JP2023113688A - 様々ながんに対する免疫療法で使用される新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫療法において使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞を提供する。【解決手段】本発明は、がんの免疫療法に関し、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連T細胞ペプチドエピトープを提供する。それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でT細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体(MHC)の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性T細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。【選択図】なし
Description
本発明は、免疫療法において使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連T細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でT細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体(MHC)の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性T細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。
本発明は、ヒト腫瘍細胞のHLAクラスI分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列およびそれらの変異型に関し、それらは抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物中で、または薬理的/免疫学的活性化合物および細胞の開発のための標的として、使用され得る。
世界保健機関(WHO)によると、がんは、2012において世界の4つの主要な非伝染性致死性疾患の1つであった。同じ年、結腸直腸がん、乳がん、および気道がんは、高所得国における10大死亡原因の1つに挙げられた(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/)。
疫学
2012年には、1410万件の新規がん症例、3260万人のがん患者(診断の5年以内)、および820万件のがん死亡が世界的に推定された(Ferlay et al.,2013;Bray et al.,2013)。表1および表2は、それぞれ、世界および選択された地域における、現在の介入に関連のある様々ながん型における、推定された発症率、5年有病率、および死亡率の概要を提供する。
2012年には、1410万件の新規がん症例、3260万人のがん患者(診断の5年以内)、および820万件のがん死亡が世界的に推定された(Ferlay et al.,2013;Bray et al.,2013)。表1および表2は、それぞれ、世界および選択された地域における、現在の介入に関連のある様々ながん型における、推定された発症率、5年有病率、および死亡率の概要を提供する。
脳腫瘍、白血病、および肺がん群のうち、本発明は、神経膠芽腫(GB)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および急性骨髄性白血病(AML)、非小細胞細胞および小細胞肺がん(NSCLCおよびSCLC)にそれぞれ特に重点を置く。
GBは、最も一般的な中枢神経系悪性病変であり、米国内の10万人当たり3.19人の年齢調整罹患率を有する。GBは、予後が非常に不良であり、1年生存率は35%であり、5年生存率は5%を下回る。男性、高齢、および民族性が、GBのリスク因子であるように見える(Thakkar et al.,2014)。
CLLは、西欧諸国で最も頻度の高い白血病であり、全ての白血病の約3分の1を構成する。発症率は、米国および欧州で同様であり、新規症例の推定数は年間約16,000件である。CLLは、アフリカ系よりも白人でより一般的であり、ヒスパニックおよび北米先住民ではより希で、アジア系ではほとんど見られない。アジア系の人々の中では、CLL発生率は白人の3分の1である(Gunawardana et al.,2008)。CLLがある患者の5年全生存率は、約79%である
AMLは成人および小児の双方で診断される白血病の2番目に頻度の高いタイプである。米国における推定新規症例は、年間約21,000人である。AML患者の5年生存率は、およそ25%である。
肺がんは世界で最も一般的なタイプのがんであり、多くの国々でがんによる主な死亡原因である。肺がんは、小細胞肺がんと非小細胞肺がんに細分される。NSCLCは、腺がん、扁平上皮がん、および大細胞がんの組織型を含み、米国における全ての肺がんの85%を占める。NSCLCの発症率は、現在および過去の喫煙者を含めた喫煙率と綿密に相関し、5年生存率は15%と報告された(World Cancer Report,2014;Molina et al.,2008)。
治療法
乳がん
乳がんは免疫原性がん実体であり、原発性腫瘍内の浸潤性免疫細胞の異なる型は、特徴的な予後および予測的有意性を示す。多数の初期免疫療法治験が、乳がん患者において実施されている。完了したワクチン接種研究のほとんどは、HER2と、MUC-1のような炭水化物抗原とを標的とし、かなり期待外れの結果が明らかにされた。乳がん患者における、イピリムマブおよびその他のT細胞活性化抗体による免疫チェックポイント調節の効果に関する臨床データが、浮上している(Emens,2012)。
乳がん
乳がんは免疫原性がん実体であり、原発性腫瘍内の浸潤性免疫細胞の異なる型は、特徴的な予後および予測的有意性を示す。多数の初期免疫療法治験が、乳がん患者において実施されている。完了したワクチン接種研究のほとんどは、HER2と、MUC-1のような炭水化物抗原とを標的とし、かなり期待外れの結果が明らかにされた。乳がん患者における、イピリムマブおよびその他のT細胞活性化抗体による免疫チェックポイント調節の効果に関する臨床データが、浮上している(Emens,2012)。
慢性リンパ球性白血病
CLLは現在治療可能ではないが、多くの患者は、遅い疾患進行または症状悪化のみを示す。患者が治療の早期開始の恩恵を受けることはないので、最初のアプローチは「経過観察」である(Richards et al.,1999)。症候性のまたは迅速に進行する疾患がある患者に対しては、いくつかの治療選択肢が利用できる。これらとしては、化学療法;標的療法;モノクローナル抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、および能動的免疫療法のような免疫ベース治療法;および幹細胞移植が挙げられる。
CLLは現在治療可能ではないが、多くの患者は、遅い疾患進行または症状悪化のみを示す。患者が治療の早期開始の恩恵を受けることはないので、最初のアプローチは「経過観察」である(Richards et al.,1999)。症候性のまたは迅速に進行する疾患がある患者に対しては、いくつかの治療選択肢が利用できる。これらとしては、化学療法;標的療法;モノクローナル抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、および能動的免疫療法のような免疫ベース治療法;および幹細胞移植が挙げられる。
モノクローナル抗体は、血液悪性疾患において広く使用されている。これは、免疫細胞表面分子のはっきりした特徴と、血液または骨髄中の腫瘍細胞へのアクセスしやすさに基づく、適切な抗原の知識によるものである。CLL療法で使用される一般的なモノクローナル抗体は、CD20またはCD52のいずれかを標的とする。元来、NHLの治療のためにFDAによって承認された最初のモノクローナル抗CD20抗体であるリツキシマブは、現在、CLL療法に広く使用されている。リツキシマブ/フルダラビン/シクロホスファミドによる併用療法は、フルダラビン/シクロホスファミドの併用と比較してCR率が高くなり、全生存(OS)が改善され、好ましい治療選択肢となった(Hallek et al.,2008)。オファツムマブ(Ofatumomab)はCD20を標的とし、難治性CLL患者の治療に使用されている(Wierda et al.,2011)。オビヌツズマブはクロラムブシルとの併用で第一選択治療において使用される、別のモノクローナル抗CD20抗体である(Goede et al.,2014)。
アレムツズマブは、化学療法抵抗性疾患を有する患者、またはdel 17pまたはp53変異として予後不良因子を有する患者の治療に用いられる抗CD52抗体である(Parikh et al.,2011)。新規モノクローナル抗体は、CD37(オルトルツズマブ、BI836826、IMGN529および(177)Lu-テツロマブ)またはCD40(ダセツズマブおよびルカツムマブ)を標的化して、前臨床設定で試験される(Robak and Robak,2014)。
いくつかの完了したおよび進行中の治験は、CD19特異性がある、遺伝子操作自己由来キメラ抗原受容体(CAR)修飾T細胞に基づく(Maus et al.,2014)。これまでのところ、少数の患者のみが、検出可能なまたは持続性のCARを示した。Porter et al.およびKalos et al.(Kalos et al.,2011;Porter et al.,2011)によって、CAR T細胞治験における1例の部分寛解(PR)および2例の完全寛解(CR)が検出されている。
活性免疫療法としては、遺伝子治療、全修飾腫瘍細胞ワクチン、DCベースのワクチン、および腫瘍関連抗原(TAA)由来ペプチドワクチンのストラテジーが挙げられる。
遺伝子治療におけるアプローチは、自己由来の遺伝子修飾された腫瘍細胞を利用する。これらのB-CLL細胞は、IL-2、IL-12、TNF-α、GM-CSF、CD80、CD40L、LFA-3、およびICAM-1のような免疫(同時)刺激遺伝子で形質移入されて、抗原提示およびT細胞活性化が改善される(Carballido et al.,2012)。特異的なT細胞応答および腫瘍細胞の減少が容易に観察される一方で、免疫応答は単に一過性である。
いくつかの研究は、自己由来DCを抗原提示細胞として使用して、抗腫瘍応答を引き起こす。DCには、腫瘍関連ペプチド、全腫瘍細胞溶解産物、および腫瘍由来のRNAまたはDNAが、生体外で負荷された。もう一つのストラテジーは、DCとの融合およびDC-B-CLL細胞ハイブリッドの生成のために、全腫瘍細胞を使用する。形質移入されたDCは、CD4+およびCD8+T細胞応答の双方を開始した(Muller et al.,2004)。腫瘍細胞溶解物またはアポトーシス小体がが負荷された融合ハイブリッドおよびDCは、腫瘍特異的CD8+T細胞応答を増加させた。臨床的奏効を示した患者は、IL-12血清レベルが上昇し、Tregの数が減少した(Palma et al.,2008)。
異なるアプローチでは、改変された腫瘍細胞を用いて、CLL特異的免疫応答を開始または増加させる。このストラテジーの一例は、トリオーマ細胞の生成であり:B-CLL細胞は、抗APC特異性を有する抗Fc受容体発現ハイブリドーマ細胞に融合される。トリオーマ細胞は、生体外でCLL特異的T細胞応答を誘導した(Kronenberger et al.,2008)。
別のストラテジーは、アジュバントとしてのカルメット・ゲラン桿菌と共に、照射された自己CLL細胞をワクチンとして利用する。幾人かの患者は、白血球レベルの減少または安定した疾患を示した(Hus et al.,2008)。
単離されたCLL細胞意外に、CLL患者由来の全血も、血液処理ユニット内での調製後にワクチンとして使用されている。このワクチンは、CLL特異的T細胞応答を引き起こし、幾人かの患者において部分的な臨床的奏効または安定した疾患をもたらした(Spaner et al.,2005)。
いくつかのTAAはCLLにおいて過剰発現され、ワクチン接種に適する。これらとしては、フィブロモジュリン(Mayr et al.,2005)、RHAMM/CD168(Giannopoulos et al.,2006)、MDM2(Mayr et al.,2006)、hTERT(Count et al.,1995)、がん胎児性抗原-未熟型ラミニン受容体タンパク質(OFAiLRP)(Siegel et al.,2003)、アディポフィリン(Schmidt et al.,2004)、サバイビン(Granziero et al.,2001)、KW1~KW14(Krackhardt et al.,2002)、および腫瘍由来IgVHCDR3領域(Harig et al.,2001;Carballido et al.、2012)が挙げられる。第I相臨床試験は、ワクチンとしてRHAMM由来R3ペプチドを使用して実施された。6人の患者のうち5人が、検出可能なR3特異的CD8+T細胞応答を有した(Giannopoulos et al.,2010)。
結腸直腸がん
結腸直腸がん(CRC)の病期次第で、異なる標準的治療法が、結腸および直腸がんに対して利用できる。標準手順としては、外科手術、放射線療法、化学療法、およびCRC標的療法が挙げられる(Berman et al.,2015a;Berman et al.,2015b)。
結腸直腸がん(CRC)の病期次第で、異なる標準的治療法が、結腸および直腸がんに対して利用できる。標準手順としては、外科手術、放射線療法、化学療法、およびCRC標的療法が挙げられる(Berman et al.,2015a;Berman et al.,2015b)。
CRCの治療には、腫瘍の除去が不可欠である。化学療法治療のためには、薬剤カペシタビンまたは5-フルオロウラシル(5-FU)が使用される。併用化学療法では、5-FU、ロイコボリンおよびオキサリプラチン(FOLFOX)を含むカクテルが推奨される(Stintzing,2014;Berman et al.,2015b)。化学療法薬に加えて、上皮成長因子受容体(EGFR、セツキシマブ、パニツマブ)または血管内皮増殖因子-A(VEGF-A、ベバシズマブ)を標的とするいくつかのモノクローナル抗体が、高ステージ疾患を有する患者に投与される。第二選択および後期治療のために、VEGFアフリベルセプトに対する阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤レゴラフェニブ、およびチミジル酸シンセターゼ阻害剤TAS-102、およびdUTPアーゼ阻害剤TAS-114が使用され得る(Stintzing,2014;Wilson et al.,2014)。
最新の臨床試験は、能動免疫療法をCRCに対する治療選択肢として分析する。これらのストラテジーとしては、腫瘍関連抗原(TAA)由来ペプチド、全腫瘍細胞、樹状細胞(DC)ワクチン、およびウイルスベクターによるワクチン接種が挙げられる(Koido et al.,2013)。
ペプチドワクチンは、これまでに、がん胎児性抗原(CEA)、ムチン1、EGFR、T細胞3(SART3)によって認識される扁平上皮がん抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン(β-hCG)、ウィルムス腫瘍抗原1(WT1)、サバイビン-2B、MAGE3、p53、リングフィンガータンパク質43、およびミトコンドリア外膜34(TOMM34)のトランスロカーゼ、または変異KRASに向けられている。いくつかの第IおよびII相臨床試験において、患者は、抗原特異的CTL応答または抗体産生を示した。免疫学的応答とは対照的に、多くの患者は、臨床的レベルでペプチドワクチンの恩恵を受けなかった(Koido et al.,2013;Miyagi et al.,2001;Moulton et al.,2002;Okuno et al.,2011)。
樹状細胞ワクチンは、TAA由来ペプチド、腫瘍細胞溶解産物、アポトーシス腫瘍細胞、または腫瘍RNAまたはDC腫瘍細胞融合産物のいずれかでパルス処理されたDCを含んでなる。第I/II相試験にある多くの患者が、特異的免疫学的応答を示した一方で、少数のみが臨床上の便益を有した(Koido et al.,2013)。
全腫瘍細胞ワクチンは、照射細胞によって改変された、GM-CSFを分泌するように改変された自己由来腫瘍細胞、またはウイルスに感染した照射細胞からなる。ほとんどの患者は、いくつかの第II/III相試験において臨床的有用性を示さなかった(Koido et al.,2013)。
CEAならびにB7.1、ICAM-1、およびLFA-3をコードする、ワクシニアウイルスまたは複製欠損鶏痘ウイルスが、第I相臨床試験におけるウイルスベクターワクチンのビヒクルとして使用されている。別の研究では、CEAおよびB7.1をコードする非自己複製カナリアポックスウイルスが使用された。CEA特異的T細胞応答の誘導に加えて、40%の患者が客観的な臨床的奏効を示した(Horig et al.,2000;Kaufman et al.,2008)。
食道がん
免疫療法は、進行した食道がんを治療するための有望な新規アプローチであってもよい。異なるMAGE遺伝子であるNY-ESO-1およびEpCAMをはじめとするいくつかのがん関連遺伝子およびがん精巣抗原は、食道がんにおいて過剰発現されることが示された(Kimura et al.,2007;Liang et al.,2005;Inoue et al.,1995;Bujas et al.,2011;Tanaka et al.,1997;Quillien et al.,1997)。これらの遺伝子は、免疫療法にとって非常に興味深い標的であり、それらの大多数についてその他の悪性病変の治療のために研究が行われている(ClinicalTrials.gov、015)。さらに、PD-L1およびPD-L2の上方制御が食道がんで報告され、より芳しくない予後と相関した。したがって、PD-L1陽性腫瘍を有する食道がん患者は、抗PD-L1免疫療法の恩恵を受けるかもしれない(Ohigashi et al.,2005)。
免疫療法は、進行した食道がんを治療するための有望な新規アプローチであってもよい。異なるMAGE遺伝子であるNY-ESO-1およびEpCAMをはじめとするいくつかのがん関連遺伝子およびがん精巣抗原は、食道がんにおいて過剰発現されることが示された(Kimura et al.,2007;Liang et al.,2005;Inoue et al.,1995;Bujas et al.,2011;Tanaka et al.,1997;Quillien et al.,1997)。これらの遺伝子は、免疫療法にとって非常に興味深い標的であり、それらの大多数についてその他の悪性病変の治療のために研究が行われている(ClinicalTrials.gov、015)。さらに、PD-L1およびPD-L2の上方制御が食道がんで報告され、より芳しくない予後と相関した。したがって、PD-L1陽性腫瘍を有する食道がん患者は、抗PD-L1免疫療法の恩恵を受けるかもしれない(Ohigashi et al.,2005)。
完了している早期臨床試験の数が非常に限られているので、食道がんにおける免疫療法アプローチに関する臨床データは、現在のところまだ比較的少ない。3つの異なるがん精巣抗原(TTKタンパク質キナーゼ、リンパ球抗原6複合遺伝子座K、およびインスリン様成長因子(IGF)-II mRNA結合タンパク質3)から誘導される、3つのペプチドからなるワクチンが、第I相試験において、進行した食道がんを有する患者に投与され、中程度の成績が得られた。自己由来悪性細胞を用いた生体外攻撃後の活性化T細胞の腫瘍内注射は、第I/II相試験にある11人の患者のうち4人で、完全または部分的腫瘍応答を誘導した(Toomey et al.,2013)。3つの異なるがん精巣抗原(TTKタンパク質キナーゼ、リンパ球抗原6複合遺伝子座K、およびインスリン様成長因子(IGF)-II mRNA結合タンパク質3)から誘導される、3つのペプチドからなるワクチンが、第I相試験において、進行した食道がんを有する患者に投与され、中程度の成績が得られた。(Kono et al.,2009)。自己由来悪性細胞およびインターロイキン2を用いた生体外攻撃後の活性化T細胞の腫瘍内注射は、第I/II相試験にある2人の患者のうち4人で、完全または部分的腫瘍応答を誘導した(Toh et al.,2000;Toh et al.,2002)。食道がんに対する異なる免疫療法の影響を評価するために、養子細胞療法(NCT01691625、NCT01691664、NCT01795976、NCT02096614、NCT02457650)予防接種ストラテジー(NCT01143545、NCT01522820)、および抗-PD-L1療法(NCT02340975)をはじめとするさらなる臨床試験が現在実施されている(ClinicalTrials.gov,2015)。
胃がん
進行したGCに対する現行の薬剤投与計画は有効性に劣り、低い5年生存率をもたらす。免疫療法は、GC患者の生存率を改善する代替アプローチであるかもしれない。腫瘍関連リンパ球およびサイトカイン誘導キラー細胞の養子免疫伝達;HER2/neu、MAGE-3または血管内皮成長因子受容体1および2を標的とするペプチドベースのワクチン;およびHER2/neuを標的とする樹状細胞ベースのワクチンが、臨床GC治験において有望な結果を示した。免疫チェックポイント阻害および遺伝子操作T細胞は、追加的な治療選択肢に相当するかもしれず、それは現在前臨床および臨床試験で評価中である(Matsueda and Graham,2014)。
進行したGCに対する現行の薬剤投与計画は有効性に劣り、低い5年生存率をもたらす。免疫療法は、GC患者の生存率を改善する代替アプローチであるかもしれない。腫瘍関連リンパ球およびサイトカイン誘導キラー細胞の養子免疫伝達;HER2/neu、MAGE-3または血管内皮成長因子受容体1および2を標的とするペプチドベースのワクチン;およびHER2/neuを標的とする樹状細胞ベースのワクチンが、臨床GC治験において有望な結果を示した。免疫チェックポイント阻害および遺伝子操作T細胞は、追加的な治療選択肢に相当するかもしれず、それは現在前臨床および臨床試験で評価中である(Matsueda and Graham,2014)。
神経膠芽腫
神経膠芽腫(WHOグレードIV)の治療選択肢は、非常に限られている。GBの治療のために、免疫チェックポイント阻害、ワクチン接種、および遺伝子操作T細胞の養子免疫伝達をはじめとする、異なる免疫療法のアプローチが調査されている。
神経膠芽腫(WHOグレードIV)の治療選択肢は、非常に限られている。GBの治療のために、免疫チェックポイント阻害、ワクチン接種、および遺伝子操作T細胞の養子免疫伝達をはじめとする、異なる免疫療法のアプローチが調査されている。
阻害性T細胞受容体またはそれらのリガンドに対する抗体は、黒色腫および膀胱がんをはじめとする、様々ながん型におけるT細胞媒介抗腫瘍免疫応答を効率的に増強することが示された。したがって、イピリムマブおよびニボルマブのようなT細胞活性化抗体の効果は、臨床的GB試験で評価されるが、予備的データは、自己免疫関連の有害事象を示唆する。
ペプチドベースのワクチン、熱ショックタンパク質ワクチン、自己由来腫瘍細胞ワクチン、樹状細胞ベースのワクチン、およびウイルスタンパク質ベースのワクチンをはじめとする、GB患者のための異なるワクチン接種ストラテジーが、現在調査されている。これらのアプローチでは、自己由来腫瘍細胞溶解産物またはサイトメガロウイルス成分を用いてパルス処理された、上皮成長因子受容体変異型III(EGFRvIII)または熱ショックタンパク質または樹状細胞のようなGB関連タンパク質から導かれるペプチドが適用されて、GB患者において抗腫瘍免疫応答が誘導される。これらの研究のいくつかは、優れた安全性および耐容性プロファイル、ならびに有望な有効性データを示す。
遺伝子修飾されたT細胞の養子免疫伝達は、GB治療のための追加的な免疫療法のアプローチである。現在、異なる臨床試験が、HER2、IL-13受容体α2、およびEGFRvIIIに向けられた、キメラ抗原受容体を有するT細胞の安全性および有効性を評価している(Ampie et al.,2015)。
肝臓がん
進行した切除不能HCCにおける治療選択肢は、マルチチロシンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブに限定される(Chang et al.,2007;Wilhelm et al.,2004)。ソラフェニブは、生存期間を約3ヶ月間増大させることが確認された唯一の全身薬物であり、目下このような患者に対する唯一の実験的治療選択肢に相当する(Chapiro et al.,2014;Llovet et al.,2008)。最近、HCCのための限定数の免疫療法治験が実施されている。免疫細胞のサブセットを活性化し、および/または腫瘍免疫原性を増大させるために、サイトカインが使用されている(Reinisch et al.,2002;Sangro et al.,2004)。その他の治験は、腫瘍浸潤性リンパ球または活性化末梢血リンパ球の輸液に焦点を合わせている(Shi et al.,2004;Takayama et al.,1991;Takayama et al.,2000)。
進行した切除不能HCCにおける治療選択肢は、マルチチロシンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブに限定される(Chang et al.,2007;Wilhelm et al.,2004)。ソラフェニブは、生存期間を約3ヶ月間増大させることが確認された唯一の全身薬物であり、目下このような患者に対する唯一の実験的治療選択肢に相当する(Chapiro et al.,2014;Llovet et al.,2008)。最近、HCCのための限定数の免疫療法治験が実施されている。免疫細胞のサブセットを活性化し、および/または腫瘍免疫原性を増大させるために、サイトカインが使用されている(Reinisch et al.,2002;Sangro et al.,2004)。その他の治験は、腫瘍浸潤性リンパ球または活性化末梢血リンパ球の輸液に焦点を合わせている(Shi et al.,2004;Takayama et al.,1991;Takayama et al.,2000)。
これまでに、少数の治療用ワクチン接種治験が実行されている。Butterfield et al.は、α-フェトプロテイン(AFP)に由来するペプチドをワクチンとして、または生体外でAFPペプチドが負荷されたDCを使用して、2つの治験を実施した(Butterfield et al.,2003;Butterfield et al.,2006)。2つの異なる研究において、自己由来腫瘍溶解産物(Lee et al.,2005)、または肝芽細胞腫細胞株HepG2の溶解産物(Palmer et al.,2009)を用いて、自己由来樹状細胞(DC)が生体外パルス処理された。これまでに、ワクチン接種治験は、臨床転帰の限定的改善のみを示している。
黒色腫
抗腫瘍免疫応答を増強することは、進行性黒色腫の治療のための有望なストラテジーのようである。米国では、免疫チェックポイント阻害剤であるイピリムマブ、ならびにBRAFキナーゼ阻害剤であるベムラフェニブおよびダブラフェニブ、およびMEK阻害剤であるトラメチニブは、進行性黒色腫の治療のために既に承認されている。イピリムマブは直接的にT細胞阻害を減少させることによって、キナーゼ阻害剤は間接的にメラノサイト分化抗原の発現を増強することによって、どちらのアプローチも患者の抗腫瘍免疫を増加させる。追加的なチェックポイント阻害剤(ニボルマブおよびランブロリズマブ)インヒビターが、最初の有望な結果をもって臨床研究で現在調査されている。さらに(Additionaly)、イピリムマブとニボリュマブ、イピリムマブとgp100由来ペプチドワクチン、イピリムマブとダカルバジン、イピリムマブとIL-2、およびイプリムマブとGM-CSFをはじめとする、抗腫瘍免疫応答を標的とする異なる併用療法が、臨床試験において試験されている(Srivastava and McDermott,2014)。
抗腫瘍免疫応答を増強することは、進行性黒色腫の治療のための有望なストラテジーのようである。米国では、免疫チェックポイント阻害剤であるイピリムマブ、ならびにBRAFキナーゼ阻害剤であるベムラフェニブおよびダブラフェニブ、およびMEK阻害剤であるトラメチニブは、進行性黒色腫の治療のために既に承認されている。イピリムマブは直接的にT細胞阻害を減少させることによって、キナーゼ阻害剤は間接的にメラノサイト分化抗原の発現を増強することによって、どちらのアプローチも患者の抗腫瘍免疫を増加させる。追加的なチェックポイント阻害剤(ニボルマブおよびランブロリズマブ)インヒビターが、最初の有望な結果をもって臨床研究で現在調査されている。さらに(Additionaly)、イピリムマブとニボリュマブ、イピリムマブとgp100由来ペプチドワクチン、イピリムマブとダカルバジン、イピリムマブとIL-2、およびイプリムマブとGM-CSFをはじめとする、抗腫瘍免疫応答を標的とする異なる併用療法が、臨床試験において試験されている(Srivastava and McDermott,2014)。
いくつかの異なるワクチン接種アプローチが、進行性黒色腫がある患者において既に評価されている。これまでのところ、第III相試験では、かなり期待外れの結果が明らかになり、ワクチン接種ストラテジーは明らかに改善を要する。そのため、OncoVEX GM-CSF治験またはDERMA治験のような新規臨床試験は、耐容性を低下させることなく臨床効果を改善することを目指す(http://www.cancerresearchuk.org)。
養子T細胞移入は、進行期黒色腫治療のために極めて有望である。生体外増殖された自己由来腫瘍浸潤性リンパ球、ならびにがん精巣抗原NY-ESO-1に対する高親和性T細胞受容体を有するT細胞は、黒色腫患者への移入時に、有意な有益かつ低毒性の効果を有した。不運にも、メラノサイト特異的抗原MART1およびgp100およびがん精巣抗原MAGEA3に対する高親和性T細胞受容体があるT細胞は、臨床試験においてかなりの毒性効果を引き起こした。したがって、養子T細胞移入は、高い治療的可能性を有するが、これらの治療の安全性と耐容性をさらに高める必要がある(Phan and Rosenberg,2013;Hinrichs and Restifo,2013)。
非小細胞肺がん
疾患は、通常は、発見時までに広がっているので、放射線療法および化学療法が頻繁に使用され、時に手術と組み合せて使用される。(S3-Leitlinie Lungenkarzinom,2011)。NSCLCに対する治療選択肢を拡大するために、異なる免疫療法アプローチが試験されており、あるいはなおも調査中である。L-BLP25またはMAGEA3を用いたワクチン接種は、NSCLC患者においてワクチン媒介延命効果を実証できなかった一方で、同種異系細胞株由来ワクチンは、有望な臨床試験結果を示した。さらに、上皮成長因子受容体であるガングリオシドと、いくつかのその他の抗原とを標的とするさらなるワクチン接種治験が現在進行中である。患者の抗腫瘍T細胞応答を高める代案のストラテジーは、特異的抗体によって阻害T細胞受容体またはそれらのリガンドをブロックすることからなる。NSCLCにおける、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、MPDL3280A、およびMEDI-4736をはじめとする、これらの抗体のいくつかの治療的可能性が、現在臨床試験で評価されている(Reinmuth et al.,2015)。
疾患は、通常は、発見時までに広がっているので、放射線療法および化学療法が頻繁に使用され、時に手術と組み合せて使用される。(S3-Leitlinie Lungenkarzinom,2011)。NSCLCに対する治療選択肢を拡大するために、異なる免疫療法アプローチが試験されており、あるいはなおも調査中である。L-BLP25またはMAGEA3を用いたワクチン接種は、NSCLC患者においてワクチン媒介延命効果を実証できなかった一方で、同種異系細胞株由来ワクチンは、有望な臨床試験結果を示した。さらに、上皮成長因子受容体であるガングリオシドと、いくつかのその他の抗原とを標的とするさらなるワクチン接種治験が現在進行中である。患者の抗腫瘍T細胞応答を高める代案のストラテジーは、特異的抗体によって阻害T細胞受容体またはそれらのリガンドをブロックすることからなる。NSCLCにおける、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、MPDL3280A、およびMEDI-4736をはじめとする、これらの抗体のいくつかの治療的可能性が、現在臨床試験で評価されている(Reinmuth et al.,2015)。
卵巣がん
炎症促進性腫瘍浸潤性リンパ球、特にCD8陽性T細胞の存在は、予後良好と相関し、腫瘍関連抗原に対して特異的なT細胞が、がん組織から単離され得ることから、免疫療法は、卵巣がん患者の治療を改善する有望なストラテジーのようである。
炎症促進性腫瘍浸潤性リンパ球、特にCD8陽性T細胞の存在は、予後良好と相関し、腫瘍関連抗原に対して特異的なT細胞が、がん組織から単離され得ることから、免疫療法は、卵巣がん患者の治療を改善する有望なストラテジーのようである。
したがって、卵巣がんにおける様々な免疫療法の調査に、多くの科学的努力がなされている。かなりの数の前臨床および臨床試験が既に実施済みであり、さらなる研究が現在進行中である。サイトカイン療法、ワクチン接種、モノクローナル抗体治療、養子細胞移入、および免疫調節に関する臨床データが利用できる。
インターロイキン2、インターフェロンα、インターフェロンγまたは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子によるサイトカイン療法は、患者自身の抗腫瘍免疫応答を増強することを目指目しており、これらの治療法は既に小規模な治験コホートにおける有望な結果を示している。
いくつかの腫瘍関連タンパク質(Her2/neu、NY-ESO-1、p53、ウィルムス腫瘍-1)に由来する単一または複数のペプチド、または自己由来腫瘍細胞に由来する全腫瘍抗原を使用した、第IおよびII相ワクチン接種研究により、優れた安全性および耐容性プロファイルが明らかにされたが、低から中程度の臨床効果しか示されなかった。
腫瘍関連タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体は、免疫細胞が媒介する腫瘍細胞の死滅を増強すると考えられている。抗CA-125抗体オレゴボマブおよびアバゴボマブならびに抗EpCAM抗体カツマキソマブは、第II相および第III相試験で有望な結果を達成した。対照的に、抗MUC1抗体HMFG1は、第III相試験で生存率を明確に高められなかった。
代案のアプローチでは、モノクローナル抗体を用いて、腫瘍細胞上の増殖因子および生存受容体を標的化しブロックする。トラスツズマブ(抗HER2/neu抗体)およびMOv18およびMORAb-003(抗葉酸受容体α抗体)の投与が、卵巣がん患者に限られた臨床的有用性のみをもたらした一方で、標準的な化学療法へのベバシズマブ(抗VEGF抗体)の追加は、進行した卵巣がんにおいて有利なようである。
免疫細胞の養子免疫伝達は、臨床試験で不均一な結果をもたらした。自己由来の生体外増幅腫瘍浸潤性T細胞の養子免疫伝達は、パイロット試験において有望なアプローチであることが示された。対照的に、葉酸受容体に対して特異的なキメラ抗原受容体を有するT細胞の移入は、第I相試験で有意な臨床的奏効を引き起こさなかった。腫瘍細胞溶解産物または腫瘍関連タンパク質を用いて生体外でパルス処理された樹状細胞は、移入時に抗腫瘍T細胞応答を促進することが示されたが、T細胞活性化の程度は臨床効果と相関しなかった。ナチュラルキラー細胞の移入は、第II相試験で顕著な毒性を引き起こした。
内在性抗腫瘍免疫ならびに免疫療法は、免疫抑制的な腫瘍微小環境によって妨げられる。この障害を克服するために、シクロホスファミド、抗CD25抗体、およびPEG化リポソーム性ドキソルビシンのような免疫調節薬が、免疫療法との組み合わせで試験されている。T細胞活性を高める抗CTLA4抗体であるイピリムマブについて、最も信頼できるデータが現在利用できる。イピリムマブは、卵巣がん患者において有意な抗腫瘍効果を発揮することが示された(Mantia-Smaldone et al.,2012)
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膵臓がん
膵臓がん患者のための治療選択肢は、非常に限られている。効果的治療のための1つの大きな問題は、診断時における典型的に進行した腫瘍病期である。ワクチン接種ストラテジーは、膵臓がんの治療のためのさらに革新的で有望な代案として調査されている。KRAS変異体、反応性テロメラーゼ、ガストリン、サバイビン、CEA、およびMUC1を標的とするペプチドベースのワクチンが臨床試験で既に評価されており、ある程度有望な結果が得られている。さらに、膵臓がん患者における、樹状細胞ベースのワクチン、同種異系GM-CSF分泌ワクチン、およびアルゲンパンツセルLの臨床試験もまた、免疫療法の有益な効果を明らかにした。異なるワクチン接種プロトコルの効率をさらに調べるための追加的な臨床試験が、現在進行中である(Salman et al.,2013)。
膵臓がん患者のための治療選択肢は、非常に限られている。効果的治療のための1つの大きな問題は、診断時における典型的に進行した腫瘍病期である。ワクチン接種ストラテジーは、膵臓がんの治療のためのさらに革新的で有望な代案として調査されている。KRAS変異体、反応性テロメラーゼ、ガストリン、サバイビン、CEA、およびMUC1を標的とするペプチドベースのワクチンが臨床試験で既に評価されており、ある程度有望な結果が得られている。さらに、膵臓がん患者における、樹状細胞ベースのワクチン、同種異系GM-CSF分泌ワクチン、およびアルゲンパンツセルLの臨床試験もまた、免疫療法の有益な効果を明らかにした。異なるワクチン接種プロトコルの効率をさらに調べるための追加的な臨床試験が、現在進行中である(Salman et al.,2013)。
前立腺がん
樹状細胞ベースのワクチンであるシプロイセルTは、FDAによって承認された最初の抗がんワクチンであった。CRPCがある患者の生存期間に対するその好ましい効果のために、さらなる免疫療法の開発に向けた多大な努力がなされている。ワクチン接種ストラテジーについては、ペプチドワクチンである前立腺特異的抗原(PSA)-TRICOM、個別化ペプチドワクチンであるPPV、DNAワクチンであるpTVG-HP、およびGM-CSF発現全細胞ワクチンであるGVAXが、異なる臨床試験で有望な結果を示した。さらに、シプロイセルT以外の樹状細胞ベースのワクチン、すなわちBPX-101およびDCVAC/Paは、前立腺がん患者において臨床的奏効を引き起こすことが示された。イピリムマブおよびニボルマブのような免疫チェックポイント阻害物質が、単剤療法として、ならびにアンドロゲン奪取療法、局所放射線療法、PSA-TRICOM、およびGVAXをはじめとするその他の治療法との併用で、現在臨床試験で評価されている。第II相試験で進行を有意に遅延させ、無憎悪生存期間を延長させた免疫調節物質タスキニモドは、現在第III相試験でさらに調査されている。もう一つの免疫修飾物質であるレナリドミドは、初期臨床試験で有望な効果をもたらしたが、第III相試験では生存率を改善できなかった。これらの期待外れな結果にもかかわらず、さらなるレナリドミド治験が継続されている(Quinn et al.,2015)。
樹状細胞ベースのワクチンであるシプロイセルTは、FDAによって承認された最初の抗がんワクチンであった。CRPCがある患者の生存期間に対するその好ましい効果のために、さらなる免疫療法の開発に向けた多大な努力がなされている。ワクチン接種ストラテジーについては、ペプチドワクチンである前立腺特異的抗原(PSA)-TRICOM、個別化ペプチドワクチンであるPPV、DNAワクチンであるpTVG-HP、およびGM-CSF発現全細胞ワクチンであるGVAXが、異なる臨床試験で有望な結果を示した。さらに、シプロイセルT以外の樹状細胞ベースのワクチン、すなわちBPX-101およびDCVAC/Paは、前立腺がん患者において臨床的奏効を引き起こすことが示された。イピリムマブおよびニボルマブのような免疫チェックポイント阻害物質が、単剤療法として、ならびにアンドロゲン奪取療法、局所放射線療法、PSA-TRICOM、およびGVAXをはじめとするその他の治療法との併用で、現在臨床試験で評価されている。第II相試験で進行を有意に遅延させ、無憎悪生存期間を延長させた免疫調節物質タスキニモドは、現在第III相試験でさらに調査されている。もう一つの免疫修飾物質であるレナリドミドは、初期臨床試験で有望な効果をもたらしたが、第III相試験では生存率を改善できなかった。これらの期待外れな結果にもかかわらず、さらなるレナリドミド治験が継続されている(Quinn et al.,2015)。
