CN109310757A - 硝羟喹啉和其类似物与化学疗法和免疫疗法在癌症治疗中的组合用途 - Google Patents

硝羟喹啉和其类似物与化学疗法和免疫疗法在癌症治疗中的组合用途 Download PDF

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Abstract

描述了包括硝羟喹啉、其类似物或其药学上可接受的盐与至少一种额外的抗癌化学治疗剂或免疫治疗剂的新型组合疗法。还描述了相关试剂盒、药物组合物或其生产方法。

Description

硝羟喹啉和其类似物与化学疗法和免疫疗法在癌症治疗中的 组合用途
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2016年3月31日提交的美国临时专利申请号62/315,774的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及一种用于治疗癌症的组合疗法，特别是涉及硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐，与至少一种额外的抗癌化学疗法或免疫治疗剂的组合，其中该组合疗法表现出协同的抗癌作用。
发明背景
用于治疗癌症的组合疗法有助于使癌症对任何一种抗癌疗法形成耐受性的可能性最小化，并且它们允许使用较低剂量的各个抗癌疗法，其导致毒性降低。根据药物-药物相互作用的性质，两种活性成分的组合可产生协同作用、累加作用或拮抗作用。
硝羟喹啉(NIT)是一种抗微生物剂，其已经长期销售用于治疗尿路感染。最近发现硝羟喹啉还具有抑制血管生成(4)和抑制癌症生长和侵袭(5,6)的活性。NIT和其类似物，例如羟基喹啉，氯碘羟喹和双碘喹啉，具有共同的在治疗传染性疾病方面的临床用途。还报道了NIT类似物具有抗癌细胞毒性(7)。然而，据本发明人所知，均未研究这些药物与其他抗癌药物的组合，并且尚未报道NIT或其类似物与任何其他癌症疗法的药物-药物相互作用。
本领域需要具有增强的抗癌作用或降低的毒性的新型的治疗癌症的组合疗法。
发明简述
本发明通过提供新型组合疗法来满足这些需要，所述组合疗法包含硝羟喹啉其类似物或其药学上可接受的盐与至少一种额外的抗癌化学疗法或免疫治疗剂。该组合疗法显示出对抑制癌细胞生长的协同作用。
在一个普通方面，本发明提供了通过向有此需要的受试者与化学疗法组合施用硝羟喹啉其类似物或其药学上可接受的盐来治疗癌症的方法。该化学疗法优选选自由微管解聚抑制剂、交联DNA的剂和铂化合物组成的组。
在另一个普通方面，本发明提供了通过向有此需要的受试者与免疫治疗剂组合施用硝羟喹啉其类似物或其药学上可接受的盐来治疗癌症的方法。该免疫治疗剂优选为可以刺激有效免疫应答并抑制免疫抑制的剂。更优选地，该免疫治疗剂是调节性T细胞或髓源性抑制性细胞的抑制剂或调节剂。
根据以下公开内容(其包括本发明的详细描述和其优选的实施方案和所附权利要求)本发明的其他方面、特征和优势将会显而易见。
附图简要说明
当结合阅读附图时，可以更好地理解以上概述以及本发明的以下详细描述。为了示例性说明本发明的目的，其在目前优选的附图实施方案中示出。但是，应理解，本发明不限于所示的精确的排布和手段。在附图中：
图1显示硝羟喹啉(NIT)的结构和其类似物的实例；
图2显示通过NIT和卡铂的组合来抑制人膀胱癌细胞系5637生长的组合指数(CI)图；
图3显示通过NIT和紫杉醇的组合来抑制人膀胱癌细胞系5637生长的CI图；
图4显示通过NIT和卡铂的组合来抑制人肝癌细胞系HepG2生长的CI图；
图5显示通过NIT和紫杉醇的组合来抑制人肝癌细胞系HepG2生长的CI图；
图6显示通过NIT和丝裂霉素C的组合来抑制人膀胱癌细胞系5637生长的CI图；
图7显示通过NIT和表柔比星的组合来抑制人膀胱癌细胞系5637生长的CI图；
图8显示通过NIT和吡柔比星的组合来抑制人膀胱癌细胞系5637生长的CI图；
图9显示了在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服NIT和丝裂霉素C的组合对肿瘤生长的抑制；
图10显示了在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服NIT和膀胱内BCG的组合对肿瘤生长的抑制；
图11显示了在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服NIT和抗PD-1抗体的组合对肿瘤生长的抑制；和
图12显示了在原位小鼠RM-9-Luc前列腺癌症模型中口服NIT和抗PD-1抗体的组合对肿瘤生长的抑制。
发明详述
在背景技术和整个说明书中引用或描述了多篇出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一篇均通过引用而整体并入本文。对包含在本说明书中的文档、行为、材料、设备、物品等的讨论是为了提供本发明的上下文。这种讨论并不是承认任何或所有这些事项构成关于所公开或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。否则，本文使用的某些术语具有说明书中规定的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均通过引用而并入，如同在本文中完全阐述一样。必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”，“一个(an)”和“该(the)”包括复数提及。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述数值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确说明，否则如本文所用的数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单独数值(包括在这些范围内的整数和这些值的分数)。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”都旨在表示改善或逆转至少一种与癌症相关的可测量的物理参数，其在受试者中不是必须要可辨别，但是可以在受试者中辨别出来。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(reatment)”还可以指引起消退、阻止进展或至少减缓癌症的进展。在一个特定实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻、预防发展或发作，或减少与该癌症相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防癌症的复发。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指增加患有癌症的受试者的存活率。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指消除该受试者中的癌症。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物。根据特定的实施方案，该受试者是包括非灵长类动物(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠、兔、豚鼠或小鼠)或灵长类动物(例如猴子、黑猩猩或人)的哺乳动物。在特定的实施方案中，该受试者是人。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指在受试者中引发所需生物反应或药物反应的活性成分或组分的量。在特定的实施方案中，该有效量是有效实现与另一种活性成分或化合物的协同作用的活性成分或化合物的量。如本文所用，“协同作用”是指大于两种单独活性成分或化合物对癌症治疗的累加作用的作用。治疗有效量可以根据所述目的凭经验和以常规方式确定。例如，可以任选地使用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。本领域技术人员可以基于对几种因素的考虑(包括待治疗或预防的疾病，所涉及的症状，患者的体重，患者的免疫状态和本领域技术人员已知的其他因素)确定特定有效剂量的选择(例如通过临床试验)。制剂中使用的精确剂量还取决于给药途径和疾病的严重程度，并应根据执业医生的判断和每位患者的情况来决定。可以从体外或动物模型试验系统得到的剂量-反应曲线推测有效剂量。例如，可以使用基于Loewe相加模型的数学算法评估药物组合。在该模型中，计算组合指数(CI)值。CI<1、CI＝1和CI>1分别表明协同、累加和拮抗相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指硝羟喹啉或其类似物之一的安全并有效的盐形式。药学上可接受的盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨盐(pearssalts)、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。优选地，硝羟喹啉的药学上可接受的盐是硝羟喹啉的碱加成盐，例如国际专利申请号PCT/US14/30532中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“化学治疗剂”是指任何作为抗癌药物的化学物质。
