JP4780540B2 - サバイビン由来癌抗原ペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）を誘導することができるペプチドに関する。
また本発明は、前記ペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤に関する。
更に本発明は、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペプチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年における免疫学と分子生物学の進歩は、腫瘍免疫の進歩に多大の影響を与えている。ヒトでインフルエンザウイルス感染が起きた場合に、その感染に対して免疫が成立して感染症から離脱するという事象は以下の細胞性免疫により説明することができる。インフルエンザウイルスに感染した上皮細胞は、その細胞表面にある主要組織適合抗原複合体ＨＬＡ分子上にウィルスゲノム由来の９〜１０のポリペプチドを提示する。このＨＬＡ−ウイルスペプチド複合体を提示する感染細胞は強烈なアロジェニック反応を惹起し、感染細胞は末梢血中に存在するＣＤ８陽性ＣＴＬにより特異的に認識され、積極的に排除される。この細胞性免疫のメカニズムは自己の細胞が腫瘍化して生じた癌細胞に対しても同様に働くと理解される。このことは、ベルギーのThierry Boonらによる悪性黒色腫からの腫瘍抗原ＭＡＧＥ遺伝子の単離により証明された（Van der Bruggenら, Science, 254, 1643-1647(1991)）。
Ｔ細胞が認識する癌抗原の同定方法としては、Ｔ細胞を用いてヒト癌由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が既に開発されており、この方法を用いて前記のＭＡＧＥ遺伝子が単離された。それ以後、悪性黒色腫を初めとした癌細胞表面上のクラスＩ分子に提示されてＴ細胞に認識される癌由来癌抗原ペプチドが複数同定され、これらのいくつかを用いた臨床治験が開始されており、既に一定の成果が得られている。例えば、癌患者の血清中に存在する抗体により認識される分子として食道癌より同定されたＮＹ−ＥＳＯ−１分子は、その合成ペプチドがＣＴＬの誘導能を有することが確認されている（Chen, YT.ら, Proc. Natl. Acad. USA, 94, 1914-1918(1997)及びJager, E.ら, J. Exp. Med., 187, 265-270(1998)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、臨床的に癌の大部分を占めるリンパ腫、肺癌、膀胱癌等の上皮癌では癌抗原がほとんど同定されておらず、これらを用いた免疫療法は確立されていない。そこで本発明は、癌の免疫療法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供することを解決すべき課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、免疫学的なヒト癌拒絶が主にＣＴＬ、特にＣＤ８（＋）ＣＴＬにより担われていることに着目した。ＣＤ８（＋）ＣＴＬは癌細胞上の主要組織適合抗原複合体（ヒトではＨＬＡ）と当該ＨＬＡ上に提示された癌抗原ペプチドとからなる複合体を認識して活性化する。そして、活性化されたＣＴＬはその細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介して癌細胞を認識し、これを攻撃する。したがって、癌抗原ペプチドが同定されれば、これを癌ワクチン及び抗癌剤として使用し、ＣＴＬを効率的に誘導して、癌を予防及び治療することができる。
サバイビン（Survivin）はアポトーシスインヒビター（ＩＡＰｓ）ファミリーに属するタンパク質であり、強い抗アポトーシス能を有する。サバイビンは当初、単一の遺伝子に由来する産物として報告されたが、この遺伝子には、スプライスバリアントが複数あることが報告されている（Mahotka, C.ら, Cancer Res., 59, 6097-6102(1999)）。
サバイビンは肺癌、膀胱癌等の多くの癌で発現するが、正常組織での発現は胎児組織と成人胸腺、精巣等に限られていることが報告されている（Ambrosini, G.ら, Nat. Med., 3, 917-921(1997)）。しかしながら、サバイビンが実際にＣＴＬを誘導しうるか否かは明らかにされていなかった。
そこで本発明者等は、種々のサバイビン由来のペプチドについて癌抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検討を重ねたところ、サバイビンエクソン２Ｂ遺伝子によりコードされる２３個からなるアミノ酸配列内にＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフがあり、このなかの特定のペプチドがＣＴＬを誘導することができることを見いだした。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド；
（２）前記（１）のペプチドを含む癌ワクチン；
（３）前記（１）のペプチドを含む抗癌剤；
（４）癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための前記（１）のペプチドの使用；
（５）前記（１）のペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞及び、
（６）前記（５）の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤；
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドは、以下の配列：
Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu （配列番号１）
で示されるペプチドをいう。
【０００６】
本発明のペプチドの同定は、以下の工程：
（１）ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩであるＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応する配列を有するサバイビン由来ペプチドを提供する工程、
（２）前記のペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する抗原提示細胞に添加し、ＨＬＡ−Ａ２４により前記ペプチドを提示している抗原提示細胞を得る工程、
（３）前記抗原提示細胞でＴ細胞を刺激してＣＴＬを誘導する工程、及び、
（４）誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害能を測定する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０００７】
本発明のペプチドはアミノ酸数が９と小さいので、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏｃ法により合成することができる。市販のアミノ酸合成装置を使用して合成することもできる。また、本発明のペプチドはサバイビンに由来するので、癌患者の癌細胞から文献（Suzuki, K.ら, J. Immunol., 163, 2783-2791(1999)）に記載の方法にしたがいサバイビンを単離して、該当するペプチドを得ることもできる。