腎細胞がん
RCCの既知の免疫原性(immunogenity)は、進行したRCCにおける免疫療法およびがんワクチンの使用を支持する基礎に相当する。リンパ球PD-1発現と、RCCの進行期、グレード、および予後との間の興味深い相関、ならびにRCC腫瘍細胞による選択的PD-L1発現と、より芳しくない臨床転帰との潜在的関連性は、単独での、または抗血管新生薬またはその他の免疫療法アプローチと併用される、RCC治療のための新規抗PD-1/PD-L1薬の開発をもたらした(Massari et al.,2015)。進行したRCCでは、TRIST試験と称される第III相がんワクチン治験が、第一選択標準的治療に追加された、TroVax(ポックスウイルスベクターと共に腫瘍関連抗原5T4を使用したワクチン)が、局所的進行またはmRCCがある患者の生存期間を延長するかどうかを評価する。いずれの群でも生存期間中央値に達しておらず、399人の患者(54%)が試験に残っているが、データの解析は、TroVaxが免疫学的に活性であり、5T4特異的抗体応答の強度と改善された生存期間との間に相関があることの双方を実証する、以前の臨床結果を裏付けている。さらにRCCにおいて過剰発現されるエピトープを使用してペプチドワクチンを検索する、いくつかの研究がある。
RCCの既知の免疫原性(immunogenity)は、進行したRCCにおける免疫療法およびがんワクチンの使用を支持する基礎に相当する。リンパ球PD-1発現と、RCCの進行期、グレード、および予後との間の興味深い相関、ならびにRCC腫瘍細胞による選択的PD-L1発現と、より芳しくない臨床転帰との潜在的関連性は、単独での、または抗血管新生薬またはその他の免疫療法アプローチと併用される、RCC治療のための新規抗PD-1/PD-L1薬の開発をもたらした(Massari et al.,2015)。進行したRCCでは、TRIST試験と称される第III相がんワクチン治験が、第一選択標準的治療に追加された、TroVax(ポックスウイルスベクターと共に腫瘍関連抗原5T4を使用したワクチン)が、局所的進行またはmRCCがある患者の生存期間を延長するかどうかを評価する。いずれの群でも生存期間中央値に達しておらず、399人の患者(54%)が試験に残っているが、データの解析は、TroVaxが免疫学的に活性であり、5T4特異的抗体応答の強度と改善された生存期間との間に相関があることの双方を実証する、以前の臨床結果を裏付けている。さらにRCCにおいて過剰発現されるエピトープを使用してペプチドワクチンを検索する、いくつかの研究がある。
腫瘍ワクチンの様々なアプローチが、調査されている。腫瘍細胞溶解産物、樹状細胞と腫瘍細胞の融合物、または全腫瘍RNAをはじめとする、全腫瘍アプローチを使用した研究が、RCC患者において実施され、これらの治験のいくつかで腫瘍病変の寛解が報告された(Avigan et al.,2004;Holtl et al.,2002;Marten et al.,2002;Su et al.,2003;Wittig et al.,2001)。
小細胞肺がん
SCLCの検出、診断、および治療に関する革新が起こった。早期のがん検出のために、X線でなくCTスキャンを使用することで、肺がんによる死亡リスクが低下することが示された。現今では、SCLCの診断は、蛍光または仮想気管支鏡検査によって支援され得て、リアルタイムの腫瘍イメージング(imagining)は、放射線治療によって実施され得る。ベバシズマブ(Avastin)、スニチニブ(スーテント)、およびニンテダニブ(BIBF1120)のような新規抗血管新生薬は、SCLCの治療において治療効果を有することが示された。(American Cancer Society,2015)。免疫療法は、過度に調査されたがん療法の分野に相当する。SCLCの治療には、様々なアプローチが点在する。アプローチの1つは、天然ヒト免疫抑制剤であるCTLA-4のブロックを標的とする。CTLA-4の阻害は、がんと戦うために免疫系を増強することを意図する。近年、SCLCの治療のための有望な免疫チェックポイント阻害剤の開発が始まっている。もう一つのアプローチは抗がんワクチンに基づき、それは現在臨床試験においてSCLC治療のために利用できる(American Cancer Society,2015;National Cancer Institute(NCI),2011)。
SCLCの検出、診断、および治療に関する革新が起こった。早期のがん検出のために、X線でなくCTスキャンを使用することで、肺がんによる死亡リスクが低下することが示された。現今では、SCLCの診断は、蛍光または仮想気管支鏡検査によって支援され得て、リアルタイムの腫瘍イメージング(imagining)は、放射線治療によって実施され得る。ベバシズマブ(Avastin)、スニチニブ(スーテント)、およびニンテダニブ(BIBF1120)のような新規抗血管新生薬は、SCLCの治療において治療効果を有することが示された。(American Cancer Society,2015)。免疫療法は、過度に調査されたがん療法の分野に相当する。SCLCの治療には、様々なアプローチが点在する。アプローチの1つは、天然ヒト免疫抑制剤であるCTLA-4のブロックを標的とする。CTLA-4の阻害は、がんと戦うために免疫系を増強することを意図する。近年、SCLCの治療のための有望な免疫チェックポイント阻害剤の開発が始まっている。もう一つのアプローチは抗がんワクチンに基づき、それは現在臨床試験においてSCLC治療のために利用できる(American Cancer Society,2015;National Cancer Institute(NCI),2011)。
急性骨髄性白血病
1つの治療選択肢は、CD33を抗体薬物コンジュゲート(抗CD33+カレキアマイシン、SGN-CD33a、抗CD33+アクチニウム-225)、二重特異性抗体(CD33+CD3(AMG330)またはCD33+CD16の認識)およびキメラ抗原受容体(CAR)で標的化することである(Estey,2014)。
1つの治療選択肢は、CD33を抗体薬物コンジュゲート(抗CD33+カレキアマイシン、SGN-CD33a、抗CD33+アクチニウム-225)、二重特異性抗体(CD33+CD3(AMG330)またはCD33+CD16の認識)およびキメラ抗原受容体(CAR)で標的化することである(Estey,2014)。
非ホジキンリンパ腫
NHLの治療は、組織型および病期に左右される(National Cancer Institute,2015)。リンパ腫患者では、自然腫瘍退縮が観察され得る。したがって、能動免疫療法が治療選択肢である(Palomba,2012)。重要なワクチン接種選択肢としては、Idワクチンが挙げられる。Bリンパ球は、それらの重鎖および軽鎖の可変領域内に、各細胞クローンに特有の(=イディオタイプ、Id)特異的アミノ酸配列がある、表面免疫グロブリンを発現する。イディオタイプは、腫瘍関連抗原として機能する。受動免疫化は、組換えマウス抗Idモノクローナル抗体を単独で、またはIFNα、IL2またはクロランブシルとの組み合わせで、注射することを含む。
NHLの治療は、組織型および病期に左右される(National Cancer Institute,2015)。リンパ腫患者では、自然腫瘍退縮が観察され得る。したがって、能動免疫療法が治療選択肢である(Palomba,2012)。重要なワクチン接種選択肢としては、Idワクチンが挙げられる。Bリンパ球は、それらの重鎖および軽鎖の可変領域内に、各細胞クローンに特有の(=イディオタイプ、Id)特異的アミノ酸配列がある、表面免疫グロブリンを発現する。イディオタイプは、腫瘍関連抗原として機能する。受動免疫化は、組換えマウス抗Idモノクローナル抗体を単独で、またはIFNα、IL2またはクロランブシルとの組み合わせで、注射することを含む。
活性免疫化としては、免疫アジュバントとしてGM-CSFと共に投与される、アジュバント(KLH)にコンジュゲートされた、組換えタンパク質(Id)の注射が挙げられる。腫瘍特異的Idは、ハイブリドーマ培養によって、または細菌、昆虫または哺乳類細胞培養による組換えDNA技術(プラスミド)を使用して、製造される。3つの第III相臨床試験が実施されている(Biovest、Genitope、Favrille)。2つの試験では、患者にリツキシマブが投与された。GM-CSFは、3つの試験の全てにおいて投与された。Biovestは、ハイブリドーマ産生タンパク質を使用し、GenitopeおよびFavrilleは、組換えタンパク質を使用した。3つの試験全てにおいて、IdはKLHにコンジュゲートされた。Biovestのみが、有意な結果を有した。
Id以外のワクチンには、がん精巣抗原MAGE、NY-ESO1およびPASD-1、B細胞抗原CD20または細胞性ワクチンが含まれる。最近言及されたものは、アポトーシス腫瘍細胞で、腫瘍細胞溶解物で、DC腫瘍細胞融合体でパルス処理されたDC、または腫瘍由来RNAでパルス処理されたDCからなる。原位置ワクチン接種は、化学療法と、またはGM-CSFの存在下で増殖させた照射腫瘍細胞との組み合わされた、腫瘍内CpGによるワクチン接種、およびT細胞の回収/増殖/再注入を伴う。免疫チェックポイントを変化させる抗体によるワクチン接種は、抗CD40、抗OX40、抗41BB、抗CD27、抗GITR(抗腫瘍応答を直接増強する作動薬抗体)または抗PD1、抗CTLA-4(免疫応答を妨げるチェックポイントを阻害する抗体をブロックする)から構成される。例は、イピリムマブ(抗CTLA-4)およびCT-011(抗PD1)である(Palomba,2012)。
子宮がん
いくつかの免疫療法アプローチもまた、現在試験されている。第I/II相臨床試験では、子宮がんに罹患している患者が、ウィルムス腫瘍遺伝子1(WT1)mRNAによって電気穿孔された自己由来樹状細胞(DC)で、ワクチン接種された。アジュバントに対する局所アレルギー反応の1症例を除いて、有害な副作用は観察されず、6人の患者のうち3人が免疫学的応答を示した(Coosemans et al.,2013)。
いくつかの免疫療法アプローチもまた、現在試験されている。第I/II相臨床試験では、子宮がんに罹患している患者が、ウィルムス腫瘍遺伝子1(WT1)mRNAによって電気穿孔された自己由来樹状細胞(DC)で、ワクチン接種された。アジュバントに対する局所アレルギー反応の1症例を除いて、有害な副作用は観察されず、6人の患者のうち3人が免疫学的応答を示した(Coosemans et al.,2013)。
上記のように、HPV感染は、最終的に子宮頸がんにつながることもある病変を誘発する。そのため、高悪性度病変およびがんにおいて構成的に発現され、悪性表現型の発症および維持に必要なHPVウイルス腫瘍性タンパク質E6およびE7は、免疫療法アプローチの有望な標的と見なされる(Hung et al.,2008;Vici et al.,2014)。一研究では、転移性子宮頸がんを有する患者において、養子T細胞療法(ACT)が実施された。患者は、E6およびE7反応性腫瘍浸潤性T細胞(TIL)で点滴を受け、9人の患者のうち、2人に完全な退縮が、1人に部分的反応がもたらされた(Stevanovic et al.,2015)。さらに、E7を標的とする細胞内抗体は、マウスにおいて腫瘍増殖を妨げることが報告された(Accardi et al.,2014)。また、HPVE6およびE7を標的とするペプチド、DNAおよびDCベースのワクチンが、臨床試験中である(Vici et al.,2014)。
胆嚢腺がんおよび胆管細胞がん
胆管がん(CCC)は診断が困難なため、大部分が進行期において同定されている。胆嚢がん(GBC)は、世界的に最も頻度が高く悪性度が高い、胆管の病変である。GBCでは、腫瘍の10%のみが切除可能であり、外科手術を実施した場合でも,大部分は転移性疾患に進行し、予後は、5年生存率が5%未満のCCCよりも芳しくない。大部分の腫瘍は切除不能であるが、有効なアジュバント療法は未だにない(Rakic et al.,2014)。いくつかの研究では、化学療法薬または化学療法と標的療法(抗VEGFR/EGFR)との併用が全生存期間の延長をもたらし、将来の有望な治療選択肢かもしれない(Kanthan et al.,2015)。一般に胆管のがん腫はまれであることから、GBCまたはCCCに特有の少数の研究のみがある一方で、それらのほとんどは全ての胆管がんを含む。これが、過去数十年にわたり治療法が改善されていない理由であり、R0切除術が依然として唯一の根治的治療選択肢である。
胆管がん(CCC)は診断が困難なため、大部分が進行期において同定されている。胆嚢がん(GBC)は、世界的に最も頻度が高く悪性度が高い、胆管の病変である。GBCでは、腫瘍の10%のみが切除可能であり、外科手術を実施した場合でも,大部分は転移性疾患に進行し、予後は、5年生存率が5%未満のCCCよりも芳しくない。大部分の腫瘍は切除不能であるが、有効なアジュバント療法は未だにない(Rakic et al.,2014)。いくつかの研究では、化学療法薬または化学療法と標的療法(抗VEGFR/EGFR)との併用が全生存期間の延長をもたらし、将来の有望な治療選択肢かもしれない(Kanthan et al.,2015)。一般に胆管のがん腫はまれであることから、GBCまたはCCCに特有の少数の研究のみがある一方で、それらのほとんどは全ての胆管がんを含む。これが、過去数十年にわたり治療法が改善されていない理由であり、R0切除術が依然として唯一の根治的治療選択肢である。
膀胱がん
膀胱がんの標準的治療法としては、外科手術、放射線療法、化学療法、および免疫療法が挙げられる。
膀胱がんの標準的治療法としては、外科手術、放射線療法、化学療法、および免疫療法が挙げられる。
効果的免疫療法アプローチが、高悪性度の筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC)の治療において確立されている。その方法によって、弱毒化形態の細菌、マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis)(カルメット・ゲラン桿菌=BCG)が、膀胱内溶液として適用される。BCG処置の主要な効果は、がん再発からの有意な長期(最大10年間)保護と、進行速度の低下である。原則的に、BCGによる処置は局所炎症応答を誘導し、それが細胞性免疫応答を刺激する。BCGの免疫応答は、以下の主要ステップに基づく:BCGによる尿路上皮および膀胱がん細胞の感染と、それに続く抗原提示分子の発現増大、サイトカイン放出が媒介する免疫応答の誘導、様々な免疫細胞(その下に細胞傷害性Tリンパ球、好中球、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージがある)の関与を通じた抗腫瘍活性の誘導(Fuge et al.,2015;Gandhi et al.,2013)。
BCG治療は、一般に患者に十分に耐容されるが、特に免疫不全患者では致死的であり得る。BCG難治性は、患者の約30?40%で観察される(Fuge et al.,2015;Steinberg et al.,2016a)。BCG療法に失敗した患者の治療は、困難である。BCG治療に失敗した患者は、筋肉浸潤性疾患を発症するリスクが高い。根治的膀胱切除術は、非応答者にとって好ましい治療選択肢である(Steinberg et al.,2016b;vonRundstedt and Lerner,2015)。FDAは、膀胱保存を望む患者のためのBCGが失敗したNMIBCの第二選治療が、バルルビシンによる化学療法であると認定した。併用BCG-インターフェロンまたはBCG-チェックポイント阻害剤治療、プレBCG経皮ワクチン接種のような免疫療法アプローチ;マイコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei)細胞壁核酸(MCNA)複合体による治療;マイトマイシンC、ゲムシタビン、ドセタキセル、ナブ-パクリタキセル、エピルビシン、マイトマイシン/ゲムシタビン、ゲムシタビン/ドセタキセルのような様々な薬剤による単一または併用化学療法;および熱化学療法、放射化学療法、起電力療法または光線力学療法のような装置支援化学療法などのその他のいくつかの第二選択治療もまた利用可能でき、または現在調査中である(Fuge et al.,2015;Steinberg et al.,2016b;vonRundstedt and Lerner,2015)。利用可能な治療法の臨床試験におけるさらなる評価が、依然として必要である。
進行性膀胱がんに対する代替治療選択肢は、進行中の臨床試験で調査されている。現在の臨床試験は、分子標的療法および免疫療法の開発に焦点を合わせている。標的療法は、膀胱がんの治療における発がん関連経路阻害剤(すなわち、mTOR、血管内皮、線維芽細胞、または上皮成長因子受容体、抗血管新生または細胞周期阻害剤)の効果を調べる。分子標的療法の開発は、膀胱がんの高度な遺伝的多様性のために依然として困難である。現在の免疫療法の主な焦点は、抗PD1モノクローナル抗体および養子T細胞移入のようなチェックポイント妨害剤の開発である(Knollman et al.,2015;Grivas et al.,2015;Jones et al.,2016;Rouanne et al.,2016)。
頭頸部扁上皮がん
頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)は、疫学、病因、および治療において差異を有する異種性の腫瘍である(Economopoulou et al.,2016)。早期HNSCCの治療は、外科手術または放射線のどちらかを用いた単独療法を伴う(World Health Organization,2014)。進行がんは、化学療法と手術および/または放射線療法との併用によって治療される。
頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)は、疫学、病因、および治療において差異を有する異種性の腫瘍である(Economopoulou et al.,2016)。早期HNSCCの治療は、外科手術または放射線のどちらかを用いた単独療法を伴う(World Health Organization,2014)。進行がんは、化学療法と手術および/または放射線療法との併用によって治療される。
HNSCCは免疫抑制疾患と考えられ、免疫担当細胞の調節不全およびサイトカイン分泌の障害を特徴とする(Economopoulou et al.,2016)。免疫療法ストラテジーは、HPV陰性およびHPV陽性腫瘍の間で異なる。
HPV陽性腫瘍では、ウイルス腫瘍性タンパク質E6およびE7が優れた標的に相当するが、これは、それらが腫瘍細胞によって連続的に発現され、HPV陽性がん細胞の形質転換状態を維持するために不可欠なためである。DNAワクチン、ペプチドワクチン、および樹状細胞(DC)が関与するワクチンをはじめとする、いくつかのワクチン接種療法が、HPV陽性HNSCCにおいて、現在調査中であるさらに、進行中の第II相臨床試験は、HPV陽性腫瘍を有する患者におけるリンパ枯渇と、それに続くTILの自己由来注入の有効性を調査する(Economopoulou et al.,2016)。
HPV陰性腫瘍では、現在、いくつかの免疫療法ストラテジーが使用され、調査中である。キメラIgG1抗EGFRモノクローナル抗体セツキシマブは、再発性/転移性HNSCCのための標準的な第一選択治療として、化学療法と組み合わせてFDAにより承認されている。パニツマブ、ニモツズマブ、およびザルツムマブをはじめとする抗EGFRモノクローナル抗体が、HNSCCにおいて評価されている。いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が、HNSCCにおける使用に関する臨床試験において調査されている。それらとしては、イピリムマブ(抗CTLA-4)、トレメリムマブ(抗CTLA-4)、ペンブロリズマブ(抗PD-1)、ニボルマブ(抗PD-1)、デュルバルマブ(抗PD1)、抗KIR、ウレルマブ(抗CD137)、および抗LAG-3抗体が挙げられる。
HNSCC患者を対象とした2つの臨床試験では、p53ペプチドまたはアポトーシス腫瘍細胞を負荷したDCの使用が評価された。免疫学的反応は満足できるものであり、副作用は許容可能であった。いくつかの研究が、養子T細胞療法(ACT)を用いて行われている。T細胞は、照射された自己由来腫瘍細胞またはEBVのどちらかに対して誘導された。疾病抑制および全生存における結果は、有望であった(Economopoulou et al.,2016)。
がん治療に関連する重篤な副作用および費用を考慮すると、がん治療全般、および神経膠芽腫(GB)、乳がん(BRCA)、結腸直腸がん(CRC)、腎細胞がん(RCC)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、肝細胞がん(HCC)、非小細胞および小細胞肺がん(NSCLC、SCLC)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性骨髄性白血病(AML)、卵巣がん(OC)、膵臓がん(PC)、前立腺がん(PCA)、胃食道接合部のがんを含む食道がん(OSCAR)、胆嚢がんおよび胆管がん(GBC、CCC)、黒色腫(MEL)、胃がん(GC)、膀胱がん(UBC)、頭頸部扁上皮がん(HNSCC)、および特に子宮がん(UEC)で使用され得る要素を同定する必要性がある。がんのより良い診断、予後の評価、および治療成功の予測につながる、がん全般、特に上述のがん型のためのバイオマーカーに相当する要素を同定する必要性もまたある。
がんの免疫療法は、がん細胞を特異的に標的化しながら副作用を最小化する選択肢に相当する。がん免疫療法は、腫瘍関連抗原の存在を利用する。
腫瘍関連抗原(TAA)の現行の分類は、次の主要群を含んでなる:
a)がん精巣抗原:T細胞によって認識され得る初めて同定されたTAAはこのクラスに属し、元々はがん精巣(CT)抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍において発現し、正常組織では精巣の精母細胞/精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスIおよびII HLA分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のT細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。CT抗原の周知の例は、MAGEファミリーメンバーおよびNY-ESO-1である。
b)分化抗原:これらのTAAは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、黒色腫および正常メラノサイトに見いだされる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとMelan-A/MART-1、または前立腺がんに対するPSAが挙げられるが、これに限定されるものではない。
c)過剰発現TAA:広範に発現されるTAAをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍において検出され、多数の正常組織においても概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示さるエピトープの多くは、T細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、以前確立された免疫寛容を破壊することにより、抗がん応答を始動し得る。このクラスのTAAの顕著な例は、Her-2/neu、サバイビン、テロメラーゼまたはWT1である。
d)腫瘍特異的抗原:これらのユニークなTAAは、正常な遺伝子(β-カテニン、CDK4など)の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および/または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのTAAは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的(関連)イソ型を有するタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性(または関連性)はまた、ペプチドが腫瘍(関連)エクソンに由来する場合に生じてもよい。
e)異常な翻訳後修飾から生じるTAA:このようなTAAは、特異的でなく腫瘍において過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍において主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍にMUC1のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターン、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシングのような事象から生じる。
f)オンコウイルスタンパク質:これらのTAAはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程において重要な役割を果たしてもよく、外来性である(ヒト由来でない)ため、それらはT細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんにおいて発現されるヒト乳頭腫16型ウイルスタンパク質E6およびE7である。
a)がん精巣抗原:T細胞によって認識され得る初めて同定されたTAAはこのクラスに属し、元々はがん精巣(CT)抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍において発現し、正常組織では精巣の精母細胞/精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスIおよびII HLA分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のT細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。CT抗原の周知の例は、MAGEファミリーメンバーおよびNY-ESO-1である。
b)分化抗原:これらのTAAは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、黒色腫および正常メラノサイトに見いだされる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとMelan-A/MART-1、または前立腺がんに対するPSAが挙げられるが、これに限定されるものではない。
c)過剰発現TAA:広範に発現されるTAAをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍において検出され、多数の正常組織においても概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示さるエピトープの多くは、T細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、以前確立された免疫寛容を破壊することにより、抗がん応答を始動し得る。このクラスのTAAの顕著な例は、Her-2/neu、サバイビン、テロメラーゼまたはWT1である。
d)腫瘍特異的抗原:これらのユニークなTAAは、正常な遺伝子(β-カテニン、CDK4など)の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および/または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのTAAは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的(関連)イソ型を有するタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性(または関連性)はまた、ペプチドが腫瘍(関連)エクソンに由来する場合に生じてもよい。
e)異常な翻訳後修飾から生じるTAA:このようなTAAは、特異的でなく腫瘍において過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍において主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍にMUC1のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターン、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシングのような事象から生じる。
f)オンコウイルスタンパク質:これらのTAAはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程において重要な役割を果たしてもよく、外来性である(ヒト由来でない)ため、それらはT細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんにおいて発現されるヒト乳頭腫16型ウイルスタンパク質E6およびE7である。
T細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体(MHC)の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的とする。腫瘍特異的Tリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞において発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。
MHC分子には、MHCクラスIおよびMHCクラスIIの2つのクラスがある。MHCクラスI分子はα重鎖およびβ2ミクログロブリンから構成され、MHCクラスII分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は、ペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される、結合溝をもたらす。
MHCクラスI分子は、ほとんどの有核細胞上に見いだされる。それらは、主に内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物(DRIP)、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、MHCクラスI分子上に頻繁に見いだされる。この非古典的様式のクラスI提示は、文献中で交差提示と称される(Brossart and Bevan,1997;Rock et al.,1990)。MHCクラスII分子は、大部分はプロフェショナル抗原提示細胞(APC)に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にAPCに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外因性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。
ペプチドとMHCクラスIの複合体が、適切なT細胞受容体(TCR)を有するCD8陽性T細胞によって認識される一方で、ペプチドとMHCクラスII分子の複合体は、適切なTCRを有するCD4陽性ヘルパーT細胞によって認識される。その結果、TCR、ペプチド、およびMHCは、化学量論的に1:1:1の量で存在することが良く知られている。
CD4陽性ヘルパーT細胞は、CD8陽性細胞傷害性T細胞による、効果的な応答の誘導と維持する上で重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原(TAA)に由来するCD4陽性T細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である(Gnjatic et al.,2003)。腫瘍部位では、Tヘルパー細胞が、細胞毒性T細胞(CTL)親和的サイトカイン環境を維持して(Mortara et al.,2006)、例えば、CTL、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける(Hwang et al.,2007)。
炎症不在下では、MHCクラスII分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェショナル抗原提示細胞(APC)に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がMHCクラスII分子を発現することが判明している(Dengjel et al.,2006)。
伸長された(より長い)本発明のペプチドは、MHCクラスII活性エピトープとして作用し得る。
MHCクラスIIエピトープによって活性化されたTヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるCTLのエフェクター機能を統合するのに重要な役割を果たす。TH1型のTヘルパー細胞応答を始動するTヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド/MHC複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、CD8陽性キラーT細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、CD8陽性Tリンパ球の不在下であっても、インターフェロンγ(IFNγ)の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、CD4陽性T細胞で十分であることが示された(Beatty and Paterson,2001;Mumberg et al.,1999)。CD4 T細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある(Braumuller et al.,2013;Tran et al.,2014)。
HLAクラスII分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスIIペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかし、Dengjel et al.は、いくつかのMHCクラスIIエピトープを腫瘍から直接成功裏に同定した(国際公開第2007/028574号パンフレット、欧州特許第1760088B1号明細書)。
CD8およびCD4依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、CD8+T細胞(リガンド:MHCクラスI分子+ペプチドエピトープ)、またはCD4陽性Tヘルパー細胞(リガンド:MHCクラスII分子+ペプチドエピトープ)のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。
MHCクラスIペプチドが、細胞性免疫応答を始動(惹起)するためには、それはまた、MHC分子に結合しなくてはならない。この過程は、MHC分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。MHCクラスI結合ペプチドは、通常は8~12アミノ酸残基長であり、通常は、MHC分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、2つの保存残基(「アンカー」)を含有する。このようにして、各MHC対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
MHCクラスI依存免疫反応においては、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のMHCクラスI分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的T細胞受容体(TCR)を有するT細胞によって認識されなくてはならない。
タンパク質が、Tリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度(すなわち、それぞれのペプチド細胞当たりのコピー数)で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、(und)したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい(Singh-Jasuja et al.,2004)。このようなペプチド(「免疫原性ペプチド」)が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内T細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。
基本的に、MHC分子に結合できるあらゆるペプチドが、T細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内T細胞応答誘導のための必要条件は、対応するTCRを有するT細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。
したがって、TAAは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、T細胞ベースの治療法開発の出発点である。TAAを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るT細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイル、またはペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。それは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するTCRを有するT細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および/または増殖性T細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性T細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるT細胞(「エフェクターT細胞」)と定義される。
本発明による特異的TCR(例えば、可溶性TCR)および抗体またはその他の結合分子(スキャフォールド)によってペプチドMHCを標的化する場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。
本発明の第1の態様では、本発明は、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306、または配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306と少なくとも77%、好ましくは少なくとも88%相同的な(好ましくは少なくとも77%または少なくとも88%同一の)それらの変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、その中で前記変異型は、MHCと結合し、および/またはT細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導し、その中で前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