如本文所用，术语“免疫剂”或“免疫调节剂”是指能够刺激免疫应答和/或抑制免疫抑制的任何剂。
如本文所用，术语“组合”，在向受试者施用两种或更多种疗法的背景下，是指使用一种以上的疗法。术语“组合”的使用不限制向受试者施用疗法的顺序。例如，可以在向受试者施用第二疗法(如有效量的免疫治疗剂或有效量的化学治疗剂)之前(如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一疗法(例如有效量的本文所述的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐)。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含有脂质的囊泡、微球、脂质体包囊或本领域熟知的用于药物制剂的其他材料。应理解，该载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于为了特定应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的有效性或根据本发明的组合物的生物活性的无毒材料。根据特定的实施方案，鉴于本公开内容，适用于基于硝羟喹啉的药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。载体的非限制性实例包括生理盐水和水。
硝羟喹啉(NIT)和其类似物
如图1所示，NIT和其类似物，例如羟基喹啉，氯碘羟喹和双碘喹啉，具有共同的在治疗传染性疾病中的临床用途。NIT是一种广谱抗生素，自20世纪60年代以来其一直在市场上出售用于治疗尿路感染。它的抑制细菌生长的作用机制仍然未被表征。发现NIT在NIT的sub-MIC下抑制尿道病原性大肠杆菌(E.coli)对尿上皮细胞和导尿管的粘附，并且认为NIT通过螯合二价离子Mg2+和Mn2+(1)促进细菌外膜的解体。羟基喹啉(Oxine)是一种具有温和抑制真菌、抑制细菌、驱虫和杀阿米巴活性的抗菌剂。羟基喹啉通过实质上剥夺Mn2+和Mg2+的酶能够抑制分离的大肠杆菌RNA聚合酶而非直接接触该酶(2)。羟基喹啉也用作金属螯合剂，从而用作放射性铟的载体以用于诊断目的。氯碘羟喹长期以来用作局部抗感染药、肠道抗阿米巴药和阴道抗滴虫药。氯碘羟喹的口服制剂已被证明可引起亚急性骨髓性视神经病变，因此在世界范围内被禁用。发现氯碘羟喹可以在动物模型中阻止阿尔茨海默病的认知下降，这可能是因为它具有作为Cu2+和Zn2+螯合剂的能力(3)。双碘喹啉是另一种广泛用作肠道抗菌剂的卤代8-羟基喹啉，特别是作为抗阿米巴剂。它也可以局部用于其他感染，并可能导致CNS和眼睛损伤。它的作用机制仍未知。
已经表明NIT和其类似物具有抗癌活性。结果表明，NIT是MetAP2抑制剂，因此可以通过抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖来阻断癌症血管生成(4)。还证明了NIT能够诱导前列腺癌细胞的凋亡(5)，当与Cu2+组合施用时，其对癌细胞的细胞毒性更明显(6)。据报道NIT类似物，例如氯碘羟喹、羟基喹啉和双碘喹啉，也具有抗癌细胞毒性(7)。
化学疗法
癌症是细胞的伴随着恶性行为(包括侵袭和转移)的不可控制的生长，以及其他特征。它是由遗传易感性和环境因素之间的相互作用引起的。这些因素导致致癌基因、控制细胞生长速度的基因和肿瘤抑制基因、有助于预防癌症的基因中的基因突变的积累，其使癌细胞具有恶性特征，例如不可控制的生长。化学疗法是一种使用化学物质(特别是一种或多种抗癌药物)的癌症治疗策略。从广义上讲，大多数化学治疗药物通过减少有丝分裂(细胞分裂)起作用，其有效地靶向快速分裂的细胞。由于这些药物会对细胞造成损伤，因此它们被称为细胞毒性的。抗癌药物通过各种机制阻止有丝分裂，包括损伤DNA和抑制细胞分裂中涉及的细胞机构。关于为什么这些药物杀死癌细胞的一个理论是它们诱导称为细胞凋亡的程序性细胞死亡形式。临床上有很多种用于治疗癌症的细胞毒性化学疗法，根据其化学结构特征将它们分为不同的类别。参见，例如，下表1和www.en.wikipedia.org/wiki/List_ of_antineoplastic_agents。
表1.抗癌化学疗法列表
传统的化学治疗剂具有细胞毒性，并且它们通过杀死快速分裂(其是大多数癌细胞的基本特性之一)的细胞起作用。这种靶向快速分裂细胞意味着化学疗法还会伤害在正常情况下快速分裂的细胞，例如骨髓、消化道和毛囊中的细胞，其导致了化学疗法最常见的副作用，包括骨髓抑制(血细胞产生减少，因此也是免疫抑制)，粘膜炎(消化道内层炎症)和秃头症(脱发)。组合疗法包括同时用多种不同药物治疗患者。因为这些药物的机制和副作用不同，所以组合疗法可以使对任何一种药剂产生耐药性的机率最小化，因此其可以用于治疗耐药癌症或以较低剂量用于降低毒性。然而，由于药物-药物相互作用的不可预测的性质，已知治疗的组合也可能导致功效降低或副作用增加。
癌症免疫疗法
癌症免疫疗法试图刺激免疫系统以排斥和破坏肿瘤。已经发现肿瘤能够通过操控肿瘤微环境和驱动免疫抑制来逃避宿主免疫，使得尽管在癌症患者中存在产生有效抗肿瘤免疫应答所必需的成分，但该宿主通常不能阻滞肿瘤进展(8)。过去已经提出了许多分子和细胞机制来解释这种违反直觉的情况，其主要集中在肿瘤的“免疫逃逸”，并暗示肿瘤具有避免该宿主产生的肿瘤特异性免疫应答的能力，或者它们完全使宿主失去抗肿瘤免疫的能力。这种被称为“肿瘤诱导的免疫抑制”的过程近年来已被认识到并且正在集中研究。肿瘤似乎可以干扰免疫系统的所有成分，影响抗肿瘤免疫应答的所有阶段。
随着肿瘤从恶变前进展到转移性表型，肿瘤细胞中发生的分子改变是遗传不稳定性的结果，现在被认为是所有肿瘤的主要特征。在肿瘤发生的早期阶段可检测到遗传变化，遗传变化随着肿瘤的进展变得更加明显，且在转移性细胞中是最大的，并且是肿瘤异质性和肿瘤细胞的抗原表位谱改变的原因。已经提出免疫系统可能通过消除那些对免疫干预敏感的恶性细胞并允许对免疫耐受变体的选择和存活，经由“免疫编辑”来驱动这些抗原变化。免疫编辑的最终结果是肿瘤逃脱宿主免疫系统。调节性T细胞(Treg)和髓源性抑制性细胞(MDSC)是肿瘤使用的用于实现免疫逃逸的两种细胞类型。保护免疫细胞免受Treg、MDSC或抑制因子的不利影响，从而增强其效应功能，可以恢复癌症患者的有效抗肿瘤免疫力。
CD4+CD25highFOXP3+Treg细胞在人肿瘤和癌症患者的外周循环中累积。尚不清楚这些细胞是否迁移到肿瘤或原位扩增。因为肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原，所以Treg积累可能是一种应答以实施免疫耐受。Treg细胞通过多种机制下调效应T细胞的免疫活性，所述机制包括IL-10和TGF-β1的产生、ATP向免疫抑制腺苷的酶促降解、或Fas/FasL与颗粒酶/穿孔素途径的衔接(engagement)。肿瘤受益于Treg介导的免疫抑制作用。
骨髓来源的未成熟骨髓细胞MDSC(CD34+CD33+CD13+CD15-)在几乎所有癌症患者的外周循环和肿瘤中以升高的频率存在。它们由肿瘤衍生的可溶性因子(例如TGF-β1、IL-10、VEGF、GMCSF、IL-6、PGE2)募集。它们通过几种机制通过抑制T细胞应答来促进肿瘤生长，包括产生精氨酸酶-1，一种参与L-精氨酸代谢的酶，以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的激活。它们还控制肿瘤的吲哚胺-2,2-双加氧酶(IDO)的产生，其参与色氨酸的分解代谢，色氨酸是T细胞分化必需的氨基酸。
用于早期(非侵入性)膀胱癌的卡介苗(BCG)免疫疗法利用将减毒的活细菌滴注到膀胱中，并且在多达三分之二的病例中有效预防复发。针对BCG的该免疫应答可归纳如下(9)：通过BCG感染尿路上皮和膀胱肿瘤细胞导致BCG内化，其增加了抗原呈递分子的表达。这通过释放细胞因子诱导免疫应答，例如Th1细胞因子(IL-2、肿瘤坏死因子、L-12和IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)连同IL-8和IL-17。这种复杂的免疫级联诱导由细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞介导的抗肿瘤活性。在另一项在原位小鼠膀胱肿瘤模型中的BCG研究中，与低剂量疗法相比，高剂量BCG疗法后MDSCs群体显著下调。在相同研究中，CD4+/Foxp3+Treg也表现出相同的变化。在BCG治疗后，血液中CD4+/Foxp3+Treg的群体减少。这些对免疫抑制因子的抑制作用可以解释BCG疗法的强效抗肿瘤治疗效果(10)。