【０００８】
本発明のペプチドを使用して癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴＬは癌細胞を認識して、これを攻撃する。したがって、本発明のペプチドは癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤を適用しうる癌は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している癌細胞からなる癌、例えば上皮癌である。上皮癌としては、肺癌、大腸癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、乳癌等が挙げられる。
本発明のペプチドを癌ワクチン及び抗癌剤として使用する場合、本発明のペプチドは、それ自身で又は補助剤と共に使用することができ、更に医薬的に許容しうる担体を適宜含有させることができる。
補助剤としては、免疫応答の強化を目的とするアジュバント、例えばフロイドの不完全（完全）アジュバント、アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
医薬的に許容しうる担体としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等の希釈剤、生理食塩水等が挙げられる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、当該技術分野において周知の方法により、液剤、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤等の形態にすることができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、その使用形態に応じて経口、非経口又は経皮投与することができる。例えば、静注投与、筋射投与が挙げられる。投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最大で５〜１０ｍｇである。例えば、成人の癌患者に皮下注射により使用する場合、１週間あたり１００〜１０００μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇである。
【０００９】
また、本発明のペプチドを、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するために使用することができる。誘導は、例えば文献（Nabeta, Y.ら, Jpn. J. Cancer Res. 91, 616-621(2000)）に記載の方法にしたがい行うことができる。
具体的には以下の工程：
ＨＬＡ−Ａ２４を発現している細胞を提供する工程、
前記細胞に本発明のペプチドを添加して、ＨＬＡ−Ａ２４上に提示させる工程、
前記ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している細胞でＴ細胞を刺激し、前記Ｔ細胞を癌細胞標的ＣＴＬへ誘導する工程、
を含む方法を使用することができる。
ＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞は癌患者から採取したものでもよいが、非ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする遺伝子を導入して作成してもよい。
【００１０】
得られたＣＴＬは癌細胞を標的とするので、これを抗癌剤に使用することができる。この場合、前記の本発明のペプチドを含む抗癌剤と同様に、適宜医薬的に許容しうる担体を含み、かつ種々の形態をとることができる。
本発明のＣＴＬを含む抗癌剤は、本発明のペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤と同様に非経口投与することができる。投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人の癌患者に皮下注射により使用する場合、１週間あたり１００〜１０００μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇである。
【実施例】
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１１】
参考例１ サバイビンｍＲＮＡの細胞株における発現
以下の細胞株：
ＬＨＫ−２（肺腺癌細胞）、ＫＭＧ−Ａ（胆のう癌細胞）、Ｆｓ−１（上顎癌細胞）、ＯＳＣ４０（口腔扁平上皮癌細胞）、ＨＣ−ＭＡ（下咽頭扁平上皮癌細胞）、ＫＥ−４（食道癌細胞）、ＬＢ３３ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、８８８ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、１１０２ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、ＢＢ６４ＲＣＣ（腎癌細胞）、ＬＢ９０５ＢＬＣ（前立腺癌細胞）、ＹＭ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＬＧ２−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＫＫ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、Ｎａｂｅ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）及びＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）並びに成人の胃、小腸、大腸、脾臓、肺、腎臓、前立腺、膵臓及び心臓から採取した正常組織に由来するｍＲＮＡ ２μｇを、サバイビン遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲし、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。内部標準としてＧ３ＰＤＨを用いた。図１に示されるように、構成的タンパク質であるＧ３ＰＤＨはいずれの細胞においても発現が見られた。一方サバイビンは、癌細胞であるＬＨＫ−２、ＫＭＧ−Ａ、Ｆｓ−１、ＯＳＣ４０、ＨＣ−ＭＡ、ＫＥ−４、ＬＢ３３ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、１１０２ｍｅｌ、ＢＢ６４ＲＣＣ、ＬＢ９０５ＢＬＣ、ＹＭ−ＥＢＶ、ＬＧ２−ＥＢＶ、ＫＫ−ＥＢＶ、Ｎａｂｅ−ＥＢＶ及びＰＨＡ−ｂｌａｓｔでサバイビンの発現が見られたが、正常細胞では発現が見られなかった。この結果より、サバイビンは多くの癌細胞に特異的に発現することが理解される。
【００１２】
実施例１ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドの製造
以下のアミノ酸配列：
Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu （配列番号１）
を有するペプチドを合成した。ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略に基づいて固相同時多重ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を使用して合成し、次いでＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Millipore）により精製した。ペプチドの純度及び同一性は、それぞれ分析用ＨＰＬＣ及び質量分析により測定した。ペプチドを、ジメチルスルホキシド中に濃度１．５ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【００１３】
実施例２ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドを用いたＣＴＬの in vitro 誘導
ヒトの末梢血をフィコール・コンレイ密度勾配中で遠心分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、次いで接着細胞と非接着細胞とに分離した。接着細胞をＡＩＭ−Ｖ（Gibco Co.）中、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Novartis Pharmaceuticals）及び１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Gibco-BRL）と共にインキュベートした。この細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。非接着細胞をＡＩＭ−Ｖ中、３０〜１００ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−４（味の素）と共にインキュベートした。７〜１０日目に、本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）をＡＰＣに添加し、１日後、組換えＴＮＦ−α及びＩＦＮ−α（住友製薬）を添加してＡＰＣを成熟させた。次いでＡＰＣに放射線を照射した後、ＡＰＣと自家非接着細胞から分離したＣＤ８陽性細胞とを、ＩＬ−２を含まないＡＩＭ−Ｖ中で混合した。インキュベート２日後、ＩＬ−２（武田薬品工業）を終濃度１００ＩＵ／ｍｌで培養へ添加した。７日毎に、Ｔ細胞マイトジェンであるＰＨＡで刺激した自家ＰＨＡブラスト（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）をＡＰＣとして、ＣＤ８陽性細胞を刺激した。刺激毎に、培養に１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地を追加した。２８日目のＣＴＬを以下の活性試験に使用した。
【００１４】
実施例３ 本発明のＣＴＬの細胞傷害性
（１）試験方法
ＣＴＬの細胞傷害能を51Ｃｒ細胞傷害試験により評価した。ＣＴＬの標的細胞を１００μＣｉのクロム酸ナトリウム（51Ｃｒ）を用いて３７℃で２時間標識し、洗浄し、再懸濁した。試験ペプチドが提示された標識標的細胞は、前記の標的細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を51Ｃｒで標識し、３０μｇ／ｍｌの試験ペプチドと室温で２時間インキュベートすることにより得た。エフェクター細胞（ＣＴＬ）をＶ字底マイクロタイタープレートＣｏｓｔａｒ３８９４（Corning Incorporated）の各ウェルに入れ、ここに前記標識標的細胞を濃度５×１０3細胞／ウェルで添加し、容量０．２ｍｌとした。６時間のインキュベート後、０．１ｍｌの上清を集め、自動化ガンマカウンター（LKB Wallac）により51Ｃｒの放出を測定した。測定は３重に行い標準偏差を計算した。特異的細胞傷害能の百分率は、特異的51Ｃｒ放出の百分率を下記の式：［（実験値）−（自発的放出値）／（最大放出値）−（自発的放出値）］×１００を用いて計算することにより決定した。自発的放出値は、標的細胞をエフェクター細胞の非存在下で単独でインキュベートしたときの放出値より得た。最大放出値は界面活性剤である１０％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ナカライケミカルＣｏ．）と共にインキュベートしたときの最大放出量により得た。
【００１５】
（２）本発明のＣＴＬの細胞傷害性
の中から、表１に示すＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応する３種のペプチドを、実施例１に記載の方法にしたがい製造した。
【００１６】
表１．試験ペプチド
【００１７】
２名のＨＬＡ−Ａ２４陽性の健常人Ａ及びＢの末梢血を用いて、実施例２と同様の方法により各群のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。
ＣＴＬの標的細胞として、サバイビンを発現する（以降、サバイビン陽性という）Ｃ１Ｒ細胞株（ATCCより入手）に、ＨＬＡ−Ａ２４＊２４０２遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳ（Clonetech, Inc.）を用いて、文献（Suzukiら、前出）にしたがい導入し、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面に発現させた（以降、ＨＬＡ−Ａ２４陽性という）Ｃ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞を用いた。前記（１）の試験法にしたがい、各標的細胞に試験ペプチドを添加して、標的細胞上にペプチドを提示させ、これを試験に使用した。
各ペプチドを用いて誘導したＣＴＬについての51Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図２に示す。縦軸は標的細胞の融解の百分率を、横軸はＥ／Ｔ比（エフェクター細胞（ＣＴＬ）／標的細胞）を示す。健常人Ａ及びＢの両方において、本発明のペプチド（サバイビン２Ｂ８０）により誘導されたＣＴＬはＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞に対して高い細胞融解を示したが、その他のペプチドにより誘導されたＣＴＬはいずれの細胞に対しても低い細胞融解性を示した（図２）。
これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞傷害性を有していることが理解される。
（３）本発明のＣＴＬの細胞傷害性
前記の健常人Ｂ由来の本発明のＣＴＬについて、下記表２に示す細胞を標的として、本発明のペプチドを添加した場合と未添加の場合の細胞傷害性を試験した。
表２．標的細胞
＋：陽性
−：陰性
51Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図３に示す。試験は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（２０、６及び２）を用いて行った。図３に示す各標的細胞における結果において、左側の棒はＥ／Ｔ＝２０での結果、真ん中の棒はＥ／Ｔ＝６での結果及び右側の棒はＥ／Ｔ＝２における結果を示している。本発明のＣＴＬは、本発明のペプチドを未添加のＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２、８８８ｍｅｌ、ＬＧ２−ｍｅｌ、ＯＳＣ４０、ＫＥ−４、ＬＨＫ−２、ＰＣ−９に対しても細胞傷害性を示した。これは前記細胞が元々ＨＬＡ−Ａ２４及びサバイビンを発現しているためであると考えられる。一方、本発明のサバイビン由来ペプチドを添加した場合、本発明のＣＴＬはより高い細胞傷害性を示した。一方、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＫ５６２に対しては、たとえ本発明のペプチドを添加した場合であっても細胞傷害性を示さなかった。
これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞傷害性を有していること、及び、細胞外からサバイビン由来癌抗原ペプチドを添加した細胞だけでなく細胞内でサバイビンを発現している癌細胞に対しても高い細胞傷害性を有していることが理解される。
【００１８】
実施例４ 本発明のＣＴＬクローンの作成及び反応性の解析
（１）ＣＴＬのクローンの作成
本発明のＣＴＬの反応性を検討するために、単一のＣＴＬクローンを、Riddellら（Walter, EA.ら, N. Engl. J. Med., 333, 1038-1044(1995)）の方法にしたがい作成した。９６穴Ｕ字型プレートにて１ウェルあたり０．３、３又は１０細胞／ウェルとなるようにＣＴＬを調整し、ここに放射線を照射して不活化した。次いで、健常人由来ＰＢＭＣ細胞（１×１０4）とＬＧ２−ＥＢＶ細胞（５×１０4）と共に培養した。培養液として、１０％ ヒトＡＢ血清、４０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（BD Pharmingn, San Diego）、５０μＭ ２−ＭＥ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ溶液を１ウェルあたり全量２００μｌで用いた。培養７日目に１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を用いたことを除いて前記と同様の新鮮培養液と交換した。培養１０日目ないし１４日目に、４８穴プレートに移し、実験２８日目に３種類のクローン：７Ｆ６、７Ｈ２及び４Ｆ９を得た。この中からクローン７Ｈ２についてＦＡＣＳにより細胞表現型を解析した。
（２）ＣＴＬクローン７Ｈ２のＦＡＣＳ解析
１次抗体として、マウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ分子標識抗体（Becton-Dickinson）を使用した。ＣＴＬクローン７Ｈ２を１次抗体で４℃、３０分処理した後、ＰＢＳで２回洗浄した。次いでＦＩＴＣで標識した抗マウス２次抗体で４℃、３０分処理し、ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton-Dickinson）により蛍光強度を測定した。
結果を図４に示す。縦軸は細胞数（カウント数）、横軸はＦＩＴＣ蛍光強度を示す。各図の下には使用した１次抗体が認識する細胞表面抗原を記載した。図中の常に右側に位置する線は１次抗体及び２次抗体で処理したときの結果を示し、図中の常に左側に位置する線は１次抗体なしで２次抗体のみで処理した陰性対照を示す。陰性対照を示す線に対して１次抗体で処理したときの線がどれだけ右に移動したかを検討することにより、陽性率を判断した。ＣＴＬクローン７Ｈ２はＣＤ３、ＣＤ８及びＴＣＲαβについては陽性であったが、ＣＤ４、ＣＤ１６及びＴＣＲγδについては陰性であった。
以上の結果より、ＣＴＬクローン７Ｈ２はＣＤ３、ＣＤ８及びＴＣＲαβ陽性の典型的なＣＴＬであることが理解される。
（３）ＣＴＬクローンの細胞傷害性
（１）で得た３種類のクローン７Ｆ６、７Ｈ２及び４Ｆ９について、肺癌細胞ＬＨＫ−２細胞（ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性）を標的として、本発明のペプチドを添加した場合と未添加の場合の細胞傷害性を試験した。
51Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図５に示す。図５に示す各ＣＴＬクローンの結果において、左側の棒は標的細胞ＬＨＫ−２、本発明のペプチド添加の場合の結果、真ん中の棒は標的細胞ＬＨＫ−２、本発明のペプチド未添加の場合の結果及び右側の棒は標的細胞Ｋ５６２の場合の結果を示している。本発明のＣＴＬは、本発明のペプチドを未添加のＬＨＫ−２に対しても細胞傷害性を示した。これはＬＨＫ−２細胞が元々ＨＬＡ−Ａ２４及びサバイビンを発現しているためであると考えられる。一方、本発明のサバイビン由来ペプチドを添加した場合、本発明のＣＴＬはより高い細胞傷害性を示した。一方、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＫ５６２に対しては、たとえ本発明のペプチドを添加した場合であっても細胞傷害性を示さなかった。
これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し特異的な細胞傷害性を有していること、及び、細胞外からサバイビン由来癌抗原ペプチドを添加した細胞だけでなく細胞内でサバイビンを発現している癌細胞に対しても高い細胞傷害性を有していることが理解される。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４を有する癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導することができる。ＨＬＡ−Ａ２４の発現率は高く、欧米人では２０〜３０％であり、特に日本人では５０％以上が発現している。したがって、本発明の癌抗原ペプチドは有用な癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
【００２０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、種々の癌細胞及び正常細胞におけるサバイビンの発現を示す図である。
【図２】図２は、種々のサバイビン由来ペプチドを用いて誘導したＣＴＬについての51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のＣＴＬの種々の標的細胞に対する51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のＣＴＬクローン７Ｈ２の細胞表面抗原についてのＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のＣＴＬクローンの肺癌細胞ＬＨＫ−２に対する51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）を誘導することができるペプチドに関する。
また本発明は、前記ペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤に関する。