ペプチドが、がん療法標的として機能するための最重要基準は、正常組織と比較した原発性腫瘍組織上のその過剰提示である一方で、対応遺伝子またはエクソンのRNA発現プロファイルもまた、適切なペプチドを選択するのを助け得る。特に、いくつかのペプチドは、それらの化学的特性または細胞上のそれらの低コピー数のどちらかのために、質量分析によって検出するのが困難であり、ペプチド提示の検出に重点を置くスクリーニングアプローチは、これらの標的を同定できないこともある。しかし、これらの標的は、腫瘍組織および正常組織における遺伝子およびエキソンの発現の分析から開始して、腫瘍におけるペプチド提示を二次的に評価する、代案のアプローチによって検出されてもよい。このアプローチは、2つのmRNAデータベース(TCGAリサーチネットワーク:腫瘍サンプルについてはhttp://cancergenome.nih.gov/、および正常組織サンプルについてはGTEXデータベース(Lonsdale,2013))ならびにペプチド提示データを用いて、本発明において実現化された。遺伝子またはエクソンのmRNAが正常組織と比較して腫瘍組織において過剰発現される場合、それは腫瘍関連と見なされる。このようなペプチドは、たとえ腫瘍組織の小さな割合でしか同定されないとしても、興味深い標的に相当する。通例の質量分析法は、標的カバー度をペプチドレベルで評価するには、感度が十分でない。むしろ、腫瘍mRNA発現が、カバー度を評価するために使用され得る。ペプチドそれ自体の検出のためには、通例のスクリーニングよりも、感度の高い標的化質量分析アプローチが必要であってもよく、ペプチド提示レベルでカバー度のより良い推定がもたらされてもよい。
本発明は、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306、または配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306と少なくとも77%、好ましくは少なくとも88%相同的な(好ましくは少なくとも77%または少なくとも88%同一の)それらの変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、本発明のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、8~100、好ましくは8~30、最も好ましくは8~14アミノ酸の全長を有する。
本発明は、配列番号2、24、32、39、64、72、106、149、251、305、および306からなる群から選択される配列からなる、本発明のペプチドにさらに関し、
続く表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予測される起源(基礎)遺伝子を示す。表3、表5および表7(AB)の全てのペプチドは、HLA-A*02に結合する。表4、表6、および表8の全てのペプチドは、HLA-A*24に結合する。表5および6のペプチドは、高い誤り率があるまたはアルゴリズムを使用して計算された、ハイスループットスクリーニングの結果としての大きなリスト中で以前開示されているが、これまでがんとは全く関連付けられていなかった。表7(A+B)のペプチドは、本発明のその他のペプチドとの組み合わせで有用であってもよい追加的なペプチドである。
本発明は、さらに、例えば、神経膠芽腫(GB)、乳がん(BRCA)、結腸直腸がん(CRC)、腎細胞がん(RCC)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、肝細胞がん(HCC)、非小細胞および小細胞肺がん(NSCLC、SCLC)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性骨髄性白血病(AML)、卵巣がん(OC)、膵臓がん(PC)、前立腺がん(PCA)、胃食道接合部のがんを含む食道がん(OSCAR)、胆嚢がんおよび胆管がん(GBC、CCC)、黒色腫(MEL)、胃がん(GC)、膀胱がん(UBC)、頭頸部扁上皮がん(HNSCC)、および子宮がん(UEC)などの増殖性疾患の治療において使用するための本発明によるペプチドに一般に関する。
特に好ましいのは、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306からなる群から選択される、本発明による単独のまたは組み合わせのペプチドである。より好ましいのは、配列番号1?配列番号149(表3を参照されたい)、配列番号158から配列番号213(表4を参照されたい)、および配列番号305、および配列番号306、からなる群から選択され、特に配列番号2、24、32、39、64、72、106、149、251、305、および306、からなる群から選択される配列からなる、単独のまたは組み合わせのペプチドと、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)、または子宮がんの免疫療法におけるそれらの使用である。
実施例1に示されるように、本発明によるペプチドの多くは、様々な腫瘍型に見いだされ、したがって、その他の適応症の免疫療法に使用され得る。実施例2に示されるように、様々ながんの根底にあるポリペプチドの過剰発現は、様々なその他の腫瘍学的適応症における、これらのペプチドの有用性を示唆している。
したがって、本発明の別の態様は、好ましくは、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん、または子宮がんの群から選択される増殖性疾患の併用療法のための本発明によるペプチドの使用に関する。
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIの分子に結合する能力を有し、または長さ変異型などの伸長形態では、MHCクラスIIに結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは(それぞれ)、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および/または非ペプチド結合を含む。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にHLA-DR抗原関連不変鎖(Ii)のN末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体(またはその配列中)に融合した、融合タンパク質の一部である。
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本発明は、DNA、cDNA、PNA、RNA、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
本発明は、本発明による核酸を発現でき、および/または発現する、発現ベクターにさらに関する。
本発明は、疾患の治療においてそして医療において、特にがんの治療において使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドに対して、または前記本発明によるペプチドとMHCの複合体に対して特異的な対抗と、それらを製造する方法とにさらに関する。
本発明は、T細胞受容体(TCR)、特に、自己由来または同種異系T細胞に組み込まれた可溶性TCR(sTCR)およびクローン化TCR;これらを製造する方法;ならびに前記TCRを有するまたは前記TCRと交差反応する、NK細胞またはその他の細胞を製造する方法にさらに関する。
抗体およびTCRは、本発明によるペプチドの免疫療法用途の追加的な実施形態である。
本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。本発明は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスIまたはII MHC分子上に抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号1~配列番号289を含有する、好ましくは、配列番号1~配列番号149、配列番号158~配列番号213または変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現する能力がありまたは発現する、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化T細胞にさらに関し、前記T細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。
本発明は、本発明によって製造されるT細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
本発明は、薬剤としてのまたは薬剤の製造における、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、本発明による活性化Tリンパ球、T細胞受容体または抗体またはその他のペプチド-および/またはペプチド-MHC-結合分子の使用にさらに関する。好ましくは、前記薬剤は、がんに対して有効である。
好ましくは、前記薬剤は、可溶性TCRまたは抗体に基づく、細胞療法、ワクチンまたはタンパク質である。
本発明は、本発明による使用にさらに関し、その中で、前記がん細胞は、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん、または子宮がん細胞である。
本発明は、がん、好ましくは、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん、または子宮がんの診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドをベースとするバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的とする免疫療法である、治療の成功確率を予測するのに使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性TCRを使用して腫瘍切片が染色され、MHCと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。
任意選択的に、抗体は、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。
本発明はまた、がん治療状況におけるこれらの新規標的の使用に関する。
ABCC11の一塩基多型は、S-1アジュバント化学療法で治療された、非小細胞肺がんを有する患者のより短い無再発生存期間に関連することが示された(Tsuchiya et al.,2016)。ABCC11は、乳がんにおける多剤耐性表現型のプロモーターとして記載された。さらに、乳腺腫におけるABCC11の高発現は、侵襲性サブタイプおよび低い無病生存率に関連することが示された(Honorat et al.,2013;Yamada et al.,2013)。結腸直腸がん患者におけるABCC11転写物レベルは、緩和化学療法に対する応答者と比較して、非応答者で有意に低いことが示され、それは有意に短い無病期間に関連する(Hlavata et al.,2012)。ABCC11は肺腺がんにおけるペメトレキセド(MTA)治療の潜在的なバイオマーカーとして記載された(Uemura et al.,2010)。急性骨髄性白血病におけるABCC11上方制御は、4年間にわたって評価された全生存の低い確率と関連しており、予測マーカーの役割を果たしてもよいことが示された(Guo et al.,2009)。ABCC11は、肝細胞がんにおいて上方制御されることが示された(Borel et al.,2012)。
ARは、N末端ドメイン、DNA結合ドメイン、およびアンドロゲン結合ドメインの3つの主要な機能ドメインを有するタンパク質をコードする90kbを超える長さのアンドロゲン受容体遺伝子をコードする。タンパク質は、ステロイド-ホルモン活性化転写因子として機能する。受容体は、ホルモンリガンドに結合すると、アクセサリータンパク質から解離して核に移行し、二量体化し、次にアンドロゲン応答性遺伝子の転写を刺激する。この遺伝子は、そのタンパク質のN末端トランス活性化ドメイン中にポリグルタミンおよびポリグリシン鎖をコードする、2つの多型トリヌクレオチドリピート断片を含む。正常な9~34反復配列から病原性38~62反復配列へのポリグルタミン鎖の伸長は球脊髄性筋萎縮症を引き起こす(ケネディ病)。この遺伝子の変異は、完全型アンドロゲン不応症(CAIS)にもまた関連する。別個のイソ型をコードする、2つの選択的スプライス変異型が記載されている。米国特許第20150306197A1号明細書は、HLA-A2コンセンサス結合配列に適合する9量体または10量体ペプチドについてAR LBDのタンパク質配列をスキャンすることによって、およびHLA-A2に対するそれらの予測された結合親和性によって同定された、AR LBD(リガンド結合ドメイン)ペプチドエピトープとして、配列番号(SQ ID NO.)305を開示する。このペプチドは、前立腺がんワクチンのために限定的に提案されている。
C1orf186は、染色体1オープンリーディングフレーム186をコードし、染色体1q32.1上に位置する(RefSeq,2002)。クルッペル様因子9は、子宮内膜がん細胞におけるC1orf186発現を阻害する(Simmen et al.,2008)。C1orf186は、ER陽性乳がんに関連する(Triulzi et al.,2015)。
DNTTは、DNAヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードする。生体内では、コードされたタンパク質は、初期分化の間に正常および悪性プレBおよびプレTリンパ球の限定集団において発現され、そこでそれは、再配列Ig重鎖とT細胞受容体遺伝子断片との接合部に非生殖細胞系要素(N領域)を合成することによって、抗原受容体多様性を生じる。この遺伝子の異なるイソ型をコードする、選択的スプライスによる転写物変種について記述されている。米国20110142842A1特許第号明細書は、造血細胞特異的タンパク質の配列としてのHLA-A*0201への結合として、配列番号305のペプチドを予測する。このペプチドはさらに試験されず、刊行物は、白血病、非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫、および多発性骨髄腫をはじめとする、多くの多くの様々ながん型の治療について推測する。
LRRC15は、15含有ロイシン富化リピートをコードし、染色体3q29上に位置する(RefSeq,2002)。EWSR1-WT1は、LRRC15の発現に影響を及ぼすことが示された発がん性転写因子である(Cliteur et al.,2012;Reynolds et al.,2003)。LRRC15は、様々な実体において過剰発現される腫瘍抗原である(O'Prey et al.,2008)。LRRC15は、乳がん浸潤に関連する(Schuetz et al.,2006)。LRRC15は、アンドロゲン非依存性転移性前立腺腫瘍の侵襲性挙動に関連する(Stanbrough et al.,2006)。LRRC15に対する自己抗体は、乳がんと逆相関する(Evans et al.,2014)。
MAGEC2は、その他のMAGEC遺伝子と同様に、染色体Xq26-q27上にクラスター化された遺伝子であるMAGEファミリーメンバーC2をコードする(RefSeq,2002)。MAGEC2の過剰発現は、サイクリンEのレベルを増加させ、G1-S移行および細胞増殖を促進する(Hao et al.,2015)。MAGEC2は、多発性骨髄腫における増殖およびアポトーシス抵抗性を促進し、MAGEC2特異的免疫療法が最も悪性の細胞を根絶する可能性を有することが示唆される(Lajmi et al.,2015)。上皮間葉転換誘導物質であるMAGEC2は、乳がん転移に関連する。多変量解析は、MAGEC2発現が、患者の全生存および無転移生存の独立した危険因子であることを示した。(Yang et al.,2014)。
METは、肝細胞増殖因子受容体をコードし、チロシンキナーゼ活性をコードする(RefSeq,2002)。METは、脱分化型脂肪肉腫において上方制御されることが示され、メラノサイト腫瘍、肝細胞がん、非小細胞肺がん、遺伝性乳頭状腎臓がん、および胃腺がんに関連する(Petrini,2015;Finocchiaro et al.,2015;Steinway et al.,2015;Bill et al.,2015;Yeh et al.,2015)。
PRAMEは、ヒトメラノーマにおいて優先的に発現され、レチノイン酸受容体のリプレッサーとして作用する抗原をコードし、おそらくこの機能を介してがん細胞に増殖上の利点を与える(RefSeq,2002)。PRAMEが、多発性骨髄腫、腎明細胞がん、乳がん、急性骨髄性白血病、黒色腫、慢性骨髄性白血病、頭頸部扁上皮がん、および骨肉腫細胞株において、上方制御されることが示された(Dannenmann et al.,2013;Yao et al.,2014;Zou et al.,2012;Szczepanski and Whiteside,2013;Zhang et al.,2013;Beard et al.,2013;Abdelmalak et al.,2014;Qin et al.,2014)。PRAMEは、粘液性脂肪肉腫および円形細胞脂肪肉腫に関連している(Hemminger et al.,2014)。PRAMEは、R-CHOPで治療されたたびまん性大細胞型B細胞リンパ腫におけるより短い無増悪生存期間および化学療法剤応答、頭頸部扁上皮がんにおける予後不良のマーカー、尿路上皮がんにおける化学療法に対する応答不良、および骨肉腫における予後不良および肺転移に関連している(Tan et al.,2012;Dyrskjot et al.,2012;Szczepanski et al.,2013;Mitsuhashi et al.,2014)。PRAMEは、急性リンパ芽球性白血病におけるより少ない再発、より低い死亡率、および全生存期間に関連している(Abdelmalak et al.,2014)。PRAMEは、R-CHOP療法で治療されたびまん性大細胞型B細胞リンパ腫の予後マーカーであってもよい(Mitsuhashi et al.,2014)。
SPINK2は、生殖器でトリプシンおよびアクロシン阻害剤の役割を果たして精子に局在する、カザール型のセリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーのメンバーをコードする(RefSeq,2002)。SPINK2は、Bリンパ芽球TK-6細胞を除くほとんどの白血病細胞株において有意に上方制御されていることが示され、腫瘍進行および治療に対する応答において、重要な役割を果たすことが示唆された(Chen et al.,2009)。
STEAP2は、ゴルジ装置、原形質膜、および 細胞質ゾルの小胞状管構造に局在する複数回貫通膜タンパク質をコードする、STEAP2メタロレダクターゼをコードする。ヒト遺伝子の転写発現の増加は、前立腺がんの進行に関連する(RefSeq,2002)。STEAP2は、TNF-α処置時に誘導され、NF-κB処置時に抑制される。NF-κBのサイレンシングは抗アポトーシスタンパク質STEAP2の過剰発現をもたらし、それは引き続いてp53を抑制する(Gonen-Korkmaz et al.,2014)。STEAP2は、前立腺、膀胱、結腸、膵臓、卵巣、精巣、乳房、子宮頸部、およびユーイング肉腫のような多くのがん実体において過剰発現される(Wang et al.,2010;Gomes et al.,2012;Grunewald et al.,2012)。STEAP2は、前立腺がん細胞の移動および侵襲を駆動してもよい。STEAP2の過剰発現は、局所的に進行した病態に関連する(Whiteland et al.,2014)。STEAP2は、去勢抵抗性前立腺がんにおいて、スプライシングされていないRNAのより高い比率を有する(Sowalsky et al.,2015)。STEAP2は、前立腺がんのバイオマーカーとして使用され得る(Edwards et al.,2005)。STEAP2は、シンバスタチンおよびロバスタチン耐性に関連する(Savas et al.,2011)。
UMODL1は、ウロモジュリ様1をコードして、染色体21q22.3上に位置する(RefSeq,2002)。UMODL1は肺腺がん転移を駆動してもよい(Tan et al.,2016)。長い非コードRNAキメラであるUMODL1-AS1は、乳がん再発の予後因子として使用され得る(Liu et al.,2016)。
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて腫瘍増殖に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのT細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物(DRIPS)に由来する、通常は8~10アミノ酸残基の主要組織適合性複合体(MHC)保有ペプチドのクラスI分子を認識するCD8陽性T細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのMHC分子はまた、ヒト白血球抗原(HLA)とも称される。
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
「T細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。MHCクラスI拘束性細胞毒性T細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされたまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解;好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン-γ、TNF-α、またはIL-2であるサイトカインの分泌;好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌;または脱顆粒であってもよい。
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは9アミノ酸長であるが、8アミノ酸長程度に短くあり得て、10、11、または12以上に長くあり得て、MHCクラスIIペプチド(本発明のペプチドの伸長された変種)の場合、それらは13、14、15、16、17、18、19または20アミノ酸長以上に長くあり得る。
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩(トリフルオロ酢酸塩)などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内で塩ではないので、本発明によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態がペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本発明には重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約30アミノ酸残基長未満であり、約15アミノ酸長を超える。
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本発明にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約30を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である(したがって本発明における「免疫原」である)。本発明では、免疫原性は、より具体的には、T細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本発明では、T細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはTCRを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとMHCの複合体、オリゴペプチド、および/またはタンパク質であり得る。
クラスI T細胞「エピトープ」は、クラスI MHC受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体(MHCクラスIα鎖、β-2-ミクログロブリン、およびペプチド)を形成し、それは、適切な親和性でMHC/ペプチド複合体に結合する適合T細胞受容体を保有するT細胞によって、認識され得る。MHCクラスI分子に結合するペプチドは、典型的に8~14アミノ酸長であり、最も典型的には9アミノ酸長である。
ヒトにおいては、MHCクラスI分子(ヒト白血球抗原(HLA)ともまた称されるヒトのMHC分子)をコードする、3つの異なる遺伝子座、HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cがある。HLA-A*01、HLA-A*02、およびHLA-B*07は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるMHCクラスI対立遺伝子の例である。
本発明のペプチドは、好ましくは、本明細書に記載される本発明のワクチンに包含される場合、A*02またはA*24に結合する。ワクチンはまた、汎結合MHCクラスIIペプチドを含んでもよい。したがって、本発明のワクチンを使用して、A*02またはA*24陽性の患者においてがんを治療し得る一方で、これらのペプチドの汎結合特性のために、MHCクラスIIアロタイプを選択する必要はない。
本発明のA*02ペプチドが、例えばA*24などの別の対立遺伝子に結合するペプチドと組み合わされた場合、MHCクラスI対立遺伝子のいずれか単独による対処と比較して、任意の患者集団のより高い割合を治療し得る。大多数の集団では、対立遺伝子のいずれか単独によって、50%未満の患者が対処され得た一方で、HLA-A*24およびHLA-A*02エピトープを含んでなるワクチンは、任意の妥当な集団で、少なくとも60%の患者を治療し得る。具体的には、以下の様々な地域において、これらの対立遺伝子の少なくとも1つが、以下の百分率の患者で陽性である:米国61%、西欧62%、中国75%、韓国77%、日本86%
好ましい実施形態では、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするDNA断片は、cDNAフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。
本明細書の用法では「ペプチドをコーディング(またはコード)するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、TCRの製造に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工(人造)開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖DNA、このような配列とその補体との二本鎖(二本鎖DNA)、およびこのような配列の補体を指す。
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
コード領域は、非変異(「正常」)、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはDNA合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、DNA配列または遺伝子にさえ由来し得る。
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるDNAの部分を意味する。
「DNA断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のDNAコンストラクトの構成要素としての、DNAポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列が同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも1回単離されたDNAに由来する。このような断片は、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳DNA配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはDNAの1本鎖と対合し得て、DNAポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離3'-OH末端を提供する。
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのRNAポリメラーゼ結合に関与する、DNAの領域を意味する。
「単離」という用語は、物質が、その元の環境(例えば、それが天然起源であれば天然環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得て、および/またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味では、なおも単離されている。
本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく;むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、cDNAライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、より好ましくは4または5桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは99.999%、または少なくとも99.99%または99.9%;さらに望ましくは99%以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。
本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および/またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「濃縮」という用語は、物質濃度が、(例えば)その天然濃度の少なくとも約2、5、10、100、または1000倍であることを意味し、有利には重量基準で0.01%、好ましくは重量基準で少なくとも約0.1%である。重量基準で約0.5%、1%、5%、10%、および20%の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性フラグメント」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスのようなそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与すると免疫応答を生じる(すなわち、免疫原性を有する)ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列のフラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でT細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外T細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列はより大型の配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列(「比較配列」)と、記載されまたは特許請求される配列(「参照配列」)とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される:
同一性百分率=100[1-(C/R)]
式中、Cは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
(i)比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
(ii)参照配列中の各ギャップ、および
(iii)比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
(iiii)アライメントは、整合配列の1位から開始しなくてはならず;
Rは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
同一性百分率=100[1-(C/R)]
式中、Cは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
(i)比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
(ii)参照配列中の各ギャップ、および
(iii)比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
(iiii)アライメントは、整合配列の1位から開始しなくてはならず;
Rは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
したがって上述したように、本発明は、配列番号1~配列番号289、または配列番号1~配列番号289と88%相同的であるその変異型、またはT細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスI分子または前記ペプチドの伸長バージョンをクラスIIに結合する能力を有する。
本発明では、「相同的」という用語は,2つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す(上の同一性百分率を参照されたい)。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた2つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばClustalWアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Vector NTI、GENETYXまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるT細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう(Appay et al.,2006;Colombetti et al.,2006;Fong et al.,2001;Zaremba et al.,1997)。
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号1~配列番号289からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、HLA分子となおも結合できるように、(例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより)例えば、アミノ酸の1つまたは2つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがHLA-A*02または-DRなどの適切なMHC分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化CTLのTCRに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
これらのT細胞は、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献およびデータベース(Rammensee et al.,1999;Godkin et al.,1997)から演繹され得るように、HLA結合ペプチドの特定の位置は、典型的に、アンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるHLA受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって、当業者は、既知のアンカー残基を保つことで、配列番号1~配列番号289、305、および306に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型がMHCクラスIまたはII分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本発明の変異型は、活性化T細胞のTCRに結合する能力を維持し、それは引き続いて、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞と交差反応して、それを殺滅し得る。
本明細書で開示される元の(未修飾)ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、1つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
保存的置換は、本明細書では、以下の5つのグループの1つの中の交換として定義される:グループ1-小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly);グループ2-極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド(Asp、Asn、Glu、Gln);グループ3-極性の正に帯電した残基(His、Arg、Lys);グループ4-大型脂肪族非極性残基(Met、Leu、Ile、Val、Cys);およびグループ5-大型芳香族残基(Phe、Tyr、Trp)。
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、過激な置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「過激な」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。
もちろんこのような置換には、通常のL-アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってD-アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見いだされるL-アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸(すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外)もまた置換目的で使用して、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが製造されてもよい
2つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の4つ以上の位置を超えて同時に置換されることはない。
本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較すると、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはII分子に結合する能力が、実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、1つまたは2つの非アンカーアミノ酸を有し得る(アンカーモチーフについては下記を参照されたい)。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはII分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、1つまたは2つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー(以下を参照されたい)で交換され得る。
T細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、T細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連MHCとの結合を排除しない、その他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異型を含む、任意のペプチド(本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める)であってもよい。