免疫检查点调控子(可以是共刺激分子和共抑制分子二者)调节免疫系统。这些检查点信号之间的平衡调节淋巴细胞活化并因此调节免疫应答。肿瘤可以使用这些检查点调控子来保护自身免受免疫系统的侵害。免疫检查点疗法可以增强受试者中T细胞的增殖、迁移、持久性和/或细胞毒活性，特别是通过增加肿瘤浸润性T细胞的数量(11)。最佳表征的免疫检查点受体是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4；也称为CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1；也称为CD279)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，并且批准了或正在临床试验中进行广泛测试靶向这些分子的剂用于治疗多种实体癌症或血液癌症。
CTLA-4，一种抑制性受体，是通过下调T细胞活化的初始阶段来参与引发免疫应答的全局免疫检查点调控子。CTLA-4是第一个临床验证的检查点途径靶标。CTLA-4与T细胞共刺激蛋白CD28同源，并且两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86结合。CTLA-4以明显比CD28更高的亲和力和亲合力结合CD80和CD86，使CTLA-4能够胜过CD28而结合其配体，从而有效抑制T细胞活化(12)。通过使用拮抗性抗体阻断CTLA-4活性而干预这种机制，并因此维持T细胞的活性。目前，百时美施贵宝的抗CTLA-4mAb，伊匹单抗(ipilimumab)已获得美国食品和药品管理局(FDA)批准用于转移性黑色素瘤患者。此外，阿斯利康的抗CTLA-4mAb，tremelimumab已经由FDA授予用于治疗恶性间皮瘤患者的孤儿药。
PD-1是在活化的T和B细胞上表达的另一种抑制性受体，且它起到抑制免疫应答的作用(13)。PD-1充当免疫检查点调控子，并且在结合其配体之一PD-L1(B7-H1,CD274)或PD-L2(B7-DC,CD273)后，PD-1抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生。肿瘤微环境中PD-L1或PD-L2的过表达导致肿瘤内免疫应答的抑制(14)。通过抗PD-1/PD-L1抗体抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用可以抑制T细胞的失活，并因此增强抗肿瘤应答，延迟肿瘤生长，促进肿瘤排斥(15)。两种抗PD-1mAb，百时美施贵宝的纳武单抗(nivolumab)和默克的派姆单抗(pembrolizumab)，已获得美国FDA批准用于转移性黑素瘤和非小细胞肺癌的患者。最近，FDA批准的纳武单抗用于转移性肾细胞癌患者的治疗。2016年，罗氏的抗PD-L1mAb，atezolizumab由FDA批准用于治疗转移性尿路上皮癌和非小细胞肺癌。其他抗PD-L1mAb，例如阿斯利康的durvalumab和辉瑞的avelumab，其正处于后期临床试验阶段。
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是催化色氨酸氧化裂解的酶(16)。IDO在抑制免疫系统中发挥作用，因为经历抗原依赖性激活的T细胞需要色氨酸用于细胞增殖和存活(17)。IDO在大多数肿瘤和/或肿瘤引流淋巴结中过表达，并且在帮助肿瘤逃避来自免疫系统的攻击中起重要作用。IDO抑制剂阻断IDO酶,其减少色氨酸消耗并最终可以有助于促进针对肿瘤的增强的免疫应答(18)。目前，正在进行许多临床试验以评估IDO抑制剂用于单一疗法和组合癌症疗法。
除PD-1、CTLA-4和IDO外，其他免疫检查点也参与恶性肿瘤的发生和进展，包括T细胞膜蛋白-3(TIM-3)、LAG3、具有Ig和基于免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)域的T细胞免疫受体(TIGIT)、BTLA、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、杀伤性抑制性受体(KIR)和含V域Ig的T细胞活化抑制剂(VISTA)。与PD-1、CTLA-4和IDO相似，这些免疫检查点抑制淋巴细胞活性和/或诱导淋巴细胞失能，因此其是癌症免疫疗法的理想靶标。这些免疫检查点的阻断抗体已经在动物模型中显示出特异性的抗肿瘤活性，并且一些正在临床试验中进行测试。
治疗方法
在一些方面，本发明包含使用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐以及有效量的至少一种第二药剂(包括用于治疗各种类型的癌症的任何化学治疗剂或免疫治疗剂)的组合治疗方法。本发明提供了将有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂组合以产生显著增强的抗癌作用的方法，该抗癌作用优选是协同的。
该癌症可以是任何癌症。在一些实施方案中，该癌症是黑素瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肉瘤、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、胃食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肝细胞癌、恶性间皮瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、神经母细胞瘤、浆细胞肿瘤、肾母细胞瘤(Wilm's tumor)、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或肝细胞癌。在特定的实施方案中，该癌症是膀胱癌、前列腺癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌、非小细胞肺癌、乳腺癌或肝细胞癌。在更特定的实施方案中，该癌症是膀胱癌、前列腺癌、肾癌或尿路上皮癌。在更特定的实施方案中，该癌症是膀胱癌或前列腺癌。
该第二药剂可以是增强硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐的抗癌作用的任何化学治疗剂。在一些实施方案中，该第二药剂是微管解聚抑制剂、交联DNA的药剂、嵌入DNA碱基对的药剂，或铂化合物。在一些实施方案中，该第二药剂是微管解聚抑制剂，例如紫杉烷，例如紫杉醇、多西他赛或卡巴他赛，或与蛋白质或抗体混合或缀合的紫杉烷。在一些实施方案中，该第二药剂是交联DNA的药剂，例如丝裂霉素C。在一些实施方案中，该第二药剂是嵌入DNA碱基对的药剂，例如蒽环类药物，例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、米托蒽醌或戊柔比星。在一些实施方案中，该第二药剂是铂化合物，例如卡铂，顺铂，奈达铂或奥沙利铂。在特定的实施方案中，该第二药剂选自由紫杉醇、丝裂霉素C、表柔比星、吡柔比星、顺铂和卡铂组成的组。
该第二药剂还可以是增强硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐的抗癌作用的任何免疫治疗剂。在一些实施方案中，该第二药剂是可以刺激有效免疫应答和/或抑制免疫抑制的免疫剂。在一些实施方案中，该第二抑制剂是调节特别是抑制和下调免疫抑制因子如调节性T细胞和MDSC的药剂，其包括程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)/程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)途径的任何抑制剂或抗体。在一些实施方案中，该第二抑制剂是能够调节免疫细胞活性的任何有效抑制剂/抗体，其包括但不限于靶向细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、CD20、CD19、IL-17a、CD25、精氨酸酶1(ARG1)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)。在一些实施方案中，该第二抑制剂是BCG。在特定的实施方案中，该第二药剂是针对PD-1的抗体或其抗原结合片段。在其他特定的实施方案中，该第二药剂是针对PD-L1的抗体或其抗原结合片段。在其他特定的实施方案中，该第二药剂是针对CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。在其他特定的实施方案中，该第二药剂是BCG疗法，优选减毒的BCG疗法，更优选分枝杆菌细胞壁碎片，最优选源自草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)的具有生物学活性的核酸的分枝杆菌细胞壁碎片(fragment)。