更に本発明は、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペプチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年における免疫学と分子生物学の進歩は、腫瘍免疫の進歩に多大の影響を与えている。ヒトでインフルエンザウイルス感染が起きた場合に、その感染に対して免疫が成立して感染症から離脱するという事象は以下の細胞性免疫により説明することができる。インフルエンザウイルスに感染した上皮細胞は、その細胞表面にある主要組織適合抗原複合体ＨＬＡ分子上にウィルスゲノム由来の９〜１０のポリペプチドを提示する。このＨＬＡ−ウイルスペプチド複合体を提示する感染細胞は強烈なアロジェニック反応を惹起し、感染細胞は末梢血中に存在するＣＤ８陽性ＣＴＬにより特異的に認識され、積極的に排除される。この細胞性免疫のメカニズムは自己の細胞が腫瘍化して生じた癌細胞に対しても同様に働くと理解される。このことは、ベルギーのThierry Boonらによる悪性黒色腫からの腫瘍抗原ＭＡＧＥ遺伝子の単離により証明された（Van der Bruggenら, Science, 254, 1643-1647(1991)）。
Ｔ細胞が認識する癌抗原の同定方法としては、Ｔ細胞を用いてヒト癌由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が既に開発されており、この方法を用いて前記のＭＡＧＥ遺伝子が単離された。それ以後、悪性黒色腫を初めとした癌細胞表面上のクラスＩ分子に提示されてＴ細胞に認識される癌由来癌抗原ペプチドが複数同定され、これらのいくつかを用いた臨床治験が開始されており、既に一定の成果が得られている。例えば、癌患者の血清中に存在する抗体により認識される分子として食道癌より同定されたＮＹ−ＥＳＯ−１分子は、その合成ペプチドがＣＴＬの誘導能を有することが確認されている（Chen, YT.ら, Proc. Natl. Acad. USA, 94, 1914-1918(1997)及びJager, E.ら, J. Exp. Med., 187, 265-270(1998)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、臨床的に癌の大部分を占めるリンパ腫、肺癌、膀胱癌等の上皮癌では癌抗原がほとんど同定されておらず、これらを用いた免疫療法は確立されていない。そこで本発明は、癌の免疫療法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供することを解決すべき課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、免疫学的なヒト癌拒絶が主にＣＴＬ、特にＣＤ８（＋）ＣＴＬにより担われていることに着目した。ＣＤ８（＋）ＣＴＬは癌細胞上の主要組織適合抗原複合体（ヒトではＨＬＡ）と当該ＨＬＡ上に提示された癌抗原ペプチドとからなる複合体を認識して活性化する。そして、活性化されたＣＴＬはその細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介して癌細胞を認識し、これを攻撃する。したがって、癌抗原ペプチドが同定されれば、これを癌ワクチン及び抗癌剤として使用し、ＣＴＬを効率的に誘導して、癌を予防及び治療することができる。
サバイビン（Survivin）はアポトーシスインヒビター（ＩＡＰｓ）ファミリーに属するタンパク質であり、強い抗アポトーシス能を有する。サバイビンは当初、単一の遺伝子に由来する産物として報告されたが、この遺伝子には、スプライスバリアントが複数あることが報告されている（Mahotka, C.ら, Cancer Res., 59, 6097-6102(1999)）。
サバイビンは肺癌、膀胱癌等の多くの癌で発現するが、正常組織での発現は胎児組織と成人胸腺、精巣等に限られていることが報告されている（Ambrosini, G.ら, Nat. Med., 3, 917-921(1997)）。しかしながら、サバイビンが実際にＣＴＬを誘導しうるか否かは明らかにされていなかった。
そこで本発明者等は、種々のサバイビン由来のペプチドについて癌抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検討を重ねたところ、サバイビンエクソン２Ｂ遺伝子によりコードされる２３個からなるアミノ酸配列内にＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフがあり、このなかの特定のペプチドがＣＴＬを誘導することができることを見いだした。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド；
（２）前記（１）のペプチドを含む癌ワクチン；
（３）前記（１）のペプチドを含む抗癌剤；
（４）癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための前記（１）のペプチドの使用；
（５）前記（１）のペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞及び、
（６）前記（５）の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤；
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドは、以下の配列：
Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu （配列番号１）
で示されるペプチドをいう。
【０００６】
本発明のペプチドの同定は、以下の工程：
（１）ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩであるＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応する配列を有するサバイビン由来ペプチドを提供する工程、
（２）前記のペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する抗原提示細胞に添加し、ＨＬＡ−Ａ２４により前記ペプチドを提示している抗原提示細胞を得る工程、
（３）前記抗原提示細胞でＴ細胞を刺激してＣＴＬを誘導する工程、及び、
（４）誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害能を測定する工程、
を含む方法により行うことができる。
【０００７】
本発明のペプチドはアミノ酸数が９と小さいので、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏｃ法により合成することができる。市販のアミノ酸合成装置を使用して合成することもできる。また、本発明のペプチドはサバイビンに由来するので、癌患者の癌細胞から文献（Suzuki, K.ら, J. Immunol., 163, 2783-2791(1999)）に記載の方法にしたがいサバイビンを単離して、該当するペプチドを得ることもできる。
【０００８】