より長い(伸長された)ペプチドもまた、適切であってもよい。MHCクラスIエピトープは、通常は8~11アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって作製することが可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。
本発明のペプチドは、最大4個のアミノ酸によって伸長させ得て、すなわち4:0~0:4の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に1,2、3または4個のアミノ酸が付加され得る。本発明による伸長の組み合わせは、表12にある。
伸長/延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、4つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
代案の実施形態では、ペプチドは、4つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大30アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。これは、MHCクラスII結合ペプチドをもたらしてもよい。MHCクラスIIへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。
したがって、本発明は、MHCクラスIエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、8~100、好ましくは8~30、最も好ましくは8~14、すなわち8、9、10、11、12、13、14アミノ酸の全長を有し、伸長されたクラスII結合ペプチドの場合、長さはまた、15、16、17、18、19、20、21または22アミノ酸であり得る。
もちろん、本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはIIの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異型のMHC複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なT細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増加の半分を達成するペプチド濃度は、約1mM以下、好ましくは約1μM以下、より好ましくは約1nM以下、さらにより好ましくは約100pM以下、最も好ましくは約10pM以下である。置換ペプチドが、2人以上、少なくとも2人、より好ましくは3人の個人からのT細胞によって認識されることもまた好ましい。
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号1~配列番号289、305、および306に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号1~配列番号289、305、および306のいずれかに記載の配列またはその変異型に加えて、MHC分子エピトープのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なNおよび/またはC末端に位置するアミノ酸の一連の配列を含有することを意味するものとする。
それでもなお、これらの一連の配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供するのに重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、NCBI、GenBank受入番号X00497に由来する、HLA-DR抗原関連不変鎖(p33、以下の「Ii」)の80個のN末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である。その他の融合物においては、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば、本明細書に記載されるような樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。
さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および/またはMHC分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。
逆ペプチド結合においては、アミノ酸残基はペプチド(-CO-NH-)結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ-インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Meziere et al(1997)(Meziere et al.,1997)に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して製造されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチドの生成を伴う。Meziere et al.(Meziere et al.,1997)は、MHC結合およびTヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含有するレトロインバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い抵抗性がある。
非ペプチド結合は、例えば、-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、および-CH2SO-である。米国特許第4,897,445号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびNaCNBH3の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中の非ペプチド結合(-CH2-NH)を固相合成する方法を提供する。
上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび/またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成して、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および/または親和性を高めてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはt-ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または9-フルオレニルメトキシ-カルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、t-ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。
さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変するように合成されてもよい。例えば、通常のL異性体でなく、ペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基のD異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも1つは、周知の非天然起源アミノ酸残基の1つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および/または結合作用の増加に役立ってもよい。
同様に、本発明のペプチドまたは変異型は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特定のアミノ酸を反応させることで化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、R.Lundblad,Chemical Reagents for Protein Modification,3rd ed.CRC Press,2004(Lundblad,2004)に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが(although without limitation thereto)、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化、システインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるカルボキシル基のアミド修飾およびスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性pHでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない(is not limited to)。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Chapter 15 of Current Protocols In Protein Science,Eds.Coligan et al.(John Wiley and Sons NY 1995-2000)(Coligan et al.,1995)を参照されたい。
簡単に述べると、例えば、タンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、および1,2-シクロヘキサンジオンなどの隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、システイン修飾のために多数の試薬が利用可能である。Sigma-Aldrichなどの会社のウェブサイト(http://www.sigma-aldrich.com)が、特定の試薬に関する情報を提供する。
タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。ウッドワード試薬Kを使用して、特定のグルタミン酸残基が修飾されてもよい。N-(3-(ジメチルアミノ)プロピル)-N’-エチルカルボジイミドを利用して、リジン残基とグルタミン酸残基との間に分子内架橋が形成され得る。例えば、ジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、4-ヒドロキシ-2-ノネナールを使用して修飾され得る。リジン残基およびその他のα-アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質/ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ(エチレン)グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンTによって修飾され得る。
テトラニトロメタンおよびN-アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素/銅イオンによって達成され得る。
トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、N-ブロモサクシニミド、臭化2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルまたは3-ブロモ-3-メチル-2-(2-ニトロフェニルメルカプト)-3H-インドール(BPNS-スカトール)が使用されている。
PEGによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長に関連することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートでのカルバミル化によって達成されることが多い。
ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異型は、本発明の好ましい実施形態である。
本発明の別の実施形態は、非天然ペプチドに関し、前記ペプチドは、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になり、薬学的に許容可能な塩として合成的に生成されている(例えば合成される)。ペプチドを合成的に生産する方法は、当該技術分野で周知である。生体内で生成されるペプチドは塩でないため、本発明によるペプチドの塩は、ペプチドの生体内での状態と実質的に異なる。ペプチドの非天然塩形態は、特に、ペプチドを含んでなる医薬組成物、例えば、本明細書で開示されるペプチドワクチンなどの文脈で、ペプチドの溶解性を媒介する。治療される対象にペプチドを効率的に提供するためには、ペプチドの十分で少なくとも実質的な溶解性が必要である。好ましくは、塩はペプチドの薬学的に許容可能な塩である。本発明によるこれらの塩としては、ア二オンとしてPO4
3-、SO4
2-、CH3COO-、Cl-、Br-、NO3
-、ClO4
-、I-、SCN-、およびカチオンとしてNH4
+、Rb+、K+、Na+、Cs+、Li+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、およびBa2+を含んでなるホフマイスター系列の塩類などのアルカリ塩およびアルカリ土類塩類が挙げられる。特に塩類は、(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、(NH4)2SO4、NH4CH3COO、NH4Cl、NH4Br、NH4NO3、NH4CIO4、NH4I、NH4SCN、Rb3PO4、Rb2HPO4、RbH2PO4、Rb2SO4、Rb4CH3COO、Rb4Cl、Rb4Br、Rb4NO3、Rb4CIO4、Rb4I、Rb4SCN、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KCH3COO、KCl、KBr、KNO3、KClO4、KI、KSCN、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2SO4、NaCH3COO、NaCl、NaBr、NaNO3、NaCIO4、NaI、NaSCN、ZnCI2Cs3PO4、Cs2HPO4、CsH2PO4、Cs2SO4、CsCH3COO、CsCl、CsBr、CsNO3、CsCIO4、CsI、CsSCN、Li3PO4、Li2HPO4、LiH2PO4、Li2SO4、LiCH3COO、LiCl、LiBr、LiNO3、LiClO4、LiI、LiSCN、Cu2SO4、Mg3(PO4)2、Mg2HPO4、Mg(H2PO4)2、Mg2SO4、Mg(CH3COO)2、MgCl2、MgBr2、Mg(NO3)2、Mg(ClO4)2、MgI2、Mg(SCN)2、MnCl2、Ca3(PO4),、Ca2HPO4、Ca(H2PO4)2、CaSO4、Ca(CH3COO)2、CaCl2、CaBr2、Ca(NO3)2、Ca(ClO4)2、CaI2、Ca(SCN)2、Ba3(PO4)2、Ba2HPO4、Ba(H2PO4)2、BaSO4、Ba(CH3COO)2、BaCl2、BaBr2、Ba(NO3)2、Ba(ClO4)2、BaI2、およびBa(SCN)2から選択される。特に好ましいのは、例えば、塩化物塩または酢酸塩(トリフルオロ酢酸塩)などのNH酢酸塩、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、KCl、NaCl、およびCaCl2である。
一般に、ペプチドおよび変異型(少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの)は、Lukas et al.(Lukas et al.,1981)によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Fmoc-ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なN-アミノ基保護は、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル(セリン、スレオニン、およびチロシンの場合)、ブチルエステル(グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合)、ブチルオキシカルボニル誘導体(リジンおよびヒスチジンの場合)、トリチル誘導体(システインの場合)、および4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル誘導体(アルギニンの場合)として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがC末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、4,4’-ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド(主鎖単量体)、ビスアクリロイルエチレンジアミン(架橋剤)、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル(機能化因子)の3つの単量体から構成される、ポリジメチル-アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド-対-樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性4-ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。逆転N,N-ジシクロヘキシル-カルボジイミド/1ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として付加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン(isotin)試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、50%スカベンジャー混合物を含有する95%トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である(例えば、(Bruckdorfer et al.,2004)、およびその中で引用される参考文献を参照されたい)。
トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在するあらゆるスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥に際して、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Calbiochem-Novabiochem(Nottingham,UK)から入手できる。
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および(通常は)例えば、アセトニトリル/水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の1つまたは組み合わせによって実施されてもよい。
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出(CSPE)、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃(FAB)質量分光分析によって、ならびにMALDIおよびESI-Q-TOF質量分光分析によって、実施されてもよい。
本発明のペプチドの同定のために、TCGA Research Network(http://cancergenome.nih.gov/)によって作製されたRNASeq腫瘍データ、および約3000の正常(健常)組織サンプルをカバーするRNASeqデータ(GTEx)(Lonsdale,2013)のRNA発現データの2つのデータベースを一緒に比較した:正常(健常)組織サンプルと比較して、腫瘍組織サンプルにおいて過剰発現された(with were)遺伝子がスクリーニングされた。次に、がん関連ペプチドが、これらの遺伝子のタンパク質産物から誘導され、本明細書に記載されるようなXPRESIDENT(商標)プラットフォームを使用して、質量分析によって同定された。
過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、目的腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのp値を計算し(Pinheiro et al.,2015)、偽発見率によって複数試験について補正することで(Benjamini and Hochberg,1995)、これらの各プロファイルが過剰提示スコアに統合され得る(実施例1、図1参照)。
質量分析によるHLAリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのHLA分子が精製されて、HLA関連ペプチドが単離された。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化(nanoESI)液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)実験によって配列を同定した。得られたペプチド配列は、がんサンプル(N=450のA*02陽性サンプル、N=211のA*24陽性サンプル)から記録された、天然腫瘍関連ペプチド(TUMAP)のフラグメンテーションパターンと、同一配列の対応する合成標準ペプチドのフラグメンテーションパターンとの比較によって確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のHLA分子のリガンドとして直接、同定されたので、これらの結果は、A*02および/またはA*24陽性がん患者から入手された原発性がん組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。
発見パイプラインXPRESIDENT(登録商標)v2.1(例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第2013-0096016号明細書を参照されたい)は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のHLA拘束性ペプチドレベルの直接相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択ができるようにする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインで処理された獲得LC-MSデータを使用して、配列同定のためのアルゴリズム、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化を組み合わせる、無標識示差定量化の開発によって達成された。
各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍において過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定されている。
組織サンプルからのHLAペプチド複合体は精製されてHLA結合ペプチドが単離され、LC-MSによって分析された(実施例を参照されたい)。本出願に含まれる全てのTUMAPは、この原発性がんサンプルに対するアプローチを用いて同定され、それらの原発性神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、または子宮がん上の提示が確認された。
複数のがんおよび正常組織上で同定されたTUMAPは、無標識LC-MSデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのLC-MSシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。様々なLC-MS実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプルあたりで平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション(除電)、および滞留時間アライメントおよび正規化のような、異なる解析法を統合する。
さらに、発見パイプラインXPRESIDENT(登録商標)v2.1.は、がんまたはその他の感染組織上で、MHC拘束性、好ましくはHLA拘束性のペプチドレベルの直接絶対定量化ができるようにする。簡単に述べると、分析された組織サンプルの全DNA含有量から、総細胞数が計算された。組織サンプル中のTUMAPの全ペプチド量は、天然TUMAPと、既知量のTUMAPの同位体標識バージョン、いわゆる内標準との比率として、ナノLC-MS/MSによって測定された。TUMAP単離の効率は、TUMAP単離手順の可能な限り早い時点で、全ての選択されたTUMAPのペプチド:MHC複合体を組織溶解産物に添加して、ペプチド単離手順の完了に続く、ナノLC-MS/MSによるそれらの検出によって判定された。総細胞数および全ペプチド量は、組織サンプル当たり三連の測定から計算された。ペプチド単離効率は、それぞれ三連で測定された、10回の添加実験からの平均として計算された(実施例6および表22を参照されたい)。このRNA発現および質量分析データの複合解析は、本発明の289個のペプチドをもたらした。
ペプチドの過剰提示に加えて、基礎となる遺伝子のmRNA発現が試験された。mRNAデータは、正常組織およびがん組織のRNASeq分析を通して得られた(実施例2、図2参照)。正常組織データのさらなる出典は、約3000の正常組織サンプル(Lonsdale,2013)に由来する、公的に利用可能なRNA発現データのデータベースであった。それがコードするmRNAが、がん組織では高度に発現されるが、生命維持に必要な正常組織では非常に低いかまたは存在しない、タンパク質に由来するペプチドが、好ましくは本発明に包含される。
本発明は、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、がん/腫瘍、好ましくは神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、および子宮がんの治療に有用なペプチドを提供する。これらのペプチドは、原発性ヒトがんサンプル上で、HLA分子によって天然に提示されることが、質量分析法によって示された。
それにペプチドが由来する、起源遺伝子/タンパク質の多く(「完全長タンパク質」または「基本的タンパク質」とも称される)は、正常組織と比較して、がんにおいて非常に過剰発現されることが示され、本発明との関連で「正常組織」とは、腫瘍と同じ臓器に由来する健常細胞または組織、またはその他の正常組織細胞のどちらかを意味するものとし、起源遺伝子の高度な腫瘍関連性が実証される(実施例2を参照されたい)。さらに、ペプチド自体は、腫瘍組織上では強く過剰提示されるが、正常組織上では過剰提示されず、「腫瘍組織」は、本発明との関連で、がんに罹患している患者に由来するサンプルを意味するものとする(実施例1を参照されたい)。
HLA結合ペプチドは、免疫系、特にTリンパ球によって認識され得る。T細胞は、例えば、由来するペプチドを提示する、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、または子宮がん細胞などの認識されたHLA/ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。
本発明のペプチドは、T細胞応答を刺激でき、および/または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および/または可溶性TCRなどのTCRの製造のために使用され得る(実施例3を参照されたい)。さらに、ペプチドは、それぞれのMHCと複合体化した場合に、本発明による抗体および/またはTCR、特にTCR製造のためにも使用され得る。それぞれの方法は当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる(下記もまた参照されたい)。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞が破壊され得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤(すなわちアジュバント)との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体(例えば伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸)を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。この文脈で、特に好ましいのは、配列番号2、24、32、39、64、72、106、149、251、305、および306からなる群から選択される、本発明のペプチドである。
本明細書は、鎖およびaβ鎖(「α/βTCR」)を含んでなるT細胞受容体(TCR)にさらに関する。また、MHC分子によって提示されるとTCRおよび抗体に結合できる、本発明によるペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のTCRおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞;そしてそれを使用する方法にも関する。この場合も、この文脈で特に好ましいのは、配列番号2、24、32、39、64、72、106、149、251、305、および306からなる群から選択される、本発明のペプチドである。
「T細胞受容体」(TCRと略記される)という用語は、αポリペプチド鎖(α鎖)およびaβポリペプチド鎖(β鎖)を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、HLA分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。本用語は、いわゆるγ/δTCRもまた含む。
一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなTCRを製造する方法を提供し、方法は、TCRの発現を促進するのに適した条件下でTCRを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。
別の態様における説明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスIまたはII MHC分子上に抗原が負荷され、または抗原/クラスIまたはII MHC複合体モノマーを四量体化することで、クラスIまたはII MHC四量体上に抗原が負荷される、本明細書に記載の方法に関する。
α/βTCRのαおよびβ鎖、そしてγ/δTCRのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ2つの「ドメイン」、すなわち可変および定常ドメインを有すると見なされる。可変ドメインは、可変領域(V)と接合領域(J)の連結からなる。可変ドメインはまた、リーダー領域(L)を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域(D)を含んでもよい。αおよびβ定常ドメインはまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるC末端膜貫通(TM)ドメインを含んでもよい。
γ/δTCRに関して、「TCRγ可変ドメイン」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域(L)のないTCRγV(TRGV)領域とTCRγJ(TRGJ)領域との連結を指し、TCRγ定常ドメインという用語は、細胞外TRGC領域を指し、またはC末端切断型TRGC配列を指す同様に「TCRδ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域(L)のないTCRδV(TRDV)領域とTCRδD/J(TRDD/TRDJ)領域との連結を指し、「TCRδ定常ドメイン」という用語は、細胞外TRDC領域を指し、またはC末端切断型TRDC配列を指す。
本明細書のTCRは、好ましくは、約1μM以下、約001μM以下、約25μM以下、または約10μM以下の結合親和性(KD)で、ペプチド-HLA分子複合体に結合する。より好ましいのは、約1μM以下、約100nM以下、約50nM以下、約25nM以下の結合親和性を有する、高親和性TCRである。本発明のTCRの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約1nM~約10nM;約10nM~約20nM;約20nM~約30nM;約30nM~約40nM;約40nM~約50nM;約50nM~約60nM;約60nM~約70nM;約70nM~約80nM;約80nM~約90nM;および約90nM~約100nMが挙げられる。
本明細書の用法では、本明細書のTCRとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、ペプチド-HLA分子複合体に対して、100μM以下の結合親和性(KD)を有するTCRを意味するために使用される。
本明細書のα/βヘテロ二量体TCRは、それらの定常ドメインの間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいTCRとしては、TRAC定常ドメイン配列とTRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列とを有するものが挙げられるが、ただし、TRACのThr48およびTRBC1またはTRBC2のSer57は、システイン残基によって置換されており、前記システインは、TCRのTRAC定常ドメイン配列とTRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。
上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα/βヘテロ二量体TCRは、TRAC定常ドメイン配列とTRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列とを有してもよく、TCRのTRAC定常ドメイン配列と、TRBC1またはTRBC2定常ドメイン配列とが、TRACのエクソン2のCys4と、TRBC1またはTRBC2のエクソン2のCys2との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。
本明細書のTCRは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のTCRは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。
一実施形態では、α鎖に少なくとも1つの変異を有し、および/またはβ鎖に少なくとも1つの変異を有する本明細書のTCRは、非変異TCRと比較して修飾されたグリコシル化を有する。
一実施形態では、TCRα鎖および/またはTCRβ鎖に少なくとも1つの変異を含んでなるTCRは、ペプチド-HLA分子複合体に対して、非変異TCRα鎖および/または非変異TCRβ鎖を含んでなるTCRの少なくとも2倍の結合親和性および/または結合半減期を有する。腫瘍特異的TCRの親和性増強とその利用は、最適TCR親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、HLA-A2拘束性病原体に対して特異的なTCRが、HLA-A2拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なTCRと比較して、一般に約10分の1のKD値を有するという観察に基づく。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異型タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原(いわゆる自己抗原)は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性のTCRを発現するT細胞は、中枢性免疫寛容として知られている過程、すなわち自己抗原に対する低親和性TCRを有するT細胞のみが残留する過程によって、胸腺において負選択される。したがって、ペプチド(pepides)に対する本明細書のTCRまたは変異型の親和性は、当技術分野で周知の方法によって高め得る。
本明細書は、本明細書に従ってTCRを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、HLA-A*02陰性健常ドナーからのPBMCをA2/ペプチドモノマーと共にインキュベートするステップと、PBMCを四量体フィコエリトリン(PE)と共にインキュベートするステップと、高結合活性T細胞を蛍光(fluo-rescence)活性化細胞選別(FACS)Calibur分析によって単離するステップとを含んでなる。
本明細書は、本明細書に従ってTCRを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのT細胞がマウスTCR欠損を補償する多様なヒトTCRレパートリーを発現する、全ヒトTCRαβ遺伝子遺伝子座(1.1および0.7Mb)を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをペプチドで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン(PE)を有する遺伝子組換えマウスから得られたPBMCをインキュベートするステップと、高結合活性T細胞を蛍光活性化細胞選別(FACS)Calibur分析によって単離するステップとを含んでなる。
一態様では、本明細書のTCRを発現するT細胞を得るために、本明細書のTCR-αおよび/またはTCR-β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的T細胞集団(一般に患者のPBMCから精製される)が形質導入され、それは患者への輸液前に増殖される。
別の態様では、本明細書のTCRを発現するT細胞を得るために、例えば、生体外転写システム(sys-tems)などの当該技術分野で公知の技術によって、TCR RNAが合成される。次に生体外で合成されたTCR RNAは、健常ドナーから得られた原発性CD8+T細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的TCR-αおよび/またはTCR-β鎖が再発現される。
発現を増加させるために、本明細書のTCRをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復(LTR)、サイトメガロウイルス(CMV)、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)U3、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、β-アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス40(SV40)/CD43複合プロモーター、伸長因子(EF)-1a、および脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーターなどの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。
強力なプロモーターに加えて、本明細書のTCR発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト(cPPT)(Follenzi et al.,2000)、およびRNA安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(wPRE)(Zufferey et al.,1999)をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。
本発明のTCRのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