根据所选的特定施用方式，例如基于所需剂量，流体体积，粘度等选择该化合物或药剂的剂量，以优选地实现协同作用。在一些实施方案中，该硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐以约100mg/天至约1600mg/天的剂量施用，例如约100mg/天、200mg/天、300mg/天、400mg/天、500mg/天、600mg/天、700mg/天、800mg/天、900mg/天、1000mg/天、1100mg/天、1200mg/天、1300mg/天、1400mg/天、1500mg/天和1600mg/天，优选口服施用。优选地，该硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐以约600mg/天至约1600mg/天的剂量施用，优选口服施用。
在一些实施方案中，该第二药剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其优选以约0.1mg/kg至约20mg/kg的剂量，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg，优选通过静脉内或肌内注射施用，每2、3或4周一次。更优选地，该抗-PD-1抗体或其抗原结合片段优选通过静脉内或肌内注射，在约3周的时间内以约2mg/kg至约15mg/kg的总剂量施用，并且任选地重复该治疗一次或多次。
在一些实施方案中，该第二药剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其优选以约1mg/kg至约40mg/kg的剂量，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40mg/kg，优选通过静脉内或肌内注射施用，每2、3或4周一次。更优选地，该抗PD-L1抗体或其抗原结合片段优选通过静脉内或肌内注射，在约4周的时间内以约10mg/kg至约30mg/kg的总剂量施用，并且任选地重复该治疗一次或多次。
在一些实施方案中，该第二药剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其优选以约0.1mg/kg至约6mg/kg的剂量，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5或6mg/kg，优选通过静脉内或肌内注射施用，每3、4或5周一次。更优选地，该抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段优选通过静脉内或肌内注射施用，在约4周的时间内以约1mg/kg至约4mg/kg的总剂量施用，并且任选地重复该治疗一次或多次。
在一些实施方案中，该第二药剂是BCG疗法，其优选以约0.5x 108至约50x 108个菌落形成单位(CFU)的剂量，例如约0.5x、1x、2x、4x、6x、8x、10x、12x、14x、16x、18x、20x、22x、24x、26x、28x、30x、32x、34x、36x、38x、40x、42x、44x、46x、48x或50x 108个CFU，优选通过膀胱内施用，每1、2、3、4或5周一次。更优选地，该BCG疗法优选通过膀胱内，每周一次以约1x108至约8x 108个CFU的剂量施用，并且任选地重复该治疗一次或多次。
在一些实施方案中，该第二药剂是化学治疗剂，其以约0.1mg/kg或更高(最高达该药剂在水中或生理盐水中的最高溶解度)的浓度，优选膀胱内施用。在一些实施方案中，该化学治疗剂是DNA交联或嵌入剂，例如丝裂霉素C、蒽环类药物(如表柔比星、吡柔比星等)、基于铂的抗肿瘤剂(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂、奈达铂)，以约0.1mg/ml至约5mg/ml的浓度，例如约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5mg/ml，在膀胱滴注液中优选膀胱内施用，每1、2、3、4或5周一次。更优选地，该化学治疗剂每周一次以约0.5mg/mL至2mg/mL的浓度在膀胱滴注液中优选膀胱内施用，且任选地重复该治疗一次或多次。
在一些实施方案中，该化学治疗剂是靶向微管蛋白的紫杉烷药物，例如紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛，其与蛋白质或抗体的缀合物等，其以约0.5mg/ml至约10mg/ml的紫杉烷药物的浓度，例如约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/ml，在膀胱滴注液中优选膀胱内施用，每1、2、3、4或5周一次。更优选地，该紫杉烷药物每周一次以约1mg/mL至5mg/mL的浓度在膀胱滴注液中优选膀胱内施用，且任选地重复该治疗一次或多次。
可以通过任何可接受的途径施用该化合物或药剂。在一些实施方案中，该化合物口服、脂肪内、动脉内、关节内、颅内、皮内、病灶内、肌肉内、鼻内、眼内(intraocularally)、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、直肠内、鞘内、气管内、肿瘤内、脐内、阴道内、静脉内、膀胱内、玻璃体内、经脂质体、局部(locally)、粘膜、口服、肠胃外、直肠、结膜下、皮下、舌下、局部(topically)、经口含化、经皮、阴道，以乳膏、以脂质组合物，通过导管，通过灌洗，通过连续输注，通过输注，通过吸入，通过注射，通过局部递送，通过局部灌注，直接浸浴靶细胞，或其任何组合。在一些实施方案中，该硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐口服或通过注射施用，且优选口服施用。在一些实施方案中，该免疫治疗剂是通过注射施用的抗体。在一些实施方案中，该免疫治疗剂是通过膀胱内或通过注射施用的BCG疗法，且优选地通过膀胱内施用。在一些实施方案中，该化学治疗剂通过膀胱内或通过注射施用，且优选通过膀胱内施用。
在一些实施方案中，该化合物或药剂每日施用一次。在其他实施方案中，该化合物或药剂每日施用两次。在其他实施方案中，该化合物一天施用多次，每两天施用一次、每三天施用一次、每四天施用一次、每五天施用一次、每六天施用一次、每七天施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每两个月施用一次、每三个月施用一次、每四个月施用一次、每五个月施用一次、每六个月施用一次，或每年施用一次。硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐的剂量方案可以不同于免疫治疗剂或化学治疗剂的剂量方案。
该化合物或药剂可以施用一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、两周、三周、四周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年、四年、五年、十年或十五年。
本发明的方法可以与额外的癌症疗法组合使用。在一些实施方案中，该额外的癌症疗法包括手术、放射疗法、化学疗法、毒素疗法、免疫疗法、冷冻疗法或基因疗法。在一些实施方案中，该癌症是化学疗法耐受的、免疫疗法耐受的或放射性耐受的癌症。
根据本发明实施方案的本发明的组合治疗可以通过同时、顺序或分开的方式施用治疗的单独组分来实现。本发明中的治疗方法可以以有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与有效量的免疫治疗剂或有效量的化学治疗剂的组合应用于在任何动物模型或临床中。
组合物/试剂盒
本发明的方面还涉及药物组合物或试剂盒，其包含有效量的硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐、有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂以及药学上可接受的载体，还涉及通过使用本领域已知的方法将基于本公开内容的所述硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐、所述至少一种额外的抗癌免疫治疗剂或化学治疗剂和药学上可接受的载体组合来制备该药物组合物或试剂盒的方法。
根据本发明的实施方案，试剂盒包含一种或多种药物组合物，其具有有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的免疫治疗剂。根据本发明的其他实施方案，试剂盒包含一种或多种药物组合物，其具有有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的化学治疗剂。该有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂可以存在于一种药物组合物中。它们也可以存在于分开的药物组合物中。该试剂盒进一步含有关于使用该有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂的组合用于治疗癌症的的说明书。
可以基于本公开内容使用本领域已知的方法制备根据本发明的实施方案的组合物或试剂盒。
