以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的方法，其特徵係使用請求項1或2之胜肽誘導細胞毒性T細胞。
- 一種以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其包含 使用請求項1或2之胜肽誘導細胞毒性T細胞的步驟，與檢測在前述步驟中被誘導之細胞毒性T細胞的步驟。
- 一種誘導以PBF陽性癌細胞為標靶之細胞毒性T細胞的方法，其特徵係使請求項1或2之胜肽與末梢血液單核細胞在培養基中接觸，並誘導細胞毒性T細胞。
- 一種以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其包含使請求項1或2之胜肽與末梢血液單核細胞在培養基中接觸，並誘導細胞毒性T細胞的步驟，與檢測在前述步驟中被誘導之細胞毒性T細胞的步驟。
- 一種以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的定量方法，其使請求項1或2之胜肽與HLA-A11分子的複合體或該複合體的多聚體和末梢血液單核細胞或癌試料反應。
- 一種用以誘導以PBF陽性癌為標靶之細胞毒性T細胞的套組，其包含請求項1或2之胜肽。
- 一種抗體，其特異性地結合至請求項1或2之胜肽與HLA-A11分子的複合體。
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