高レベルのTCR表面発現の達成には、導入されたTCRのTCR-αおよびTCR-β鎖の双方が、高レベルで転写される必要がある。これを行うために、本明細書のTCR-αおよびTCR-β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。TCR-αおよびTCR-β鎖は、翻訳中に2つのタンパク質に分かれて等モル比のTCR-αおよびTCR-β鎖の生成を確実にする単一転写物から生成されるので、TCR-α鎖とTCR-β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす(Schmitt et al.,2009)。
本明細書のTCRをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増加されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が2つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合tRNAの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない(Gustafsson et al.,2004)。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、TCR-αおよびTCR-β遺伝子配列を修飾すること、ならびにmRNA不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、TCR-αおよびTCR-β遺伝子発現を有意に高めることが示されている(Scholten et al.,2006)。
さらに、導入TCR鎖と内因性TCR鎖との間の誤対合は、重大な自己免疫リスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合TCR二量体の形成は、適切に対合するTCR複合体を形成するために利用できるCD3分子の数を減少させてもよく、ひいては導入TCRを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る(Kuball et al.,2007)。
誤対合を減少させるために、本明細書の導入TCR鎖のC末端領域は、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性TCRと対形成する能力を低下させるために、修飾されてもよい。これらのストラテジーは、ヒトTCR-αおよびTCR-βのC末端領域をそれらのマウス対応物(マウス化C末端領域)で置換する;導入TCRのTCR-αおよびTCR-β鎖の双方に第2のシステイン残基を導入することで、C末端領域に第2の鎖間ジスルフィド結合を生成する(システイン修飾);TCR-αおよびTCR-β鎖C末端領域内の相互作用残基を交換する(「ノブ・イン・ホール」);そしてTCR-αおよびTCR-β鎖の可変領域をCD3ζに直接融合させる(CD3ζ融合)ことを含んでもよい。
(Schmitt et al.,2009)。
(Schmitt et al.,2009)。
一実施形態では、宿主細胞は、本細書のTCRを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトT細胞またはT細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞またはT細胞前駆細胞は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、T細胞またはT細胞前駆細胞は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α/βTCRを発現するように形質転換されたγ/δT細胞である。
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、GMPガイドラインに準拠して製造される。
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる(上記もまた参照されたい)。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基から調製される(典型的に、薬剤の中性形態が中性NH2基を有する)。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を使用して調製される。
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸(酢酸塩)、トリフルオロ酢酸または塩酸(塩化物)の塩としてのペプチドを含んでなる。
好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンなどの免疫療法剤である。それは、患者に直接、罹患臓器に、または全身的に、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、およびi.v.投与され、または生体外で患者またはヒト細胞株に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン2などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント(下記参照)と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと組み合わせて使用され、または例えば、リポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい(国際公開第95/18145号パンフレットおよび(Longenecker et al.,1993)を参照されたい)。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、CD4またはCD8 T細胞を刺激することが予測される。しかし、CD8 T細胞の刺激は、CD4 Tヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、CD8 T細胞を刺激するMHCクラスIエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはCD4陽性T細胞を刺激するエピトープを提供する。CD4およびCD8刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものが挙げられる。
一態様では、ワクチンは、配列番号1~配列番号289、305、および306に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも50つのペプチドと、少なくとも2つの追加的なペプチド、好ましくは2~305、より好ましくは2~306、なおもより好ましくは2~20、最も好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、1つまたは複数の特異的TAAから誘導されてもよく、MHCクラスI分子に結合してもよい。
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異型をエンコードする核酸(例えばポリヌクレオチド)を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および/または二本鎖のいずれかのDNA、cDNA、PNA、RNAまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にDNAをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターDNAに挿入されるDNA断片に、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびDNA断片が連結されて組換えDNA分子が形成する。
1つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、DNA断片をベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、International Biotechnologies Inc.New Haven,CN,USAをはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを修飾する望ましい方法は、Saiki RK,et al.(Saiki et al.,1988)で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限酵素認識部位を改変することで、DNAを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でDNAを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
次にDNA(またはレトロウイルスベクターの場合はRNA)を適切な宿主において発現させ、本発明のペプチドまたは変異型を含んでなるポリペプチドが製造されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異型をコードするDNAを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および製造のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、米国特許第4,440,859号明細書、米国特許第4,530,901号明細書、米国特許第4,582,800号明細書、米国特許第4,677,063号明細書、米国特許第4,678,751号明細書、米国特許第4,704,362号明細書、米国特許第4,710,463号明細書、米国特許第4,757,006号明細書、米国特許第4,766,075号明細書、および米国特許第4,810,648号明細書で開示されるものが挙げられる。
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするDNA(またはレトロウイルスベクターの場合はRNA)は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のDNA配列に連結されてもよい。コンパニオンDNAは、宿主の性質、DNAの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
一般に、DNAは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、DNAは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するDNA配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えDNAによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。
細菌(例えば大腸菌(E.coli)およびバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌(例えばアスペルギルス属(Aspergillus))、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ATCC Cell Biology Collectionから入手できるCHO細胞などの哺乳類細胞であり得る。
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリA尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとを有する、CMVまたはSV40プロモーターを含んでなる。一例は、Pharmacia,Piscataway,NJ,USAから入手できるpSVLである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるpMSGもまた、Pharmaciaから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、pRS403-406およびpRS413-416であり、通常、Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから入手できる。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405、およびpRS406は、酵母組み込みプラスミド(YIps)であり、酵母の選択可能なマーカーHIS3、TRP1、LEU2、およびURA3が組み込まれている。プラスミドpRS413-416は、酵母セントロメアプラスミド(Ycps)である。CMVプロモーターベースのベクター(例えばSigma-Aldrich製)は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびFRAG、3xFLAG、c-mycまたはMATの様々な組み合わせでのN末端またはC末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
強力なヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター調節領域は、COS細胞において、構成タンパク質発現レベルを1mg/L程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約0.1mg/Lである。SV40複製起点の存在は、SV40複製許容COS細胞における高レベルのDNA複製をもたらす。CMVベクターは、例えば、細菌細胞におけるpMB1(pBR322の誘導体)複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのb-ラクタマーゼ遺伝子、hGHポリA、およびf1起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー(PPT)配列を含有するベクターは、抗FRAG抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのFRAG融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞において使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
別の実施形態では、本発明の2つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される(「数珠玉構造」コンストラクトに類似する)。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばLLLLLLなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、MHC IとMHC IIの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc.,Bethesda,MD,USAから入手できる大腸菌(E.coli)DH5株、および米国微生物系統保存機関(ATCC)Rockville,MD,USAから入手できるRR1(ATCC番号31343)などの大腸菌(E.coli)株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA 92037,USAから一般に入手できる、YPH499、YPH500、およびYPH501が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ATCCからCCL61として入手できるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ATCCからCRL1658として入手できるNIH Swissマウス胚細胞NIH/3T3、ATCCからCRL1650として入手できるサル腎臓由来COS-1細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である293細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るSf9細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Paulina BalbasおよびArgelia Lorenceの教科書、"Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression,Reviews and Protocols,"Part One,Second Edition,ISBN 978-1-58829-262-9、および当業者に知られているその他の文献にある。
本発明のDNAコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohenetal.(Cohen et al.,1972)および(Green and Sambrook,2012)を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al.(Sherman et al.,1986)に記載される。Beggs(Beggs,1978)の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびDEAE-デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、Stratagene Cloning Systems,or Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD 20877,USAから入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および/または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のDNAコンストラクトを含有する細胞は、PCRなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なMHC分子中に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたAPCは、無症候性または微小症候性転移性HRPCを治療するために、米国食品医薬品局(FDA)によって2010年4月20日に認可された(シプロイセルT)(Rini et al.,2006;Small et al.,2006)。
本発明のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹腔内(i.p.)注射、筋肉内(i.m.)注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.、およびi.v.が挙げられる。DNA注射の好ましい方法としては、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、およびi.v.が挙げられる。例えば、50μg~1.5mg、好ましくは125μg~500μgのペプチドまたはDNAの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはDNAに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された(Walter et al.,2012)。
活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、DNA、cDNA、PNA、RNAまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Teufel et al.(Teufel et al.,2005)によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または2つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスDNAおよび/またはRNAが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、DNA送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド(単数)またはペプチド(複数)は、例えば、上述のように、それぞれの逆CDRのT細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
本発明の薬剤は、1つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答(例えば、CD8陽性T細胞およびヘルパーT(TH)細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤中で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、1018 ISS、アルミニウム塩、AMPLIVAX(登録商標)、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、フラジェリンまたはフラジェリン由来TLR5リガンド、FLT3リガンド、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド(ALDARA(登録商標))、レシキモド、ImuFact IMP321、IL-2やL-13やIL-21などのインターロイキン、インターフェロン-αまたは-βまたはそれらのPEG化誘導体、ISパッチ、ISS、ISCOMATRIX、ISCOM、JuvImmune(登録商標)、LipoVac、MALP2、MF59、モノホスホリルリピドA、モンタニドIMS1312、モンタニドISA206、モンタニドISA50V、モンタニドISA-51、油中水型および水中油型エマルション、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel(登録商標)ベクター系、ポリ(ラクチドコグリコリド)[PLG]ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンSRL172、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、YF-17D、VEGFトラップ、R848、β-グルカン、Pam3Cys、サポニンに由来するAquila’s QS21 stimulon、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体、およびRibi’s DetoxまたはQuilまたはSuperfosなどのその他の独自仕様の補助剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはGM-CSFなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント(例えばMF59)が、以前記載されている(Allison and Krummel,1995)。また、サイトカインが使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織(例えばTNF-)への移動に影響を与えること、Tリンパ球(例えば、GM-CSF、IL-1、およびIL-4)のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること(その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第5,849,589号明細書)、および免疫増強剤(例えば、IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)として作用することと、直接関連付けられている(Gabrilovich et al.,1996)。
CpG免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を増強することが報告されている。理論により拘束されることなく、CpGオリゴヌクレオチドは、Toll様受容体(TLR)、主にTLR9を通じた、内在的(非適応性)免疫系の活性化によって作用する。CpG誘導性TLR9活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を増強し、CD4 T細胞援助の不在下であってさえも、TH1細胞の活性化の促進、および強力な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)生成をもたらす。TLR9刺激によって誘導されるTH1バイアスは、通常はTH2バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント(IFA)などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。CpGオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物、または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、CpGなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ2桁分の低減を可能にする(Krieg,2006)。米国特許第6,406,705B1号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのCpGオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。CpG TLR9拮抗薬は、本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である、Mologen(Berlin,Germany)製のdSLIM(二重ステムループ免疫調節剤)である。RNA結合TLR7、TLR8および/またはTLR9などのその他のTLR結合分子もまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾CpG(例えば、CpR、Idera);ポリ(I:C)などのdsRNAアナログおよびそれらの誘導体(例えばAmpliGen(登録商標)、Hiltonol(登録商標)、ポリ(ICLC)、ポリ(IC-R)、ポリ(I:C12U)、非CpG細菌DNAまたはRNA;ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ(登録商標)、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗CTLA4などの免疫活性小型分子および抗体;免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体(例えば、抗CD40、抗TGFβ、抗TNFα受容体);SC58175が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび/またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
好ましいアジュバントは、抗CD40、イミキモド、レシキモド、GM-CSF、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、CpGオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ(I:C)および誘導体、RNA、シルデナフィル、およびPLGまたはビロソーム微粒子調合物である。
本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、サルグラモスチム)、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF、サルグラモスチム)、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 20、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、poly-ICLC(Hiltonol(登録商標))、および抗CD40mABまたはそれらの組み合わせである。
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、風味、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、A.Kibbe,Handbook of Pharmaceutical Excipients(Kibbe,2000)から採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および/または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、欧州特許第2112253号明細書にある。
本発明によるワクチンによって引き起こされる免疫応答は、異なる細胞分裂期および異なる発生段階のがんを攻撃することを理解することが重要である。さらに、異なるがん関連シグナル伝達経路が攻撃される。これは、1つまたは少数の標的のみに対処して、攻撃に対する腫瘍の容易な適応(腫瘍エスケープ)を引き起こすこともある、ワクチンに優る利点である。さらに個々の腫瘍の全てが、同一パターンの抗原を発現するとは限らない。したがって、いくつかの腫瘍関連ペプチドの組み合わせによって、ありとあらゆる腫瘍が標的の少なくとも一部を有することが確実になる。組成物は、それぞれの腫瘍が抗原のいくつかを発現することを予期して設計され、腫瘍の増殖と維持に必要ないくつかの独立した経路をカバーする。したがって、ワクチンは、より大きな患者集団のために、容易に「出来合」で使用され得る。これは、ワクチンで治療される患者の予備選択が、HLAタイピングに限定され得て、抗原発現に関する任意の追加的なバイオマーカーアセスメントを必要としないことを意味するが、いくつかの標的が誘導免疫応答によって同時に攻撃されることはなおも確実であり、これは有効性にとって重要である(Banchereau et al.,2001;Walter et al.,2012)。
本明細書の用法では、「スキャフォールド」という用語は、(例えば、抗原性)決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、スキャフォールドはまた、それが付着する実体(例えば、(第2の)抗原結合部分)を例えば、抗原決定基(例えば本出願書に記載のペプチドとMHCの複合体)を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、キャフォールドは、例えば、T細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を通じて、シグナル伝達を活性化できる。スキャフォールドとしては、抗体およびそれらのフラグメント、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも1つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合(SDAB)分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、(可溶性)TCR、および同種または自己由来T細胞などの(改変)細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合するスキャフォールドであるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。
「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を殺滅できる活性分子を装備したスキャフォールドが、特異的標的がないがその他のペプチド-MHC複合体を提示する別の細胞を殺滅できない程度に、スキャフォールドがその他の天然ペプチド-MHC-複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド-MHC-複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド-MHCのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトHLA-ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド-MHC複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド-MHC提示を有する標的細胞(初代細胞または細胞株)、または天然に存在するペプチド-MHCレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。
各スキャフォールドは標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合スキャフォールドが検出され得ることを提供する。例えば、スキャフォールドは、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。
各スキャフォールドは、例えば、IL-21、抗-CD3、および抗-CD28などの第2の活性分子にコンジュゲートされ得る。
ポリペプチドスキャフォールドに関するさらなる情報については、例えば国際公開第2014/071978A1号パンフレットの背景セクション、およびその中で引用された参考文献を参照されたい。
本発明は、アプタマーにさらに関する。アプタマー(例えば、国際公開第2014/191359号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい)は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。
細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去10年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。
DNAアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。
さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。
アプタマーは、診断および治療目的で有用である。さらに、アプタマーの一部は腫瘍細胞に取り込まれ、したがって腫瘍細胞内へのsiRNAなどの抗がん剤の標的化送達のための分子ビヒクルとして、機能し得ることが示され得た。
アプタマーは、細胞SELEX(試験管内進化法)技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本発明による配列番号1~配列番号289、305、および306のいずれかに記載の配列とMHC分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体などに対して、選択され得る。
本発明のペプチドを使用して、MHC/ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され、開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、PETなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織の大きさと正確な位置確認の判定を助け得る。
したがってHLA拘束性抗原(好ましくは本発明によるペプチド)と複合体化した、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはIIと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはIIを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を前記HLA拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のMHCクラスIまたはII分子によって免疫化するステップと;mRNA分子を前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から単離するステップと;前記mRNA分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作製するステップと;少なくとも1つのファージを前記ファージディスプレイライブラリーから単離するステップとを含んでなる。前記少なくとも1つのファージは、前記HLA拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはIIと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
したがってHLA拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはIIと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および/またはキメラ抗体である。
このような抗体および一本鎖クラスI主要組織適合性複合体を製造するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を製造するためのその他のツールは、本発明の目的で、その内容全体が参照により全て明示的に援用される、国際公開第03/068201号パンフレット、国際公開第2004/084798号パンフレット、国際公開第01/72768号パンフレット、国際公開第03/070752号パンフレット、および文献(Cohen et al.,2003a;Cohen et al.,2003b;Denkberg et al.,2003)で開示される。
好ましくは、抗体は,20ナノモル濃度未満、好ましくは10ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」とも見なされる。
本発明は、配列番号1~配列番号289、305、および306からなる群から選択される配列、または配列番号1~配列番号289、305、および306と少なくとも88%相同的な(好ましくは同一の)その変異型を含んでなるペプチド、またはT細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異型に関し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
本発明は、配列番号1~配列番号289、305、および306からなる群から選択される配列、または、配列番号1~配列番号289、305、および306と少なくとも88%相同的な(好ましくは同一の)その変異型を含んでなるペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたは変異型は、8~100、好ましくは8~30、最も好ましくは8~14アミノ酸の全長を有する。
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはIIの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、ペプチドが、配列番号1~配列番号289、305、および306に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、ペプチドが(化学的に)修飾された、および/または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にHLA-DR抗原関連不変鎖(Ii)のN末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に(またその中に)融合する。
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全(完全長)ヒトタンパク質でない。
本発明は、DNA、cDNA、PNA、RNAまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
本発明は、本発明による核酸を発現できる、発現ベクターにさらに関する。