根据特定的实施方案，有效量是指有效实现以下作用中的一种，两种，三种，四种或更多种的协同作用的每种活性成分或化合物的量：(i)减轻或改善待治疗的癌症或与其相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的癌症或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的癌症或与其相关的症状的进展；(iv)引起待治疗的癌症或与去相关的症状的消退；(v)预防待治疗的癌症或与其相关的症状的进展或发作；(vi)预防待治疗的癌症或与其相关的症状的再次发生；(vii)减少患有待治疗癌症或与其相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有待治疗癌症或与其相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有待治疗的癌症或与其相关的症状的受试者的存活率；(xi)抑制或减少受试者中待治疗的癌症或与其相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗作用。
实施方案
实施方案1是一种治疗癌症的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的免疫治疗剂，优选地，该免疫治疗剂是调节性T细胞或髓源性抑制细胞的抑制剂和调节剂，并且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该免疫治疗剂的组合引起协同作用。
实施方案2是实施方案1的方法，其中该免疫治疗剂是PD-L1/PD-1途径的抑制剂或CTLA-4途径的抑制剂，优选地，该免疫治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体，或其抗原结合片段，更优选地，该抗体或其片段通过静脉内或肌内注射施用。
实施方案3是实施方案1的方法，其中该免疫治疗剂是卡介苗(BCG)疗法，优选减毒BCG疗法，更优选分枝杆菌细胞壁碎片，且最优选源自草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)的具有生物学活性的核酸的分枝杆菌细胞壁碎片，更优选地，该BCG疗法是膀胱内施用的。
实施方案4是实施方案3的方法，其中在膀胱内滴注BCG疗法的24小时内不施用硝羟喹啉其类似物或药学上可接受的盐。
实施方案5是实施方案1至4中任一项的方法，其中该癌症是选自由以下组成的组：黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肉瘤、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、胃食管癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、肝细胞癌、恶性间皮瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、神经母细胞瘤、浆细胞肿瘤、肾母细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和肝细胞癌。
实施方案6是实施方案5的方法，其中该癌症是膀胱癌。
实施方案7是实施方案5的方法，其中该癌症是前列腺癌。
实施方案8是实施方案1至7中任一项的方法，其中该有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐口服或通过静脉内或肌内注射施用。
实施方案9是一种治疗癌症的方法，该癌症优选膀胱癌、肝癌或前列腺癌，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的化学治疗剂，其中硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该化学治疗剂的组合引起协同作用。
实施方案10是实施方案9的方法，其中该化学治疗剂是靶向微管蛋白的紫杉烷药物，其优选紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛；或该化学治疗剂是DNA交联或嵌入剂，其优选丝裂霉素C、蒽环类药物优选表柔比星、吡柔比星，或基于铂的抗肿瘤剂优选卡铂、顺铂、奥沙利铂或奈达铂。
实施方案11是实施方案9或10的方法，其中该化学治疗剂每周一次，或每2、3、4或5周一次膀胱内施用。
实施方案12是实施方案1至11中任一项的方法，其中该硝羟喹啉类似物选自由羟基喹啉、氯碘羟喹和双碘喹啉组成的组。
实施方案13是实施方案1至12中任一项的方法，其中该有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐每日口服施用100mg至1600mg，优选每日口服施用600mg至1600mg。
实施方案14是一种治疗癌症的方法，该癌症优选膀胱癌或前列腺癌，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐每日口服施用100mg至1600mg，优选每日600mg至1600mg，且该抗PD-1抗体或其抗原结合片段通过静脉内或肌内注射0.1mg/kg至20mg/kg每1至4周一次，优选在3周时间内总量为2mg/kg至15mg/kg，并且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该抗PD-1抗体或其抗原结合片段的组合引起协同作用。
实施方案15是一种治疗癌症的方法，该癌症优选膀胱癌或前列腺癌，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐每日口服施用100mg至1600mg，优选每日600mg至1600mg，且该抗PD-L1抗体或其抗原结合片段通过静脉内或肌内注射施用1mg/kg至40mg/kg每2至4周一次，优选在4周时间内总量为10mg/kg至30mg/kg，并且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的组合引起协同作用。
实施方案16是一种治疗癌症的方法，该癌症优选膀胱癌或前列腺癌，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其中硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐每日口服施用100mg至1600mg，优选每日600mg至1600mg，且该抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段通过静脉内或肌内注射施用0.1mg/kg至6mg/kg每3至5周一次，优选在4周时间内总量为1mg/kg至4mg/kg，并且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的组合引起协同作用。
实施方案17是一种治疗癌症的方法，该癌症优选膀胱癌或前列腺癌，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的BCG疗法，其中硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐每日口服施用100mg至1600mg，优选每日600mg至1600mg，且该BCG疗法以0.5x 108至50x 108个菌落形成单位(CFU)的剂量膀胱内施用每1至5周一次，优选1x 108至8x 108个CFU一周一次，并且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该BCG疗法的组合引起协同作用。
实施方案18是一种治疗癌症的方法，该癌症优选膀胱癌、肝癌或前列腺癌，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和有效量的化学治疗剂，其中硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐每日口服施用100mg至1600mg，优选每日600mg至1600mg，且该有效量的化学治疗剂通过膀胱内或通过静脉内或肌内注射施用，且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该化学治疗剂的组合引起协同作用。
实施方案19是实施方案18的方法，其中该化学治疗剂是DNA交联或嵌入剂，其选自由丝裂霉素C、表柔比星、吡柔比星、卡铂、顺铂、奥沙利铂和奈达铂组成的组，且该化学治疗剂在膀胱滴注液中以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度膀胱内施用每1-5周一次，优选0.5mg/mL至2mg/mL。