本発明のペプチドを使用して癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴＬは癌細胞を認識して、これを攻撃する。したがって、本発明のペプチドは癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤を適用しうる癌は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している癌細胞からなる癌、例えば上皮癌である。上皮癌としては、肺癌、大腸癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、乳癌等が挙げられる。
本発明のペプチドを癌ワクチン及び抗癌剤として使用する場合、本発明のペプチドは、それ自身で又は補助剤と共に使用することができ、更に医薬的に許容しうる担体を適宜含有させることができる。
補助剤としては、免疫応答の強化を目的とするアジュバント、例えばフロイドの不完全（完全）アジュバント、アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
医薬的に許容しうる担体としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等の希釈剤、生理食塩水等が挙げられる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、当該技術分野において周知の方法により、液剤、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤等の形態にすることができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、その使用形態に応じて経口、非経口又は経皮投与することができる。例えば、静注投与、筋射投与が挙げられる。投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最大で５〜１０ｍｇである。例えば、成人の癌患者に皮下注射により使用する場合、１週間あたり１００〜１０００μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇである。
【０００９】
また、本発明のペプチドを、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するために使用することができる。誘導は、例えば文献（Nabeta, Y.ら, Jpn. J. Cancer Res. 91, 616-621(2000)）に記載の方法にしたがい行うことができる。
具体的には以下の工程：
ＨＬＡ−Ａ２４を発現している細胞を提供する工程、
前記細胞に本発明のペプチドを添加して、ＨＬＡ−Ａ２４上に提示させる工程、
前記ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している細胞でＴ細胞を刺激し、前記Ｔ細胞を癌細胞標的ＣＴＬへ誘導する工程、
を含む方法を使用することができる。
ＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞は癌患者から採取したものでもよいが、非ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする遺伝子を導入して作成してもよい。
【００１０】
得られたＣＴＬは癌細胞を標的とするので、これを抗癌剤に使用することができる。この場合、前記の本発明のペプチドを含む抗癌剤と同様に、適宜医薬的に許容しうる担体を含み、かつ種々の形態をとることができる。
本発明のＣＴＬを含む抗癌剤は、本発明のペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤と同様に非経口投与することができる。投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人の癌患者に皮下注射により使用する場合、１週間あたり１００〜１０００μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇである。
【実施例】
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１１】
参考例１ サバイビンｍＲＮＡの細胞株における発現
以下の細胞株：
ＬＨＫ−２（肺腺癌細胞）、ＫＭＧ−Ａ（胆のう癌細胞）、Ｆｓ−１（上顎癌細胞）、ＯＳＣ４０（口腔扁平上皮癌細胞）、ＨＣ−ＭＡ（下咽頭扁平上皮癌細胞）、ＫＥ−４（食道癌細胞）、ＬＢ３３ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、８８８ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、１１０２ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、ＢＢ６４ＲＣＣ（腎癌細胞）、ＬＢ９０５ＢＬＣ（前立腺癌細胞）、ＹＭ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＬＧ２−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＫＫ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、Ｎａｂｅ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）及びＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）並びに成人の胃、小腸、大腸、脾臓、肺、腎臓、前立腺、膵臓及び心臓から採取した正常組織に由来するｍＲＮＡ ２μｇを、サバイビン遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲし、得られたＰＣＲ産物を電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。内部標準としてＧ３ＰＤＨを用いた。図１に示されるように、構成的タンパク質であるＧ３ＰＤＨはいずれの細胞においても発現が見られた。一方サバイビンは、癌細胞であるＬＨＫ−２、ＫＭＧ−Ａ、Ｆｓ−１、ＯＳＣ４０、ＨＣ−ＭＡ、ＫＥ−４、ＬＢ３３ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、１１０２ｍｅｌ、ＢＢ６４ＲＣＣ、ＬＢ９０５ＢＬＣ、ＹＭ−ＥＢＶ、ＬＧ２−ＥＢＶ、ＫＫ−ＥＢＶ、Ｎａｂｅ−ＥＢＶ及びＰＨＡ−ｂｌａｓｔでサバイビンの発現が見られたが、正常細胞では発現が見られなかった。この結果より、サバイビンは多くの癌細胞に特異的に発現することが理解される。
【００１２】
実施例１ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドの製造
以下のアミノ酸配列：
Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu （配列番号１）