本発明は、医療において、特に神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がんなどのがんの治療において使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。
本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞および/またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスIまたはII MHC分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号1~配列番号289、305、および306または前記異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できる、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化T細胞にさらに関し、前記T細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
本発明は、本発明によるT細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Tリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
本発明は、発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、細胞であり、または神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がん細胞などのその他の固形または血液学的腫瘍細胞である。
本発明は、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がんの診断および/または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本発明はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
「抗体(単数)」または「抗体(複数)」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。非損傷または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、それらが本発明による所望の性質のいずれか(例えば、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部がんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭部および頸部扁平上皮がん、または子宮がんマーカー(ポリ)ペプチドの特異的結合、増加したレベルでがんマーカー遺伝子を発現するがん細胞への毒素の送達、および/またはがんマーカーポリペプチドの活性の阻害)を示しさえすれば、これらの免疫グロブリン分子のフラグメント(例えば、CDR、Fv、Fab、およびFcフラグメント)またはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンもまた含まれる。
可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、完全長の神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん,胃食道接合部のがんを含む食道がんる、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がんマーカーポリペプチド、またはその断片のどちらかを使用して、本発明の抗体が生成されてもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を製造するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えDNA技術を使用して製造されてもよい。
例えば、配列番号1~配列番号289、305、および306ポリペプチドに記載のペプチドなどの本発明によるペプチドをコードするcDNA、またはその変異型またはフラグメントが、原核細胞(例えば、細菌)または真核細胞(例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞)で発現され得て、その後、組換えタンパク質が精製されて、本発明による抗体を生成するために使用される、上述のがんのマーカーポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体製剤を生成するために使用され得る。
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の2つ以上の異なるセットの生成が、その目的の用途(例えば、ELISA、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法)に必要な特異性および親和性を有する抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験された(例えば、ELISA、免疫組織化学的検査、免疫療法など;抗体の生成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Greenfield,2014(Greenfield,2014)を参照されたい。例えば、抗体は、ELISAアッセイ、ウエスタンブロット、ホルマリン固定がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色で試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し;すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生変異以外は同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントを特に含む(その内容全体が本明細書に援用される、米国特許第4,816,567号明細書)。
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
モノクローナル抗体はまた、米国特許第4,816,567号明細書に記載されるものなどの組換えDNA法によって製造されるものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって)。
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体フラグメント、特にFabフラグメントを作製するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第94/29348号パンフレットおよび米国特許第4,342,566号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位を有するFabフラグメントと称される2つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのFcフラグメントとを典型的に生じる。ペプシン処理は、F(ab’)2フラグメントおよびpFc’フラグメントをもたらす。
抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸の除去/付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト(例えばマウス)抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(抗体のFv、Fab、Fab’またはその他の抗原結合部分配列など)である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入CDRまたはフレームワーク配列のどちらにも見いだされない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つおよび典型的に2つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、CDR領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、それは典型的に「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯類CDR(複数)またはCDR(単数)配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号明細書)であり、その中では、実質的に完全でないヒト可変ドメインが、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中ではいくつかのCDR残基と、おそらくはいくつかのFR残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。
免疫化に際して、内因性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる遺伝子組換え動物(例えばマウス)を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。
本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて、製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のpHは、好ましくは約5~約8、より好ましくは約7~約7.5である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路と濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。
抗体は、注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内)によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような測定の実施は、当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な1日量は、上述の要素次第で、1日あたり約1(μg/kg~最大100mg/kg体重またはそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。好ましくは、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がんを治療するための抗体投与に続いて、治療用抗体の有効性が、熟練した実務家に良く知られている様々な様式で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象におけるがんの大きさ、数、および/または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こるであろう疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および/または新規腫瘍の発生を予防する、治療的に投与された抗体は、がん治療のための有効な抗体である。
特異的ペプチド-MHC複合体を認識する可溶性T細胞受容体(sTCR)を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性T細胞受容体は、特異的T細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増加させ得る。T細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る(米国特許第2010/0113300号明細書、(Liddy et al.,2012))。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、T細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合(一本鎖T細胞受容体)、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る(Boulter et al.,2003;Card et al.,2004;Willcox et al.,1999)。T細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン(例えば、米国特許第2013/0115191号明細書を参照されたい)、および抗CD3ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるT細胞において発現され得た。さらなる情報は、国際公開第2004/033685A1号パンフレットおよび国際公開第2004/074322A1号パンフレットにある。TCRの組み合わせは、国際公開第2012/056407A1号パンフレットに記載される。さらなる製造法は、国際公開第2013/057586A1号パンフレットで開示される。
さらに本発明のペプチドおよび/またはTCRまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。
抗体またはTCRはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、腫瘍が位置確認され得るように、免疫シンチグラフィー(immunoscintiography)を使用して、放射性ヌクレオチド(111In、99Tc、14C、131I、3H、32Pまたは35Sなど)で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらのフラグメントは、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の2つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性(Kd)は1×10μM未満である。
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査;磁気共鳴画像法および分光法;蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素18およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の2つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
本発明の別の態様は、活性化T細胞を製造するインビトロ法を含み、方法は、生体外T細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトMHC分子に、T細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。
好ましくは、哺乳類細胞は、TAPペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。TAPペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、T2、RMA-S、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。TAPは、抗原プロセシングに関連する輸送体である。
ヒトペプチド負荷欠乏細胞系T2は、カタログ番号CRL1992の下に、米国微生物系統保存機関、12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USAから入手でき;ショウジョウバエ細胞株Schneider株2は、カタログ番号CRL19863の下にATCCから入手でき;マウスRMA-S細胞株はLjunggren et al.(Ljunggren and Karre,1985)に記載される。
好ましくは、移入前に、宿主細胞は、MHCクラスI分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、B7.1、B7.2、ICAM-1、およびLFA3のいずれかなどのT細胞のための共刺激シグナルを提供するのに重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のMHCクラスI分子および共刺激因子分子の核酸配列は、GenBankおよびEMBLデータベースから公的に入手可能である。
MHCクラスIエピトープが抗原として使用される場合、T細胞はCD8陽性T細胞である。
抗原提示細胞が、このようなエピトープを発現するために形質移入される場合、好ましくは、細胞は、配列番号1~配列番号289、305、および306またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる。
生体外でT細胞を製造するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、CTLを生成するために使用され得る。Plebanski et al.(Plebanski et al.,1995)は、T細胞の調製において、自己由来末梢血リンパ球(PLB)を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来T細胞の製造も可能である。B細胞もまた、自己由来T細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己CTLの調製において使用されてもよい。S.Walter et al.(Walter et al.,2003)は、人工抗原提示細胞(aAPC)を使用したT細胞の生体外プライミングを記載し、それはまた、選択されたペプチドに対するT細胞を製造するための適切な方法でもある。本発明では、ビオチン:ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたMHC:ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子(ミクロビーズ)に共役することで、aAPCが生成された。このシステムは、aAPC上のMHC密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的T細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。MHC:ペプチド複合体の他に、aAPCは、それらの表面に共役する、抗CD28抗体のような共刺激活性を有するその他のタンパク質を保有すべきである。さらに、このようなaAPCベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン12などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。
同種異系細胞はまた、T細胞の調製において使用されてもよく、方法は、参照により本明細書に援用される、国際公開第97/26328号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびT2細胞に加えて、その他の細胞を使用して、CHO細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、およびワクシニア感染標的細胞などの抗原が提示されてもよい。さらに植物ウイルスが使用されてもよい(例えば、外来性ペプチド提示のための高収率システムとしてのササゲモザイクウイルス開発を記載するPorta et al.(Porta et al.,1994)を参照されたい)。
本発明のペプチドに向けられた活性化T細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化T細胞を提供する。
上記方法によって製造される活性化T細胞は、配列番号1~配列番号289、305、および306のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
好ましくは、T細胞は、そのTCRを通じた、HLA/ペプチド複合体(例えば結合)との相互作用によって、細胞を認識する。T細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には有効数の活性化T細胞が投与される。患者に投与されるT細胞は、患者に由来して、上述のように活性化されてもよい(すなわち、それらは自己T細胞である)。代案としては、T細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得るいかなる疾患にも罹患していないことを意味する。
生体内で、本発明によるCD8陽性T細胞の標的細胞は、(時にMHCクラスIIを発現する)腫瘍細胞であり得て、および/または(時にMHCクラスIIもまた発現する;(Dengjel et al.,2006))腫瘍(腫瘍細胞)周囲の間質細胞であり得る。
本発明のT細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなT細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。
「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常組織における発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織においては遺伝子がサイレントであるが、腫瘍においてはそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも1.2倍のレベルで;好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも5倍または10倍のレベルで存在することを意味する。
T細胞は、例えば上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。
T細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。レビューは、Gattioni et al.およびMorgan et al.(Gattinoni et al.,2006;Morgan et al.,2006)にある。
本発明の別の態様は、その核酸がクローン化されて、好ましくはT細胞である宿主細胞に導入されるT細胞受容体を生成するための、MHCと複合体形成するペプチドの使用を含む。次に、この遺伝子操作T細胞は、がん治療のために患者に移入され得る。
本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化T細胞、T細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わせで、使用されてもよい。
本発明は、
(a)溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器;
(b)任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第2の容
器;
(c)任意選択的に、(i)溶液の使用、または(ii)凍結乾燥製剤の再構成および/
または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
(a)溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器;
(b)任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第2の容
器;
(c)任意選択的に、(i)溶液の使用、または(ii)凍結乾燥製剤の再構成および/
または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
キットは、(iii)緩衝液、(iv)希釈剤、(v)濾過、(vi)針、または(v)シリンジの1つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり;それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および/または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル(例えば二重チャンバーバイアル)、シリンジ(二重チャンバーシリンジなど)、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび/または容器は、容器上の、または容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および/または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。
製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与(例えば2~6回の投与)を可能にする。キットは、適切な希釈剤(例えば、炭酸水素ナトリウム溶液)を含んでなる、第2の容器をさらに含んでなってもよい。
希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも0.15mg/mL/ペプチド(=75μg)であり、好ましくは3mg/mL/ペプチド(=1500μg)以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする商業的および使用者観点から望ましい、その他の物品をさらに含んでもよい。
本発明のキットは、その他の構成要素(例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物)が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。
好ましくは、本発明のキットは、第2の化合物(アジュバント(例えばGM-CSF)、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘導剤またはキレート剤など)またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、1つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常、2つ以上の構成要素がある場合、キットは、第2のバイアルまたはその他の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置(例えば、1本または複数本の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど)を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。
本製剤は、経口(腸内)、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はs.c.であり、最も好ましくはi.d.投与であり、輸液ポンプによってもよい。
本発明のペプチドは、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、または子宮がんから単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくは、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がんを治療するために用いられる
本発明は、プレスクリーニングTUMAPの貯蔵庫から選択される少なくとも1つのペプチドを含んでなる医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化薬剤を製造する方法にさらに関し、医薬組成物中で使用される少なくとも1つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。一実施形態では、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、TCR単離などの下流用途、または可溶性抗体、およびその他の治療選択肢のためのT細胞クローンを製造するためにも適応され得る。
「個別化医薬品」は、積極的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用した養子細胞療法をはじめとするこのような個々の患者の治療のためにのみ使用される、一個人の患者のために特に調整された治療法を意味するものとする。
本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、特定の腫瘍型における免疫原性および/または過剰提示について予備スクリーニングされている、一群のまたは一組のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが、明示的に検討される。貯蔵庫(例えば、データベースの形態)は、様々なHLA-AHLA-BおよびHLA-C対立遺伝子を有する、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がん患者の腫瘍組織において高度に過剰発現された腫瘍関連ペプチドから構成される。それは、MHCクラスIおよびMHCクラスIIペプチドまたは伸長MHCクラスIペプチドを含有してもよい。いくつかのがん組織から採取された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、HLA-A*02およびHLA-A*24標識ペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、TUMAPによって誘導されるT細胞免疫の規模を定量的に比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第2に、それらは、患者において、「自己」抗原に由来するTUMAPに対するいかなるワクチン誘導T細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第3に、それは、患者の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。
貯蔵庫のためのTUMAPは、遺伝子発現解析、質量分析、およびT細胞免疫学(XPresident(登録商標))を組み合わせた、統合ゲノム機能解析アプローチを使用して同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織上では発現されず、または最小限にのみ発現されるTUMAPだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。最初のペプチド選択のために、患者からの神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部がんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭部および頸部扁平上皮がん、または子宮がんサンプル、および健常ドナーからの血液が、段階的なアプローチで分析された。
1.悪性物質からのHLAリガンドを質量分析法によって同定した
2.ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸(mRNA)発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織中の遺伝子過剰発現を同定した
3.同定されたHLAリガンドを遺伝子発現データと比較した。好ましくは、ステップ2で検出されたような選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、腫瘍組織上で過剰提示されまたは選択的に提示されるペプチドが、多重ペプチドワクチンのための適切なTUMAP候補と見なされた。
4.同定されたペプチドのTUMAPとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査を実施した
5.mRNAレベルでの過剰発現の関連性をステップ3からの選択されたTUMAPの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如(またはまれな)検出によって確認した。
6.選択されたペプチドによる生体内T細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびにがん患者からのヒトT細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイを実施した。
1.悪性物質からのHLAリガンドを質量分析法によって同定した
2.ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸(mRNA)発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織中の遺伝子過剰発現を同定した
3.同定されたHLAリガンドを遺伝子発現データと比較した。好ましくは、ステップ2で検出されたような選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、腫瘍組織上で過剰提示されまたは選択的に提示されるペプチドが、多重ペプチドワクチンのための適切なTUMAP候補と見なされた。
4.同定されたペプチドのTUMAPとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査を実施した
5.mRNAレベルでの過剰発現の関連性をステップ3からの選択されたTUMAPの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如(またはまれな)検出によって確認した。
6.選択されたペプチドによる生体内T細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびにがん患者からのヒトT細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイを実施した。
一態様では、貯蔵庫に含める前に、ペプチドが免疫原性について予備スクリーニングされる。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド/MHC複合体および抗CD28抗体が負荷された人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのCD8+T細胞の反復刺激を通じた、生体外T細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。
この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルを有する患者にとって、好ましい。一定組成を有する多重ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍における抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば50個の抗原性ペプチドのライブラリーからの5個の異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチは、それだけでおよそ1700万個の可能な医薬品(DP)組成物をもたらす。
一態様では、ペプチドは、本明細書に記載される、または以下のような本発明による方法に基づく、個々の患者に対するそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。
HLA表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータが、患者の腫瘍材料および血液サンプルから収集されて、「貯蔵庫」および患者に特有の(すなわち変異)TUMAPを含有する、各患者に対して最も適切なペプチドが同定される。患者の腫瘍において選択的にまたは過剰発現されて、可能であれば、患者の個々のPBMCと共に試験すると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが選択される。
好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、(a)個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド(TUMAP)を同定するステップと;(b)(a)で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫(データベース)と比較するステップと;(c)少なくとも1つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫(データベース)から選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるTUMAPは、(a1)前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと;(a2)発現データを腫瘍サンプル中のMHCクラスIおよび/またはクラスII分子と結合しているMHCリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するMHCリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、MHCリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたMHC分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から入手される。
貯蔵庫(データベース)モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、TUMAPを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一例として、(a1)前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと;(a2)発現データを腫瘍サンプル中のMHCクラスIおよび/またはクラスII分子と結合しているMHCリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するMHCリガンドを同定するステップとによって、候補TUMAPが患者において同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに特有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするTUMAPが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域における非同義の変異を発見するために、ゲノムDNAおよびRNAが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系DNAが末梢血単核細胞(PBMC)から抽出される。適用されたNGSアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定(エクソーム再配列決定)に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンDNAが捕捉され、例えばHiSeq2000(Illumina)による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化と、変異遺伝子が患者の腫瘍において発現されることの妥当性評価とのために、腫瘍mRNAが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。PBMC由来生殖細胞系の多様性と比較することで腫瘍特異的体細胞変異が判定され、優先順位がつけられる。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫について上述した免疫原性について試験され得て、適切な免疫原性を保持する候補TUMAPが、ワクチンへの包含のために選択される。