实施方案20是实施方案18的方法，其中该化学治疗剂是选自由紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛组成的组的紫杉烷药物，且该化学治疗剂在膀胱滴注液中以0.5至10mg/mL的浓度膀胱内施用，优选1mg/mL至5mg/mL。
实施方案21是实施方案1至20中任一项的方法，其中硝羟喹啉或其药学上可接受的盐口服地或通过注射施用至有此需要的受试者中。
实施方案22是实施方案1至20中任一项的方法，其中选自由羟基喹啉、氯碘羟喹和双碘喹啉组成的组的硝羟喹啉类似物或其药学上可接受的盐口服地或通过注射施用至有此需要的受试者中。
实施方案23是试剂盒，其包含有效量的硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐、有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂和一种或多种药学上可接受的载体，其中该有效量的硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐和该有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂存在于同一药物组合物中或分开的药物组合物中。
实施方案24是实施方案23的试剂盒，其中该试剂盒包含药物组合物，所述药物组合物含有100mg至1600mg优选600mg至1600mg的每剂型的硝羟喹啉或其类似物或其药学上可接受的盐。
实施方案25是实施方案23或24的试剂盒，其中该试剂盒包含药物组合物，所述药物组合物含有选自由以下组成的组的免疫治疗剂：抗PD-1抗体或其抗原结合片段；抗PD-L1抗体或其抗原结合片段；抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段；和BCG疗法。
实施方案26是实施方案23或24的试剂盒，其中该试剂盒包含药物组合物，所述药物组合物含有选自由以下组成的组的化学治疗剂：丝裂霉素C、表柔比星、吡柔比星、卡铂、顺铂、奥沙利铂、奈达铂、紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛。
实施方案27是实施方案23至26中任一项的试剂盒，其中该试剂盒包含含有硝羟喹啉或其药学上可接受的盐的药物组合物。
实施方案28是实施方案23至26中任一项的试剂盒，其中该试剂盒包含含有选自羟基喹啉、氯碘羟喹和双碘喹啉的硝羟喹啉类似物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
实施方案29是制备实施方案23至28中任一项的试剂盒的方法，其包括将该硝羟喹啉、其类似物或其药学上可接受的盐、该免疫治疗法或化学治疗剂与一种或多种的药学上可接受的载体组合在该试剂盒中。
实施方案30是制备实施方案23至28中任一项的试剂盒的方法，其包括获得包含该有效量的硝羟喹啉、其类似物或其药学上可接受的盐的第一药物组合物，获得包含该有效量的免疫治疗剂或化学治疗法剂第二药物组合物，并将该第一和第二药物组合物组合在该试剂盒中。
实施方案31是实施方案23至28中任一项的试剂盒在制备用于治疗癌症的药物中的用途，且硝羟喹啉或其类似物或药学上可接受的盐与该免疫治疗剂或化学治疗剂的组合使用引起协同作用。
实施方案32是实施方案31的用途，其中该癌症选自黑素瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肉瘤、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、胃食管癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、肝细胞癌、恶性间皮瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、神经母细胞瘤、浆细胞肿瘤、肾母细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和肝细胞癌。
实施方案33是实施方案32的用途，其中该癌症是膀胱癌。
实施方案34是实施方案32的用途，其中该癌症是前列腺癌。
实施方案35是实施方案32的用途，其中该癌症是肝癌。
实施例
以下本发明的实施例是为了进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附的权利要求确定。
实施例1：通过NIT和一种或多种化学疗法的组合协同抑制肿瘤生长
测试NIT与一组化学疗法(包括卡铂、紫杉醇、丝裂霉素C、表柔比星和吡柔比星)一起对两种人癌细胞系的生长抑制作用。如表2和3中所示，NIT抑制人膀胱癌细胞系5637和人肝癌细胞系HepG2的生长。
表2.将NIT与人膀胱癌细胞系5637孵育120小时导致细胞生长的抑制
表3.将NIT与人肝癌细胞系HepG2孵育120小时导致细胞生长的抑制
如表4和5中所示，卡铂抑制人膀胱癌细胞系5637和人肝癌细胞系HepG2的生长。
表4.将卡铂与人膀胱癌细胞系5637孵育120小时导致细胞生长的抑制。
表5.将卡铂与人肝癌细胞系HepG2孵育120小时导致细胞生长的抑制
如表6和7中所示，紫杉醇抑制人膀胱癌细胞系5637和人肝癌细胞系HepG2的生长。
表6.将紫杉醇与人膀胱癌细胞系5637孵育112小时导致细胞生长的抑制
表7.将紫杉醇与人肝癌细胞系HepG2孵育112小时导致细胞生长的抑制
表8中总结了这些化合物的细胞生长抑制的IC50值。
表8.NIT、卡铂和紫杉醇对人膀胱癌细胞系5637和人肝癌细胞系HepG2的细胞生长抑制的IC50值。
相似地测试丝裂霉素C、表柔比星和吡柔比星对膀胱癌细胞系5637的生长的抑制，并且表9中总结了它们的IC25、IC50和IC75值。
表9.丝裂霉素C、表柔比星和吡柔比星对人膀胱癌细胞系5637的细胞生长抑制的IC25、IC50和IC75值。
药物 IC<sub>25</sub>(ng/ml) IC<sub>50</sub>(ng/ml) IC<sub>75</sub>(ng/ml)
丝裂霉素C 48.36 152.53 536.62
表柔比星 34.97 45.21 63.93
吡柔比星 96.58 142.57 219.58
通过将NIT与5至7个浓度水平(其中中等浓度水平接近它们的IC50值)的各个化学疗法混合而进行NIT和化学疗法的组合研究。根据Ting-Chao Chou的方法(19)计算和绘制组合指数(CI)，以评估组合作用，其包括协同作用、累加作用和拮抗作用。如表10和11中所示，NIT分别与卡铂和紫杉醇组合抑制人膀胱癌5637的生长，并且计算这些研究的CI值并分别绘制在图2和图3中。
表10.将NIT和卡铂的组合与人膀胱癌细胞系5637孵育120小时导致细胞生长的抑制。
表11.将NIT和紫杉醇的组合与人膀胱癌细胞系5637孵育96小时导致细胞生长的抑制。
如表12和13中所示，NIT分别与卡铂和紫杉醇组合抑制人肝癌细胞系HepG2的生长，这些研究的CI值分别绘制在图4和图5中。
表12.将NIT和卡铂的组合与人肝癌细胞系HepG2孵育120小时导致细胞生长的抑制。
表13.将NIT和紫杉醇的组合与人肝癌细胞系HepG2孵育120小时导致细胞生长的抑制。
相似地，NIT与丝裂霉素C、表柔比星和吡柔比星组合以抑制膀胱癌细胞系5637的生长，并且它们的组合抑制结果和CI图显示在表14-17和图6-8中。
表14.将NIT和丝裂霉素C的组合与人膀胱癌细胞系5637孵育96小时导致细胞生长的抑制。
表15.当与人膀胱癌细胞系5637孵育96小时时，NIT和丝裂霉素C的组合的CI值。
表16.当与人膀胱癌细胞系5637孵育96小时时，NIT和表柔比星的组合的CI值。
表17.当与人膀胱癌细胞系5637孵育96小时时，NIT和吡柔比星的组合的CI值。
根据Chou(19)，CI值低于0.9表示两种药物的协同组合，并且0.1-0.3、0.3-0.7、0.7-0.85和0.85-0.9的值分别表示强协同作用、协同作用、中度协同作用和轻微协同作用。因此，图2和4中的CI图支持以下结论：NIT和卡铂以分类为协同或强协同的方式抑制膀胱癌细胞系5637和肝癌细胞系HepG2的生长。图3中的CI图显示NIT和紫杉醇的组合在抑制膀胱癌细胞系5637的生长方面表现出轻微协同作用，并且图5显示当药物浓度的Fa(吸收分数)低于0.3时，用这种组合抑制肝癌细胞系HepG2的生长是部分协同的。如表15和图6所示，还发现了NIT和丝裂霉素C的组合以低于药物的IC50值的浓度对抑制膀胱癌细胞系5637的这种部分协同作用，表16和17以及图7和8表明NIT与表柔比星或吡柔比星的组合在某些浓度下部分地协同抑制膀胱癌细胞系5637的生长。