を有するペプチドを合成した。ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略に基づいて固相同時多重ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を使用して合成し、次いでＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Millipore）により精製した。ペプチドの純度及び同一性は、それぞれ分析用ＨＰＬＣ及び質量分析により測定した。ペプチドを、ジメチルスルホキシド中に濃度１．５ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【００１３】
実施例２ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドを用いたＣＴＬの in vitro 誘導
ヒトの末梢血をフィコール・コンレイ密度勾配中で遠心分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、次いで接着細胞と非接着細胞とに分離した。接着細胞をＡＩＭ−Ｖ（Gibco Co.）中、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Novartis Pharmaceuticals）及び１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Gibco-BRL）と共にインキュベートした。この細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。非接着細胞をＡＩＭ−Ｖ中、３０〜１００ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−４（味の素）と共にインキュベートした。７〜１０日目に、本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）をＡＰＣに添加し、１日後、組換えＴＮＦ−α及びＩＦＮ−α（住友製薬）を添加してＡＰＣを成熟させた。次いでＡＰＣに放射線を照射した後、ＡＰＣと自家非接着細胞から分離したＣＤ８陽性細胞とを、ＩＬ−２を含まないＡＩＭ−Ｖ中で混合した。インキュベート２日後、ＩＬ−２（武田薬品工業）を終濃度１００ＩＵ／ｍｌで培養へ添加した。７日毎に、Ｔ細胞マイトジェンであるＰＨＡで刺激した自家ＰＨＡブラスト（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）をＡＰＣとして、ＣＤ８陽性細胞を刺激した。刺激毎に、培養に１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地を追加した。２８日目のＣＴＬを以下の活性試験に使用した。
【００１４】
実施例３ 本発明のＣＴＬの細胞傷害性
（１）試験方法
ＣＴＬの細胞傷害能を51Ｃｒ細胞傷害試験により評価した。ＣＴＬの標的細胞を１００μＣｉのクロム酸ナトリウム（51Ｃｒ）を用いて３７℃で２時間標識し、洗浄し、再懸濁した。試験ペプチドが提示された標識標的細胞は、前記の標的細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を51Ｃｒで標識し、３０μｇ／ｍｌの試験ペプチドと室温で２時間インキュベートすることにより得た。エフェクター細胞（ＣＴＬ）をＶ字底マイクロタイタープレートＣｏｓｔａｒ３８９４（Corning Incorporated）の各ウェルに入れ、ここに前記標識標的細胞を濃度５×１０3細胞／ウェルで添加し、容量０．２ｍｌとした。６時間のインキュベート後、０．１ｍｌの上清を集め、自動化ガンマカウンター（LKB Wallac）により51Ｃｒの放出を測定した。測定は３重に行い標準偏差を計算した。特異的細胞傷害能の百分率は、特異的51Ｃｒ放出の百分率を下記の式：［（実験値）−（自発的放出値）／（最大放出値）−（自発的放出値）］×１００を用いて計算することにより決定した。自発的放出値は、標的細胞をエフェクター細胞の非存在下で単独でインキュベートしたときの放出値より得た。最大放出値は界面活性剤である１０％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ナカライケミカルＣｏ．）と共にインキュベートしたときの最大放出量により得た。
【００１５】
（２）本発明のＣＴＬの細胞傷害性
【００１６】
表１．試験ペプチド
２名のＨＬＡ−Ａ２４陽性の健常人Ａ及びＢの末梢血を用いて、実施例２と同様の方法により各群のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。
ＣＴＬの標的細胞として、サバイビンを発現する（以降、サバイビン陽性という）Ｃ１Ｒ細胞株（ATCCより入手）に、ＨＬＡ−Ａ２４＊２４０２遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳ（Clonetech, Inc.）を用いて、文献（Suzukiら、前出）にしたがい導入し、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面に発現させた（以降、ＨＬＡ−Ａ２４陽性という）Ｃ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞を用いた。前記（１）の試験法にしたがい、各標的細胞に試験ペプチドを添加して、標的細胞上にペプチドを提示させ、これを試験に使用した。
各ペプチドを用いて誘導したＣＴＬについての51Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図２に示す。縦軸は標的細胞の融解の百分率を、横軸はＥ／Ｔ比（エフェクター細胞（ＣＴＬ）／標的細胞）を示す。健常人Ａ及びＢの両方において、本発明のペプチド（サバイビン２Ｂ８０）により誘導されたＣＴＬはＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞に対して高い細胞融解を示したが、その他のペプチドにより誘導されたＣＴＬはいずれの細胞に対しても低い細胞融解性を示した（図２）。
これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞傷害性を有していることが理解される。
（３）本発明のＣＴＬの細胞傷害性
前記の健常人Ｂ由来の本発明のＣＴＬについて、下記表２に示す細胞を標的として、本発明のペプチドを添加した場合と未添加の場合の細胞傷害性を試験した。
表２．標的細胞
−：陰性
51Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図３に示す。試験は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（２０、６及び２）を用いて行った。図３に示す各標的細胞における結果において、左側の棒はＥ／Ｔ＝２０での結果、真ん中の棒はＥ／Ｔ＝６での結果及び右側の棒はＥ／Ｔ＝２における結果を示している。本発明のＣＴＬは、本発明のペプチドを未添加のＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２、８８８ｍｅｌ、ＬＧ２−ｍｅｌ、ＯＳＣ４０、ＫＥ−４、ＬＨＫ−２、ＰＣ−９に対しても細胞傷害性を示した。これは前記細胞が元々ＨＬＡ−Ａ２４及びサバイビンを発現しているためであると考えられる。一方、本発明のサバイビン由来ペプチドを添加した場合、本発明のＣＴＬはより高い細胞傷害性を示した。一方、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＫ５６２に対しては、たとえ本発明のペプチドを添加した場合であっても細胞傷害性を示さなかった。
これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞傷害性を有していること、及び、細胞外からサバイビン由来癌抗原ペプチドを添加した細胞だけでなく細胞内でサバイビンを発現している癌細胞に対しても高い細胞傷害性を有していることが理解される。
【００１８】
実施例４ 本発明のＣＴＬクローンの作成及び反応性の解析
（１）ＣＴＬのクローンの作成
本発明のＣＴＬの反応性を検討するために、単一のＣＴＬクローンを、Riddellら（Walter, EA.ら, N. Engl. J. Med., 333, 1038-1044(1995)）の方法にしたがい作成した。９６穴Ｕ字型プレートにて１ウェルあたり０．３、３又は１０細胞／ウェルとなるようにＣＴＬを調整し、ここに放射線を照射して不活化した。次いで、健常人由来ＰＢＭＣ細胞（１×１０4）とＬＧ２−ＥＢＶ細胞（５×１０4）と共に培養した。培養液として、１０％ ヒトＡＢ血清、４０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（BD Pharmingn, San Diego）、５０μＭ ２−ＭＥ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ溶液を１ウェルあたり全量２００μｌで用いた。培養７日目に１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を用いたことを除いて前記と同様の新鮮培養液と交換した。培養１０日目ないし１４日目に、４８穴プレートに移し、実験２８日目に３種類のクローン：７Ｆ６、７Ｈ２及び４Ｆ９を得た。この中からクローン７Ｈ２についてＦＡＣＳにより細胞表現型を解析した。
（２）ＣＴＬクローン７Ｈ２のＦＡＣＳ解析
１次抗体として、マウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ分子標識抗体（Becton-Dickinson）を使用した。ＣＴＬクローン７Ｈ２を１次抗体で４℃、３０分処理した後、ＰＢＳで２回洗浄した。次いでＦＩＴＣで標識した抗マウス２次抗体で４℃、３０分処理し、ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton-Dickinson）により蛍光強度を測定した。
結果を図４に示す。縦軸は細胞数（カウント数）、横軸はＦＩＴＣ蛍光強度を示す。各図の下には使用した１次抗体が認識する細胞表面抗原を記載した。図中の常に右側に位置する線は１次抗体及び２次抗体で処理したときの結果を示し、図中の常に左側に位置する線は１次抗体なしで２次抗体のみで処理した陰性対照を示す。陰性対照を示す線に対して１次抗体で処理したときの線がどれだけ右に移動したかを検討することにより、陽性率を判断した。ＣＴＬクローン７Ｈ２はＣＤ３、ＣＤ８及びＴＣＲαβについては陽性であったが、ＣＤ４、ＣＤ１６及びＴＣＲγδについては陰性であった。
以上の結果より、ＣＴＬクローン７Ｈ２はＣＤ３、ＣＤ８及びＴＣＲαβ陽性の典型的なＣＴＬであることが理解される。
（３）ＣＴＬクローンの細胞傷害性
（１）で得た３種類のクローン７Ｆ６、７Ｈ２及び４Ｆ９について、肺癌細胞ＬＨＫ−２細胞（ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性）を標的として、本発明のペプチドを添加した場合と未添加の場合の細胞傷害性を試験した。
51Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図５に示す。図５に示す各ＣＴＬクローンの結果において、左側の棒は標的細胞ＬＨＫ−２、本発明のペプチド添加の場合の結果、真ん中の棒は標的細胞ＬＨＫ−２、本発明のペプチド未添加の場合の結果及び右側の棒は標的細胞Ｋ５６２の場合の結果を示している。本発明のＣＴＬは、本発明のペプチドを未添加のＬＨＫ−２に対しても細胞傷害性を示した。これはＬＨＫ−２細胞が元々ＨＬＡ−Ａ２４及びサバイビンを発現しているためであると考えられる。一方、本発明のサバイビン由来ペプチドを添加した場合、本発明のＣＴＬはより高い細胞傷害性を示した。一方、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＫ５６２に対しては、たとえ本発明のペプチドを添加した場合であっても細胞傷害性を示さなかった。
これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し特異的な細胞傷害性を有していること、及び、細胞外からサバイビン由来癌抗原ペプチドを添加した細胞だけでなく細胞内でサバイビンを発現している癌細胞に対しても高い細胞傷害性を有していることが理解される。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４を有する癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導することができる。ＨＬＡ−Ａ２４の発現率は高く、欧米人では２０〜３０％であり、特に日本人では５０％以上が発現している。したがって、本発明の癌抗原ペプチドは有用な癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
【００２０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、種々の癌細胞及び正常細胞におけるサバイビンの発現を示す図である。
【図２】図２は、種々のサバイビン由来ペプチドを用いて誘導したＣＴＬについての51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のＣＴＬの種々の標的細胞に対する51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のＣＴＬクローン７Ｈ２の細胞表面抗原についてのＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のＣＴＬクローンの肺癌細胞ＬＨＫ−２に対する51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
Claims (6)
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド。
- 請求項１に記載のペプチドを含む癌ワクチン。
- 請求項１に記載のペプチドを含む抗癌剤。
- ＨＬＡ−Ａ２４を発現する癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞をin vitroで誘導するための請求項１に記載のペプチドの使用。
- 請求項１に記載のペプチドにより誘導され、かつ、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞。
- 請求項５に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤。
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