例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、(a)個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド(TUMAP)を上述の方法によって同定するステップと;(b)a)で同定されたペプチドを対応する正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫と比較するステップと;(c)少なくとも1つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫から選択するステップと;(d)任意選択的に、(a)で新規に同定された少なくとも1つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、(a)個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド(TUMAP)を同定するステップと;(b)(a)で新規に同定された少なくとも1つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
ひとたび個別化ペプチドベースのワクチンのためのペプチドを選択したら、ワクチンを製造する。ワクチンは、好ましくは、約33%DMSOなどの20~40%DMSO、好ましくは約30~35%DMSOに溶解された、個々のペプチドからなる液体製剤である。
製品に包含される各ペプチドをDMSOに溶解する。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチド数に応じて選択しなくてはならない。単一ペプチドDMSO溶液を等量で混合し、ペプチド当たり約2.5mg/mlの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液を得る。次に、混合溶液を注射用水で1:3に希釈して、33%DMSO中でペプチド当たり0.826mg/mlの濃度を得る。希釈溶液を0.22μmの無菌フィルターを通して濾過する。最終バルク溶液を得る。
最終バルク溶液をバイアルに充填して、使用時まで-20℃で保存する。1本のバイアルは、0.578mgの各ペプチドを含有する700μLの溶液を含有する。このうち、500μL(ペプチド当たりおよそ400μg)を皮内注射のために適用する。
がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドは神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がん細胞から生成されたので、またこれらのペプチドは正常組織中に皆無でありまたはより低いレベルで存在することが判定されたので、これらのペプチドを使用して、がんの存在を診断し得る。
特許請求されるペプチドの血液サンプル中の組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法または当該技術分野で既知のその他の方法による特定のペプチドの検出は、組織サンプルが悪性であるまたは炎症を起こしているまたは一般的に病的であることを病理学者に伝え得て、または、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁上皮がん、または子宮がんのバイオマーカーとして使用され得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。
患部組織検体上のペプチドの検出は、特にTリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。MHC発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。
本発明のペプチドは、ペプチドまたはMHC分子と複合体化したペプチドに対するT細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療段階を決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理応答マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。
本発明をここで、その好ましい実施形態を描写する以下の実施例において、添付図面を参照して説明するが、それでもなお、それらには限定されないものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。
図1A~Tは正常組織(白色バー)および様々ながん(黒色バー)における様々なペプチドの過剰提示を示す。
図1E-Rは正常組織と比較した、種々のがん組織中の様々なペプチドの過剰提示である。分析は、490個を超えるA*02陽性正常組織サンプルおよび70個のA*24陽性正常組織サンプル、543個のA*02陽性がんサンプルおよび200個のA*24陽性がんサンプルからのデータを含んだ。示されているのは、ペプチドが提示されたと認められたサンプルのみである。
図2A-Iは、正常組織(白色バー)および種々のがんサンプル(黒色バー)のパネルにおいて、がんで高度に過剰発現されまたは排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルを示す。
MET、ペプチド:GLIAGVVSI(配列番号2)-組織左から右へ:4細胞株(1腎臓、2膵臓、1黒色腫)、24がん組織(1脳がん、1胆嚢がん、7腎臓がん、1直腸がん、1肝臓がん、7肺がん、2胃がん、4膀胱がん);
TMEM223、ペプチド:GLLFSLRSV(配列番号92)-組織左から右へ:2細胞株(2膵臓)、1正常組織(1リンパ節)、14がん組織(4白血病、2骨髄性細胞がん、1骨髄がん、1乳がん、1リンパ節がん、1卵巣がん、2前立腺がん、1皮膚がん、1膀胱がん);
PRKDC、ペプチド:HYSQELSLLYL(配列番号158)-組織左から右へ:19がん組織(1脳がん、1腎臓がん、2肝臓がん、9肺がん、2前立腺がん、4胃がん);
GPX6、GPX7、ペプチド:TYSVSFPMF(配列番号195)-組織左から右へ:3細胞株(3良性前立腺肥大)、1正常組織(1胃)、58がん組織(1脳がん、2肝臓がん、47肺がん、7前立腺がん、1胃がん)。
遺伝子記号:FEN1、ペプチド:SIYQFLIAV(配列番号8)-組織左から右へ:2細胞株(1血液細胞、1膵臓)、14がん組織(3白血病、1骨髄性細胞がん、1乳がん、1胆嚢がん、1頭頸部がん、1結腸がん、2肺がん、3リンパ節がん、1子宮がん);
遺伝子記号:DERL3、ペプチド:ALMAMLVYV(配列番号13)-組織左から右へ:17がん組織(1胆管がん、2乳がん、1胆嚢がん、3頭頸部がん、7肺がん、1リンパ節がん、1卵巣がん、1胃がん);
遺伝子記号:HEATR2、ペプチド:ALAPHLDDA(配列番号237)-組織左から右へ:1細胞株(血液細胞)、10がん組織(1骨髄性細胞がん、2脳がん、1乳がん、1肺がん、1卵巣がん、1皮膚がん、1膀胱がん、2子宮がん);
遺伝子記号:SLC4A11、ペプチド:ILLPRIIEA(配列番号259)-組織左から右へ:1細胞株(1膵臓)、27がん組織(3白血病、1脳がん、2乳がん、3頭頸部がん、1結腸がん、1直腸がん、6肺がん、5卵巣がん、1膵臓がん、2皮膚がん、1胃がん、1子宮がん);
遺伝子記号:ABCC11、ペプチド:HLLEGSVGV(配列番号39)-組織左から右へ:7がん組織(5乳がん、1肝臓がん、1皮膚がん);
遺伝子記号:PRAME、ペプチド:VQLDSIEDLEV(配列番号32)-組織左から右へ:10がん組織(1白血病、1肺がん、4卵巣がん、3皮膚がん、1子宮がん);
遺伝子記号:ZWILCH、ペプチド:FYSRLLQKF(配列番号203)-組織左から右へ:1細胞株(1良性前立腺肥大)、15がん組織(13肺がん、2胃がん);
遺伝子記号:PRC1、ペプチド:NYYEVHKELF(配列番号270)-組織左から右へ:14がん組織(1脳がん、11肺がん、2胃がん);
遺伝子記号:GZMK、ペプチド:KFSSFSLFF(配列番号164)-組織左から右へ:2細胞株(2良性前立腺肥大)、14がん組織(11肺がん、1前立腺がん、2胃がん);
遺伝子記号:TREX2、HAUS7、ペプチド:LYITEPKTI(配列番号:287)-組織左から右へ:12がん組織(3脳がん、1肝臓がん、7肺がん、1胃がん);
遺伝子記号:DNMBP、ペプチド:RYISDQLFTNF(配列番号278)-組織左から右へ:1正常組織(1肺)、31がん組織(2脳がん、1腎臓がん、2肝臓がん、20肺がん、2前立腺がん、4胃がん);
遺伝子記号:PTK7、ペプチド:VYQGHTALL(配列番号277)-組織左から右へ:2細胞株(2良性前立腺肥大)、4正常組織(1直腸、2肺、1膵臓)、64がん組織(5脳がん、48肺がん、6前立腺がん、5胃がん);
遺伝子記号:NUP210P1、NUP210、ペプチド:VYVSDIQEL(配列番号288)-組織左から右へ:2正常組織(1結腸、1脳下垂体)、21がん組織(1肝臓がん、14肺がん、1前立腺がん、5胃がん);
遺伝子記号:ATAD2、ペプチド:VYTLDIPVL(配列番号160)-組織左から右へ:17がん組織(1肝臓がん、9肺がん、1前立腺がん、6胃がん);
遺伝子記号:DNTT、ペプチド:KLFTSVFGV(配列番号305)-組織左から右へ:5がん組織(5血液細胞がん);
遺伝子記号:AR、ペプチド:ALLSSLNEL(配列番号306)-組織左から右へ:3細胞株(1腎臓、2前立腺)、4正常組織(1肝臓、1肺、1卵巣、1子宮)、29がん組織(1胆管がん、2血液細胞がん、1脳がん、3乳がん、1腎臓がん、5肝臓がん、1肺がん、1リンパ節がん、4卵巣がん、6前立腺がん、1膀胱がん、3子宮がん)。
TNC、ペプチド:KLLDPQEFTL、(配列番号59)-組織左から右へ:73正常組織サンプル(6動脈、1血液細胞、1脳、1心臓、2肝臓、2肺、2静脈、1脂肪組織、1副腎、6骨髄、1軟骨、1結腸、1食道、2眼、2胆嚢、1腎臓、6リンパ節、5膵臓、2脳下垂体、1直腸、1唾液腺、1骨格筋、1皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、1膀胱、1乳房、5卵巣、3胎盤、1前立腺、1精巣、1胸腺、1子宮)および46がんサンプル(24脳がん、11肺がん、11食道がん);
LRRC15、ペプチド:ILNTHITEL、(配列番号149)-組織左から右へ:73正常組織サンプル(6動脈、1血液細胞、1脳、1心臓、2肝臓、2肺、2静脈、1脂肪組織、1副腎、6骨髄、1軟骨、1結腸、1食道、2眼、2胆嚢、1腎臓、6リンパ節、5膵臓、2脳下垂体、1直腸、1唾液腺、1骨格筋、1皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、1膀胱、1乳房、5卵巣、3胎盤、1前立腺、1精巣、1胸腺、1子宮)および56がんサンプル(10乳がん、3胆嚢がん、11胃がん、10リンパ節がん、11肺がん、11食道がん);
C1QL1、ペプチド:TYTTVPRVAF、(配列番号172)-組織左から右へ:73正常組織サンプル(6動脈、1血液細胞、1脳、1心臓、2肝臓、2肺、2静脈、1脂肪組織、1副腎、6骨髄、1軟骨、1結腸、1食道、2眼、2胆嚢、1腎臓、6リンパ節、5膵臓、2脳下垂体、1直腸、1唾液腺、1骨格筋、1皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、1膀胱、1乳房、5卵巣、3胎盤、1前立腺、1精巣、1胸腺、1子宮)および34がんサンプル(24脳がん、10腎臓がん);
AMC2、ペプチド:GYIDNVTLI、(配列番号220)-組織左から右へ:73正常組織サンプル(6動脈、1血液細胞、1脳、1心臓、2肝臓、2肺、2静脈、1脂肪組織、1副腎、6骨髄、1軟骨、1結腸、1食道、2眼、2胆嚢、1腎臓、6リンパ節、5膵臓、2脳下垂体、1直腸、1唾液腺、1骨格筋、1皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、1膀胱、1乳房、5卵巣、3胎盤、1前立腺、1精巣、1胸腺、1子宮)および48がんサンプル(11肺がん、11食道がん、26膵臓がん)。
ABCC11、ペプチド:HLLEGSVGV、(配列番号39)-組織左から右へ:6動脈、2血液細胞(cellss)、6脳、4心臓、8肝臓、6肺、2静脈、1脂肪組織、5副腎、1胆管、5骨髄、1軟骨、1胸部壁および骨格筋、1結腸、5食道、2眼、2胆嚢、8頭頸部、5頭頸部および唾液腺、1腎臓、6リンパ節、4膵臓、3副甲状腺腺、2末梢神経、3腹膜、2脳下垂体、3胸膜、1直腸、1骨格筋、2皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、5尿管、1膀胱、1乳房、5卵巣、5胎盤、1前立腺、1精巣、2胸腺、1子宮、および10乳がんサンプル。
PRAME、ペプチド:VQLDSIEDLEV、(配列番号32)-組織左から右へ:6動脈、2血液細胞(cellss)、6脳、4心臓、8肝臓、6肺、2静脈、1脂肪組織、5副腎、1胆管、5骨髄、1軟骨、1胸部壁および骨格筋、1結腸、5食道、2眼、2胆嚢、8頭頸部、5頭頸部および唾液腺、1腎臓、6リンパ節、4膵臓、3副甲状腺腺、2末梢神経、3腹膜、2脳下垂体、3胸膜、1直腸、1骨格筋、2皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、5尿管、1膀胱、1乳房、5卵巣、5胎盤、1前立腺、1精巣、2胸腺、1子宮、および37がんサンプル(10黒色腫がん、17卵巣がん、10子宮がん)。
SPINK2、ペプチド:ALSVLRLAL、(配列番号251)-組織左から右へ:6動脈、2血液細胞(cellss)、6脳、4心臓、8肝臓、6肺、2静脈、1脂肪組織、5副腎、1胆管、5骨髄、1軟骨、1胸部壁および骨格筋、1結腸、5食道、2眼、2胆嚢、8頭頸部、5頭頸部および唾液腺、1腎臓、6リンパ節、4膵臓、3副甲状腺腺、2末梢神経、3腹膜、2脳下垂体、3胸膜、1直腸、1骨格筋、2皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、5尿管、1膀胱、1乳房、5卵巣、5胎盤、1前立腺、1精巣、2胸腺、1子宮、および11急性骨髄性白血病サンプル。
MAGEC2、ペプチド:TLDEKVAEL、(配列番号24)-組織左から右へ:6動脈、2血液細胞(cellss)、6脳、4心臓、8肝臓、6肺、2静脈、1脂肪組織、5副腎、1胆管、5骨髄、1軟骨、1胸部壁および骨格筋、1結腸、5食道、2眼、2胆嚢、8頭頸部、5頭頸部および唾液腺、1腎臓、6リンパ節、4膵臓、3副甲状腺腺、2末梢神経、3腹膜、2脳下垂体、3胸膜、1直腸、1骨格筋、2皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、5尿管、1膀胱、1乳房、5卵巣、5胎盤、1前立腺、1精巣、2胸腺、1子宮、および29がんサンプル(19肝臓がん、10黒色腫がん)。
C1orf186、ペプチド:FLTAINYLL、(配列番号72)-組織左から右へ:6動脈、2血液細胞(cellss)、6脳、4心臓、8肝臓、6肺、2静脈、1脂肪組織、5副腎、1胆管、5骨髄、1軟骨、1胸部壁および骨格筋、1結腸、5食道、2眼、2胆嚢、8頭頸部、5頭頸部および唾液腺、1腎臓、6リンパ節、4膵臓、3副甲状腺腺、2末梢神経、3腹膜、2脳下垂体、3胸膜、1直腸、1骨格筋、2皮膚、1小腸、1脾臓、1胃、1甲状腺、7気管、5尿管、1膀胱、1乳房、5卵巣、5胎盤、1前立腺、1精巣、2胸腺、1子宮、および49がんサンプル(11急性骨髄性白血病サンプル、17卵巣がんサンプル、11腎細胞がんサンプル、10子宮がんサンプル)。
例示的免疫原性データを示す:ペプチド特異的多量体染色後の:フローサイトメトリー結果。
図4A-Dは、健常HLA-A*02+ドナーのペプチド特異的生体外CD8+T細胞応答の例示的結果を示す。CD8+T細胞は、抗-CD28 mAbで被覆された人工的APCと、配列番号27ペプチド(A、左パネル)、配列番号229ペプチド(B、左パネル)、配列番号230ペプチド(C、左パネル)または配列番号235ペプチド(D、左パネル)とそれぞれ複合体形成するHLA-A*02とを使用して、初回刺激された。3サイクルの刺激後、A*02/配列番号27(A)、A*02/配列番号229(B)、A*02/配列番号230(C)またはA*02/配列番号235(D)を用いた2D多量体染色によって、ペプチド反応性細胞の検出を実施した。右パネル(A、B、およびC)は、無関係のA*02/ペプチド複合体で刺激された細胞の対照染色を示す。生存一重細胞は、CD8+リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の排除を助けた。CD8+リンパ球の中の特異的多量体+細胞の頻度が示される。
同上
図5A-Cは、健常HLA-A*24+ドナーのペプチド特異的生体外CD8+T細胞応答の例示的結果を示す。CD8+T細胞は、それぞれ、配列番号159ペプチド(A、左側パネル)、配列番号161ペプチド(B、左側パネル)、および配列番号281ペプチド(C、左側パネル)と複合体形成する、抗CD28mAbおよびHLA-A*24で被覆された、人工APCを用いてプライミングされた。3サイクルの刺激後、A*24/配列番号159(A)、A*24/配列番号161(B)またはA*24/配列番号281(C)を用いた2D多量体染色によって、ペプチド反応性細胞の検出を実施した。右パネル(A、B、およびC)は、無関係のA*24/ペプチド複合体で刺激された細胞の対照染色を示す。生存一重細胞は、CD8+リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の排除を助けた。CD8+リンパ球の中の特異的多量体+細胞の頻度が示される。
同上
図1E-Rは正常組織と比較した、種々のがん組織中の様々なペプチドの過剰提示である。分析は、490個を超えるA*02陽性正常組織サンプルおよび70個のA*24陽性正常組織サンプル、543個のA*02陽性がんサンプルおよび200個のA*24陽性がんサンプルからのデータを含んだ。示されているのは、ペプチドが提示されたと認められたサンプルのみである。
図2A-Iは、正常組織(白色バー)および種々のがんサンプル(黒色バー)のパネルにおいて、がんで高度に過剰発現されまたは排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルを示す。
実施例1
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、Asterand(米国ミシガン州デトロイト;英国ハートフォードシャー州ロイストン)Bio-Options Inc.(米国カリフォルニア州ブレア);BioServe(米国メリーランド州ベルツビル);Center for cancer immune therapy(CCIT),Herlev Hospital(デンマーク国ヘアレウ);Geneticist Inc.(米国カリフォルニア州グレンデール);Indivumed GmbH(独国ハンブルク);Istituto Nazionale Tumori"Pascale"(イタリア国ナポリ);京都府立医科大学(KPUM)(日本国京都);Leiden University Medical Center(LUMC)(オランダ国ライデン);ProteoGenex Inc.(米国カリフォルニア州カルバーシティ);Saint Savas Hospital(ギリシャ国アテネ);Stanford Cancer Center(米国カリフォルニア州スタンフォード);Tissue Solutions Ltd(英国グラスゴー);University Hospital Bonn(独国ボン);University Hospital Geneva(スイス国ジュネーブ);University Hospital Heidelberg(独国ハイデルベルク);University Hospital Munich(独国ミュンヘン);大阪市立大学(OCU)(日本国大阪);University Hospital Tubingen(独国チュービンゲン);Val d’Hebron University Hospital(スペイン国バルセロナ)から入手された。
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、Asterand(米国ミシガン州デトロイト;英国ハートフォードシャー州ロイストン)Bio-Options Inc.(米国カリフォルニア州ブレア);BioServe(米国メリーランド州ベルツビル);Center for cancer immune therapy(CCIT),Herlev Hospital(デンマーク国ヘアレウ);Geneticist Inc.(米国カリフォルニア州グレンデール);Indivumed GmbH(独国ハンブルク);Istituto Nazionale Tumori"Pascale"(イタリア国ナポリ);京都府立医科大学(KPUM)(日本国京都);Leiden University Medical Center(LUMC)(オランダ国ライデン);ProteoGenex Inc.(米国カリフォルニア州カルバーシティ);Saint Savas Hospital(ギリシャ国アテネ);Stanford Cancer Center(米国カリフォルニア州スタンフォード);Tissue Solutions Ltd(英国グラスゴー);University Hospital Bonn(独国ボン);University Hospital Geneva(スイス国ジュネーブ);University Hospital Heidelberg(独国ハイデルベルク);University Hospital Munich(独国ミュンヘン);大阪市立大学(OCU)(日本国大阪);University Hospital Tubingen(独国チュービンゲン);Val d’Hebron University Hospital(スペイン国バルセロナ)から入手された。
正常組織は、Asterand(米国ミシガン州デトロイト;英国ハートフォードシャー州ロイストン);BioCat GmbH(独国ハイデルベルク);Bio-Options Inc.(米国カリフォルニア州ブレア);BioServe(米国メリーランド州ベルツビル);Capital BioScience Inc.(米国メリーランド州ロックビル);Geneticist Inc.(米国カリフォルニア州グレンデール);京都府立医科大学(KPUM)(日本国京都);ProteoGenex Inc.(米国カリフォルニア州カルバーシティ);Tissue Solutions Ltd(英国グラスゴー);University Hospital Geneva(スイス国ジュネーブ);University Hospital Heidelberg(独国ハイデルベルク);University Hospital Munich(独国ミュンヘン);大阪市立大学(OCU)(日本国大阪);University Hospital Tubingen(独国チュービンゲン)から入手された。
全ての患者の告知に基づく同意書は、外科手術または検死解剖前に得られた。組織は切除の直後に衝撃凍結されて、TUMAPの単離まで-70℃未満で保存された。
ペプチドは、次の3つの条件に当てはまれば選択された:(1)その基礎となる転写物および/またはエクソンが低レベルで発現され、すなわち、脳、血管、心臓、肝臓、肺、血液では、百万回読み取りあたりキロベースあたり中央値読み取り(RPKM)が、10未満であることが要求された。また、RPKMの中央値は、膀胱、唾液腺、胃、副腎、結腸、小腸、脾臓、骨髄、膵臓、筋肉、脂肪組織、皮膚、食道、腎臓、甲状腺、下垂体、神経で50未満であることが要求された。(2)その基礎となる転写物および/またはエクソンは、腫瘍サンプルにおける発現レベルの最高90%パーセンタイル値(TCGA Research Network:http://cancergenome.nih.gov/によって作製されたデータを基準にして)が、3000前後の正常組織サンプルをカバーするRNASeqデータのデータベース(Lonsdale,2013)を基準にして正常サンプルから判定された発現レベルの最高75%パーセンタイル値の6倍を上回る場合に、過剰発現されたと見なされる。(3)ペプチドは、腫瘍関連であり、すなわち、正常組織のベースラインと比較して、腫瘍上で特異的に、または過剰発現された(実施例1参照)。
HLA-A*02 TUMAP選択のためのサンプル数は次のとおりであった:膵臓がんではN=16、腎臓がんではN=20、結腸直腸がんではN=28、胃食道接合部がんを含む食道がんではN=17、前立腺腫瘍ではN=39、肝細胞がんではN=16、非小細胞肺がんではN=90、胃がんではN=29、乳がんではN=17、黒色腫ではN=7、卵巣がんではN=20、慢性リンパ球性白血病ではN=17、膀胱がんではN=16、小細胞肺がんではN=19、胆嚢がんおよび胆管がんではN=6、急性骨髄性白血病ではN=18、神経膠芽腫ではN=41、精巣がんではN=1、非ホジキンリンパ腫ではN=18、子宮がんではN=15、および正常組織ではN=262。
HLA-A*24 TUMAP選択のためのサンプル数は次のとおりであった:胃がんではN=44、前立腺腫瘍ではN=40、非小細胞肺がんではN=91、肝細胞がんではN=15、腎臓がんではN=2、結腸直腸がんではN=1、神経膠芽腫ではN=18、および正常組織ではN=70。
図1はまた、腎臓がん細胞株、メラノーマ細胞株、膵臓がん細胞株、および良性前立腺肥大をはじめとする細胞株についての結果を示す。
組織サンプルからのHLAペプチドの単離
衝撃凍結組織サンプルからのHLAペプチド貯留は、わずかに修正されたプロトコル(Falk et al.,1991;Seeger et al.,1999)に従って、HLA-A*02-特異的抗体BB7.2、HLA-A、-B、-C特異的抗体W6/32、CNBr活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、免疫沈殿によって固形組織から得られた。
衝撃凍結組織サンプルからのHLAペプチド貯留は、わずかに修正されたプロトコル(Falk et al.,1991;Seeger et al.,1999)に従って、HLA-A*02-特異的抗体BB7.2、HLA-A、-B、-C特異的抗体W6/32、CNBr活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、免疫沈殿によって固形組織から得られた。
質量分析
得られたHLAペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー(nanoAcquity UPL C system,Waters)によってそれらの疎水性に従って分離し、ESI源を装着したLTQ-velosおよびfusion hybrid質量分光計(ThermoElectron)内で溶出ペプチドを分析した。ペプチド貯留は、毎分400nLの流速を適用して、1.7μm C18逆相材料(Waters)で充填された分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム(75μm内径×250mm)上に直接挿入した。引き続いて、毎分300nLの流速で10%から33%へのBの二段階180分間二成分勾配を用いて、ペプチドを分離した。勾配は、溶媒A(水中の0.1%ギ酸)および溶媒B(アセトニトリル中の0.1%ギ酸)から構成された。nanoESI源への導入には、金被覆ガラス毛管(PicoTip,New Objective)を使用した。LTQ-Orbitrap質量分光計は、TOP5ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作した。手短に述べると、Orbitrap(R=30000)内の高質量精度の完全スキャンでスキャンサイクルを開始し、これもまたOrbitrap(R=7500)内の5種の最も豊富な前駆イオンのMS/MSスキャンがそれに続き、以前選択されたイオンは動的に排除された。タンデム質量スペクトルは、SEQUESTおよび追加的な手動調節によって解釈した。同定されたペプチド配列は、生成された天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確認した。
得られたHLAペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー(nanoAcquity UPL C system,Waters)によってそれらの疎水性に従って分離し、ESI源を装着したLTQ-velosおよびfusion hybrid質量分光計(ThermoElectron)内で溶出ペプチドを分析した。ペプチド貯留は、毎分400nLの流速を適用して、1.7μm C18逆相材料(Waters)で充填された分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム(75μm内径×250mm)上に直接挿入した。引き続いて、毎分300nLの流速で10%から33%へのBの二段階180分間二成分勾配を用いて、ペプチドを分離した。勾配は、溶媒A(水中の0.1%ギ酸)および溶媒B(アセトニトリル中の0.1%ギ酸)から構成された。nanoESI源への導入には、金被覆ガラス毛管(PicoTip,New Objective)を使用した。LTQ-Orbitrap質量分光計は、TOP5ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作した。手短に述べると、Orbitrap(R=30000)内の高質量精度の完全スキャンでスキャンサイクルを開始し、これもまたOrbitrap(R=7500)内の5種の最も豊富な前駆イオンのMS/MSスキャンがそれに続き、以前選択されたイオンは動的に排除された。タンデム質量スペクトルは、SEQUESTおよび追加的な手動調節によって解釈した。同定されたペプチド配列は、生成された天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確認した。
イオン計数によって、すなわちLC-MS特性の抽出と解析(Mueller et al.,2007)によって、無標識相対LC-MS定量化を実施した。この方法は、ペプチドのLC-MSシグナル面積がサンプル中のその存在量と相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメント(Mueller et al.,2008;Sturm et al.,2008)によってさらに処理した。最終的に、全てのLC-MS特性を配列同定結果と相互参照して、異なるサンプルの定量的データと、組織からペプチドへの提示プロファイルとを組み合わせた。定量的データは、技術的および生物学的反復試験内の変動を考慮した中心傾向に従って、二段法で正規化された。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データに関連付けられ得て、サンプルと組織との間の相対定量化ができるようになる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データを手動で検査し、データ整合性を保証して自動解析の確度を確認した。各ペプチドについて提示プロファイルを計算し、平均サンプル提示ならびに反復試験変動を示した。プロファイルは、異なるがんサンプルを正常組織サンプルのベースラインに並置する。
例示的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図1に示される。例示的ペプチドの提示スコアは、表15および表16に示される。
表13(AおよびB)および14(AおよびB)は、選択されたペプチドについての多様ながん実体の提示を示し、したがって示されたがんの診断および/または治療に関して言及されたペプチドの特定の関連性を示す(例えば、神経膠芽腫、非小細胞肺がん、および卵巣がんのためのペプチド配列番号1、神経膠芽腫、胃がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、胆嚢腺がんおよび胆管細胞がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、および膵臓がんのためのペプチド配列番号2)。
びその他の結合分子の標的になり得る。
びその他の結合分子の標的になり得る。
表13Bは、選択されたペプチドについての追加的ながん実体の提示を示し、したがって示されたがんの診断および/または治療に関して言及されたペプチドの特定の関連性を示す。
表14Bは、選択されたペプチドについての追加的ながん実体の提示を示し、したがって示されたがんの診断および/または治療に関して言及されたペプチドの特定の関連性を示す。
実施例2
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のペプチドの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、mRNA発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟TCRなどの安全性リスクが高い治療選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のペプチドの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、mRNA発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟TCRなどの安全性リスクが高い治療選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。
本発明のHLAクラスI結合ペプチドでは、3000前後の正常組織サンプルをカバーするRNASeqデータのデータベース(Lonsdale,2013)に基づいて、全ての起源遺伝子の正常組織発現は、最小であることが示された。さらに、腫瘍対正常組織からの遺伝子およびエクソン発現データを分析して、様々な腫瘍実体の標的カバー度を評価した。
RNA起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された(実施例1を参照されたい)。腫瘍組織標本を手術直後にスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化した。TRI試薬(Ambion,Darmstadt,Germany)を使用して、これらのサンプルから全RNAを調製し、RNeasy(QIAGEN,Hilden,Germany)による精製がそれに続き;どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施した。
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された(実施例1を参照されたい)。腫瘍組織標本を手術直後にスナップ凍結し、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化した。TRI試薬(Ambion,Darmstadt,Germany)を使用して、これらのサンプルから全RNAを調製し、RNeasy(QIAGEN,Hilden,Germany)による精製がそれに続き;どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施した。
RNASeq実験のための健常ヒト組織からの全RNAは、Asterand(米国ミシガン州デトロイト;英国ハートフォードシャー州ロイストン);BioCat GmbH(独国ハイデルベルク);BioServe(米国メリーランド州ベルツビル);Geneticist Inc.(米国カリフォルニア州グレンデール);Istituto Nazionale Tumori"Pascale"(イタリア国ナポリ);ProteoGenex Inc.(米国カリフォルニア州カルバーシティ);University Hospital Heidelberg(独国ハイデルベルク)から入手された。
RNASeq実験のための腫瘍組織からの全RNAは、Asterand(米国ミシガン州デトロイト;英国ハートフォードシャー州ロイストン);Bio-Options Inc.(米国カリフォルニア州ブレア);BioServe(米国メリーランド州ベルツビル);Center for cancer immune therapy(CCIT),Herlev Hospital(デンマーク国ヘアレウ);Geneticist Inc.(米国カリフォルニア州グレンデール);Istituto Nazionale Tumori"Pascale"(イタリア国ナポリ);京都府立医科大学(KPUM)(日本国京都);Leiden University Medical Center(LUMC)(オランダ国ライデン);Tissue Solutions Ltd(英国グラスゴー);University Hospital Bonn(独国ボン);University Hospital Geneva(スイス国ジュネーブ);University Hospital Heidelberg(独国ハイデルベルク);大阪市立大学(OCU)(日本国大阪);University Hospital Tubingen(独国チュービンゲン);Val d'Hebron University Hospital(スペイン国バルセロナ)から入手された。
全てのRNAサンプルの品質および量は、RNA 6000 Pico LabChipキット(Agilent)を使用して、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent,独国バルトブロンの)上で評価した。
RNAseq実験
腫瘍および正常組織RNAサンプルの遺伝子発現解析は、CeGaT(Tubingen,Germany)によって、次世代配列決定(RNAseq)によって実施された。簡単に述べると、配列決定ライブラリーは、RNA断片化、cDNA転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Illumina HiSeq v4試薬キットを使用して、販売業者(Illumina Inc.,San Diego,CA,USA)のプロトコルに従って作製される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Illumina HiSeq 2500配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、50bpのシングルエンドリードが生成される。処理された読み取りは、STARソフトウェアを使用して、ヒトゲノム(GRCh38)にマッピングされる。発現データは、ensembl配列データベース(Ensembl77)の注釈に基づいて、RPKM(100万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たり読み取り、ソフトウェアCufflinksによって生成される)として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで(全読み取り、ソフトウェアBedtoolsによって生成される)提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、RPKM値が得られる。
腫瘍および正常組織RNAサンプルの遺伝子発現解析は、CeGaT(Tubingen,Germany)によって、次世代配列決定(RNAseq)によって実施された。簡単に述べると、配列決定ライブラリーは、RNA断片化、cDNA転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Illumina HiSeq v4試薬キットを使用して、販売業者(Illumina Inc.,San Diego,CA,USA)のプロトコルに従って作製される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Illumina HiSeq 2500配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、50bpのシングルエンドリードが生成される。処理された読み取りは、STARソフトウェアを使用して、ヒトゲノム(GRCh38)にマッピングされる。発現データは、ensembl配列データベース(Ensembl77)の注釈に基づいて、RPKM(100万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たり読み取り、ソフトウェアCufflinksによって生成される)として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで(全読み取り、ソフトウェアBedtoolsによって生成される)提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、RPKM値が得られる。