在小鼠膀胱癌原位异种移植中进一步评估了NIT与丝裂霉素C(MMC)组合表现出的协同肿瘤生长抑制。图9显示了口服给药的NIT和膀胱内施用的MMC的组合对MBT-2-luc原位小鼠膀胱癌模型中肿瘤进展的抑制作用。在指示的治疗后，通过Xenogen IVIS200系统分析肿瘤体积。图9A显示了每个治疗组的典型IVIS图像。通过每秒总光子的感兴趣区域分析而确定每只小鼠的肿瘤体积。每组中分析6只小鼠。如图9B所示，15mg/kg Bid口服的NIT与Q7d1mg/ml膀胱内丝裂霉素C组合(NIT+MMC)的组的平均肿瘤体积与单一NIT或单一MMC治疗组的平均肿瘤体积显著不同(分别p&lt;0.0001和p＝0.0001)，这表明通过NIT与MMC的组合治疗显著增强肿瘤生长抑制。还进行了Kaplan-Meier分析以评估每种治疗的小鼠存活率，并总结在图9C中。一致地，与对照组和单一药物治疗组相比，NIT加MMC组的存活状态显著改善。
表18中总结了肿瘤生长抑制和存活比例以及加和性的Bliss独立模型计算的结果。
表18：在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服NIT与MMC组合的加和性的Bliss独立模型计算。
以15mg/kg(Bid)的剂量口服施用的NIT以0.33的比率抑制肿瘤生长，并且在实验结束时(45天)存活小鼠的比例为0.33。膀胱内施用MMC治疗的肿瘤抑制率和存活小鼠的比例分别为0.56和0.57。当口服的NIT与MMC一起给药时，观察到的肿瘤抑制率和存活小鼠的比例分别显著增加至0.71和1，这大于它们预期的Bliss加和值，表明NIT和MMC的组合对肿瘤抑制的协同作用。
NIT与不同类别的化学疗法具有不同程度的协同作用的发现可用于各种实体肿瘤和血液肿瘤的组合治疗。
实施例2：通过NIT和免疫疗法的组合协同抑制肿瘤生长
测试NIT与一组免疫疗法一起对小鼠膀胱和前列腺癌原位异种移植模型的肿瘤生长抑制，所述免疫疗法包括BCG和抗PD-1抗体。
图10显示了在MBT-2-luc原位小鼠膀胱癌模型中口服给药的NIT和膀胱内滴注的BCG的组合对抑制肿瘤进展的作用。在指示的治疗后，通过Xenogen IVIS200系统分析肿瘤体积，并且在图10A中显示了指示的治疗的每个治疗组的典型IVIS图像。通过每秒总光子的感兴趣区域分析而确定每只小鼠的肿瘤体积。每组中分析8只小鼠。如图10B所示，连续或48小时间断口服施用的30mg/kg NIT抑制了癌症生长，与膀胱内施用的BCG引起的活性相比略高或相似。当口服NIT(连续地或48小时间断地施用)与BCG一起给药时，与单一NIT或BCG治疗相比，抑制率显著增加(所有比较p&lt;0.0001)。还进行了Kaplan-Meier分析以评估每种治疗的小鼠存活率，并总结于图10C中。与单一药物治疗组相比，口服的NIT(连续或48h间断地施用)与BCG组合的组的存活状态显著改善。
肿瘤生长抑制和存活比例的加和性的Bliss独立性模型计算的结果总结在表19(连续的NIT)和表20(48小时间断的NIT)中。
表19.在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服的NIT(连续的)与膀胱内的BCG组合的加和性的Bliss独立模型计算。
表20.在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服的NIT(48h间断)与膀胱内的BCG组合的加和性的Bliss独立模型计算。
不论连续地还是48小时间断地，当口服的NIT与膀胱内的BCG组合施用时，与单一NIT和BCG治疗相比，观察到的肿瘤抑制率和生存比例显著增加。NIT与BCG组合的实际肿瘤抑制率和存活比例远高于其预期的Bliss加和值，这表明NIT和BCG组合对肿瘤抑制的强协同作用。
为了评估NIT与抗PD-1组合的协同肿瘤抑制作用，测试了该组合对小鼠膀胱癌和前列腺癌原位异种移植模型的肿瘤生长抑制。
图11显示了在MBT-2-luc原位小鼠膀胱癌模型中口服给药的NIT与经腹膜内的抗PD-1抗体组合对肿瘤生长的抑制作用。图11A显示了每个指示治疗组的典型IVIS图像。通过每秒总光子的感兴趣区域分析确定每只小鼠的肿瘤体积。每组中分析5只小鼠。如图11B所示，10mg/kg经腹膜内的抗PD-1以80％的比率强烈抑制肿瘤生长，而口服施用的15mg/kgNIT显示了31％的肿瘤抑制率。当口服的NIT与抗PD-1组合时，与单一NIT或抗PD-1治疗相比，抑制率显著提高(90％)(分别p&lt;0.0001和p＝0.039)。还进行了Kaplan-Meier分析，并总结在图11C中。NIT加抗PD-1组或单一抗-PD-1组的存活状态显著高于单一NIT组。
表21中总结了肿瘤生长抑制的加和性的Bliss独立模型计算结果。当NIT与抗PD-1组合施用时，其实际观察到的肿瘤抑制率大于预期的Bliss加和值，这表明肿瘤抑制的协同作用。
表21.在原位小鼠MBT-2-Luc膀胱癌模型中口服NIT与抗PD-1抗体组合的加和性的Bliss独立模型计算。
图12显示在RM-9-luc原位小鼠前列腺癌模型中口服给药的NIT与经腹膜内的抗PD-1抗体的组合抑制肿瘤生长的作用。图12A中显示了每个指示治疗组的典型IVIS图像。通过每秒总光子的感兴趣区域分析而确定每只小鼠的肿瘤体积。每组中分析8只小鼠。如图12B所示，10mg/kg经腹膜内的抗PD-1显示出强烈的肿瘤生长抑制(76％)，而口服施用的15mg/kg NIT显示出52％的肿瘤抑制率。当NIT与抗PD-1组合时，与单一NIT和抗PD-1治疗相比，肿瘤抑制率显著增强至96％，p值分别为0.017和0.027。图12C显示了从每组收集的肿瘤的图像。测定了每只小鼠的肿瘤重量，并总结在图12D中。肿瘤重量数据的分析显示，与单一NIT和抗PD-1治疗(分别为37％和56％)相比，NIT和抗PD-1的组合导致肿瘤抑制的显著增强(74％)，p值分别为0.0006和0.0111。
表22中总结了肿瘤体积和重量的加和性的Bliss独立模型计算结果。当NIT与抗PD-1组合施用时，其实际观察到的肿瘤体积和重量抑制率分别为0.96和0.74，大于它们预期的Bliss加和值(分别为0.89和0.72)，这表明肿瘤抑制的协同作用。
表22.在原位小鼠RM-9-Luc前列腺癌模型中口服NIT与抗PD-1抗体组合的加和性的Bliss独立模型计算。
NIT与不同免疫疗法具有不同程度的协同作用的发现可用于各种实体肿瘤和血液肿瘤的组合治疗。
实施例3：实验步骤
3.1研究材料
化合物：从供应商处购买NIT、卡铂、紫杉醇、表柔比星和吡柔比星，并将其溶解在DMSO成储备溶液并储存在-20℃。使用前，将该储备溶液稀释至不同浓度的工作溶液。工作溶液中的DMSO浓度小于1％。所有癌细胞系均购自供应商。
细胞系和试剂：鼠膀胱癌细胞系MBT-2和RM-9由美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD,USA)提供。将所有细胞维持在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中。将该细胞在37℃以5％CO2气氛中培养，并通过在含有BCG(81mg；Connaught substrain，ImmuCyst,Nihou Kayaku,Inc.,东京，日本)和磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)的100-cm2烧瓶中通过胰蛋白酶-EDTA处理进行常规传代，用于体内研究。
通过使用-3T3转染试剂盒(Mirus Bio LLC，Madison，WI，USA)用pGL3-Luc质粒转染MBT-2和RM-9细胞而产生稳定表达荧光素酶的MBT-2和RM-9细胞(MBT-2-Luc和RM-9-Luc；从Sigma-Aldrich Japan GK获得的荧光素酶L4899)。通过用500μg/mL的G418筛选两周而获得稳定表达荧光素酶的细胞。在G418筛选后，测试来自MBT-2-Luc和RM-9-Luc的生长培养基的荧光素酶活性，以确认荧光素酶表达且分泌至细胞培养基中。
大鼠抗小鼠PD-1mAb(RMP1-14；IgG2a)购自BioXCell(West Lebanon,NH,USA)。
动物：从供应商处获得8周龄雌性C3H/HeN和C57/BL6小鼠。将小鼠维持在无特定病原体环境中的动物设施中，提供自由采食的食物和水。
3.2体外分析
使用MTT测定法作为测试方法。将适量的细胞(2×103/100μL)接种至96孔板中并在37℃在CO2培养箱中孵育过夜以进行细胞粘附和适应。将癌细胞也接种在单独的96孔板中(T0板)，12孔/细胞系，以测定零时刻(T0)的OD值。过夜适应后，每孔加入20μL MTT试剂(终浓度0.5mg/mL)至T0板并在37℃孵育4小时。用移液管移出上清液培养基，每孔加入约150μL DMSO。使用550nm作为测试波长，630nm作为参考波长，在平板读数器上读板，以获得零时刻(T0)的OD值。过夜适应后，将测试化合物和媒介物加入该板中以处理细胞。在一式三份孔中以6种浓度测试该测试化合物。将该板在37℃在CO2培养箱中孵育48小时。可以使用更长的孵育时间。每孔加入20μL MTT试剂，并在37℃孵育4小时。用移液管移出上清液培养基，每孔加入约150μL DMSO。使用约550nM作为测试波长，使用约630nM作为参考波长，在平板读数器(TECAN，Infinite M200)上读取该板。以两种方式计算细胞活力(％)：
％活力＝[(T-B)/(C-B)]×100％