様々ながんにおいて高度に過剰発現されまたは排他的に発現される本発明の起源遺伝子の代表的発現プロファイルは、図2に示される。TCGA Research Network(http://cancergenome.nih.gov/)からの腫瘍サンプルを正常組織サンプル(Lonsdale,2013)と比較することによって作製されたデータに基づいて、異なる実体およびさらなる例示的ペプチドの発現データを表17に要約する。さらに例示的な遺伝子の発現スコアを、社内RNASeq分析に基づいて表18に示す。
実施例3
MHCクラスI提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のTUMAPの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド/MHC複合体および抗CD28抗体を負荷した人工抗原提示細胞(aAPC)によるCD8+T細胞の反復刺激に基づく、生体外T細胞プライミングアッセイを用いて研究を実施した。このようにして、本発明者らは、本発明のHLA-A*0201拘束性TUMAPの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するCD8+前駆T細胞がヒトに存在する、T細胞エピトープであることを実証した(表19)。
MHCクラスI提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のTUMAPの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド/MHC複合体および抗CD28抗体を負荷した人工抗原提示細胞(aAPC)によるCD8+T細胞の反復刺激に基づく、生体外T細胞プライミングアッセイを用いて研究を実施した。このようにして、本発明者らは、本発明のHLA-A*0201拘束性TUMAPの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するCD8+前駆T細胞がヒトに存在する、T細胞エピトープであることを実証した(表19)。
CD8+T細胞の生体外プライミング
ペプチドMHC複合体(pMHC)および抗CD28抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、独国のUniversity clinics Mannheimから得られた健常ドナーのCD8ミクロビーズ(独国ベルギッシュ・グラートバッハのMiltenyi Biotec)を使用した正の選択を通じて、新鮮HLA-A*02白血球除去生成物からCD8+T細胞を単離した。
ペプチドMHC複合体(pMHC)および抗CD28抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、独国のUniversity clinics Mannheimから得られた健常ドナーのCD8ミクロビーズ(独国ベルギッシュ・グラートバッハのMiltenyi Biotec)を使用した正の選択を通じて、新鮮HLA-A*02白血球除去生成物からCD8+T細胞を単離した。
PBMCおよび単離CD8+リンパ球またはPBMCは、10%熱不活性化ヒトAB血清(独国アイデンバッハのPAN-Biotech)、100U/mlペニシリン/100μg/mlストレプトマイシン(独国ケルンのCambrex)、1mMピルビン酸ナトリウム(独国オーバードルラのCC Pro)、20μg/mlゲンタマイシン(Cambrex)を添加した、RPMI-Glutamax(独国カールスルーエのInvitrogen)からなるT細胞培地(TCM)中で、使用時まで培養した。2.5ng/mlのIL-7(独国ハイデルベルクのPromoCell)および10U/mlのIL-2(独国ニュルンベルクのNovartis Pharma)もまた、この段階でTCMに添加した。
pMHC/抗CD28被覆ビーズの生成、T細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件当たり4種の異なるpMHC分子と、読み取り条件当たり8種の異なるpMHC分子を使用して実施した。
製造会社(独国ボンのPerbio)が推奨する通りにスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、精製共刺激マウスIgG2a抗ヒトCD28 Ab9.3(Jung et al.,1987)を化学的にビオチン化した。使用されたビーズは、直径5.6μmのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子(米国イリノイ州のBangs Laboratories)であった。
陽性および陰性対照刺激のために使用されたpMHCは、それぞれ、A*0201/MLA-001(修飾Melan-A/MART-1に由来するペプチドELAGIGILTV(配列番号303))およびA*0201/DDX5-001(DDX5に由来するYLLPAIVHI、配列番号304)であった。
4×12.5ngの異なるビオチンpMHCの存在下で、800,000個のビーズ/200μlを96ウェルプレート内で被覆し、洗浄して、引き続いて200μlの容量中で600ngのビオチン抗CD28を添加した。5ng/mlのIL-12(PromoCell)が添加された200μlのTCM中で、1×106個のCD8+T細胞を2×105個の洗浄被覆ビーズと共に、37°Cで3日間共培養することによって、96ウェルプレート内にで刺激を開始した次に80U/mlのIL-2を添加した新鮮TCMで培地の半分を交換し、37℃で4日間にわたり培養を継続した。この刺激サイクルを合計3回実施した。条件当たり8種の異なるpMHC分子を使用したpMHC多量体読み取りでは、5種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような(Andersen et al.,2012)二次元コンビナトリアルコーディングアプローチを使用した。最後に、Live/dead近赤外染料(独国カールスルーエのInvitrogen)、CD8-FITC抗体クローンSK1(独国ハイデルベルクのBD)、および蛍光性pMHC多量体による細胞の染色によって多量体解析を実施した。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したBD LSRII SORP血球計数器を使用した。ペプチド特異的細胞を全CD8+細胞の百分率として計算した。FlowJoソフトウェア(米国オレゴン州のTree Star)を使用して、多量体解析の評価を実施した。陰性対照刺激と比較することで、特異的多量体+CD8+リンパ球の生体外初回刺激を検出した。1人の健常ドナーの少なくとも1つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的CD8+T細胞株を含有することが判明したら、所与の抗原の免疫原性が検出された(すなわちこのウェルは、CD8+T細胞内に少なくとも1%の特異的多量体+を含有し、特異的多量体+細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも10倍であった)。
様々ながんペプチドの生体外免疫原性
HLAクラスIペプチドを試験するために、ペプチド特異的T細胞株の生成によって生体外免疫原性が実証され得た。本発明の2種のペプチドの、TUMAP特異的多量体染色後の例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図3に示される。本発明からの10種のペプチドの結果は、表19Aに要約される。本発明の7種のペプチドに関する、TUMAP特異的多量体染色後における例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図4および図5に示される。本発明からの60種のペプチドの結果は、表19Bに要約される。
HLAクラスIペプチドを試験するために、ペプチド特異的T細胞株の生成によって生体外免疫原性が実証され得た。本発明の2種のペプチドの、TUMAP特異的多量体染色後の例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図3に示される。本発明からの10種のペプチドの結果は、表19Aに要約される。本発明の7種のペプチドに関する、TUMAP特異的多量体染色後における例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図4および図5に示される。本発明からの60種のペプチドの結果は、表19Bに要約される。
実施例4
ペプチドの合成
Fmocストラテジーを使用した標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して、全てのペプチドを合成した。個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析および分析用RP-HPLCによって判定された。ペプチドは、純度>50%の白色から灰白色の凍結乾燥物(トリフルオロ酢酸塩)として得られた。全てのTUMAPは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。
ペプチドの合成
Fmocストラテジーを使用した標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して、全てのペプチドを合成した。個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析および分析用RP-HPLCによって判定された。ペプチドは、純度>50%の白色から灰白色の凍結乾燥物(トリフルオロ酢酸塩)として得られた。全てのTUMAPは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。
実施例5
MHC結合アッセイ
本発明によるT細胞ベースの治療法のための候補ペプチドを、それらのMHC結合能力(親和性)についてさらに試験した。個々のペプチド-MHC複合体は、UVリガンド交換によって生成され、UV感受性ペプチドはUV照射に際して切断されて、分析される目的ペプチドで交換された。ペプチド受容性MHC分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、MHC複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化MHC複合体の軽鎖(β2m)の検出に基づくELISAを実施した。アッセイは、Rodenko et al.(Rodenko et al.,2006)に一般的に記載されるようにして実施した。
MHC結合アッセイ
本発明によるT細胞ベースの治療法のための候補ペプチドを、それらのMHC結合能力(親和性)についてさらに試験した。個々のペプチド-MHC複合体は、UVリガンド交換によって生成され、UV感受性ペプチドはUV照射に際して切断されて、分析される目的ペプチドで交換された。ペプチド受容性MHC分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、MHC複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化MHC複合体の軽鎖(β2m)の検出に基づくELISAを実施した。アッセイは、Rodenko et al.(Rodenko et al.,2006)に一般的に記載されるようにして実施した。
96ウェルMAXISorpプレート(NUNC)をPBS中の2μg/mlストレプトアビジンにより室温で一晩被覆して4回洗浄し、ブロック緩衝液を含有する2%BSA中で37℃で1時間ブロックした。再折りたたみされたHLA-A*020102:01/MLA-001単量体が、15~500ng/mlの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。UV交換反応のペプチド-MHC単量体をブロック緩衝液で100倍に希釈した。サンプルを37℃で1時間インキュベートし、4回洗浄して,2μg/mlのHRP結合抗β2mと共に37℃で1時間インキュベートし、再度洗浄して、NH2SO4で停止させたTMB溶液で検出した。吸収は、450nmで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および/またはT細胞受容体またはそれらのフラグメントの生成および製造のためには、高い交換収率(好ましくは50%より高い、最も好ましくは75%より高い)を示す候補ペプチドが、MHC分子に対する十分な結合活性を示してMHC複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。
実施例6
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの絶対定量化
抗体および/またはTCRなどのバインダーの生成は、骨の折れる工程であり、いくつかの選択された標的に対してのみ実施されてもよい。腫瘍関連および特異的ペプチドの場合、選択基準としては、提示の排他性および細胞表面に提示されるペプチドの密度が挙げられるが、これに限定されない。実施例1に記載されるペプチドの単離および相対定量化に加えて、本発明者らは、記載される細胞当たりの絶対的ペプチドコピー数も分析された。固形腫瘍サンプル中の細胞当たりのTUMAPコピーの定量化は、単離されたTUMAPの絶対定量化、TUMAP単離の効率、および分析される組織サンプルの細胞計数を必要とする。
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの絶対定量化
抗体および/またはTCRなどのバインダーの生成は、骨の折れる工程であり、いくつかの選択された標的に対してのみ実施されてもよい。腫瘍関連および特異的ペプチドの場合、選択基準としては、提示の排他性および細胞表面に提示されるペプチドの密度が挙げられるが、これに限定されない。実施例1に記載されるペプチドの単離および相対定量化に加えて、本発明者らは、記載される細胞当たりの絶対的ペプチドコピー数も分析された。固形腫瘍サンプル中の細胞当たりのTUMAPコピーの定量化は、単離されたTUMAPの絶対定量化、TUMAP単離の効率、および分析される組織サンプルの細胞計数を必要とする。
ナノLC-MS/MSによるペプチド定量化
質量分析によるペプチドの正確な定量化のために、内標準法を使用して各ペプチドの検量線を作成した。内標準は各ペプチドの二重同位体標識変異型であり、すなわち、2つの同位体標識アミノ酸がTUMAP合成に含まれた。それは、腫瘍関連ペプチドとはその質量異なるのみであるが、他の物理化学的性質に差異を示さない(Anderson et al.,2012)。内標準を各MSサンプルに添加して、全てのMSシグナルを内標準のMSシグナルに対して正規化し、MS実験間の可能な技術的変動を平準化した。少なくとも3つの異なるマトリックス中、すなわち、ルーチンのMSサンプルと同様の天然サンプルからのHLAペプチド溶出液中で検量線を作成し、各調製物を二連のMS試験で測定した。評価のために、MSシグナルを内標準のシグナルに対して正規化し、検量線をロジスティック回帰によって算出した。組織サンプルからの腫瘍関連ペプチドの定量化のためには、それぞれのサンプルにも内標準が添加され、MSシグナルが、内標準に対して正規化され、ペプチド検量線を使用して定量化された。
質量分析によるペプチドの正確な定量化のために、内標準法を使用して各ペプチドの検量線を作成した。内標準は各ペプチドの二重同位体標識変異型であり、すなわち、2つの同位体標識アミノ酸がTUMAP合成に含まれた。それは、腫瘍関連ペプチドとはその質量異なるのみであるが、他の物理化学的性質に差異を示さない(Anderson et al.,2012)。内標準を各MSサンプルに添加して、全てのMSシグナルを内標準のMSシグナルに対して正規化し、MS実験間の可能な技術的変動を平準化した。少なくとも3つの異なるマトリックス中、すなわち、ルーチンのMSサンプルと同様の天然サンプルからのHLAペプチド溶出液中で検量線を作成し、各調製物を二連のMS試験で測定した。評価のために、MSシグナルを内標準のシグナルに対して正規化し、検量線をロジスティック回帰によって算出した。組織サンプルからの腫瘍関連ペプチドの定量化のためには、それぞれのサンプルにも内標準が添加され、MSシグナルが、内標準に対して正規化され、ペプチド検量線を使用して定量化された。
ペプチド/MHC単離の効率
あらゆるタンパク質精製処理と同様に、組織サンプルからのタンパク質の単離には、目的タンパク質のいくらかの損失が伴う。TUMAP単離の効率を判定するために、絶対定量化のために選択された全てのTUMAPについて、ペプチド/MHC複合体が生成された。添加されたものを天然ペプチド/MHC複合体から識別できるように、TUMAPの単一同位体標識バージョンが使用され、すなわち、1つの同位体標識アミノ酸がTUMAP合成に含まれた。これらの複合体は、新鮮に調製された組織溶解産物に、すなわち、TUMAP単離手順の可能な限り早い時点で添加され、次に、以下の親和性精製において、天然ペプチド/MHC複合体のように捕捉された。したがって単一標識TUMAPの回収率を測定することで、個々の天然TUMAPの単離効率に関する結論が可能になる。
あらゆるタンパク質精製処理と同様に、組織サンプルからのタンパク質の単離には、目的タンパク質のいくらかの損失が伴う。TUMAP単離の効率を判定するために、絶対定量化のために選択された全てのTUMAPについて、ペプチド/MHC複合体が生成された。添加されたものを天然ペプチド/MHC複合体から識別できるように、TUMAPの単一同位体標識バージョンが使用され、すなわち、1つの同位体標識アミノ酸がTUMAP合成に含まれた。これらの複合体は、新鮮に調製された組織溶解産物に、すなわち、TUMAP単離手順の可能な限り早い時点で添加され、次に、以下の親和性精製において、天然ペプチド/MHC複合体のように捕捉された。したがって単一標識TUMAPの回収率を測定することで、個々の天然TUMAPの単離効率に関する結論が可能になる。
少数のサンプルで単離効率が分析され、これらの組織サンプル間で同等であった。対照的に、単離効率は個々のペプチド間で異なる。これは、単離効率が、限定数の組織サンプルにおいてのみ判定されるが、任意のその他の組織標本に外挿されてもよいことを提案する。しかしながら、単離効率がペプチドからその他のペプチドに外挿されないこともあるので、各TUMAPは個別に分析する必要がある。
固体冷凍組織中の細胞数測定
絶対ペプチド定量化に供した組織サンプルの細胞数を測定するために、本発明者らは、DNA含量分析を適用した。この方法は、異なる起点の幅広いサンプルに、最も重要なことには、冷凍サンプルに適用できる(Alcoser et al.,2011;Forsey and Chaudhuri,2009;Silva et al.,2013)。ペプチド単離プロトコル中に、組織サンプルを均質溶解産物に処理して、それから小さな溶解産物アリコートを取り出す。アリコートを3つに分割し、それからDNAを単離する(QiaAmp DNA Mini Kit、独国ヒルデンのQiagen)。蛍光ベースのDNA定量化アッセイ(Qubit dsDNA HS Assay Kit、独国ダルムシュタットのLife Technologies)を使用して、少なくとも2つの反復試験において、各DNA単離からの全DNA含有量を定量化する。
絶対ペプチド定量化に供した組織サンプルの細胞数を測定するために、本発明者らは、DNA含量分析を適用した。この方法は、異なる起点の幅広いサンプルに、最も重要なことには、冷凍サンプルに適用できる(Alcoser et al.,2011;Forsey and Chaudhuri,2009;Silva et al.,2013)。ペプチド単離プロトコル中に、組織サンプルを均質溶解産物に処理して、それから小さな溶解産物アリコートを取り出す。アリコートを3つに分割し、それからDNAを単離する(QiaAmp DNA Mini Kit、独国ヒルデンのQiagen)。蛍光ベースのDNA定量化アッセイ(Qubit dsDNA HS Assay Kit、独国ダルムシュタットのLife Technologies)を使用して、少なくとも2つの反復試験において、各DNA単離からの全DNA含有量を定量化する。
細胞数を計算するために、一連の定義された細胞数がある、単一健常血液細胞のアリコートから、DNA標準曲線を作成した。標準曲線を使用して、各DNA単離物からの全DNA含有量から、全細胞含有量を計算する。既知の溶解産物アリコートの容量および全溶解産物容量を考慮して、ペプチド単離のために使用された組織サンプルの平均総細胞数を外挿する。
細胞当たりペプチドコピー数
前述の実験のデータを用いて、本発明者らは、サンプルの全ペプチド量を総細胞数で除算して、それに続いて単離効率により除算することで、細胞当たりのTUMAPコピー数を算出した。選択されたペプチドの細胞コピー数は、表22に示される。
前述の実験のデータを用いて、本発明者らは、サンプルの全ペプチド量を総細胞数で除算して、それに続いて単離効率により除算することで、細胞当たりのTUMAPコピー数を算出した。選択されたペプチドの細胞コピー数は、表22に示される。
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BCG治療は、一般に患者に十分に耐容されるが、特に免疫不全患者では致死的であり得る。BCG難治性は、患者の約30~40%で観察される(Fuge et al.,2015;Steinberg et al.,2016a)。BCG療法に失敗した患者の治療は、困難である。BCG治療に失敗した患者は、筋肉浸潤性疾患を発症するリスクが高い。根治的膀胱切除術は、非応答者にとって好ましい治療選択肢である(Steinberg et al.,2016b;vonRundstedt and Lerner,2015)。FDAは、膀胱保存を望む患者のためのBCGが失敗したNMIBCの第二選治療が、バルルビシンによる化学療法であると認定した。併用BCG-インターフェロンまたはBCG-チェックポイント阻害剤治療、プレBCG経皮ワクチン接種のような免疫療法アプローチ;マイコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei)細胞壁核酸(MCNA)複合体による治療;マイトマイシンC、ゲムシタビン、ドセタキセル、ナブ-パクリタキセル、エピルビシン、マイトマイシン/ゲムシタビン、ゲムシタビン/ドセタキセルのような様々な薬剤による単一または併用化学療法;および熱化学療法、放射化学療法、起電力療法または光線力学療法のような装置支援化学療法などのその他のいくつかの第二選択治療もまた利用可能でき、または現在調査中である(Fuge et al.,2015;Steinberg et al.,2016b;vonRundstedt and Lerner,2015)。利用可能な治療法の臨床試験におけるさらなる評価が、依然として必要である。
特に好ましいのは、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306からなる群から選択される、本発明による単独のまたは組み合わせのペプチドである。より好ましいのは、配列番号1~配列番号149(表3を参照されたい)、配列番号158から配列番号213(表4を参照されたい)、および配列番号305、および配列番号306、からなる群から選択され、特に配列番号2、24、32、39、64、72、106、149、251、305、および306、からなる群から選択される配列からなる、単独のまたは組み合わせのペプチドと、神経膠芽腫、乳がん、結腸直腸がん、腎細胞がん、慢性リンパ球性白血病、肝細胞がん、非小細胞および小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃食道接合部のがんを含む食道がん、胆嚢がんおよび胆管がん、黒色腫、胃がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)、または子宮がんの免疫療法におけるそれらの使用である。
Claims (39)
- 配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306、および配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306と少なくとも88%相同的なそれらの変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびその薬学的に許容可能な塩であって;前記変異型が、主要組織適合性複合体(MHC)分子と結合し、および/またはT細胞を前記変異型ペプチドと交差反応させ;前記ペプチドが完全長ポリペプチドでない、ペプチド。
- MHCクラスIまたはII分子に結合する能力を有し、前記MHCに結合すると、CD4および/またはCD8T細胞によって認識されることができるようになる、請求項1に記載のペプチド。
- そのアミノ酸配列が、配列番号1?配列番号289、配列番号305、および配列番号306のいずれか1つに記載の一続きのアミノ酸を含んでなる、請求項1または2に記載のペプチドまたはその変異型。
- 請求項1?3のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型であって、前記ペプチドまたはその変異型が、8?100個、好ましくは8?30個、より好ましくは8?16個のアミノ酸の全長を有し、最も好ましくは、前記ペプチドが、配列番号1?配列番号289、配列番号305、および配列番号306のいずれかに記載のアミノ酸配列、好ましくは、配列番号2、24、32、39、64、72、106、149、251、305、および306のアミノ酸配列からなるか、またはそれから本質的になる、ペプチドまたはその変異型。
- 前記ペプチドが、修飾され、および/または非ペプチド結合を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型。
- 前記ペプチドが、特にHLA-DR抗原関連不変鎖(Ii)のN末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質の一部である、請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型をエンコードする核酸であって、任意選択的に異種プロモーター配列と結合する、核酸。
- 請求項7に記載の核酸を発現する能力がある、発現ベクター。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチド、請求項7に記載の核酸または請求項8に記載の発現ベクターを含んでなり、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞である、組換え宿主細胞。
- 医療において使用するための、請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項7に記載の核酸、請求項8に記載の発現ベクター、または請求項9に記載の宿主細胞。
- 請求項1~6に記載のペプチドを提示し、または請求項7に記載の核酸を発現し、または請求項8に記載の発現ベクターを含んでなる、請求項9に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたはその変異型を前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を製造する方法。
- T細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に、または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスIまたはII MHC分子に、前記T細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項1~4のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化Tリンパ球を製造するインビトロ法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項12に記載の方法によって製造される活性化Tリンパ球。
- 請求項13で定義される活性T細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞が、請求項1~4のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する患者において、標的細胞を死滅させる方法。
- MHC分子と結合すると、好ましくは請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型である、請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を特異的に認識する、特に可溶性または膜結合抗体である、抗体。
- がんの診断および/または治療において使用するための、またはがんに対する薬剤の製造において使用するための、請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチド、請求項7に記載の核酸、請求項8に記載の発現ベクター、請求項9に記載の細胞、請求項13に記載の活性化Tリンパ球または請求項15に記載の抗体の使用。
- がんが、配列番号1~配列番号289、配列番号305、または配列番号306のペプチドがそれに由来するタンパク質の過剰発現を示す、神経膠芽腫(GB)、乳がん(BRCA)、結腸直腸がん(CRC)、腎細胞がん(RCC)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、肝細胞がん(HCC)、非小細胞および小細胞肺がん(NSCLC、SCLC)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性骨髄性白血病(AML)、卵巣がん(OC)、膵臓がん(PC)、前立腺がん(PCA)、胃食道接合部のがんを含む食道がん(OSCAR)、胆嚢がんおよび胆管がん(GBC、CCC)、黒色腫(MEL)、胃がん(GC)、膀胱がん(UBC)、および子宮がん(UEC)およびその他の腫瘍の群から選択される、請求項16に記載の使用。
- (a)請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチド変異型、請求項7に記載の核酸、請求項8に記載の発現ベクター、請求項10に記載の細胞、請求項13に記載の活性化Tリンパ球、または請求項15に記載の抗体を含有する医薬組成物を溶液または凍結乾燥形態で含んでなる容器;
(b)任意選択的に、前記凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第2の容器;
(c)任意選択的に、配列番号1?配列番号302、配列番号305、および配列番号306からなる群から選択される、少なくとももう1つのペプチド、および
(d)任意選択的に、(i)溶液の使用、または(ii)凍結乾燥製剤の再構成および/また使用のための取扱説明書
を含んでなるキット。 - (iii)緩衝液、(iv)希釈剤、(v)フィルター、(vi)針、または(v)シリンジの1つまたは複数をさらに含んでなる、請求項18に記載のキット。
- 前記ペプチドが、配列番号1?配列番号289、配列番号305、および配列番号306からなる群から選択される、請求項18または19に記載のキット。
- a)前記個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド(TUMAP)を同定するステップと;
b)a)で同定された前記ペプチドを、正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および/または過剰提示について予備選別されたペプチド貯蔵庫と比較するステップと;
c)少なくとも1つのペプチドを、前記患者において同定されたTUMAPと一致する前記貯蔵庫から選択するステップと;
d)ステップc)に基づいて、個別化ワクチンまたは化合物ベースのまたは細胞療法を製造および/または処方するステップと
を含んでなる、個々の患者のための化合物ベースのおよび/または細胞療法のための個別化抗がんワクチンを製造する方法。 - 前記TUMAPが、
a1)前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと;
a2)前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のMHCクラスI/またはクラスII分子と結合しているMHCリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するMHCリガンドを同定するステップと
によって同定される、請求項21に記載の方法。 - 結合ペプチドを前記腫瘍サンプルから単離されたMHC分子から溶出させて、前記溶出したリガンドを配列決定することで、MHCリガンドの配列が同定される、請求項21または22に記載の方法。
- 前記腫瘍サンプルの組織型に対応する前記正常組織が、前記同一患者から得られる、請求項21~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドが、
aa.正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸(mRNA)発現解析を実施するステップと;
ab.ステップaaで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと;
ac.健常ドナーまたは前記患者からのヒトT細胞を使用した生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内T細胞応答の誘導を判定するステップ;または
ba.HLAリガンドを前記腫瘍サンプルから質量分析を使用して同定するステップと;
bb.正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸(mRNA)発現解析を実施するステップと;
bc.前記同定されたHLAリガンドを前記遺伝子発現データと比較するステップと;
bd.ステップbcで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと;
be.ステップbdから選択されたTUMAPを腫瘍組織上で再検出し、健常組織上の検出欠如または希な検出が、mRNAレベルにおける過剰発現の関連性を裏付けるステップと;
bf.健常ドナーまたは前記患者からのヒトT細胞を使用した生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内T細胞応答の誘導を判定するステップと
に基づいて同定される、請求項21~24のいずれか一項に記載の方法。 - 前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドの免疫原性が、生体外免疫原性アッセイ、個々のHLA結合についての患者免疫モニタリング、MHC多量体染色、ELISPOTアッセイおよび/または細胞内サイトカイン染色を含んでなる方法によって判定される、請求項21~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記貯蔵庫が、配列番号1?配列番号302、配列番号305、および配列番号306からなる群より選択される複数のペプチドを含んでなる、請求項21~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも1つの変異を同定するステップと、前記ワクチンに包含するために、または細胞療法を作成するために、前記変異に関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなる、請求項21~27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの変異が、全ゲノム配列決定によって同定される、請求項28に記載の方法。
- 好ましくは可溶性または膜結合性であり、HLAリガンドと反応するT細胞レセプターであって、前記リガンドが、配列番号1?配列番号289、配列番号305、および配列番号306からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有する、T細胞レセプター。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306と少なくとも88%同一である、請求項30に記載のT細胞受容体。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306のいずれかからなる、請求項30または31に記載のT細胞受容体
- 前記T細胞受容体が可溶性分子として提供され、任意選択的に、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する、請求項30~32のいずれか一項に記載のT細胞受容体。
- 請求項30~33のいずれか一項に記載のTCRをエンコードする核酸であって、任意選択的に異種プロモーター配列と結合する、核酸。
- 請求項34に記載の核酸を発現できる、発現ベクター。
- 請求項34に記載の核酸、または請求項15に記載の抗体をコードする核酸、または請求項35に記載の発現ベクターを含んでなる、好ましくはT細胞またはNK細胞である、宿主細胞。
- 請求項36に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記T細胞受容体を前記宿主細胞および/またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項30~33のいずれか一項に記載のT細胞受容体を製造する方法。
- a)配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306群から選択されるペプチド;
b)a)に記載のペプチドおよび/またはペプチドMHC複合体と反応性のT細胞受容体;
c)a)に記載のペプチドと、HLA-DR抗原関連不変鎖(Ii)のN末端のアミノ酸1~80とを含んでなる融合タンパク質;
d)a)~c)のいずれかをコードする核酸、または前記核酸を含んでなる発現ベクター;
e)d)の発現ベクターを含んでなる宿主細胞;
f)T細胞を、抗原特異的様式でT細胞を活性化するのに十分な時間にわたり、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるa)に記載のペプチドと生体外で接触させるステップを含んでなる方法、ならびにこれらの活性化T細胞を自己または他の患者に移入する方法によって得られる、活性化Tリンパ球;
g)a)に記載のペプチドおよび/またはペプチド-MHC複合体および/またはa)に記載のペプチドを提示する細胞と反応性であり、例えば、免疫活性化ドメインまたは毒素との融合によって潜在的に修飾される、抗体、または可溶性T細胞受容体;
h)配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306からなる群から選択されるペプチドおよび/または配列番号1~配列番号289、配列番号305、および配列番号306からなる群から選択されるペプチドとMHC分子の複合体を認識するアプタマー;
i)a)~h)のいずれかに記載のコンジュゲートされまたは標識されたペプチドまたはスキャフォールド
からなる群から選択される、少なくとも1つの活性成分と、薬学的に許容できる担体、および任意選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤および/または安定剤とを含んでなる医薬組成物。 - 請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、好ましくはMHC分子と結合している請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を特異的に認識する、アプタマー。
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