％活力＝[(T-C0)/(C-C0)]×100％
T：在不同时间的治疗的平均吸光度；
C：在不同时间的阴性对照的平均吸光度；
B：在不同时间的空白孔(仅培养基)的平均吸光度；
C0：在0h时的阴性对照的平均吸光度。
结果表示为平均值±SD。通过XLfit软件计算IC50。每种化合物的测试独立重复一次。
3.3小鼠膀胱癌和前列腺癌模型的体内作用。
为了建立原位膀胱癌肿瘤，通过腹膜内(ip)施用0.1ml/10g体重的剂量的氯胺酮/甲苯噻嗪溶液(K113；Sigma-Aldrich日本GK，东京，日本)麻醉小鼠。随后使用惰性润滑剂将24号聚四氟乙烯静脉内导管通过尿道插入膀胱或前列腺。为了制备用于肿瘤植入的膀胱，短暂的酸暴露，随后碱性中和，促进膀胱壁上的化学损伤，通过膀胱内滴注8μl 1MOI硝酸银进行。这导致形成足够且受控制的弥漫性膀胱壁损伤。15秒后，通过经尿道输注PBS洗掉内容物。取出第一根导管，在尿道内插入新的24号导管用于膀胱内滴注MBT-2-Luc细胞(与0.1ml PBS混合的5x104个细胞)，且通过缝合保持1.5h。每10天，i.p.施用荧光素后使用生物发光技术进行肿瘤成像(Xenogen IVIS200系统；Xenogen Corporation,Hopkinton,MA,USA)。
对于NIT和BCG组合，将携带原位膀胱癌肿瘤的小鼠随机分成六组：对照(PBS)、BCG、连续给药的NIT、除了每周BCG滴注前后24小时间断之外连续给药的NIT(48小时间断组)、NIT(连续给药)和BCG的组合，和NIT(48小时间断)和BCG的组合。表23中显示了药物给药的详细说明。根据肿瘤成像结果，如通过荧光素酶表达测定的，BCG(1×105个CFU/100μL)每周一次膀胱内施用持续三周。NIT连续施用或具有48小时的间断。
表23.药物给药示意图
○:PBS膀胱内施用，●:BCG膀胱内施用，△：CMC p.o，▲：NIT p.o，*：NIT给药间断48h
对于NIT和MMC组合，将携带原位膀胱癌肿瘤的小鼠随机分成四组：对照(PBS)、NIT、MMC、以及NIT和MMC的组合。表24中显示了药物给药的详细说明。
表24.药物给药示意图
○：PBS膀胱内施用，●：MMC膀胱内施用，△：CMC p.o，▲：NIT p.o
对于NIT和抗PD-1组合，将携带原位膀胱癌肿瘤的小鼠随机分成四组：对照(PBS)、NIT、抗PD-1、以及NIT和抗PD-1的组合。表25中显示了药物给药的详细说明。
表25.药物给药示意图
○：PBS膀胱内施用，●：抗PD-1腹膜内施用，△：CMC p.o，▲：NIT p.o
为了建立原位前列腺癌肿瘤，以0.1ml/10g体重的剂量的氯胺酮/甲苯噻嗪溶液(K113；Sigma-Aldrich日本GK，东京，日本)腹膜内麻醉C57/BL6小鼠。制作下腹部横切口，暴露前列腺双侧背侧叶。在胰蛋白酶消化RM-9-Luc细胞后，使用新的24号导管将在10μlHanks平衡盐溶液中的5.0×10 3个细胞直接注射到前列腺的右背侧叶。注射的前列腺叶内的明显可识别的水泡被认为是技术上令人满意的注射的标志。用不锈钢夹(Autoclip；Becton Dickinson Co.，Sparks，MD)封闭腹部伤口。在RM-9-Luc细胞注射后一周，当该肿瘤直径达到5mm时，将携带原位前列腺癌肿瘤的小鼠随机分成四组：对照(PBS)、NIT、抗PD-1以及NIT和抗PD-1的组合。表26中显示了药物给药的详细描述。
表26.药物给药示意图
○：PBS腹腔内施用，●:抗PD-1腹腔内施用，△：CMC p.o，▲：NIT p.o
小鼠接受i.p.注射荧光素，并通过Xenogen IVIS200系统测定肿瘤中的荧光素酶表达。根据动物安乐死指南(2013版本)使用CO2杀死该小鼠用于安乐死。
3.4统计分析
来自所有定量分析的数据表示为平均值±标准偏差，并使用单因素方差分析(ANOVA)和独立样品t检验进行统计学分析。使用GraphPad Prism 5进行统计学计算。小于0.05的P值被认为是统计学上显著的。
使用分数乘积概念(fractional product concept)或Bliss独立模型确定加和性(Exy＝Ex+Ey-(ExEy))，其中EXY是2种化合物x和y的加和作用，其由该2种化合物的单独作用Ex和Ey的乘积计算得出。当实际观察到的肿瘤抑制值大于由Bliss独立模型确定的预期肿瘤抑制值时，则建立了协同作用(20)。
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Claims (15)

1.一种治疗癌症的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐以及有效量的免疫治疗剂，其中所述硝羟喹啉、其类似物或药物上可接受的盐与所述免疫治疗剂的组合引起协同作用。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫治疗剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的有效量是每1至4周静脉内施用1mg/kg至20mg/kg。
3.权利要求1的方法，其中所述免疫治疗剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的有效量是每1至4周静脉内施用4mg/kg至40mg/kg。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫治疗剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的有效量是每1至4周静脉内施用0.6mg/kg至6mg/kg。
5.权利要求1的方法，其中所述免疫治疗剂是卡介苗(BCG)疗法，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述BCG疗法的有效量是每1至4周膀胱内施用0.5x108至50x108个菌落形成单位(CFU)。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述癌症是膀胱癌。
7.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
8.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐以及有效量的化学治疗剂，其中所述硝羟喹啉、其类似物或药物上可接受的盐与所述化学治疗剂的组合引起协同作用。
9.权利要求8的方法，其中所述癌症是膀胱癌，并且所述化学治疗剂是膀胱内施用的。
10.权利要求8的方法，其中所述癌症是肝癌或前列腺癌。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述化学治疗剂是紫杉醇、多西他赛或卡巴他赛，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述紫杉醇、多西他赛或卡巴他赛在膀胱滴注液中以0.5mg/ml至10mg/ml的浓度膀胱内施用。
12.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述化学治疗剂是丝裂霉素C，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述丝裂霉素C在膀胱滴注液中以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度膀胱内施用。
13.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述化学治疗剂是表柔比星或吡柔比星，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述表柔比星或吡柔比星在膀胱滴注液中以0.1mg/mL至5mg/mL的浓度膀胱内施用。
14.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述化学治疗剂是卡铂、顺铂、奥沙利铂或奈达铂，优选地，所述硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐的有效量是每日口服施用100mg至1600mg，且所述卡铂、顺铂、奥沙利铂或奈达铂在膀胱滴注液中以0.1mg/mL至5mg/mL的浓度膀胱内施用。
15.一种试剂盒，其包含有效量的硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐以及有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂以及一种或多种药学上可接受的载体，以及关于使用所述有效量的硝羟喹啉、其类似物或药学上可接受的盐和所述有效量的免疫治疗剂或化学治疗剂的组合用于治疗有此需要的受试者中癌症的说明书。
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